HU176225B - Process for the isolation of glucagon from the supernatant of the basic crystallization in the process of producing insulin - Google Patents

Description

A találmány tárgya új eljárás glukagon kinyerésére az inzulin-előállítás során alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszóból.The present invention relates to a novel process for the recovery of glucagon from the supernatant from alkaline crystallization used in insulin production.

A találmány szerinti glukagon-kinyerési eljárás soránIn the glucagon extraction process of the invention

1. a glukagon-tartalmú fehérjét az inzulin előállításnál alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszóból1. glucagon-containing protein from the supernatant from alkaline crystallization used in insulin production

a) 4,2-6,6 pH-η legfeljebb 20tf% 1-4 szénatomos alkanol jelenlétében végzett izoelektromos ponton történő kicsapással, vagy(a) by precipitation at a pH of 4,2 to 6,6 at an isoelectric point in the presence of up to 20% v / v of a C 1 -C 4 alkanol;

b) ioncserélő kromatográfiával, a glukagon-tartalmú fehérjét adszorbensen megkötve, majd az adszorbenst híg bázissal — előnyösen 0,1 n ammónium-hidroxid-oldattal — eluálva, vagy(b) ion exchange chromatography, binding the glucagon-containing protein to an adsorbent and eluting the adsorbent with a dilute base, preferably 0.1 N ammonium hydroxide, or

c) az a) eljárásváltozat szerinti izoelektromos ponton történő kicsapás termékének a kicsapást követő, enyhén lúgos — előnyösen legfeljebb 8,5 pH-értékű — fenolos vizes oldatból történő kisózásával izoláljuk,c) isolating the product of precipitation at the isoelectric point of process variant a) from the slightly alkaline phenolic aqueous solution after precipitation, preferably having a pH of not more than 8.5,

2. a kapott szilárd anyag oldatából a glukagont valamely szervetlen só, előnyösen ammónium-szulfát hozzáadásával pH 1,5-2,7 tartományban elválasztjuk a többi fehérétől, és2. separating the glucagon from the solution of the resulting solid by addition of an inorganic salt, preferably ammonium sulfate, to the other proteins at a pH of 1.5 to 2.7, and

3. a 2. lépésben kapott glukagont feloldjuk, és3. dissolving the glucagon obtained in step 2, and

4,5-8,5 pH-értéken, 2—10 mg/ml glukagon-koncentráció mellett végzett egy vagy több kristályosítással tisztítjuk.It is purified by one or more crystallizations at a pH of 4.5 to 8.5 at a glucagon concentration of 2 to 10 mg / ml.

Röviddel azután, hogy 1921-ben Banting és Best az inzulint felfedezte, számos kutató [Muriin és munkatársai, J. Bioi. Chem. 56, 252 (1923) és Kimball és Muriin, J. Bioi. Chem. 58, 337 (1924)] megfigyelése szerint bizonyos inzulintartalmú hasnyálmirigy-kivonatok beadása után a vércukorszint emelkedik. A hiperglikémiás reakcióért felelős faktort hívták glukagonnak.Shortly after Banting and Best discovered insulin in 1921, many researchers [Muriin et al., J. Bioi. Chem. 56, 252 (1923) and Kimball and Muriin, J. Biol. Chem. 58, 337 (1924)], after administration of certain insulin-containing pancreatic extracts, blood glucose levels rise. The factor responsible for the hyperglycemic reaction was called glucagon.

Jelenleg a glukagon legfontosabb felhasználását az inzulin-okozta hipoglikémia kezelése jelenti. Mivel világszerte nő a cukorbetegek száma, a glukagon iránti kereslet is növekszik. Ezenfelül kutatás tárgyát képezi a glukagonnak szívrendellenességek gyógyítására való felhasználása. így ez a két alkalmazási terület növekvő igényeket támaszt a glukagon előállításával szemben, mely igények leginkább a természetes forrásokból származó glukagon kinyerésének a tökéletesítése útján elégíthetők ki.Currently, the most important use of glucagon is in the treatment of insulin-induced hypoglycemia. As the number of diabetics increases worldwide, demand for glucagon is also increasing. In addition, the use of glucagon for the treatment of cardiac disorders is being investigated. Thus, these two fields of application are increasingly demanding for the production of glucagon, which can best be met by improving the extraction of glucagon from natural sources.

Kristályos glukagon előállítását először 1953-ban írták le [Staub és munkatársai, Science 117,628 (1953), Staub és munkatársai, J. Bioi. Chem. 214, 619 (1955)]. Kiindulóanyagként az inzulin ipari előállítása során kapott amorf frakciót használták fel.The production of crystalline glucagon was first described in 1953 (Staub et al., Science 117,628 (1953), Staub et al., J. Biol. Chem., 214, 619 (1955)]. The starting material used was the amorphous fraction obtained in the industrial production of insulin.

Az inzulin ezen ipari előállításának lépései: a hasnyálmirigy-szövet savas-alkoholos extrakciója, a kivonat bepárlása, kicsapás nátrium-kloriddal, izoelektromos ponton történő kicsapás, többszöri alkoholos frakcionálás, derítés, kristályosítás cinkkel acetát-pufferból, mosás az amorf frakció eltávolítása céljából és a kapott cink-inzulin szárítása. Az amorf frakció mintegy 4 súly% glukagont és 7 súly% inzulint tartalmazott. Általában az amorf anyag kinyerése körülbelül 11-22 mg/kg hasnyálmirigy. A glukagon-eloállítás lépései: frakcionálás pH 6,7-nél, acetonos frakcionálás, frakciónak kicsapás pH 4,3-nál, két frakcionált kicsapás pH 2,5-nél és két laistályosítás karbamid-glikoll pufferből, pHThe steps of this industrial production of insulin are: acid-alcoholic extraction of the pancreatic tissue, evaporation of the extract, precipitation with sodium chloride, precipitation at the isoelectric point, multiple alcohol fractionation, clarification, zinc crystallization from acetate buffer and washing of the amorphous fraction. drying the resulting zinc insulin. The amorphous fraction contained about 4% glucagon and 7% insulin. Generally, the recovery of amorphous material is about 11-22 mg / kg of pancreas. Steps for glucagon production: fractionation at pH 6.7, fractionation with acetone, precipitation of fraction at pH 4.3, two fractional precipitation at pH 2.5, and two purifications from urea-glycol buffer, pH

8,6-nál. A kristályos glukagon kinyerése a száraz amorf anyag glukagontartalmának mintegy 20 súly%-a volt, ami körülbelül 0,088—0,176 mg glukagon/kg hasnyálmirigy kitermelésnek felel meg.8.6 at. Crystalline glucagon recovery was about 20% by weight of the dry amorphous glucagon content, which corresponds to about 0.088-0.176 mg glucagon / kg pancreatic yield.

A cink-inzulin citrát pufferből való közbenső kikristályosításának a bevezetése — a 2 626 228 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint - hathatósan csökkentette a marha-hasnyálmirigyből kiinduló inzulin-előállítás szükséges lépéseinek a számát. Míg megközelítőleg azonos mennyiségű amorf frakció képződött a mosási művelet folyamán, mint a régebbi eljárásnál, addig az amorf frakció glukagontartalma lecsökkent körülbelül 0,2 súly%-ra. Mint kiderült, a glukagon a citrát-pufferben maradt vissza a közbenső kristályosítás folyamán. A glukagont a citrát-pufferből cink-felesleggel való kicsapással nyerték ki, majd a cink eltávolítása céljából sós kicsapás és két, pH 5,1-nél illetve 5,6-nál végzett kicsapás következett. A citrát pufferből kinyert nyers glukagon körülbelül 1,77-2 mg/kg hasnyálmirigy, a tisztított glukagon kinyerése pedig mintegy 0,22—0,66 mg/kg hasnyálmirigy. A cink kicsapószer használata megnehezítette a cink tökéletes eltávolítását, és növelte a végső tisztított glukagonba átvitt inzulin mennyiségét.The introduction of intermediate crystallization of zinc insulin from citrate buffer, according to U.S. Patent No. 2,626,228, has effectively reduced the number of steps required to produce insulin from the bovine pancreas. While approximately the same amount of amorphous fraction was formed during the washing operation as in the older process, the glucagon content of the amorphous fraction was reduced to about 0.2% by weight. As it turned out, glucagon remained in the citrate buffer during the intermediate crystallization. Glucagon was recovered from the citrate buffer by precipitation with excess zinc, followed by saline precipitation and two precipitations at pH 5.1 and 5.6 to remove the zinc. Raw glucagon recovered from citrate buffer is about 1.77-2 mg / kg of pancreas and purified glucagon yields about 0.22-0.66 mg / kg of pancreas. The use of a zinc precipitator made it difficult to completely remove the zinc and increased the amount of insulin transferred to the final purified glucagon.

A 3 715 345 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet, melynek során az ecetsavas vizes-alkoholos hasnyálmirigy-extraktumot 7—8 pH-értékre állítják, és a kapott oldatot szulfonált makroretikuláris alkálifém-formájú, sztirol-divinilbenzol kopolimerre viszik fel, majd a gyantát megfelelő pufferrel mossák, a glukagont a gyantáról megfelelő vizes bázissal eluálják, az eluátum pH-ját 2 és 3 közé állítják, majd a glukagont nátriumklorid hozzáadásával csapják ki. A csapadékot kiszűrik, és a sóformájú szüredék szolgál a standard glukagon tisztítási lépések kiindulási anyagául. Ilyen tisztítási eljárások a leírásban ismertetett Staub-féle módszerek. A fenti szabadalmi leírás azonban nem glukagonnak inzulintól való elválasztására, hanem inzulin és az ahhoz igen közel álló egyéb proteinek, például proinzulin, dezamidoinzulin, egymástól és a hasnyálmirigy-extraktumban levő összes más proteintől való elválasztására vonatkozik.No. 3,715,345. U.S. Pat. No. 4,193,125 discloses a process for adjusting acetic acid aqueous alcoholic pancreatic extract to a pH of 7-8 and applying the resulting solution to a styrene-divinylbenzene copolymer in the form of a sulfonated macroreticular alkali metal, followed by washed with buffer, the glucagon is eluted from the resin with a suitable aqueous base, the pH of the eluate is adjusted to 2 to 3, and the glucagon is precipitated by the addition of sodium chloride. The precipitate is filtered off and the salt-like filtrate serves as a starting material for standard glucagon purification steps. Such purification procedures include the Staub methods described herein. However, the above patent does not relate to the separation of glucagon from insulin but to the separation of insulin and other proteins closely related thereto, such as proinsulin, desamidine insulin, and all other proteins in the pancreatic extract.

A glukagon az eljárás során melléktermékként keletkezik, és a Staub-féle tisztításnak alávetve minimálisan is a következő lépéseket kell elvégezni.Glucagon is produced as a by-product during the process and, subject to Staub purification, the following steps should be minimized.

1. acetonos frakcionálás,1. acetone fractionation,

2. frakcionált kicsapás pH = 4,3 értéken,2. fractional precipitation at pH 4.3,

3. legalább két frakcionált kicsapás pH = 2,5 értéken, és3. at least two fractionated precipitations at pH 2.5, and

4. legalább két átkristályosítás pH = 8,6 karbamid-glicin pufferből.4. at least two recrystallizations from a pH 8.6 urea glycine buffer.

Általánosságban a nyers hasnyálmirigy-extraktumban levő proteinek savas illetve bázikus jellegük szerint csoportosíthatók. Az inzulin és inzulin-jellegű proteinek savas jelleműek, és a nyers hasnyálmirigy-extraktumnak csak kis részét alkotják. Az összes fennmaradó protein, beleértve a glukagont is, bázikus. Ezért a korábbi irodalmi források sze rinti módszereknél, melyeknél kopolimert használnak, az összes bázikus protein e kopolimerhez kötődik, mint a fenti Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerinti eljárásban is, amely lényegében ioncserélő folyamat, mely szelektíven eltávolítja a proteineket a nyers hasnyálmirigy-extraktumból. Az irodalomban található vizes bázissal és sóval végzett kicsapásos módszer egyszerű izolálási lépés, és glukagonon és bármely más bázikus proteinen egyaránt alkalmazható. Bár a nyers extraktumban levő glukagon gyakorlatilag teljesen kiválik a vizes bázis hatására, a sóval kicsapott protein glukagon tartalma általában 5%-nál kisebb. így a fenti szabadalmi leírásban szereplő eljárás hozzávetőlegesen csak a találmány szerinti eljárással izolált glukagon az izolálási lépés során kapott protein összmennyiségének csupán kis részét jelenti.In general, proteins in crude pancreatic extract can be classified according to their acidic or basic nature. Insulin and insulin-like proteins are acidic in nature and make up only a small proportion of the crude pancreas extract. All remaining proteins, including glucagon, are basic. Therefore, in prior art methods using a copolymer, all basic proteins bind to this copolymer, as in the process of the above-mentioned U.S. Patent, which is essentially an ion exchange process that selectively removes the proteins from the crude pancreas extract. . The prior art precipitation method with aqueous base and salt is a simple isolation step and can be used with glucagon and any other basic protein. Although glucagon in the crude extract is virtually completely precipitated by the aqueous base, the glucagon content of the salt precipitated protein is generally less than 5%. Thus, the process disclosed in the above patent represents only a small fraction of the total amount of glucagon isolated by the process of the invention during the isolation step.

A glukagon elválasztás kiindulási anyagául a jelen találmány egységes kiindulási anyaga előtt, azaz a lúgos kristályosítás felülúszójának használata előtt, az egyetlen glukagon-forrás egy amorf alapanyag volt. Ez jól látható a Staub-féle módszereknél, ahol cink-inzulin-kristályok váltak ki és glukagont tartalmazó amorf réteg maradt vissza. Ezt a réteget manuálisan kellett eltávolítani a cinkkristályok felületéről a glukagon-kiindulási anyag nyerésére. Az amorf bázist sertés- vagy szarvasmarha pankreáz-extraktumból nyerték. A hiperglikémiás faktort pH = 7 értéken elbontották, majd a kicsapódott glukagont tisztították és szálképzéssel elválasztották.The starting material for glucagon separation before the uniform starting material of the present invention, that is, before using the supernatant of alkaline crystallization, was the only source of glucagon was an amorphous source. This can be clearly seen in the Staub methods, where crystals of zinc insulin were precipitated and an amorphous layer containing glucagon remained. This layer had to be manually removed from the surface of the zinc crystals to obtain the glucagon starting material. The amorphous base was obtained from pork or bovine pancreatic extract. The hyperglycemic factor was decomposed at pH 7, and the precipitated glucagon was purified and separated by fiber formation.

1961-től, mint azt a leírás bevezető részében is leírtuk, az inzulin cinkkel végzett kristályosítását citrátpuffer jelenlétében végezték. Ezen módszer csak sertéspankreáz esetén volt alkalmazható. A glukagon a cink-inzulin kristályok kicsapódása után a citrátos felülúszóban maradt, azonban az inzulinsó-kristályok is tartalmaztak glukagonkristályokat, tehát az elválasztás nem volt kielégítő. Az eljárás nem kielégítő tisztasága a sertéspankreázban található szennyezésekből adódott.From 1961, as described in the preamble of this specification, crystallization of insulin with zinc was performed in the presence of citrate buffer. This method was only applicable to porcine pancreas. Glucagon remained in the citrate supernatant after precipitation of the zinc-insulin crystals, but the insulin salt crystals also contained glucagon crystals, so the separation was not satisfactory. The unsatisfactory purity of the process was due to impurities in the swine pancreas.

A hasnyálmirigy-kivonatokon végzett vizsgálatok szerint az inzulin előállításánál kapott különböző savas-alkoholos kivonatok 8,8—13 mg glukagont tartalmaznak hasnyálmirigy kilogrammonként. A kivonatqk bepárlása és zsírtalanítása után a glukagonttartalom lecsökken 3,3-4,4 mg-ra hasnyálmirigy kilogrammonként. Azonban - mint fentebb említettük — ennek a mennyiségnek csak mintegy 25—50sűly%-a nyerhető ki tisztán, függően a használt kiindulóanyagoktól.Studies on pancreatic extracts have shown that the various acid-alcohol extracts obtained in the manufacture of insulin contain from 8.8 to 13 mg of glucagon per kilogram of pancreas. After evaporation and degreasing of the extracts, glucagon content decreases to 3.3-4.4 mg per kilogram of pancreas. However, as mentioned above, only about 25-50% by weight of this amount can be recovered purely, depending on the starting materials used.

Az eljárás glukagon-forrása a 3 719 655 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban leírt inzulin-előállítás lúgos kristályosítási lépésénél kapott felülúszó. Ez a felülúszó 7,22 —ΙΟ,ΟρΗ-jú és 0,2—1,0 mól kation-koncentrációjú vizes oldat, és a benne oldott fehérje mintegy 1—10%-a inzulin és 0,2—1,5%-a glukagon, függően az inzulin-előállításhoz használt hasnyálmirigy eredetétől. Például szarvasmarha-hasnyálmirigy esetén a lúgos kristályosításkor kapott felülúszó fehérjetartalmának általában 5—10%-a inzulin és 1,0—1,5%-a glukagon, sertés-hasnyálmirigynél a felülúszó fehérje általában mintegy 1-2% inzulint és 0,2-0,3% glukagont tartalmaz. Megjegyzendő azonban, hogy a tényleges kitermelés sarasonként széles határok között változhat a glukagon enzimes lebomlásra való hajlama miatt.The glucagon source of the process is the supernatant obtained from the alkaline crystallization step of insulin production described in U.S. Patent No. 3,719,655. This supernatant is an aqueous solution of 7.22 ΙΟ, ΟρΗ and 0.2 to 1.0 mole cation, and approximately 1 to 10% of the protein dissolved therein is insulin and 0.2% to 1.5% glucagon, depending on the origin of the pancreas used to make insulin. For example, in bovine pancreas, the protein content of the supernatant obtained by alkaline crystallization is generally 5-10% insulin and 1.0-1.5% glucagon, whereas in the pancreas the supernatant protein is generally about 1-2% insulin and 0.2% insulin. Contains 0.3% glucagon. However, it should be noted that actual yields may vary widely within batches due to the propensity for glucagon to undergo enzymatic degradation.

A mellékelt rajz a találmány előnyben részesített kivitelének folyamat ábrája. A rajz a találmány szerinti eljárás és az inzulin-előállítás során alkalmazott lúgos kristályosítási lépés kapcsolatát is bemutatja.The accompanying drawing is a flow chart of a preferred embodiment of the invention. The drawing also illustrates the relationship between the process of the invention and the alkaline crystallization step used in insulin production.

A glukagontartalmú fehérjének a lúgos kristályosításakor kapott felülúszóból való izolálása bármilyen ismert módszerrel végrehajtható. Például a felülúszó pH-ját 3,0-ra állítjuk be és 20% (súly/térfogat) nátrium-kloridot adunk hozzá a glukagon és más fehérjék kicsapása céljából. A kicsapást feles mennyiségű cink-kloriddal is végrehajthatjuk pH 6,0-nál. Harmadik lehetőség az izoelektromos ponton való kicsapás. Ismét más módszer az ioncserélő kromatográfía.Isolation of glucagon-containing protein from the supernatant obtained by alkaline crystallization can be performed by any known method. For example, the supernatant was adjusted to pH 3.0 and 20% w / v sodium chloride was added to precipitate glucagon and other proteins. The precipitation can also be carried out with an excess of zinc chloride at pH 6.0. A third possibility is precipitation at the isoelectric point. Another method is ion exchange chromatography.

A glukagontartalmú fehérjét a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóból előnyösen izoelektromos ponton történő kicsapással vagy ioncserélő kromatográfiával választjuk el. Általában az izoelektromos ponton való kicsapáshoz a felülúszó pH-jának körülbelül 4,2-6,6-nak kell lennie. Előnyösen körülbelül 4,6-5,2, legelőnyösebben körülbelül 4,7— —5,0 pH-tartományt használunk.The glucagon-containing protein is preferably separated from the supernatant obtained by alkaline crystallization by precipitation at an isoelectric point or by ion exchange chromatography. Generally, the pH of the supernatant must be about 4.2-6.6 to precipitate at the isoelectric point. Preferably a pH range of about 4.6 to about 5.2, most preferably about 4.7 to about 5.0 is used.

Mivel a lúgos kristályosításnál kapott felülúszó pH-ja körülbelül 7,2—10, ezért a felülúszót a kívánt pH eléréséhez meg kell savanyítani. A megsavanyítás glukagonnal nem reagáló vagy azt nem károsító szervetlen vagy szerves savak híg oldatának egyszerű hozzáadásával történhet. Alkalmas sav például a sósav, foszforsav, hangyasav, ecetsav, propionsav és hasonlók. A sósavat részesítjük előnyben.Since the pH of the supernatant obtained from the alkaline crystallization is about 7.2 to 10, the supernatant must be acidified to the desired pH. Acidification can be accomplished by the simple addition of a dilute solution of inorganic or organic acids which are inactive or unaffected by glucagon. Suitable acids include hydrochloric acid, phosphoric acid, formic acid, acetic acid, propionic acid and the like. Hydrochloric acid is preferred.

Előnyösen alkoholt — körülbelül 20 térfogat%-ig — adhatunk a felülúszóhoz, hogy csökkentsük a glukagontartalmú fehérjének a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóban való oldhatóságát. „Alkohol” alatt 1-4 szénatomszámú telített, alifás egyértékű alkoholt értünk. Előnyösen az alkohol metil-, etil-, propil- és izopropil-alkohol. Leginkább az etil-alkoholt részesítjük előnyben. Alkohol használata esetén az alkoholt általában megsavanyítás előtt adjuk a felülúszóhoz.Preferably, alcohol, up to about 20% by volume, is added to the supernatant to reduce the solubility of the glucagon-containing protein in the supernatant obtained by alkaline crystallization. "Alcohol" means saturated aliphatic monovalent alcohol having from 1 to 4 carbon atoms. Preferably, the alcohol is methyl, ethyl, propyl and isopropyl alcohol. Most preferred is ethyl alcohol. If alcohol is used, the alcohol is usually added to the supernatant before acidification.

Amikor a felülúszót a kívánt ρΗ-ig megsavanyítjuk, gyorsan megindul a glukagontartalmú fehérje kiválása, általában néhány perc alatt. A teljes kicsapódás biztosítása érdekében az oldatot állni hagyjuk, szokásosan szobahőmérsékletnél nem magasabb hőmérsékleten. Előnyösen az oldatot körülbelül 3—10°C-ra lehűtjük. Bár a kicsapódás mintegy 24 óra alatt általában teljesen végbemegy az elegyet károsodás nélkül bármeddig állni hagyhatjuk.When the supernatant is acidified to the desired ρΗ, the glucagon-containing protein begins to precipitate rapidly, usually within a few minutes. To ensure complete precipitation, the solution is allowed to stand, usually at a temperature no higher than room temperature. Preferably, the solution is cooled to about 3 to about 10 ° C. Although precipitation usually takes about 24 hours to complete, the mixture can be left to stand for any time without damage.

Teljes kicsapódás után a csapadékot — a továbbiakban „csapadékot” — alkalmas ismert módszerrel, mint centrifugálással vagy szűréssel izoláljuk, általában a szűrést részesítjük előnyben. A kapott csapadékot nem kell mosni vagy szárítani, bár szükség esetén ilyen lépéseket alkalmazhatunk.After complete precipitation, the precipitate, hereinafter referred to as "precipitate", is isolated by a suitable known method, such as centrifugation or filtration, and filtration is generally preferred. The resulting precipitate does not need to be washed or dried, although such steps may be employed if necessary.

A glukagontartalmú fehérjét a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóból ioncserélő kromatográfiával is kinyerhetjük. Az ismert ioncserélő eljárások közül a 3 715 345 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban leírt különösen hatásos módszert részesítjük előnyben. Az ioncserélő kromatográfía során a glukagontartalmú oldatot alkálifém-formájú szulfonált makroretikuláris sztirol/divinil-benzoi kopolimer gyantán bocsátjuk át pH7-8-nál. A gyantán adszorbeált glukagont híg lúggal, mint 0,1 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk. A glukagont tartalmazó eluátumot pH 2,5-re állítjuk be és a glukagont standard „só-kicsapási” módszerrel izoláljuk. A képződött glukagontartalmú csapadékot az inzulin-fehéijéktől így nagyrészt elválasztottuk, de a csapadék még tartalmaz más, nem-glukagon anyagokat.The glucagon-containing protein can also be recovered from the supernatant obtained by alkaline crystallization by ion-exchange chromatography. Of the known ion exchange processes, the particularly effective method described in United States Patent 3,715,345 is preferred. The glucagon-containing solution is passed through an ion exchange chromatography on an alkali metal sulfonated macroretricular styrene / divinylbenzene copolymer resin at pH7-8. Glucagon adsorbed on the resin is eluted with dilute alkali such as 0.1 N ammonium hydroxide. The glucagon containing eluate is adjusted to pH 2.5 and the glucagon is isolated by a standard "salt precipitation" method. The resulting glucagon-containing precipitate is thus largely separated from the insulin proteins, but the precipitate still contains other non-glucagon substances.

A lúgos kristályosítás során kapott felülúszót a 3 715 345 számú Amerikai Egyesült Államok-beii szabadalmi leírás eljárása szerint kezelve inzulintartalmú eluátumot és glukagontartalmú sót kapunk. Az inzulintartalmú eluátum — szükség esetén — visszavezethető az inzulinelőállító folyamatba. A glukagontartalmú sót a további feldolgozáshoz feloldjuk, kényelmi okokból az oldat pH-ját és fehérje-koncentrációját a lúgos kristályosításnál kapott felülúszó ρΗ-jával és fehérje-koncentrációjával megközelítőleg azonosra állítjuk be.The supernatant obtained by alkaline crystallization is treated with the procedure described in U.S. Patent No. 3,715,345 to provide an insulin-containing eluate and a glucagon-containing salt. The insulin-containing eluate can be traced back to the insulin production process, if necessary. The glucagon-containing salt is dissolved for further processing and, for convenience, the pH and protein concentration of the solution are approximately equal to the ρΗ and protein concentration of the supernatant obtained by alkaline crystallization.

Mint fentebb említettük, a glukagont a többi fehérjétől legelőnyösebben szálképző eljárással választhatjuk el. Általában a glukagon-szálakat savas vizes oldatban hozzuk létre. Szokásosan a glukagontartalmú fehérjét mintegy 2,7 pH-jú savas vizes közegben oldjuk. Bár általában mintegy 1,5— —2,7 pH-tartományt használhatunk, előnyben részesítjük a 2,0-2,5 pH-tartományt Bár a megsavanyításhoz mindazok a savak alkalmasak, amelyek a lúgos kristályosításnál kapott felülúszó izoelektromos ponton való kicsapása előtt használhatók, mégis ismét előnyben részesítjük a sósavat. Sósav esetében azonban tartósítószert, mint fenolt kell alkalmazni, szokásosan körülbelül 0,2% (súly/térfogat) töménységben. A glukagontartalmú fehérjét előnyösen 0,2% (súly per térfogat) fenolt tartalmazó 0,01 n sósavban oldjuk.As mentioned above, glucagon is most preferably isolated from other proteins by a fiber-forming process. Generally, the glucagon fibers are formed in an acidic aqueous solution. Typically, the glucagon-containing protein is dissolved in an acidic aqueous medium having a pH of about 2.7. Although it is generally possible to use a pH in the range of about 1.5 to about 2.7, a pH in the range of 2.0 to 2.5 is preferred. However, for acidification, any acid which can be used prior to precipitation of the supernatant obtained by alkaline crystallization at the isoelectric point, yet again, hydrochloric acid is preferred. However, in the case of hydrochloric acid, a preservative such as phenol is usually used at a concentration of about 0.2% (w / v). The glucagon-containing protein is preferably dissolved in 0.01N hydrochloric acid containing 0.2% (w / v) phenol.

Az oldatban a glukagontartalmú fehérje koncentrációja általában körülbelül 2,5-30 mg/ml. Előnyös az 5-20 mg/ml, legelőnyösebb az 5-10 mg/ml koncentráció-tartomány.The concentration of glucagon-containing protein in the solution is generally about 2.5-30 mg / ml. A concentration range of 5-20 mg / ml is preferred, most preferably 5-10 mg / ml.

Úgy is eljárhatunk, hogy a szálképződés megindításához vízoldható szervetlen sót adunk a savas glukagontartalmú fehérjeoldathoz. A „vízoldható” sók közé tartoznak azok a szervetlen sók, melyek az alább leírt koncentrációkban használva vízben oldhatók. Mivel a szervetlen sók elsődleges hatása a szálképződést megindító kisózó hatás, ezért a szervetlen só kiválasztása nem kritikus. Mégis a gyakorlatban radioaktív, mérgező vagy színes sók, vagy olyanok, amelyek oxidálószerek, redukálószerek, vagy erős savak vagy bázisok, érthető okokból nem kívánatosak. így az alkalmas szervetlen sók közé jznak általában a vízoldható ammóniumsók, lifémek és alkáliföldfémek - beleértve a perióö rendszer 6. periódusának megfelelő elemeit berts C. Weast, Ed.-in-Chief, „Handbook of aiistry and Physics”, 53rd,Edition, The ChemiRubber Co., Cleveland, Ohio, 1972, p. B3) — vizáid sói. Ilyen sók egyebek mellett az ammónijromid, ammónium-klorid, ammónium-fluorid, nónium-jodid, ammónium-magnézium-szulfát, íónium-nitrát, ammónium-szulnít, lítium-bro, lítium-klorid, lítium-fluoroszilikát, lítium-fluordfonát, lítium-jodid, lítium-molibdát, lítium-nitlítium-kálium-szulfát, nátrium-ammónium-fosznátrium-ammónium-szulfát, nátrium-bromid, ium-klorid, nátrium-jodid, nátrium-hexafluorofát, nátrium-fluoroszulfonát, nátrium-magnéziszulfát, nátrium-nitrát, nátrium-hexametafoszfát, ium-dihidrogén-ortofoszfát, nátrium-monohidroortofoszfát, nátrium-szulfát, nátrium-hidrogénlfát, kálium-bromid, kálium-kalcium-bromid, káí-ldorid, kálium-fluorid, kálium-jodid, káliumgnézium-klorid-szulfát, kálium-magnézium-szulkálium-magnézium-klorid, kálium-molibdát, káι-ortofoszfát, kálium-nátrium-szulfát, rubídiumimid, rubídium-klorid, rubídium-fluorid, rubídijodid, rubídium-nitrát, cézium-bromid, céziumrid, cézium-fluorid, cézium-jodid, cézium-nitrát, um-szulfát, berfllium-bromid, berillium-klorid, Jlium-fluorid, berillium-nitrát, berillium-ortofoszmagnézium-bromid, magnézium-klorid, magnézijodid, magnézium-nitrát, magnézium-szilikofluokalcium-bromid, kalcium-klorid, kalcium-jodid, ;ium-nitrát, stroncium-bromid, stroncium-klorid, »ncium-jodid, bárium-bromid, bárium-jodid, ezek jldható hidrátjai és hasonlók. Előnyben részesítaz ammőniumsókat, közülük leginkább az amnium-szulfátot. Az alkalmas szervetlen sók áltaw körülbelül 0,5 mól koncentrációig használha. Előnyös koncentrációjuk mintegy 0,01— ,05 mól.Alternatively, a water-soluble inorganic salt may be added to the acidic glucagon-containing protein solution to initiate fiber formation. "Water-soluble" salts include those inorganic salts that are soluble in water at the concentrations described below. Since the primary effect of inorganic salts is the salting effect that induces fiber formation, the selection of the inorganic salt is not critical. However, in practice, radioactive, toxic or colored salts, or oxidizing agents, reducing agents, or strong acids or bases, are, for obvious reasons, undesirable. Suitable inorganic salts include, in general, water-soluble ammonium salts, lifemems and alkaline earth metals, including those corresponding to Period 6 of the Periodic System, edited by C. Weast, Ed. ChemiRubber Co., Cleveland, Ohio, 1972, p. B3) - salts of your waters. Such salts include, but are not limited to, ammonium iromide, ammonium chloride, ammonium fluoride, ammonium iodide, ammonium magnesium sulfate, ammonium nitrate, ammonium sulphate, lithium bro, lithium chloride, lithium fluorosilicate, lithium iodide, lithium molybdate, lithium nitrile potassium sulphate, sodium ammonium phosodium ammonium sulphate, sodium bromide, sodium chloride, sodium iodide, sodium hexafluorophate, sodium fluorosulphonate, sodium nitrate, sodium hexametaphosphate, lumium dihydrogen orthophosphate, sodium monohydrogenorthophosphate, sodium sulfate, sodium hydrate, potassium bromide, potassium calcium bromide, potassium chloride, potassium fluoride, potassium fluoride, sulfate, potassium magnesium sulphate magnesium chloride, potassium molybdate, potassium orthophosphate, potassium sodium sulfate, rubidium imide, rubidium chloride, rubidium fluoride, rubidium iodide, rubidium nitrate, cesium fluorenone rid, cesium iodide, cesium nitrate, um sulphate, beryllium bromide, beryllium chloride, Jlium fluoride, beryllium nitrate, beryllium orthophosmagnesium bromide, magnesium chloride, magnesium iodide, magnesium nitrate, magnesium silicon fluoride bromide, calcium chloride, calcium iodide, nitrate nitrate, strontium bromide, strontium chloride, sodium iodide, barium bromide, barium iodide, their hydrates and the like. Preference is given to ammonium salts, most of them to ammonium sulfate. Suitable inorganic salts may be used up to about 0.5 molar concentration. Preferred concentrations are about 0.01 to about 05 moles.

A glukagon-szálképződés hőmérséklettartománya -30 °C. Az előnyös hőmérséklettartomány kőjelül 24—26 °C. A legelőnyösebb hőmérséklet °C.The temperature range for glucagon filament formation is -30 ° C. The preferred temperature range is 24-26 ° C. The most preferred temperature is ° C.

A szálképződés — melyet rázással segítünk — általában a savas vizes glukagonoldat elkészí3 utáni 3-4 órán belül megkezdődik és 48 óra tt befejeződik. 48 óránál hosszabb időre általáí nincs szükség.Fibration, which is assisted by shaking, generally begins within 3-4 hours after the preparation of the acidic aqueous glucagon solution and is completed within 48 hours. More than 48 hours are generally not required.

A szálképződés megtörténte után a glukagon-száat bármilyen ismert módszerrel összegyűjtjük, szűréssel vagy centrifugálással, az utóbbi elját részesítjük előnyben. Szükség esetén a glukai-szálakaí moshatjuk, szervetlen sót tartalmazó y nem tartalmazó vizes savas közegben való iszpendálás útján. A mosófolyadék hőmérsékleteAfter the formation of the fiber, the glucagon fiber is collected by any known method, by filtration or centrifugation, the latter being preferred. If necessary, the glucose fiber may be washed by slurrying in an aqueous acidic medium containing no inorganic salt. The temperature of the washing liquid

-30 °C, előnyösen 25 °C. Ezután a szálakat az bbiek szerint összegyűjtjük és hidegen tartjuk, ikásosan 10 °C alatt, ha a következő lépést nem jtjuk azonnal végre.-30 ° C, preferably 25 ° C. The fibers are then collected as described above and kept cold at a temperature below 10 ° C unless the next step is carried out immediately.

Szükség esetén kelátképző vegyületet, mint etii-diamin-tetraecetsavct is adhatunk a szálképző zeghez. A kelátképző vegyület koncentrációja szososan 0,01 mól alatt van, az előnyös koncentrái 0,004 mól. Mégis a kelátképző vegyületet előnyösen csak cink vagy más kétértékű fémion jelenléte esetén alkalmazzuk.If desired, a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid may also be added to the filament. The concentration of the chelating agent is substantially less than 0.01 mol, preferably 0.004 mol. However, the chelating agent is preferably used only in the presence of zinc or other divalent metal ions.

Mint említettük, a 2. lépésben kapott glukagont előnyösen kristályosítás útján tisztítjuk. Általában a glukagon kristályosítását úgy hajtjuk végre, hogy a glukagont lúgos vizes közegben oldjuk és gyengén lúgos vagy savas pH-ig megsavanyítjuk - pH 4,5-8,5-ig - a kristályosodás megindítása céljából.As mentioned above, the glucagon obtained in Step 2 is preferably purified by crystallization. In general, crystallization of glucagon is accomplished by dissolving glucagon in an alkaline aqueous medium and acidifying it to a slightly alkaline or acidic pH - from pH 4.5 to 8.5 - to initiate crystallization.

A glukagont kétféleképpen oldhatjuk fel, éspedig közvetlenül lúgos vizes közegben, vagy először desztillált vízben szuszpendáljuk és a pH-t bázis segítségével állítjuk be. Alkalmas bázisok az alkálifém- és ammónium-hidroxidok, melyek közül a kálium-hidroxidot részesítjük előnyben.There are two ways to dissolve glucagon, either directly in an alkaline aqueous medium or first in distilled water and adjusting the pH with a base. Suitable bases include alkali metal and ammonium hydroxides, with potassium hydroxide being preferred.

A kapott glukagonoldat pH-ja általában 9,0-11,5, az előnyös pH-tartomány 9,5—10,5.The pH of the resulting glucagon solution is generally 9.0 to 11.5, with a preferred pH range of 9.5 to 10.5.

A glukagon koncentrációja a lúgos oldatban körülbelül 2—10 mg/ml. Az előnyös koncentráció-tartomány körülbelül 4—8 mg/ml, a legelőnyösebb koncentráció mintegy 5 mg/ml.The concentration of glucagon in the alkaline solution is about 2 to 10 mg / ml. A preferred concentration range is about 4-8 mg / ml, most preferably about 5 mg / ml.

Mivel a megsavanyítás gyakran kevés nem-glukagon fehéqe kicsapódását eredményezi, ezért — bár ez nem alapvető - a következő megsavanyítási eljárást részesítjük előnyben.Since acidification often results in a small amount of non-glucagon protein precipitation, although not essential, the following acidification process is preferred.

A lúgos glukagonoldatot körülbelül 55-65 °C-ra melegítjük. Az oldatot ezután pH 4—6-ig megsavanyítjuk 10%-os foszforsavval. Bár az előző lépésnél alkalmazott savak bármelyike használható, a foszforsavat részesítjük előnyben. A kapott oldatot ezután a kezdeti magas hőmérsékleten leszűqük. Általában a szűrés nem kötelező és gyakran mellőzzük, ha a megsavanyítás után csak kevés csapadék képződik. Ezenfelül szükség esetén szűrésen kívül más módszerek is használhatók, így például centrifugálás.The alkaline glucagon solution is heated to about 55-65 ° C. The solution is then acidified to pH 4-6 with 10% phosphoric acid. Although any of the acids used in the previous step may be used, phosphoric acid is preferred. The resulting solution was then filtered at the initial high temperature. In general, filtration is optional and is often omitted if little precipitation occurs after acidification. In addition, methods other than filtration may be used if necessary, such as centrifugation.

Ha a glukagonoldat színes, derítő szenet adhatunk hozzá a megsavanyítás előtt vagy után, előnyösen előtte.If the glucagon solution is colored, clarifying charcoal may be added before or after acidification, preferably before.

Megsavanyítás (és adott esetben szűrés) után a glukagonoldatot állni hagyjuk körülbelül 2—10 °C-on, előnyösen 4°C-on. A kristályosodás ideje körülbelül 24—120 óra, előnyösen körülbelül 72— -120 óra, legelőnyösebben 72 óra.After acidification (and optionally filtration), the glucagon solution is allowed to stand at about 2-10 ° C, preferably at 4 ° C. The crystallization time is about 24 to 120 hours, preferably about 72 to 120 hours, most preferably 72 hours.

A képződött glukagonkristályokról a felülúszó nagyrészét dekantáljuk, szokásosan szűrőt használva. A maradék felülúszót a kristályokról centrifugálással távólítjuk el. A tiszta glukagont ezután egymás után híg sóoldattal (szokásosan 0,001%) és vízzel mossuk. Utána a glukagont liofílizáljuk és hidegben tároljuk.Most of the supernatant from the formed glucagon crystals is decanted, usually using a filter. The remaining supernatant is removed from the crystals by centrifugation. The pure glucagon is then washed successively with dilute saline (typically 0.001%) and water. The glucagon is then lyophilized and stored cold.

A 2. lépésben kapott glukagon tisztaságától és a végső tisztított glukagon megkívánt tisztaságától függően egy vagy több további kristályosítást végezhetünk. Mégis azt találtuk, hogy összesen két kristályosítás elegendő legalább 80% tisztaságú glukagon előállításához.Depending on the purity of the glucagon obtained in Step 2 and the purity required of the final purified glucagon, one or more further crystallizations may be performed. However, it has been found that a total of two crystallizations is sufficient to produce glucagon of at least 80% purity.

Ha két kristályosítást végzünk, a következő eljárást részesítjük előnyben: az első kristályosítást a fentiek szerint hajtjuk végre és a kristályokat lúgoldatban oldjuk. A második kristályosításhoz az oldatot körülbelül pH 7,0—8,5-ig, előnyösen körülbelül 7,3-7,5-ig, legelőnyösebben körülbelül 7,4-ig megsavanyítjuk. Az oldást és — adott esetben — a szűrést előnyösen mintegy 35—45 °C-on, legelőnyö176225 sebben 40 °C körül hajtjuk végre. A glukagon koncentrációja előnyösen körülbelül 10 mg/ml.When two crystallizations are carried out, the following process is preferred: the first crystallization is carried out as described above and the crystals are dissolved in an alkaline solution. For the second crystallization, the solution is acidified to a pH of about 7.0 to about 8.5, preferably about 7.3 to about 7.5, most preferably about 7.4. Dissolution and optionally filtration is preferably carried out at about 35-45 ° C, most preferably 176225 wounds at about 40 ° C. The concentration of glucagon is preferably about 10 mg / ml.

Szükség esetén a kristályosítás után kapott felülúszók valamelyikét vagy mindegyikét visszavezethetjük a folyamatba. Például a felülúszókban oldott fehérjéket kicsaphatjuk, ha a pH-t híg sósavval 2,5-3,0-ra állítjuk be és 20% nátrium-kloridot (súly/térfogat) adunk hozzá. A csapadékon elvégezzük a találmány szerinti eljárás 1. lépését, akár különállóan, akár a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóban feloldva.If necessary, some or all of the supernatants obtained after crystallization may be recycled. For example, proteins in supernatants may be precipitated by adjusting the pH to 2.5-3.0 with dilute hydrochloric acid and adding 20% sodium chloride (w / v). The precipitate is subjected to Step 1 of the process of the invention, either alone or dissolved in the supernatant obtained by alkaline crystallization.

Mint említettük, a lúgos kristályosításnál kapott felülúszó általában több oldott inzulint, mint glukagont tartalmaz. Ez az inzulin az izoelektromos ponton végzett kicsapáskor kapott glukagontartalmú fehéqe komponense. Bár az eljárás 2. lépése, vagyis a glukagon más fehérjéktől való elválasztása, hatásosan választja el a glukagont az inzulintól, de az elválasztási eljárás károsíthatja a fehérjekeverék inzulin-komponensét. Ezért gyakran kívánatos az eljárás 1. lépését ioncserélő kromatográfia segítségével végrehajtani, ami ugyancsak az inzulin és a glukagon szétválasztásához vezet.As mentioned above, the supernatant obtained from alkaline crystallization generally contains more dissolved insulin than glucagon. This insulin is the glucagon-containing protein component of the precipitation at the isoelectric point. Although step 2 of the process, i.e., separation of glucagon from other proteins, effectively separates glucagon from insulin, the separation process can damage the insulin component of the protein mixture. Therefore, it is often desirable to perform step 1 of the process by ion exchange chromatography, which also results in the separation of insulin and glucagon.

Hangsúlyozni kell azonban, hogy az ioncserélő kromatográfia nem az egyetlen módszer az inzulinnak a glukagontól való elválasztására, mielőtt a glukagont a többi fehérjétől elválasztanánk. így például az izoelektromos ponton végzett kicsapáskor kapott üledéken az úgynevezett hiperglikémiás faktor frakcionálási is elvégezhetjük. Ez röviden a glukagonnak enyhén lúgos, fenolos közegből való kisózásából áll. A hiperglikémiás faktor frakcionálását Staub és munkatársai írták le a már idézett közleményükben. Az inzulintartalmú felülúszót visszavezetjük az inzulinelőállító folyamatba, míg a kicsapott nyers glukagont a találmány szerinti eljárás 2. lépésében használjuk.However, it should be emphasized that ion exchange chromatography is not the only way to separate insulin from glucagon before separating glucagon from other proteins. Thus, for example, the so-called hyperglycemic factor fractionation can be performed on the precipitate obtained by precipitation at the isoelectric point. Briefly, it consists of salting glucagon from a slightly alkaline phenolic medium. Fractionation of the hyperglycemic factor is described in Staub et al., Supra. The insulin-containing supernatant is recycled to the insulin production process while the precipitated crude glucagon is used in step 2 of the process of the invention.

Bár a találmány szerinti eljáráshoz nem alapvetően fontos, de előnyös, ha a szálképző lépés felülúszóját visszavezetjük az inzulintermelő folyamatba, szokásosan az említett 3 719 655 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalomban leírt lúgos kristályosítási lépés kezdetén. Természetesen erre a visszavezetésre nincs szükség, ha a fentiek szerint az inzulint a szálképzés előtt elválasztjuk a glukagontól.Although not essential to the process of the present invention, it is preferred that the supernatant of the spinning step is recycled to the insulin production process, usually at the beginning of the alkaline crystallization step described in U.S. Patent 3,719,655. Of course, this recycle is not required if the insulin is separated from the glucagon prior to fiber formation.

A találmány szerinti eljárás és az inzulinelőállító eljárással való kapcsolata talán jobban megérthető a találmány szerinti eljárás kivitelét bemutató folyamatábra alapján. Az egyszerűség kedvéért az eljárásThe process of the present invention and its relationship to the insulin production process may be better understood from the flowchart illustrating the embodiment of the process of the invention. For simplicity, the procedure

1. és 3. lépése után kapott felülúszókat a rajz szerint elöntjük, de — mint említettük - ezek a felülúszók a folyamatba visszavezethetők.The supernatants obtained after steps 1 and 3 are discarded according to the drawing, but as mentioned above, these supernatants can be traced back to the process.

A 3 719 655 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás lúgos kristályosítását a rajz felső része mutatja. A lúgos kristályosítási elljárás alkálifém- vagy anunónium-inzulint eredményez. Mivel a lúgos kristályosítási eljárás és az általa kapott alkálifém- vagy ammónium-inzulin az inzulinelőállító folyamat részét képezi, ezt az eljárást és az inzulint jelképező kockákat a rajzon szaggatott vonallal vettük körül és „inzulinos eljárás”-ként jelöljük. Minden, ami a szaggatott vonalon kívül esik, a találmány szerinti eljárás része és „glukagonos eljárás”-ként szerepel.The alkaline crystallization of U.S. Pat. No. 3,719,655 is shown at the top of the drawing. The alkaline crystallization procedure results in an alkali metal or anunonium insulin. Because the alkaline crystallization process and the resulting alkali metal or ammonium insulin are part of the insulin production process, this process and the cubes representing the insulin are outlined in the drawing as a "insulin process". Anything outside the dotted line is part of the process of the invention and is referred to as the "glucagon process".

Az eljárás - mint látható — a lúgos kristályosításnál kapott felülúszóval kezdődik. Az eljárást képező, előnyben részesített lépéseket végrehajtva kapjuk meg az izoelektromos csapadékot, a glukagonszálakat, illetve a kristályos glukagont. A rajz a szálképző lépés felülúszójának az inzulinelőállító folyamatba való visszavezetését is mutatja.The process begins, as can be seen, with the supernatant obtained from the alkaline crystallization. Preferred steps of the process are to obtain the isoelectric precipitate, the glucagon fibers and the crystalline glucagon. The drawing also shows the return of the supernatant of the fiber-forming step to the insulin production process.

Ha másként nem jelezzük, minden hőmérséklet °C-t jelent.Unless otherwise stated, all temperatures are in ° C.

1. példaExample 1

5,850 kg szarvasmarha/sertés-pankreász feldolgozásából származó 14,75 liter lúgos kristályosítási felülúszó hoz - melynek szilárd anyag tartalma 40,7 mg/ml (pH-értéke 8,6) — 1,45 liter abszolút alkoholt adunk. Az oldat pH-ját 3 n sósavoldattal 5,2-re állítjuk be. Az oldatot éjszakán át 5°-on tartjuk. A képződött csapadékot szűréssel összegyűjtjük, 0,2% (súly/térfogat) fenolt tartalmazó 11,28 liter 0,01 n sósavoldatban (a továbbiakban savas fenolos víz) oldjuk és az oldatot elemezzük:1.45 liters of absolute alcohol are added to 14.75 liters of alkaline crystallization supernatant obtained from the processing of 5.850 kg of bovine / porcine pancreas. The solution was adjusted to pH 5.2 with 3N hydrochloric acid. The solution was kept at 5 ° overnight. The precipitate formed is collected by filtration, dissolved in 11.28 L of 0.01 N hydrochloric acid (0.2% w / v phenol) (hereinafter referred to as acidic phenolic water) and analyzed for:

összes szilárd anyag 512,6 g (45,4 mg/ml) inzulin 87,43 E/ml (1,93 E/mg szilárd anyag) glukagon 463,7 mg/ml (az összes szilárd anyag 1,02%-a).total solids 512.6 g (45.4 mg / ml) insulin 87.43 U / ml (1.93 U / mg solid) glucagon 463.7 mg / ml (1.02% of total solids ).

Az oldat 870 ml-es részletéből végezzük el a meghatározásokat. A visszamaradó 10,4 liter körülbelül 473 g szilárd anyagot tartalmaz.Carry out determinations on an 870 ml aliquot of the solution. The remaining 10.4 liters contained approximately 473 g of solid.

A „hiperglikémiás faktor” frakcionálásához a fenti oldatot 111,8 liter savas fenolos vízzel hígítjuk, a kapott 122,2 liter össztérfogat 0,387% szilárd anyagot tartalmaz. A felhígított oldathoz 245,8 ml folyékony fenolt, 941 g nátrium-kloridot és annyi 40%-os vizes nátrium-hidroxid-oldatot adunk, hogy a szilárd anyagok oldódásának elősegítése céljából az oldat pH-ja 9,0 legyen. Ezután a pH-t 3 n sósavoldattal 7,5-re állítjuk be. A kapott oldatot 1 —2 napig 5°-on tartjuk. A képződött csapadékról a felülúszót dekantáljuk és szívatással leszűijük. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük. A szűréssel és centrifugálással kapott szilárd anyagokat egyesítjük és 10 liter savas fenolos vízben oldjuk, a kapott oldat elemzése:To fractionate the "hyperglycemic factor", the above solution was diluted with 111.8 L of acidic phenolic water to give a total volume of 122.2 L containing 0.387% solids. To the diluted solution was added 245.8 ml of liquid phenol, 941 g of sodium chloride and 40% aqueous sodium hydroxide solution to pH 9.0 to aid solubility of the solids. The pH is then adjusted to 7.5 with 3N hydrochloric acid. The resulting solution was kept at 5 ° for 1-2 days. From the precipitate formed, the supernatant is decanted and suction filtered. The precipitate was collected by centrifugation. The solids obtained by filtration and centrifugation were combined and dissolved in 10 liters of acidic phenolic water.

Összes szilárd anyag 75,0 g (7,5 mg/ml) inzulin 6,33 E/ml glukagon 275 mcg/ml (az összes szilárd anyag 5,01%-a).Total solids 75.0 g (7.5 mg / mL) insulin 6.33 U / mL glucagon 275 mcg / mL (5.01% of total solids).

Az oldatot 5 liter savas fenolos vízzel hígítjuk, hogy a szilárd anyag koncentrációja 5,0 mg/ml legyen. Az oldat 5,0 literes részletéből végezzük el a próbákat. A visszamaradó 10,0 liter körülbelül 50 g szilárd anyagot tartalmaz.The solution was diluted with 5 L of acidic phenolic water to give a solid concentration of 5.0 mg / mL. Carry out a 5.0 liter aliquot of the solution. The remaining 10.0 liters contained about 50 g of solid.

A visszamaradt oldathoz keverés közben 8,0 ml 0,5 mólos vizes tetranátrium-etilén-diamin-tetraacetátot és 60 ml 50%-os vizes ammónium-szulfát-oldatot adunk. A keveréket környezeti hőmérsékleten 16 óráig keveijük. A képződött glukagonszálakat centrifugálással összegyűtjük és a fentiek szerint etilén-diamin-tetraacetátot és ammónium-szulfátot tartalmazó savas fenolos vízzel mossuk.To the remaining solution was added 8.0 mL of 0.5 M aqueous tetrasodium ethylenediamine tetraacetate and 60 mL of 50% aqueous ammonium sulfate solution with stirring. The mixture was stirred at ambient temperature for 16 hours. The resulting glucagon fibers were collected by centrifugation and washed with acidic phenolic water containing ethylenediaminetetraacetate and ammonium sulfate as described above.

A glukagonszálakat 0,2% (súly/térfogat) fenolt tartalmazó 10 liter vízben szuszpendáljuk. A keveréket 40°-ra melegítjük és a pH-t 150 ml 10%-os vizes kálium-hidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk be. Ezután az oldatot 60°-ra melegítjük és pH-ját 68 ml 10%-os foszforsavoldattal 7,8-ra állítjuk be. Miután az oldat hőmérséklete elérte a 60°-ot, a pH-t 68 ml 10%-os foszforsavoldattal 5,0-re állítjuk be. Az oldatot még melegen szűqük és a szűrletet 72 óráig 5°-on keverjük. A kivált glukagont szűréssel izoláljuk. A kapott szilárd anyagot a glukagonszálakra fentebb leírt módon oldjuk, a pH-t 10,5-re beállít- ¹⁵ va az össztérfogat 870 ml. Az oldatot 60°-ra melegítjük, a pH-t 10%-os foszforsavval 5,0-re állítjuk be és a kapott oldatot melegen szűqük. A szűrletet a fentiek szerint lehűtjük és keverjük. A kivált glukagont centrifugálással összegyűjtjük, majd liofí- ²⁰ lizáljuk, 1,84 g tisztított glukagont kapunk. Ez a szálképzés előtt rendelkezésre álló glukagon 74%-ának és a lúgos kristályosításkor kapott felülúszó fehérjeinek kicsapása után meglevő glukagon 39%-ának felel meg (számításba véve a mintavételeket). 25The glucagon fibers were suspended in 10 liters of water containing 0.2% (w / v) phenol. The mixture was heated to 40 ° and the pH was adjusted to 10.5 with 150 ml of 10% aqueous potassium hydroxide solution. The solution was then heated to 60 ° and the pH adjusted to 7.8 with 68 ml of 10% phosphoric acid. After the temperature of the solution has reached 60 ° C, the pH is adjusted to 5.0 with 68 ml of 10% phosphoric acid solution. The solution was filtered while still warm and the filtrate was stirred at 5 ° for 72 hours. The precipitated glucagon was isolated by filtration. The resulting solid was dissolved in glukagonszálakra as described above, the pH at 10.5 with ¹⁵ va set information of a total volume of 870 ml. The solution was heated to 60 °, the pH was adjusted to 5.0 with 10% phosphoric acid and the resulting solution was warm filtered. The filtrate was cooled and stirred as above. The resulting glucagon collected by centrifugation and lysed liofí- ^20, 1.84 g of purified glucagon was obtained. This corresponds to 74% of the available glucagon prior to fiber formation and 39% of the glucagon present after precipitation of the supernatant protein obtained by alkaline crystallization (taking into account the sampling). 25

2. példaExample 2

29,380 kg, 36,900 kg és 48,520 kg szarvasmar- 30 ha/sertés-hasnyálmirigyből (2 :1 keverék) származó inzulin feldolgozásának három lúgos kristályosítási anyalúgját (pH = 7,6) centrifugálással elválasztjuk az inzulinkristályoktól. A megfelelő 460 liter 515 liter és 680 liter térfogatú anyalúgokhoz 51 liter, 57,2 liter 35 illetve 75,5 liter abszolút alkoholt adunk és pH-jukat 3 n sósavoldattal 5,0-re állítjuk he, 15 percig keverjük és legalább 24 óráig hidegen tartjuk. A kicsapás előtti anyalúg és a feloldott csapadék elemzése:Three alkaline crystallization mother liquors (pH 7.6) of 29.380 kg, 36,900 kg and 48,520 kg of bovine 30 ha / pig pancreas (2: 1 mixture) were separated from the insulin crystals by centrifugation. To the corresponding mother liquors of 460 liters of 515 liters and 680 liters of volume, 51 liters, 57.2 liters of 35 and 75.5 liters of absolute alcohol were added and the pH adjusted to 5.0 with 3N hydrochloric acid, stirred for 15 minutes and cold for at least 24 hours. we. Analysis of pre-precipitation mother liquor and dissolved precipitation:

1. az anyalúgban: 2530 pg glukagon és 501,6 E inzulin/kg eredeti pankreász-szövet, a csapadék 158 liter oldatában 1846 meg glukagon és 651 E inzulin/kg eredeti pankreász-szövet, 131,34 mg szilárd anyag/kg eredeti pankreász-szö- 45 vet,1. in mother liquor: 2530 pg glucagon and 501.6 U insulin / kg original pancreatic tissue, 1846 meg glucagon and 651 U insulin / kg original pancreatic tissue in 158 liters of solution, 131.34 mg solids / kg original pancreas -weaves 45,

2. az anyalúgban 1619 gg glukagon és 305,8 E inzulin per kg eredeti pankreász-szövet, a csapadék 150 liter oldatában 759 meg glukagon és 270,6 E inzulin/kg eredeti pankreász-szövet és 50 61,16 mg szilárd anyag/kg pankreász,2. in mother liquor 1619 gg of glucagon and 305.8 U insulin per kg of original pancreatic tissue, 759 µg glucagon and 270.6 U of insulin / kg original pancreatic tissue in 150 liters of solution and 50 61.16 mg solids / kg pancreatic,

3. az anyalúgban 2670 gg glukagon és 480 E inzulin per kg eredeti pankreász-szövet, a csapadék 156 liter oldatában 2081 gg glukagon és 420 E inzulin/kg eredeti pankreász-szövet és 55 130 mg szilárd anyag/kg eredeti pankreász-szövet.3. in mother liquor 2670 gg glucagon and 480 U insulin per kg of original pancreatic tissue, in a solution of 156 liters of solution 2081 gg glucagon and 420 U insulin / kg original pancreatic tissue and 55 130 mg solids / kg original pancreatic tissue.

A csapadékokat szűréssel összegyűjtjük és az 1. példa szerint előállított savas fenolos vízben oldjuk.The precipitates were collected by filtration and dissolved in the acidic phenolic water prepared in Example 1.

A pH 5,0-nél végzett kicsapással kapott csapadékok oldatait egyesítve 464 liter oldattérfogatot (12,570 g szilárd anyag) kapunk, melyet 630 literre hígítunk savas fenolos vízzel. A 2,0% szilárd anyagot tartalmazó oldat pH-ját 3 n sósavoldattal 2,1-re ¢5 állítjuk be. Az oldatot 0,3%- ammónium-szulfáttal kezeljük és 24 óráig 25°-on keverjük, majd 48 óráig 15°-on állni hagyjuk. A képződött glukagonszálakat az oldatból centrifugálással választjuk el. A felülúszó oldatból próbát veszünk (488,4 gg glukagont és 251 E inzulint tartalmaz eredeti hasnyálmirigy-szövet kilogrammonként) és visszavezetjük az inzulinelőállító folyamatba. A glukagonszálakat 0,2% fenolt tartalmazó 450 liter lhideg vízben szuszpendáljuk, hozzáadunk 2,700 ml 50%-os ammónium-szulfát-oldatot és a szálak mosása céljából a keveréket 30 percig lassan keverjük, a szálakat centrifugálással újra összegyűjtjük és a mosófolyadékokat elöntjük. A glukagonszálakat 0,2% fenolt tartalmazó 275 liter vízben szuszpendáljuk és a pH-t 10%-os foszforsavval 3,85-re állítjuk be. Elemzés:The precipitate solutions obtained by precipitation at pH 5.0 were combined to give a solution volume of 464 liters (12.570 g solids), which was diluted to 630 liters with acidic phenolic water. The solution containing 2.0% solids was adjusted to pH ¢5 with 3N hydrochloric acid. The solution was treated with 0.3% ammonium sulfate and stirred for 24 hours at 25 ° and then left for 48 hours at 15 °. The glucagon fibers formed are separated from the solution by centrifugation. The supernatant solution is probed (containing 488.4 gg of glucagon and 251U of insulin per kg of original pancreatic tissue) and returned to the insulin production process. The glucagon fibers were suspended in 450 liters of cold water containing 0.2% phenol, 2.700 ml of 50% ammonium sulfate solution were added, and the mixture was washed slowly for 30 minutes to wash the fibers, and the fibers were collected again by centrifugation and the washings were discarded. The glucagon fibers were suspended in 275 liters of water containing 0.2% phenol and adjusted to pH 3.85 with 10% phosphoric acid. Analysis:

Szilárd anyag: 12,05 mg/kg eredeti hasnyálmirigy-szövet (0,52%, 1,404 g 115 kg eredeti hasnyálmirigyszövetből, glukagon: 466,4 gg/kg eredeti hasnyálmirigy-szövet (54,2 g).Solid: 12.05 mg / kg original pancreatic tissue (0.52%, 1.404 g from 115 kg original pancreatic tissue, glucagon: 466.4 gg / kg original pancreatic tissue (54.2 g).

A 275 liter glukagonszál/szuszpenziót az első kristályosításhoz 1/135 literes és 2/140 literes részre osztjuk _t Az első részt 0,2% fenol-vízzel 140 literre hígítva a szilárd anyag koncentrációját 0,5%-ra állítjuk be, a második rész szilárd anyag koncentrációja 0,52%. Mindkét szál-szuszpenziót 60°-ra melegítjük és pH-jukat 9,0-11,0-re állítjuk be (az l)rész pH-ja 9,9, a 2) részét 9,7) 10%-os kálium-hidroxid-oldattal. Az áttetsző oldathoz 281 g Norite A-szűrősegédanyagot adunk (0,4 g/g szilárd anyag) és 10 perc keverés után az oldat pH-ját 10%-os foszforsavval 5,0-re állítjuk be, majd melegen szűrőpapírral ellátott tölcséren leszűrjük. A szűrletet lassan, 4°-os hűtés közben 16—20 óráig keverjük a glukagon egyenletes kikristályosodásának az elősegítése céljából. A szűréssel pH 5,0-nél, 60°-on elválasztott csapadékot további glukagonkristályok nyerése céljából 120 liter 0,2%-os fenolos vízben szuszpendáljuk (0,5%) szilárd anyag koncentráció), 60-ra melegítjük, a szilárd anyag oldása céljából pH-t 10,0-re állítjuk be, 10 percig keverjük, a pH-t 10%-os foszforsavval 5,0-re állítjuk be és melegen szűqük. A szűrletet 40°-on 16—20 óráig keverjük. A kristályosodás 72—120 óra alatt lezajlik. A második, pH 5,0-nél kapott csapadékot elöntjük. Az első és a második kristályosítás anyalúgjának fő tömegét dekantáljuk és szívatással leszűrjük. Az első anyalúgot mindkét esetben 20%-os (súly/térfogat) nátrium-klorid-oldattal kezeljük a ki nem kristályosodott glukagon kicsapása céljából. A csapadékokat egyesítjük más sarasokkal és pH 4,6-on való ismételt kicsapás után újabb kristályosítást végzünk további glukagonkristályok nyerése céljából. A két részletből származó glukagonkristályokat (1. termékrészlet), valamint az első kristályosításból származó, pH 5,0-nél kapott csapadékok újrafeldolgozásával kapott kristályokat (2. termékrészlet) 3 perces centrifugálással összegyűjtjük, az anyalúgtól elválasztjuk, hideg vízben szuszpendálva liofilizáló készülék tartályba visszük át és gyorshűtéses fagyasztással szárítjuk. A közbenső kristályosításbői származó glukagonkristályok súlyát lemérjük és belőlük mintát veszünk. A glukagon közbenső kristályok kitermelése:The 275 liters of glucagon fiber / suspension is divided into 1/135 liters and 2/140 liters for the first crystallization _. The first portion is diluted with 0.2% phenol-water to 140 liters to adjust the solids concentration to 0.5%. solids concentration 0.52%. Both fiber suspensions were heated to 60 ° and adjusted to pH 9.0-11.0 (part I) pH 9.9, part 2 9.7) 10% potassium hydroxide. To the clear solution was added 281 g of Norite A filter aid (0.4 g / g solids) and after stirring for 10 min, the pH of the solution was adjusted to 5.0 with 10% phosphoric acid and filtered through a funnel with warm filter paper. The filtrate is stirred slowly at 4 ° C for 16 to 20 hours to promote uniform crystallization of glucagon. The precipitate separated by filtration at pH 5.0, 60 °, was suspended in 120 liters of 0.2% phenolic water (0.5% solids concentration) to obtain additional glucagon crystals, warmed to 60, to pH 10.0, stir for 10 minutes, adjust the pH to 5.0 with 10% phosphoric acid and filter warm. The filtrate was stirred at 40 ° for 16 to 20 hours. Crystallization takes place in 72-120 hours. The second precipitate obtained at pH 5.0 was discarded. The main mass of the mother liquor of the first and second crystallizations is decanted and suction filtered. In both cases, the first mother liquor is treated with 20% (w / v) sodium chloride to precipitate the non-crystallized glucagon. The precipitates were combined with other pins and, after repeated precipitation at pH 4.6, further crystallization was carried out to obtain additional glucagon crystals. The glucagon crystals from the two batches (product part 1) and the crystals obtained from the recrystallization of the precipitates from the first crystallization at pH 5.0 (product part 2) were collected by centrifugation for 3 minutes, separated from the mother liquor and resuspended in lyophilization container. and freeze-dried. The weight of the glucagon crystals from the intermediate crystallization is weighed and sampled. Yields of glucagon intermediate crystals:

1. termékrészlet, 1/ 41,0 g (91,7% tisztaság) és 2/ 44,0 g (86,8% tisztaság), vagy 85,0 g (89,1% tisztaság), 75,8 g glukagon, 642 Mg eredeti hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként 730 Mg, első újrafeldolgozásból nyert kristályok (2. termékrészlet) kitermelése: 19,0 g (100,0% tisztaság), 165 Mg eredeti pankreász-szövet-kilogrammonként második újrafeldolgozásból nyert kristályok (1. anyalúgok) kitermelése: 22,0 g (46,0% tisztaság) vagy 9,9 g, 85,8 Mg eredeti hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként (tiszta) vagy 187 Mg (tisztítás nélkül).Product Part 1, 1 / 41.0 g (91.7% purity) and 2 / 44.0 g (86.8% purity) or 85.0 g (89.1% purity), 75.8 g glucagon , 642 Mg 730 Mg per kilogram of original pancreatic tissue (Part 2): 19.0 g (100.0% purity), 165 Mg of second recycling per kilogram of pancreatic tissue (Figure 1). mother liquors): 22.0 g (46.0% purity) or 9.9 g, 85.8 Mg per kilogram of original pancreatic tissue (pure) or 187 Mg (without purification).

Összes kitermelés: 126,0 g szilárd anyag (1047 Mg* eredeti hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként), 83,1% tisztasággal, vagy 104,7 g glukagon (900 Mg hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként.Total yield: 126.0 g of solid (1047 Mg * per kg of original pancreatic tissue), with a purity of 83.1%, or 104.7 g of glucagon (900 mg / kg of pancreatic tissue).

Az átkristályosítást az összegyűlt más közbenső kristályokkal közösen végezzük el. A végső glukagonkristályok a közbenső kristályokban jelenlevő glukagon súlyának 85%-át képezik,Az átkristályosítást pH 7,5-nél hajtjuk végre, miután a közbenső kristályokat pH 8,0—10,0 között 10%-os kálium-hidroxid-oldattal 40°-on feloldottuk (1,0% szilárd anyag tartalom), a pH-t 10%-os foszforsawal 7,5-re állítjuk be, az oldatot szűrjük és hűtjük. A végső kristályokat az anyalúg főtömegének dekantálása után centrifugálással összegyűjtjük (az anyalúgot további kristálykinyerés céljából újra feldolgozzuk), 0,001%-os nátrium-klorid-oldattal kétszer, hideg desztillált vízzel egyszer mossuk és gyorshűtéses fagyasztással szárítjuk. A számított kitermelés 89,0 g vagy 765,6 Mg eredeti hasnyálmirigy-szövet-kilogrammonként és a lúgos kristályosításkor kapott anyalúgból való kinyerés 33,2%.Recrystallization is carried out in conjunction with other intermediate crystals that have accumulated. The final glucagon crystals represent 85% by weight of the glucagon present in the intermediate crystals. The recrystallization is carried out at pH 7.5, after which the intermediate crystals are at pH 8.0 to 10.0 with 10% potassium hydroxide solution at 40 °. (1.0% solids), adjusted to pH 7.5 with 10% phosphoric acid, filtered and cooled. The final crystals, after decanting the bulk of the mother liquor, are collected by centrifugation (the mother liquor is reprocessed for further crystal recovery), washed twice with 0.001% sodium chloride solution, once with cold distilled water, and freeze-dried. The calculated yield is 89.2 g or 765.6 Mg per kilogram of original pancreatic tissue and 33.2% recovery from mother liquor from alkaline crystallization.

3. példaExample 3

425 liter lúgos kristályosítási felülúszót, melynek pH-ja 7,5, és 65 mikrogramm/ml glukagont tartalmaz, alkáli- vagy alkálifém ciklusban működő szulfonált makroretikuláris sztirol-divinilbenzol-kopolimerrel (Amberlite 200) töltött ioncserélő oszlopon vezetjük át.425 liters of alkaline crystallization supernatant at pH 7.5 and 65 micrograms / ml glucagon was passed through an ion exchange column packed with a sulfonated macrorethical styrene-divinylbenzene copolymer (Amberlite 200) in an alkaline or alkaline-metal cycle.

A 630 liter glukagont tartalmazó frakció 4047 g szilárd anyagot, és 33,6 g glukagont tartalmaz. Ezen frakció 32 literjét pH = 3 értéken 4,38 literre pároljuk be. A koncentrátumhoz pH = 9,5 érték eléréséig híg kálium-hidroxid-oldatot adunk. A keletkezett oldat 82,5 g szilárd anyagot, és 1,3 g glukagont tartalmaz.The fraction containing 630 liters of glucagon contained 4047 g of solid and 33.6 g of glucagon. 32 liters of this fraction are concentrated to pH 4.38 liters at pH 3. Dilute potassium hydroxide solution is added to the concentrate until pH = 9.5. The resulting solution contains 82.5 g of solids and 1.3 g of glucagon.

Az oldat egyik felét, mely 0,65 g glukagont 5 tartalmaz, pH = 2,1 értékre állítjuk be, híg sósavval, majd 2,2 ml/liter mennyiségben fenolt, 4 ml/liter mennyiségben 0,1 n etiléndiamin-tetraecetsav-nátriumsót és 6 ml/liter mennyiségben 50%-os ammónium-szul fát oldatot adunk hozzá. Az elegyet 2 napon át szo0 bahőmérsékleten kevertetjük.One half of the solution, containing 0.65 g of glucagon 5, is adjusted to pH 2.1 with dilute hydrochloric acid followed by 2.2 ml / l phenol, 4 ml / l 0.1 N ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt and 50 ml of a 50% ammonium sulphate solution are added. The mixture was stirred at room temperature for 2 days.

A kapott glukagonszálakat az anyalúgtól centrifugálással elválasztjuk. Ily módon 0,42 g glukagont kapunk. A szálas frakciót híg káliumhidroxid-oldat bán oldva 212 ml, 1,89 g szilárd anyagot, ésThe resulting glucagon fibers were separated from the mother liquor by centrifugation. This gives 0.42 g of glucagon. The fibrous fraction was dissolved in dilute potassium hydroxide solution (212 ml, 1.89 g) and

0,307 g glukagont tartalmazó oldatot kapunk.A solution containing 0.307 g of glucagon was obtained.

Az oldatot 60 °C hőmérsékletre melegítjük, és a pH-t sósavval 5,0 értékre állítjuk be. Az oldatot ezután 5 °C hőmérsékleten 72 órán át állni hagyjuk. A csapadékot szűréssel elválasztjuk. Az anya20 lúg 0,004 g glukagont tartalmaz. A csapadék súlya 1,35 g, mely 0,157 g glukagont tartalmaz. (Kitermelés: 24%).The solution was heated to 60 ° C and the pH was adjusted to 5.0 with hydrochloric acid. The solution was then allowed to stand at 5 ° C for 72 hours. The precipitate was collected by filtration. The mother liquor contains 0.004 g of glucagon. The precipitate weighed 1.35 g and contained 0.157 g of glucagon. (Yield: 24%).

Claims (3)

Eljárás glukagon előállítására glukagon-tartalmú oldatból, melynek soránA process for the preparation of glucagon from a glucagon-containing solution comprising: 30 1. a glukagon-tartalmú fehérjét oldatából30 1. from a solution of glucagon-containing protein a) 4,2—6,6 pH-η legfeljebb 20 tf% 1-4 szénatomos alkanol jelenlétében végzett izoelektromos ponton történő kicsapással, vagy(a) by precipitation at a pH of 4,2 to 6,6 at an isoelectric point in the presence of up to 20% v / v of a C 1 -C 4 alkanol, or b) ioncserélő kromatográfiával, a glukagon-tartal35 mú fehéqét adszorbensen megkötve, majd az adszorbenst híg bázissal — előnyösen 0,1 n ammönium-hidroxid-oldattal — eluálva, vagy(b) ion exchange chromatography, binding the glucagon-containing protein to an adsorbent and then eluting the adsorbent with a dilute base, preferably 0.1 N ammonium hydroxide, or c) az a) eljárásváltozat szerinti izoelektromos ponton történő kicsapás termékének a kicsapástc) precipitation of the product of precipitation at the isoelectric point of process variant a) 40 követő, enyhén lúgos — előnyösen legfeljebb 8,5 pH-értékű — fenolos vizes oldatból történő kisózásával izoláljuk,Isolated from 40 successive slightly alkaline phenolic aqueous solutions, preferably at pH 8.5 or less, 2. a kapott szilárd anyag oldatából a glukagont valamely szervetlen só, előnyösen ammónium-szul45 fát hozzáadásával pH 1,5-2,7 tartományban elválasztjuk a többi fehérjétől, és2. separating the glucagon from the solution of the resulting solid by addition of an inorganic salt, preferably ammonium sulphate, at a pH of from 1.5 to 2.7, and 3. a 2. lépésben kapott glukagont feloldjuk, és 4,5-8,5 pH-értéken, 2-10mg/ml glukagon-koncentráció mellett végzett egy vagy több kristályosítással3. dissolving the glucagon obtained in step 2 and crystallizing it at a pH of 4.5 to 8.5 with glucagon at a concentration of 2-10 mg / ml glucagon. 50 tisztítjuk, azzal jellemezve, hogy glukagon-tartalmú oldatként az inzulin előállításánál alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszót használjuk.50, characterized in that the glucagon-containing solution used is the supernatant formed during the alkaline crystallization of insulin.