HU185312B - Process for tha elimination of protective groups of aminoacid and peptide derivatives in liquid with metallic sodium - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya új eljárás védőcsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékok N-benziloxikarbonil-, O- és S-benzil, valamint N-p-toluolszulfonil-védőcsoportjainak eltávolítására cseppfolyós ammóniában, fémnátriummal, amelynek során a fémnátriumot a védőcsoportok eltávolításához elméletileg szükséges mennyiség 90-115%ának megfelelő, de a reakcióelegy teljes térfogatában kék színeződést okozó mennyiségnél kisebb mennyiségben alkalmazzuk. Amennyiben a védőcsoportot tartalmazó peptid- vagy aminosavszármazék a lehasitandó védőcsoport(ok) mellett más fémnátriummal reagáló csoportot, különösen hidroxil-, karboxil- és/vagy karboxamidcsoportot is tartalmaz, úgy előnyösen az elméletileg szükséges mennyiség 90-100%-ának megfelelő mennyiségű fémnátriumot alkalmazunk. A nátrium ilyen korlátozott mennyiségben való alkalmazásával jelentősen csökkenthető a mellékreakciók fellépése; nagy méretekben is tiszta termék nyerhető, jó hozammal. -1-The present invention relates to a novel process for the removal of N-benzyloxycarbonyl, O- and S-benzyl-protecting groups of amino acid and peptide derivatives containing a protecting group, and Np-toluenesulfonyl protecting groups in liquid ammonia with metal sodium, in which 90-115% of the theoretically required amount of the deprotection is present. it is used in an amount less than the amount that causes blue coloration in the total volume of the reaction mixture. If the protecting group-containing peptide or amino acid derivative contains, in addition to the protecting group (s) to be cleaved, other metal-reactive groups, especially hydroxyl, carboxyl and / or carboxamide, preferably 90-100% of the theoretically required amount of sodium is used. Using such a limited amount of sodium can significantly reduce side effects; it is also possible to obtain a pure product in large sizes with good yields. -1-

Description

A találmány tárgya új eljárás a védőcsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékok Nbenziloxikarbonil-, O- és S-benzil, valamint N-ptoluolszulfonil-védőcsoportjainak cseppfolyós ammóniában, fémnátriummal történő eltávolítására.The present invention relates to a novel process for the deprotection of N-benzyloxycarbonyl, O- and S-benzyl, and N-ptoluenesulfonyl protecting groups of amino acid and peptide derivatives in liquid ammonia with metal sodium.

A biológiailag aktív peptidek szintézisének stratégiáját rendszerint úgy tervezik, hogy az utolsó lépésben a védett származékról egy lépésben lehessen eltávolítani az összes védöcsoportot. Az egyik és azóta is általánosan használt eljárás a végső védőcsoport-eltáyolításra a cseppfolyós ammóniában nátriummal végzett redukció (du Vigneaud, V. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 52, 4500 [1930]; Schifferd, R. H. és du Vigneaud, V., J. Bioi. Chem. 108, 753 [1935]), amelynek alkalmazását gyakran az indokolja, hogy a védett peptidek nem vagy nehezen vihetők oldatba a szokásos oldószerekkel, illetve részlegesen bomlanak más védőcsoport-eltávolítási reakciók körülményei között. A cseppfolyós ammóniában nátriummal végzett redukciót mindig úgy valósítják meg, hogy a reakció végpontját a nátriumfeleslegetjelző kék szín megjelenéséhez kötik (Shífferd, R. H. és du Vigneaud, V., J. Bioi. Chem. 108, 753 [1935]; Patterson, W. I. és du Vigneaud, V., J. Bioi. Chem. Ili, 393 [1935]; Lutz, W. B. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 81, 167 [1959]; Hoffmann, K. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 82, 3721 [1960]; du Vigneaud, V. és munkatársai, J. Am, Chem. Soc. 76, 3115 [1954]; Li, C. H. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 83, 4449 [1961]; Marglin, A. és Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 88, 5051 [1966]; Katsoyannis, P. G. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 93, 5871 és 5877 [1971]; Kisfaludy L. és munkatársai, 151 959 sz, magyar szabadalmi leírás; Ohta, N. és munkatársai, Chem. Pharm. Bull, 27, 2968 [1979]; Kawasaki, K. és munkatársai, Chem. Pharm. Bull. 28, 2105 [1980]; Tzougraki, C és munkatársai, int. J. Peptide Protein Rés. 5, 377 [1980]). A nátriumfeleslegel jelző kék színt pár másodperctől (Okada, Y. és munkatársai, Chem. Pharm. Bull. 27, 3015 [1979]) 45 percig terjedő ideig (Tzougraki, C. és munkatársai, Int. J. Peptide Protein Rés. 5, 377 [1980]) szokták fenntartani.The strategy for the synthesis of biologically active peptides is usually designed to remove all protecting groups from the protected derivative in a final step. One of the methods commonly used since then for the final deprotection in sodium ammonia by liquid ammonia (Du Vigneaud, V., et al., J. Am. Chem. Soc. 52, 4500 [1930]; Schifferd, R. H. and du Vigneaud. V, J. Bioi. Chem. 108, 753 (1935)), the use of which is often justified by the fact that protected peptides are not or difficult to be solubilized with conventional solvents or are partially degraded under other deprotection reactions. Reduction with sodium in liquid ammonia is always accomplished by linking the end point of the reaction to the appearance of an excess sodium blue color (Shiffer, R. H. and du Vigneaud, V., J. Biol. Chem. 108, 753 [1935]; Patterson, W.I. and du. Vigneaud, V., J. Biol. Chem. Ill., 393 (1935); Lutz, W. B., et al., J. Am. Chem. Soc., 81, 167 (1959); Hoffmann, K., et al., J. Am. Chem. Soc. 82, 3721 (1960); du Vigneaud, V. et al., J. Am. Chem. Soc. 76, 3115 (1954); Li, CH et al., J. Am. Chem. Soc. 4449 (1961); Marglin, A. and Merrifield, RB. J. Am. Chem. Soc. 88, 5051 (1966); Seeyannis, PG et al., J. Am. Chem. Soc. 93, 5871 and 5877 (1971). Kisfaludy L. et al., Hungarian Patent No. 151,959; Ohta, N. et al., Chem. Pharm. Bull. 27, 2968 (1979); Kawasaki, K. et al., Chem. Pharm. Bull. , 2105 (1980); Tzougraki, C et al., J. Peptide Protein Res. 377 (1980)). The blue color indicating excess sodium is from a few seconds (Okada, Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 27, 3015 (1979)) to 45 minutes (Tzougraki, C. et al., Int. J. Peptide Protein Sl. 377 (1980)).

A cseppfolyós ammóniában nátriummal végzett redukciót a szerves és peptidkémiában általánosan alkalmazzák az Ν-benzil-oxi-karbonil-, az O- ésSodium reduction in liquid ammonia is commonly used in organic and peptide chemistry for Ν-benzyloxycarbonyl, O and

S-benzil- valamint az N-tozílcsoport eltávolítására.S-benzyl and N-tosyl groups.

A védett aminosav- és peptidszármazékok cseppfolyós ammóniában nátriummal végzett redukciója során számos, nemkívánatos meílékreakciót mutattak ki: a metionin teljes demetilezödését (Stekol, J. A., J. Bioi. Chem. 140, 827 [1941]; Dekker, C. A. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 180, 155 [1949]; Hope, D. P. és Ilumpries, J. F., J. Chem. Soc. 1964, 869), a prolin pirrolidingyürűjének felnyílását (Ramachadran, J., Natúré 206, 927 [1965]), a különböző acil-prolin kötések, különösen a Lys-Pro, ArgPro, Thr-Pro és Ser-Pro kötés hasadását (Guttmann, S., Peptides 1962 [szerkesztő: Young, G. T.], Pergamon Press, Oxford, 1963, 41. oldal; Merrifield, R. B. és Marglin, A., Peptides 1966 [szerkesztők: Beyermann, H. C. és munkatársai], NorthHolland Publ. Co., Amsterdam, 1967, 85. oldal;The reduction of protected amino acid and peptide derivatives with sodium in liquid ammonia has shown a number of undesirable side-reactions: complete demethylation of methionine (Stekol, J. J. Biol. Chem. 140, 827 (1941); Dekker, CA, et al., Bio et al. Chem. 180, 155 (1949); Hope, DP and Ilumpries, J.F., J. Chem. Soc. 1964, 869), opening of the pyrrolidine ring of proline (Ramachadran, J., Naturre 206, 927 (1965)), various cleavage of acyl-proline bonds, in particular Lys-Pro, ArgPro, Thr-Pro and Ser-Pro bonds (Guttmann, S., Peptides 1962 [edited by Young, GT], Pergamon Press, Oxford, 1963, p. 41; Merrifield , RB and Marglin, A., Peptides 1966 (ed. Beyermann, HC, et al.), North Holland Publ. Co., Amsterdam, 1967, p. 85;

Katsoyannis, P. G. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 93, 5871 és 5877 [1971]; Benisek, W. F., Biochemistry 6, 3780 [1967]; Hofmann, K. és Yajima, H., J. Am. Chem. Soc. 83, 2289 [1961]), az arginin részleges átalakulását ornitinné (Guttmann, S., Peptides 1962 [szerkesztő: Young, G, T.], Pergamon Press, Oxford, 1963, 41. oldal), a ciszteinszármazékok részleges átalakulását alaninná (GebauerFuelnegg, E., J. Am. Chem. Soc. 52, 4910 [1930]; Zahn, H. és munkatársai, Peptides 1966 (szerkesztők: Beyermann, H. C. és munkatársai), NorthHolland Publ. Co., Amsterdam, 1967, 108. oldal; Shimonishi, Y. és munkatársai, Z. Naturforsch. 24b 422 [1969]), a szerin (Wünsch, E., Coll. Czech. Chem. Commun. Spec. Issue 24, 141 [1959]; Rudinger, J. és Massen van dér Brink-Zimmermanová, H., Helv. Chim. Acta 56, 2216 [1973]), a treonin (Brenner, M., Coll. Czech. Chem. Commun. Spec. Issue, 24, 141 [1973]), a triptofán (Bajusz, S. és Medzihradszky, K., Peptides 1962 [szerkesztő; Young, G. T.],P ergamon Press, Oxford, 1963, 49. oldal) bomlását, acilvándorlást (Zimmermanová, H. és munkatársai, peptides 1963 [szerkesztő: Zervas, L.], Pergamon Press, Oxford, 1965, 21. oldal; Poduska, K. és munkatársai, Coll. Czech. Chem. Commun. 30, 2410 [1965]) és racemizációt (Arnstein, H. R. V. és Morris, D., Biochem. J. 76, 318 [1960]; Brenner, M. és Pfister, R. W., Helv. Chin. Acta 34, 2085 [1951]; Hanby, W. E, és munkatársai, J. Chem. Soc. 1950, 3239; Hope, D. B., Peptides 1968 [szerkesztő: Bricas, E.], North-Holland Publ. Co., Amsterdam, 1968, 111. oldal).See, J. G., et al., J. Am. Chem. Soc. 93, 5871 and 5877 (1971); Benisek, W. F., Biochemistry 6, 3780 [1967]; Hofmann, K. and Yajima, H., J. Am. Chem. Soc. 83, 2289 (1961)), partial conversion of arginine to ornithine (Guttmann, S., Peptides 1962, ed. Young, G, T.), Pergamon Press, Oxford, 1963, p. 41), the partial conversion of cysteine derivatives to alanine (Gebauer Fuelnegg, E., J. Am. Chem. Soc. 52, 4910 [1930]; Zahn, H. et al., Peptides 1966 (eds. Beyermann, HC, et al., North Holland Publ. Co., Amsterdam, 1967, p. 108; Shimonishi, Y., et al., Z. Naturforsch. 24b 422 (1969)), serine (Wünsch, E., Coll. Czech). Chem. Commun. Spec. Issue 24, 141 (1959); Rudinger, J. and Massen van der Brink-Zimmermanova, H., Helv. Chim. Acta 56, 2216 (1973)), threonine (Brenner, M.). (Coll. Czech. Chem. Commun. Spec. Issue, 24, 141 (1973)), tryptophan (Bajusz, S. and Medzihradszky, K., Peptides 1962 (ed. Young, GT), P ergamon Press, Oxford). 1963, p. 49), acyl migration (Zimmermanová, H. et al., Peptides 1963 [edited by Zervas, L.], Pergamon Press, Oxford, 1965, page 21; Poduska, K., et al., Coll. Czech. Chem. Commun. 30, 2410 (1965)) and racemization (Arnstein, HRV and Morris, D., Biochem. J. 76, 318 (1960); Brenner, M. and Pfister, R. W., Helv. Chin. Acta 34, 2085 (1951)). Hanby, W. E, et al., J. Chem. Soc. 1950, 3239; Hope, DB, Peptides 1968 (ed. Bricas, E.), North Holland Publ. Co., Amsterdam, 1968, p. ).

Több esetben, főleg az oxitocin-szintézisek során azt tapasztalták, hogy a reakciók nagyobb méretben való megvalósítása a hozam rohamos csökkenésével jár együtt (Bodanszky, M. és du Vigneaud, V., J. Am. Chem. Soc. 81, 2504 [1959]; Sakakibára,In many cases, especially during oxytocin syntheses, the larger scale realization of the reactions has been associated with a rapid decrease in yield (Bodanszky, M. and du Vigneaud, V., J. Am. Chem. Soc. 81, 2504 [1959]). ]; Sakakiba,

S. és munkatársai, Bull. Chem. Soc. Japan 38, 120 [1965]); például Bodanszky és du Vigneaud néhány milligrammos méretű redukcióban 330-395 NE/mg oxitocin-aktivitást, viszont 1,3 g védett nonapeptidamidot redukálva már csak 170 NE/mg oxitoxin-aktivitást ért el.S. et al., Bull. Chem. Soc. Japan 38, 120 (1965)); for example, Bodanszky and du Vigneaud achieved oxytocin activity of 330-395 IU / mg in a few milligram reductions, but only 1.3 IU / mg of oxytoxin when reducing 1.3 g of protected nonapeptidamide.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a védőcsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékoknak, valamint az oxitocin védett nonapeptidamidjának a redukciója során a védőcsoportok teljes eltávolításához, illetve az optimális hozam és a legnagyobb elérhető kémiai tisztaság eléréséhez nincs szükség annyi nátrium beadagolására, amennyi a nátrium fölöslegét jelző tartós kék színt eredményezi. Részletes vizsgálataink alátámasztják, hogy az eddigi gyakorlatban alkalmazott módszer során nemcsak a védőcsoportok eltávolítása igényel nátriumot, hanem - a peptid aminosavösszctételétöl függő mennyiségben - a sóképzésre és a nemkívánatos reakciókban is fogy nátrium. Kísérleteink során különböző aminosav- és peptidszármazékok cseppfolyós ammóniában készült oldatához tartós kék szín megjelenéséig adagoltuk a nátriumot g-atom/mó! peptid adagokban. Bebizonyosodott, hogy sót képeznek fém-nátriummal a karboxilcsoportok, a hidroxilcsoportok, a karboxidcsoportok, a merkaptocsoportok, valamint az N-benziloxikarbonil-csoport hasításakor képződőSurprisingly, it has been found that during the reduction of the protected amino acid and peptide derivatives and the protected nonapeptide amide of oxytocin, the addition of sodium in excess of the excess of sodium is not necessary to completely remove the protecting groups and to achieve optimum yield and maximum chemical purity. blue color. Our detailed studies confirm that the method used to date requires not only sodium deprotection, but also, in dependence on the amino acid composition of the peptide, sodium for salt formation and undesirable reactions. In our experiments, sodium was added to a solution of various amino acid and peptide derivatives in liquid ammonia until a persistent blue color appeared. peptide doses. It has been shown to form salts with metal sodium when cleaved by the cleavage of carboxyl groups, hydroxy groups, carboxide groups, mercapto groups and N-benzyloxycarbonyl groups.

185 312185 312

N-karboxil-csoportok is. Ez a magyarázata annak, hogy a védett származékok redukciójakor mindig több nátriumra van szükség az elméletileg számított értéknél a tartós kék színnel jelzett végpont eléréséhez.Also N-carboxyl groups. This is the reason why when reducing protected derivatives, more sodium is always needed than the theoretically calculated value to reach the end point indicated by a permanent blue color.

Tovább bonyolítja a problémát az a tény, hogy a védőcsoport-eltávolitási reakciók sztöchiometriája nem egészen tisztázott, és jelentős mértékben függ a reakciókörülményektől. Az O- és S-benzilcsoport eltávolításakor toluol és bibenzil is képződik (Shifferd, R. H. és du Vjgneaud, V., J. Bioi.. Chem. 108, 753 [1935]; Patterson, W. I. és du Vigneaud, V., J. Bioi. Chem. 111, 385 [1935]). Míg 1 mól benzilcsoport hasításához 1 g-atom nátriumra van szükség, ha kizárólag bibenzil képződik, 2 g-atom szükséges, ha toluol az egyetlen hasítási termék (Nayak, U. G. és Brown, R. K., Can. J. Chem. 44, 591 [1966]). Az N-tozilcsoport hasításakor is többféle termék képződik (Kovács, J. és Ghatak, U. R., J. Org. Chem. 31, 119 [1966]; Zimmermanová, H. és munkatársai, Peptides 1963 [szerkesztő; Zervas, L.], Pergamon Press, Oxford, 1965, 21. oldal; Rudinger, J. és Maassen van dér Brink-Zimmermanová, H., Helv. Chim. Acta, 56, 2216 [1973]), ezért a reakció sztöchiometriája ebben a reakcióban is bonyolult.Further complicating the problem is the fact that the stoichiometry of the deprotection reactions is not completely clear and is highly dependent on the reaction conditions. Removal of the O- and S-benzyl groups also produces toluene and bibenzyl (Shifferd, R. H. and du Vjgneaud, V., J. Biol. Chem. 108, 753 (1935); Patterson, W.I. and du Vigneaud, V., J. Biol. Chem. 111, 385 [1935]). While 1 mole of benzyl cleavage requires 1 g of sodium when bibenzyl is formed only, 2 g is needed when toluene is the only cleavage product (Nayak, UG and Brown, RK, Can. J. Chem. 44, 591 [1966]). ]). Multiple products are also formed upon cleavage of the N-tosyl group (Kovács, J. and Ghatak, UR, J. Org. Chem. 31, 119 (1966); Zimmermanová, H. et al., Peptides 1963 [ed., Zervas, L.], Pergamon Press, Oxford, 1965, p. 21; Rudinger, J., and Maassen van Brink-Zimmermanova, H., Helv. Chim. Acta, 56, 2216 (1973)), so the stoichiometry of the reaction is complicated.

Megállapították, hogy az S-benzilcsoport (Hope, D. B., Peptides 1968 [szerkesztő: Bricas, E.], NorthHolland Publ. Co., Amsterdam, 1969, 111. oldal) és az N-tozilcsoport (Hope, D. B. és Horncastle, K.S-benzyl group (Hope, DB, Peptides 1968 [edited by Bricas, E.], North Holland Publ. Co., Amsterdam, 1969, p. 111) and N-tosyl group (Hope, DB and Horncastle, K .

C., J. Chem. Soc. 1966,1098) hasítása sokkal gyorsabb, mint a karboxilát-anionnal sót képező ammónium-ion redukciója nátriummal. Saját tapasztalataink azt igazolják, hogy az N benziloxikarbonil-csoport hasítása nagyságrenddel gyorsabb, mint az ammónium-ion redukciója. Csak így magyarázható, hogy az N-benziloxikarbonil-L-alanin redukciójához alig több, mint 2 g-alom/mót nátriumra volt szükség. Kísérleteink alapján az is egyértelműnek látszik, hogy a karboxamid-csoport sóképzése nagyságrendekkel lassúbb, mint a karboxilátionnal sót képző ammónium-ion redukciója. Ezt igazolja, hogy 1 mól N-terc-butiloxikarbonil-L-glutamint 1 g-atom fémnátriummal reagáltatva, változatlanul visszanyertük a kiindulási anyagot a reakció után, és vékonyréteg-kromatográfiásan sem tapasztaltunk átalakulást. Viszont 2 gatom fémnátrium hatására részlegesen olyan változás következett be, amely a karboxamidcsoporttal van kapcsolatban.C., J. Chem. Soc. 1966, 1098) is much faster than the reduction of ammonium ion, which forms a salt with a carboxylate anion, with sodium. In our experience, the cleavage of the N-benzyloxycarbonyl group is one order of magnitude faster than the reduction of ammonium ion. This is the only explanation why the reduction of N-benzyloxycarbonyl-L-alanine required only more than 2 g of litter / mol of sodium. From our experiments it also seems clear that the formation of the carboxamide group is much slower than the reduction of the ammonium ion forming the carboxylate ion. This is evidenced by the fact that 1 mole of N-tert-butyloxycarbonyl-L-glutamine was reacted with 1 g of metal sodium, and the starting material was still recovered after the reaction, and no change was observed by TLC. On the other hand, 2 g atoms of metal sodium partially caused a change in the carboxamide group.

A reakciókat általában 10 mmol védett aminosav- vagy peptidszármazékkal végeztük, nátriumról desztillált vízmentes ammóniában, annak forráspontján. Az ammóniába beadagoltunk 10 mmol védett származékot, majd az oldatba beszórtunk fémnátriumot 10 mg-atomnyi adagokban. Ha a fémnátrium elreagált, vagy a reakcióelegy 15-20 percig tartósan kék maradt, beleszórtunk a beadagolt nátriummal egyenértékű mólnyi ammóniumkloridot a fölösleg elreagáltatására és a nátriumsóik) fölszabadítására. A kapott oldatot 20-30 °Cos fürdőn szárazra pároltuk. A maradékot 50-100 ml vízben, etanolban vagy a kettő elegyében oldottuk, és az oldat kémhatását tömény sósavval pHThe reactions were generally carried out with 10 mmol of the protected amino acid or peptide derivative in sodium distilled anhydrous ammonia at its boiling point. 10 mmol of the protected derivative was added to the ammonia and then 10 mg of the sodium metal was sprayed into the solution. When the metal sodium reacted or the reaction mixture remained blue for 15-20 minutes, a mole of ammonium chloride equivalent to the added sodium was added to react the excess and liberate their sodium salts. The resulting solution was evaporated to dryness in a 20-30 ° C bath. The residue was dissolved in 50-100 ml of water, ethanol or a mixture of the two, and the solution was concentrated to pH

3-7 közé állítottuk a további feldolgozástól függően. A benzilcsoportot tartalmazó vegyüíetek redukciójakor mind toluol, mind 1,2-difenil-etán (bibenzil) képződését észleltük.3-7 depending on further processing. Both toluene and 1,2-diphenylethane (bibenzyl) were formed upon reduction of the benzyl-containing compounds.

Meglepő módon a következőket tapasztaltuk:Surprisingly, we experienced the following:

1. Hidantoinszármazék képződése mmol N-benzi!oxikarbonil-L-prolinamidból 10 mg-atom fémnátrium hatására a várt L-prolinamidcn kívül 10% hidantoinszármazék (Suzuki, T. és munkatársai, Agr. Bioi. Chem. 37,411 [1973]) is képződött. Kevesebb nátriummal a kiindulási anyag egy része nem reagált el, több nátrium hatására viszont a hidantoinszármazék többféle vegyületté reagált tovább a tartósan kék reakcióelegyben.1. Formation of a hydantoin derivative from mmol N-benzyloxycarbonyl-L-prolinamide at 10 mg of metal sodium, in addition to the expected L-prolinamide, formed a 10% hydantoin derivative (Suzuki, T. et al., Agr. Bioi. Chem. 37, 411 (1973)). . With less sodium, some of the starting material did not react, but with more sodium, the hydantoin derivative continued to react with a variety of compounds in the sustained blue reaction mixture.

2. A karboxamidcsoport redukciója alkohollá2. Reduction of the carboxamide group to an alcohol

A karboxamidcsoportot tartalmazó védett aminosa vszármazékokból részlegesen alkoholszármazékok képződtek a karboxamidcsoport redukciójával, ha a karboxamidcsoport sóképzéséhez elegendő mennyiségű fémnátriumot adagoltunk a reakcióelegybe. Ezt, a peptidkémiában eddig le nem írt reakciót egyszerű savak amidjainál már régebben tapasztalták (Chabley, Μ. E., Compt. rendre, 154, 364 [1912] és Ann. Chim. 8, 201 [1917]).Partially alcoholic derivatives of the protected amino derivatives containing the carboxamide group were formed by reduction of the carboxamide group when sufficient metal sodium was added to form the carboxamide group. This reaction, which has not previously been described in peptide chemistry, has been observed in the past for amides of simple acids (Chabley, E. E., Compt. Rendre, 154, 364 [1912] and Ann. Chim. 8, 201 [1917]).

így 10 mmol N-terc-butiloxikarbonil-glicinamidot 10 mg-atom fémnátriummal reagáltatvaThus, 10 mmol of N-tert-butyloxycarbonylglycinamide is reacted with 10 mg of metal sodium

3,4 mmol N-terc-butiloxikarbonil-etanol-amint izoláltunk oszlopkromatográfiás elválasztással.3.4 mmol of N-tert-butyloxycarbonyl-ethanolamine were isolated by column chromatography.

mmól N-terc-butiloxikarbonil-L-aszparagint 20 mg-atom fémnátriummal reagáltatva 2,5 mmól N-terc-butiloxikarbonii-L-homoszerint izoláltunk diciklohexil-ammónium-sója formájában. 10 mgato n nátrium hatására nem tapasztaltunk ilyen áta’akulást.N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparagine (20 mmol) was reacted with 20 mg of sodium metal to isolate 2.5 mmol of N-tert-butyloxycarbonyl-L-homoserine as its dicyclohexylammonium salt. No such conversion was observed with 10 mg of sodium.

mmol N-terc-butiloxikarbonil-L-izoaszparagin 20 mg-atom nátriummal reagáltatva az előzőhöz hasonlóan 3-(S)-(terc-butiloxikarbonilamino)-4-hidroxi-vajsavvá redukálódik részlegesen. 10 mg-atom nátrium hatására nem tapasztaltul ezt a reakciót.mmol of N-tert-butyloxycarbonyl-L-isoasparagine is reacted with 20 mg of sodium as before to partially reduce it to 3- (S) - (tert-butyloxycarbonylamino) -4-hydroxybutyric acid. 10 mg of sodium did not show this reaction.

mmól N-terc-butiloxikarbonil-L-glutamint 20 mg-atom fémnátriummal reagáltatva 1 mmól Nte c-butiloxikarbonil-2-L-amino-5-hidroxÍ-valeriánsavat izoláltunk diciklohexil-ammónium-sója formájában, míg 10 mg-atom fémnátriummal kezelve, változatlanul visszanyertük a kiindulási anyagot.N-tert-butyloxycarbonyl-L-glutamine was reacted with 20 mg of sodium metal to isolate 1 mmol of Nte-c-butyloxycarbonyl-2-L-amino-5-hydroxy-valeric acid in the form of its dicyclohexylammonium salt, while 10 mg was treated with metal sodium, the starting material was unchanged.

Az előzőekhez hasonlóan 10-10 mmol N-tercbi tiloxikarbonil-L-tirozinamid, illetve -fenil-alaniiamid 20, illetve 10 mg-atom nátrium hatására ré szlegesen N-terc-butil-oxikarbonil-L-tirozinollá, illetve -fenil-alaninollá redukálódott, míg 10 mgatom nátrium jelenlétében nem történt ilyen átalakulás a tirozinszármazékkal.Similarly to the foregoing, N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosinamide and / or phenylalanylamide, respectively, were reduced to N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosinol and / or phenylalaninol, respectively, by 20 and 10 mg atoms respectively. , while in the presence of 10 mg of sodium no such conversion was made with the tyrosine derivative.

mmol N-benziloxikarbonil-L-aszparagint 30 mg-atom nátriummal reagáltatva vékonyrétegk omatográfiásan kimutattunk kevés kiindulási a ryagöt. Az elektroforetikus vizsgálat szerint a várt L-aszparaginon kívül néhány %-nyi L-homoszerin is képződött a reakcióban, amelyet laktonja formájában azonosítottunk.Reaction of mmol of N-benzyloxycarbonyl-L-asparagine with 30 mg of sodium in the presence of thin layer omatography revealed a small amount of starting rag. In the electrophoretic assay, in addition to the expected L-asparagine, some% of the L-homoserine was formed in the reaction, which was identified as its lactone.

-3I-3 '

185 312 mmol N-benziloxikarbonil-L-tirozinamidot 20, illetve 30 mg-atom fémnátriummal reagáltatva, az első reakcióban csak a várt L-tirozinamidot, míg a második reakcióban ezen kívül még L-tirozinol képződését kimutattuk kis mennyiségben az elektroforetogramon.185 312 mmol of N-benzyloxycarbonyl-L-tyrosinamide was reacted with 20 and 30 mg atomic metal sodium, respectively, in the first reaction only the expected L-tyrosinamide, and in the second reaction, a small amount of L-tyrosinol was also detected on the electrophoretogram.

3. A karboxamidcsoport hidrolízise ( dezamidálódás)3. Hydrolysis of the carboxamide group (deamidation)

Az N-benziloxikarbonil-glicinamid redukciójakor a várt glicinamidon kívül glicint is kimutattunk az elektroforetogramon.In addition to the expected glycinamide, glycine was detected in the electrophoretogram during the reduction of N-benzyloxycarbonylglycinamide.

4. Az N-terc-butiloxikarbonil-csoport hasadása4. Cleavage of the N-tert-butyloxycarbonyl group

Az N-terc-butiloxikarbonil-L-tirozinamid és izoaszparagin redukciójakor tercier-butil-karbamát képződését észleltük. Az első esetben oszlopkromatográfiás elválasztással 8% tercier-butil-karbamátot izoláltunk. Az elektroforetikus vizsgálatok szerint a reakcióban L-tirozinamid is képződött. A peptidkémíában eddig az N-terc-butiloxikarbonil-csoportot stabilisnak tartották ilyen körülmények között (Anderson, C. W. és McGregor, A. C., J. Am. Chem. Soc. 79, 6180 [1957]; Mühlemann, M. és munkatársai, Helv. Chim. Acta, 55, 2854 [1972]).During the reduction of N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosinamide and isoasparagine, formation of tert-butyl carbamate was observed. In the first case, 8% of tert-butyl carbamate was isolated by column chromatography. Electrophoretic studies also indicate that L-tyrosinamide was formed in the reaction. In peptide chemistry, the N-tert-butyloxycarbonyl group has so far been considered stable under these conditions (Anderson, CW and McGregor, AC, J. Am. Chem. Soc. 79, 6180 (1957); Mühlemann, M., et al., Helv. Chim. Acta, 55, 2854 (1972)).

5. Dezaminálódás5. Deamination

Az N-terc-butiloxikarbonil-L-tirozinamid említett reakciójában nemcsak N-terc-butiloxi-karbonil-L-tirozinol és L-tirozinamid képződését mutattuk ki, hanem oszlopkromatográfiás elválasztással 12% 3-(4-hidiOxi-fenil)-propionsavamidot is izoláltunk, amelynek szerkezetét infravörös, Ή- és ^l3Cmagmágneses rezonanciaszínképével igazoltuk. Ugyanilyen káros átalakulást figyeltünk meg az N-íerc-butiloxikarbonil-L-fenil-alaninamid redukciójában is. Ez a dezaminálási reakció eddig ugyancsak ismeretlen volt a szerves és peptidkémíában.In this reaction of N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosinamide, not only the formation of N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosinol and L-tyrosinamide was detected, but also 12% of 3- (4-hydroxy-phenyl) -propionic acid amide was isolated by column chromatography. The structure was confirmed by infrared, and ^l3 Ή- Cmagmágneses resonance spectroscopy. The same deleterious transformation was observed in the reduction of N-tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalaninamide. This deamination reaction has also been unknown so far in organic and peptide chemistry.

6. Egyidejű transzpeptidáció és dezamidálódás mmol N-benziloxikarbonil-L-aszparaginilglicinamidot 15 mg-atom fémnátriummal reagáltatva nemcsak a várt L-aszparaginil-glicinamidot mutattuk ki az elektroforetogramon, hanem alfaés béta-L-aszpartil-gíicinamidot is, mégpedig a béta-peptidből nagyobb mennyiséget. A redukció során képződő L-amino-szukcinil-glicinamid hidrolíziséből származó peptidek mennyisége megközelítette a 20%-ot. A védőcsoport-eltávolítást az elméletileg szükséges 10 mg-atom fémnátriummal végezve ezek a melléktermékek csak 1-2%-os mennyiségben képződtek.6. Simultaneous transpeptidation and deamidation By reacting mmol N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginylglycinamide with 15 mg of metal sodium, not only the expected L-asparaginylglycinamide was detected in the electrophoretogram but also the higher alpha amount. The amount of peptides resulting from the hydrolysis of L-amino-succinylglycinamide during reduction was close to 20%. By deprotection with the theoretically required 10 mg of sodium metal, these by-products were formed in only 1-2%.

Megjegyezzük, hogy az előzőekben felsorolt reakciók egyikében sem maradt tartósan kék a reakcióelegy, sőt a reakciók zöménél a beadagolt nátrium anélkül oldódott föl, hogy a reakcióelegy tömege megkékült volna.It should be noted that none of the reactions listed above remained permanently blue in the reaction, and in the majority of the reactions, the added sodium was dissolved without the reaction mixture becoming blue.

Az előzőekben említett, részben a szakirodalomban leírt, részben az általunk felismert, nemkívánatos mellékreakciók egyértelműen arra utalnak, hogy a fémnátrium fölöslegben való alkalmazása káros; az eddigi gyakorlatban teljesen általánosan elfogadott, kék színnel jelzett végpont elfogadása a peptidkémiai redukcióban nátriumfölösleget jelent, és így mellékreakciókhoz vezet. Párhuzamos reakcióinkból egyértelműen az a következtetés vonható le, hogy a peptidkémíában a védőcsoportok eltávolításához a nátriumot az elméletileg számított mennyiséghez képest csak kis fölöslegben kell alkalmazni, mivel a védőcsoport-eltávolítással· egyidejűleg lejátszódó sóképzések is fogyasztanak kevés nátriumot. Minthogy párhuzamos, bár sokkal kisebb sebességgel lejátszódó reakciókról van szó, ezek a reakciók nem küszöbölhetők ki teljesen. Viszont ha a párhuzamos reakciók lejátszódásához szükséges fémnátriumot is beadagoljuk a reakcióelegy be, teljessé válnak ezek és az ezeket kísérő mellékreakciók, és az így megvalósított reakciók végpontját már valóban az eddig általánosan elfogadott kék szín megjelenése jelzi.The aforementioned adverse reactions, partly described in the literature and partly recognized by us, clearly indicate that the use of excess metal sodium is harmful; Acceptance of the blue endpoint, which is generally accepted in the art so far, represents an excess of sodium in peptide chemical reduction and thus leads to side reactions. From our parallel reactions, it can be clearly deduced that in the peptide chemistry only a small excess of sodium is required to remove the protecting groups, as the salt formation that occurs at the same time as the deprotection also consumes little sodium. Since these reactions are parallel, although at a much lower rate, these reactions cannot be completely eliminated. On the other hand, the addition of the metal sodium necessary for the parallel reactions to complete the reaction will result in the completion of these reactions and the accompanying side reactions, and the endpoint of the reactions thus achieved will be indicated by the appearance of the generally accepted blue color.

Az elméletileg számított mennyiségű nátrium alkalmazásával teljesen elkerülhető a karboxamidcsoport redukciója alkohollá, az N-terc-butiloxikarbonil-csoport hasadása, a megképződött hidantoinszármazék továbbalakulása és a dezaminálódás, hasonlóképpen jelentős mértékben visszaszorul az egyidejűleg lejátszódó transzpeptidáció és dezamidálódás. +By using theoretically calculated amounts of sodium, the reduction of the carboxamide group to the alcohol, the cleavage of the N-tert-butyloxycarbonyl group, the conversion of the hydantoin derivative formed, and the deamidation, concomitant transpeptidation and deamidation are significantly reduced. +

Az elméletileg szükséges fémnátrium mennyiségét minden esetben a fémnátriummal eltávoíítandó védöcsoportok száma alapján állapítjuk meg (védőcsoportonként 2 g-atom/mól); így például a három eltávoíítandó védőcsoportot tartalmazó oxitocin esetében 6 g-atom/mól az elméletileg szükséges fémnátrium-mennyiség. Ez a számítási alap olyan esetekben is érvényes, amikor a molekula egyéb elemi nátriummal reagálni képes csoportokat is tartalmaz, hiszen az eljárás célja éppen a védőcsoportok szelektív lehasítása, vagy annak elkerülése, hogy ezek az egyéb csoportok is reagáljanak a nátriummal. Ha a kezelendő peptid fémnátriummal nem reagáló csoportokat vagy szubsztituenseket is tartalmaz, ezek a találmány szerinti eljárást nem zavarják, így ezeket nem szükséges figyelembe venni.The amount of metal sodium theoretically required is determined in each case by the number of protecting groups to be removed with the metal sodium (2 g / mole per protecting group); For example, for the oxytocin containing the three protecting groups to be removed, the amount of metal sodium theoretically required is 6 g / mole. This basis of calculation also applies when the molecule also contains groups capable of reacting with other elemental sodium, since the purpose of the procedure is to selectively cleave protecting groups or to prevent these other groups from reacting with sodium as well. If the peptide to be treated contains groups or substituents that do not react with metal sodium, they do not interfere with the process of the present invention and need not be considered.

Eljárásunk széles körű alkalmazhatóságát mutatja az oxitocin gyártása N-benziloxikarbonil-%benzil-L-ciszteinil-L-tirozil-L-glutaminil-L-aszparaginil-S-benzil-L-ciszteinil-L-prolil-L-leucil-glicinamidból (védett nonapeptidamid, N-benziloxikarbonil-S,S'-dibenzil-oxitocein) és S,S'-dibenziloxiloceinböl.The wide applicability of our process is demonstrated by the production of oxytocin from N-benzyloxycarbonyl% benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucylglycinamide nonapeptidamide, N-benzyloxycarbonyl-S, S'-dibenzyloxytocene) and S, S'-dibenzyloxyloxin.

7,5 g (5,67 mmol) védett nonapeptidamidot vízmentes körülmények között keveréssel l liter cseppfolyós ammóniában oldunk, és az oldatba 913 mg (39,7 mg-atom, 7 g-atom/mol peptid) fémnátriumot szórunk. A nátrium 5 perc alatt úgy elreagál, hogy az oldat nem kékül meg ezalatt öszszefüggöen. A tiszta oldatot vákuumban bepároíjuk. A szilárd maradékot 6 liter ionmentes vízben oldva a szokásos módon (151 959 sz. magyar szabadalmi leírás) hidrogén-peroxid jelenlétében leve-41Protected nonapeptide amide (7.5 g, 5.67 mmol) was dissolved in 1 L of liquid ammonia under anhydrous stirring, and 913 mg (39.7 mg, 7 g / mol peptide) of metal sodium was added to the solution. Sodium reacts within 5 minutes so that the solution does not become blue. The clear solution was evaporated in vacuo. The solid residue was dissolved in 6 liters of deionized water in the usual manner (U.S. Pat. No. 151,959) in the presence of hydrogen peroxide.

185 312 gő-átbuborékoltatással oxidáljuk. Ilyen módon összesen 1,88 millió NE oxitocint kapunk, amely az oxitocin 450 NE/mg biológiai aktivitásával számolva 73,2%-os hozamnak felel meg.185 312 by steam bubbling. In this way, a total of 1.88 million IU oxytocin is obtained which corresponds to a yield of 73.2% based on 450 IU / mg oxytocin.

Azonos mennyiségű védett nonapeptidamid redukcióját 11 g-atom/mól peptid fémnátriummal végezve 1,49 millió NE (58,2%) oxitocint kapunk. A redukció során a reakcióelegy átmenetileg megkékült, majd végeredményben fehér szuszpenziót kaptunk. 15,4 g-atom/mól peptid fémnátriummal redukálva a védett nonapeptidamidot 0,83 millió. NE (32,2%) oxitocint kapunk. Ebben a redukcióban már tartósan kék szuszpenzió maradt a reakcióelegy, és a nátrium fölöslegét ammóniumkloriddal reagáltattuk el.Reduction of the same amount of protected nonapeptidamide with 11 g atom / mol of peptide metal sodium gives 1.49 million IU (58.2%) of oxytocin. During the reduction, the reaction mixture was temporarily blue, and a white slurry was finally obtained. 15.4 g-atom / mole of peptide with metal sodium reduced the protected nonapeptidamide by 0.83 million. NO (32.2%) was obtained as oxytocin. In this reduction, a blue suspension was retained for a long time, and excess sodium was reacted with ammonium chloride.

Hasonló eredményeket kaptunk az S,S'-dimbenzil-oxitocin redukciójakor is. A biológiai aktivitás maximumát ebben az esetben 5 g-atom/mol peptid fémnátriummal értük el. Ez megfelel annak a 7 g-atom/mol peptid nátriummennyiségnek, amelyet a védett nonapeptidamid optimális redukciójához használtunk, mivel ebben az esetben nincs szükség az N-benziloxikarbonil-csoport hasítására.Similar results were obtained for the reduction of S, S'-dimbenzyloxytocin. The maximum biological activity in this case was reached with 5 g atom / mol of peptide metal sodium. This corresponds to the amount of sodium of 7 g atom / mol of peptide used for optimal reduction of the protected nonapeptidamide, since no cleavage of the N-benzyloxycarbonyl group is required in this case.

A védett nonapeptidamid redukcióját 56,7 mmolos méretben is elvégeztük 7 g-atom/mol peptid fémnátriummal. Teljesen hasonló eredményeket kaptunk, mint az előző, kisebb méretben végzett reakcióban.Reduction of the protected nonapeptidamide was also performed in 56.7 mmol size with 7 g atom / mol peptide metal sodium. Totally similar results were obtained as in the previous smaller scale reaction.

Megjegyezzük, hogy az oxitocingyártás során kapott oldat oxitocinkoncentrációját nemcsak biológiai értékméréssel, hanem nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálattal is meghatároztuk, és a két vizsgálat eredményei megegyeznek egymással.It is noted that the oxytocin concentration of the solution obtained during the oxytocin production was determined not only by biological measurement but also by high performance liquid chromatography and the results of the two tests are identical.

Mindezek a tapasztalatok és megfigyelések azt igazolják egyértelműen, hogy a peptidek tozil- és benzilcsoportjának eltávolításához nem szükséges a reakció végpontjaként a rövidebb-hosszabb ideig tartós kék szín fenntartása. Ehelyett, a peptid aminosav-összetételétől függően, csupán kis feleslegben alkalmazzuk a nátriumot. Az elméletileg szükséges nátrium mennyiségét fémnátriummal eltávolítható védőcsoportként 2 g-atom/mol peptid értéknek fogadjuk el. Már maga ez is kis felesleget jelent, mivel minden reakcióban 1,2-difenii-etán is képződik. A peptid egyéb funkciós csoportjainak sóképzése káros mellékreakciók forrása, ezért csak akkora fölöslegben adagoljuk a nátriumot, hogy a védőcsoportok hasítási reakciójával kompetitív reakciókban fogyó nátrium mennyiségét pótoljuk a védöcsoportok hasításának teljessé tételére. Olyan esetekben, amikor már ez a nátriumfölösleg is mellékreakciókhoz vezet, célszerű a nátriumot az elméletileg számítottnál kisebb mennyiségben alkalmazni, mivel így a kívánt végtermék jobban izolálható a védőcsoporto(ka)t tartalmazó peptidek mellől, mint az esetleg hasonló sajátságú melléktermékektől a tisztítási műveletek során.All these experiences and observations clearly demonstrate that the removal of the tosyl and benzyl groups of the peptides does not require the maintenance of a shorter to longer lasting blue color as the endpoint of the reaction. Instead, only a small excess of sodium is used, depending on the amino acid composition of the peptide. The theoretically required amount of sodium is accepted as a 2 g-atom / mol peptide as a metal-removable protecting group. This in itself means a small excess since 1,2-diphenylethane is also formed in each reaction. The salt formation of other functional groups of the peptide is a source of adverse side reactions, so only an excess of sodium is added to replace the amount of sodium consumed in competitive reactions by protecting group cleavage to complete the cleavage of protecting groups. In cases where this excess sodium leads to side reactions, it is preferable to use sodium in amounts lower than theoretically estimated, since this will allow the desired end product to be better isolated from the protecting group peptides than from any similar by-products during purification operations.

A találmány tárgya tehát olyan új eljárás védőcsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékok Ν-benziloxikarbonil-, O- és S-benzil- valamint N-p-toluolszulfonil-védőcsoportjainak eltávolítására cseppfolyós ammóniában, fémnátriummal, amelynek során a fémnátriumot a védőcsoportok eltávolításához elméletileg szükséges menynyiség 90-115%-ának megfelelő, de a reakcióelegy teljes térfogatában kék színeződést okozó mennyiségnél kisebb mennyiségben alkalmazzuk. Olyan esetekben, amikor a védett peptid a lehasítandó védőcsoportokon kívül más nátriummal reagáló csoportot, így különösen hidroxil-, karboxil- és/ vagy karboxamidcsoportot, továbbá például imidazoI-NH vagy indol-NH csoportot is tartalmaz, a fémnátriumot célszerűen csak a védöcsoportok eltávolításához elméletileg szükséges mennyiség’ 90-100%-ának megfelelő mennyiségben alkalmazzuk. Ezáltal kellő mértékben biztosítjuk az eljárás szelektivitását, minthogy az említett egyéb csoportokkal a fémnátrium sokkal lassabban reagál és így ezek csak az elméleti mennyiséget meghaladó nátrium jelenlétében lépnének számottevő mértékben reakcióba. így a találmány szerinti eljárással biztosíthatjuk, hogy a védőcsoport(ok) fémnátriummal történő lehasításakor az adott esetben jelenlévő egyeb, fémnátriummal reagálni képes csoportok legfeljebb csak minimális mértékben lépjenek a nátriummal reakcióba és egyéb káros mellékreakciók se lépjenek fel számottevő mértékben.The present invention therefore relates to a novel process for the removal of Ν-benzyloxycarbonyl, O- and S-benzyl and Np-toluenesulfonyl protecting groups of amino acid and peptide derivatives containing a protecting group in liquid ammonia with metal sodium in the amount of 90-1 theoretically required to remove the protecting groups. but less than the total volume of the reaction mixture which causes blue discoloration. In cases where the protected peptide contains a sodium reactive group other than the protecting groups to be cleaved, in particular hydroxyl, carboxyl and / or carboxamide groups, such as imidazole-NH or indole-NH, the metal is preferably only theoretically necessary for deprotection. 90-100% by volume. Thereby, sufficient selectivity of the process is assured, since the metal sodium reacts much more slowly with the other groups mentioned and would only react in the presence of excess sodium in excess of the theoretical amount. Thus, the process of the present invention ensures that when the protecting group (s) is cleaved with metal sodium, any other metal-reactive groups that may be present will not react to the sodium to a minimum and other adverse side effects will not be significant.

A találmány szerinti eljárás nemcsak a védőcsopoi t-eltávolítási reakció egyértelműbb megvalósítását teszi lehetővé, amely ebben az esetben nagycbb hozamot, tisztább és könnyebben tisztítható végterméket jelent, hanem a reakciók méretének jelentős növelését, akár ipari méretű megvalósítását is anélkül, hogy ez károsan befolyásolná a végtermék minőségét, és csökkentené a hozamot. Eljárásunk előnye, hogy az említett mellékreakciókra vagy egyáltalán nincs lehetőség, vagy a minimumra szoríthatók vissza,The process of the present invention not only enables a clearer deprotection reaction, which in this case results in a higher yield, a cleaner and easier to clean end product, but also a significant increase in the size of the reactions, even industrial scale, without adversely affecting the final product. quality and lower your yield. The advantage of our procedure is that these side effects are either not at all possible or can be kept to a minimum,

A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik.The following examples illustrate the practice of the present invention in more detail.

A példákban az aminosav- és peptidszármazékok jelölésére használt rövidítések az IUPAC.IUB által ajánlottak (J. Bioi. Chem. 247, 977 1972). További rövidítések: Z = N-benziloxikarbonil, ‘Bj = tercier-butil, Boc = N-terc-butil-oxikarboniBzl = benzil, Hse = L-homoszerin.Abbreviations used in the examples to denote amino acid and peptide derivatives are recommended by IUPAC.IUB (J. Bioi. Chem. 247, 977 1972). Further abbreviations are: Z = N-benzyloxycarbonyl, 'Bj = tert-butyl, Boc = N-tert-butyloxycarbonylBzl = benzyl, Hse = L-homoserine.

Az olvadáspont-meghatározások dr. Tottoli-féle készülékben (Büchi, Svájc) történtek.Melting point determinations were made by dr. They were made in a Tottoli apparatus (Büchi, Switzerland).

A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokat előregyártott kovasavgél adszorbensen (DCFertigplatten, Merck) végeztük az alábbi oldószerelegyekben:Thin layer chromatography was performed on a precast silica gel adsorbent (DCFertigplatten, Merck) in the following solvent mixtures:

1. etil-acetát: (piridin : ecetsav: víz = 20:6:11) = = 19:1 etil-acetát: (piridin : ecetsav : víz = 20: 6:11) = = 9:1 etil-acetát: (piridin : ecetsav: víz = 20:6:11) = = 4:1 etil-acetát: (piridin : ecetsav : víz = 20:6:11) =1. ethyl acetate: (pyridine: acetic acid: water = 20: 6: 11) = = 19: 1 ethyl acetate: (pyridine: acetic acid: water = 20: 6:11) = = 9: 1 ethyl acetate: (pyridine: acetic acid: water = 20: 6: 11) = = 4: 1 ethyl acetate: (pyridine: acetic acid: water = 20: 6: 11) =

3:2 etil-acetát: (piridin: ecetsav: víz = 20:6:11) = = 2:33: 2 ethyl acetate: (pyridine: acetic acid: water = 20: 6: 11) = = 2: 3

A krorrtátogramokat ninhidrinnel, valamint klórozást követően Kl-tolidinnel hívtuk elő.The chororthatograms were obtained with ninhydrin and after chlorination with K-tolidine.

Az anyagkeverékek oszlopkromatográfiás elválasztásához 62-200 fim szemcseméret-tartományú kovasavgélt (Kieselgel G) használhatunk. Az eluciöt etil-acetáttal vagy az előzőekben felsorolt oldószereiegyekkel végeztük. Az elválasztandó anyag5Column chromatography on silica gel (Kieselgel G) of 62-200 µm particle size can be used. Elution was performed with ethyl acetate or the solvent mixtures listed above. Material to be separated5

-518 keveréket a súlyának ötven-, százszoros mennyiségű kovasavgélen választottuk szét 100-200 ml · óra^_I · kg^-1 eluciós sebességgel. Megjegyezzük, hogy az oszlopkromatográfiás tisztítások során csak arra törekedtünk, hogy a melléktermékeket a szerkezetük meghatározásához megfelelő tisztaságban izoláljuk. Ezeket az elválasztásokat nem optimáltuk.The -518 mixture was separated on a silica gel of ^fifty to 100 times its weight at an elution rate of 100-200 ml · hr- ¹ kg- ¹ . It should be noted that purification by column chromatography merely sought to isolate the by-products in sufficient purity to determine their structure. These separations have not been optimized.

A fajlagos optikai forgatóképesség mérése Perkin Elmer 141 számkijelzésű fotoelektromos polariméteren történt. ,Specific optical rotation was measured on a Perkin Elmer 141-digit photoelectric polarimeter. .

Az NMR-színképek Varian EM 360 műszerrel,NMR spectra with Varian EM 360,

TMS belső standard alkalmazásával készültek.They were made using an internal standard TMS.

A nagynyomású folyadékkromatográfiás méréseket Hewlett-Packard 1081 A típusú, Schoffel 770 változtatható hullámhosszú detektorral, Roadyne 7010 loop-injektorral és KUTESZ 185 típusú kétcsatornás irószerkezettel ellátott berendezésben végeztük. Az elválasztáshoz nucleosil 10 C_l8 (Chrom pack B. V.) 250 mm hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű töltetet használtunk. Az eluálást A: B = 4:6 eleggyel végeztük (A = metanol: acetonitril = 5 : l; B = pH 2,2-es Mcllvain pufferoldat tízszeresére hígítva, és nátrium-szulfáttal 0,1 mól/1 koncentrációjúra állítva); 500 μ\ oxitocinoldatot fecskendeztünk a rendszerbe, és a mérést 1 ml/perc áramlási sebességgel végeztük, 210 nm-en detektálva az oldatok elnyelését. Kiértékelésre a külső standard módszert alkalmaztuk. Standardként tiszta oxitocint használtunk, amelynek biológiai aktivitá- ^3C sát előzőleg meghatároztuk.HPLC measurements were performed on a Hewlett-Packard 1081 A type Schoffel 770 variable wavelength detector, a Roadyne 7010 loop injector and a KUTESZ 185 dual-channel scanner. Separations were Nucleosil used, long charge 10 C _l8 (Chrom pack BV) of 250 mm, inner diameter 4.6 mm. Elution was carried out with A: B = 4: 6 (A = methanol: acetonitrile = 5: 1; B = diluted ten-fold with pH 2.2 Mcllvain buffer and adjusted to 0.1 M sodium sulfate); 500 μl of oxytocin solution was injected into the system and the measurement was carried out at a flow rate of 1 ml / min and the absorbance of the solutions was detected at 210 nm. The external standard method was used for evaluation. Standard there is used pure oxytocin having biological aktivitá- ^3C SAT previously determined.

A vékonyréteg-elektroforézist CAMAG (Unttem, Svájc) típusú készüléken, Moderey-Na Co. Polygram SIL G/UV₂₅₄ kovasavgél lemezeken,Thin-layer electrophoresis on a CAMAG (Unttem, Switzerland) apparatus, Moderey-Na Co. Polygram SIL G / UV ₂₅₄ silica gel plates,

800 V feszültségen a következő pufferoldatokban ³⁵ végeztük:At 800 volts, we performed ^{35 in} the following buffer solutions:

pH 1,9: 80 ml ecetsav+ 20 ml hangyasav+ 90 ml víz pH 4,3: 8 ml piridin + 12 ml ecetsav+ 980 ml víz pH 6,5: 100 ml piridin+ 4 ml ecetsav+ 896 ml víz.pH 1.9: 80 ml acetic acid + 20 ml formic acid + 90 ml water pH 4.3: 8 ml pyridine + 12 ml acetic acid + 980 ml water pH 6.5: 100 ml pyridine + 4 ml acetic acid + 896 ml water.

Az elektroforetogramokat ninhidrinnel hívtuk elő.Electrophoretograms were obtained with ninhydrin.

A védőcsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékok kezelését fémnátriummal cseppfolyós ammóniában a következőképpen végeztük. ⁴⁵ Egy 250 ml-es háromnyakú gömblombikba, amelyet etanolfürdőben szénsavhóval hűtünk, körülbelül 150 ml, fémnátriumról desztillált ammóniát csapunk le. Az ammóniagáz paraffinolajat tartalmazó gázmosón keresztül buborékoltatva desztillál e! a ⁵⁰ lombikból. Ha a kellő mennyiségű ammónia összegyűlt, a gázbevezetést és a hűtést megszüntetjük, a mágneses keverést megindítjuk, és egy gumicsövön keresztül csatlakoztatott adagolókapszulából az előre kiméri cs paraffinolaj alatt tarlóit fémnátri- ⁵⁵ umból 1-2 mg-ot beejtünk az ammóniába, hogy vizmentességéről meggyőződjünk. A kísérleteket 5-10 mmól védett aminosav- vagy peptidszármazékkal végezzük. A továbbiakat 10 mmóios anyagmennyiségre közöljük. ⁶⁰ Treatment of the protected amino acid and peptide derivatives with metal sodium in liquid ammonia was carried out as follows. ⁴⁵ A 250 mL three-neck flask, which was cooled ethanol bath for carbon dioxide snow, precipitated down to about 150 mL, distilled from sodium ammonia. Ammonia gas is bubbled through a scrubber containing paraffin oil to distill it! out of ⁵⁰ flasks. When sufficient ammonia has been accumulated, the gas supply and cooling are stopped, magnetic stirring is initiated, and 1-2 mg of the metal sodium sodium ( ⁵⁵ mg) stored in a pre-weighed tube of paraffin oil through a rubber tube is dropped into anhydrous solution. The experiments were carried out with 5-10 mM protected amino acid or peptide derivatives. Further details are given for 10 mm material. ⁶⁰

A kék ammóniaoldatba óvatosan beadagolunk 10 ml védett aminosav- vagy peptidszárrhazékot, majd 10 mg atomnyi részletekben a fémnátriumot.Carefully add 10 ml of the protected amino acid or peptide derivative to the blue ammonia solution followed by 10 mg of atomic metal in portions.

Ha a fémnátrium elreagált, vagy 15-20 percig kék maradt a reakcióelegy, beszórunk a beadagolt fém- ⁶⁵ 6If the sodium reacted, or 15-20 minutes of the reaction mixture stayed blue, sprayed on the metal added ⁶⁵ 6

5312 nátriummal egyenértékű mmólnyi ammóniumkloridot a nátriumsó(k) fölszabadítására és az esetleges nátriumfolösleg elreagáltatására. A kapott oldatot 20-30 °C-os fürdőben szárazra pároljuk. ⁵ A maradékot 50-100 ml vízben, etanolban vagy a kettő elegyében oldjuk. Az oldat kémhatását tömény sósavval pH 3-7 közé állítjuk a további földolgozástól függően.5312 milliliters of sodium equivalent to liberate the sodium salt (s) and react for any excess sodium. The resulting solution was evaporated to dryness in a bath at 20-30 ° C. ⁵ The residue was dissolved in 50-100 ml of water, ethanol or a mixture of the two. The pH of the solution is adjusted to pH 3-7 with concentrated hydrochloric acid depending on further tillage.

7. példaExample 7

Az N-benziloxíkarbonil-L-prolinamid redukciója. 15 a) 5 mmól Z-Pro-NH₂-ot 5 mg-atom fémnátriummal kezelve fehér szuszpenziót kapunk. A következő 5 mg-atom fémnátrium hatására a reakcióelegy 15 percen keresztül halványkék maradt. A reakcióelegyet a szokásos módon dolgozzuk fel. A maradékot 50 ml etanolban oldjuk, és az oldat kémhatását pH 7-re állítjuk. A vékonyrétegkromatogramon a várt H-Pro-NH₂-on (Rf: 0,55, Rf: 0,95) kívül a prolin hidantoinszármazékát (Rf: 0,55, Rf: 0,95) is kimutattuk. A kiindulási Z-Pro-NH₂ (Rf: 0,45) teljesen elreagált.Reduction of N-benzyloxycarbonyl-L-prolinamide. 15 a) 5 mmol of Z-Pro-NH ₂ is treated with 5 mg of metal sodium to give a white suspension. The next 5 mg of sodium metal left the reaction mixture pale blue for 15 minutes. The reaction mixture is worked up in the usual manner. The residue was dissolved in ethanol (50 mL) and the pH of the solution was adjusted to pH 7. In addition to the expected H-Pro-NH ₂ (Rf: 0.55, Rf: 0.95), the hydantoin derivative of proline (Rf: 0.55, Rf: 0.95) was detected in the TLC. The starting Z-Pro-NH ₂ (Rf: 0.45) was completely reacted.

b) 5 mmol Z-Pro-NH₂ redukcióját 15 mg-atom fémnátriummal végezve nagyon heterogén elegyet kaptunk, mivel a hidantoinszármazék (Rf: 0,90) további reakciókba lép a nátriummal, és több vegyület (Rf: 0,05-0,25) képződik.b) Reduction of 5 mmol of Z-Pro-NH ₂ with 15 mg of metal sodium gave a very heterogeneous mixture as the hydantoin derivative (Rf: 0.90) further reacts with sodium and several compounds (Rf: 0.05-0, 25) is formed.

2. példaExample 2

Az N-terc-butiloxikarbonÍl-giicinamid kezelése mmol Boc-Gly-NH,-ot 10 mg-atom fémnátriummal reagáítatva fehér szuszpenziót kapunk. A földolgozáskor a maradékot vízben szuszpendáljuk, az elegy kémhatását pH 6-7-re állítjuk tömény sósavval, majd háromszor kloroformmal kirázzuk. A szerves fázist vákuumban bepároljuk. A maradékot éterben kristályosítjuk, így 1 mmol kiindulási Boc-Gly-NH<ot (Rf: 0,35) nyerünk vissza. Az éteres szűrletet vákuumban bepároljuk, és a maradékot éter-n-hexán (8 : 2) eleggyel oszlopkromatografáljuk. Az Rf: 0,70 kromatográfiás viselkedésű melléktermék (becsléssel a reakcióelegyben 20%) nem izolálható tiszta állapotban. A következő frakciókból 3,4 mmol N-terc-butil-oxikarbonil-etanol-amin (Rf: 0,55) nyerhető ki. A pH 6-7-es vizes oldat elektroforetogramján (pH 6,5-ös pufferoldatban) 1 : 1 arányban H-Gly-NH₂-ot és etanol-amint mutattunk ki.Treatment of N-tert-butyloxycarbonylglycinamide with Boc-Gly-NH, (10 mmol) reacts with 10 mg of sodium metal to give a white suspension. During cultivation, the residue was suspended in water, adjusted to pH 6-7 with concentrated hydrochloric acid, and extracted three times with chloroform. The organic phase is concentrated in vacuo. The residue was crystallized from ether to give 1 mmol of starting Boc-Gly-NH (Rf: 0.35). The ethereal filtrate was evaporated in vacuo and the residue was subjected to column chromatography with ether-n-hexane (8: 2). The by-product of Rf: 0.70 chromatography (estimated at 20% in the reaction mixture) cannot be isolated in pure state. From the following fractions 3.4 mmol of N-tert-butyloxycarbonyl-ethanolamine (Rf: 0.55) are obtained. H-Gly-NH ₂ and ethanolamine were detected in a 1: 1 ratio in the electrophoretogram of a pH 6-7 aqueous solution (pH 6.5 buffer).

3. példaExample 3

Aa. N-terc-butiloxikarbonil-L-aszparagin kezelése a) 10 mmol Boc-Asn-OH-t 10 mg-atom fémnátriummal reagáítatva fehér szuszpenziót kapunk. Ennek feldolgozásakor a maradékot etanolban oldottuk, az oldat kémhatását pH 7-re állítottuk tömény sósavval, majd vákuumban szárazra pároltuk. Vizmentesítésére többször etanolt hajtottunkAa Treatment of N-tert-butyloxycarbonyl-L-asparagine a) Reaction of 10 mmol of Boc-Asn-OH with 10 mg of metal sodium gives a white suspension. After working up, the residue was dissolved in ethanol, the pH of the solution was adjusted to pH 7 with concentrated hydrochloric acid, and then concentrated to dryness in vacuo. Ethanol was added several times to dehydrate

185 312 le róla vákuumban, majd a maradékot etanoíban szuszpendáltuk, és a nem oldódó sókat kiszűrtük, így a szűrlet bepárlását követően 9,3 mmol BocAsn-OH-t (R’: 0,25) nyertünk vissza. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint a redukcióban nem károsodott a Boc-Asn-OH.After removal of the filtrate by evaporation in vacuo, the residue was slurried in ethanol and the insoluble salts filtered off to give 9.3 mmol of BocAsn-OH (R ': 0.25). Thin layer chromatography showed no reduction in Boc-Asn-OH.

b) 10 mmol Boc-Asn-OH-t 20 mg-atom fémnátriummal kezelve kék szuszpenziót kapunk, amely 10 perc alatt kifehéredik. A földolgozáskor a maradékot 50 ml vízben oldottuk, az oldat kémhatását pH 3-ra állítottuk be, majd háromszor 20 ml etilacetáttal kiráztuk. A szerves fázis bepárlása után kapott maradékot éterben szuszpendáltuk. A kirázások közben kivált anyagok és az éteres szuszpenzió szűrésével 5,35 mmol Boc-Asn-OH-t (Rj: 0,25) nyertünk vissza. Az éteres szűrletből 2,5 mmol BocHse-ÖH-t (R’: 0,40) nyertünk ki diciklohexilammónium-sója (Rf :0,15) formájában. Olvadáspontja: 143-146 °C, [aj,² —3,25° (c = 2,0, dimetilformamidban).b) 10 mmol of Boc-Asn-OH is treated with 20 mg of sodium metal to give a blue slurry which becomes white in 10 minutes. During cultivation, the residue was dissolved in water (50 mL), adjusted to pH 3, and extracted with ethyl acetate (3 x 20 mL). After evaporation of the organic phase, the residue was suspended in ether. Filtration of the precipitated materials and the ethereal suspension gave 5.35 mmol of Boc-Asn-OH (Rj: 0.25). From the ethereal filtrate, 2.5 mmol of BocHse-OH (R ': 0.40) was obtained in the form of its dicyclohexylammonium salt (Rf: 0.15). M.p. 143-146 ° C, m.p. ^{2 -} 3.25 ° (c = 2.0 in dimethylformamide).

4. példaExample 4

Az N-terc-butiloxikarbonil-L-izoaszparagin kezeléseTreatment of N-tert-butyloxycarbonyl-L-isoasparagine

a) 8,6 mmol Boc-Asp-NH₂-t (Rj: 0,40) 8,6 mgatom fémnátriummal reagáltatva a vékonyrétegkromatogram szerint nem történik átalakulás.a) 8.6 mmol of Boc-Asp-NH ₂ -t (R: is reacted with 0.40) sodium metal in 8.6 mgatom transition occurs according to TLC.

b) 8,6 mmol Boc-Asp-NH₂-t 17,2 mg-atom fémnátriummal reagáltatva kék szuszpenziót katunk, amely 15 perc alatt fehér szuszpenzióvá alakult. A földolgozáskor a maradékot 100 ml vízben oldottuk, az oldat kémhatását tömény sósavval pH 3 és 4 közé állítottuk, majd háromszor 40 ml etilacetáttal kiráztuk. A szerves fázist vákuumban szárazra pároltuk, és a maradékot éterben szuszpendáltuk. Szűréssel 3,8 mmol (43%) Boc-Asp-NH₂-t nyertünk vissza. Az éteres szűrletet vákuumban bepároltuk, és a maradékot etil-acetáttal eluálva oszlopkromatografáltuk. Az első frakciókból bepárlás után n-hexánnal 0,75 mmol (8,7%) tercbutil-karbamátot (Rj: 0,85) izoláltunk, amelyet infravörös és ’H-magmágneses színképe alapján azonosítottunk. A további frakciókból bepárlás, majd éterben sóképzést követően 120 mg 3-(S)(terc-butiloxikarbonil-amino)-4-hidroxi-vajsavat (Rj: 0,55) diciklohexil-ammónium-sója (Rj: 0,15) formájában izoláltunk. Olvadáspontja: 129132 °C, infravörös és ¹H-magmágneses rezonanciaszínképe igazolja szerkezetét.b) Reaction of Boc-Asp-NH ₂ (8.6 mmol) with 17.2 mg of metal sodium sodium to a blue slurry which became a white slurry in 15 minutes. During cultivation, the residue was dissolved in water (100 mL), adjusted to pH 3 to 4 with concentrated hydrochloric acid, and partitioned between ethyl acetate (3 x 40 mL). The organic phase was evaporated to dryness in vacuo and the residue suspended in ether. Filtration gave 3.8 mmol (43%) of Boc-Asp-NH ₂ . The ethereal filtrate was evaporated in vacuo and the residue was column chromatographed with ethyl acetate. After evaporation of the first fractions, 0.75 mmol (8.7%) of tert-butyl carbamate (Rj: 0.85) was isolated from n-hexane and identified by its infrared and 1 H nuclear magnetic spectrum. From the remaining fractions, 120 mg of 3- (S) (tert-butyloxycarbonylamino) -4-hydroxybutyric acid (Rj: 0.55) was isolated as a dicyclohexylammonium salt (Rj: 0.15) from the remaining fractions. . 129132 ° C, infrared and ¹ H nuclear magnetic resonance.

5. példaExample 5

Az N-terc-butiloxikarbonil-L-glutamin kezeléseTreatment of N-tert-butyloxycarbonyl-L-glutamine

a) 10 mmol Boc-Gln-OH (Rf: 0,20) 10 mg-atom fémnátriummal gyorsan sót képez anélkül, hogy a reakcióelegy tartósan megkékülne. A földolgozást követően a vizes oldatban csak a kiindulási BocGln-OH jelenléte mutatható ki.a) 10 mmol of Boc-Gln-OH (Rf: 0.20) rapidly forms a salt with 10 mg of metal sodium without permanently blueing the reaction mixture. Only the initial BocGln-OH can be detected in the aqueous solution after soil cultivation.

b) 20 mg-atom fémnátriummal végezve a reakciót, a reakcióelegy kék szuszpenzió maradt 15 percen keresztül. Ekkor 20 mmol ammónium-kloriddal elreagáltattuk a nátrium fölöslegét és a sót felszabadítottuk. Az ammónia elpárologtatása után a maradékot 100 ml vízben oldottuk, és az oldat kémhatását pH 4-re állítottuk, majd háromszor 70 ml etil-acetáttal kiráztuk. A szerves fázist vákuumban bepároltuk, a maradékot éterben szuszpendáltuk. 6,33 mmol kiindulási Boc-GlnOH-t nyertünk vissza szűréssel. A szürletet vákuumban bepároltuk, és a maradékot kovasavgél oszlopon a 3. oldószereleggyel eluálva kromatografáltuk. A megfelelő frakciókat összegyűjtöttük, vákuumban szárazra pároltuk, majd a maradék 20 ml éterben készült oldatához 0,40 ml (2 mmol) diciklohexil-amint adtunk. így 1 mmol 2-(terc-butiloxikarbonil-L-amino)-4-hÍdroxi-valeriánsavat (R’ : 0,40) izoláltunk diciklohexil-ammónium-sója (R': 0,15) formájában- Olvadáspontja: 128-131 ’C. Szerkezetét infravörös és'H-magmágneses rezonanciaszínképével igazoltuk.b) Carrying out the reaction with 20 mg of metal sodium, the reaction mixture remained a blue suspension for 15 minutes. At this time, an excess of sodium was reacted with 20 mmol of ammonium chloride and the salt was liberated. After evaporation of the ammonia, the residue was dissolved in water (100 ml) and the pH of the solution was adjusted to pH 4 and extracted with ethyl acetate (3 x 70 ml). The organic phase was evaporated in vacuo and the residue suspended in ether. Starting Boc-GlnOH (6.33 mmol) was recovered by filtration. The filtrate was evaporated in vacuo and the residue was chromatographed on a silica gel column eluting with solvent mixture 3. The appropriate fractions were collected, evaporated to dryness in vacuo, and dicyclohexylamine (0.40 mL, 2 mmol) was added to a solution of the residue in ether (20 mL). 1 mmol of 2- (tert-butyloxycarbonyl-L-amino) -4-hydroxyhaleranoic acid (R ': 0.40) was isolated in the form of its dicyclohexylammonium salt (R': 0.15), m.p. 128-131 ' C. Its structure was confirmed by infrared and 1 H nuclear magnetic resonance spectra.

6. példaExample 6

Az N-terc-butíloxikarbonil-L-tirozinamid kezeléstN-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosinamide treatment

c) 10 mmol Boc-Tyr-NH₂-ot (Rj: 0,35) 10 mgatom fémnátriummal reagáltatva fehér szuszpenziót kapunk anélkül, hogy a reakcióelegy megkékülne. A földolgozást követően vékonyréteg-kromatográfiásan csak Boc-Tyr-NH,-ot mutattunk ki.c) Reaction of 10 mmol of Boc-Tyr-NH ₂ (Rj: 0.35) with 10 mg of metal sodium gives a white suspension without the reaction mixture becoming blue. Only Boc-Tyr-NH, was detected by TLC after land application.

b) 10 mmol Boc-Tyr-NH₂-ot 20 mg-atom fémnátriummal reagáltatva kék szuszpenziót kaptunk, amely 25 perc alatt kifehéredett. A szokásos feldolgozást követően a maradékot 100 ml 50%-os etanol oan oldottuk, az oldat kémhatását pH 7-re állítottuk. A pH 1,9-es pufTcroldatban készített elektroforetogramon L-tirozinamid jelenlétét mutattuk ki. \z oldatot vákuumban bepároltuk, a maradékot etanoíban szuszpendáltuk, a szervetlen sókat és a kiindulási Boc-Tyr-NH₂ egy részét kiszűrtük. A szűrletet vákuumban bepároltuk, majd a maradékot kovasavgél oszlopon először etil-acetáttal, majd a 2. oldószereleggyel eluálva kromatografáltuk A különböző frakciókat összegyűjtöttük, vákuumban szárazra pároltuk ezeket, és a maradékokat diizopropil-éter, valamint éter hozzáadásával megkristályosítottuk. Tisztán mindössze 58 mg (0,2%) N-terc-butil-oxikarbonil-L-tirozinoIt (Rj O, 70, olvadáspontja: 112-114 ’C) kaptunk, mivel a többi frakcióban terc-butil-karbamátíal volt szennyezve (Rj: 0,75). Az utóbbit szintén nem sikerült tisztán kinyerni. A további frakciókból 2 mmol Boc-Tyr-NH₂-ot (Rj: 0,55) és 1,2 mmol 3-(4hidioxi-fenil)-propionsavamidot (Rj: 0,40, olvadáspontja: 119-121 °C) izoláltunk.b) 10 mmol of Boc-Tyr-NH ₂ was reacted with 20 mg of sodium metal to give a blue slurry which was bleached in 25 minutes. After usual work-up, the residue was dissolved in 100 ml of 50% ethanol and the pH of the solution was adjusted to pH 7. The presence of L-tyrosinamide was detected on an electrophoretogram in pH 1.9 buffer. The solution was evaporated in vacuo, the residue was suspended in ethanol, and the inorganic salts and a portion of the starting Boc-Tyr-NH ₂ were filtered off. The filtrate was concentrated in vacuo and the residue was chromatographed on a silica gel column eluting with ethyl acetate and then solvent mixture 2. The various fractions were collected, evaporated to dryness in vacuo and the residue crystallized by addition of diisopropyl ether and ether. Only 58 mg (0.2%) of N-tert-butyloxycarbonyl-L-tyrosinol (R 10, 70, m.p. 112-114 ° C) was obtained purely because it was contaminated with tert-butyl carbamate in the other fractions (R 1). : 0.75). The latter could also not be obtained clearly. Further fractions were isolated with 2 mmol of Boc-Tyr-NH ₂ (Rj: 0.55) and 1.2 mmol of 3- (4-hydroxy-phenyl) -propionic acid amide (Rj: 0.40, m.p. 119-121 ° C). .

7. példaExample 7

Az N-benziloxikarbonil-L-aszparagin redukciójaReduction of N-benzyloxycarbonyl-L-asparagine

a) 10 mmol Z-Asn-OH-t 20 mg-atom fémnátriummal reagáltatva fehér, géles reakcióelegyet ka7a) 10 mmol of Z-Asn-OH is reacted with 20 mg of atomic metal sodium to give a white, gelatinous reaction mixture.

-7185 312 ptunk anélkül, hogy a szuszpenzió megkékiill volna. A szokásos feldolgozást követően a vékonyréteg-kromatogramon 1-2% kiindulási Z-Asn-OH-t (R³:0,20) mutattunk ki a várt L-aszparagin mellett (R/: 0). A pH 1,9-es pufferoldatban készített elektroforetogramon csak L-aszparagint mutattunk ki.-7185 312 pts without the suspension turning blue. Following standard work-up, TLC showed 1-2% starting Z-Asn-OH (R ³ : 0.20) with the expected L-asparagine (R / 0). Only L-asparagine was detected in the electrophoretogram in pH 1.9 buffer.

b) 10 mmol Z-Asn-OH-t 30 mg atom fémnátriummal reagáltatva tartósan kék szuszpenziót kaptunk, amelyet a szokásos módon dolgoztunk fel.b) Reaction of 10 mmol of Z-Asn-OH with 30 mg of atomic metal sodium gave a sustained blue suspension which was worked up in the usual manner.

Vékonyréteg-kromatográfiásan Z-Asn-OH-t nem tudtunk kimutatni. A pH 1,9-es pufferoldatban készített elektroforetogramon pár százaléknyi L-homoszerinlaktont mutattunk ki a várt L-asz.paragin és egy kevés azonosítatlan, erősen bázisos anyag mellett.Z-Asn-OH could not be detected by thin layer chromatography. The electrophoretogram in pH 1.9 buffer showed a few percent of L-homoserine lactone with the expected L-asparagine and some unidentified, highly basic material.

8. példaExample 8

Az N-benziloxikarbonil-L-tirozinamid redukciójaReduction of N-benzyloxycarbonyl-L-tyrosinamide

a) 6,5 mmol Z-Tyr-NH₂-ot 13 mg fémnátriummal kezelve fehér szuszpenziót kaptunk. A szokásos feldolgozás során a pH 7-re állított vizes oldatból 0,26 mmol (4,0%) kiindulási Z-Tyr-NH₂-ot nyertünk vissza. A pH 1,9-es pufferoldatban készült elektroforetogram szerint a reakcióban csak a várt H-Tyr-NH₂ képződött.a) 6.5 mmol of Z-Tyr-NH ₂ was treated with 13 mg of metal sodium to give a white suspension. During the usual work-up, the aqueous solution was adjusted to pH 7 with 0.26 mmol (4.0%) of the starting Z-Tyr-NH ₂ . According to the electrophoretogram in pH 1.9 buffer solution, only the expected H-Tyr-NH _{2 was} formed in the reaction.

b) 6,5 mmol Z-Tyr-NH₂ redukcióját 19,5 ingatom nátriummal végezve tartósan kék reakcióelegyet kaptunk, amelyet a szokásos módon dolgoztunk fel. A pH 1,9-es pufferoldatban készült elektroforetogramon a várt H-Tyr-NH₂-on kívül körülbelül 1% L-tirozinolt is kimutattunk.b) Reduction of 6.5 mmol of Z-Tyr-NH ₂ with 19.5 ppm of sodium gave a blue reaction mixture which was worked up in the usual manner. In addition to the expected H-Tyr-NH ₂ , about 1% L-tyrosinol was detected in the electrophoretogram in pH 1.9 buffer.

9. példaExample 9

Az N-benziloxikarbonil-L-aszparaginil-glicinamid redukciójaReduction of N-benzyloxycarbonyl-L-asparaginylglycinamide

a) 5 mmol Z-Asn-Gly-NH₂-ot 10 mg-atom fémnátriummal gyorsan elreagált és a reakcióelegy megkékülése nélkül fehér szuszpenzió képződött. A szokásos feldolgozást követően a vékonyrétegkromatogramon néhány százalék kiindulási ZAsn-Gly-NH₂-ot (R*: 0,45) mutattunk ki. A pH 1,9-es pufferoldatban készült elektroforetogramon a várt H-Asn-Gly-NH₂-on kívül pár százalék Hbéta-Asp-Gly-NH₂-ot és a ninhidrines előhívás kimutatási határának mennyiségében H-Asp-GlyNH₂-ot mutattunk ki.a) 5 mmol of Z-Asn-Gly-NH ₂ was reacted rapidly with 10 mg of metal sodium and a white slurry was formed without bleaching the reaction mixture. After standard work-up, a few percent of the starting ZAsn-Gly-NH ₂ (R *: 0.45) was detected in the TLC. In addition to the expected H-Asn-Gly-NH ₂ , a few percent Hb-Asp-Gly-NH ₂ and H-Asp-GlyNH ₂ were detected in the pH 1.9 electrophoretogram in addition to the expected H-Asn-Gly-NH ₂ we showed.

b) 5 mmol Z-Asn-Gly-NH₂-ot 15 mg-atom fémnátriummal reagáltatva kék szuszpenziót kaptunk, amely 35 perc alatt kifehéredett. A szokásos feldolgozást követően a pH 1,9-es pufferoldatban készült elektroforetogramon a várt H-Asn-Gly-NH₂ mellett 10-20%-nyi H-béta-Asp-Gly-NH₂-ot és H-Asp-Gly-NH₂-ot mutattunk ki.b) Reaction of 5 mmol of Z-Asn-Gly-NH ₂ with 15 mg of sodium metal gave a blue suspension which was bleached in 35 minutes. Following standard work-up, 10-20% H-Beta-Asp-Gly-NH ₂ and H-Asp-Gly- were added to the electrophoretogram in pH 1.9 buffer with the expected H-Asn-Gly-NH ₂ . NH ₂ was detected.

10. példaExample 10

Oxitocin előállítása védett nonapeptidamidból a) Egy 2 literes háromnyakú gömblombikba, amelyet etanolfürdőben szénsavhóval hütöttünk, liter fémnátriumról desztillált ammóniát csaptunk le. Amikor a kellő mennyiségű ammónia öszszegyült, a hűtést és a gázbevezetést megszüntettük, a mágneses keverést megindítottuk, majd egy adagolókapszulán keresztül 5-10 mg fémnátriumot adtunk az ammóniához. Az oldat legalább 5 percig tartó kék színe jelezte a vízmentes körülményeket. Az oldatba ezután 7,5 g (5,67 mmol) Z-Cys(Bzl)Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-G!y-NH₂-ot szórtunk, majd feloldódása után 913 mg (39,7 mgatom, 7 g-atom/mol) nátriumot szórtunk az oldatba, A nátrium körülbelül 5 perc alatt elreagált, miközben az oldat nem kékült meg összefüggően. Ezután az ammóniát 20-30 °C-os fürdőn elpárologtattuk, majd a maradékot vákuumban ammóniamentesítettük. A visszamaradó fehér anyagot 6 liter ionmentes vízben oldottuk és a szokásos módon oxidáltuk. így összesen 1,88 millió NE (73,2%) oxtocint kaptunk (biológiai értékmérés és nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat alapján). Ez 329 NÉ./mg biológiai aktivitásnak felel meg.Preparation of Oxytocin from Protected Nonapeptidamide (a) Ammonia was distilled from a liter of sodium metal in a 2-L three-necked round-bottomed flask cooled with carbonic acid in an ethanol bath. When sufficient ammonia was pooled, cooling and gas inlet were stopped, magnetic stirring was started, and 5-10 mg of sodium metal were added through a dosing capsule. The blue color of the solution for at least 5 minutes indicated anhydrous conditions. To the solution was then added 7.5 g (5.67 mmol) of Z-Cys (Bzl) Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys (Bzl) -Pro-Leu-Gly-NH ₂ and after dissolution 913 mg (39.7 mg atoms, 7 g / mole) of sodium was added to the solution. The sodium reacted for about 5 minutes while the solution did not become blue. The ammonia was then evaporated in a bath at 20-30 ° C and the residue was removed in vacuo to remove ammonia. The remaining white material was dissolved in 6 L of deionized water and oxidized in the usual manner. This yielded a total of 1.88 million IU (73.2%) of oxtocin (based on bioassay and HPLC). This corresponds to a biological activity of 329 U / mg.

h) Ί g-atom/mol fémnátriummal 15,0 g (11,34 mmol), illetve 75,0 g (56,7 mmol) védett nonapeptidámidot redukálva 315 NE/mg, illetve 331 NE/ mg oxitocint kaptunk.h) Reduction of the protected nonapeptidamide (15.0 g, 11.34 mmol) and 75.0 g (56.7 mmol) with Ί g atom / mol metal sodium yielded 315 IU / mg and 331 IU / mg oxytocin, respectively.

c) 7,5 g (5,67 mmol) védett nonapeptidamidotc) 7.5 g (5.67 mmol) of protected nonapeptide amide

1,43 g (62,2 mg-atom, 11 g-atom/mol) fémnátriummal az előzőekben leírt módon redukáltunk. A reakcióelegy 10 percre megkékült, majd fehér szuszpenzióvá alakult. Az oxidációt a szokásos módon végezve 1,49 millió NE (58,2%) oxitocint kaptunk. Ez 261 NE/mg biológiai aktivitásnak felel meg.1.43 g (62.2 mg atom, 11 g atom / mol) of metal sodium were reduced as described above. The reaction mixture turned blue for 10 minutes and then turned into a white suspension. The oxidation was carried out in the usual manner to give 1.49 million IU (58.2%) of oxytocin. This corresponds to a biological activity of 261 IU / mg.

d) 7,5 g (5,67 mmol) védett nonapeptidamidot 2,0 í g (87,4 mg-atom, 15 g-atom/mol) fémnátriummal kezelve az előzőekben leírt módon tartósan kék reakcióelegyet kaptunk. A nátrium fölöslegét ammónium-kloriddal reagáltattuk el. Ily módon 0,83 millió NE (32,2%) oxitocint kaptunk. Ez 145 NE/mg biológiai aktivitásnak feiel meg.d) Treated 7.5 g (5.67 mmol) of the protected nonapeptide amide with 2.0 g (87.4 mg, 15 g / mol) of sodium metal to give a sustained blue reaction mixture as described above. Excess sodium was reacted with ammonium chloride. This gave 0.83 million IU (32.2%) of oxytocin. This corresponds to a biological activity of 145 IU / mg.

II. példaII. example

Oxitocin előállítása S,S'-dibenzil-oxitoceinbőlPreparation of oxytocin from S, S'-dibenzyloxytocene

a) 6,74 g (5,67 mmol) S,S'-dibenzil-oxitoceint a szokásos módon 652 mg (28,35 mg-atom, 5 gatom/mol fémnátriummal reagáltatva víztiszta és a reakció során összefüggően nem megkékülő oldat képződött. Az oxidációt a szokásos módon végezve 1,65 millió NE (61,0%) oxitocint kaptunk. Ez 275 NE/mg biológiai aktivitásnak felel meg.a) S, S'-dibenzyloxytoceine (6.74 g, 5.67 mmol) was reacted in the usual manner with 652 mg (28.35 mg atoms, 5 g / mol of sodium metal) to give a clear solution which was not blue during the reaction. The oxidation was carried out in the usual manner to give 1.65 million IU (61.0%) of oxytocin, which corresponds to a biological activity of 275 IU / mg.

b) 6,74 g (5,67 mmol) S,S'-dibenzil-oxitoceint 913 mg (39,7 mg-atom, 7 g-atom/mol) fémnátriummal reagáltatva fehér szuszpenzió képződött. A szokásos módon oxidálva 1,28 millió NE (47,3%) oxitocint kaptunk. Ez 213 NE/mg biológiai aktivitásnak felel meg.b) S, S'-dibenzyloxytoceine (6.74 g, 5.67 mmol) was reacted with metal sodium (913 mg, 39.7 mg, 7 g / mol) to form a white suspension. Oxidation in the usual manner gave 1.28 million IU (47.3%) of oxytocin. This corresponds to a biological activity of 213 IU / mg.

c) 6,74 g (5,67 mmol) S,S'-dibenzil-oxitoceint 1,17 g (51,0 mg-atom, 9 g-atom/mol) fémnátriummal reagáltatva pár percre megkékülő elegy képződött, amely fehér szuszpenzióvá alakult. így 0,64 millió NE (23,7%) oxitocint kaptunk. Ez 107 NE/mg biológiai aktivitásnak felel meg.c) Reaction of 6.74 g (5.67 mmol) of S, S'-dibenzyloxytocaine with 1.17 g (51.0 mg, 9 g / mol) of sodium metal gave a blue-blueing mixture which became a white suspension. established. This gave 0.64 million IU (23.7%) of oxytocin. This corresponds to a biological activity of 107 IU / mg.

185 312185 312

Szabadalmi igénypontokPatent claims

Claims (2)

Szabadalmi igénypontokClaims 1. Eljárás védőcsoportot tartalmazó aminosavés peptidszármazékok Ν-benziloxikarbonil-, O- és S-benzil-, valamint N-p-toluolszulfonil-védöcsoportjainak eltávolítására cseppfolyós ammóniában, fémnátriummal, azzal jellemezve, hogy a fémnátriumot a védőcsoportok eltávolításához elméletileg szükséges mennyiség 90-115%-ának megfelelő, de a reakcióelegy teljes térfogatában kék színe- ¹0 ződést okozó mennyiségnél kisebb mennyiségben . alkalmazzuk.1. A method for removing β-benzyloxycarbonyl, O- and S-benzyl, and Np-toluenesulfonyl protecting groups containing a protected amino acid peptide derivative in liquid ammonia with metal sodium, characterized in that the metal sodium is 90-115% of the theoretical amount needed to remove the protecting groups adequate, but the blue reaction mixture throughout the volume of coloring agent quantities not exceeding ¹ 0 contract quantities. used. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja a lehasitandó védőcsoportok mellett más, fémnátriummal reagáló csoportot, különösen hidroxil-, karboxil- és/vagy karboxamidcsoportot is ⁵ tartalmazó aminosav- és peptidszármazékok említett védőcsoportjainak eltávolítására, azzal jellemezve, hogy a fémnátriumot a védőcsoportok lehasításához elméletileg szükséges mennyiség 90-100%-ának megfelelő mennyiségben alkalmazzuk.Process 2 The compound of claim 1 embodiment next to be cleaved protecting groups characterized remove other reactive metallic sodium groups, in particular hydroxyl, carboxyl carboxamide group is ⁵ containing and / or protecting groups of the amino acid and peptide derivatives referred to, by the sodium metal in the cleavage of protective groups 90-100% of the amount required theoretically. Ábra nélkülWithout a figure