HU198057B - Process for producing pentafluorphenol derivatives of biotin - Google Patents
Process for producing pentafluorphenol derivatives of biotin Download PDFInfo
- Publication number
- HU198057B HU198057B HU98286A HU98286A HU198057B HU 198057 B HU198057 B HU 198057B HU 98286 A HU98286 A HU 98286A HU 98286 A HU98286 A HU 98286A HU 198057 B HU198057 B HU 198057B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- biotin
- pentafluorophenol
- formula
- ester
- aminocaproic acid
- Prior art date
Links
Landscapes
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Abstract
Description
A találmány új biotin-származékok előállítási eljárására vonatkozik.The present invention relates to a process for the preparation of novel biotin derivatives.
A biotln - kémiai nevén hexahidro-2-oxo-l H-tieno[3,4-d|imidazol-4-pe»lánsav - a természetben általában proteinekhez kötődve előforduló anyag. Jellegzetes tulajdonsága, hogy az immunológiai reagenseket elterjedten alkalmazott avidinnel erős kölcsönhatásba lép. A bíotin-avidin-kapcsolódáson alapuló kimutatás során az Immunológiai reakcióban résztvevő fehérjékhez, így elsődleges vagy másodlagos immunglobulinhoz, tormaperoxidázhoz vagy egyéb enzimekhez, illetve módosított nukleotid-trifoszfátokhoz biotint kell kapcsolni. Miután a jelölés során a fehérjék biológiai (immunfelismerő vagy enzim) aktivitása jelentésen nem csökkenhet, a kapcsolást enyhe fiziológiás körülmények között is hatásos eljárással kell végezni.Biotin, chemically known as hexahydro-2-oxo-1H-thieno [3,4-d] imidazole-4-pentanoic acid, is a naturally occurring protein bound substance. It is characterized by its strong interaction with avidin, which is widely used in immunological reagents. Detection by biotin-avidin binding requires binding of biotin to proteins involved in the immunological reaction, such as primary or secondary immunoglobulin, horseradish peroxidase or other enzymes or modified nucleotide triphosphates. Since the biological (immune recognition or enzyme) activity of the proteins should not be diminished in significance during labeling, coupling should be performed under mild physiological conditions.
A biotin fehérjékhez kapcsolására a 97.373 számú európai szabadalmi leírás' szerint a biotin-N-hidroxi-szukcinimid, ún. aktív észterének felhasználását javasolták. Ez az aktív észter vizes közegben, 8,0 pH-értéken jó hatásfokkal acilezi a fehérjék lizin maradékainak e-amino-csoportjait, illetve az arginineket. Az avidin-biotin-kötés tanulmányozása során kiderült, hogy az avidin biotin-kötő-helyei A mélyen helyezkednek el az avidin felszínétől, ezért a biotint célszerű egy távolságtartó farkon keresztül a fehérjéhez kapcsolni, ha a cél az, hogy a szabad biotinhoz hasonló erőséggel kötődjék. Erre a célra például az e-amino-kapronsav használható. (A biotinnak az e-amlno-kapronsav-N-hidroxi-szukcininűd-észterrel képezett származékát az Enzo Biocliem USA-beli) cég Enzotin márkanévvel forgalmazza).European Patent 97,373 discloses biotin-N-hydroxysuccinimide, a so-called "biotin". The use of its active ester has been recommended. This active ester acylates e-amino groups of protein lysine residues and arginines in aqueous media at pH 8.0 with good efficiency. Studying avidin-biotin binding has shown that the biotin binding sites for avidin are located deep down from the surface of avidin, so it is advisable to attach biotin to the protein via a spacer tail if the aim is to bind with a similar strength to free biotin . For example, e-aminocaproic acid can be used for this purpose. (Biotin derivative of N-hydroxysuccinide ester of e-amnocaproic acid is sold by Enzo Biocliem under the trade name Enzotin).
A biotin N-hidroxi-szukcinimid-észterének illetve az e-amino-kapronsav-N-hidroxi-szukcinímid-észterrel képezett származékának előállítása eléggé bonyolult. Leírták ugyan ezeknek az észtereknek biotinból, dlciklohexil-karbodiimid (DCC) felhasználásával történő közvetlen előállítását is (K. Hofmann és munkatársai, Blochemistry, 21, 978-984 /1982/), a gyakorlatban azonban ez a reakció csak igen kis termeléssel szolgáltatja a kívánt reagenseket. Ezért gyakorlati célra az N-nidroxi-szukcinimid-származékok közvetett, kerülő úton való előállítását használják. A kiindulási vegyületből először Ν,Ν’-karbodiimidazollaI elkészítik a megfelelő imidazol-származékot, amelyből N-hidroxi-szukclnimiddel, transzimidálási reakcióban keletkezik a kívánt N-hidroxi-szukcinimid aktív észter.The preparation of the N-hydroxysuccinimide ester of biotin and the N-hydroxysuccinimide ester of e-aminocaproic acid is quite complex. Although the direct preparation of these esters from biotin using dlcyclohexylcarbodiimide (DCC) has been described (K. Hofmann et al., Blochemistry, 21, 978-984 (1982)), in practice, this reaction provides only the desired yield in very small quantities. reagents. Therefore, for practical purposes, indirect circumvention of N-hydroxysuccinimide derivatives is used. The starting compound is first used to prepare the corresponding imidazole derivative of Ν, Ν'-carbodiimidazole, which is converted into the desired N-hydroxysuccinimide active ester by a transimidation reaction with N-hydroxysuccinimide.
A módszer alapvető hátránya a hosszú reakcióidő és a reagáltatáshoz szükséges magas hőmérséklet.The main disadvantage of the method is the long reaction time and high reaction temperature.
A fenti problémák kiküszöbölése érdekében célunk olyan aktív-észterek előállítása volt, amelyek a fehérjék jelölésében legalább egyenértékűek az ismert biotln-aktív-észterekkel, de lényegesen egyszerűbben, jó hozammal, kíméletes reakciókörülmények között állíthatók elő.In order to overcome the above problems, our aim was to provide active esters which are at least equivalent to the known biotin active esters in protein labeling, but can be prepared in a much simpler, good yield, under mild reaction conditions.
Azt találtuk, hogy a biotin pentafluor-fenil-származékai, amelyek új vegyületek az N-hidroxi-szukdnlmid-származékoktól eltérően közvetlenül Is jó hozammal előállíthatók.It has been found that the pentafluorophenyl derivatives of biotin, which are novel compounds, unlike the N-hydroxysuccinamide derivatives, can be prepared directly in good yields.
Ennek megfelelően a találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű blotln-pentafluor-fenol-származékok - a képletben n értéke 0 vagy 1 előállítására, amelyre jellemző, hogy a (II) képletű biotint diciklohexil-karbodiimid jelenlétében pentafluor-fenollal reagáltatjuk, kívánt esetben a kapott (III) képletű biotin-pentafluor-fenol-észtert (biotln5 -oPIP) e-amino-kapronsawal, a kapott (IV) képletű vegyületet pedig diciklohexil-karbodiimid (DCC) jelenlétében pentafluor-fenollal visszük reakcióba. így kívánság szerint, vagy a biotinil-pentafluor-fenol-észtert (n = 0) vagy a távolságtartó (spacer) szakaszt is tartalmazó biotinil-e-amino-kapronsav-pentafluor-fenol-észtert állítjuk elő (η = l). Mind a (III) képletű biotinil-e-amino-kapronsav-pentafluor-fenol-észtert alkalmas aminosavak, peptidek, fehérjék enyhe körülmények közötti biotinilezésére. A gyakorlatban az N-hidroxi-szukcinlniid-származékokkal kapcsolatbanAccordingly, the present invention relates to a process for the preparation of blotin-pentafluorophenol derivatives of the formula I wherein n is 0 or 1, characterized in that the biotin II is reacted with pentafluorophenol in the presence of dicyclohexylcarbodiimide, if desired. the resulting biotin-pentafluorophenol ester of formula (III) (biotin5-oPIP) is reacted with e-aminocaproic acid and the resulting compound of formula IV is reacted with pentafluorophenol in the presence of dicyclohexylcarbodiimide (DCC). Thus, if desired, biotinyl-e-aminocaproic acid pentafluorophenol ester containing either the biotinyl pentafluorophenol ester (n = 0) or the spacer moiety is prepared (η = 1). Each of the biotinyl-β-aminocaproic acid pentafluorophenol esters of formula (III) is suitable for biotinylation of amino acids, peptides, and proteins under mild conditions. In practice, it relates to N-hydroxysuccinylide derivatives
-J5 említett okokból, a (IV) képletű vegyület felhasználása előnyösebb.For these reasons, the compound of formula (IV) is more preferred.
A találmány szerinti eljárás első lépésében, azaz a (Hl) képletű biotinil-pentafluor-fenol-észter előállítása során úgy járunk el, hogy a biotint egy Inért szerves oldószerrel, például dimetil-szulfoxiddal vagy di20 metil-formainiddal, előnyösen dimetil-formamiddal készült oldatban, DCC jelenlétében reagáltatjuk a pentafluor-fenollal. A reakcióhőmérséklet általában 20 és 50 °C között változtatható, de legelőnyösebben szobahőmérsékleten hajtható végre a reakció. A pentafluor-fenolt a biotinre számítva előnyösen sztöchlo25 metriás arányban alkalmazzuk.In the first step of the process of the invention, the preparation of the biotinyl pentafluorophenol ester of formula (III), the biotin is prepared in a solution of Inert organic solvent such as dimethylsulfoxide or di 2 O-methylforminide, preferably dimethylformamide. , In the presence of DCC, with pentafluorophenol. The reaction temperature is usually in the range of 20 ° C to 50 ° C, but most preferably the reaction temperature is at room temperature. The pentafluorophenol is preferably used in a stoichiometric ratio to biotin.
Az eljárási lépés egy előnyös megvalósítási módja szerint a biotint dimetil-formamidos oldatban pentafluor-fenollal és DCC-vel szobahőmérsékleten l-2 órán át keverjük. A vegyületet a diciklohexil-karba2q mid (DCU) kiszűrése után ismert módszerekkel, például a szűrlet vákuumban végzett bepárlásával elkülöníthetjük, és szükség esetén szokásos eljárásokkal, például átkristályosítással tisztíthatjuk. A biotlnil-pentafluor-fenol-észter gyakorlatilag kvantitativen keletkezik.In a preferred embodiment of the process step, the biotin is stirred in dimethylformamide solution with pentafluorophenol and DCC at room temperature for 1-2 hours. After filtration of the dicyclohexylcarba 2q mid (DCU), the compound can be isolated by known methods, for example by evaporation of the filtrate in vacuo, and, if necessary, purified by conventional techniques such as recrystallization. The biotinnyl pentafluorophenol ester is formed essentially quantitatively.
A kapott blotinil-pentafluor-fenol-észter az előző lépéssel kapcsolatban felsorolt inért szerves oldószerekkel, előnyösen dimetil-formamiddal készült oldatban, vizes-alkálikus közegben reagál az a-amino-kapronsawal. A reakcióhőmérséklet általában 10 és 30 °C között változhat, előnyösen azonban szobahő40 mérsékleten dolgozunk. Az e-amíno-kapronsavat a blotin-pentafluor-fenol-észterre számítva általában sztöchiometriás mennyiségben alkalmazzuk. 0—5 °C hőmérsékleten a reakció mintegy egy óra alatt lejátszódik. A reakcióelegy savanyítása (pH 2,0-ig) hatására a biotin-amid-származék fehér kristályok formájában kiválik. Ebben a lépésben a hozam 85—90%, és a termék közvetlenül, további tisztítás nélkül továbbalakítható.The resulting blotinyl pentafluorophenol ester is reacted with a-aminocaproic acid in aqueous alkaline medium in a solution in the inert organic solvents listed above in connection with the previous step, preferably dimethylformamide. The reaction temperature is usually in the range of 10 to 30 ° C, but preferably at room temperature. E-aminocaproic acid is generally used in stoichiometric amounts relative to the blotin pentafluorophenol ester. At 0-5 ° C, the reaction is complete within about one hour. Upon acidification of the reaction mixture (up to pH 2.0), the biotinamide derivative precipitates as white crystals. The yield in this step is 85-90% and the product can be further transformed directly without further purification.
A biotin-amid-származék és a pentafluor-fenol reagáltatása során a reakciókörülmények lényegében gQ megegyeznek az eljárás első lépésével kapcsolatban leírtakkal A kapott biotinll-e-amino-kapronsav-pentafluor-fenolészter kívánt esetben ismert módszerekkel, például átkristályosítással tisztítható. Az utolsó lépésThe reaction conditions for the reaction between the biotinamide derivative and the pentafluorophenol are substantially the same as those described for the first step of the process. The resulting biotinyl-β-aminocaproic acid pentafluorophenol ester may be purified, if desired, by known methods such as recrystallization. The last step
80-85%-os hozammal valósítható meg.80-85% yield.
A találmány szerinti eljárás részleteit a következő 55 kiviteli példákban ismertetjük.Details of the process of the present invention are illustrated in the following embodiments 55.
I. példaExample I
Blotinll-pentafluor-fenol-észter előállításaPreparation of blotinyl pentafluorophenol ester
0,506 g (2,07 mmól) biotint feloldunk 6 ml abszolút dimetil-formamidban (DMF), majd hozzá60 adunk 0,504 g (2,78 mmól) pentafluor-fenolt (HOPF ) és 0,650 g (3,1 inmóí) diciklohexil-karbodiimidJi (DCC). Λ reakcióelegyet szobahőmérsékleten 3 óra hosszáig keverjük, majd kiszűrjük a díciklohexil-karbamidot (DCU) és a szűrletet vákuumban bepároljuk. Λ maradék olajat metanolból átkristályosítjuk. o Biotin (0.506 g, 2.07 mmol) was dissolved in absolute dimethylformamide (DMF) (6 mL) and pentafluorophenol (HOPF) (0.504 g, 2.78 mmol) and dicyclohexylcarbodiimide (0.650 g, 3.1 mmol) were added. DCC). The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours, then dicyclohexylurea (DCU) was filtered off and the filtrate was concentrated in vacuo. The residual oil was recrystallized from methanol. She
A termék tömege: 800 mg (94,1%), op.: 182-186 C R, = 0,53 (10% MeOH/CHClj) |a|Jp =♦ 33,18 (c =0,5 MeOH)Weight of product: 800 mg (94.1%), m.p. 182-186 CR, 0.53 (10% MeOH / CHCl3) | J p = ♦ 33.18 (c = 0.5 MeOH)
2. példaExample 2
Biotlnil-pentatluor-fenol-észter előállítása (biotin-OPFP) l g (4,1 mmól) biotint feloldunk 12 ml abszolút dimetil-formamidban. Oklasi hőmérséklet 50 60 C. Hozzáadunk 1 g (5,4 mmól) pentafluor-fenolt, majd kis idő múlva 1,2 g (6 mmól) dieiklohexil-karbodiírnidet. Az oldatot szobahőmérsékleten kevertetjük, kb. 3 óra leforgása alatt a reakció teljessé válik. A keletkezett diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot metanolból átkristályosítjuk. A termék tömege: 1,2 g (71,85%) op.: 187 190°C '[oipry *33,2° (c =0,5, metanol)Preparation of Biotinyl Pentatluorophenol Ester (Biotin OPFP) 1 g (4.1 mmol) of biotin is dissolved in 12 ml of absolute dimethylformamide. Occlusive temperature 50-60 ° C. 1 g (5.4 mmol) of pentafluorophenol is added followed by 1.2 g (6 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide. The solution was stirred at room temperature for approx. Within 3 hours, the reaction was complete. The dicyclohexylurea formed was filtered off and the filtrate was evaporated to dryness in vacuo. The residue was recrystallized from methanol. Mass of product: 1.2 g (71.85%) m.p. 187-190 ° C [α] D = 33.2 ° (c = 0.5, methanol)
R|-: 0(53 (10% metanol kloroform)R f: 0 (53 (10% methanol in chloroform)
3. példaExample 3
Biotinil-e-amíno-kapronsav előállításaPreparation of biotinyl-e-aminocaproic acid
0,1967 g (1,5 mmól) e-amino-kapronsavat feloldunk 1,5 ml IN NaOH-ban.0 5 °C-ra hűtés után kevertetés közben hozzáadunk 0,585 g (1,4 mmóhblotin-OPFPt 2,5 ml DMF-es oldatban. 1 órás 0 C-on végzett keverés után pH = 2,0-re savanyítjuk a reakcióelegyet, majd a kívánt terméket kiszűrjük. A termék további átkristályosítási nem igényel.0.1967 g (1.5 mmol) of e-aminocaproic acid is dissolved in 1.5 mL of 1N NaOH.0 After cooling to 5 ° C, 0.585 g (1.4 mmole of hblotin OPFP) in 2.5 mL of DMF is added with stirring. After stirring for 1 hour at 0 ° C, the reaction mixture is acidified to pH 2.0 and the desired product is filtered off without further recrystallization.
A termék tömege: 298 mg (83,6%)Product Weight: 298 mg (83.6%)
OP:221-222°CMP: 221-222 ° C
Rf = 0,056 (10% MeOH/CHClj)R f = 0.056 (10% MeOH / CHCl 3)
4. példaExample 4
Biotinil-e-amino-kapronsav előállításaPreparation of biotinyl-e-aminocaproic acid
0,4 g (3,1 mmól) e-amíno-kapronsavat 4 ml IN NaOH-oldatban feloldunk, és szobahőmérsékleten történő kevertetés közben 1,2 g (2,9 mmól) biotinil-pentafluorfenol-észter 5- 6 ml dímetílformamidos oldatát adjuk az előző oldathoz egy részletben. I órán keresztül folytatjuk a kevertetést, majd az elegyet feldolgozzuk. IN sósavval 2 pH-ra savanyítunk, a termék kristályosán kiválik, majd szárítjuk. A kapott termék tömege: 800 mg (80%), netn igényel további tisztítást, mert szennyezést nem tartalmaz.0.4 g (3.1 mmol) of e-aminocaproic acid is dissolved in 4 mL of 1N NaOH and stirred at room temperature with a solution of 1.2 g (2.9 mmol) of biotinylpentafluorophenol ester in 5-6 mL of dimethylformamide. to the previous solution in one installment. Stirring is continued for 1 hour and the mixture is worked up. Acidified with 1N hydrochloric acid to pH 2, the product crystallized out and dried. Weight of product: 800 mg (80%) requires further purification on the net as it does not contain impurities.
Op.: 215- 219 °CMp 215-219 ° C
R( : 0,056 (10% metanol kloroform)R ( : 0.056 (10% methanol in chloroform)
5. példaExample 5
Biotinil-e-amino-kapronsav-pentafluor-fcnol-észter előállításaPreparation of pentafluorophenol ester of biotinyl-e-aminocaproic acid
252 mg (0,706 mmól) biotinil-e-amino-kapronsavat melegítés közben 13 ml dimetil-formamidban oldunk fel. Szobahőmérsékleten 110 mg (0,63 mmól) HOPFP-t és 140 mg (0,69 mmól) DCC-t adunk az elegyhez, szobahőmérsékleten 2-3 órán át keverjük, majd a DMF-ot lepároljuk, a maradékot pedig metanolból átkristályosítjuk. Analitikai célra az átkristályosítást etilacetát-éterből végezzük.252 mg (0.706 mmol) of biotinyl-e-aminocaproic acid are dissolved in 13 ml of dimethylformamide with heating. HOPFP (110 mg, 0.63 mmol) and DCC (140 mg, 0.69 mmol) were added at room temperature, stirred at room temperature for 2 to 3 hours, then the DMF was evaporated and the residue was recrystallized from methanol. For analytical purposes, recrystallization is carried out from ethyl acetate.
A termék tömege: 120 mg (80%)Product Weight: 120 mg (80%)
Op.: 161 164 CM.p. 161-164 ° C
Rt :0,24 (10% MeOH/CHClj)R t : 0.24 (10% MeOH / CHCl 3)
6. példaExample 6
Biotinil-e-amino-kapronsav-pentafiuor-fenolésztét előállításaPreparation of pentafluorophenol biotinyl-e-aminocaproic acid
800 mg (2,23 mmól) biotinil-e-amino-kapronsavat 30 35 ml abszolút dimetil-formamidban oldunk fel 50 60 °C-on. Hozzáadunk 460 mg (2,5 mmól) pentafluor-fenolt kevertetés közben, majd 570 mg (2,75 mmól) diciklohexil-karbodiimidet. A kevertetést kb.800 mg (2.23 mmol) of biotinyl-e-aminocaproic acid are dissolved in 35 ml of absolute dimethylformamide at 50-60 ° C. 460 mg (2.5 mmol) of pentafluorophenol are added with stirring followed by 570 mg (2.75 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide. The mixing is carried out for approx.
órán keresztül folytatjuk szobahőmérsékleten. A keletkezett diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk, a maradékot etilacetát petroléter elegyből kristályosítjuk.continue at room temperature. The dicyclohexylurea formed was filtered off, the filtrate was evaporated to dryness in vacuo and the residue crystallized from ethyl acetate / petroleum ether.
A termék tömege: 810 mg(67,8%)Product Weight: 810 mg (67.8%)
Op.:16l 164 CMp: 161-164 ° C
Rj-. 0,24 (10 metanol kloroform)RJ. 0.24 (10 methanol in chloroform)
A biotin-aktív-észterek felhasználásának jelentős területe a szerológia és az ummunhísztológia. Ezért szereológiai, illetve iinmunhrsztológiai vizsgálatokkal ellenőriztük, hogy a találmány szerint előállított, új aktív észterek megfelelnek-e az előzetes célkitűzésnek, azaz legalább egyenértékűek a korábban alkalmazott biotin-N-hidroxi-szukcinimid-származékokkal.Serology and ummunhistology are important areas of use for biotin-active esters. Therefore, it has been verified by serological and / or immunohistological studies that the new active esters of the present invention meet the prior art objective of being at least equivalent to the previously used biotin N-hydroxysuccinimide derivatives.
Szerológia! alkalmazásSerology! application
A szerológiában az Elisa (F.nzyme-Linked-lmmunosorben-Assay) egyszerű és érzékeny módszer az antitest, illetve antigén mennyiségi meghatározására. A meghatározás során úgy járunk el, hogy műanyag felületre kötött antigénhez biotinilált specifikus ellenanyagot kötünk, amihez acidin vagy strepatívídín hídon keresztül biotinilált enzimet (tormagyökér peroxidáz, savanyú vagy alkalikus foszfatáz, béta-galakto/.idáz) kapcsolunk. Az enzim a szubsztrátján keresztül színreakciót ad, aminek az intenzitását koloriinetríásan mérni tudjuk. Ha a műanyag felület telítve van az antigénnel, illetve a szabadon maradt specifikus kötőhelyek BSA-val le vannak fedve, akkor a biotinilált enzim csak a specifikus ellenanyaghoz képes kapcsolódni.In serology, Elisa (F.nzyme-Linked-Immunosorben-Assay) is a simple and sensitive method for quantifying antibody or antigen. The assay involves the binding of a biotinylated specific antibody to a surface-bound antigen to which a biotinylated enzyme (horseradish root peroxidase, acid or alkaline phosphatase, beta-galacto / ididase) is coupled via an acidin or strepativeidine bridge. The enzyme gives a color reaction through its substrate, the intensity of which can be measured colorimetrically. If the plastic surface is saturated with the antigen or the specific binding sites left free are covered with BSA, the biotinylated enzyme can only bind to the specific antibody.
Vizsgálataink során a következőképpen járunk el.In our investigations, we proceed as follows.
A) Anti-egér-/birka/ immunglobulin és tormagyökér-peroxidáz-enzim biotinilálásaA) Biotinylation of anti-mouse / sheep / immunoglobulin and horseradish peroxidase enzyme
Mindkét fehérjét 1 mg/ml koncentrációban 0,1 M NaHCO3 (pH: 9,0) pufferben oldottuk. Az Immunglobulinhoz 1:3, az enzimhez 1.60 mól arányban dimetil-szulfoxidban oldott biotinil-e-aminokapronsav-pentafluor-fenol-észtert adunk. Szobahőmérsékleten órát inkubáljuk, majd dialízissel eltávolítjuk az el nem reagált biotnil-e-aminokapronsav-pentafluor-fenol-észtert továbbiakban biotin-eOPFP). A biotináTt enzimmel és streptavidinnel 1:2,4 mól arányban stabil komplexet hozunk létre, mely a továbbiakban más biotinilált fehérjék, például biotinilált anti-egér-/birka/ 'lg előhívására alkalmazható. A fehérjék bloíinilálásárá vonatkozó részletes adatok az azonos bejelentési napon tett szabadalmi bejelentésünk találhatók.Both protein in 0.1 M NaHCO3 (pH 9.0) at a concentration of 1 mg / mL dissolved in buffer. Biotinyl-e-aminocaproic acid pentafluorophenol ester, dissolved in dimethylsulfoxide (1: 3) and the enzyme (1.60 mol) were added to Immunoglobulin. After incubation at room temperature for an hour, the unreacted pentafluorophenol ester of biotnyl-e-aminocaproic acid (hereinafter biotin-eOPFP) is removed by dialysis. The biotinate is formed in a 1: 2.4 molar ratio with the enzyme and streptavidin, which can subsequently be used to induce other biotinylated proteins such as biotinylated anti-mouse / sheep / Ig. Detailed information on the protein binding of proteins can be found in our patent application filed on the same date.
B) Biotin-e-OPFP-vel jelölt anti-egér-/birka/ 'Ig„öszszehasonlítása a biotin-N-hidroxi-szukdnimid aktív észterévelt jelölt anti-egér-/birka/ Ig-nalB) Comparison of Biotin-e-OPFP-Labeled Anti-Mouse / Sheep / Ig Ig with Biotin-N-Hydroxysuccinimide Active Ester-Labeled Anti-Mouse / Sheep / Ig
198.057198 057
Az összehasonlító kísérletekben használt az Aniersham cég által forgalmazott termékek a következő katalógusszám alatt találhatók: 5Products sold by Aniersham for use in comparative tests are listed under the following catalog number:
Biotinilált anii-egér /bjrka/ lg RPN.1001Biotinylated anil mouse / bjrka / Ig RPN.1001
Biotinilált peroxidáz +streptavidin RPN.1041Biotinylated peroxidase + streptavidin RPN.1041
Mikrotitrátor lemez lyukait szuperoxid-dizmutáz (SÓD) enzimmel (Sigma) fedtük be (5 pg/nil). A szabadon maradt aspecifikus kötőhelyeket marha-szérum-albuminnan (BSA) telítettük. A lekötött enzimre 10 az anti-SOD monoklonális ellenanyag 1:500 szoros hígítását tettük egy órára. Alapos mosás után a találmány szerint készített, illetve az Amersham cég által forgalmazott biotinilált anti-egér-/birka/ lg azonos, felező léptékű hígításaival 1 órát, mosás után streptavidin-biotinilált peroxidáz-komplex 500-szoros hígításával szintén egy órát inkubáltunk. Negatív kontrollként az anti-SOD ellenanyagot nem tartalmazó lyukakat használtuk. Pozitív kontrollként a jelöletlen anti-SOD után anti-egér-/nyúl/-lg-peroxidáz-konjugátum megfelelő hígításait használtuk (Dakopatts P260 Kat.no.)The wells of the microtiter plate were covered with superoxide dismutase (SOD) enzyme (Sigma) (5 pg / nil). The remaining non-specific binding sites were saturated with bovine serum albumin (BSA). The bound enzyme was diluted 1: 500 times with anti-SOD monoclonal antibody for 1 hour. After a thorough wash, the biotinylated anti-mouse / sheep / Ig according to the invention and marketed by Amersham were incubated for 1 hour with the same batch dilutions, and 500 hours after washing with the streptavidin-biotinylated peroxidase complex. Wells containing no anti-SOD antibody were used as a negative control. Appropriate dilutions of unlabeled anti-SOD anti-mouse / rabbit / Ig peroxidase conjugate (Dakopatts P260 Cat.no.) were used as positive controls.
Az azonos körülmények között végzett 12 párhuzamos kísérlet adatai a következők:The data of 12 replicate experiments under the same conditions are as follows:
Az egyes lyukak extinkciója közti szórás nem haladta meg a 6%-ot. A fenti értékek a negatív kontroliból adódó háttér levonása után értendők (átlagban 0,01 0,05).The standard deviation between the extinction of each well did not exceed 6%. The above values are calculated after subtracting the background from the negative control (mean 0.01 to 0.05).
Mint a példaként említett kísérlet adataiból is kitűnik, a biotin-e-OPFP-vcl végzett jelzett ellenanyag legalább olyan jó, de általában jobb minőségű, mint a biotin-N-hidroxi-szukcinimid aktív észterével jelölt, ismert analóg típusú ellenanyag.As can be seen from the data of the exemplified experiment, the labeled antibody on biotin-e-OPFP-vcl is at least as good, but generally of better quality, than the labeled analogue antibody with the active ester of biotin-N-hydroxysuccinimide.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU98286A HU198057B (en) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | Process for producing pentafluorphenol derivatives of biotin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU98286A HU198057B (en) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | Process for producing pentafluorphenol derivatives of biotin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT47116A HUT47116A (en) | 1989-01-30 |
| HU198057B true HU198057B (en) | 1989-07-28 |
Family
ID=10952303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU98286A HU198057B (en) | 1986-03-07 | 1986-03-07 | Process for producing pentafluorphenol derivatives of biotin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU198057B (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1814908A4 (en) * | 2004-11-22 | 2009-07-01 | Biosight Ltd | Activated labeling reagents and methods for preparing and using the same |
-
1986
- 1986-03-07 HU HU98286A patent/HU198057B/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1814908A4 (en) * | 2004-11-22 | 2009-07-01 | Biosight Ltd | Activated labeling reagents and methods for preparing and using the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT47116A (en) | 1989-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5198537A (en) | Digoxigenin derivatives and use thereof | |
| US4485177A (en) | Creatinine specific antibody | |
| DE69324751T2 (en) | METHOD FOR DETERMINING PEPTIDES RELATED TO IMMUNOLOGICALLY IMPORTANT EPITOPES OF HCV | |
| US4214048A (en) | Reagent suitable for enzyme immuno assay | |
| DE3537877C2 (en) | ||
| FI90542B (en) | Chemiluminescent acridine derivatives, their preparation and their use in luminescence immunoassays | |
| US4302438A (en) | Antigen, antiserum and immunoassay for theophylline | |
| US5180828A (en) | Chromophoric reagents for incorporation of biotin or other haptens into macromolecules | |
| US5989806A (en) | Immunodissociation for improving the immunochemical determination of an analyte | |
| JP4068137B2 (en) | Biotinylated chemiluminescent label, conjugate, assay and assay kit | |
| US5164495A (en) | Method for preparing a dicarboxylic acid half-acid ester of FK506 | |
| DE69331721T2 (en) | New carbamazepines have analogs | |
| US5521319A (en) | Biotinylation reagent and method of use thereof | |
| US5698408A (en) | Pterin derivatives the preparation thereof and the use thereof | |
| US6153393A (en) | Elimination of interference in diagnostic methods by peptides comprising D-amino acids | |
| US20040038294A1 (en) | Hydrophilic chemilumescent acridinium labeling reagents | |
| US4543325A (en) | Process and reagent for the determination of creatinine | |
| DE4439345A1 (en) | New conjugates comprising oligomeric carrier and attached hapten(s) | |
| US4423227A (en) | Process for the preparation of reactive, couplable derivatives of the thyroid hormones | |
| US5977299A (en) | Activated peptides and conjugates | |
| HU198057B (en) | Process for producing pentafluorphenol derivatives of biotin | |
| CN110872344A (en) | Chloramphenicol complete antigen and preparation method and application thereof | |
| JP3253181B2 (en) | Photochemical labeling of nucleic acids using digoxigenin reagent | |
| EP0864863A2 (en) | Use of Anti-Creatinine-Antibodies or other Creatinine bonding substances for the determination of Creatinine in biological samples and method of producing thereof | |
| US4822878A (en) | Cyclic anhydride derivatives of chromophors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 |