GR20160100569A - Method for the flurometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins - Google Patents
Method for the flurometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteinsInfo
- Publication number
- GR20160100569A GR20160100569A GR20160100569A GR20160100569A GR20160100569A GR 20160100569 A GR20160100569 A GR 20160100569A GR 20160100569 A GR20160100569 A GR 20160100569A GR 20160100569 A GR20160100569 A GR 20160100569A GR 20160100569 A GR20160100569 A GR 20160100569A
- Authority
- GR
- Greece
- Prior art keywords
- protein
- sample
- carbonyl groups
- fraction
- cells
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 218
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 218
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 33
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 26
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 11
- WTDHTIVYKKLOTC-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3',6'-bis(diethylamino)spiro[isoindole-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound NN1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(N(CC)CC)C=C1OC1=CC(N(CC)CC)=CC=C21 WTDHTIVYKKLOTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 52
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 33
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 claims description 31
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 24
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 23
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 19
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 19
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 18
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 15
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 13
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 13
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims description 12
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 11
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 5
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000009738 saturating Methods 0.000 claims description 4
- -1 tissue homogenate Substances 0.000 claims description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 33
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 193
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 91
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 33
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 8
- 108091006003 carbonylated proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 4
- 239000002265 redox agent Substances 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 4
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 4
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 description 3
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxynonenal Chemical compound CCCCCC(O)C=CC=O JVJFIQYAHPMBBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 2
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 2
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 238000007421 fluorometric assay Methods 0.000 description 2
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940071870 hydroiodic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QUMMHDKUYXGXQJ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3',6'-bis(ethylamino)-2',7'-dimethylspiro[isoindole-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound NN1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(C)=C(NCC)C=C1OC1=C2C=C(C)C(NCC)=C1 QUMMHDKUYXGXQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRBKEAMVRSLQPH-UHFFFAOYSA-N 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 MRBKEAMVRSLQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MEUCHQDLZYLNQY-UHFFFAOYSA-N 5-(aminocarbamothioylamino)-2-(3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl)benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(NC(=S)NN)=CC=C1C1=C2C=CC(=O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MEUCHQDLZYLNQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000015930 Lon proteases Human genes 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033647 Pancreatitis acute Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023294 Protease La Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010043391 Thalassaemia beta Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000003229 acute pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000006851 antioxidant defense Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N chloric acid Chemical compound OCl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940005991 chloric acid Drugs 0.000 description 1
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000015961 delipidation Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229940097156 peroxyl Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7004—Stress
- G01N2800/7009—Oxidative stress
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Description
Μέθοδος για την φθορισμομετρική ανίχνευση ή/ και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων Method for the fluorometric detection and/or quantification of protein carbonyl groups
ΠΕΔΙΟ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ FIELD OF THE INVENTION
Η εφεύρεση περιγράφει νέες μεθόδους και κιτ για την φθορισμομετρική ανίχνευση ή/ και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων. Αυτή η μέθοδος είναι χρήσιμη σε ένα πλήθος εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού του επιπέδου κυτταρικής οξείδωσης, καθώς και για τη επιλογή παραγόντων που ελαττώνουν το επίπεδο κυτταρικής οξείδωσης. Παρέχονται επίσης κιτ για χρήση στην φθορισμομετρική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε ένα ή περισσότερα δείγματα. The invention describes new methods and kits for the fluorometric detection and/or quantification of protein carbonyl groups. This method is useful in a number of applications, including determining the level of cellular oxidation, as well as for selecting agents that reduce the level of cellular oxidation. Kits are also provided for use in the fluorimetric quantification of protein carbonyl groups in one or more samples.
ΣΤΑΘΜΗ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ STATE OF THE ART
Η ακριβής ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την αξιολόγηση της έκτασης της οξειδωτικής βλάβης των πρωτεϊνών. Η οξείδωση των πρωτεϊνών είναι το αποτέλεσμα μιας βιολογικής διαδικασίας που περιγράφεται γενικά ως οξειδωτικό στρες, μια κατάσταση την οποία υφίστανται όλοι οι αερόβιοι οργανισμοί όπως ο άνθρωπος. Accurate quantification of protein carbonyl groups is a prerequisite for assessing the extent of oxidative damage to proteins. Protein oxidation is the result of a biological process generally described as oxidative stress, a condition experienced by all aerobic organisms such as humans.
Το οξειδωτικό στρες εμπλέκεται σε φυσιολογικές λειτουργίες και καταστάσεις του ανθρώπινου οργανισμού, όπως ο κυτταρικός κύκλος, η διαφοροποίηση και η γήρανση, καθώς και σε παθολογικές καταστάσεις που ευθύνονται για όλες τις ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της φαρμακευτικής αντιμετώπισής τους και του προσδιορισμού της κατάλληλης φαρμακευτικής δόσης. Ως εκ τούτου, η βιοχημεία του οξειδωτικού στρες θεωρείται από τις πλέον καινοτόμες και ταχέως αναπτυσσόμενες όλων των γνωστικών αντικειμένων των βιολογικών επιστημών. Oxidative stress is involved in normal functions and states of the human body, such as the cell cycle, differentiation and aging, as well as in pathological conditions responsible for all diseases, including their drug treatment and determining the appropriate drug dose. Therefore, the biochemistry of oxidative stress is considered one of the most innovative and rapidly developing of all biological sciences.
Οξειδωτικό στρες παρουσιάζεται κάθε φορά που η αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού προσβάλλεται από δραστικά είδη οξυγόνου (εφεξής καλούμενα και ROS) όπως οι ρίζες σουπεροξειδίου και υδροξυλίου. Τα ROS προσβάλλουν βιομόρια ζωτικής σημασίας για το μεταβολισμό των κυττάρων, όπως τα μεμβρανικά λιπίδια, το RNA/DNA, και οι πρωτεΐνες, και προκαλεί σοβαρές μοριακές βλάβες και συγκεκριμένα οξειδωτικές τροποποιήσεις και αποικοδομήσεις. Oxidative stress occurs whenever the body's antioxidant defenses are attacked by reactive oxygen species (hereinafter referred to as ROS) such as superoxide and hydroxyl radicals. ROS attack biomolecules vital for cell metabolism, such as membrane lipids, RNA/DNA, and proteins, and causes severe molecular damage, specifically oxidative modifications and degradation.
Οι πρωτεΐνες είναι μεταξύ των κύριων στόχων του οξειδωτικού στρες, που οδηγεί σε αναστολή του βιολογικού ρόλου τους, ιδιαίτερα των βιοχημικών αντιδράσεων που καταλύονται από ένζυμα κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού. Οι πρωτεΐνες μπορεί να υποστούν τροποποιήσεις από έναν μεγάλο αριθμό αντιδράσεων που περιλαμβάνουν ROS, και ειδικότερα από το υπεροξείδιο του υδρογόνου και τις ρίζες σουπεροξειδίου, υπεροξυλίου και υδροξυλίου, μεταξύ άλλων, τα οποία είναι βιοχημικά συστατικά του οξειδωτικού στρες. Αυτά μπορούν να προκαλέσουν διάφορα είδη οξειδωτικών τροποποιήσεων στις πρωτεΐνες, με πιο σημαντική τον σχηματισμό καρβονυλικών ομάδων σε ορισμένα αμινοξέα της πρωτεϊνικής/πεπτιδικής αλυσίδας (π.χ., λυσίνη, κυστεΐνη, αργινίνη, προλίνη, θρεονίνη). Άλλες μορφές καρβονυλίωσης των αμινοξέων προκύπτουν από την αντίδραση ορισμένων αμινοξέων (ιστιδίνη, κυστεΐνη και λυσίνη) με δραστικά είδη καρβονυλίου (όπως το 4-hydroxy-2-nonenal) που προέρχονται από την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Proteins are among the main targets of oxidative stress, which leads to inhibition of their biological role, especially biochemical reactions catalyzed by enzymes during metabolism. Proteins can undergo modifications by a large number of reactions involving ROS, and in particular by hydrogen peroxide and superoxide, peroxyl and hydroxyl radicals, among others, which are biochemical components of oxidative stress. These can cause various kinds of oxidative modifications to proteins, most notably the formation of carbonyl groups on certain amino acids of the protein/peptide chain (eg, lysine, cysteine, arginine, proline, threonine). Other forms of amino acid carbonylation result from the reaction of certain amino acids (histidine, cysteine, and lysine) with reactive carbonyl species (such as 4-hydroxy-2-nonenal) derived from lipid peroxidation.
Η καρβονυλίωση έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή, κυρίως λόγω της μη αναστρέψιμης, μη επιδιορθώσιμης φύσης της. Η περιεκτικότητα μιας πρωτεΐνης σε καρβονυλομάδες είναι ο πιο ευρέως αναγνωρισμένος αξιόπιστος δείκτης σοβαρής οξειδωτικής βλάβης της πρωτεΐνης. Οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες σημαδεύονται για πρωτεόλυση από το πρωτεόσωμα και την πρωτεάση Lon, αλλά μπορεί να ξεφύγουν από την αποικοδόμηση και να σχηματίσουν συσσωματώματα καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών υψηλού μοριακού βάρους σε ιστούς, τα οποία, εκτός από την συσσώρευση τους με την ηλικία, μπορεί να καταστούν κυτταροτοξικά. Η ύπαρξη καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών έχει συνδεθεί με ένα μεγάλο αριθμό ανθρώπινων ασθενειών και διαταραχών που σχετίζονται με την ηλικία, συμπεριλαμβανομένης της νόσου του Πάρκινσον και του Αλτσχάιμερ, τον καρκίνο, την χρόνια πνευμονική νόσο και την νεφρική ανεπάρκεια, τον διαβήτη και την σήψη, και τις δυσλειτουργίες του σκελετικού μυ. Επιπλέον, κλινικές μελέτες έχουν δείξει αυξημένα επίπεδα πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε ένα μεγάλο εύρος παθολογικών καταστάσεων στον άνθρωπο, π.χ. σε πρωτεΐνες του πλάσματος παιδιών με νεανική ρευματοειδή αρθρίτιδα, σε εκκρίματα της τραχείας από πρόωρα νεογνά που υποβάλλονται σε θεραπεία αερισμού, στο πλάσμα και το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με σοβαρή σήψη και μείζον τραύμα, στον ορό του πλάσματος ανδρών με χρόνια αρτηριακή απόφραξη, σε ασθενείς που πάσχουν από μείζονα θαλασσαιμία ή οξεία παγκρεατίτιδα, στον εγκέφαλο ατόμων με ήπια γνωστική διαταραχή, και σε πρωτεΐνες του πλάσματος σε ασθενείς με νεανικό διαβήτη τύπου 1 . Carbonylation has attracted much attention, mainly because of its irreversible, non-repairable nature. The carbonyl group content of a protein is the most widely recognized reliable indicator of severe oxidative damage to the protein. Carbonylated proteins are marked for proteolysis by the proteasome and Lon protease, but may escape degradation and form aggregates of high molecular weight carbonylated proteins in tissues, which, in addition to accumulating with age, may become cytotoxic. The presence of carbonylated proteins has been linked to a large number of age-related human diseases and disorders, including Parkinson's and Alzheimer's disease, cancer, chronic lung disease and kidney failure, diabetes and sepsis, and dysfunctions of skeletal muscle. Furthermore, clinical studies have shown increased levels of protein carbonyls in a wide range of human pathological conditions, e.g. in plasma proteins of children with juvenile rheumatoid arthritis, in tracheal secretions from premature neonates undergoing ventilation therapy, in plasma and bronchoalveolar lavage from patients with severe sepsis and major trauma, in the plasma serum of men with chronic arterial occlusion, in patients who suffer from thalassemia major or acute pancreatitis, in the brain of subjects with mild cognitive impairment, and in plasma proteins in patients with juvenile type 1 diabetes.
Ως εκ τούτου, η ακριβής ποσοτικοποίηση της καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών καθίσταται αναγκαία προϋπόθεση για την εκτίμηση της έκτασης της πρωτεϊνικής οξειδωτικής βλάβης. Επιπλέον, η ποσοτικοποίηση των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών παρέχει ένα νέο διαγνωστικό και ενδεχομένως προ-συμπτωματικό βιοδείκτη για ασθένειες του ανθρώπου, καθώς επίσης και για οποιαδήποτε βιολογική δυσλειτουργία που σχετίζεται με την οξειδωτική βλάβη. Επιπλέον, παρέχουν ένα σημαντικό κλινικό εργαλείο για την αξιολόγηση των παρενεργειών των νέων φαρμάκων και τον καθορισμό της κατάλληλης δόσης τους. Therefore, accurate quantification of protein carbonylation becomes a prerequisite for estimating the extent of protein oxidative damage. In addition, quantification of carbonylated proteins provides a novel diagnostic and potentially pro-symptomatic biomarker for human disease, as well as any biological dysfunction associated with oxidative damage. In addition, they provide an important clinical tool for evaluating the side effects of new drugs and determining their appropriate dosage.
Ένας τρόπος που είναι γνωστός σήμερα για την εκτέλεση της ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων είναι η φθορισμομετρική ποσοτικοποίηση τους. Ωστόσο, η φθορισμομετρική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων όπως γίνεται μέχρι τώρα έχει σοβαρούς περιορισμούς, που οδηγούν σε μη αναπαραγώγιμα και αναξιόπιστα στοιχεία. One way known today to perform the quantification of protein carbonyl groups is their fluorometric quantification. However, the fluorometric quantification of protein carbonyl groups as done until now has serious limitations, leading to non-reproducible and unreliable data.
Η φθορισμομετρική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων πραγματοποιείται με το φθορίζον αντιδραστήριο fluorescein-5-thiosemicarbazide (εφεξής καλούμενο FTC). Στην δοκιμασία FTC, οι πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες επωάζονται με 0,2 mM (mmol) FTC για 24 ώρες, και το μη αντιδράσαν αντιδραστήριο FTC απομακρύνεται στην συνέχεια με κατακρήμνιση της πρωτεΐνης με παγωμένο 16% τριχλωροξικό οξύ (εφεξής καλούμενο TCA). Στο επόμενο στάδιο της δοκιμασίας FTC, το πρωτεΐνικό ίζημα πλένεται τρεις φορές με ακετόνη (για να απομακρυνθεί το μη αντιδράσαν FTC), και το πλυμένο πρωτεΐνικό ίζημα που προκύπτει διαλυτοποιείται σε 6 Μ (Molar) γουανιδίνη. Η δαλυτοποιημένη πρωτεΐνη αραιώνεται 10 φορές (με 0,1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα, pH 7,0) πριν από τη μέτρηση του φθορισμού της (στα μήκη κύματος διέγερσης/εκπομπής 485/535 nm), και την μετατροπή της σε moles καρβονυλομάδων με την βοήθεια πρότυπης καμπύλης που δημιουργείται με το αντιδραστήριο FTC. Fluorometric quantification of protein carbonyl groups is performed with the fluorescent reagent fluorescein-5-thiosemicarbazide (hereafter referred to as FTC). In the FTC assay, protein carbonyl groups are incubated with 0.2 mM (mmol) FTC for 24 h, and unreacted FTC reagent is then removed by precipitation of the protein with ice-cold 16% trichloroacetic acid (hereafter referred to as TCA). In the next step of the FTC assay, the protein pellet is washed three times with acetone (to remove unreacted FTC), and the resulting washed protein pellet is solubilized in 6 M (Molar) guanidine. Solubilized protein is diluted 10-fold (with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0) before measuring its fluorescence (at excitation/emission wavelengths 485/535 nm), and converting it to moles of carbonyl groups by using standard curve generated with FTC reagent.
Τα κύρια μειονεκτήματα της δοκιμασίας FTC είναι τα ακόλουθα: The main disadvantages of the FTC test are the following:
Πρώτον, όπως και σε όλες τις περιπτώσεις που χρησιμοποιείται TCA και μόνο για την κατακρήμνιση πρωτεϊνών, το στάδιο κατακρήμνισης του προσδιορισμού FTC με 16% TCA δεν είναι 100% αποτελεσματικό στην πλήρη ανάκτηση της πρωτεΐνης του δείγματος ως ίζημα. Επιπλέον, οι διαλυτές σε οξύ πρωτεΐνες χάνονται και, κατά συνέπεια, δεν συνυπολογίζονται στην ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων. First, as in all cases where TCA alone is used to precipitate proteins, the precipitation step of the FTC assay with 16% TCA is not 100% efficient in fully recovering the sample protein as a precipitate. In addition, acid-soluble proteins are lost and therefore not counted in the amount of protein carbonyl groups.
Δεύτερον, η πολύ μεγάλη (24 ώρες) περίοδος επώασης των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων με FTC κάνει τη δοκιμασία μη πρακτική για τη ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων. Second, the very long (24 h) incubation period of protein carbonyl groups with FTC makes the assay impractical for the analysis of large numbers of samples.
Τρίτον, το αντιδραστήριο FTC φθορίζει είτε είναι ελεύθερο είτε δεσμευμένο στις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες. Έτσι, το μη αντιδράσαν FTC θα παρεμποδίζει την ανάλυση αν δεν απομακρυνθεί συστηματικά και με αποτελεσματικότητα (100%), προκαλώντας υπερεκτίμηση και στατιστική μεταβλητότητα στην περιεκτικότητα των δειγμάτων πρωτεΐνης σε καρβονυλομάδες. Third, the FTC reagent fluoresces either free or bound to protein carbonyl groups. Thus, unreacted FTC will interfere with analysis if not removed systematically and efficiently (100%), causing overestimation and statistical variability in the carbonyl content of protein samples.
Τέταρτον, για τον προσδιορισμό FTC πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα με υψηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης (για παράδειγμα, δείγμα ανθρώπινου πλάσματος 5mg/ml), διότι αυτή η δοκιμασία είναι αναξιόπιστη για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε δείγματα που περιέχουν λιγότερο από 2 mg/ml πρωτεΐνη όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως. Ο λόγος είναι η σημαντική απώλεια πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της κατακρήμνισης με TCA και πλύσης των πρωτεϊνικών ιζημάτων (βλέπε αναφορά: Mohanty JG et al. , Anal. Biochem. 2010, Vol. 400, pp. 289-294). Fourth, samples with a high protein concentration (for example, a 5mg/ml human plasma sample) should be used for the FTC assay, because this assay is unreliable for the determination of protein carbonyl groups in samples containing less than 2 mg/ml protein such as has been mentioned before. The reason is the significant loss of protein during TCA precipitation and washing of the protein pellets (see reference: Mohanty JG et al. , Anal. Biochem. 2010, Vol. 400, pp. 289-294).
Πέμπτον, το αντιδραστήριο γουανιδίνη (διάλυμα 6 Μ) που χρησιμοποιείται για την διαλυτοποίηση του πρωτεΐνικού ιζήματος (που έχει προκύψει μετά από κατακρήμνιση με TCA και πλύση με ακετόνη) στο τελευταίο στάδιο της δοκιμασίας FTC, προκαλεί τα ακόλουθα δύο είδη παρεμβολών: (i) αποσβένει το φθορισμό της πρωτεϊνικής καρβονυλ-FTC υδραζόνης που παράγεται κατά την αντίδραση και (ii) επηρεάζει τον ακριβή προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη του διαλυτοποιημένου με γουανιδίνη ιζήματος. Γ ια να ελαχιστοποιηθούν οι παρεμβολές αυτές απαιτείται μια ελάχιστη αραίωση 10 φορές σε σχέση με την αρχικά διαλυτοποιημένη με γουανιδίνη πρωτεΐνη, η οποία αραίωση από μόνη της μειώνει την ευαισθησία της δοκιμασίας FTC κατά 10 φορές. Fifth, the guanidine reagent (6 M solution) used to solubilize the protein precipitate (obtained after TCA precipitation and acetone washing) in the final step of the FTC assay causes the following two kinds of interference: (i) it quenches the fluorescence of the protein carbonyl-FTC hydrazone produced during the reaction and (ii) affects the accurate determination of the protein content of the guanidine-solubilized precipitate. To minimize these interferences a minimum dilution of 10-fold relative to the original guanidine-solubilized protein is required, which dilution alone reduces the sensitivity of the FTC assay by 10-fold.
Έκτον, αν και ο προσδιορισμός FTC δέχεται ως δεδομένη μία μοριακή στοιχειομετρική αναλογία φθορισμού 1:1 μεταξύ της υδραζόνης που παράγεται και του αντιδραστηρίου FTC που χρησιμοποιείται για να κατασκευαστεί η πρότυπη καμπύλη (βλέπε αναφορά: Mohanty JG et al., Anal. Biochem. 2010, Vol. 400, pp. 289-294), η μελέτη στην οποία παραπέμπει αυτή η δοκιμασία δεν τεκμηριώνει μια τέτοια αξίωση (βλέπε αναφορά: Ahn Β et al. Anal. Biochem.1987, Vol. 161, pp. 245-257), και αυτό θέτει περαιτέρω σε αμφισβήτηση την αξιοπιστία της μεθόδου στον υπολογισμό των επιπέδων των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων. Sixth, although the FTC assay assumes a 1:1 fluorescence molar stoichiometric ratio between the hydrazone produced and the FTC reagent used to construct the standard curve (see reference: Mohanty JG et al., Anal. Biochem. 2010 , Vol. 400, pp. 289-294), the study referenced by this test does not substantiate such a claim (see reference: Ahn B et al. Anal. Biochem. 1987, Vol. 161, pp. 245-257) , and this further calls into question the reliability of the method in calculating protein carbonyl levels.
Έβδομον, η δοκιμασία FTC δεν μπορεί να εφαρμοστεί με βεβαιότητα σε δείγματα που περιέχουν DNA και /ή RNA επειδή η πιθανότητα παρεμβολής (δηλαδή η πρόσδεση του FTC στα μόρια αυτά) δεν έχει ερευνηθεί. Έτσι, αυτή η δοκιμασία απαιτεί προεπεξεργασία για την απομάκρυνση του DNA από το δείγμα, η οποία γίνεται συνήθως μέσω κατακρήμνισης του DNA με θειική στρεπτομυκίνη (εφεξής καλούμενη SS). Ωστόσο, αυτό το βήμα δεν εξαλείφει εντελώς την πιθανότητα παρεμβολής από το DNA, διότι η απομάκρυνσή του δεν είναι 100% αποτελεσματική (είναι περίπου 50% αποτελεσματική), με αποτέλεσμα να αυξάνει την πιθανή υπερεκτίμηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που μετρώνται με τη δοκιμασία FTC. Seventh, the FTC assay cannot be applied with certainty to samples containing DNA and/or RNA because the possibility of interference (ie, binding of FTC to these molecules) has not been investigated. Thus, this assay requires pretreatment to remove DNA from the sample, which is usually done by precipitating the DNA with streptomycin sulfate (hereafter referred to as SS). However, this step does not completely eliminate the possibility of DNA interference because its removal is not 100% efficient (it is about 50% efficient), thus increasing the potential overestimation of protein carbonyl groups measured by the FTC assay.
Τέλος, το αντιδραστήριο FTC είναι αρκετά ακριβό. Finally, the FTC reagent is quite expensive.
Ως εκ τούτου, υπάρχει η ανάγκη για μια νέα φθορισμομετρική δοκιμασία για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που θα είναι πιο αποτελεσματική από αυτές που είναι ήδη γνωστές στην τεχνική, δηλαδή που να μπορεί: Therefore, there is a need for a new fluorometric assay for the quantification of protein carbonyl groups that will be more efficient than those already known in the art, namely that can:
- Να εφαρμόζεται αποτελεσματικά σε οποιαδήποτε ποσότητα δείγματος πρωτεΐνης, και να μπορεί να εφαρμοστεί σε δείγματα με πολύ χαμηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης (ακόμη και σε 2.5 μg), και παρουσία DNA, - To be effectively applied to any amount of protein sample, and to be able to be applied to samples with a very low protein concentration (even at 2.5 µg), and the presence of DNA,
- Να είναι ακριβής και με πολύ μικρή ή και καθόλου στατιστική διακύμανση, - To be accurate and with very little or no statistical variation,
- Να έχει μικρό χρόνο εκτέλεσης, έτσι ώστε να μπορεί να εφαρμοστεί σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων, - To have a short execution time, so that it can be applied to a large number of samples,
- Να χρησιμοποιεί ένα μη φθορίζον (σε ελεύθερη μορφή) αντιδραστήριο που να μην είναι επιρρεπές σε παρεμβολές, - Use a non-fluorescent (in free form) reagent that is not prone to interference,
- Να χρησιμοποιεί ένα φθηνό φθορίζον (μετά από την αντίδρασή του με τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες) αντιδραστήριο που να συντίθεται εύκολα και να παράγεται εμπορικά. - To use an inexpensive fluorescent (after its reaction with protein carbonyl groups) reagent that is easily synthesized and commercially produced.
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ SUMMARY OF THE INVENTION
Αντικείμενο της παρούσας εφεύρεσης είναι να παρέχει νέες μεθόδους και κιτ για την ανίχνευση ή/και ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε ένα δείγμα. Η αποκαλυπτόμενη εφεύρεση περιγράφει μία αποτελεσματική λύση σε όλα τα προβλήματα που περιγράφονται παραπάνω, με την παρουσίαση μιας νέας και εφευρετικής φθορισμομετρικής μεθόδου ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που χρησιμοποιεί ένα υδραζίδιο ροδαμίνης (rhodamine hydrazide) για την σήμανση των καρβονυλομάδων, η οποία δεν είναι μόνο αποτελεσματική, αλλά είναι επίσης ιδιαίτερα εύκολη μέθοδος στην εκτέλεσή της και απαιτεί αντιδραστήρια χαμηλού κόστους και σε μικρούς αριθμούς και την ποσότητα. The object of the present invention is to provide new methods and kits for the detection and/or quantification of protein carbonyl groups in a sample. The disclosed invention describes an effective solution to all the problems described above, by presenting a new and inventive fluorometric method for the quantification of protein carbonyl groups that uses a rhodamine hydrazide to label the carbonyl groups, which is not only efficient, but it is also a particularly easy method to perform and requires low-cost reagents and small numbers and quantity.
Σε προτιμώμενες ενσωματώσεις, το υδραζίδιο ροδαμίνης που χρησιμοποιείται ως ιχνηθέτης είναι ένα μη φθορίζον (σε ελεύθερη μορφή) υδραζίδιο ροδαμίνης. Η χρήση του μη-φθορίζοντος ιχνηθέτη, έχει ως αποτέλεσμα μειωμένο φθορισμό υποβάθρου σε σχέση με το (φθορίζον σε ελεύθερη μορφή) αντιδραστήριο FTC της δοκιμασίας FTC. Σε μία περισσότερο προτιμώμενη ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, η ποσότητα των καρβονυλομάδων σε ένα δείγμα πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται φθορισμομετρικά χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο υδραζίδιο Β ροδαμίνης (Rhodamine Β Hydrazide ή 2-amino-3',6'-bis(diethy lamino)spiro[isoindole-3,9'-xanthene]-1 -one, εφεξής καλούμενο RBH). Η φθορισμομετρική δοκιμασία όπου το υδραζίδιο ροδαμίνης είναι το RBH στο εξής θα αναφέρεται ως δοκιμασία RBH. In preferred embodiments, the rhodamine hydrazide used as a tracer is a non-fluorescent (in free form) rhodamine hydrazide. The use of the non-fluorescent tracer results in reduced background fluorescence relative to the (fluorescent free form) FTC reagent of the FTC assay. In a more preferred embodiment of the present invention, the amount of carbonyl groups in a protein sample is quantified fluorometrically using the reagent Rhodamine B Hydrazide or 2-amino-3',6'-bis(diethy lamino)spiro[isoindole-3 ,9'-xanthene]-1 -one, hereafter called RBH). The fluorometric assay where rhodamine hydrazide is RBH will hereafter be referred to as the RBH assay.
Σε άλλες προτιμώμενες ενσωματώσεις, το pH του δείγματος στο στάδιο της επαφής με το υδραζίδιο ροδαμίνης διατηρείται μέσα στο εύρος από 2,5 έως 3,5. Σε αυτή την περιοχή pH, με προτιμώμενο pH το 3, εξασφαλίζεται ότι οποιαδήποτε νουκλεϊκά οξέα μπορεί να υπάρχουν στο δείγμα κατακρημνίζονται από το διάλυμα και έτσι δεν παρεμβαίνουν στην ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων. Σε αυτές τις ενσωματώσεις, το δείγμα στο στάδιο της επαφής με το υδραζίδιο επίσης περιλαμβάνει ένα άλας γουανιδινίου, το οποίο βοηθά στην μερική αποδιάταξη των πρωτεϊνών του δείγματος, καθιστώντας έτσι τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες περισσότερο προσβάσιμες στο υδραζίδιο ροδαμίνης. In other preferred embodiments, the pH of the sample in the rhodamine hydrazide contacting step is maintained within the range of 2.5 to 3.5. In this pH range, with a preferred pH of 3, it is ensured that any nucleic acids that may be present in the sample are precipitated from the solution and thus do not interfere with the quantification of protein carbonyl groups. In these embodiments, the sample in the hydrazide contact step also includes a guanidinium salt, which helps to partially disorder the proteins in the sample, thereby making the protein carbonyl groups more accessible to the rhodamine hydrazide.
Σε μερικές ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης, μετά την αντίδραση του υδραζιδίου ροδαμίνης με τις καρβονυλομάδες της πρωτεΐνης στο δείγμα, κάθε μη αντιδράσαν υδραζίδιο απομακρύνεται με πλύση του δείγματος πριν την μετάβαση στο βήμα ανίχνευσης και/ή ποσοτικοποίησης. Αυτό το στάδιο πλύσης μπορεί να επιτευχθεί με ποικίλους τρόπους, όπου ο πλέον προτιμώμενος είναι με πέρασμα του δείγματος μετά την αντίδραση μέσω μιας συσκευής φιλτραρίσματος που κατακρατά την πρωτεΐνη αλλά όχι και τον μη αντιδράσαντα ιχνηθέτη, ή εναλλακτικά με κατακρήμνιση της πρωτεΐνης ως ίζημα μετά από επώαση με δεοξυχολικό νάτριο (εφεξής καλούμενο DOC) και TCA. In some embodiments of the present invention, after the reaction of rhodamine hydrazide with the carbonyl groups of the protein in the sample, any unreacted hydrazide is removed by washing the sample before proceeding to the detection and/or quantification step. This washing step can be accomplished in a variety of ways, the most preferred being by passing the post-reaction sample through a filtration device that retains the protein but not the unreacted tracer, or alternatively by precipitating the protein as a precipitate after incubation with sodium deoxycholate (hereafter referred to as DOC) and TCA.
Σε άλλες προτιμώμενες ενσωματώσεις, η πρωτεΐνη που κατακρατείται στην συσκευή φιλτραρίσματος ή που ανακτάται ως ίζημα μετά από επώαση με DOC και TCA και φυγοκέντρηση, πριν από το βήμα ανίχνευσης και /ή ποσοτικοποίησης της πρωτεϊνικής καρβονυλ-ροδαμιν-υδραζόνης που παράγεται κατά την αντίδραση (εφεξής καλούμενη υδραζόνη) επαναδιαλυτοποιείται σε ένα διάλυμα που περιλαμβάνει ένα άλας γουανιδίνης και έναν ή περισσότερους ρυθμιστικούς παράγοντες. Το διάλυμα αυτό (εφεξής καλούμενο διάλυμα ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων) είναι βελτιστοποιημένο ως προς το pH και τη συγκέντρωση του άλατος γουανιδίνης όπως θα περιγράφει στην συνέχεια, ώστε να εξασφαλίζεται μέγιστη ένταση φθορισμού και σταθερότητα της υδραζόνης που προκύπτει. Επίσης, τυχόν νουκλεϊκά οξέα που τυχόν υπήρχαν στο δείγμα πρωτεΐνης και κατακρημνίστηκαν κατά την διάρκεια του σταδίου αντίδρασης με το υδραζίδιο ροδαμίνης, δεν επαναδιαλυτοποιούνται στο βελτιστοποιημένο διάλυμα ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων και απομακρύνονται με φυγοκέντρηση πριν το βήμα ανίχνευσης/ποσοτικοποίησης της προκύπτουσας υδραζόνης. Για το RBH, το βέλτιστο pH είναι εντός του εύρους από 4,5 έως 6,5, με την μέγιστη ένταση φθορισμού να επιτυγχάνεται σε pH 5. In other preferred embodiments, the protein retained in the filtration device or recovered as a precipitate after incubation with DOC and TCA and centrifugation, prior to the step of detecting and/or quantifying the protein carbonyl-rhodamine-hydrazone produced during the reaction (hereinafter called hydrazone) is redissolved in a solution comprising a guanidine salt and one or more buffering agents. This solution (hereafter called carbonyl group quantification solution) is optimized for pH and guanidine salt concentration as described below to ensure maximum fluorescence intensity and stability of the resulting hydrazone. Also, any nucleic acids that may have been present in the protein sample and precipitated during the rhodamine hydrazide reaction step are not redissolved in the optimized carbonyl group quantification solution and are removed by centrifugation before the resulting hydrazone detection/quantification step. For RBH, the optimum pH is within the range of 4.5 to 6.5, with maximum fluorescence intensity achieved at pH 5.
Η μέθοδος της παρούσας εφεύρεσης μπορεί επίσης να περιλαμβάνει το επιπλέον στάδιο της ανάλυσης των πρωτεϊνών που υπάρχουν στο δείγμα χρησιμοποιώντας αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση πρωτεΐνης σε πηκτή (denaturing protein gel electrophoresis), που παρέχει μια εκτίμηση της περιεκτικότητας σε καρβονύλια των πρωτεϊνών, οι οποίες διαχωρίζονται σε ζώνες βάσει του μοριακού βάρους τους και γίνονται ορατές επί του πήγματος από την εκπομπή φθορισμού. O ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των πρωτεϊνών του δείγματος μπορεί να πραγματοποιηθεί μετά την αντίδρασή τους με το υδραζίδιο ροδαμίνης ή πριν, όπου στην δεύτερη περίπτωση το υδραζίδιο ροδαμίνης αντιδρά με τις πρωτεϊνικές ζώνες μέσα στο πήκτωμα. The method of the present invention may also include the additional step of analyzing the proteins present in the sample using denaturing protein gel electrophoresis, which provides an estimate of the carbonyl content of the proteins, which are separated into bands based on of their molecular weight and become visible on the gel by fluorescence emission. The electrophoretic separation of the sample proteins can be performed after their reaction with rhodamine hydrazide or before, where in the second case rhodamine hydrazide reacts with the protein bands in the gel.
Η παρούσα μέθοδος για την ανίχνευση ή/και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα, και ειδικότερα: The present method for the detection and/or quantification of protein carbonyl groups offers several advantages, in particular:
Α. Είναι αξιόπιστη ακόμα και σε δείγματα με πολύ χαμηλή περιεκτικότητα πρωτεΐνης (ακόμα και 2,5 μg) σε σύγκριση με την δοκιμασία FTC η οποία εφαρμόζεται σε δείγματα με συγκεντρώσεις πρωτεΐνης ≥2 mg/ml. Η μέθοδος που περιγράφεται εδώ χρησιμοποιεί δείγματα πολύ χαμηλών ποσοτήτων πρωτεΐνης επειδή χρησιμοποιεί TCA σε συνδυασμό με δεοξυχολικό νάτριο, ένα αντιδραστήριο συν-κατακρήμνισης το οποίο αυξάνει την ανάκτηση των πρωτεϊνών μέχρι και ≥95% ακόμη και για πολύ χαμηλό εύρος συγκέντρωσης πρωτεΐνης του δείγματος (μέχρι τα 2 μg). Επιπλέον, ο συνδυασμός DOC-TCA αποτρέπει την απώλεια των διαλυτών σε οξύ πρωτεϊνών, και, ως εκ τούτου, τις συνυπολογίζει στην ποσότητα καρβονυλίου της πρωτεΐνης. A. It is reliable even in samples with very low protein content (even 2.5 µg) compared to the FTC test which applies to samples with protein concentrations ≥2 mg/ml. The method described here uses very low protein samples because it uses TCA in combination with sodium deoxycholate, a co-precipitation reagent that increases protein recovery up to ≥95% even for a very low range of sample protein concentration (up to 2 µg). In addition, the DOC-TCA combination prevents the loss of acid-soluble proteins, and therefore accounts for them in the carbonyl content of the protein.
Β. Ο χρόνος αντίδρασης της παρούσας μεθόδου είναι 1 ώρα, ενώ εκείνος της δοκιμασίας FTC είναι 24 φορές υψηλότερος. Επιπλέον, η μέθοδος της εφεύρεσης χρησιμοποιεί δύο στάδια πλύσης για να αφαιρεθεί ο ιχνηθέτης που δεν αντιδρά, έναντι των τριών σταδίων πλυσίματος που χρησιμοποιούνται στην δοκιμασία FTC για να απομακρυνθεί το αντιδραστήριο FTC. Αυτό προσθέτει στην απλότητα και στην ταχύτητα της μεθόδου που περιγράφεται στο παρόν. B. The reaction time of the present method is 1 hour, while that of the FTC assay is 24 times higher. In addition, the method of the invention uses two washing steps to remove the unreacted tracer, as opposed to the three washing steps used in the FTC assay to remove the FTC reagent. This adds to the simplicity and speed of the method described herein.
Γ. Τυχόν παρεμβάλλοντα νουκλεϊκά οξέα που μπορεί να υπάρχουν στο δείγμα παραμένουν κατακρημνισμένα τόσο κατά την αντίδραση του δείγματος πρωτεΐνης με τον ιχνηθέτη στο όξινο ρυθμιστικό διάλυμα της δοκιμασίας, όσο και στο στάδιο όπου η κατακρημνισμένη με DOC-TCA υδραζόνη που παράγεται κατά την αντίδραση διαλύεται στο διάλυμα ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων προκειμένου να μετρηθεί ο φθορισμός της. C. Any interfering nucleic acids that may be present in the sample remain precipitated both during the reaction of the protein sample with the tracer in the acidic assay buffer and at the step where the DOC-TCA-precipitated hydrazone produced during the reaction is dissolved in the carbonyl group quantification solution in order to measure its fluorescence.
Δ. Ο φθορισμός της υδραζόνης που σχηματίζεται μεταξύ του υδραζίδιου ροδαμίνης και των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων είναι σταθερός για τουλάχιστον δύο ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου στο διάλυμα ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων που χρησιμοποιείται για τη διάλυση της πρωτεΐνης πριν από τη μέτρηση του φθορισμού, ενώ εκείνη που σχηματίζεται μεταξύ του FTC και των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων είναι ασταθής. Έτσι, η μέτρηση του φθορισμού των πρωτεϊνών του δείγματος μπορεί να καθυστερήσει για να ταιριάζει με το χρονοδιάγραμμα του ερευνητή. D. Hydrazone fluorescence formed between rhodamine hydrazide and protein carbonyl groups is stable for at least two days at room temperature in the carbonyl quantification solution used to solubilize the protein prior to fluorescence measurement, whereas that formed between FTC and of protein carbonyl groups is unstable. Thus, the fluorescence measurement of sample proteins can be delayed to fit the researcher's schedule.
Ε. Η ευαισθησία της παρούσας μεθόδου είναι αρκετές φορές υψηλότερη σε σύγκριση με την δοκιμασία FTC. Για παράδειγμα, η ευαισθησία φθορισμού της υδραζόνης που σχηματίζεται από το αντιδραστήριο RBH είναι ~ 100 φορές υψηλότερη από εκείνη της υδραζόνης που σχηματίζεται κατά την δοκιμασία FTC. Αυτό σε συνδυασμό με την ελάχιστη ποσότητα πρωτεΐνης (2,5 μg) του προσδιορισμού RBH η οποία είναι 800 φορές μικρότερη από εκείνη του προσδιορισμού FTC, δίνει ένα αθροιστικό όριο ευαισθησίας 8.500 φορές υψηλότερο για την δοκιμασία RBH της εφεύρεσης σε σύγκριση με την δοκιμασία FTC. Αυτό επεκτείνει τη δυνατότητα εφαρμογής της δοκιμασίας RBH σε οποιοδήποτε βιολογικό δείγμα. Επιπλέον, το αντιδραστήριο RBH συντίθεται εύκολα στο εργαστήριο με δύο φθηνά αντιδραστήρια, και, ως εκ τούτου μπορεί να είναι εμπορικά διαθέσιμη σε χαμηλό κόστος. Αυτό, σε συνδυασμό με το υψηλό κόστος του αντιδραστηρίου FTC, καθιστά η δοκιμασία RBH λιγότερο δαπανηρή. E. The sensitivity of the present method is several times higher compared to the FTC test. For example, the fluorescence sensitivity of the hydrazone formed by the RBH reagent is ~100 times higher than that of the hydrazone formed in the FTC assay. This combined with the minimum amount of protein (2.5 µg) of the RBH assay which is 800 times less than that of the FTC assay, gives a cumulative limit of sensitivity 8,500 times higher for the RBH assay of the invention compared to the FTC assay. This extends the applicability of the RBH assay to any biological sample. Furthermore, the RBH reagent is easily synthesized in the laboratory with two inexpensive reagents, and therefore can be commercially available at low cost. This, combined with the high cost of the FTC reagent, makes the RBH assay less expensive.
ΣΤ. Οι πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες μπορούν να ποσοτικοποιηθούν σε moles με μετατροπή του φθορισμού τους χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη με το υδραζίδιο ροδαμίνης. Το Παράδειγμα 6 και η Εικ. 2 δείχνουν μια πειραματική επιβεβαίωση της ισομοριακής στοιχειομετρίας μεταξύ του αντιδραστηρίου RBH (που έχει χαμηλό φθορισμό στην όξινη περιοχή του pH) και της υδραζόνης που σχηματίζεται κατά την αντίδραση με τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες. Από την άλλη πλευρά, αν και επίσης δηλώνεται ότι η υπάρχει ισομοριακή στοιχειομετρία μεταξύ της υδραζόνης που παράγεται κατά την δοκιμασία FTC και του αντιδραστηρίου FTC που χρησιμοποιείται για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης (Mohanty JG et al.. Anal. Biochem. 2010, Vol. 400, pp. 289-294), κάνοντας αναφορά σε μια προηγούμενη μελέτη (Ahn Β et al. Anal. Biochem. 1987, Vol. 161 , pp. 245-257), ο ισχυρισμός αυτός δεν τεκμηριώνεται από την αναφερόμενη μελέτη. F. Protein carbonyl groups can be quantified in moles by converting their fluorescence using a standard curve with rhodamine hydrazide. Example 6 and Fig. 2 show an experimental confirmation of the equimolar stoichiometry between the reagent RBH (which has low fluorescence in the acidic pH range) and the hydrazone formed upon reaction with the protein carbonyl groups. On the other hand, although it is also stated that there is equimolar stoichiometry between the hydrazone produced in the FTC assay and the FTC reagent used to construct the standard curve (Mohanty JG et al.. Anal. Biochem. 2010, Vol. 400, pp. 289-294), citing a previous study (Ahn B et al. Anal. Biochem. 1987, Vol. 161 , pp. 245-257), this claim is not substantiated by the cited study.
Η αποκαλυπτόμενη εφεύρεση παρέχει επίσης μία μέθοδο για την φωτομετρική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε συγκεκριμένα υποκυτταρικά πρωτεϊνικά κλάσματα, όπως το κυτταροπλασματικό/υδατικό, λιπιδικό/μεμβρανικό, και/ή το κλάσμα χρωμοσωμικών πρωτεϊνών (ιστόνες). Η μέθοδος αυτή ξεπερνά τα εγγενή προβλήματα των χρησιμοποιούμενων σήμερα μεθοδολογιών κλασματοποίησης πρωτεϊνών που εστιάζουν στην απομόνωση μόνο του κυτταροπλασματικού πρωτεϊνικού κλάσματος με παραλλαγές της διαδικασίας καθίζησης/πλύσης πρωτεϊνών με τριχλωροξικό οξύ (εφεξής καλούμενο TCA), η οποία, ωστόσο, απομακρύνει το κλάσμα των διαλυτών σε οξέα πρωτεϊνών (acid soluble proteins) και ως εκ τούτου, οι καρβονυλομάδες τους δεν λαμβάνονται υπόψη. Επιπλέον, οι υπάρχουσες μεθοδολογίες δεν περιλαμβάνουν όλες τυποποιημένα πρωτόκολλα για την αφαίρεση των νουκλεϊκών οξέων που επίσης περιέχουν καρβονυλομάδες, ούτε για την εξουδετέρωση των σουλφενικών ομάδων (-SOH) της κυστεΐνης, που παρεμβάλλονται στην ανάλυση. Σε αντίθεση, η τυποποιημένη μέθοδος κλασματοποίησης πρωτεϊνών η οποία παρουσιάζεται εδώ, απομονώνει πρωτεΐνες (συμπεριλαμβανομένων των διαλυτών σε οξέα πρωτεϊνών) με κατακρήμνιση, μέσω επεξεργασίας με το απορρυπαντικό DOC σε συνδυασμό με TCA, συνοδευόμενη από εκχύλιση με μίγμα μεθανόλης (εφεξής καλούμενη MeOH) και χλωροφόρμιου (εφεξής καλούμενου CHCI3). Ταυτόχρονα, αφαιρεί από τα πρωτεϊνικά κλάσματα πιθανούς παράγοντες που προκαλούν παρεμβολή στην φθορισμομετρική μέθοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που αποκαλύπτεται στην παρούσα εφεύρεση. The disclosed invention also provides a method for the photometric quantification of protein carbonyl groups in specific subcellular protein fractions, such as the cytoplasmic/aqueous, lipid/membrane, and/or chromosomal protein (histones) fraction. This method overcomes the inherent problems of currently used protein fractionation methodologies that focus on isolating only the cytoplasmic protein fraction with variations of the protein precipitation/washing procedure with trichloroacetic acid (hereafter TCA), which, however, removes the solvent fraction in acid soluble proteins and therefore their carbonyl groups are not taken into account. Furthermore, existing methodologies do not all include standardized protocols for removing nucleic acids that also contain carbonyl groups, nor for neutralizing cysteine sulfenic groups (-SOH), which interfere with analysis. In contrast, the standard protein fractionation method presented here isolates proteins (including acid-soluble proteins) by precipitation, by treatment with the detergent DOC combined with TCA, followed by extraction with a mixture of methanol (hereafter MeOH) and chloroform (hereafter referred to as CHCl3). At the same time, it removes from the protein fractions possible factors that cause interference in the fluorimetric method for the quantitative determination of protein carbonyl groups disclosed in the present invention.
Παρέχονται επίσης κιτ για την εκτέλεση των μεθόδων. Kits for performing the methods are also provided.
Επιπλέον περιγράφονται μέθοδοι για τον προσδιορισμό του επιπέδου κυτταρικής οξείδωσης. Μία μέθοδος περιλαμβάνει: την παροχή ενός δείγματος που περιλαμβάνει ένα κυτταρικό εκχύλισμα, ομογενοποιημένο ιστό ή βιολογικό υγρό, ποσοτικοποίηση της ποσότητας των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων στο δείγμα, όπως περιγράφεται σε οποιαδήποτε σχετική ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, και σύγκριση της ποσότητας των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων στο δείγμα προς την ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που υπάρχουν σε ένα πρότυπο δείγμα. In addition, methods for determining the level of cellular oxidation are described. A method includes: providing a sample comprising a cell extract, tissue homogenate, or biological fluid, quantifying the amount of protein carbonyl groups in the sample, as described in any related embodiment of the present invention, and comparing the amount of protein carbonyl groups in the sample to amount of protein carbonyl groups present in a standard sample.
Επίσης περιγράφονται μέθοδοι για την επιλογή υποψήφιων φαρμάκων που ελαττώνουν το επίπεδο οξείδωσης των κυττάρων. Τέτοιες μέθοδοι είναι χρήσιμες, για παράδειγμα, στην αξιολόγηση της ικανότητας ενός νέου φαρμακευτικού προϊόντος να μειώνει το επίπεδο οξείδωσης σε ένα ή περισσότερα κύτταρα που υφίστανται οξειδωτικό στρες ή στην ταυτοποίηση νέων υποψήφιων φαρμάκων για τη θεραπεία των παθολογικών καταστάσεων που προκαλούνται ή επιδεινώνονται από το οξειδωτικό στρες. Μία τέτοια μέθοδος περιλαμβάνει: την επαφή ενός ή περισσοτέρων κυττάρων που έχουν ένα επίπεδο κυτταρικής οξείδωσης με μία ένωση, ποσοτικοποίηση της παρουσίας καρβονυλομάδων όπως περιγράφεται σε οποιαδήποτε από τις σχετικές ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης, αξιολογώντας έτσι το επίπεδο οξείδωσης των κυττάρων, και σύγκριση του επιπέδου οξείδωσης των κυττάρων που έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση με το επίπεδο οξείδωσης κυττάρων που δεν έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση. Μια ελάττωση στο επίπεδο οξείδωσης στα κύτταρα που έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση, σε σύγκριση με το επίπεδο οξείδωσης κυττάρων που δεν έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση, είναι ενδεικτική της ικανότητας της ένωσης να ελαττώνει το επίπεδο οξείδωσης στα κύτταρα. Ακόμη περαιτέρω οφέλη, πλεονεκτήματα και χρήσεις της εφεύρεσης θα γίνουν προφανή στους έμπειρους στην τεχνική αυτή από την λεπτομερή περιγραφή που ακολουθεί. Also described are methods for selecting drug candidates that reduce the level of cell oxidation. Such methods are useful, for example, in evaluating the ability of a new drug product to reduce the level of oxidation in one or more cells undergoing oxidative stress or in identifying new drug candidates for the treatment of pathological conditions caused or aggravated by oxidative stress. . Such a method includes: contacting one or more cells having a cellular oxidation level with a compound, quantifying the presence of carbonyl groups as described in any of the related embodiments of the present invention, thereby assessing the oxidation level of the cells, and comparing the oxidation level of cells exposed to the compound to the oxidation level of cells not exposed to the compound. A decrease in the level of oxidation in cells contacted with the compound, compared to the level of oxidation in cells not contacted with the compound, is indicative of the ability of the compound to reduce the level of oxidation in the cells. Still further benefits, advantages and uses of the invention will become apparent to those skilled in the art from the detailed description that follows.
ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΣΧΕΔΙΩΝ DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Η παρούσα εφεύρεση θα περιγράφει τώρα με αναφορά στα συνοδευτικά σχέδια στα οποία: The present invention will now be described with reference to the accompanying drawings in which:
Η Εικ. 1 δείχνει την χημική δομή της ένωσης Rhodamine Β hydrazide (RBH). Fig. 1 shows the chemical structure of the compound Rhodamine B hydrazide (RBH).
Η Εικ. 2 απεικονίζει την μοριακή στοιχειομετρία της αντίδρασης των καρβονυλομάδων της τεχνητά οξειδωμένης πρωτεΐνης BSA (εφεξής καλούμενης ox-BSA) με το αντιδραστήριο RBH, και η σχέση της σχηματιζόμενης υδραζόνης με τον μοριακό φθορισμό του ελεύθερου RBH. Οι γραμμές σφάλματος ορίζουν το τυπικό σφάλμα (SD). Fig. 2 illustrates the molecular stoichiometry of the reaction of the carbonyl groups of the artificially oxidized protein BSA (hereafter referred to as ox-BSA) with the reagent RBH, and the relationship of the formed hydrazone to the molecular fluorescence of free RBH. Error bars define the standard error (SD).
ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Συνεπώς, η παρούσα εφεύρεση κατευθύνεται σε μεθόδους και κιτ για την ανίχνευση ή/και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτείνικών καρβονυλομάδων σε ένα ή περισσότερα δείγματα. Οι μέθοδοι και τα κιτ χρησιμοποιούν ένα υδραζίδιο ροδαμίνης που αντιδρά με τις καρβονυλομάδες της πρωτεΐνης στο δείγμα παράγοντας μία σημασμένη υδραζόνη η οποία μπορεί στη συνέχεια να ανιχνευθεί και/ή ποσοτικοποιηθεί όπως περιγράφεται στο παρόν. Accordingly, the present invention is directed to methods and kits for the detection and/or quantification of protein carbonyl groups in one or more samples. The methods and kits use a rhodamine hydrazide that reacts with the carbonyl groups of the protein in the sample to produce a labeled hydrazone which can then be detected and/or quantified as described herein.
Σε μια ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, η υδραζίνη που χρησιμοποιείται για την σήμανση των πρωτεϊνών είναι ένα μη φθορίζον υδραζίδιο ροδαμίνης. Αυτά τα παράγωγα ροδαμίνης είναι μη φθορίζοντα και άχρωμα, ενώ η αλληλεπίδραση της ομάδας υδραζιδίου με τις ομάδες καρβονυλίου της πρωτεΐνης οδηγεί σε σχηματισμό υδραζόνης με ισχυρή εκπομπή φθορισμού. Λόγω αυτών των ιδιοτήτων, τα μη φθορίζοντα υδραζίδια ροδαμίνης εμφανίζουν υψηλή αναλογία σήματος προς υπόβαθρο, καθιστώντας τα ανώτερους ιχνηθέτες. Παραδείγματα μη φθοριζόντων υδραζιδίων ροδαμίνης, ανάμεσα σε άλλα, είναι: η rhodamine Β Hydrazide (εφεξής καλούμενη RBH) και τα παράγωγά της, η rhodamine 6G hydrazide (Zhang Ζ et al., Anal. Methods, 2015, Vol 7, pp. 107-114) και τα παράγωγά της, η rhodamine-B thiohydrazide και τα παράγωγά της. In one embodiment of the present invention, the hydrazine used to label the proteins is a non-fluorescent rhodamine hydrazide. These rhodamine derivatives are non-fluorescent and colorless, while the interaction of the hydrazide group with the carbonyl groups of the protein leads to hydrazone formation with strong fluorescence emission. Because of these properties, non-fluorescent rhodamine hydrazides exhibit a high signal-to-background ratio, making them superior tracers. Examples of non-fluorescent rhodamine hydrazides, among others, are: rhodamine B Hydrazide (hereafter RBH) and its derivatives, rhodamine 6G hydrazide (Zhang Z et al., Anal. Methods, 2015, Vol 7, pp. 107- 114) and its derivatives, rhodamine-B thiohydrazide and its derivatives.
Σε μερικές προτιμώμενες ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης, η υδραζίνη που χρησιμοποιείται ως ιχνηθέτης είναι η RBH, της οποίας η χημική δομή φαίνεται στην Εικ. 1. Κατά την αλληλεπίδραση με τις καρβονυλομάδες της πρωτεΐνης, η διάνοιξη του δακτυλίου της αντίστοιχης σπειρολακτάμης του RBH δημιουργεί το παράγωγο υδραζόνης με ισχυρή εκπομπή φθορισμού. To RBH συντίθεται εύκολα στο εργαστήριο σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο Dujols V et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 119, pp. 7386-7387, ή μπορεί να αγοραστεί από προμηθευτές χημικών αντιδραστηρίων. In some preferred embodiments of the present invention, the hydrazine used as a tracer is RBH, the chemical structure of which is shown in Fig. 1. Upon interaction with the carbonyl groups of the protein, ring opening of the corresponding spirolactam of RBH generates the derivative of hydrazone with strong fluorescence emission. RBH is readily synthesized in the laboratory according to the procedure described in Dujols V et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 119, pp. 7386-7387, or may be purchased from chemical reagent suppliers.
Σε μερικές ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης, μετά την αντίδραση του υδραζιδίου ροδαμίνης με τις καρβονυλομάδες της πρωτεΐνης στο δείγμα, το μη αντιδράσαν υδραζίδιο απομακρύνεται με πλύση του δείγματος πριν την μετάβαση στο βήμα ανίχνευσης και/ή ποσοτικοποίησης. Αυτό το στάδιο πλύσης ελαχιστοποιεί το φθορισμό υποβάθρου, αυξάνοντας έτσι την ευαισθησία της δοκιμασίας. Αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο σε εφαρμογές όπου μικρές ποσότητες πρωτεΐνης είναι διαθέσιμες και/ή σε περιπτώσεις όπου είναι σημαντική η ακριβής ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων στο δείγμα. In some embodiments of the present invention, after the reaction of rhodamine hydrazide with the carbonyl groups of the protein in the sample, the unreacted hydrazide is removed by washing the sample before proceeding to the detection and/or quantification step. This washing step minimizes background fluorescence, thereby increasing the sensitivity of the assay. This is particularly useful in applications where small amounts of protein are available and/or in cases where accurate quantification of protein carbonyl groups in the sample is important.
Σε μία ενσωμάτωση, το υδραζίδιο που δεν αντέδρασε απομακρύνεται με κατακρήμνιση της πρωτεΐνης που υπάρχει στο δείγμα (τόσο αυτή που αντέδρασε όσο και αυτή που δεν αντέδρασε) με την προσθήκη δεοξυχολικού (DΟC) και τριχλωροξικού οξέος (TCA). Η προσθήκη του DOC και του TCA ιδανικά εκτελείται διαδοχικά, δηλαδή το DOC προστίθεται πρώτο, ακολουθεί μια σύντομη επώαση, προστίθεται το TCA και ακολουθεί μια δεύτερη σύντομη επώαση. Στη συνέχεια, το δείγμα φυγοκεντρείται και η πρωτεΐνη ανακτάται ως ίζημα. In one embodiment, the unreacted hydrazide is removed by precipitating the protein present in the sample (both reacted and unreacted) by the addition of deoxycholate (DOC) and trichloroacetic acid (TCA). The addition of DOC and TCA is ideally performed sequentially, i.e. DOC is added first, followed by a short incubation, TCA is added, followed by a second short incubation. The sample is then centrifuged and the protein is recovered as a precipitate.
Σε μία άλλη ενσωμάτωση, το υδραζίδιο που δεν αντέδρασε απομακρύνεται με πέρασμα του αντιδράσαντος δείγματος μέσω μιας συσκευής φιλτραρίσματος με ικανότητα κατακράτησης της πρωτεΐνης στο δείγμα, ενώ επιτρέπει το μη αντιδράσαν υδραζίδιο ροδαμίνης να περάσει μέσα από τη συσκευή φιλτραρίσματος. Κατάλληλες συσκευές φιλτραρίσματος για την εφαρμογή αυτή είναι φίλτρα από μεμβράνη κυτταρίνης (cellulose membrane filters) και τα νάιλον φίλτρα μεμβράνης. Ως παράδειγμα, κατάλληλα φίλτρα από μεμβράνη κυτταρίνης είναι τα Amicon Ultra 10k 0,5 ml και Centricon Ultracel YM-10, και τα δύο από την Merck Millipore (Darmstadt, Γερμανία), ή άλλα παρόμοια. Το φίλτρο μπορεί στη συνέχεια να ξεπλένεται με περίσσεια ρυθμιστικού διαλύματος, για παράδειγμα με ρυθμιστικό διάλυμα Tris με υδροχλωρική γουανιδίνη, ώστε να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα του υδραζίδιου ροδαμίνης, ενώ η ανακτώμενη πρωτεΐνη παραμένει δεσμευμένη στο φίλτρο. In another embodiment, the unreacted hydrazide is removed by passing the reacted sample through a filter device capable of retaining the protein in the sample while allowing the unreacted rhodamine hydrazide to pass through the filter device. Suitable filtering devices for this application are cellulose membrane filters and nylon membrane filters. As an example, suitable cellulose membrane filters are Amicon Ultra 10k 0.5 ml and Centricon Ultracel YM-10, both from Merck Millipore (Darmstadt, Germany), or the like. The filter can then be washed with excess buffer, for example Tris buffer with guanidine hydrochloride, to remove any residual rhodamine hydrazide while the recovered protein remains bound to the filter.
Δύο διαφορετικά είδη πρωτεΐνης μπορεί να υπάρχουν στο δείγμα: η σημασμένη με υδραζόνη και η μη σημασμένη, μη αντιδρώσα πρωτεΐνη. Η μη αντιδρώσα πρωτεΐνη δεν παρεμβάλλεται στην δοκιμασία. Η ποσότητα της συνολικής πρωτεΐνης μπορεί να μετρηθεί όπως περιγράφεται στην παρούσα και η μέτρηση αυτή χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό του ποσοστού της σημασμένης πρωτεΐνης στο δείγμα. Two different kinds of protein can be present in the sample: the hydrazone-labeled and the unlabeled, unreacted protein. Non-reactive protein does not interfere with the assay. The amount of total protein can be measured as described herein and this measurement used to calculate the percentage of labeled protein in the sample.
Σε προτιμώμενες ενσωματώσεις, η πρωτεΐνη που κατακρατείται στην συσκευή φιλτραρίσματος ή που ανακτάται μετά από επώαση με DOC και TCA και φυγοκέντρηση, και πριν από το βήμα ανίχνευσης και/ή ποσοτικοποίησης της παραγόμενης υδραζόνης, επαναδιαλυτοποιείται σε ένα διάλυμα ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων που περιλαμβάνει ένα άλας γουανιδινίου και έναν ή περισσότερους ρυθμιστικούς παράγοντες. Κατάλληλα άλατα γουανιδινίου είναι, ανάμεσα σε άλλα, η θειοκυανική γουανιδίνη και η υδροχλωρική γουανιδίνη. Σε μερικές προτιμώμενες ενσωματώσεις, το διάλυμα περιλαμβάνει υδροχλωρική γουανιδίνη σε συγκέντρωση που κυμαίνεται από 7 Μ έως συγκέντρωσης κορεσμού. Σε ορισμένες προτιμώμενες ενσωματώσεις, η συγκέντρωση της υδροχλωρικής γουανιδίνης είναι 8 Μ. Σε άλλες προτιμώμενες ενσωματώσεις, το διάλυμα ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων είναι κορεσμένο σε υδροχλωρική γουανιδίνη. Οι ένας ή περισσότεροι ρυθμιστικοί παράγοντες απαιτούνται για την επίτευξη του μέγιστου σήματος φθορισμού και μέγιστης σταθερότητας της υδραζόνης που παράγεται, ενώ την ίδια στιγμή τα τυχόν νουκλεϊκά οξέα που μπορεί να υπάρχουν στο δείγμα δεν διαλύονται σε αυτό το pH. In preferred embodiments, the protein retained on the filtration device or recovered after incubation with DOC and TCA and centrifugation, and prior to the step of detecting and/or quantifying the hydrazone produced, is redissolved in a carbonyl group quantification solution comprising a guanidinium salt and one or more regulatory factors. Suitable guanidinium salts are, among others, guanidine thiocyanate and guanidine hydrochloride. In some preferred embodiments, the solution comprises guanidine hydrochloride at a concentration ranging from 7 M to saturating concentration. In some preferred embodiments, the concentration of guanidine hydrochloride is 8 M. In other preferred embodiments, the carbonyl group quantification solution is saturated in guanidine hydrochloride. The one or more buffering agents are required to achieve maximum fluorescence signal and maximum stability of the hydrazone produced, while at the same time any nucleic acids that may be present in the sample are not dissolved at this pH.
Σε μία περισσότερο προτιμώμενη ενσωμάτωση, ο ένας ή περισσότεροι ρυθμιστικοί παράγοντες του διαλύματος ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων διατηρούν το pH του δείγματος εντός του εύρους από 4,5 έως 6,5. Στους κατάλληλους ρυθμιστικούς παράγοντες περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, το όξινο φωσφορικό νάτριο, κιτρικό νάτριο ή ένα μίγμα αυτών. Στα κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, 50 mΜ κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5 και κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, κατά προτίμηση 50 mΜ κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5. In a more preferred embodiment, the one or more buffering agents of the carbonyl group quantification solution maintain the pH of the sample within the range of 4.5 to 6.5. Suitable buffering agents include, but are not limited to, sodium hydrogen phosphate, sodium citrate, or a mixture thereof. Suitable buffers include, but are not limited to, 50 mM citrate-phosphate buffer pH 5 and citrate buffer, preferably 50 mM citrate-phosphate buffer pH 5.
Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, στο στάδιο που η πρωτεΐνη του δείγματος έρχεται σε επαφή με το υδραζίδιο, το δείγμα περιλαμβάνει ένα άλας γουανιδινίου και έναν ή περισσότερους ρυθμιστικούς παράγοντες. Κατάλληλα άλατα γουανιδινίου είναι, ανάμεσα σε άλλα, η θειοκυανική γουανιδίνη και η υδροχλωρική γουανιδίνη, κατά προτίμηση η υδροχλωρική γουανιδίνη. Το άλας γουανιδινίου είναι παρόν σε ποσότητες επαρκείς για τη μερική αποδιάταξη της πρωτεΐνης που υπάρχει στο δείγμα. In a preferred embodiment of the present invention, in the step where the sample protein is contacted with the hydrazide, the sample comprises a guanidinium salt and one or more buffering agents. Suitable guanidinium salts are, among others, guanidine thiocyanate and guanidine hydrochloride, preferably guanidine hydrochloride. The guanidinium salt is present in amounts sufficient to partially denature the protein present in the sample.
Αυτή η επίδραση του άλατος γουανιδινίου επιτυγχάνεται καλύτερα στο εύρος συγκέντρωσης από 0.05 Μ έως 0.15 Μ, κατά προτίμηση 0.1 Μ. This effect of the guanidinium salt is best achieved in the concentration range of 0.05 M to 0.15 M, preferably 0.1 M.
Σε μία πλέον προτιμώμενη ενσωμάτωση, στο στάδιο που η πρωτεΐνη του δείγματος έρχεται σε επαφή με το υδραζίδιο, το δείγμα ρυθμίζεται σε ένα pH μέσα στο εύρος από 2,5 έως 3,5, κατά προτίμηση pH 3. Στους κατάλληλους ρυθμιστικούς παράγοντες περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα σε ένα τελικό pH 3 και ρυθμιστικό διάλυμα γλυκίνης/HCI, κατά προτίμηση κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα σε ένα τελικό pH 3. Η προτιμώμενη αναλογία μεταξύ κιτρικού νατρίου και φωσφορικού νατρίου στο κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 3 είναι δύο γραμμομοριακά μέρη κιτρικό νάτριο και ένα γραμμομοριακό μέρος φωσφορικό νάτριο. In a more preferred embodiment, in the step where the sample protein is contacted with the hydrazide, the sample is adjusted to a pH within the range of 2.5 to 3.5, preferably pH 3. Suitable buffering agents include, without limitation, citrate-phosphate buffer at a final pH 3 and glycine/HCI buffer, preferably citrate-phosphate buffer at a final pH 3. The preferred ratio between sodium citrate and sodium phosphate in the citrate-phosphate buffer pH 3 is two mole parts sodium citrate and one mole part sodium phosphate.
Σε μια ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, το δείγμα που περιέχει πρωτεΐνη περιλαμβάνει έναν παράγοντα οξειδοαναγωγής (redox) για την εξουδετέρωση των σουλφενικών ομάδων, όταν αυτές είναι παρούσες. Στους κατάλληλοι παράγοντες οξειδοαναγωγής περιλαμβάνονται, χωρίς να περιορίζονται σε αυτούς, η διθειοθρεϊτόλη (εφεξής καλούμενη DTT), β-μερκαπτοαιθανόλη, ασκορβικό οξύ και την ανηγμένη γλουταθειόνη, και κατά προτίμηση DTT ή β-μερκαπτοαιθανόλη. Ο παράγοντας οξειδοαναγωγής βρίσκεται στο διάλυμα σε ποσότητα επαρκή για την εξουδετέρωση των σουλφενικών ομάδων. Στις περιπτώσεις όπου το επιλεγμένο μέσο οξειδοαναγωγής είναι το DTT, η αποτελεσματική συγκέντρωση DTT κυμαίνεται μεταξύ 15 και 50 mΜ, κατά προτίμηση 25 mΜ. In one embodiment of the present invention, the protein-containing sample includes a redox agent to neutralize sulfenic groups, when present. Suitable redox agents include, but are not limited to, dithiothreitol (hereinafter referred to as DTT), β-mercaptoethanol, ascorbic acid and reduced glutathione, and preferably DTT or β-mercaptoethanol. The redox agent is present in the solution in an amount sufficient to neutralize the sulfenic groups. In cases where the redox agent of choice is DTT, the effective concentration of DTT is between 15 and 50 mM, preferably 25 mM.
Σύμφωνα με μία ενσωμάτωση, η σημασμένη υδραζόνη που παράγεται κατά την αντίδραση ανιχνεύεται φθορισμομετρικά. Στην ενσωμάτωση όπου το υδραζίδιο ροδαμίνης είναι το RBH, η φθορισμομετρική ανίχνευση και /ή ποσοτικοποίηση της παραγόμενης υδραζόνης μπορεί να μετράται σε ένα μήκος κύματος που κυμαίνεται από 540 nm έως περίπου 580 nm, κατά προτίμηση 560 nm. Το μήκος κύματος εκπομπής μπορεί να είναι στο εύρος από περίπου 570 nm έως περίπου 610 nm, κατά προτίμηση 590 nm. According to one embodiment, the labeled hydrazone produced during the reaction is detected fluorometrically. In the embodiment where the rhodamine hydrazide is RBH, the fluorometric detection and/or quantification of the hydrazone produced can be measured at a wavelength ranging from 540 nm to about 580 nm, preferably 560 nm. The emission wavelength may be in the range of about 570 nm to about 610 nm, preferably 590 nm.
Στις ενσωματώσεις όπου η ανίχνευση και /ή ποσοτικοποίηση της σημασμένης υδραζόνης εκτελείται φθορισμομετρικά, το περιεχόμενο των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων μπορεί να προσδιοριστεί με τη χρήση μιας καμπύλης βαθμονόμησης που δείχνει τη σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης του υδραζίδιου ροδαμίνης και του φθορισμού προτύπων διαλυμάτων που περιέχουν γνωστές συγκεντρώσεις του υδραζίδιου ροδαμίνης. In embodiments where the detection and/or quantification of the labeled hydrazone is performed fluorimetrically, the content of protein carbonyl groups can be determined using a calibration curve showing the relationship between the concentration of rhodamine hydrazide and the fluorescence of standard solutions containing known concentrations of the hydrazide. rhodamine.
Οι μέθοδοι της παρούσας εφεύρεσης μπορούν να προσαρμοστούν σε μια μορφή στερεού υποστρώματος. Στα κατάλληλα στερεά υποστρώματα περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, τα σφαιρίδια, μαγνητικά σφαιρίδια, λεπτά υμένια (thin films), νανοσωλήνες άνθρακα, μικροσωλήνες, φίλτρα, πήγματα (gel), πλάκες (plates), μικροπλάκες (microplates) και οι ηλεκτρονικοί αισθητήρες (sensor chips). The methods of the present invention can be adapted to a solid substrate form. Suitable solid substrates include, without limitation, beads, magnetic beads, thin films, carbon nanotubes, microtubes, filters, gels, plates, microplates, and sensor chips. ).
Σε μία ενσωμάτωση, η ανίχνευση και/ή ποσοτικοποίηση της σημασμένης υδραζόνης που παράγεται κατά την αντίδραση πραγματοποιείται φθορισμομετρικώς με την χρήση ενός κοινού φθορισμόμετρου. Σε μία άλλη ενσωμάτωση, χρησιμοποιείται ένα φθορισμόμετρο μικροπλακών για την ταυτόχρονη μέτρηση πολλαπλών δειγμάτων. In one embodiment, detection and/or quantification of the labeled hydrazone produced during the reaction is performed fluorometrically using a common fluorometer. In another embodiment, a microplate fluorometer is used to measure multiple samples simultaneously.
Σε μία ακόμη ενσωμάτωση της παρούσας εφεύρεσης, η μέθοδος για την ανίχνευση ή/ και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε δείγματα πρωτεΐνης που αποκαλύπτεται δια του παρόντος, περιλαμβάνει ένα στάδιο ηλεκτροφορητικού διαχωρισμού των πρωτεϊνών που υπάρχουν στο εν λόγω δείγμα σε ένα πήκτωμα. Σε αυτή την ενσωμάτωση, οι σημασμένες πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε ζώνες ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Δείκτες του μοριακού βάρους πρωτεϊνών ηλεκτροφορούνται παράλληλα με τα δείγματα πρωτεϊνών, βοηθώντας έτσι να γίνει μια εκτίμηση του μοριακού βάρους των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών του δείγματος. Εναλλακτικά, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ηλεκτροφόρηση πηκτώματος δύο διαστάσεων (two-dimensional gel electrophoresis), που επιπλέον χωρίζει τις πρωτεΐνες και σύμφωνα με το ισοηλεκτρικό σημείο τους. Σε αυτές τις ενσωματώσεις, η σημασμένη υδραζόνη ανιχνεύεται in situ, κατά προτίμηση με τη χρήση φθορισμομετρίας. In yet another embodiment of the present invention, the method for detecting and/or quantifying protein carbonyl groups in protein samples disclosed herein comprises a step of electrophoretically separating the proteins present in said sample on a gel. In this embodiment, the labeled proteins are separated into bands according to their molecular weight. Protein molecular weight markers are electrophoresed alongside the protein samples, thereby helping to make an estimate of the molecular weight of the sample's carbonylated proteins. Alternatively, two-dimensional gel electrophoresis can also be used, which additionally separates proteins according to their isoelectric point. In these embodiments, the labeled hydrazone is detected in situ, preferably using fluorimetry.
Στα κατάλληλα δείγματα που περιέχουν πρωτεΐνη για την παρούσα εφεύρεση περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, δείγμα καθαρής (απομονωμένης) πρωτεΐνης, ακατέργαστο κυτταρικό εκχύλισμα, δείγμα ομογενοποιημένου ιστού, βιολογικό υγρό ή υποκυτταρικό κλάσμα πρωτεΐνης. Το εν λόγω βιολογικό δείγμα μπορεί να επιλέγεται από την ομάδα που περιλαμβάνει, χωρίς να περιορίζεται σε, σάλιο, πλήρες αίμα, πλάσμα, ορό, υγρό δακρύων, υδατοειδές υγρό, υαλοειδές υγρό του οφθαλμού, λεμφικό υγρό, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, αρθρικό υγρό, ούρα, πτύελα, σπέρμα, βλέννη, κολπικό έκπλυμα, αμνιακό υγρό, αδενικό υγρό, ιδρώτα και μυελός των οστών. Το υποκυτταρικό κλάσμα μπορεί να περιλαμβάνει το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών, το κυτταροπλασματικό πρωτεϊνικό κλάσμα, το μεμβρανικό κλάσμα, ή έναν συνδυασμό αυτών. Το αντιοξειδωτικό λιπίδιο butylhydroxyanisol (εφεξής καλούμενο ΒΗΑ) μπορεί να προστεθεί στο δείγμα πριν από την επεξεργασία για την αποφευχθεί η τεχνητή οξείδωση της απομονωμένης πρωτεΐνης. Suitable protein-containing samples for the present invention include, without limitation, a pure (isolated) protein sample, crude cell extract, tissue homogenate sample, biological fluid, or subcellular protein fraction. Said biological sample may be selected from the group including, but not limited to, saliva, whole blood, plasma, serum, tear fluid, aqueous humor, vitreous fluid of the eye, lymphatic fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, urine, sputum, semen, mucus, vaginal lavage, amniotic fluid, glandular fluid, sweat and bone marrow. The subcellular fraction may include the acid-soluble fraction of histones, the cytoplasmic protein fraction, the membrane fraction, or a combination thereof. The antioxidant lipid butylhydroxyanisol (hereafter referred to as BHA) can be added to the sample before processing to avoid artificial oxidation of the isolated protein.
Το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών μπορεί να απομονωθεί από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού με οποιοδήποτε κατάλληλη τεχνική, συμπεριλαμβανομένης οποιοσδήποτε τεχνικής η οποία είναι ή μπορεί να γίνει γνωστή στο μέλλον σε ένα άτομο έμπειρο στην τέχνη. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών απομονώνεται από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού με την τεχνική της κατακρήμνισης με θειική στρεπτομυκίνη. Σε αυτή την ενσωμάτωση, η προσθήκη θειικής στρεπτομυκίνης στο δείγμα πρωτεΐνης έχει ως αποτέλεσμα την κατακρήμνιση του διαλυτού σε οξύ κλάσματος των ιστονών και οποιωνδήποτε νουκλεϊκών οξέων που υπάρχουν στα κύτταρα. Μετά τη φυγοκέντρηση, το προκύπτον ίζημα επαναδιαλύεται σε ένα αλκαλικό ρυθμιστικό διάλυμα, προκειμένου να επωαστεί με 25 mM DTT για να εξουδετερωθούν τυχόν παρεμβάλλουσες σουλφενικές ομάδες. Όπως χρησιμοποιείται σε αυτή την εφεύρεση, ο όρος "αλκαλικό ρυθμιστικό διάλυμα" αναφέρεται σε ένα διάλυμα που κατασκευάζεται από μία ασθενή βάση και από ένα από τα άλατά της, και το οποίο διάλυμα έχει μία τιμή pH που κυμαίνεται μεταξύ 8 και 10. Στα κατάλληλα αλκαλικά ρυθμιστικά διαλύματα περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, το ρυθμιστικό διάλυμα βορικού νατρίου, ρυθμιστικό διάλυμα υδροξειδίου του αμμωνίουχλωριούχου αμμωνίου, ρυθμιστικό διάλυμα γλυκίνης/υδροξείδιου του νατρίου (εφεξής καλούμενο NaOH), ρυθμιστικό διάλυμα διαιθυλαμίνης/HCI, κατά προτίμηση το ρυθμιστικό διάλυμα βορικού νατρίου. Στη συνέχεια γίνεται επεξεργασία του διαλυτοποιήματος με ένα ισχυρό οξύ σε μία αποτελεσματική συγκέντρωση που κατακρημνίζει τα νουκλεϊκά οξέα. Στα κατάλληλα ισχυρά οξέα περιλαμβάνονται ανάμεσα σε άλλα το υδροχλωρικό οξύ (HCI), υδροϊωδικό οξύ (HI), υδροβρωμικό οξύ (ΗΒr), υπερχλωρικό οξύ (HCIO4), χλωρικό οξύ (HCIO3), νιτρικό οξύ (ΗΝO3) και θειικό οξύ (H2SO4), κατά προτίμηση το H2SO4. Τα νουκλεϊκά οξέα μπορούν στη συνέχεια να απομακρυνθούν ως ίζημα μετά από φυγοκέντρηση. Το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών (που υπάρχει στο απαλλαγμένο από νουκλεϊκά οξέα υπερκείμενο) ανακτάται στη συνέχεια μετά από επώαση με DOC και TCA. Άλλα μικρά μόρια μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθούν αντί του DOC. Άλλα κατάλληλα μόρια περιλαμβάνουν μικρά ανιονικά ή κατιονικά μόρια, όπως τα ανιονικά χολικά άλατα. Η προσθήκη του DOC και του TCA ιδανικά εκτελείται διαδοχικά, δηλαδή, πρώτα προστίθεται το DOC, ακολουθούμενο από μια σύντομη επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, μετά προστίθεται το TCA και ακολουθεί μια σύντομη επώαση σε ένα λουτρό πάγου-νερού. Στη συνέχεια, το δείγμα φυγοκεντρείται και η πρωτεΐνη ανακτάται ως ίζημα. Η προσθήκη του DOC είναι απαραίτητη όταν είναι επιθυμητή η ποσοτική κατακρήμνιση πρωτεϊνών από δείγματα με χαμηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη ή από δείγματα με άγνωστη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη. Για δείγματα με υψηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης (δηλαδή 500 μg ανά ml), το στάδιο της προσθήκης DOC μπορεί να παραληφθεί και το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών ανακτάται ως ίζημα μετά από μια σύντομη επώαση σε ένα λουτρό πάγου-ύδατος με TCA μόνο και φυγοκέντρηση. The acid-soluble fraction of histones can be isolated from a total cell extract or homogenized tissue sample by any suitable technique, including any technique that is or may become known in the future to a person skilled in the art. In a preferred embodiment, the acid-soluble fraction of histones is isolated from a total cell extract or homogenized tissue sample by the streptomycin sulfate precipitation technique. In this embodiment, the addition of streptomycin sulfate to the protein sample results in the precipitation of the acid-soluble fraction of the histones and any nucleic acids present in the cells. After centrifugation, the resulting pellet is redissolved in an alkaline buffer to be incubated with 25 mM DTT to neutralize any interfering sulfenic groups. As used in this invention, the term "alkaline buffer" refers to a solution made of a weak base and one of its salts, and which solution has a pH value ranging between 8 and 10. In suitable alkaline buffers include, but are not limited to, sodium borate buffer, ammonium hydroxide buffer, ammonium chloride buffer, glycine/sodium hydroxide buffer (hereinafter referred to as NaOH), diethylamine/HCl buffer, preferably sodium borate buffer. The solution is then treated with a strong acid to an effective concentration that precipitates the nucleic acids. Suitable strong acids include but are not limited to hydrochloric acid (HCI), hydroiodic acid (HI), hydrobromic acid (HBr), perchloric acid (HCIO4), chloric acid (HCIO3), nitric acid (HNO3) and sulfuric acid (H2SO4). , preferably H2SO4. The nucleic acids can then be removed as a pellet after centrifugation. The acid-soluble fraction of histones (present in the nucleic acid-free supernatant) is then recovered after incubation with DOC and TCA. Other small molecules may also be used instead of DOC. Other suitable molecules include small anionic or cationic molecules, such as anionic bile salts. The addition of DOC and TCA is ideally performed sequentially, i.e., DOC is added first, followed by a short incubation at room temperature, then TCA is added, followed by a short incubation in an ice-water bath. The sample is then centrifuged and the protein is recovered as a precipitate. The addition of DOC is necessary when quantitative protein precipitation is desired from samples with low protein content or from samples with unknown protein content. For samples with a high protein concentration (ie, 500 µg per ml), the DOC addition step can be omitted and the acid-soluble fraction of histones recovered as a pellet after a brief incubation in an ice-water bath with TCA alone and centrifugation.
Το κυτταροπλασματικό πρωτεϊνικό κλάσμα μπορεί να απομονωθεί από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού με οποιοδήποτε κατάλληλη τεχνική, συμπεριλαμβανομένης οποιοσδήποτε τεχνικής η οποία είναι ή μπορεί να γίνει γνωστή στο μέλλον σε ένα άτομο έμπειρο στην τέχνη. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση το κυτταροπλασματικό πρωτεϊνικό κλάσμα απομονώνεται από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού διά της κατακρήμνισης με DOC και TCA, μετά την απομάκρυνση του διαλυτού σε οξύ κλάσματος των ιστονών και οποιωνδήποτε νουκλεϊκών οξέων που υπάρχουν στο δείγμα (όπου η εν λόγω απομάκρυνση επιτυγχάνεται με θειική στρεπτομυκίνη όπως περιγράφεται εδώ ή με οποιαδήποτε άλλη κατάλληλη μέθοδο). Άλλα μικρά μόρια μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθούν αντί του DOC. Άλλα κατάλληλα μόρια περιλαμβάνουν μικρά ανιονικά ή κατιονικά μόρια, όπως τα ανιονικά χολικά άλατα. Η προσθήκη του DOC και TCA ιδανικά εκτελείται διαδοχικά, δηλαδή, πρώτα προστίθεται το DOC, ακολουθούμενο από μια σύντομο επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, μετά προστίθεται το TCA και ακολουθεί μια σύντομη επώαση σε ένα λουτρό πάγου-νερού. Στη συνέχεια, το δείγμα φυγοκεντρείται και η πρωτεΐνη ανακτάται ως ίζημα. Η προσθήκη του DOC είναι απαραίτητη όταν είναι επιθυμητή η ποσοτική κατακρήμνιση πρωτεϊνών από δείγματα με χαμηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη ή από δείγματα με άγνωστη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη. Γ ια δείγματα με υψηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης (δηλαδή 500 μg ανά ml), το στάδιο της προσθήκης DOC μπορεί να παραληφθεί και το διαλυτό σε οξύ κλάσμα των ιστονών ανακτάται ως ίζημα μετά από μια σύντομη επώαση σε ένα λουτρό πάγου-ύδατος με TCA μόνο και φυγοκέντρηση. The cytoplasmic protein fraction can be isolated from a total cell extract or homogenized tissue sample by any suitable technique, including any technique which is or may become known in the future to a person skilled in the art. In a preferred embodiment the cytoplasmic protein fraction is isolated from a total cell extract or tissue homogenate sample by DOC and TCA precipitation, after removal of the acid-soluble fraction of histones and any nucleic acids present in the sample (where said removal is achieved with streptomycin sulfate as described herein or by any other suitable method). Other small molecules may also be used instead of DOC. Other suitable molecules include small anionic or cationic molecules, such as anionic bile salts. The addition of DOC and TCA is ideally performed sequentially, i.e., DOC is added first, followed by a short incubation at room temperature, then TCA is added, followed by a short incubation in an ice-water bath. The sample is then centrifuged and the protein is recovered as a precipitate. The addition of DOC is necessary when quantitative protein precipitation is desired from samples with low protein content or from samples with unknown protein content. For samples with a high protein concentration (ie 500 µg per ml), the DOC addition step can be omitted and the acid-soluble fraction of histones recovered as a pellet after a brief incubation in an ice-water bath with TCA alone and centrifugation .
Το μεμβρανικό πρωτεϊνικό κλάσμα μπορεί να απομονωθεί από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού με οποιοδήποτε κατάλληλη τεχνική, συμπεριλαμβανομένης οποιοσδήποτε τεχνικής η οποία είναι ή μπορεί να γίνει γνωστή στο μέλλον σε ένα άτομο έμπειρο στην τέχνη. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση το μεμβρανικό πρωτεϊνικό κλάσμα απομονώνεται από ολικό κυτταρικό εκχύλισμα ή δείγμα ομογενοποιημένου ιστού μετά την απομάκρυνση του διαλυτού σε οξύ κλάσματος των ιστονών και των οποιωνδήποτε νουκλεϊκών οξέων που υπάρχουν στο δείγμα (όπου η εν λόγω απομάκρυνση επιτυγχάνεται με θειική στρεπτομυκίνη όπως περιγράφεται εδώ ή με οποιαδήποτε άλλη κατάλληλη μέθοδο) και την απομάκρυνση του κυτταροπλασματικού πρωτεϊνικού κλάσματος (όπως περιγράφεται εδώ ή με οποιαδήποτε άλλη κατάλληλη μέθοδο), μέσω εκχύλισης με μεθανόλη και χλωροφόρμιο. Το κυτταροπλασματικό πρωτεϊνικό κλάσμα σχηματίζει ένα ίζημα στη μεσαία ζώνη μεταξύ της άνω υδατικής φάσης και της κατώτερης οργανικής φάσης, και μπορεί να απομονωθεί και να καθαριστεί περαιτέρω όπως περιγράφεται εδώ ή χρησιμοποιώντας οποιαδήποτε κατάλληλη τεχνική που είναι γνωστή στην τέχνη. The membrane protein fraction can be isolated from a total cell extract or homogenized tissue sample by any suitable technique, including any technique which is or may become known in the future to a person skilled in the art. In a preferred embodiment the membrane protein fraction is isolated from a total cell extract or tissue homogenate sample after removal of the acid-soluble fraction of histones and any nucleic acids present in the sample (where said removal is accomplished with streptomycin sulfate as described herein or by any other suitable method) and removing the cytoplasmic protein fraction (as described herein or by any other suitable method), by extraction with methanol and chloroform. The cytoplasmic protein fraction forms a precipitate in the middle zone between the upper aqueous phase and the lower organic phase, and can be isolated and further purified as described herein or using any suitable technique known in the art.
Οι μέθοδοι που περιγράφονται στην παρούσα εφεύρεση έχουν πολλές εφαρμογές στον βιοϊατρικό και κτηνιατρικό τομέα, καθώς και στη βιομηχανία τροφίμων και γεωργίας. The methods described in the present invention have many applications in the biomedical and veterinary fields, as well as in the food and agricultural industries.
Σε μία ενσωμάτωση, παρέχεται μία μέθοδος για τον προσδιορισμό του επιπέδου οξείδωσης ενός κυττάρου, ιστού ή βιολογικού υγρού, προκειμένου να εκτιμηθεί εάν το κύτταρο, ο ιστός ή το βιολογικό υγρό υφίσταται οξειδωτικό στρες. Η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει το βήμα της ανίχνευσης ή/και του ποσοτικού προσδιορισμού των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων όπως περιγράφεται στην παρούσα εφεύρεση, όπου το δείγμα που περιέχει πρωτεΐνη περιλαμβάνει ένα κυτταρικό εκχύλισμα, ένα υποκυτταρικό κλάσμα πρωτεΐνης ή ένα δείγμα ομογενοποιημένου ιστού. Η ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων στο εν λόγω δείγμα μπορεί στη συνέχεια να συγκριθεί με την ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που υπάρχουν σε ένα πρότυπο δείγμα. Ένα κατάλληλο πρότυπο δείγμα μπορεί να είναι, χωρίς δεν περιορίζεται σε, ένα κυτταρικό εκχύλισμα ή ένα δείγμα ομογενοποιημένου ιστού που δεν έχει εκτεθεί σε οξειδωτικό στρες. Μία ποσότητα πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων μεγαλύτερη από εκείνη που υπάρχει στο πρότυπο δείγμα είναι ενδεικτική της παρουσίας οξειδωτικού στρες στο κύτταρο ή τον ιστό. Η ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων στο εξεταζόμενο δείγμα μπορεί επίσης να συγκριθεί με την ποσότητα των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων που υπάρχουν σε ένα θετικό δείγμα ελέγχου. Στα κατάλληλα θετικά δείγματα ελέγχου περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, ένα κυτταρικό εκχύλισμα, ένα δείγμα ομογενοποιημένου ιστού ή ένα βιολογικό υγρό που έχει εκτεθεί σε έναν ισχυρό οξειδωτικό παράγοντα, όπως, για παράδειγμα, το υπεροξείδιο του υδρογόνου. In one embodiment, a method is provided for determining the oxidation level of a cell, tissue or biological fluid in order to assess whether the cell, tissue or biological fluid is undergoing oxidative stress. Said method includes the step of detecting and/or quantifying protein carbonyl groups as described in the present invention, wherein the protein-containing sample comprises a cell extract, a subcellular protein fraction, or a tissue homogenate sample. The amount of protein carbonyl groups in said sample can then be compared to the amount of protein carbonyl groups present in a standard sample. A suitable reference sample may be, but is not limited to, a cell extract or homogenized tissue sample that has not been exposed to oxidative stress. An amount of protein carbonyl groups greater than that present in the standard sample is indicative of the presence of oxidative stress in the cell or tissue. The amount of protein carbonyl groups in the test sample can also be compared to the amount of protein carbonyl groups present in a positive control sample. Suitable positive control samples include, without limitation, a cell extract, a tissue homogenate sample, or a biological fluid that has been exposed to a strong oxidizing agent, such as, for example, hydrogen peroxide.
Επίσης παρέχεται μία μέθοδος για την επιλογή ενώσεων που ελαττώνουν το επίπεδο οξείδωσης ενός κυττάρου, όπου η εν λόγω μέθοδος περιλαμβάνει την επαφή ενός ή περισσοτέρων κυττάρων τα οποία έχουν ένα επίπεδο κυτταρικής οξείδωσης με μία ένωση, ποσοτικοποίηση της παρουσίας πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων όπως περιγράφεται σε οποιαδήποτε από τις σχετικές ενσωματώσεις της παρούσας εφεύρεσης, αξιολογώντας έτσι το επίπεδο οξείδωσης των κυττάρων, και σύγκριση του επιπέδου οξείδωσης των κυττάρων που έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση με το επίπεδο οξείδωσης κυττάρων που δεν έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση. Μια ελάττωση στο επίπεδο οξείδωσης στα κύτταρα που έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση, σε σύγκριση με το επίπεδο οξείδωσης κυττάρων που δεν έχουν έρθει σε επαφή με την ένωση, είναι ενδεικτική της ικανότητας της ένωσης να ελαττώνει το επίπεδο οξείδωσης στα κύτταρα. Η εν λόγω ένωση μπορεί να περιλαμβάνει μία μεμονωμένη ένωση, ένα μίγμα ενώσεων, ή μια βιβλιοθήκη ενώσεων. Μία βιβλιοθήκη ενώσεων μπορεί να περιλαμβάνει υδατάνθρακες, μονοσακχαρίτες, ολιγοσακχαρίτες, πολυσακχαρίτες, αμινοξέα, πεπτίδια, ολιγοπεπτίδια, πολυπεπτίδια, πρωτεΐνες, νουκλεοζίτες, νουκλεοτίδια, ολιγονουκλεοτίδια, πολυνουκλεοτίδια, λιπίδια, γλυκοπεπτίδια, γλυκοπρωτεΐνες, πρωτεογλυκάνες, φυσικές ενώσεις, συνθετικά ανάλογα ή παράγωγα αυτών, και τα παρόμοια. Also provided is a method for selecting compounds that reduce the oxidation level of a cell, said method comprising contacting one or more cells having a cellular oxidation level with a compound, quantifying the presence of protein carbonyl groups as described in any of related embodiments of the present invention, thereby assessing the oxidation level of the cells, and comparing the oxidation level of cells that have been contacted with the compound to the oxidation level of cells that have not been contacted with the compound. A decrease in the level of oxidation in cells contacted with the compound, compared to the level of oxidation in cells not contacted with the compound, is indicative of the ability of the compound to reduce the level of oxidation in the cells. Said compound may comprise a single compound, a mixture of compounds, or a library of compounds. A library of compounds may include carbohydrates, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, amino acids, peptides, oligopeptides, polypeptides, proteins, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, lipids, glycopeptides, glycoproteins, proteoglycans, natural compounds, synthetic analogs or derivatives thereof, and the like.
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επίσης κιτ για την εκτέλεση των μεθόδων που αποκαλύπτονται εδώ. Σε μία ενσωμάτωση, παρέχεται ένα κιτ για την φθορισμομετρική ανίχνευση ή/και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε ένα δείγμα, όπου το εν λόγω κιτ περιλαμβάνει ένα υδραζίδιο ροδαμίνης και ένα διάλυμα αντίδρασης του υδραζιδίου ροδαμίνης. Το υδραζίδιο ροδαμίνης μπορεί να παρέχεται είτε ως στερεό είτε διαλυμένο σε έναν υδατικό διαλύτη που δεν περιλαμβάνει καρβονυλομάδες. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, το υδραζίδιο ροδαμίνης είναι ένα μη φθορίζον υδραζίδιο ροδαμίνης. Σε μία περισσότερο προτιμώμενη ενσωμάτωση, το υδραζίδιο ροδαμίνης είναι το RBH. Το διάλυμα της αντίδρασης περιλαμβάνει ένα άλας γουανιδινίου και έναν ή περισσότερους ρυθμιστικούς παράγοντες. Σε μία προτιμώμενη πραγματοποίηση, ο ένας ή περισσότεροι ρυθμιστικοί παράγοντες περιλαμβάνουν ένα ρυθμιστικό διάλυμα που διατηρεί το pH εντός της περιοχής από 2,5 έως 3,5. Στους κατάλληλους ρυθμιστικούς παράγοντες περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, ένα κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα σε ένα τελικό pH 3 και ρυθμιστικό διάλυμα γλυκίνης/HCl, πλέον κατά προτίμηση ένα κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα σε ένα τελικό pH 3. Η προτιμώμενη αναλογία μεταξύ κιτρικού νατρίου και φωσφορικού νατρίου στο κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 3 είναι δύο γραμμομοριακά μέρη κιτρικό νάτριο και ένα γραμμομοριακό μέρος φωσφορικό νάτριο. Κατάλληλα άλατα γουανιδινίου είναι, ανάμεσα σε άλλα, η θειοκυανική γουανιδίνη και η υδροχλωρική γουανιδίνη, κατά προτίμηση η υδροχλωρική γουανιδίνη. Το άλας γουανιδινίου είναι παρόν σε ποσότητες επαρκείς για τη μερική αποδιάταξη της πρωτεΐνης που υπάρχει στο δείγμα. Αυτή η επίδραση του άλατος γουανιδινίου επιτυγχάνεται καλύτερα στο εύρος συγκέντρωσης από 0.05 Μ έως 0.15 Μ, κατά προτίμηση 0.1 Μ. The present invention also provides kits for performing the methods disclosed herein. In one embodiment, a kit is provided for the fluorimetric detection and/or quantification of protein carbonyl groups in a sample, wherein said kit comprises a rhodamine hydrazide and a rhodamine hydrazide reaction solution. Rhodamine hydrazide can be provided either as a solid or dissolved in an aqueous solvent that does not include carbonyl groups. In a preferred embodiment, the rhodamine hydrazide is a non-fluorescent rhodamine hydrazide. In a more preferred embodiment, the rhodamine hydrazide is RBH. The reaction solution comprises a guanidinium salt and one or more buffers. In a preferred embodiment, the one or more buffering agents comprise a buffer that maintains the pH within the range of 2.5 to 3.5. Suitable buffering agents include, without limitation, a citrate-phosphate buffer at a final pH of 3 and glycine/HCl buffer, more preferably a citrate-phosphate buffer at a final pH of 3. The preferred ratio of sodium citrate to phosphate of sodium in citrate-phosphate buffer pH 3 is two mole parts sodium citrate and one mole part sodium phosphate. Suitable guanidinium salts are, among others, guanidine thiocyanate and guanidine hydrochloride, preferably guanidine hydrochloride. The guanidinium salt is present in amounts sufficient to partially denature the protein present in the sample. This effect of the guanidinium salt is best achieved in the concentration range of 0.05 M to 0.15 M, preferably 0.1 M.
Σε μία ενσωμάτωση, το κιτ μπορεί να περιλαμβάνει περαιτέρω ένα διάλυμα ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων το οποίο περιλαμβάνει ένα άλας γουανιδινίου και έναν ή περισσότερους ρυθμιστικούς παράγοντες. Το διάλυμα αυτό είναι βελτιστοποιημένο ως προς το pH και τη συγκέντρωση του άλατος γουανιδίνης ώστε να εξασφαλίζεται μεγίστη ένταση φθορισμού και σταθερότητα της υδραζόνης που προκύπτει. Για το RBH, το βέλτιστο pH είναι εντός του εύρους από 4,5 έως 6,5, με την μέγιστη ένταση φθορισμού να επιτυγχάνεται σε pH 5. Κατάλληλα άλατα γουανιδινίου είναι, ανάμεσα σε άλλα, η θειοκυανική γουανιδίνη και η υδροχλωρική γουανιδίνη. Ένα κατάλληλο εύρος συγκέντρωσης του άλατος γουανιδινίου είναι από 7 Μ έως συγκέντρωσης κορεσμού. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, η συγκέντρωση της υδροχλωρικής γουανιδίνης είναι 8 Μ. Σε άλλη προτιμώμενη ενσωμάτωση, το διάλυμα ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων είναι κορεσμένο σε υδροχλωρική γουανιδίνη. Σε μία προτιμώμενη ενσωμάτωση, ο ένας ή περισσότεροι ρυθμιστικοί παράγοντες του διαλύματος ποσοτικοποίησης καρβονυλομάδων διατηρούν το pH του δείγματος εντός του εύρους από 4,5 έως 6,5. Στους κατάλληλους ρυθμιστικούς παράγοντες περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, το όξινο φωσφορικό νάτριο, κιτρικό νάτριο ή ένα μίγμα αυτών. Στα κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, 50 mΜ κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5 και κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, κατά προτίμηση 50 mΜ κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5. In one embodiment, the kit may further comprise a carbonyl group quantification solution comprising a guanidinium salt and one or more buffering agents. This solution is optimized for pH and guanidine salt concentration to ensure maximum fluorescence intensity and stability of the resulting hydrazone. For RBH, the optimum pH is within the range of 4.5 to 6.5, with maximum fluorescence intensity occurring at pH 5. Suitable guanidinium salts are, among others, guanidine thiocyanate and guanidine hydrochloride. A suitable concentration range of the guanidinium salt is from 7 M to saturation concentration. In a preferred embodiment, the concentration of guanidine hydrochloride is 8 M. In another preferred embodiment, the carbonyl group quantification solution is saturated in guanidine hydrochloride. In a preferred embodiment, the one or more buffering agents of the carbonyl group quantification solution maintain the pH of the sample within the range of 4.5 to 6.5. Suitable buffering agents include, but are not limited to, sodium hydrogen phosphate, sodium citrate, or a mixture thereof. Suitable buffers include, but are not limited to, 50 mM citrate-phosphate buffer pH 5 and citrate buffer, preferably 50 mM citrate-phosphate buffer pH 5.
Σε μία άλλη ακόμη ενσωμάτωση το κιτ μπορεί περαιτέρω να περιλαμβάνει ένα ή περισσότερα διαλύματα βαθμονόμησης με γνωστή συγκέντρωση υδραζιδίου ροδαμίνης για χρήση στην κατασκευή μιας καμπύλης βαθμονόμησης. In yet another embodiment the kit may further include one or more calibration solutions of known concentration of rhodamine hydrazide for use in constructing a calibration curve.
Το κιτ της παρούσας εφεύρεσης μπορεί περαιτέρω να περιλαμβάνει μικρο-φυγοκεντρικές συσκευές φιλτραρίσματος για την απομάκρυνση του ιχνηθέτη που δεν αντέδρασε. Κατάλληλες συσκευές φιλτραρίσματος για την εφαρμογή αυτή είναι φίλτρα από μεμβράνη κυτταρίνης (cellulose membrane filters) και τα νάιλον φίλτρα μεμβράνης. Ως παράδειγμα, κατάλληλα φίλτρα από μεμβράνη κυτταρίνης είναι τα Amicon Ultra 10k 0,5 ml και Centricon Ultracel YM-10, και τα δύο από την Merck Millipore (Darmstadt, Γερμανία), ή άλλα παρόμοια. The kit of the present invention may further include micro-centrifugal filtration devices to remove unreacted tracer. Suitable filtering devices for this application are cellulose membrane filters and nylon membrane filters. As an example, suitable cellulose membrane filters are Amicon Ultra 10k 0.5 ml and Centricon Ultracel YM-10, both from Merck Millipore (Darmstadt, Germany), or the like.
Σε ακόμη άλλη ενσωμάτωση το κιτ μπορεί περαιτέρω να περιλαμβάνει ένα φυλλάδιο οδηγιών. In yet another embodiment the kit may further include an instruction booklet.
Τα κιτ της παρούσας εφεύρεσης μπορούν να προσαρμοστούν για χρήση είτε σε κοινό φθορισμόμετρο ή σε φθορισμόμετρο μικροπλακών ή σε άλλες μορφές στερεού υποστρώματος. Στα κατάλληλα στερεά υποστρώματα περιλαμβάνονται, χωρίς περιορισμό, τα σφαιρίδια, μαγνητικά σφαιρίδια, λεπτά υμένια (thin films), νανοσωλήνες άνθρακα, μικροσωλήνες, φίλτρα, πήγματα (gel), πλάκες (plates), μικροπλάκες (microplates) και οι ηλεκτρονικοί αισθητήρες (sensor chips). The kits of the present invention can be adapted for use in either a common fluorometer or a microplate fluorometer or other forms of solid support. Suitable solid substrates include, without limitation, beads, magnetic beads, thin films, carbon nanotubes, microtubes, filters, gels, plates, microplates, and sensor chips. ).
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ EXAMPLES
Κατωτέρω γίνεται πιο λεπτομερής περιγραφή της παρούσας εφεύρεσης με αναφορά σε παραδείγματα. Θα γίνει προφανές σε ένα άτομο που έχει συνήθη εμπειρία στην τεχνική ότι αυτά τα παραδείγματα είναι μόνο για επεξηγηματικούς σκοπούς και δεν πρέπει να θεωρηθούν ότι περιορίζουν ή ότι αλλάζουν το πεδίο εφαρμογής της παρούσας εφεύρεσης. Below is a more detailed description of the present invention with reference to examples. It will be apparent to a person of ordinary skill in the art that these examples are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting or altering the scope of the present invention.
Παράδειγμα 1 Example 1
Προετοιμασία του κλάσματος των ιστονών για την ανάλυση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων Preparation of the histone fraction for analysis of protein carbonyl groups
Διαυγή δείγματα κυττάρων ή ομογενοποιημένου ιστού (σε ένα χαμηλής ιοντικής ισχύος ρυθμιστικό διάλυμα με ουδέτερο pH, όπως 50 mΜ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 7,0), επωάζονται σε 1% SS για 30 λεπτά σε λουτρό πάγου-ύδατος, που ακολουθείται από φυγοκέντρηση σε 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Το προκύπτον ίζημα (που περιλαμβάνει DNA και χρωμοσωμικές πρωτεΐνες) πλένεται με 1% SS. Το υπερκείμενο που προκύπτει μπορεί να υποστεί περαιτέρω επεξεργασία, όπως εξηγείται στο Παράδειγμα 2, ώστε να απομονωθεί το κυτταροπλασματικό/υδατικό πρωτεϊνικό κλάσμα του δείγματος, ή όπως στο παράδειγμα 2 [για την απομόνωση του κυτταροπλασματικού/υδατικού κλάσματος και του λιπιδικού/μεμβρανικού πρωτεϊνικού κλάσματος ξεχωριστά ή ως ένα μίγμα (βλέπε σημείωση στο Παράδειγμα 2)]. Clear cell samples or tissue homogenate (in a low ionic strength buffer with a neutral pH, such as 50 mM phosphate buffer pH 7.0), are incubated in 1% SS for 30 min in an ice-water bath, followed by centrifugation at 16,000 g for 10 min at 4°C. The resulting pellet (comprising DNA and chromosomal proteins) is washed with 1% SS. The resulting supernatant can be further processed, as explained in Example 2, to isolate the cytoplasmic/aqueous protein fraction of the sample, or as in example 2 [to isolate the cytoplasmic/aqueous fraction and the lipid/membrane protein fraction separately or as a mixture (see note to Example 2)].
Το ίζημα που περιέχει DΝA και χρωμοσωμική πρωτεΐνη επαναδιαλυτοποιείται/ διασπείρεται σε 50 mΜ ρυθμιστικού διαλύματος βορικού νατρίου (pH 9), που περιέχει 25 mM DTT (για την εξουδετέρωση τυχόν παρεμβαλόμενων σουλφενικών ομάδων), και επωάζεται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι χρωμοσωμικές πρωτεΐνες (ιστόνες) που υπάρχουν στο προκύπτον εναιώρημα DTT-πρωτεΐνης απομονώνονται ως ακολούθως: Το εναιώρημα DTT-πρωτεΐνης επωάζεται σε 0,2 Μ H2SO4για 30 λεπτά σε λουτρό πάγου-ύδατος, και φυγοκεντρείται στα 16.000 g για 10 min στους 4°C. Το προκύπτον ίζημα που περιέχει το DNA απορρίπτεται και οι διαλυτές σε οξύ ιστόνες στο προκύπτον υπερκείμενο επωάζονται σε 0,02% DOC για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια κατακρημνίζονται με 33% TCA (μετά από επώαση για 30 λεπτά σε λουτρό πάγου-νερού λουτρό) και φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. The pellet containing DNA and chromosomal protein is redissolved/dispersed in 50 mM sodium borate buffer (pH 9), containing 25 mM DTT (to neutralize any interfering sulfenic groups), and incubated for 30 min at room temperature. Chromosomal proteins (histones) present in the resulting DTT-protein suspension are isolated as follows: The DTT-protein suspension is incubated in 0.2 M H2SO4 for 30 min in an ice-water bath, and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C . The resulting pellet containing the DNA is discarded, and the acid-soluble histones in the resulting supernatant are incubated in 0.02% DOC for 10 min at room temperature. They are then precipitated with 33% TCA (after incubation for 30 min in an ice-water bath) and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C.
Το ίζημα των ιστονών πλένεται στη συνέχεια μια φορά με 33% παγωμένο TCA (σε 0.134 Μ H2SO4), και φυγοκεντρείται στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Το ίζημα στη συνέχεια πλένεται τρεις φορές με 100% ακετόνη (παγωμένη στους -20°C), όπου κάθε πλύση ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Στη συνέχεια, η οργανική φάση της ακετόνης από την τρίτη πλύση απορρίπτεται, και το ίζημα των ιστονών ξηραίνεται. Γ ια την ανάλυση των πρωτείνικών καρβονυλομάδων, το ίζημα επαναδιαλύεται σε έναν ελάχιστο όγκο 50 mM NaOH. The histone pellet is then washed once with 33% ice-cold TCA (in 0.134 M H2SO4), and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C. The pellet is then washed three times with 100% acetone (frozen at -20°C), where each wash is followed by centrifugation at 16,000 g for 10 min at 4°C. The acetone organic phase from the third wash is then discarded, and the histone precipitate is dried. For analysis of protein carbonyl groups, the pellet is redissolved in a minimum volume of 50 mM NaOH.
Παράδειγμα 2 Example 2
Απομόνωση του κυτταροπλασματικού/υδατικού και μεμβρανικού πρωτεϊνικού κλάσματος Isolation of the cytoplasmic/aqueous and membrane protein fraction
Για την απομόνωση του κυτταροπλασματικού/υδατικού και μεμβρανικού πρωτεϊνικού κλάσματος που υπάρχει στο υπερκείμενο που προκύπτει στο Παράδειγμα 1 μετά την επώαση με SS (ή στον ορό του αίματος ή το πλάσμα, ή οποιαδήποτε άλλο βιολογικό υγρό που έχει υποστεί επεξεργασία με SS), το υπερκείμενο επωάζεται σε 0,02% DOC για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια σε 10% TCA σε ένα λουτρό πάγουνερού για 20 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση σε 16000 g για 10 λεπτά στους 4°C) συλλέγεται το προκύπτον ακατέργαστο ίζημα που περιέχει το κυτταροπλασματικό/υδατικό πρωτεϊνικό κλάσμα. To isolate the cytoplasmic/aqueous and membrane protein fraction present in the supernatant obtained in Example 1 after incubation with SS (or in blood serum or plasma, or any other biological fluid treated with SS), the supernatant incubated in 0.02% DOC for 10 min at room temperature, then in 10% TCA in an ice-water bath for 20 min. After centrifugation at 16000 g for 10 min at 4°C) the resulting crude pellet containing the cytoplasmic/aqueous protein fraction is collected.
Το υπερκείμενο περιέχει λιπίδια και λιπίδια/μεμβρανικές πρωτεΐνες. Οι μεμβράνες δεν διαλυτοποιούνται σε 0,02% DOC, καθώς το αντιδραστήριο αυτό χρησιμοποιείται σε συγκέντρωση πολύ μικρότερη από την κρίσιμη μικυλλιακή συγκέντρωση, και μαζί με το γεγονός ότι οι ενσωματωμένες μεμβρανικές πρωτεΐνες ως ιδιαίτερα υδρόφοβες είναι θαμμένες μέσα στην λιπιδική διπλοστοιβάδα, δεν είναι προσβάσιμες στο TCA και δεν καθιζάνουν. Το υπερκείμενο στη συνέχεια εκχυλίζεται με έναν ίσο όγκο CHCΙ3:MeOH (2:1 ν/ν), μια επεξεργασία που προκαλεί απολιπιδίωση, διαλυτοποίηση των μεμβρανών και απελευθέρωση των πρωτεϊνών τους. Στη συνέχεια η υδατική ανώτερη φάση (μαζί με τη μεσαία στοιβάδα λιπιδίων/μεμβρανικών πρωτεϊνών) επανεκχυλίζεται με 2⁄3 του όγκου χλωροφόρμιο και η μεσαία στοιβάδα λιπιδίων/μεμβρανικών πρωτεϊνών συλλέγεται. The supernatant contains lipids and lipids/membrane proteins. Membranes are not solubilized in 0.02% DOC, as this reagent is used at a concentration much lower than the critical micellar concentration, and together with the fact that the integral membrane proteins being highly hydrophobic are buried within the lipid bilayer, they are not accessible to the TCA and do not precipitate. The supernatant is then extracted with an equal volume of CHCl 3 :MeOH (2:1 v/v), a treatment that causes delipidation, solubilization of the membranes and release of their proteins. The aqueous upper phase (along with the lipid/membrane protein midlayer) is then back-extracted with 2⁄3 volume chloroform, and the lipid/membrane protein midlayer is collected.
Σημείωση: Εάν η παραπάνω κατακρήμνιση της πρωτεΐνης με DOC-TCA και η εκχύλιση των λιπιδίων/μεμβρανικών πρωτεϊνών με χλωροφόρμιο συνδυαστούν σε ένα μόνο στάδιο, το προκύπτον πρωτεϊνικό ίζημα θα είναι ένα μίγμα του κυτταροπλασματικού/υδατικού και του μεμβρανικού πρωτεϊνικού κλάσματος. Αυτή η διαδικασία μπορεί να ακολουθηθεί σε περίπτωση που δεν υπάρχει πειραματική ανάγκη να απομονωθούν αυτά τα πρωτεϊνικά κλάσματα για χωριστή ανάλυση. Note: If the above DOC-TCA protein precipitation and chloroform extraction of lipids/membrane proteins are combined in a single step, the resulting protein pellet will be a mixture of the cytoplasmic/aqueous and membrane protein fractions. This procedure can be followed when there is no experimental need to isolate these protein fractions for separate analysis.
Το προκύπτον ίζημα λιπιδίων/μεμβρανικών πρωτεϊνών και το ήδη συλλεχθέν κυτταροπλασματικό/ υδατικό πρωτεϊνικό ίζημα πλένονται το καθένα μία φορά με παγωμένο 10% TCA (με στροβιλισμό και φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C). Στη συνέχεια πλένονται τρεις φορές με 100% ακετόνη (παγωμένη στους -20<ο>C), όπου κάθε πλύση διευκολύνεται με μηχανική διασπορά, και φυγοκεντρούνται στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Η περίσσεια ακετόνης στα πρωτεϊνικά ιζήματα απομακρύνεται με απορροφητικό χαρτί. The resulting lipid/membrane protein pellet and already collected cytoplasmic/aqueous protein pellet are each washed once with ice-cold 10% TCA (by vortexing and centrifugation at 16,000 g for 10 min at 4°C). They are then washed three times with 100% acetone (frozen at -20<o>C ), where each wash is facilitated by mechanical dispersion, and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C. Excess acetone in the protein precipitates is removed with absorbent paper.
Το λιπιδικό/μεμβρανικό και το κυτταροπλασματικό/υδατικό πρωτεϊνικό ίζημα που προκύπτουν στο Παράδειγμα 2 ρυθμίζονται σε 64 mΜ ρυθμιστικού διαλύματος βορικού νατρίου (pH 9) και σε 25 mM DTT, και επωάζονται για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, επωάζονται σε 0,02% DOC για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια σε 10% TCA σε ένα λουτρό πάγου-νερού για 20 λεπτά, και φυγοκεντρούνται στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Τα προκύπτοντα πρωτεϊνικά ιζήματα πλένονται μια φορά με παγωμένο 10% TCA, φυγοκεντρούνται στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C, και στη συνέχεια πλένονται τρεις φορές με 100% ακετόνη (παγωμένη στους -20°C), όπου κάθε πλύση ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 10 λεπτά στους 4°C. Στη συνέχεια, η οργανική φάση της ακετόνης από την τρίτη πλύση απορρίπτεται, τα ιζήματα ξηραίνονται και διαλυτοποιούνται για άμεση χρήση με την δοκιμασία ntrDNPH. Εναλλακτικά, τα ξηρά ιζήματα μπορούν να φυλαχθούν για μεταγενέστερη χρήση στους -80°C για τουλάχιστον ένα μήνα. Για τη δοκιμασία ntrDNPH, τα ιζήματα επαναιωρούνται το καθένα σε έναν ελάχιστο όγκο 50 mM NaOH που περιέχει 4 Μ ουρία. Τα πρωτεϊνικά ιζήματα από τα δείγματα λιπώδους ιστού (βλέπε Παράδειγμα 3) μπορεί να μην διαλυτοποιηθούν πλήρως στα 50 mM NaOH/4 Μ ουρία, λόγω της παρουσίας των λιπιδίων/μεμβρανικών (υδρόφοβων) πρωτεϊνών. Τα ιζήματα αυτά μπορούν να απομονωθούν περαιτέρω μετά από πλύση με νερό και διαλυτοποίηση σε 50 mM NaOH/4 Μ ουρία που περιέχει 50 έως 200 mM SDS. The lipid/membrane and cytoplasmic/aqueous protein pellet resulting from Example 2 is adjusted to 64 mM sodium borate buffer (pH 9) and 25 mM DTT, and incubated for 30 minutes at room temperature. They are then incubated in 0.02% DOC for 30 min at room temperature, then in 10% TCA in an ice-water bath for 20 min, and centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C. The resulting protein pellets are washed once with ice-cold 10% TCA, centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C, and then washed three times with 100% acetone (ice-cold at -20°C), where each wash is followed by centrifugation at 16,000 g for 10 min at 4°C. The acetone organic phase from the third wash is then discarded, the precipitates are dried and solubilized for immediate use with the ntrDNPH assay. Alternatively, dried sediments can be stored for later use at -80°C for at least one month. For the ntrDNPH assay, the pellets are each resuspended in a minimal volume of 50 mM NaOH containing 4 M urea. Protein precipitates from adipose tissue samples (see Example 3) may not be completely solubilized in 50 mM NaOH/4 M urea due to the presence of lipids/membrane (hydrophobic) proteins. These precipitates can be further isolated after washing with water and solubilization in 50 mM NaOH/4 M urea containing 50 to 200 mM SDS.
Παράδειγμα 3 Example 3
Προετοιμασία του λιπώδους ιστού για την ανάλυση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων Preparation of adipose tissue for the analysis of protein carbonyl groups
Ανθρώπινος λιπώδης ιστός ομογενοποιείται σε 3,5 όγκους 10 mM φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος pH 7,0 (ή σε άλλο ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλής ιονικής ισχύος ή ακόμη και σε ddΗ2O). Ο ομογενοποιημένος λιπώδης ιστός δεν φυγοκεντρείται (και το DNA του δεν κατακρημνίζεται με επεξεργασία σε SS), αν προορίζεται να αναλυθεί με τη δοκιμασία ntrDNPH. Στη συνέχεια επωάζεται σε 10% TCA και εκχυλίζεται με ίσο όγκο CHCΙ3:MeOH (2:1) για να απομονωθούν, με φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 5 λεπτά στους 4°C, τα ακόλουθα κλάσματα: (ί) το λιπιδικό κλάσμα, που εκχυλίζεται στην κάτω οργανική φάση του CHCI3και συνδυάζεται με μια δεύτερη φάση CHCI3από μια δεύτερη εκχύλιση με 1.5 όγκο δείγματος CHCI3. Το υγρό ίζημα ξηραίνεται εν κενώ μέχρι να επιτευχθεί ένα σταθερό βάρος το οποίο καταγράφεται, και στη συνέχεια το ίζημα αποθηκεύεται στους -20°C για περαιτέρω ανάλυση, (ii) Η μεσαία ζώνη που περιέχει το συνολικό πρωτεϊνικό κλάσμα, το οποίο πλένεται με TCA/ακετόνη και επωάζεται με DTT όπως στο Παράδειγμα 2. Human adipose tissue is homogenized in 3.5 volumes of 10 mM phosphate buffer pH 7.0 (or other low ionic strength buffer or even ddH2O). The adipose tissue homogenate is not centrifuged (and its DNA is not precipitated by treatment in SS) if it is to be analyzed by the ntrDNPH assay. It is then incubated in 10% TCA and extracted with an equal volume of CHCl3:MeOH (2:1) to isolate, by centrifugation at 16,000 g for 5 min at 4°C, the following fractions: (i) the lipid fraction, extracted in the bottom organic phase of CHCl3 and combined with a second CHCl3 phase from a second extraction with 1.5 sample volume of CHCl3. The liquid pellet is vacuum dried until a constant weight is reached which is recorded, and then the pellet is stored at -20°C for further analysis, (ii) The middle zone containing the total protein fraction, which is washed with TCA/ acetone and incubated with DTT as in Example 2.
Παράδειγμα 4 Example 4
Προετοιμασία των δειγμάτων πρωτεΐνης για την ανάλυση των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων Preparation of protein samples for the analysis of protein carbonyl groups
Όταν το δείγμα πρωτεΐνης περιλαμβάνει ένα ίζημα από τα Παραδείγματα 1, 2, ή 3 που επαναδιαλυτοποιείται σε 50 mΜ NaOH, το δείγμα πρωτεΐνης είναι έτοιμο προς ανάλυση με την δοκιμασία RBH. Όταν το δείγμα πρωτεΐνης περιλαμβάνει μία καθαρισμένη πρωτεΐνη, ακατέργαστο ολικό κυτταρικό εκχύλισμα, δείγμα ομογενοποιημένου ιστού ή βιολογικού υγρού, το δείγμα πρώτα φέρεται σε μια τελική συγκέντρωση 50 mM NaOH. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες και επειδή η δοκιμασία μπορεί να αναλύσει δείγματα πρωτεΐνης σε συγκέντρωση τόσο χαμηλή όσο τα 2,5 μg, πρέπει να χρησιμοποιηθούν εξαιρετικά ευαίσθητες διαδικασίες για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης στα εν λόγω δείγματα. Τέτοιες μέθοδοι έχουν εφευρεθεί από τον ίδιο εφευρέτη (βλέπε αναφορά: Georgiou CD et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 2008; Vol 391, pp. 391-403, και την τροποποιημένη εκδοχή της: Grintzalis Κ et al., Analytical Biochemistry 2015; Vol 480, pp. 28-30). Η αρχή των δύο αυτών μεθόδων στηρίζεται στην αποτελεσματική πρόσδεση της ιοντικά ουδέτερης μορφής του αντιδραστηρίου Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) (που σχηματίζεται σε pH 0,4) στις πρωτεΐνες (με συνδυασμό υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και ετεροπολικών δεσμών με βασικά αμινοξέα), αντί των όξινων μορφών CBB που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες εκδοχές της μεθόδου. When the protein sample includes a precipitate from Examples 1, 2, or 3 that is redissolved in 50 mM NaOH, the protein sample is ready for analysis by the RBH assay. When the protein sample comprises a purified protein, crude total cell extract, tissue homogenate or biological fluid sample, the sample is first brought to a final concentration of 50 mM NaOH. To quantify protein content, and because the assay can analyze protein samples at a concentration as low as 2.5 µg, highly sensitive procedures must be used to determine the protein in said samples. Such methods have been invented by the same inventor (see reference: Georgiou CD et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry 2008; Vol 391, pp. 391-403, and its modified version: Grintzalis K et al., Analytical Biochemistry 2015; Vol 480, pp. 28-30). The principle of these two methods is based on the effective binding of the ionically neutral form of the reagent Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) (formed at pH 0.4) to proteins (by a combination of hydrophobic interactions and heteropolar bonds with basic amino acids), instead of the acid forms of CBB used in previous versions of the method.
Παράδειγμα 5 Example 5
Διαδικασία για την δοκιμασία RBH Procedure for the RBH test
Για την προετοιμασία του δείγματος (εφεξής καλούμενο S) σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρησης, η πρωτεΐνη του δείγματος (σε ποσότητα τόσο χαμηλή όσο τα 2,5 μg, διαλυμένη σε 50 mM NaOH) αναμιγνύεται με το αντιδραστήριο RBH σε τελικές συγκεντρώσεις 20-100 μΜ από ένα αρχικό στοκ σε απόλυτη αιθανόλη, μαζί με τα αντιδραστήρια (σε τελικές συγκεντρώσεις): κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM σε τελικό pH 3.0), HCI (35 mM, που χρησιμοποιείται για να εξουδετερώσει το NaOH που υπάρχει στο δείγμα πρωτεΐνης) και υδροχλωρική γουανιδίνη (0,1 Μ, εφεξής καλούμενη GndHCI). Για το δείγμα μάρτυρα (εφεξής καλούμενο SB), η ίδια ποσότητα πρωτεΐνης αναμιγνύεται με όλα τα αντιδραστήρια αλλά παραλείποντας το αντιδραστήριο RBH. Στη συνέχεια, τα προκύπτοντα μίγματα S και SB επωάζονται στο σκοτάδι για 60 λεπτά στους 37°C. To prepare the sample (hereafter referred to as S) in a microcentrifuge tube, the sample protein (in an amount as low as 2.5 μg, dissolved in 50 mM NaOH) is mixed with the RBH reagent at final concentrations of 20–100 μM from an initial stock in absolute ethanol, along with the reagents (in final concentrations): citrate-phosphate buffer (50 mM at a final pH of 3.0), HCl (35 mM, used to neutralize the NaOH present in the protein sample) and guanidine hydrochloride (0.1 M, hereafter referred to as GndHCl). For the control sample (hereafter referred to as SB), the same amount of protein is mixed with all reagents but omitting the RBH reagent. The resulting mixtures of S and SB are then incubated in the dark for 60 min at 37°C.
Μετά την επώαση, η πρωτεΐνη στα υδατικά μίγματα S και SB διαχωρίζεται/πλένεται από το μη αντιδράσαν αντιδραστήριο RBH στην υδατική φάση, χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμες συσκευές φιλτραρίσματος μικροφυγοκέντρου, οι οποίες κατακρατούν την πρωτεΐνη, ενώ το RBH που δεν αντέδρασε απορρίπτεται. Οι πρωτεΐνες που κατακρατούνται στην επιφάνεια του φίλτρου ανακτώνται από αυτό με διάλυση σε 8 Μ (ή κορεσμένο) GndHCI/50 mM κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 5 (εφεξής καλούμενο ρυθμιστικό 8Gnd-50CP). Στο σημείο αυτό τα διαλυτοποιήματα S και SB φυγοκεντρούνται προκειμένου να απομακρυνθούν τυχόν νουκλεϊκά οξέα που υπήρχαν στο δείγμα πρωτεΐνης και κατακρατήθηκαν στην επιφάνεια του φίλτρου, τα οποία δεν επαναδιαλυτοποιούνται στο ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP (pH 5). After incubation, the protein in the S and SB aqueous mixtures is separated/washed from the unreacted RBH reagent in the aqueous phase, using commercially available microcentrifuge filtration devices, which retain the protein, while the unreacted RBH is discarded. Proteins retained on the surface of the filter are recovered from it by dissolution in 8 M (or saturated) GndHCl/50 mM citrate-phosphate buffer pH 5 (hereafter referred to as 8Gnd-50CP buffer). At this point the S and SB solubilizers are centrifuged to remove any nucleic acids that were present in the protein sample and retained on the filter surface, which are not redissolved in the 8Gnd-50CP buffer (pH 5).
Εναλλακτικά, στα υδατικά μίγματα S και SB προστίθεται DOC σε τελική συγκέντρωση 0,02% και επωάζονται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στην συνέχεια προστίθεται TCA σε τελική συγκέντρωση 10% και επωάζονται για 15 λεπτά σε λουτρό πάγου-νερού. Έπειτα, η πρωτεΐνη των επεξεργασμένων με DOC-TCA μιγμάτων S και SB κατακρημνίζεται με φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 5 λεπτά στους 4°C. Τα προκύπτοντα ιζήματα πλένονται δύο φορές με παγωμένη (≤ -25°C) ακετόνη με περιδίνηση (όπου μετά από κάθε πλύση επακολουθεί φυγοκέντρηση στα 16.000 g για 5 λεπτά στους 4°C), και ξηραίνονται π.χ. σε ένα ρεύμα αζώτου. Τα προκύπτοντα πλυμένα ιζήματα πρωτεΐνης S και SB διαλύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP και εκλούονται με φυγοκέντρηση. Στο σημείο αυτό τα διαλυτοποιήματα S και SB φυγοκεντρούνται προκειμένου να απομακρυνθούν τυχόν νουκλεϊκά οξέα που υπήρχαν στο δείγμα πρωτεΐνης τα οποία είχαν κατακρημνιστεί κατά την επώαση με DOC-TCA και που δεν επαναδιαλυτοποιούνται στο ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP (pH 5). Alternatively, aqueous mixtures of S and SB are spiked with DOC to a final concentration of 0.02% and incubated for 10 min at room temperature. TCA is then added to a final concentration of 10% and incubated for 15 minutes in an ice-water bath. The protein of the DOC-TCA-treated S and SB mixtures is then precipitated by centrifugation at 16,000 g for 5 min at 4°C. The resulting pellets are washed twice with ice-cold (≤ -25°C) acetone by spinning (where each wash is followed by centrifugation at 16,000 g for 5 min at 4°C), and dried e.g. in a stream of nitrogen. The resulting washed protein S and SB precipitates are dissolved in 8Gnd-50CP buffer and eluted by centrifugation. At this point the S and SB solubilizers are centrifuged to remove any nucleic acids present in the protein sample that were precipitated during incubation with DOC-TCA and are not redissolved in 8Gnd-50CP buffer (pH 5).
Σημείωση : Το ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP (pH 5) στο οποίο διαλύεται η παραγόμενη υδραζόνη πριν από το βήμα της μέτρησης φθορισμού, είναι πολύ σημαντικό να περιέχει τη μέγιστη συγκέντρωση GndHCI ώστε να μεγιστοποιείται ο φθορισμός της υδραζόνης. Το διάλυμα 8 Μ GndHCI παρασκευάζεται εύκολα και βρίσκεται κοντά στο όριο κορεσμού του GndHCI. Ωστόσο, ο φθορισμός του υδραζόνης στην συγκέντρωση κορεσμού του GndHCI μπορεί να είναι τουλάχιστον 3 φορές υψηλότερος από ό,τι στα 8 Μ GndHCI. Έτσι, η χρήση ενός κορεσμένου διαλύματος GndHCI είναι μια εναλλακτική επιλογή από τη χρήση 8 Μ GndHCI. Note: The 8Gnd-50CP buffer (pH 5) in which the produced hydrazone is dissolved prior to the fluorescence measurement step, is very important to contain the maximum concentration of GndHCl to maximize hydrazone fluorescence. The 8 M GndHCI solution is easily prepared and is close to the saturation limit of GndHCI. However, hydrazone fluorescence at the saturating concentration of GndHCI can be at least 3-fold higher than at 8 M GndHCI. Thus, using a saturated solution of GndHCI is an alternative to using 8 M GndHCI.
Από τα διαλυτοποιήματα S και SB σε ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP (που προέκυψαν χρησιμοποιώντας είτε τις συσκευές φιλτραρίσματος μικροφυγοκέντρου ή την τεχνική κατακρήμνισης με DOC/TCA) λαμβάνεται το ένα δέκατο καθενός, αναμιγνύεται με εννέα δέκατα απιονισμένου-απεσταγμένου Η2Ο (εφεξής καλούμενο ddH2Ο), και αποθηκεύεται για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης, όπως περιγράφεται στο Παράδειγμα 4 (χρησιμοποιώντας ως τυφλό δείγμα 0.8 Μ GndHCI/5 mM κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα σε pH 5). Αυτή η αραίωση κατά δέκα φορές απαιτείται προκειμένου να μειωθεί η συγκέντρωση GndHCI έτσι ώστε να αποφεύγεται η παρεμβολή του GndHCI στο βήμα προσδιορισμού πρωτεΐνης. From the S and SB solubilities in 8Gnd-50CP buffer (obtained using either the microcentrifuge filtration devices or the DOC/TCA precipitation technique) one tenth each is taken, mixed with nine tenths of deionized-distilled H2O (hereafter referred to as ddH2O), and stored for protein determination as described in Example 4 (using 0.8 M GndHCl/5 mM citrate-phosphate buffer at pH 5 as a blank). This tenfold dilution is required in order to reduce the concentration of GndHCI so as to avoid interference of GndHCI in the protein determination step.
Τα υπόλοιπα εννέα δέκατα καθενός από τα διαλυτοποιήματα S και SB (που προέκυψαν χρησιμοποιώντας είτε τις συσκευές φιλτραρίσματος μικροφυγοκέντρου ή την τεχνική κατακρήμνισης με DOC/TCA) υφίστανται δοκιμαστικές αραιώσεις με ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP. Στη συνέχεια μετρώνται οι μονάδες φθορισμού της υδραζόνης στο διαλυτοποίημα S (εφεξής καλούμενες FUS) σε μήκη κύματος διέγερσης/εκττομττής 560/590 nm έναντι των μονάδων φθορισμού (FU) του διαλυτοττοιήματος SB (εφεξής καλούμενες FUSB). Η καθαρή FU (= FUS - FUSB), με άλλα λόγια οι μονάδες φθορισμού που προκύπτουν από την αφαίρεση των μονάδων φθορισμού του τυφλού δείγματος (SB, που δεν αντέδρασε με το RBH) από τις μονάδες φθορισμού του δείγματος (S) εκφράζονται ως πικογραμμομόρια καρβονυλομάδων ανά pg πρωτεΐνης, χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη που λαμβάνεται με RBH διαλυμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP. The remaining nine-tenths of each of the S and SB solutions (obtained using either the microfuge filtration devices or the DOC/TCA precipitation technique) are subjected to test dilutions with 8Gnd-50CP buffer. The hydrazone fluorescence units in the S solubilizer (hereafter FUS) at excitation/excitation wavelengths of 560/590 nm are then measured against the fluorescence units (FU) of the SB solubilizer (hereafter FUSB). Net FU (= FUS - FUSB), in other words the fluorescence units resulting from the subtraction of the fluorescence units of the blank (SB, which did not react with RBH) from the fluorescence units of the sample (S) are expressed as picograms of carbonyl groups per pg protein, using a standard curve obtained with RBH dissolved in 8Gnd-50CP buffer.
Για την προετοιμασία της πρότυπης καμπύλη του αντιδραστηρίου RBH, παρασκευάζεται μια σειρά διαλυμάτων RBH (συγκεντρώσεως 0-100 nM RBH) από διαδοχικές αραιώσεις (με ρυθμιστικό 8Gnd-50CP) ενός διαλύματος 0,1 mΜ RBH (που προκύπτει μετά από 10 φορές αραίωση με ddH2O, ενός στοκ 1 mM RBH που παρασκευάζεται σε απόλυτη αιθανόλη ή σε οποιοδήποτε αναμίξιμο με το νερό οργανικό διαλύτη που δεν διαθέτει καρβονυλομάδες). Τέλος, ετοιμάζεται γραφική παράσταση της συγκέντρωσης των διαδοχικών αραιώσεων του RBH συναρτήσει των αντίστοιχων τιμών FU, οι οποίες μετρώνται σε μήκη κύματος διέγερσης/εκπομπής 560/590 nm, χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP ως τυφλό αντιδραστήριο. To prepare the RBH reagent standard curve, a series of RBH solutions (0-100 nM RBH concentration) is prepared from serial dilutions (with 8Gnd-50CP buffer) of a 0.1 mM RBH solution (obtained after 10-fold dilution with ddH2O , of a 1 mM RBH stock prepared in absolute ethanol or any water-miscible organic solvent lacking carbonyl groups). Finally, a plot is prepared of the concentration of serial dilutions of RBH versus the corresponding FU values, which are measured at excitation/emission wavelengths of 560/590 nm, using 8Gnd-50CP buffer as a reagent blank.
Παράδειγμα 6 Example 6
Μοριακή στοιχειομετρία της αντίδρασης των καρβονυλομάδων της τεχνητά οξειδωμένης πρωτεΐνης ελέγχου ox-BSA με το RBH, και η σχέση της σχηματιζόμενης υδραζόνης με τον μοριακό φθορισμό του ελεύθερου RBH. Molecular stoichiometry of the reaction of the carbonyl groups of the artificially oxidized control protein ox-BSA with RBH, and the relationship of the formed hydrazone to the molecular fluorescence of free RBH.
Η στοιχειομετρική αναλογία καθορίζεται από τις ακόλουθες τιτλοδοτήσεις κάνοντας χρήση της δοκιμασίας RBH (Εικ. 2): (Α) από την αντίδραση μίας σταθερής ποσότητας (0,6 nmoles) RBH με διάφορες ποσότητες nmoles καρβονυλομάδων της ox-BSA (ανοιχτοί κύκλοι), και (Β) με την αντίδραση μίας σταθερής ποσότητας (0,6 nmoles) ox-BSA καρβονυλομάδων με διάφορες ποσότητες nmoles της RBH (γεμάτοι κύκλοι). Οι διακεκομμένες γραμμές στις καμπύλες Α και Β είναι οι θεωρητικές τιμές της ειδικής ενεργότητας φθορισμού (fluorescence specific activity, εφεξής καλούμενη FSA) της παραγόμενης υδραζόνης ox-BSA, που εκφράζεται ως μονάδες φθορισμού ανά μg ox-BSA. Οι τιμές αυτές λαμβάνονται από τις πρότυπες καμπύλες γνωστών συγκεντρώσεων RBH και γνωστών συγκεντρώσεων καρβονυλομάδων της ox-BSA (γεμάτοι κύκλοι, καμπύλη C), και δείχνουν ότι η μοριακή στοιχειομετρική αναλογία φθορισμού της παραγόμενης υδραζόνης και του ελεύθερου RBH είναι 1:1. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται στις καμπύλες Α και Β (μαύροι κύκλοι) αντιπροσωπεύουν τις πραγματικές (πειραματικές) τιμές FSA για την παραγόμενη υδραζόνη, και ταιριάζουν πολύ καλά με τις αντίστοιχες θεωρητικές καμπύλες. Αμφότερα τα βέλη στις καμπύλες Α και Β δείχνουν το σχηματισμό ισομοριακής υδραζόνης στην ισομοριακή αναλογία 1 : 1 ανά καρβονυλομάδα της ox-BSA και μορίου RBH. Η πρότυπη καμπύλη C ετοιμάζεται επίσης με διάφορες συγκεντρώσεις καρβονυλομάδων της ox-BSA (ανοιχτοί κύκλοι). Η κλίση της είναι ταυτόσημη με εκείνη της πρότυπης καμπύλης του RBH (γεμάτοι κύκλοι), κάτι που δείχνει και πάλι ότι η μοριακή στοιχειομετρική αναλογία φθορισμού της υδραζόνης και του ελεύθερου RBH είναι 1:1. Οι γραμμές σφάλματος ορίζουν το τυπικό σφάλμα (SD). The stoichiometric ratio is determined by the following titrations using the RBH assay (Fig. 2): (A) by reacting a fixed amount (0.6 nmoles) of RBH with varying amounts of nmoles of carbonyl groups of ox-BSA (open circles), and (B) by reacting a fixed amount (0.6 nmoles) of ox-BSA carbonyl groups with varying amounts of nmoles of RBH (filled circles). The dotted lines in curves A and B are the theoretical values of the fluorescence specific activity (hereafter referred to as FSA) of the produced ox-BSA hydrazone, expressed as fluorescence units per µg ox-BSA. These values are obtained from standard curves of known concentrations of RBH and known concentrations of carbonyl groups of ox-BSA (filled circles, curve C), and show that the molar stoichiometric fluorescence ratio of hydrazone produced and free RBH is 1:1. The data shown in curves A and B (black circles) represent the actual (experimental) FSA values for the produced hydrazone, and match the corresponding theoretical curves very well. Both the arrows in curves A and B indicate the formation of an equimolar hydrazone in the isomolar ratio of 1:1 per carbonyl group of ox-BSA and RBH molecule. Standard curve C is also prepared with various concentrations of carbonyl groups of ox-BSA (open circles). Its slope is identical to that of the RBH standard curve (filled circles), again indicating that the molecular stoichiometric fluorescence ratio of hydrazone to free RBH is 1:1. Error bars define the standard error (SD).
Παράδειγμα 7 Example 7
Ημι-ποσοτική ανίχνευση πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων σε ένα δείγμα με την χρήση ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) Semi-quantitative detection of protein carbonyl groups in a sample using polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
Το δείγμα πρωτεΐνης (καθαρισμένη πρωτεΐνη, ακατέργαστο ολικό εκχύλισμα κυττάρων, ομογενοποιημένος ιστός, υποκυτταρικό κλάσμα πρωτεΐνης ή βιολογικό υγρό) αναλύεται χρησιμοποιώντας SDS-PAGE (ουσιαστικά όπως περιγράφεται στο Shapiro AL et al. Biochem Biophys Res Commun. 1967, Vol. 28(5): pp. 815-820). Εν συντομία, το δείγμα πρωτεΐνης αναμιγνύεται με το αρνητικά φορτισμένο απορρυπαντικό SDS το οποίο, μετά την πρόσδεσή του στην πολυπεπτιδική αλυσίδα της προσδίδει μια ομοιόμορφη κατανομή του αρνητικού φορτίου ανά μονάδα μάζας, με αποτέλεσμα την κλασματοποίηση, κατά μήκος του πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου, των πρωτεϊνών σε ζώνες ανάλογα με το κατά προσέγγιση μοριακό βάρος τους κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Οι δείκτες μοριακού βάρους πρωτεΐνης ηλεκτροφορούνται παράλληλα με τα δείγματα πρωτεΐνης, προκειμένου να παρέχουν μια εκτίμηση των μοριακών βαρών των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών που υπάρχουν στο δείγμα. The protein sample (purified protein, crude total cell extract, tissue homogenate, subcellular protein fraction, or biological fluid) is analyzed using SDS-PAGE (essentially as described in Shapiro AL et al. Biochem Biophys Res Commun. 1967, Vol. 28(5) : pp. 815-820). Briefly, the protein sample is mixed with the negatively charged detergent SDS which, after binding to the polypeptide chain, imparts a uniform distribution of negative charge per unit mass, resulting in the fractionation, along the polyacrylamide gel, of the proteins into bands depending on their approximate molecular weight during electrophoresis. Protein molecular weight markers are electrophoresed alongside the protein samples in order to provide an estimate of the molecular weights of the carbonylated proteins present in the sample.
Στη συνέχεια, το πήκτωμα εμβαπτίζεται σε ένα διάλυμα του αντιδραστηρίου RBH (σε τελικές συγκεντρώσεις 20-100 μΜ, από ένα αρχικό στοκ παρασκευασμένο σε απόλυτη αιθανόλη), και με τα αντιδραστήρια (σε τελικές συγκεντρώσεις) κιτρικό-φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM σε ένα τελικό pH 3.0), και γουανιδίνη-HCI (0.1 Μ), και επωάζονται στο σκοτάδι για 60 λεπτά στους 37°C. Στη συνέχεια, το μη αντιδράσαν RBH ξεπλένεται με εμβάπτιση του πηκτώματος σε διάλυμα αιθανόλης, με την τελευταία εμβάπτιση να πραγματοποιείται σε ddH2O, μετά την οποία το πήκτωμα εμβαπτίζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP. Ο φθορισμός των ζωνών των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών απεικονίζεται με κάμερα (το φως διέγερσης φτάνει στο δείγμα με άμεσο φωτισμό του πεδίου απεικόνισης, τοποθετώντας την πηγή διέγερσης πάνω από το δείγμα) ή με σύστημα απεικόνισης μέσω laser (αυτό κατευθύνει τη δέσμη διέγερσης στο δείγμα). Χρησιμοποιείται ένα μήκος κύματος διέγερσης της τάξης των περίπου 540 nm έως περίπου 580 nm, και μήκος κύματος εκπομπής στο εύρος από περίπου 570 nm έως περίπου 610 nm. The gel is then soaked in a solution of the RBH reagent (at final concentrations of 20-100 µM, from an initial stock prepared in absolute ethanol), and with the reagents (at final concentrations) citrate-phosphate buffer (50 mM in a final pH 3.0), and guanidine-HCl (0.1 M), and incubated in the dark for 60 min at 37°C. Unreacted RBH is then washed away by soaking the gel in ethanol solution, with the last soak in ddH2O, after which the gel is soaked in 8Gnd-50CP buffer. The fluorescence of the carbonylated protein bands is imaged with a camera (the excitation light reaches the sample by direct illumination of the imaging field, placing the excitation source above the sample) or with a laser imaging system (this directs the excitation beam at the sample). An excitation wavelength in the range of about 540 nm to about 580 nm, and an emission wavelength in the range of about 570 nm to about 610 nm is used.
Εναλλακτικά προς τα παραπάνω, το δείγμα πρωτεΐνης αντιδρά πρώτα με το RBH (για παράδειγμα όπως περιγράφεται στο Παράδειγμα 5) και στη συνέχεια ηλεκτροφορείται σε πήκτωμα SDS-PAGE, σύμφωνα με τα προαναφερθέντα βήματα εμβάπτισης στο ρυθμιστικό διάλυμα 8Gnd-50CP, και οπτικοποιείται ο φθορισμός. Alternatively to the above, the protein sample is first reacted with RBH (for example as described in Example 5) and then electrophoresed on an SDS-PAGE gel, according to the aforementioned steps of soaking in 8Gnd-50CP buffer, and fluorescence is visualized.
Claims (17)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20160100569A GR20160100569A (en) | 2016-11-04 | 2016-11-04 | Method for the flurometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20160100569A GR20160100569A (en) | 2016-11-04 | 2016-11-04 | Method for the flurometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| GR20160100569A true GR20160100569A (en) | 2018-08-29 |
Family
ID=59285268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| GR20160100569A GR20160100569A (en) | 2016-11-04 | 2016-11-04 | Method for the flurometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| GR (1) | GR20160100569A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021113905A1 (en) * | 2019-12-09 | 2021-06-17 | The University Of Adelaide | Device for monitoring an oxidative stress and methods thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1108434A1 (en) * | 1998-08-24 | 2001-06-20 | Kurokawa, Kiyoshi | Drugs for relieving carbonyl stress and peritoneal dialysates |
| US20090226396A1 (en) * | 2008-03-07 | 2009-09-10 | Haley John D | Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation |
| US20160199437A1 (en) * | 2015-01-08 | 2016-07-14 | D. Travis Wilson | Therapeutic compositions including iron chelators and uses thereof |
-
2016
- 2016-11-04 GR GR20160100569A patent/GR20160100569A/en unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1108434A1 (en) * | 1998-08-24 | 2001-06-20 | Kurokawa, Kiyoshi | Drugs for relieving carbonyl stress and peritoneal dialysates |
| US20090226396A1 (en) * | 2008-03-07 | 2009-09-10 | Haley John D | Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation |
| US20160199437A1 (en) * | 2015-01-08 | 2016-07-14 | D. Travis Wilson | Therapeutic compositions including iron chelators and uses thereof |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| GLENN M ELDRIDGE, WEISS GREGORY A: "Supporting Information for: Hydrazide-Reactive Peptide Tags for Site-Specific Protein Labeling", vol. 22, 19 October 2011 (2011-10-19), pages 1 - 16, XP055407780 * |
| GLENN M. ELDRIDGE, GREGORY A. WEISS: "Hydrazide Reactive Peptide Tags for Site-Specific Protein Labeling", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 22, no. 10, 19 October 2011 (2011-10-19), US, pages 2143 - 2153, XP055407775, ISSN: 1043-1802, DOI: 10.1021/bc200415v * |
| MARIANA BEIJA, AFONSO CARLOS A. M., MARTINHO JOS� M. G.: "Synthesis and applications of Rhodamine derivatives as fluorescent probes", CHEMICAL SOCIETY REVIEWS, vol. 38, no. 8, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 2410 - 2433, XP055226890, ISSN: 0306-0012, DOI: 10.1039/b901612k * |
| MIYOSHI, N. NANIWA, K. YAMADA, T. OSAWA, T. NAKAMURA, Y.: "Dietary flavonoid apigenin is a potential inducer of intracellular oxidative stress: The role in the interruptive apoptotic signal", ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, ACADEMIC PRESS, US, vol. 466, no. 2, 26 September 2007 (2007-09-26), US, pages 274 - 282, XP022274120, ISSN: 0003-9861, DOI: 10.1016/j.abb.2007.07.026 * |
| PAMELA E STARKE, OLIVER CN, STADTMAN ER: "Modification of hepatic proteins in rats exposed to high oxygen concentration", THE FASEB JOURNAL, FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY, US, vol. 1, no. 1, 1 July 1987 (1987-07-01), US, pages 36 - 39, XP055408238, ISSN: 0892-6638, DOI: 10.1096/fasebj.1.1.2886388 * |
| ROE, M.R. ; MCGOWAN, T.F. ; THOMPSON, L.V. ; GRIFFIN, T.J.: "Targeted ^1^8O-Labeling for Improved Proteomic Analysis of Carbonylated Peptides by Mass Spectrometry", JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MASS SPECTROMETRY., ELSEVIER SCIENCE INC., US, vol. 21, no. 7, 1 July 2010 (2010-07-01), US, pages 1190 - 1203, XP027095750, ISSN: 1044-0305 * |
| XP 021176896 * |
| XP 028224261 * |
| XP 029619259 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021113905A1 (en) * | 2019-12-09 | 2021-06-17 | The University Of Adelaide | Device for monitoring an oxidative stress and methods thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hawkins et al. | Quantification of protein modification by oxidants | |
| Yin et al. | Fluorescent probes with multiple binding sites for the discrimination of Cys, Hcy, and GSH | |
| Furdui et al. | Chemical approaches to detect and analyze protein sulfenic acids | |
| Yan et al. | Chemical probes for analysis of carbonylated proteins: a review | |
| Papafilippou et al. | Protein corona fingerprinting to differentiate sepsis from non-infectious systemic inflammation | |
| JP2021530549A (en) | Identification of post-translational modifications in proteins by single molecule sequencing | |
| Peng et al. | Redox-based selective fluorometric detection of homocysteine | |
| Ulrich et al. | Uterine smooth muscle S-nitrosylproteome in pregnancy | |
| EP3110827A1 (en) | Method of detecting peroxynitrite using a complex of a saccharide and an arylboronate-based! fluorescent probe | |
| US20240060991A1 (en) | Methods of identifying the presence and/or concentration and/or amount of proteins or proteomes | |
| Yang et al. | A mitochondria-targeted ratiometric fluorescent probe for detection of SO2 derivatives in living cells and in vivo | |
| JP2011519021A (en) | Compounds and methods for labeling and affinity selection of protein molecules | |
| GokhanáCaglayan | A tri-serine tri-lactone scaffold for the quantification of citrate in urine | |
| Wa-Yi et al. | A highly selective quinolizinium-based fluorescent probe for cysteine detection | |
| Choi et al. | Cu2+-selective ratiometric fluorescence signaling probe based on the hydrolysis of dansylhydrazine | |
| RU2748540C1 (en) | Method for detecting sars-cov-2 virus by mass spectrometry | |
| GR20160100569A (en) | Method for the flurometric detection and quantification of the carbonyl groups of proteins | |
| Deng et al. | Trace determination of short-chain aliphatic amines in biological samples by micellar electrokinetic capillary chromatography with laser-induced fluorescence detection | |
| US20180284126A1 (en) | A method of detecting molecules in proximity to a target molecule in a sample | |
| KR20150140657A (en) | Methods and compositions for diagnosing preeclampsia | |
| US9809837B2 (en) | Method for evaluating suitability of duodenal fluid sample as sample for detecting pancreatic fluid-derived components | |
| Sundaram | Protein stains and applications | |
| CN108801993A (en) | A kind of hypochlorous kit of quick high-selectivity analysis | |
| Sundaram et al. | Protein stains and applications | |
| JP2002131232A (en) | Method and kit for detection of hydroxyproline |