HU201093B - Process for solubilisation and recovery of somatotropin - Google Patents
Process for solubilisation and recovery of somatotropin Download PDFInfo
- Publication number
- HU201093B HU201093B HU86741A HU74186A HU201093B HU 201093 B HU201093 B HU 201093B HU 86741 A HU86741 A HU 86741A HU 74186 A HU74186 A HU 74186A HU 201093 B HU201093 B HU 201093B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- urea
- priority
- somatotropin
- process according
- solution
- Prior art date
Links
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 27
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title description 18
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 160
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 56
- HHVIBTZHLRERCL-UHFFFAOYSA-N sulfonyldimethane Chemical compound CS(C)(=O)=O HHVIBTZHLRERCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 65
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 53
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 abstract description 20
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 19
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 abstract description 13
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 abstract description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 26
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 6
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 6
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 4
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GNYUVVJYGJFKHN-RVMXOQNASA-N Arg-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N GNYUVVJYGJFKHN-RVMXOQNASA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102100021809 Chorionic somatomammotropin hormone 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000272496 Galliformes Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- VOKCBYNCZVSILJ-KKUMJFAQSA-N His-Asn-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O VOKCBYNCZVSILJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N Leu-Gln-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 101000868138 Ovis aries Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 description 1
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 description 1
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical compound OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000007347 radical substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009645 skeletal growth Effects 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003567 thiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- GKODZWOPPOTFGA-UHFFFAOYSA-N tris(hydroxyethyl)aminomethane Chemical compound OCCC(N)(CCO)CCO GKODZWOPPOTFGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
A találmány tárgya új eljárás szomatotropin szolubilizálására és kinyerésére.The present invention relates to a novel process for the solubilization and recovery of somatotropin.
A rekombináns DNS technológia lehetővé teszi heterológ fehérje kifejeződését olyan gazdasejtekben, mint pl. E. coli bakériumok. 5 Arról is beszámoltak, hogy bizonyos heterolög fehérjék, mint a szomatotropinok (növekedési hormonok) elkülöníthetők változó mértékben a kifejeződést követően fénytörő testecskékben a gazdasejt citoplazmáján belül. 10Recombinant DNA technology allows expression of a heterologous protein in host cells such as germ cells. E. coli bacteria. It has also been reported that certain heterologic proteins, such as somatotropins (growth hormones), can be isolated to varying degrees after expression in refractive cells within the host cell cytoplasm. 10
Kaotróp ágenseket, mint pl. guanidin-hidrokloridot, nátrium-tiocianátot, karbamidot és különböző detergenseket alkalmaznak a nem kovalens intermolekuláris vonzások széttörésére a fehérjéken belül. így pl. ki- 15 mutatták, hogy a fehérjéket ki lehet .göngyölíteni· olyan módon, hogy a fehérjéket kaotróp ágensek hatásának teszik ki lásd: Stryer: Biochemistry (2. kiadás, 1981), 34-35. oldal, kiadó: W.H. Freeman and Company. Ha- 20 sonlóképpen kimutatták azt is, hogy azokat a fehérjéket, amelyek több alegységet tartalmaznak, megfelelő alegységeikre lehet disszociálni kaotróp ágensekkel.Chaotropic agents such as guanidine hydrochloride, sodium thiocyanate, urea and various detergents are used to break the non-covalent intermolecular attraction within proteins. so e.g. It has been shown that proteins can be wound up in such a way that they are exposed to chaotic agents, see Stryer, Biochemistry (2nd ed. 1981), 34-35. pages, by W.H. Freeman and Company. Similarly, it has been shown that proteins containing multiple subunits can be dissociated with their corresponding subunits by chaotropic agents.
Nemrégiben közölték a 114.506A európai 25 szabadalmi közzétételi iratban, hogy heterológ fehérjéket szolubilizalni lehet fény törő testecskékból erős kaotróp ágenseket, mint pl. guanidin-hidrokloridot, detergenseket, mint pl. nátrium-dodecil-szulfátot, és tiocia- 30 nátok sóit alkalmazva. A karbamidnak, amely viszonylag gyenge kaotróp szer, alkalmazását hatástalannak írták le fénytörő testecskék szolubilizálására. Az erős denaturálószerek, mint pl. a guanidin-hidroklorid, igen drágák. 35 Ezen túl ha egyszer erős denaturálószerrel szolubilizálnak, a heterológ fehérjét át kell vinni gyenge denaturálószerbe, amely nem lép kölcsönhatásba a később következő, ioncserélőt alkalmazó tisztítási lépésekkel. 40It has recently been reported in European Patent Publication No. 114,506A that heterologous proteins can be solubilized from refractive bodies by strong chaotropic agents, e.g. guanidine hydrochloride; detergents, e.g. sodium dodecyl sulfate; and thiocyanate salts. The use of urea, a relatively weak chaotropic agent, has been described as ineffective in solubilizing refractive bodies. Strong denaturing agents such as. guanidine hydrochloride is very expensive. In addition, once solubilized with a strong denaturing agent, the heterologous protein must be transferred to a weak denaturing agent which will not interfere with subsequent purification steps using an ion exchanger. 40
Következésképpen a jelen találmány tárgya javított módszer szolgáltatása a szolubilizáláshoz és a heterológ szomatotropin fehérjék ezt követő naturálisához a gazdasejt fénytörö testecskéiból, 45 amely könnyen rendelkezésre álló és viszonylag olcsó ágenst használ, a helyreállítási (naturálási) lépést viszonylag nagy szomatotropin koncentrációnál lehet végrehajtani. 50Accordingly, it is an object of the present invention to provide an improved method for solubilization and subsequent naturalization of heterologous somatotropin proteins from refractory bodies of the host cell using a readily available and relatively inexpensive agent. 50
A szomatotropin fehérjék szolubilizálását és/vagy helyreállítását redukáló ágensek jelenlétében vagy távollétében hajtjuk végre, egyben olyan szert alkalmazunk, amely ökológia- 55 ilag biztonságosabb, mint az eddigi módszerekben alkalmazott ágensek.Solubilization and / or recovery of somatotropin proteins is carried out in the presence or absence of reducing agents, and is an agent which is ecologically safer than the agents used to date.
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a vizes karbamid- vagy dimetil-szulfon-oldatot hatásosan lehet alkalmazni az 60 ilyen szomatotropin-fehérjét tartalmazó fénytörö testecskék szolubilizálására. Meglepő módon azt találtuk továbbá, hogy ha egyszer már szolubilizáltunk, az ilyen szomatotropin fehérjét helyre lehet állítani karbamid- vagy 65 dimetil-szulfon-oldatban, az oldatot érintkezésbe hozva enyhe oxidálószerrel annyi ideig, amely elegendő, hogy diszulfid-hidak képződése legyen az eredmény, amely diszulfid-kötés jelen van a fehérje natív konformációjában. A helyreállítás hatékonyan létrejöhet még nagy fehérje-koncentrációnál is, tisztátalan készítményben és redukálóezer távollétében.The invention is based on the discovery that an aqueous solution of urea or dimethylsulfone can be effectively used to solubilize refractive bodies containing 60 such somatotropin proteins. Surprisingly, it has now been found that once solubilized, such somatotropin protein can be reconstituted in a solution of urea or 65 dimethylsulfone by contacting the solution with a mild oxidant for a time sufficient to produce disulfide bridges, which disulfide bond is present in the native conformation of the protein. Recovery can be accomplished effectively even at high protein concentrations, in an impure composition and in the absence of a reducing thousands.
A .szomatotropin' kifejezés jelenthet emlős szomatotropinokat, de nem korlátozódik ezekre, ilyenek pl. a humán-, juh-, sertésés szarvasmarha szomatotropin, és mások, pl. a madár szomatotropinok. A természetben előforduló szekvenciával biró fenti szomatotropin-fehérjékhez alkalmas eljárásokon túl a jelen találmány azonos mértékben alkalmazható olyan rendszereknél is, amelyek természetben előforduló fehérjék olyan analógjait foglalják magukban, amelyek szomatotropin-szerű aktivitással bírnak. Azok számára, akik a szakterületen jártasak, érthető, hogy más szomatotropin-szerű fehérjéket, amelyek hasonló kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, mint pl. a prolaktin és a placenta-laktogén, tisztítási szempontból lényegében azonosnak tekinthetjük a szomatotropinokkal. Következésképpen addig a mértékig, ameddig az ilyen fehérjék egyenértékűek tisztítási szempontból, a jelen találmány kiterjed az ilyen fehérjék alkalmazására is.The term "somatotropin 'may include, but is not limited to, mammalian somatotropins, e.g. human, ovine, porcine and bovine somatotropin, and others, e.g. the bird is somatotropin. In addition to methods suitable for the aforementioned somatotropin proteins having a naturally occurring sequence, the present invention is equally applicable to systems that include analogs of naturally occurring proteins that have somatotropin-like activity. It will be appreciated by those skilled in the art that other somatotropin-like proteins having similar chemical properties, e.g. prolactin and placental lactogen may be considered to be substantially identical to somatotropins in purification. Consequently, to the extent that such proteins are equivalent in purity, the present invention also encompasses the use of such proteins.
A ..heterológ' fehérjék olyan fehérjék, amelyeket a gazdasejt normálisan nem termel. A rekombináns DNS technológia lehetővé teszi a heterológ fehérjék viszonylag nagy menynyiségének kifejeződését a transzformált gazdaeejtekből. Nem teljesen érthető okokból azonban ezek gyakran oldhatatlan fénytörő testecskékbe záródnak a gazdasejt citoplazmájában.Heterologous proteins are proteins that are not normally produced by the host cell. Recombinant DNA technology allows the expression of a relatively large amount of heterologous proteins from transformed host cells. However, for reasons that are not fully understood, they are often enclosed in insoluble refractive bodies in the host cell cytoplasm.
A .fénytörő testecskék* azokat a bezárt testecskéket vagy citoplazmás aggregátumokat jelentik, amelyek legalábbis részben a kinyerendő heterológ szomatotropint tartalmazzák. Az aggregátumok fényes foltként tűnnek fel fáziskontraszt-mikroszkóp alatt.Reflective Bodies * denote closed bodies or cytoplasmic aggregates that contain at least some of the heterologous somatotropin to be recovered. The aggregates appear as a bright spot under the phase contrast microscope.
A .gazdasejt* olyan mikrobiológiai sejtet, pl. baktériumot vagy élesztőt vagy más alkalmas sejteket, mint állati és növényi sejteket jelent, amelyek transzformálva vannak, hogy heterológ szomatotropint fejezzenek ki. A gazdasejtek, amelyeket a jelen találmány szerint ennek tekintünk, azok, amelyekben a heterológ szomatotropin elkülönül a kifejeződés után a fényszóró testecskékben. Példa szerinti gazdasejt az E. coli K 12 (W3110/pBGH-1 törzs), amelyet úgy transzformáltunk, hogy lehetővé váljék a bovin szomatotropin kifejeződése.The host cell * is a microbiological cell, e.g. bacterial or yeast or other suitable cells such as animal and plant cells that have been transformed to express heterologous somatotropin. The host cells that are considered to be this according to the present invention are those in which the heterologous somatotropin is isolated after expression in the scattering bodies. An exemplary host cell is E. coli K12 (strain W3110 / pBGH-1) transformed to allow expression of bovin somatotropin.
A .helyreállítás* a szomatotropin fehérje .begöngyólitésére* (naturálására), és oxidációjára vonatkozik természetes konformációjára, hogy a biológiai aktivitás biztosítva legyen.Restoring * refers to the natural conformation * of the somatotropin protein.
HU 201093 ΒHU 201093 Β
A .begóngyölés* a fehérje általános konformációs alakjának visszaállítását jelenti olyan mértékben, amely elegendő a megfelelő oxidációhoz. A .begöngyölés'-t a karbamid denaturáló hatásának csökkentésével hajtjuk 5 végre olyan módon, hogy a karbamid-koncentrációt a megfelelő szintre állítjuk be, ha szükséges, hogy lehetővé tegyük a fehérje aminosav-szekvenciájának kölcsönhatásba lépését, hogy felvegye natív szekunder és 10 tercier szerkezetét..Begon killing * is the restoration of the general conformation of a protein to an extent sufficient for proper oxidation. Spin-up is accomplished by reducing the denaturation effect of urea by adjusting the urea concentration to the appropriate level, if necessary, to allow the protein's amino acid sequence to interact to incorporate its native secondary and 10-tertiary structure.
Az .oxidáció kifejezés intramolekuláris diszulfidkőtések képződésére vonatkozik, hogy stabil, natív konformációt nyerjünk a biológiai aktivitás biztosítása érdekében. 15The term oxidation refers to the formation of intramolecular disulfide bonds to obtain a stable native conformation to provide biological activity. 15
Az .enyhe oxidáló ágens* olyan szert jelent, amely elősegíti a szulfhidril-csoportok oxidációját, ezáltal az intramolekuláris diszulfid-hidak képződését, miközben nem oxidálja az oxidálásnak kitett fehérje más szubsztitu- 20 ens csoportjait. Bár enyhe oxidáló ágenseket, mint pl. hidrogén-peroxidot is alkalmazhatunk, a levegőnek való kitevés egészen elfogadható és előnyös megoldás.A mild oxidizing agent * is an agent that promotes the oxidation of sulfhydryl groups, thereby forming intramolecular disulfide bridges without oxidizing other substituent groups on the protein to be oxidized. Although mild oxidizing agents such as hydrogen peroxide may also be used, and exposure to air is quite acceptable and advantageous.
A .biológiai aktivitás azt jelenti, hogy 25 a szomatotropin képes a kivánt in vivő fiziológiai válasz létrehozására. A biológiai aktivitást a megfelelő fajban végzett in vivő vizsgálat nélkül megfelelő biológiai meghatározásokat végezve határozzuk meg. A találmány- 30 bán foglalt szomatotropinokhoz megfelelő biológiai meghatározás (bioassay) a .patkány súlygyarapodás biológiai meghatározás*. Ebben a biológiai meghatározásban a szomatotropin készítmények bioaktivitását ismert ké- 35 szitményekkel (pl. extrahált natív szomatotropin) viszonyítva vesszük fel, hipofizisirtott patkányok súlygyarapodásának mennyiségét összevetve a beadott készítmény különböző mennyiségével. 40Biological activity means that somatotropin is capable of producing the desired in vivo physiological response. Biological activity is determined by appropriate biological assays without in vivo testing in the appropriate species. A suitable bioassay for the somatotropins of the present invention is the bioassay for rat weight gain *. In this biological assay, the bioactivity of the somatotropin formulations is compared to known formulations (eg, extracted native somatotropin) by comparing the amount of weight gain of the pituitary glandular rats with the different amounts of the formulation administered. 40
A szomatotropinok olyan hormonok, amelyeket az adeno-hipofizis (az agyfüggelék első lebenye) választ ki, és amelyekről ismert, hogy hatnak a csontváz növekedési sebességére és a testsúlygyarapodásra. A szomatot- 45 ropin beadásáról kimutatták, hogy növekedést idéz elő a tejtermelésben tejelő állatokban, mint a tejelő tehenek és kecskék. Tipikusan a szomatotropinok mintegy 191 aminosav-gyököt tartalmaznak, és molekulasúlyuk hozzávetőlegesen 22000 dalton. Néhány fajból származó szomatotropinoknál a teljes aminosav-szekvenciát megállapították, beleértve az embert és bizonyos állatokat, pl. madarakat (avian), juhokat (ovin), sertéseket (poréin) és szarvasmarhákat (bovin). A fentebb felsorolt fajokból származó aminosav-szekvenciák összehasonlítása viszonylag nagy általános homológiát jelez, amikor a .konzervatív aminosav-helyettesítéseket tekintjük át. Általában bizonyos .konzervatív helyettesítések végbemehetnek jelentős változások nélkül egy fehérje durvább kémiai tulajdonságaiban. Az ilyen helyettesítésekre példa egy alifás, hidrofób gyök helyettesítése egy másikkal (izoleucin, valin, leucin és metionin), és a poláros gyökök helyettesítése egy másikkal (arginin lizint, glutamin aszparagint és glutaminsav aszparaginsavat). Ellenkező töltésű ionos gyökökről kimutatták, hogy helyettesíthetik egymást, pl. az aszparaginsav vagy glutaminsav helyettesítheti a lizint. Ezen túl .radikális helyettesítések (különböző fajtájú oldalláncot képviselők) is megtörténhetnek lényeges változások nélkül a működésben vagy a kémiai tulajdonságokban, amikor a helyettesítés helyzete nem kritikus a konformáció szempontjából, és a helyettesítés mértéke nem kiterjedt.Somatotropins are hormones that are secreted by the adeno-pituitary gland (the first lobe of the pituitary gland) and are known to affect skeletal growth rate and weight gain. Administration of somatropin 45 has been shown to induce an increase in milk production in dairy animals, such as dairy cows and goats. Typically, somatotropins contain about 191 amino acid residues and have a molecular weight of approximately 22,000 daltons. In somatotropins from some species, the complete amino acid sequence has been established, including humans and certain animals, e.g. birds (avian), sheep (ovin), pigs (pores) and cattle (bovin). Comparison of amino acid sequences from the species listed above indicates relatively high overall homology when reviewing conservative amino acid substitutions. In general, certain conservative substitutions can occur without significant changes in the coarser chemical properties of a protein. Examples of such substitutions are the replacement of an aliphatic hydrophobic radical by another (isoleucine, valine, leucine and methionine) and the replacement of polar radicals by another (arginine lysine, glutamine aspartic acid and glutamic acid aspartic acid). Opposite charged ionic radicals have been shown to be interchangeable, e.g. aspartic acid or glutamic acid may replace lysine. In addition, radical substitutions (representing different types of side chains) can occur without significant changes in function or chemical properties when the position of substitution is not critical to conformation and the degree of substitution is not extensive.
Az alábbi 1. táblázatban bemutatjuk a különböző állatfajokból származó ezomatotropinok közölt primer konfigurációját. Az 1. táblázatban a következő rövidítéseket alkalmazzuk.: BGH (bovin szomatotropin); PGH (porcin, vagyis sertés szomatotropin): OGH (ovin, vagyis juh szomatotropin); ÁGH (avian, pl. baromfi szomatotropin); HGH (humán szoniatotropin). Az .X jel üres helyet jelöl a szekvenciában, ez csak azért van beiktatva, hogy demonstrálja a szóban forgó szomatotropinok sorbaállitását. Egy-egy szóban forgó szekvenciában a származásnál ezt a beiktatást nem vesszük figyelembe. így pl. a BGH 126. helyénél Leu szerepel (vagy Val, mint pl. a 10. példában alkalmazott alléi variációnál).Table 1 below shows the reported primary configurations of esomatotropins from different animal species. In Table 1, the following abbreviations are used: BGH (bovine somatotropin); PGH (porcine, i.e. porcine somatotropin): OGH (ovin, i.e. sheep somatotropin); AGH (avian, eg poultry somatotropin); HGH (Human Soniatotrophin). The .X mark indicates a blank space in the sequence, it is inserted only to demonstrate the ordering of the somatotropins in question. In the sequence in question, this insertion is not taken into account at the origin. so e.g. at position 126 BGH is Leu (or Val, as in the allele variation used in Example 10).
HU 201093 Β 1. TáblázatEN 201093 Β Table 1
Reprezentatív szomatotropinok aminosav-szekvenciájaAmino acid sequence of representative somatotropins
BGH Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-Gly~Leu-Phe-Ala-A6n-Ala-Val-LeuPGH---------------Pro----------Ser—------—-—-———---—--OGH-----------------------------------------------------------ÁGH----------------Pro----------Asn-------------------------HGH---------Thr-Ue-Pro----------Arg---------Asp---------Met--20 30BGH Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-Gly ~ Leu-Phe-Ala-A6n-Ala-Val-LeuPGH --------------- Pro ---- Ser ------ -------------------- ---------------------- OGH ÁGH ------------ ------------------------------------- Pro Asn ---- ---------- ------------------------- -------- HGH -Thr-Ue-Pro ---------- Arg --------- Asp --------- Met - 20 30
BGH Arg-Ala-Gln-His-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-GluPGH-------------------------------------------------Tyr------OGH-----------------------------------------------------------ÁGH------------------------Leu-------------Gin-----Tyr------HGH---------His-Arg---------------------Phe---------Tyr-Gln----40BGH Arg-Ala-Gln-His-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-GluPGH -------------------- Tyr ----------------------------- ------ ------------- OGH ---------------------------------------------- --- ÁGH Leu Gln --------------------- ------------- ----- ------ Tyr hGH -------- --------- His Arg Phe Tyr Gln --------------------- ---- 40
BGH Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser—X—IleOGH----------------------------------------------------------ÁGH---------------------------------Asp-------------Thr-----Asn-HGH--------Glu-Ala-------------Lys-Glu-----Lys---------Phe-Leu--50 60BGH Phe-Glu-Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-X-IleOGH -------------------- -------------------------------------- ----------- ÁGH ---------------------- ------------- Asp Thr Asn HGH ----- ----- --- Glu-Ala ------------- Lys-Glu ----- Lys --------- Phe-Leu - 50 60
BGH Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Cye-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-AlaPGH----------Ala-----Ala----------------------------------------OGH-----------------------------------------------------------ÁGH Lys------Ser-----Ala--------------Tyr----------------------HGH---------Pro-----Thr-Ser-Leu------------------Ser---------Thr70BGH Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Cye-Phe-Ser-Glu-Thr-Ile-Pro-AlaPGH ---------- Ala ----- Ala --- OGH ------------ ------------------------------------- ----------------------------------------------- ÁGH Lys- ----- ----- Ser Ala Tyr -------------- ---------------------- HGH --------- ----- Pro Thr Ser Leu Ser ------------------ --------- Thr70
BGH Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Leu-Glu-LeuPGH------------------Asp-----------------Arg----------Val-----OGH------------------------------------------------------------ÁGH------------------Asp-Asp--------------------------Met-Gly--HGH-----Ser-Asn-Arg-Glu-----Thr-----------------Asn-----Gin80 90BGH Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-Gln-Lys-Ser-Asp-Leu-Glu-LeuPGH ------------------ Asp- Arg Val ---------- ----- ---------------- ---------------- OGH -------------------------------------------- ----- ÁGH ------------- -------------------------- Asp-Met-Gly - HGH-- --- Ser-Asn-Arg-Glu ----- Thr ----------------- Asn ----- Gin80 90
BGH Leu-Arg-Ue-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-LeuPGH---------Phe----------------------------------------------ValOGH----------------------------------------------------------ÁGH--------Phe---------Val---------------------------Thr----ValHGH--------------------------------------------------Glu----Val100BGH Leu-Arg-Ue-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-LeuPGH --------- Phe ---------- ------------- ------------------------------------ ValOGH --------------------------------------------- ---- ÁGH --------- Phe Val Thr ---- ---- --------------------------- ValHGH-- Glu ------------------------------------------------ --- Val100
BGH Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrPGH---------------------------------------------------------OGH----------------------------------------------------------—BGH Gln-Phe-Leu-Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrPGH -------------------- OGH ------------ ------------------------------------- -----------------------------------------------
ÁGH-----Tyr----------Lys------------------Asn---------------HGH--------------Arg-Ser----------Ala------------------Tyr----Ala110 120 BGH Ser-Asp-Arg—X—Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-GlyPGH----------------------------------------------------------OGH-----------------------------------------------------------ÁGH---------------------Phe-----------------------------------HGH-----Asn-Ser-Asp---------Asp-Leu---------------------------130ÁGH ----- ---------- Lys-Tyr Asn ------------------ ------------- --HGH -------------- ---------- Arg Ser Ala Tyr ------------------ ---- Ala110 120 BGH Ser-Asp-Arg-X-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-GlyPGH -------------- OGH -------------------------------------------- ----- -------------------------------------------------- ---- Phe ÁGH --------------------- ----------------------- ------------ ----- HGH Asn-Ser-Asp-Asp-Leu --------------- --------- 130 ------------
BGH Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Thr-Pro-Arg-AlaPGH-----Gin— -----------------------------------Ser-----------OGH-----------------------------------------Val--------------ÁGH-----Gin-----------------------------------Arg-Ser---------GlyHGH-----Gln-Thr---------Gly-Arg-------------------Ser---------Thr-47BGH Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp-Gly-Thr-Pro-Arg-AlaPGH ----- Gin- ------------- Ser ---------------------- --------------- ----------- OGH -------------------------- Val ----- -------------- ÁGH Gin-- --------------------------------- --------- Arg-Ser GlyHGH ---- Thr-Gln-Gly-Arg ------------------- --------- --------- Ser Thr 47
HU 201093 ΒHU 201093 Β
140 150140,150
BGH Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-LyB-Phe-Aep-Thr—Αβη-MetPGH-----------------------------------------------------------LeuOGH-----------------------------------------------------------ÁGH Pro-----Leu-----Arg-Pro----------------------------Ile-Hie-LeuHGH-------------Phe-----------------Ser—----------------------Ser160BGH Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr-Tyr-Asp-LyB-Phe-Aep-Thr — Αβη-MetPGH -------------------- --------------------------------------- ---------- LeuOGH ------------------------------------------------- ÁGH ----- ----- Leu Pro Arg-Ile-Pro ---------------------------- Hie-LeuHGH-- ----------- Phe Ser -------------------- ----------------- --- Ser160
BGH Arg-Ser-Asp-Asp-Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-GIy-Leu-Leu-Ser-CysPGH---------------------------------------------------------------OGH------------------------------------------------------------ÁGH-----Aen-Glu------------------------------------------------HGH His-Asn-------------------------------------—------—Tyr——— .170 180BGH Arg-Ser-Asp-Asp-Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-CysPGH -------------------- ------------------------------------------- ------ OGH -------------------------------------------------- ÁGH ---- ----- Aen-Glu ------------------------------------- ----------- HGH His-Asn ----------------------------------- --—------— Tyr ——— .170 180
BGH Phe-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-Val-MetPGH-----Lys-----------------------Ala--------------------------OGH-------------------:------------------------------------------ÁGH-----Lys-----------------------Val------------------Lys--------—BGH Phe-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg-Val-MetPGH ----- Lys -------------- --------- ------------- Ala -------------------------- OGH ------: ------------------------------------------ ÁGH ----- ----------------------- Lys Val Lys ------------------ --------
HGH-----------------Met-Asp-------Val---------Phe-----------Ile-Val-190HGH ----------------- ------- Met Asp Val Phe ----------- --------- Ile-Val-190
BGH Lys-Cys-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-Cys-Ala-PhePGH----------------------Val-----Ser-----------------OGH---------------------------------------------------ÁGH-------------------------------Ser-Asn-----Thr-Ile—BGH Lys-Cys-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-Cys-Ala-PhePGH ---------------------- Val --- --Ser ----------------------------- ----------------- OGH --------------------------- ---------------------- ÁGH ---- Ser-Ile-Thr-Asn -----
HGH Gin------X--------Ser-Val-----Gly---------Gly-----A bemutatott szekvenciákra alapozva az egyes aminosavak relatív mennyiségeinek táblázatos formáját az alábbi 2. táblázatban adjuk meg.HGH Gin ------ X -------- Ser-Val ----- Gly --------- Gly ----- Based on the sequences shown, the relative amounts of each amino acid the table form is given in Table 2 below.
A diszulfid-hidakkal kapcsolatban a szomatotropin-fehérjékben beszámoltak arról, hogy számuk homogén módon kettő. Az irodalomban alaposan alátámasztott az az álláspont, hogy az emlős szomatotropinok a fehérjék viszonylag homogén családját képezik.In relation to disulfide bridges, somatotropin proteins have been reported to have a homogeneous number of two. It is well supported in the literature that mammalian somatotropins form a relatively homogeneous family of proteins.
Arról is beszámoltak, hogy a legtöbb, E. coli baktériumban kifejezett beterológ fehérje be van zárva, a kifejeződést követően különböző mértékben, a fénytörő testecskékbe a baktérium citoplazmáján belül. Bár ez még nem teljesen érthető, ügy vélik, hogy ez legalábbis részben a heterológ fehérje túllermelődésének eredménye a gazdasejtben. A heterológ szomatotropinokról ügy vélik, hogy a fénytörő testecskékben lényegében redu35 kált formában (diszulfid-kötések nélkül) vannak jelen az E. coli sejtekben uralkodó viszonylag nagy redox-potenciál következtében.Most beterologic proteins expressed in E. coli have also been reported to be enclosed, to varying degrees in expression, in refractive cells within the bacterial cytoplasm. Although this is not yet fully understood, it is believed that this is at least in part the result of an overproduction of the heterologous protein in the host cell. Heterologous somatotropins are believed to be present in refractile bodies in substantially reduced form (without disulfide bonds) due to the relatively high redox potential in E. coli cells.
Számos szomatotropint fejeztek már ki E. coli baktériumokban. így pl. humán szomatotropint (E. coli K 12, W3110/pl07 törzs), amint ez a 4,342,832 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás ismerteti); bovin szomatotropint.Many somatotropins have already been expressed in E. coli. so e.g. human somatotropin (E. coli K12, strain W3110 / p107, as disclosed in U.S. Patent No. 4,342,832); bovin somatotropin.
-510-510
HU 201093 Β 2. TáblázatEN 201093 Β Table 2
Reprezentatív szomatotropinok aminosav-ősszetételeAmino acid composition of representative somatotropins
(E. coli K 12, W3110/pBGH-l törzs), amint ez 30 a 75,444A számú európai szabadalmi közzétételi irat ismerteti; porcin szomatotropint, amint ezt a 111,389A számú európai szabadalmi közzétételi irat ismerteti; és avian szomatotropint, amint ezt a W084/Ü1150 számú PCT 35 közzétételi irat ismerteti.(E. coli K12, strain W3110 / pBGH-1) as described in European Patent Publication No. 75,444A; porcin somatotropin, as disclosed in European Patent Publication No. 111,389A; and avian somatotropin, as disclosed in PCT Publication No. WO84 / Ü1150.
A jelen találmány céljaira a fénytörő testecskéket standard bilógiai technikákkal lehet kinyerni, igy pl. a gazdasejteket, amelyeket előzőleg toluolra és fenolra egyaránt 40 0,25 súly %-os oldattal öltünk el, általánosan használt mechanikai eszközökkel, pl. Manton-Goulin homogenizátorral vagy francia préssel összezúzzuk. Előnyös, ha az összezúzás folyamatát ügy hajtjuk végre, hogy a gazda- 45 szervezetből származó sejttörmelék megfelelően legyen összezúzva ahhoz, hogy kis sebességű centrifugálásnál a homogenizált oldatból az üledékbe kerüljön. Kis sebességű centrifugálásnál a fénytörő testecskék kiülepednek 50 a homogenizált állatból. A fénytörő testecskéket előnyösen újra szuszpendáljuk, mossuk és ismét centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük, viszonylag tiszta készítményt nyerve.For the purposes of the present invention, refractive bodies can be recovered by standard biology techniques, e.g. the host cells previously killed with 40 0.25% w / w solutions of both toluene and phenol using commonly used mechanical means, e.g. Crush with Manton-Goulin homogenizer or French press. Preferably, the crushing process is performed to ensure that cell debris from the host organism is sufficiently crushed to be transferred from the homogenized solution to the pellet at low speed centrifugation. At low speed centrifugation, refractile bodies settle out of 50 homogenized animals. Preferably, the refractile bodies are resuspended, washed and centrifuged again. The supernatant was discarded to give a relatively pure preparation.
Bár a jelen találmány szempontjából nem kri- 55 tikus, előnyös, ha a fénytörő testecske készítményt még egyszer homogenizáljuk, hogy szabadon diszpergáit készítményt biztosítsunk, amely mentes az agglomerált fénytörő testecskéktől. A készítményt előnyösen Mán- go ton-Goulin homogenizátorban homogenizáljuk 3000-5000 psig-nél (-20,3 - 33,9 MPa).Although not critical to the present invention, it is preferred that the refractive body composition be homogenized once more to provide a freely dispersed composition which is free of agglomerated refractory bodies. Preferably, the composition is homogenized in a Mango ton-Goulin homogenizer at 3000-5000 psig (-20.3 - 33.9 MPa).
Bár korábban beszámoltak arról, hogy a karbamid hatásos ágens egyes fehérjék .kigöngyőlités'-éré (denaturálésára) és több 55 egységből álló fehérjék disszociálására alegységeikké, most azt találtuk, hogy - a korábbi kitanitásokkal ellentétben - a szomatotropinokat hatásosan lehet szolubilizálni a gazdasejtek fénytörő testecBkéiből is, ezeket a fénytörő testecskéket hatásos mennyiségű és koncentrációjú karbamid hatásának téve ki. Nyilvánvaló lesz majd az alábbiakból, hogy a karbamid hatásos szolibilizáló ágens adott koncentrációknál és pH-nél. Egy másik változat szerint a vízben oldott alkalikus dimetilszulfont is hatásosnak találtuk a szomatotropinok szolubilizálására fénytörő testecskék bői.Although it has been previously reported that urea is an active agent for the denaturation of certain proteins and to dissociate several 55-unit proteins into their subunits, it has now been found that, contrary to previous teachings, somatotropins can be effectively solubilized from host cells by , exposing these refractive bodies to an effective amount and concentration of urea. It will be apparent from the following that urea is an effective solubilizing agent at particular concentrations and pH. Alternatively, alkaline dimethylsulfone dissolved in water has also been found to be effective in solubilizing somatotropins from refractile bodies.
A szükséges karbamid vagy a dimetil-szulfon koncentráció függ a pH-tól, a bzóban forgó szomatotropintól, a szolubilizálandó fehérje mennyiségétől. A karbamid vagy dimetil-szulfon alkalmazása gazdaságilag kedvező, mivel ezek könnyen rendelkezésre állnak, viszonylag olcsók, ökológiailag biztonságosabbak, mint az erős kaotróp ágensek, és lényegében nem lépnek kölcsönhatásba a továbbiakban következő tisztítási lépésekkel.The concentration of urea or dimethylsulfone required depends on the pH, the somatotropin in the bath and the amount of protein to be solubilized. The use of urea or dimethylsulfone is economically advantageous because they are readily available, relatively inexpensive, more environmentally safe than strong chaotropic agents, and do not substantially interfere with subsequent purification steps.
A magyarázat tisztasága és tömörsége érdekében a következő leirást a karbamid alkalmazását hangsúlyozva adjuk meg. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerhetik azonban, hogy az azonos tipusú folyamati paraméterek, (pl. koncentráció, abszolút mennyiség, pH, hőmérséklet, stb.) azonos módon hatnak a dimetil-szulfonnal mért eredményekre is, lásd pl. a 13. példát.For clarity and conciseness of the explanation, the following description is given emphasizing the use of urea. However, those of ordinary skill in the art may recognize that the same type of process parameters (e.g., concentration, absolute amount, pH, temperature, etc.) affect the results for dimethylsulfone in the same way, see e.g. See Example 13.
A ezomatotropin fehérjéket tartalmazó E. coli fénytőrő testecskéket különböző mértékben lehet szolubilizálni 8 mól/liter ásE. coli luminous bodies containing esomatotropin proteins can be solubilized to varying degrees at 8 mol / liter.
-611-611
HU 201093 Β mól/liter közti karbamidot tartalmazó vizes oldatokban közel semleges pH-η. Egy lényegében tiszta fénytörő testecske preparátum viszonylag kis mennyiségének csak részleges szolubilizálását érjük el karbamiddal közel semleges pH-η rövid időn belül. Ahogy a karbamid koncentráció csökken, a szolubilizálás mértéke is csökken. Ahogy a karbamid-koncentráció jóval 8 mól/liter alá kerül, közel semleges pH-η csak kis szolubilizálás észlelhető.EN 201093 In aqueous solutions containing urea between ól mol / l and near neutral pH η. Only a partial solubilization of a relatively small amount of a substantially pure refractive body preparation with urea is achieved within a short time to a near neutral pH η. As urea concentration decreases, so does the degree of solubilization. As the urea concentration is well below 8 mol / liter, only a small solubilization can be observed at a near neutral pH η.
A hidrofób fehérjék általában csökkentett hőmérsékleten oldhatóbbak vizes oldatban. A jelen találmány szempontjából is úgy találtuk, hogy a szomatotropin-jellegű fehérjék szolubilizálása karbamiddal nagyobb mértékű csökkentett hőmérsékleten, tipikusan 4 °C hőmérsékleten, mint szobahőmérsékleten, tipikusan 20-25 °C hőmérsékleten. A nagyobb oldhatóságon túl a csökkentett hőmérsékleten végzett szolubilizálás a karbamidos oldat megnövekedett stabilitását és a proteáz aktivitás gátlását is eredményezi, amely proteáz-aktivitás jelen lehet a fénytöró testecske készítményben. Bár a fentebb leirt előnyös hatásokról bemutatjuk, hogy eredményesek, a műveleteket csökkentett hőmérsékleten végezve, a műveleti hőmérséklet nem kritikus a jelen találmány szempontjából. Lehet alkalmazni más hőmérsékleteket is, amig a fehérje nem denaturálódik irreverzibilisen. Legtöbb esetben azonban elvárható, hogy a hőmérséklet 25 °C alatt, de az oldat fagyáspontja fölött legyen, ez a legelőnyösebb, ezért ezt célszerű alkalmazni.Hydrophobic proteins are generally more soluble in aqueous solution at reduced temperatures. It has also been found, for the purposes of the present invention, that solubilization of somatotropin-like proteins with urea at a greater reduced temperature, typically 4 ° C, than at room temperature, typically 20-25 ° C. In addition to the higher solubility at reduced temperature, solubilization also results in increased stability of the urea solution and inhibition of protease activity that may be present in the refractive body composition. While the foregoing beneficial effects have been shown to be effective in performing operations at reduced temperature, the operating temperature is not critical to the present invention. Other temperatures may be used until the protein is irreversibly denatured. However, in most cases, temperatures below 25 ° C but above the freezing point of the solution are expected to be most preferred and should be used.
A jelen találmányban szomatotropin fehérje szignifikáns mennyiségének szolubilizálását valósítjuk meg vizes karbamidoldat pH-jának növelésével vagy csökkentésével. Bár az oldat pH-ja beállításának nem várt hatása a savasabb vagy lúgosabb pH felé nyilvánvalóvá válik az ez után következő példákból, az alkalikus pH beállítása az előnyösebb, mivel a helyreállítási lépés, pontosabban a redukált monomer oxidálása, bázissal katalizált. Az oldat pH-ját alkalikusabbá lehet tenni megfelelő bázis, mint pl. nátrium-hidroxid, hozzáadásával. Ahogy a fénytörő testecskék oldódnak, az oldat pH-ja csökkenhet, több bázis időszakos hozzáadását igényelve, hogy az alkalikus körülményeket fenntartsuk. A fénytöró testecskék teljesen szolubilizálódnak 60 mg/ml vagy nagyobb koncentrációknál. Ezen felül a szolubilizálást el lehet érni akár 1,0 mól/liter karbamid-koncentrációnál is. Az igényelt szolubilizálási körülmények (azaz karbamid-koncentráció, az alkalmazott karbamid-oldat mennyisége a fénytörő testecskék mennyiségéhez viszonyítva, az oldat pH-ja) függ a szóban forgó fénytöró testecske öszszetételétől és a szolubilizálandó fénytöró testecskék mennyiségétől.In the present invention, a significant amount of somatotropin protein is solubilized by increasing or decreasing the pH of an aqueous urea solution. Although the unexpected effect of adjusting the pH of the solution to the more acidic or alkaline pH is evident from the following examples, adjusting the alkaline pH is preferable because the recovery step, more particularly the oxidation of the reduced monomer, is catalyzed by a base. The pH of the solution may be made more alkaline by the use of a suitable base, e.g. with sodium hydroxide. As the refractive bodies dissolve, the pH of the solution may decrease, requiring the addition of several bases periodically to maintain alkaline conditions. Refractile bodies are completely solubilized at concentrations of 60 mg / ml or more. In addition, solubilization can be achieved at concentrations of up to 1.0 M urea. The solubilization conditions required (i.e. the urea concentration, the amount of urea solution used relative to the number of refractory bodies, and the pH of the solution) depend on the composition of the refractory body in question and the number of refractory bodies to be solubilized.
Bár a jelen találmány szempontjából nem kritikus, alkalmazhatunk megfelelő, kölcsönhatásba nem lépő pufferoló szereket, hogy 8 segítsük az oldatban a pH csökkenést jelentő változásokat a szolubilizálási lépések során. A megfelelő pufferoló szerek lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) pl. a következők: Trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán és etanol-amin. A trisz (hidroxi-raetil)-amino-metán, amelyet a továbbiakban trisz-nek nevezünk, előnyös, mivel olcsó és könnyen rendelkezésre áll. A trisz koncentrációja 10 és 90 mmól/liter között úgy tűnik, hogy ezignifikánsan nem befolyásolja a szomatotropin kitermelését. Egy frissen készített 50 mmól/literes trisz-oldat pH-ja mintegy 11,5. A trisz azonban, 4 °C hőmérsékleten 8,8 pK-val, csupán gyenge pufferoló kapacitással rendelkezik ennél a magas pH-nál. 40 és 60 mmól/liter közti trisz-koncentráció előnyös, hogy minimumra csökkentsük a trisz-felhasználást, miközben mégis fenntartunk bizonyos pufferoló kapacitást.Although not critical to the present invention, suitable, non-interacting buffering agents may be used to assist the solution in reducing the pH of the solution during the solubilization steps. Suitable buffering agents include, but are not limited to, e.g. include Tris-hydroxymethylaminomethane and ethanolamine. Tris (hydroxyethyl) aminomethane, hereinafter referred to as tris, is advantageous because it is inexpensive and readily available. Tris concentrations between 10 and 90 mmol / l appear to have no significant effect on somatotropin yield. A freshly prepared 50 mM Tris solution has a pH of about 11.5. However, Tris at 8.8 pK only has a weak buffering capacity at this high pH. Tris concentrations between 40 and 60 mM are advantageous to minimize the use of tris while maintaining a certain buffering capacity.
Ha a szomatotropin a fénytörő testecskékben aggregéit és/vagy oxidált formában van jelen, előnyös exogén redukálószert, pl. ű-merkapto-etanolt vagy 1,4-ditio-treitolt alkalmazni a vizes karbamid-oldatban, hogy megelőzzük az intramolekuláris és intermolekuláris diszulfid-kötések hasadását. Ha ilyen nem megfelelően .göngyölt' monomer vagy aggregéit szomatotropin van jelen, redukáló ágens jelenléte tipikusan növeli a biológiailag aktív szomatotropin kinyerését. Ügy találtuk, hogy a redukáló ágens és a szulfhidril csoportok együtt oxidálódhatnak a karbamid-oldatban, jó kitermeléssel adva a korrekt módon oxidált monomer szomatotropint, és nem szükséges feltétlenül eltávolítani ezeket a redukáló ágenseket a szóban forgó szomatotropin oxidációja előtt. Az E. coli gazdasejtben kifejezett N-metionil-bovin szomatotropin és N-metionil-porcin szomatotropin esetében úgy találtuk, hogy a fehérje a fénytöró testecskékben lényegében redukált formában van jelen (diszulfidkötések nélkül). Ezáltal ezeknél a készítményeknél a redukáló reagensek alkalmazása szükségtelen.When somatotropin is present in aggregates and / or in oxidized form in refractive bodies, an exogenous reducing agent, e.g. use of γ-mercaptoethanol or 1,4-dithiothreitol in aqueous urea solution to prevent cleavage of intramolecular and intermolecular disulfide bonds. If such a misfolded monomer or aggregated somatotropin is present, the presence of a reducing agent will typically increase the recovery of the biologically active somatotropin. It has been found that the reducing agent and the sulfhydryl groups can be oxidized together in the urea solution in good yield to give the correctly oxidized monomeric somatotropin, and it is not necessary to remove these reducing agents before the oxidation of said somatotropin. In the case of N-methionyl bovine somatotropin and N-methionyl porcine somatotropin expressed in E. coli host cells, the protein was found to be in substantially reduced form (without disulfide bonds) in refractive bodies. Thus, the use of reducing agents in these formulations is unnecessary.
A jelen eljárás egy másik szempontja szerint továbbá azt találtuk, hogy amikor szolubilizálunk, az ilyen szomatotropinok könnyen transzformálódnak natív formájukká. Natív formájukban a szomatotropinok két intramolekuláris diszulfid-hidat tartalmaznak négy cisztein-győk között. Nem szerencsés . módon amikor a redukált formából elvégezzük az oxidálást, a ciszteingyökök kombinálódhatnak a két intramolekuláris kötés képzése közben, és az intramolekuláris kötések három lehetséges útja közül csupán egy kombináció . határozza meg a natív formát. Hasonlóképpen az egyik szomatotropin molekulából származó cisztein-gyökók diszulfid-hidakat képezhetnek egy másik molekulából származó cisztein-gyókökkel dimereket, trimereket és magasabb oligomereket képezve. A korrekt módon kialakult monomerek arányát a nem korrekt módon kialakult monomerekhez és oligomerek-713In another aspect of the present invention, it has also been found that when solubilized, such somatotropins are readily transformed into their native form. In their native form, somatotropins contain two intramolecular disulfide bridges between four cysteine residues. Not lucky . Thus, when oxidation of the reduced form is performed, the cysteine residues may combine to form the two intramolecular bonds, and only one of the three possible routes of the intramolecular bonds. determine the native form. Similarly, cysteine residues from one somatotropin molecule can form disulfide bridges with cysteine residues from another molecule to form dimers, trimers and higher oligomers. The ratio of correctly formed monomers to incorrectly formed monomers and oligomers-713
HU 201093 Β hez viszonyítva befolyásolják azok a körülmények, amelyek között a szomatotropin fehérjét .kigöngyöljük' és oxidáljuk.The conditions under which the somatotropin protein is "unwound" and oxidized are influenced by EN 201093.
A jelen felfedezés előtt az volt az állandó biokémiai gyakorlat, hogy amikor helyreállították a fehérjét, átvitték a fehérjét a denaturáló oldatból (azaz a kaotróp oldatból) valamilyen elfogadható puffer-oldatba, pl. nátrium-hidrogén-karbonát oldatba a szóban forgó fehérjének megfelelő pH-nál valamilyen redukálószer jelenlétében lásd: Stryer: Biochemistry, 32-35 oldal, kiadó: W.H. Freeman and Company (2. kiadás, 1981); Bewley és munkatársai: .Humán Pituarity Growth Hormoné* - The Reduction and Reoxidation of the Hormoné (.Emberi hipofízis növekedési hormon* - A hormon redukciója és re-oxidációja). Archives of Biochemistry and Biophysics, 138, 338-346 (1970). Az alkalmazott pufferoldat térfogata olyan volt, hogy a fehérje-koncentráció egészen alacsony, általábanPrior to the present discovery, it was a constant biochemical practice that, when protein was restored, the protein was transferred from a denaturing solution (i.e., a chaotropic solution) to an acceptable buffer solution, e.g. in sodium bicarbonate solution in the presence of a reducing agent at a pH corresponding to the protein in question, see Stryer, Biochemistry, pp. 32-35, W.H. Freeman and Company (2nd edition, 1981); Bewley et al., Human Pituarity Growth Hormone * - Reduction and Reoxidation of Human Pituitary Growth Hormone *. Archives of Biochemistry and Biophysics, 138, 338-346 (1970). The volume of buffer used was such that the protein concentration was quite low, generally
1,5 mg/ml legyen. A fehérje oxidálását azután a levegőnek való kitevéssel hajtották végre.1.5 mg / ml. Oxidation of the protein was then performed by exposure to air.
A diszulfid kötések kialakítását fehérjékben olyan módon is javasolják, hogy bázissal katalizált szabad-gyökös mechanizmussal történjék, amint ezt a March in Adv. Organic Chemistry című kiadványban (McGraw Hill, 1977) leírták. Mivel az oxidációs lépés bázissal katalizált, előnyösen alkalikus pH-nál hajtják végre. Bár a diszulfid - hidakat képző oxidációs reakció 7-nél nagyobb pH-nál végbemegy, a műveleti pH előnyösen a fehérje szulfhidril-csoportja pH-ja (~8,4) fölött legyen. Pontosabban a műveleti pH 9 és 12 között előnyös. Ha puffért használunk, trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán az előnyös puffer.The formation of disulfide bonds in proteins is also suggested to be carried out by a base-catalyzed free-radical mechanism as described in March in Adv. Organic Chemistry (McGraw Hill, 1977). Since the oxidation step is base catalyzed, it is preferably carried out at an alkaline pH. Although the oxidation reaction to produce disulfide bridges occurs at a pH greater than 7, the process pH is preferably above the pH of the sulfhydryl group of the protein (~ 8.4). More specifically, an operating pH of between 9 and 12 is preferred. When a buffer is used, tris (hydroxymethyl) aminomethane is the preferred buffer.
A korábbi gyakorlattal ellentétben azt találtuk, hogy a szomatotropinokat hatásosan helyre lehet állítani, miután már feloldottuk karbamid- vagy dimetil-szulfon-oldatban, az oldatot valamely enyhe oxidálószerrel, pl. hidrogén-peroxiddal vagy levegővel érintkezésbe hozva annyi ideig, hogy a szulfhidril -csoportok oxidálódjanak, intramolekuláris diszulfid-kötéseket képezve. Azt találtuk továbbá, hogy a helyreállítást akár 30 mg/ml Ezomatotropin-koncentcációnál is végrehajthatjuk, de előnyösen azonban kevesebb, mint 30 mg/ml és még előnyösebben kevesebb, mint 20 mg/ml koncentrációnál. A helyreállítás hatásos módon megy végbe a gazdasejt szennyező fehérjéinek jelenlétében is redukáló reagensek jelenlétében vagy távollétében egyaránt. A szomatotropin monomer mennyiségét bármilyen alkalmas biokémiai technikával meghatározhatjuk, mint pl. radioimmunassay-val (RIA), méret-kizárásos kromatográfiával, és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC).In contrast to prior art, it has been found that somatotropins can be effectively reconstituted after having been dissolved in a solution of urea or dimethylsulfone with a mild oxidizing agent, e.g. by contact with hydrogen peroxide or air for such time that the sulfhydryl groups are oxidized to form intramolecular disulfide bonds. It has further been found that recovery can be performed at concentrations of up to 30 mg / ml Esomatotropin, but preferably below 30 mg / ml and more preferably below 20 mg / ml. Recovery is effected efficiently in the presence or absence of reducing reagents in the presence of contaminating proteins of the host cell. The amount of somatotropin monomer may be determined by any suitable biochemical technique, such as radioimmunassay (RIA), size exclusion chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC).
Exogén redukáló ágensek távollétében, mint pl. 0-merkapto-etanol és 1,4-ditiotreitol, vagy oxigén kizárására tett óvintézkedések nélkül a szomatotropin molekula oxidálása a szolubilizáláskor elkezdődik. A karbamid koncentrációja, ügy tűnik, a leginkább befolyásoló paraméter, amely a biológiailag aktiv szomatotropin monomer kitermelésére hat. Valójában az oxidáció lényegében bármilyen karbamid-koncentrációnál végbemegy, amelynél a szomatotropin oldott állapotban marad. Megérthető, hogy amikor szolubilizáltuk, a szomatotropin csökkentett hőmérsékleten, 1 mól/liter vagy kisebb karbamid-koncentrációnál oldatban marad. Ezáltal hogy maximumra emeljük az ilyen monomerek termelését, a karbamid-koncentrációtól át kell állítani a szolubilizálási lépésben felhasznált koncentrációról arra a koncentrációra, amelyet a helyreállítási lépéshez optimálisnak határozunk meg. A szóban forgó optimális koncentráció szükségszerűen függ az adott szomatotropintól. Amikor a szolubilizálás után a karbamid-koncentrációt kívánatos csökkenteni, a hígítást desztillált viz vagy pufferoldat hozzáadásával lehet végrehajtani. Lehet választani redukálószerek alkalmazását is, hogy enyhitsük a gyors akció szükségességét a karbamid-koncentráció beállítására. Redukáló anyag távollétében a monomer-kitermelés MBS-nél csökken, eltelt óránként mintegy 5 süly%-al a karbamid-koncentráció hígítása előtt, amikor 7,5 mól/literee karbamid-oldatot alkalmazunk a szoiubilizáláshoz. (MBS=N-metionil-bovin szomatotropin).In the absence of exogenous reducing agents, e.g. Without precautions to exclude 0-mercaptoethanol and 1,4-dithiothreitol or oxygen, the oxidation of the somatotropin molecule will begin upon solubilization. Concentration of urea seems to be the most influential parameter affecting the yield of the biologically active somatotropin monomer. In fact, the oxidation occurs at essentially any concentration of urea in which the somatotropin remains in solution. It will be appreciated that when solubilized, somatotropin remains in solution at reduced temperature, at concentrations of 1 molar or less. Thus, in order to maximize the production of such monomers, the urea concentration must be changed from the concentration used in the solubilization step to the concentration that is determined to be optimal for the recovery step. The optimal concentration in question will necessarily depend on the particular somatotropin. When it is desired to reduce the urea concentration after solubilization, dilution can be accomplished by the addition of distilled water or buffer. Alternatively, reducing agents may be selected to alleviate the need for rapid action to adjust the urea concentration. In the absence of a reducing agent, the monomer yield at MBS decreases by about 5% by weight per hour before diluting the urea concentration when 7.5 mol / l urea solution is used for solubilization. (MBS = N-methionylbovin somatotropin).
N-metionil-bovin szomatotropin esetében a helyreállítás során 4 mól/liter és 5 mól/liter közti karbamid-koncentráció az előnyös. A helyreállítás mintegy 4,5 mól/liternél tűnik optimálisnak, csökkentett monomer-kinyeréssel és megnövekedett aggregátum-képződéssel mind az ennél kisebb, mind az ennél nagyobb karbamid-koncentrációknál. Ennek megfelelően ha 7,5 mól/liter karbamidot alkalmazunk a szolubilizációnál, előnyös a gyors hígítás desztillált vízzel vagy megfelelő pufferrel, mint pl. trisz-szel 4,5 mól/liter karbamid-koncentrációra, ha redukálószer nincs jelen, hogy minimálisra csökkentsük a nagyobb, nem optimális karbamid-koncentrációt.In the case of N-methionylbovine somatotropin, a urea concentration of 4 mol / l to 5 mol / l is preferred during the recovery. Recovery seems to be optimal at about 4.5 mol / liter, with reduced monomer recovery and increased aggregate formation at both lower and higher urea concentrations. Accordingly, when 7.5 M urea is used for solubilization, rapid dilution with distilled water or a suitable buffer, such as, for example, is preferred. Tris to a concentration of 4.5 M urea when no reducing agent is present to minimize the higher, non-optimal urea concentration.
N-metionil porcin szomatotropin esetében, amely az MBS-től 18 aminosavban különbözik, a reaktiválás során a 2,5 mól/liter ésIn the case of N-methionyl porcine somatotropin, which differs from MBS by 18 amino acids, reactivation of 2.5 mol / l and
3,5 mól/liter közti karbamid-koncentrációk az előnyösek. A helyreállítás 3 mól/liter karbamid-koncentrációnál tűnik optimálisnak, csökkentett monomer-kinyeréssel és megnövekedett aggregátum-képződéssel mind az ennél kisebb, mind az ennél nagyobb karbamid-koncentrációknál. Hasonlóképpen a gyors hígítás 7,5 mól/liter karbamid-koncentrációról 3 mól/literre jó keveréssel megfelelő pufferral, pl. trisz-szel előnyös, ha redukálőszer nincs jelen, hogy minimálisra csökkentsük a nagyobb, nem optimális karbamid-koncentrációt.Concentrations of urea of 3.5 mol / l are preferred. Recovery appears to be optimal at concentrations of 3M urea with reduced monomer recovery and increased aggregate formation at both lower and higher urea concentrations. Similarly, rapid dilution from 7.5 mol / liter urea to 3 mol / liter with good mixing, e.g. with tris, it is preferred that no reducing agent is present to minimize the higher, non-optimal urea concentration.
-815 HU 201093 Β 16-815 HU 201093 Β 16
A fentebb leirt módon szolubilizált és helyreállított szomatotropinokat ezután tisztítottuk standard kromatográfiás technikákkal. A bioaktivitást a patkány növekedési biológiai vizsgálatokra adott pozitív válasz jelezte. Ebben a vizsgálatban a heterológ szomatotropin bioaktivitását becsüljük fel különféle ismert szomatotropin-anyagokkal (pl. bovin- vagy poréin hipofízis szomatotropinnal) összehasonlítva, a hipofízis-irtott patkányok által a váltakozó mennyiségű beadott anyagra mutatott súlygyarapodás mennyiségeit összevetve. A testsúlynövekedés regressziós meredekségeit a szóban forgó szomatotropin anyag adagjaival szemben összehasonlítjuk az ismert standarddal (azaz hipofízis-eredetű anyaggal) és kiszámítjuk a relatív bioaktivitást U(egység)/mg növekedési hormon formában a heterológ szomatotropin anyaghoz.The somatotropins solubilized and reconstituted as described above were then purified by standard chromatographic techniques. Bioactivity was indicated by a positive response to rat growth bioassays. In this assay, the bioactivity of the heterologous somatotropin is estimated by comparing the amount of weight gain exhibited by the pituitary-depleted rats with various amounts of somatotropin known in the art (e.g., bovine or porane pituitary somatotropin). The regression slopes of body weight gain versus doses of said somatotropin material are compared to a known standard (i.e., pituitary-derived material) and the relative bioactivity in U (unit) / mg growth hormone is calculated for the heterologous somatotropin material.
A jelen találmány által körvonalazott eljárás szerint szolubilizált és helyreállított, majd ezt követően tisztított N-metionil-bovin szomatotropint ez után tejelő teheneknek adtuk be. Azok a tehenek, amelyeknek ilyen készítményt adtunk be, 10-40 súly%-kal több tejet termeltek, mint a kontroll állatok, lásd Eppard és munkatársai: .The Effect of Long-term Administration of Growth Hormoné on Performance of Lactating Dairy Cows (A növekedési hormon hosszú időn át végzett bedásának hatása a tejelő tehenek tejképződési teljesítményére)· Proceedings of the 1984 Cornell Nutrition Conference.The N-methionylbovine somatotropin solubilized and reconstituted according to the process outlined in the present invention and subsequently purified is then administered to dairy cows. Cows to which such a formulation was administered produced 10-40% more milk than control animals, see Eppard et al., The Effect of Long-Term Administration of Growth Hormone on Lactating Dairy Cows (A Effect of Long-Term Growth Hormone Insertion on Milking Performance of Dairy Cows) Proceedings of the 1984 Cornell Nutrition Conference.
Az ez után következő példák a jelen találmány gyakorlatának jobb megvilágítását foglalják magukban. Meg kell érteni azonban, hogy ezek a példák csak az illusztráció céljait szolgálják, és semmiképpen sem szándékoznak korlátozni a jelen találmány oltalmi körét.The following examples include a better illustration of the practice of the present invention. It should be understood, however, that these examples are provided for purposes of illustration only and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.
1. példaExample 1
A jelen találmányt E. coli-ban kifejezett N-metionil-bovin szomatotropin (MBS) szolubilizálásával demonstráljuk, az E. coliban való kifejeződést általában leírták Seeburg és munkatársai: DNA 2(1), 37-45 (1983). Az egyes lépések részleteit megtalálhatjuk a következő irodalmi helyeken: Goeddel és munkatársai: Natúré, 281 (1979 október); DeBoert és munkatársai; Promoters: Structure and Function, 462-481, Kiadó: Praeger Scientific Publishing Co, (1982); és Miozzari és munkatársai: J. Bacteriology, 133, 1457-1466 (1978). A kinyert sejteket kétszeres átengedéssel zúzzuk össze Manton-Gualin homogenizátoron keresztül. Az MBS-t tartalmazó fénytörő testecskéket kiülepitjük a homogenizált oldatból· kis sebességű centrifugálással. A felülúszót elöntjük, a fónytörő testecskéket újra szuszpendáljuk, mossuk, és újra üledékbe viszszük. A felülúszót ismét elöntjük, amikor is tThe present invention is demonstrated by solubilizing N-methionyl bovine somatotropin (MBS) expressed in E. coli, expression in E. coli generally described by Seeburg et al., 1983, DNA 2 (1), 37-45. Details of each step can be found in Goeddel et al., Natura, 281 (October 1979); DeBoert et al; Promoters: Structure and Function, 462-481, published by Praeger Scientific Publishing Co. (1982); and Miozzari et al., J. Bacteriology, 133, 1457-1466 (1978). The harvested cells were crushed in double pass through a Manton-Gualin homogenizer. Refractile bodies containing MBS are pelleted from the homogenized solution by low speed centrifugation. The supernatant is discarded, the supernatants are resuspended, washed and re-pelleted. The supernatant was discarded again when t
1 lényegében tiszta fénytörő testecske készítmény marad vissza. 1 substantially pure refractive body composition remains.
A fentebb leírt módon készített fénytörő testecskéket különböző koncentrációjú kar5 bamid-oldatoknak tesszük ki, különböző pH szinteken 25 °C hőmérsékleten. Minden pufferolt oldat 100 mmól/liter trisz-bázist tartalmaz. A pH beállítását HC1 hozzáadásával hajtjuk végre. A végső fénytörő testecske kon10 centráció mintegy 4 mg/ml oldat. A feloldódás mértékét spektrofotometriásán határozzuk meg, feltételezve, hogy a fénytörő testecskék teljesen fehérje-jellegűek, és 0,68 extinkciós együtthatót (ε) alkalmazva 277 nm-nél ésThe refractive bodies prepared as described above are exposed to various concentrations of urea bamide solutions at various pH levels at 25 ° C. Each buffered solution contains 100 mM Tris base. The pH adjustment is performed by addition of HCl. The final refractive body concentration was about 4 mg / ml solution. The degree of dissolution is determined spectrophotometrically, assuming that the refractive bodies are completely proteinaceous and using an extinction coefficient of 0.68 (ε) at 277 nm and
1 cm fényútnál, 1 mg/ml fehérje-koncentrációt ennek véve. A kiindulási koncentrációt spektrofotometriásán határozzuk meg és teljesen oldott mintánál. A fentebb leirt kísérlet eredményeit az 1. ábrában mutatjuk be. Ezek az adatok is alátámasztják a nem várt felfedezést, hogy a pH beállítása alkalikus körülmények közt lényegesen megnöveli a szolubilizálás mértékét.1 cm light path, at a protein concentration of 1 mg / ml. The initial concentration was determined spectrophotometrically and in a completely dissolved sample. The results of the experiment described above are shown in Figure 1. These data also support the unexpected finding that pH adjustment under alkaline conditions significantly increases the degree of solubilization.
2. példaExample 2
Az 1. példában leírt folyamatot követjük azzal a különbséggel, hogy a hőmérsékletetThe process described in Example 1 is followed except that the temperature
4 °C hőmérsékleten tartjuk fenn és a pH-t beállítjuk mind savas, mind alkalikus szintekre. Amint az 1. példánál, minden pufferolt oldat 100 mmól/liter triszbázist tartalmaz. A pH beállítást savas szintekre ecetsav hozzá35 adáséval hajtjuk végre. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 2. ábrában mutatjuk be. Az 1. és 2. ábrákat összevetve állandó karbamid-koncentrációnál és adott pH-nál azt mutatjuk ki, hogy a szolubilizálódás növekedé40 sét kapjuk a csökkentett hőmérsékleten (4 °C) a szobahőmérséklethez (25 °C) viszonyítva.Maintain at 4 ° C and adjust the pH to both acidic and alkaline levels. As in Example 1, each buffered solution contains 100 mM Tris base. The pH adjustment to acidic levels is accomplished by addition of acetic acid. The results of this experiment are shown in Figure 2. Comparison of Figures 1 and 2 at constant urea concentration and pH indicates that solubilization is increased at reduced temperature (4 ° C) relative to room temperature (25 ° C).
.A ' összehasonlító példa. 'Comparative example
MBS-t tartalmazó fénytörő testecskéket készítünk az 1. példában leirt módon. A fénytörő testecskéket 10 mól/liter karbamid50 -oldattal keverjük össze pH beállítás nélkül, úgy, hogy a végsó fénytörő testecske koncentráció mintegy 5,0 mg/ml legyen. Az oldatot összekeverjük és hagyjuk kiegyensúlyozódni egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten. A szolubilizálódás mértékét csupán 2,9 mg/ml-nek határozzuk meg a fentebb leirt spektrofotometriás módszerrel. A fénytörő testecskék kiindulási koncentrációját ahhoz elegendő karbamid oldat hozzáadásával határozzuk meg, hogy a fénytörő testecskék teljesen feloldódjanak, a teljesen feloldott oldatot spektrofotometriásán mérve és megfelelő hígításra beállítva.Refractile bodies containing MBS were prepared as described in Example 1. The refractive bodies were mixed with 10 M urea 50 without adjusting the pH to a final refractive body concentration of about 5.0 mg / mL. The solution was stirred and allowed to equilibrate overnight at 4 ° C. The degree of solubilization was determined to be only 2.9 mg / ml by the spectrophotometric method described above. The initial concentration of the refractile bodies is determined by adding sufficient urea solution to dissolve the refractile bodies completely, measured spectrophotometrically and adjusted to the appropriate dilution.
-9HU 201093 B .Β ’ összehasonlító példa-9EN 201093 B .Β 'Comparative Example
Az 1. példában leírt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytoró testecskéket vizes, 8,0 mól/literes karbamid-oldattal keverünk össze pH beállítás nélkül, ügy, hogy a végső fénytörő testecske koncentráció mintegy 5,0 mg/ml legyen. Az oldatot összekeverjük és hagyjuk kiegyensúlyozódni egy éjszakán 4 °C hőmérsékleten. A szolubilizálódás mértékét 2,4 mg/ml-nek határozzuk meg a fentebb leirt spektrofotometriás módszerrel. A fénytórő testecskék kiidulási koncentrációját ahhoz elegendő karbamidoldat hozzáadásával határozzuk meg, hogy a fénytörő testecskék teljesen feloldódjanak, a teljesen feloldott oldatot spektrofotometriásán mérve és megfelelő hígításra beállítva.The MBS-containing fluorescent bodies prepared as described in Example 1 were mixed with an aqueous 8.0 M urea solution without adjusting the pH to a final refractive body concentration of about 5.0 mg / ml. The solution was stirred and allowed to equilibrate overnight at 4 ° C. The degree of solubilization was determined to be 2.4 mg / ml by the spectrophotometric method described above. The baseline concentration of refractive matter is determined by adding sufficient urea solution to completely dissolve the refractive matter, measured by spectrophotometry and adjusted to the appropriate dilution.
3. példaExample 3
Az 1. példában leírt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytörő testecskéket öszszekeverünk nem pufferolt, vizes 4,5 mól/literes karbamid oldattal olyan módon, hogy a fénytörő testecske koncentráció mintegy 66 mg/ml légyen. Az oldt pH-ját 7-ről 11-re állítjuk be hig NaOH-val. Az oldat kitisztulása jelzi a teljes szolubilizálást. A fénytörö testecske koncentrációt 66 mg/ml-nek az 1. példában leirt spektrofotometriás elemzéssel határozzuk meg.Refractive bodies containing MBS prepared as described in Example 1 were mixed with non-buffered aqueous 4.5 M urea so that the refractive body concentration was about 66 mg / mL. The pH of the solution was adjusted from 7 to 11 with dilute NaOH. The clearing of the solution indicates complete solubilization. Refractive body concentration was determined to be 66 mg / ml by spectrophotometric analysis as described in Example 1.
4. példaExample 4
Az 1. példában leírt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytörő testecskéket szolubilizálunk vizes. 7,5 mól/literes karbamid-oldatban, amely 100 mmól/liter íriszt tartalmaz 10,5 pH-nál. A karbamid-koncentrációt különböző szintekre állítjuk be 100 mmöl/literes írisz hozzáadásával és a teljes fehérjekoncentrációt mintegy 1 mg/ml értéken tartjuk (egy teljesen feloldott minta spektrofotometriás elemzésével meghatározva) a megfelelő karbamid oldat bizonyos térfogatának hozzáadásával. A feloldott MBS-t oxidálódni engedjük az oldatot levegő hatásának téve ki, keverés körülményei között 24 órás időtartamra. Az eredményeket grafikusan a 3. ábrában mutatjuk be. Az MBS monomer kitermelést mint a teljes MBS tartalom súlyszázalékát jelezzük. Amint a 3. ábrából látható, optimális helyreállítási hatékonyságot nyertünk mintegy 4,5 mól/liter karbamid-koncentrációnál.Refractive bodies containing MBS prepared as described in Example 1 are solubilized in water. In a 7.5 mol / l urea solution containing 100 mmol / l iris at pH 10.5. The urea concentration is adjusted to various levels by the addition of 100 mM iris and the total protein concentration is maintained at about 1 mg / ml (as determined by spectrophotometric analysis of a completely dissolved sample) by adding a certain volume of the appropriate urea solution. The dissolved MBS is allowed to oxidize by exposing the solution to air for 24 hours under agitation. The results are shown graphically in Figure 3. MBS monomer yield is expressed as weight percent of total MBS content. As shown in Figure 3, optimum recovery efficiency was obtained at a urea concentration of about 4.5 mol / liter.
5. példaExample 5
A 4. példában leírt folyamatot követve MBS-t tartalmazó fénytörö testecskéket szolubilizálunk vizes, 7,5 mól/literes karbamid-oldatban, amely trisz-re 100 mmól/literes, pH 10,5-nél. A szolubilizálást követően az oldatot 4,5 mól/liter karbamid-tartalomra hígítjuk 100 mmól/literes trisz-oldattal és a pH-t különböző szintekre állítjuk be 10,5 és 8,5 közé. Ezeket az egyedi kísérleti tételeket oxidálódni hagyjuk olyan módon, hogy levegő hatásának tesszük ki keverés körülményei között 24 órán át. Az MBS monomer és oligomer tartalmat HPLC-vel meghatározzuk. Bár az eredmények viszonylag lapos választ jeleznek a helyreállítási hatékonyságban az oldat pH-jával szemben az oxidálás során, az irányzat az, hogy a nagyobb pH-knál nagyobb a hatékonyság. Ezen túl a bázissal katalizált oxidáció gyorsabban halad előre az alkalikusabb pH-knál.Following the procedure described in Example 4, refractile bodies containing MBS were solubilized in aqueous 7.5 M urea at 100 mM Tris at pH 10.5. After solubilization, the solution is diluted to 4.5 M urea with 100 mM Tris and the pH is adjusted to 10.5 to 8.5 for various levels. These individual experimental batches are allowed to oxidize by exposure to air under stirring conditions for 24 hours. The MBS monomer and oligomer contents were determined by HPLC. Although the results indicate a relatively flat response in recovery efficiency against the pH of the solution during oxidation, the tendency is that higher pH results in higher efficiency. In addition, base-catalyzed oxidation proceeds faster than alkaline pH.
6. példaExample 6
Mintegy 150 ml, 1. példában leirt módon készített fénytörö testecske készítményt adunk mintegy 850 ml vizes, 5,3 mól/literes karbamid-oldathoz 4 °C hőmérsékleten. Az igy kialakult 4,5 möl/literes karbamid-oldatot pH 11 értékre állítjuk 50 súly%-os NaOH oldattal. A fénytörő testecskék teljesen feloldódnak, mintegy 12,4 mg/ml teljes MBS koncentrációt eredményezve. Az oldatot 4 °C hőmérsékleten kevertetjük egy éjszakán át, hogy oxidáljuk az MBS-t. Az oxidált oldat HPLC elemzése azt jelzi, hogy az MBS monomer kitermelés hatékonysága mintegy 80%.About 150 ml of the refractile body composition prepared as described in Example 1 is added to about 850 ml of an aqueous 5.3 M urea solution at 4 ° C. The resulting 4.5 M urea solution was adjusted to pH 11 with 50% NaOH. The refractive bodies are completely dissolved, resulting in a total MBS concentration of about 12.4 mg / ml. The solution was stirred at 4 ° C overnight to oxidize MBS. HPLC analysis of the oxidized solution indicates that the yield of MBS monomer is about 80%.
7. példaExample 7
N-metionil porcin szomatotropint (MPS) fejezünk ki E. coli-bán, az 1. példában felsorolt referenciák általános kitanításait alkalmazva. Az MPS-t tartalmazó fénytörő testecskék korábban leírt módszert alkalmazva végzett kinyerését követően ezeket 4 °C hőmérsékleten 7,5 mól/literes karbamid-oldatban szolubilizáljuk, amely 90 mmól/liter íriszt is tartalmaz (pH 11,0). Milliliterenként 113 mg (nedves súly) fénytörö testecske üledékét oldunk fel a fenti karbamid-oldatban. A mintákat 90 mmól/liter trisz-szel és/vagy karbamiddal hígítjuk, hogy 4,5 mól/liter és 2,0 mól/liter karbamid-koncentrációkat nyerjünk 4 mg/ml MPS-koncentrációval, a fénytörő testecske üledék nedves súlyára alapozva. A mintákat oxidálódni hagyjuk olyan módon, hogy egy éjszakán át levegőnek tesszük ki kevert körülmények között. A HPLC-vel végzett mérés 3 mól/liter karbamid-koncentrációnál jelez optimális MPS monomer kitermelést.N-methionyl porcine somatotropin (MPS) is expressed in E. coli using the general teachings of the references listed in Example 1. After the refraction of the MPS-containing refractive bodies was performed according to the procedure described above, they were solubilized at 4 ° C in 7.5 M urea containing 90 mM Iris (pH 11.0). 113 ml (wet weight) of refractory body pellet are dissolved in the above urea solution. Samples were diluted with 90 mM Tris and / or urea to obtain urea concentrations of 4.5 M and 2.0 M at a MPS concentration of 4 mg / mL based on the wet weight of the refractile body pellet. Samples were allowed to oxidize by exposing them to air overnight under stirring conditions. HPLC measurement indicates an optimum yield of MPS monomer at a concentration of 3 M urea.
-1019-1019
HU 201093 ΒHU 201093 Β
8. példaExample 8
A 7, példában körvonalazott eljárást követve MPS-t szolubilizálunk 4 °C hőmérsékleten vizes, 7,5 mól/literes karbamid oldatban, amely 90 mmól/liter triszt is tartalmaz (pH 11), három különböző koncentrációnál (20,40 és 80 mg üledék) nedves súly(/ml fenti karbamid oldat). Az oldatok mintáit 90 mmól/literes trisz és/vagy karbamid oldattal higitjuk olyan módon, hogy 3 mól/liter karbamid koncentrációt és 1 mg/ml MPS koncentrációt nyerjünk. A hígított MPS oldatokat levegő hatásénak tesszük ki kevert körülmények között 4 °C hőmérsékleten 56 órán át. A HPLC-vel végzett mérések az átlagos MPS monomer kitermelést 69 suly%-nak mutatják.Following the procedure outlined in Example 7, MPS is solubilized at 4 ° C in an aqueous 7.5 M urea solution containing 90 mM Tris (pH 11) at three different concentrations (20.40 and 80 mg pellet). ) wet weight (/ ml urea solution above). Samples of the solutions were diluted with 90 mM Tris and / or urea to give a 3 M urea concentration and a 1 mg / ml MPS concentration. Diluted MPS solutions were exposed to air under stirring conditions at 4 ° C for 56 hours. Measurements by HPLC show an average MPS monomer yield of 69% by weight.
9. példaExample 9
A é. példa szerinti eljárást követjük azzal a kivétellel, hogy a szolubilizálást és helyreállítást 0,1 mmól/liter 1,4-ditiotreitol jelenlétében hajtjuk végre. A HPLC-vel végzett mérések az átlagos MPS monomer kitermelést 66 súly%-nak mutatják.The É. The procedure of Example 1B is followed except that the solubilization and recovery is carried out in the presence of 0.1 mM 1,4-dithiothreitol. Measurements by HPLC show an average MPS monomer yield of 66% by weight.
10. példaExample 10
A BGH három változatát, nevezetesen az Ala-i-et, Ala-i Vali26-ot és Met-i Vali26-ot kifejezzük E. coli-ban a 704, 362 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (benyújtva 1985 február 22-én, bejelentő: Krivi, G.G., címe: Production of Proteins in Procaryotes (Fehérjék előállítása prokariótákban)] általában megadott eljárást követve; a fenti bejelentést ebbe a bejelentésbe hivatkozásként építjük be. A BGH változatokat szolubilizáljuk és helyreállítjuk, az 1. példában leírt általános eljárást követve.Three variants of BGH, namely Ala-i, Ala-Vali26 and Met-Vali26, are expressed in E. coli in U.S. Patent Application No. 704, 362, filed February 22, 1985, Applicant Krivi, GG, Production of Proteins in Procaryotes], which is incorporated herein by reference, BGH variants are solubilized and reconstituted following the general procedure described in Example 1.
A megfelelő BGH változatokat tartalmazó fénytörő testecskéket az 1. példában leirt módon nyerjük ki. Mintegy 300 g (nedves súly) fény törő testecskét szuszpendálunk vizben, hogy 1 liter zagyot nyerjünk. Ezt a zagyot mintegy 5 liter 9 mól/literes karbamid-oldathoz adjuk, amely 108 mmól/liter triszt is tartalmaz, így olyan szolubilizáló oldathoz jutunk, amely a megfelelő BGH változatot 7,5 mól/liter karbamidot és 90 mmól/liter triszt tartalmazó oldatban tartalmazzaRefractile bodies containing the appropriate BGH variants were recovered as described in Example 1. About 300 g (wet weight) of light refracting body is suspended in water to produce 1 liter of slurry. This slurry was added to about 5 liters of a 9M urea solution containing 108 mM Tris to give a solubilization solution of the corresponding BGH in 7.5M urea and 90 mM Tris. included
10,5 pH-nál, 4 °C hőmérsékleten. A teljes szolubilizálás néhány perces keverés alatt bekövetkezik. 4 liter hideg vizet adunk lassan a keverékhez, hogy kialakítsuk a helyreállító oldatot, amely a megfelelő BGH változatot 4,5 mól/liter karbamidot és 54 mmól/liter triszt tartalmazó oldatban tartalmazzaPH 10.5 at 4 ° C. Complete solubilization occurs with stirring for a few minutes. Slowly add 4 liters of cold water to the mixture to form a recovery solution containing the appropriate BGH in a solution containing 4.5 M urea and 54 M Tris
10,5 pH^nál és 4 °C hőmérsékleten. Az oldatot kevertetjük és a megfelelő BGH változatot oxidálódni hagyjuk, az old ltot levegő hatásának kitéve mintegy 48 órán át. Az oxidált BGH-változat oldatot HPLC-vel mérjük, mindhárom BGH változatnál mintegy 60-70 súly% monomer-kitermelést mutatva ki.At pH 10.5 and at 4 ° C. The solution is stirred and the corresponding BGH variant is allowed to oxidize by exposing the solution to air for about 48 hours. The oxidized BGH variant solution was measured by HPLC, showing a monomer yield of about 60-70% by weight for each of the three BGH variants.
11. példaExample 11
A fentebb leírtak szerint nyert ezomatotropin fehérje szerkezeti homológiáját meghatározzuk a természetes hipofízis szomatotropin szerkezetéhez cirkuláris dikroizmussal, amint ezt Bewley leírta: Recent Progress in Hormoné Research, 35. kötet, 155-210 oldal (Academic Press). Pontosabban az MBS-t és a BGH Ala-i változatát hasonlítjuk össze a bovin hipofízis szomatotropinnal. A mintákat feloldjuk 50 mmól/literes nétrium-bikarbonát oldatban (pH 9,5), és a fentebb leírt technikával elemezzük. Ennek az elemzésnek az eredményei igazolják, hogy az itt leírt módon készített rekombináns szomatotropin a helyreállítás után természetes konformációban van.The structural homology of the esomatotropin protein obtained as described above is determined by the circular dichroism of the structure of the natural pituitary somatotropin as described by Bewley in Recent Progress in Hormones Research, Vol. 35, pp. 155-210 (Academic Press). Specifically, MBS and the Ala-I version of BGH are compared with the bovine pituitary somatotropin. Samples were dissolved in 50 mM sodium bicarbonate (pH 9.5) and analyzed as described above. The results of this analysis confirm that the recombinant somatotropin prepared as described herein is in natural conformation after reconstitution.
12. példaExample 12
Az 1. példában leírt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytöró' testecskéket ószszekeverünk nem pufferolt, vizes 1,0 raól/literes karbamid-oldattal 4 °C hőmérsékleten. A pH-t nátrium-hidroxiddal állítjuk be és tartjuk fenn 12,1 értéken. Az oldat feltisztulása jelzi a teljes szolubilizálódást. A fénytöró testecske koncentrációt mintegy 10 mg/ml-nek határozzuk meg spektrofotometriás elemzéssel, amint ezt az 1. példában leirtuk.Refractive bodies containing MBS prepared as described in Example 1 were mixed with unbuffered aqueous 1.0 U urea solution at 4 ° C. The pH was adjusted with sodium hydroxide and maintained at 12.1. Clearing of the solution indicates complete solubilization. The refractive body concentration was determined to be about 10 mg / ml by spectrophotometric analysis as described in Example 1.
13. példaExample 13
Az 1. példában leirt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytöró testecskéket feloldunk 3,0 mól/literes dimetil-szulfon-oldatban, 28 °C hőmérsékleten, pH=ll,8-nál és 2 mg/ml MBS koncentrációnál. A feloldott MBS oxidációja levegőn olyan oxidált MBS-t eredményez, amely lényegében nem különbözik attól, amelyet 4,5 mól/liter karbamidot, pH=ll,3-at (50 mmól/liter trisz) alkalmazva nyerünk 5 °C hőmérsékleten, amint ezt az intermolekuláris kötések mértéke alapján megítéljük.Refractive bodies containing MBS prepared as described in Example 1 were dissolved in 3.0 M dimethylsulfone at 28 ° C, pH 11, 8 and 2 mg / ml MBS. Oxidation of dissolved MBS in air results in oxidized MBS that is not substantially different from that obtained using 4.5 M urea, pH 11.3 (50 mM Tris) at 5 ° C as judged by the degree of intermolecular bonding.
14. példaExample 14
Az 1. példában leirt módon készitett, MBS-tartalmú fénytöró testecskéket feloldunk 3,0 mól/literes, vizes karbamid-oldatban, 4 °C hőmérsékleten, és 11,25 pH-értéken, melyet 10%-os nátrium-hidroxid-oldattal állítunk be. Az oldódás után 100 1 fenti oldathoz 2,2 1 0,0153 t%-os hidrogén-peroxid-oldatot adunk, és 30 órán át 4 °C hőmérsékleten tartjuk. Az MBS monomer kitermelése 80%.MBS-containing refractive bodies prepared as described in Example 1 were dissolved in 3.0 M aqueous urea solution at 4 ° C and pH 11.25 adjusted with 10% sodium hydroxide solution. in. After dissolution, 100 L of the above solution are added with 2.2 L of 0.0153 wt% hydrogen peroxide solution and kept at 4 ° C for 30 hours. The yield of MBS monomer is 80%.
Claims (17)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70434185A | 1985-02-22 | 1985-02-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT40140A HUT40140A (en) | 1986-11-28 |
| HU201093B true HU201093B (en) | 1990-09-28 |
Family
ID=24829071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU86741A HU201093B (en) | 1985-02-22 | 1986-02-21 | Process for solubilisation and recovery of somatotropin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU201093B (en) |
-
1986
- 1986-02-21 HU HU86741A patent/HU201093B/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT40140A (en) | 1986-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4652630A (en) | Method of somatotropin naturation | |
| JP2572963B2 (en) | Somatotropin solubilization and reconstitution | |
| US4731440A (en) | Method of somatotropin solubilization using dimethylsulfone and naturation | |
| CA2444480C (en) | Methods and compositions for production of recombinant peptides | |
| HU206375B (en) | Process for producing biologically active, stable somatotropins and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient | |
| JP2784232B2 (en) | New somatotropin | |
| US9505802B2 (en) | Method for protein isolation in anoxic conditions | |
| HU201093B (en) | Process for solubilisation and recovery of somatotropin | |
| US7659363B2 (en) | Process for the preparation of insulin or an insulin derivative in the presence of oxygen | |
| JPH06104070B2 (en) | Purification of somatotropin from transformed microorganisms. | |
| US4975529A (en) | Method of folding somatotropins | |
| EP0282318A2 (en) | Bovine growth hormone analogs | |
| EP0432419B1 (en) | Method for solubilization and naturation of somatotropins utilizing low urea concentration | |
| KR100327040B1 (en) | Process for the preparation of active somatotropin from inclusion bodies | |
| KR100487299B1 (en) | Method for solubilization and naturation of somatotropins | |
| JPS6318960B2 (en) | ||
| US5151501A (en) | Method for solubilization and naturation of somatotropins utilizing sulfolane | |
| EP0578472A2 (en) | A process for recovering peptides expressed as fusion proteins | |
| EP0273780A1 (en) | Process for isolating acid-stable biologically active proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: MONSANTO TECHNOLOGY LLC, US |
|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |