FR3143031A1 - Nouveaux peptides et leur utilisation en tant que transporteurs pour l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne de nouveaux peptides de pénétration cellulaire comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8. L’invention concerne en outre des protéines de fusion comprenant lesdits peptides et une molécule d’intérêt pharmaceutique, diagnostic ou biotechnologique. Figure pour l’abrégé : Fig. 1
Description
L’invention relève du domaine des transporteurs peptidiques pour l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles. Elle concerne plus particulièrement des nouveaux peptides ou acides nucléiques codant pour de tels peptides, et leurs utilisations en tant que transporteurs pour l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles. Elle vise également la combinaison de tels peptides avec des molécules d’intérêt, notamment des polypeptides d’intérêt et l’utilisation d’une telle combinaison dans le traitement, le diagnostic ou la prévention de pathologies, notamment le cancer. L’invention concerne en outre une protéine de fusion comprenant un nouveau peptide ayant la propriété de pénétration cellulaire (dit « peptide de pénétration cellulaire » ou « Cell-penetrating peptide, CPP ») objet de la présente invention et un polypeptide d’intérêt, ainsi qu’un acide nucléique codant pour une telle protéine de fusion, un vecteur d’expression comprenant des acides nucléiques codant une telle protéine de fusion, mais aussi une cellule hôte comprenant un tel vecteur d’expression. Enfin, l’invention vise également une composition pharmaceutique comprenant un nouveau peptide objet de la présente invention et un polypeptide d’intérêt.
Les médicaments issus de biotechnologies, aussi appelés biomédicaments ou médicaments biologiques, ont une place importante dans le traitement des pathologies humaines. Ils comprennent notamment les protéines thérapeutiques (enzymes, hormones de croissance, anticorps monoclonaux, facteurs de croissance, vaccins recombinants, …), les acides nucléiques (ADN, siARN, ARNm, oligonucléotides, …), les peptides et les dérivés tels que les acides nucléiques peptidiques (ANP).
Dans certains cas, il est nécessaire d’utiliser des transporteurs pour que ces biomédicaments soient internalisés dans des cellules cibles. L’internalisation de molécules thérapeutiques dans des cellules fait l’objet de nombreuses recherches dans le but de trouver de nouveaux transporteurs, d’améliorer l’efficacité des transporteurs connus mais aussi des molécules thérapeutiques transportées, d’améliorer leur ciblage au niveau des cellules et de diminuer la dose efficace de certains traitements afin de diminuer le risque de toxicité.
Plusieurs familles de peptides transporteurs ont déjà été mis en évidence. Ces peptides naturels ou synthétiques appelés PTD (pour« Protein Transduction Domain »en terminologie anglo-saxonne) ou CPP (pour« Cell-Penetrating Peptides »en terminologie anglo-saxonne) possèdent la capacité de transporter et transférer dans les cellules des molécules telles que des peptides ou des acides nucléiques selon différents mécanismes d’internalisation cellulaires possible comme l’endocytose, la macropinocytose ou la formation de pores membranaires par exemple.
Dans leur publication de 2008“Expression and purification of Zebra Fusion Proteins and Applications for the Delivery of Macromolecules into Mammalian Cells”dans la revue Current Protocols in Protein Science, 54 : 18.11.1-18.11.29, Lenormand et Rothe décrivent une méthode de production de protéines de fusion comprenant un segment de la protéine ZEBRA et la protéine eGFP ou la β-galactosidase. Lesdites protéines de fusion sont capables d’être internalisées dans les cellules HeLa à une concentration de 0,01 µM à 0,3 µM.
La protéine ZEBRA est un activateur transcriptionnel issu du virus Epstein-Barr. C’est une protéine de 245 acides aminés comprenant une région de transactivation en N-terminal (TAD), un domaine de liaison à l'ADN (DBD) et une région de dimérisation (DIM) de type leucine zipper. Le domaine C-terminal de ladite protéine interagit avec le domaine leucine zipper conduisant à la formation d'une poche hydrophobe qui stabilise le complexe protéine ZEBRA/ADN.
Jusqu'à présent, les voies d'internalisation empruntées par les peptides de transport, connus de l'homme du métier, telles que l'endocytose et la macropinocytose, nécessitaient une dépense d'énergie importante afin de réaliser ce mécanisme de pénétration intracellulaire. De plus, le mécanisme d’endocytose conduit à l’internalisation des molécules par l’intermédiaire des endosomes dont le contenu subit une dégradation partielle. Seule, une petite fraction des peptides transportés est relarguée dans le cytosol, après rupture de la membrane des endosomes, leur permettant d'exercer leur action au niveau intracellulaire. Par conséquent, à l'échelle de production industrielle, afin d'assurer l'efficacité de la transduction de polypeptides d'intérêt, il est nécessaire de produire une grande quantité de transporteur et de polypeptides d'intérêt. Cela exige parfois une procédure de production ou de purification lourde qui n’est pas réalisable pour tous les types de polypeptides d'intérêt. Par ailleurs, pour certains polypeptides d’intérêt, il est nécessaire de limiter la quantité administrée en raison des risques de toxicité. Il apparait donc nécessaire d’utiliser des polypeptides de transport plus efficaces dans leur capacité de pénétration cellulaire afin de limiter ces risques.
La demande de brevet WO2011135222 divulgue l’utilisation d’un fragment peptidique issue de la protéine ZEBRA (de l’acide aminé en position 170 à l’acide aminé en position 220) en tant que peptide transporteur permettant d’effectuer une internalisation de polypeptides d’intérêt à des concentrations faibles et d’éviter la dégradation de ces polypeptides d’intérêt par un mécanisme de pénétration direct indépendant des endosomes.
La publication“MD11 mediated delivery of recombinant eIF3f induces melanoma and colorectal carcinoma cell death”de R. MARCHIONEet al. en 2015 divulgue l’utilisation d’un complexe formé de la protéine eIF3f fusionnée avec un peptide de pénétration cellulaire pour augmenter la quantité intracellulaire disponible de protéine eIF3f dans les cellules cancéreuses et activer leur apoptose. Le peptide de pénétration cellulaire utilisé est un fragment de séquence de la protéine ZEBRA (de l’acide aminé en position 178 à l’acide aminé en position 220) appelé MD11.
Il persiste encore aujourd’hui un besoin de trouver de nouveaux peptides transporteurs dont le potentiel de pénétration cellulaire est amélioré et dont la production est facilitée, ceux-ci devant permettre de transporter, à une concentration faible, avec une haute efficacité et une meilleure affinité, des molécules d'intérêt dans les cellules cibles tout en garantissant leur bonne stabilité et faible toxicité dans lesdites cellules.
La présente invention a pour objectif de fournir de nouveaux peptides comme transporteurs destinés à l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles. Ces nouveaux peptides sont des mutants d’un fragment peptidique de la protéine ZEBRA. Ce fragment dont la séquence est la séquence SEQ ID NO : 1 correspondant à la séquence peptidique de la protéine ZEBRA allant de l’acide aminé en position 178 à l’acide aminé en position 220 est connu et sera appelé MD11 dans la suite de la présente description. Il s’agit d’un peptide de pénétration cellulaire (CPP pour« cell-penetrating peptide »en terminologie anglo-saxonne) aussi appelé « peptide de transport » ou encore « peptide transporteur » ou plus simplement « transporteur » ou « vecteur de transport » (« Delivery system »en terminologie anglo-saxonne).
A cet effet, selon un premier aspect, la présente invention vise un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
De tels peptides peuvent être qualifiés de peptides transporteurs et sont destinés à l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles. Ils ont pour avantage de bénéficier d’une capacité de pénétration cellulaire au moins équivalente ou supérieure à celle du peptide transport MD11. Ils sont par ailleurs présents dans les cellules même lorsqu’elles sont traitées avec de faibles concentrations de l’ordre du nanomolaire ce qui corrobore une pénétration directe et sans intermédiaire dans les cellules pour les molécules qu’ils peuvent transporter. Enfin, aucune toxicité des peptides seuls pour les cellules cibles n’a pu être mise en évidence.
On entend par capacité de pénétration cellulaire l'efficacité d'internalisation de molécules d'intérêt, c’est à dire le pourcentage de cellules traitées contenant les molécules d'intérêt dans leur cytoplasme. Cette efficacité d'internalisation repose sur la détection des molécules d'intérêt dans les cellules transduites au moyen, par exemple, de la microscopie ou de la cytométrie en flux ou toutes autres techniques d’imagerie permettant de visualiser l’internalisation au niveau moléculaire, par exemple le transfert d’énergie par résonnance de bioluminescence (BRET pour« Bioluminescence Resonance Energy Transfer »en terminologie anglo-saxonne), le transfert d’énergie par résonnance de type Förster (FRET pour« Förster Resonance Energy Transfer »en terminologie anglo-saxonne, la microscopie électronique, la microscopie à force atomique (AFM pour« Atomic Force Microscopy »en terminologie anglo-saxonne), l’optogénétique,….
L'expression « transporteur » désigne une molécule capable de transporter et de transférer une autre molécule différente à travers la membrane plasmique pour lui permettre de pénétrer dans la cellule.
L’expression « l’internalisation d’une molécule d’intérêt dans les cellules cibles » désigne le passage d’une molécule d’intérêt de l’extérieur d’une cellule cible à l’intérieur de celle-ci.
Selon un deuxième aspect la présente invention vise une molécule d’acide nucléique codant un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
Les séquences d’acides nucléiques codant les peptides représentés par les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8 tels que décrit ci-dessus peuvent être déduites à partir de ces séquences d’acides aminés selon le principe de la dégénérescence du code génétique connu de l’homme du métier.
Selon un troisième aspect la présente invention vise un vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique codant un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8. Un tel vecteur d’expression peut être de tout type connu en lui-même pour une mise en œuvre en ingénierie génétique, notamment un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codant le peptide selon l’invention.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le vecteur comporte en outre les éléments de génie génétique, en particulier les origines de réplication et les promoteurs, permettant de contrôler la réplication autonome du vecteur dans l’organisme hôte et l’expression spécifique des peptides tels que décrits ci-dessus.
Selon un quatrième aspect la présente invention vise une cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique codant un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8, ou un vecteur d’expression comprenant une telle molécule d’acide nucléique. Les cellules hôtes peuvent être par exemple des cellules procaryotes telles queE. coliou lesBacillus, ou des cellules eucaryotes telles que les levures notammentSaccharomyces cerevisiaeetPichia pastoris, les champignons filamenteux, notammentTrichoderma reeseietAspergillus niger, les cellules d’insecte en utilisant les Baculovirus, ou des lignées cellulaires telles que CHO, HEK 293, Cos ou Per.C6.
Selon un cinquième aspect la présente invention vise l’utilisation d’un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8 ou d’une molécule d’acide nucléique codant pour un tel peptide ou d’un vecteur d’expression comprenant une telle molécule d’acide nucléique ou d’une cellule hôte comprenant une telle molécule d’acide nucléique ou un tel vecteur d’expression, pour l’obtention d’un transporteur destiné à l'internalisation d'une molécule d'intérêt dans des cellules cibles.
Les cellules susceptibles d'être les cellules cibles d'un processus d'internalisation mis en œuvre par un transporteur objet de la présente invention sont de préférence choisies parmi des cellules eucaryotes, notamment des cellules humaines. Ces cellules humaines peuvent être des cellules tumorales, telles que des cellules de mélanomes, des cellules de cancer du sein, des cellules de glioblastomes, des cellules de cancer du côlon, des cellules de lymphomes. Ces cellules humaines peuvent être également des cellules normales incluant des fibroblastes, cellules épithéliales, lymphocytes, cellules dendritiques, cellules musculaires comme les myocytes, les myoblastes et les myotubes par exemple…. Ces cellules humaines peuvent être également des cellules somatiques différenciées qui seront amenées à la dédifférenciation pour former des cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Pour cibler certaines lignées de cellules, des séquences peptidiques comme des peptides de guidage ou peptide de ciblage (respectivement« homing peptides »et« target peptides »en terminologie anglo-saxonne), des signaux de localisation nucléaire ou NLS (pour« nuclear localization signal» en terminologie anglo-saxonne), peuvent être greffées sur le transporteur selon l'invention.
Selon un sixième aspect la présente invention vise une combinaison comprenant un transporteur et une molécule d’intérêt, ledit transporteur étant un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
Dans des modes de réalisation particulier de la présente invention la molécule d’intérêt est de préférence une molécule d’intérêt biotechnologique, diagnostique ou thérapeutique. Une telle molécule d'intérêt est de préférence choisie parmi polypeptide, ADN, ARN, oligonucléotides, siARN, shARN miARN, ARN antisens, ou des acides nucléiques peptidiques (ANP).
Selon un septième aspect la présente invention vise une protéine de fusion comprenant un transporteur qui est un peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8, et une molécule d’intérêt qui est un polypeptide d’intérêt.
Par « protéine de fusion », on entend un polypeptide recombinant ou synthétique contenant au moins deux peptides, issus de deux protéines différentes, l’un lié à l’autre directement par liaison peptidique, ou par un linker peptidique, par exemple GSGG. Le polypeptide d’intérêt peut être lié à la partie N-terminale ou C-terminale du transporteur.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la protéine de fusion comprend ou consiste en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 23 à SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 39 à SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 47 à SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 55 à SEQ ID NO : 61.
Selon un huitième aspect la présente invention vise une molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion objet de la présente invention.
Selon un neuvième aspect la présente invention vise un vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion objet de la présente invention. Un tel vecteur d’expression peut être de tout type connu en lui-même pour une mise en œuvre en ingénierie génétique, notamment un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codant la protéine de fusion selon l’invention.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le vecteur comporte en outre les éléments de génie génétique, en particulier les origines de réplication et les promoteurs, permettant de contrôler la réplication autonome du vecteur dans l’organisme hôte et l’expression spécifique des protéines de fusion telles que décrites ci-dessus.
Selon un dixième aspect la présente invention vise une cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion objet de la présente invention ou un vecteur d’expression comprenant une telle molécule d’acide nucléique. Les cellules hôtes peuvent être par exemple des cellules procaryotes telles queE. coliou lesBacillus, ou des cellules eucaryotes telles que les levures notammentSaccharomyces cerevisiaeetPichia pastoris, les champignons filamenteux, notammentTrichoderma reeseietAspergillus niger, les cellules d’insecte en utilisant les Baculovirus, ou des lignées cellulaires telles que CHO, HEK 293, Cos, Per.C6.
Dans des modes de réalisation particulier de la combinaison ou de la protéine de fusion objet de la présente invention, la molécule d’intérêt est liée au transporteur par une liaison covalente ou non covalente, telle qu’une liaison ionique, une liaison hydrogène, ou une liaison hydrophobique. Lorsque la molécule d’intérêt est un polypeptide d’intérêt, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le polypeptide d'intérêt est lié au transporteur selon l'invention par une liaison peptidique directe.
Selon un onzième aspect la présente invention vise une composition pharmaceutique comprenant une combinaison ou une protéine de fusion objet de la présente invention. De préférence, la composition comprend un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Le choix d'un excipient et/ou d’un véhicule pharmaceutiquement acceptable est connu de l'homme du métier.
Selon un douzième aspect la présente invention vise la combinaison ou la protéine de fusion ou la composition pharmaceutique objet de la présente invention pour son utilisation dans le traitement, le diagnostic ou la prévention des cancers tels que mélanomes, cancer du sein, tumeurs du cerveau, glioblastomes, cancer du côlon, lymphomes.
Pour n’importe lequel des aspects de l’invention cités ci-avant, selon des modes de réalisations particuliers de l’invention, la molécule d’intérêt comprend ou consiste en un polypeptide d’intérêt choisi parmi un polypeptide codant la protéine eGFP représenté par la séquence SEQ ID NO : 17, un polypeptide codant la protéine eIF3f représenté par la séquence SEQ ID NO : 18, un polypeptide codant la protéine FERM représenté par la séquence SEQ ID NO : 19, un polypeptide codant tout ou partie de la protéine MDA-7 représenté respectivement par les séquences SEQ ID NO : 20 (protéine MDA-7 entière) et SEQ ID NO : 21 (protéine MDA-7 tronquée) et un polypeptide représenté par une séquence ayant 80%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 21.
Le pourcentage d'identité de séquences de peptides est déterminé par comparaison directe de deux séquences de molécules polypeptidiques, en déterminant le nombre de résidus d'acides aminés identiques dans les deux séquences, puis en le divisant par le nombre de résidus d'acides aminées de la séquence la plus longue des deux, et en multipliant le résultat par 100.
Les séquences d'acides nucléiques codant les polypeptides représentés par les séquences SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21 tels que décrit ci-dessus peuvent être déduites à partir de ces séquences d'acides aminés des peptides selon le principe de la dégénérescence du code génétique connu de l'homme du métier.
L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description suivante, donnée à titre d’exemple nullement limitatif, et faite en se référant aux figures qui représentent :
Dans la suite de la description, les séquences d'acides nucléiques codant les peptides et polypeptides représentés par les séquences d’acides aminés telles que décrites ci-après, peuvent être déduites à partir de ces séquences d'acides aminés selon le principe de la dégénérescence du code génétique connu de l'homme du métier.
Réalisation des plasmides MDmut et MD11
A partir de la séquence originale du peptide de pénétration cellulaire (CPP) MD11, les inventeurs ont créé 7 modifications de séquence numérotées de #2 à #8 selon l’éloignement par rapport à la séquence d’origine :
- SEQ ID NO : 2 appelée MDmut1DelCys qui correspond à la séquence KRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK,
- SEQ ID NO : 3 appelée MDmut2 qui correspond à la séquence RREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK,
- SEQ ID NO : 4 appelée MDmut2DelCys qui correspond à la séquence RREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK,
- SEQ ID NO : 5 appelée MDmut3 qui correspond à la séquence
KRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL, - SEQ ID NO : 6 appelée MDmut3DelCys qui correspond à la séquence KRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL,
- SEQ ID NO : 7 appelée MDmut4 qui correspond à la séquence RREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL,
- SEQ ID NO : 8 appelée MDmut4DelCys qui correspond à la séquence
RREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL.
Les fragments d’ADN codant chaque CPP mutantMDmutsont obtenus par PCR et insérés dans le vecteur d’expression pET15b qui permet d’exprimer dans des bactéries, les peptides dont l'extrémité N-terminale est liée à une étiquette de 6-histidine, tous les plasmides étant construits selon la même organisation d’éléments de génie génétiques entourant la séquence du CPP.
La séquence de MD11 numérotée #1 et correspondant à la séquence KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQ (SEQ ID NO : 1) est également insérée dans un plasmide d’expression pET_15b comprenant la même organisation d’éléments de génie génétique que les plasmides comprenant les mutants MDmut.
L’organisation des éléments de génie génétique est la suivante dans chaque plasmide d’expression dans le sens 5’ vers 3’ :
NdeI Res Site – His Tag – TEV seq – site de clivage MMP2 – MD Seq – XhoI Res Site
dans laquelle :
NdeI Res Site = site de restriction NdeI
His Tag = étiquette polyhistidine
TEV seq = séquence de clivage de la protéase Tev
Site de clivage MMP2 = séquence de clivage par la métalloprotéase 2 (ciblage des tumeurs)
MD Seq = la séquence MD11 ou MDmut
XhoI Res Site = site de restriction XhoI
Les plasmides ont tous été vérifiés par séquençage en double sens au niveau de la séquence d’insertion des éléments génétiques codant pour les protéines de fusion d’intérêt.
Avec cette organisation des éléments de génie génétique on obtient ainsi les séquences suivantes de peptides de pénétration cellulaire (CPP) :
- SEQ ID NO : 9 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQ pour le CPP comprenant la séquence MD11,
- SEQ ID NO : 10 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK pour le CPP comprenant la séquence MDmut1DelCys,
- SEQ ID NO : 11 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK pour le CPP comprenant la séquence Mdmut2,
- SEQ ID NO : 12 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK pour le CPP comprenant la séquence Mdmut2DelCys,
- SEQ ID NO : 13 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL pour le CPP comprenant la séquence Mdmut3, - SEQ ID NO : 14 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL pour le CPP comprenant la séquence Mdmut3DelCys,
- SEQ ID NO : 15 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL pour le CPP comprenant la séquence Mdmut4,
- SEQ ID NO : 16 qui correspond à la séquence
MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQL pour le CPP comprenant la séquence Mdmut4DelCys.
Réalisation des plasmides des polypeptides d’intérêt
Pour l’obtention des séquences des molécules d’intérêt rapportrices, ici des polypeptides des protéines eGFP (pour« enhanced green fluorescent protein »en terminologie anglo-saxonne) à usage biotechnologique et eIF3f (pour« eukaryotic Translation Initiation Factor 3 subunit F »en terminologie anglo-saxonne), FERM (correspondant au domaine FERM) et MDA-7 (pour« Melanoma Differentiation Associated 7 »en terminologie anglo-saxonne) entière ou tronquée, aussi connue sous le nom IL-24, à usage thérapeutique, à mettre en fusion de nos CPP-mutants Mdmut, 5 plasmides, dits donneurs, contenant les inserts d’intérêt dont les séquences des polypeptides d’intérêt sont les suivantes ont été utilisés :
- SEQ ID NO : 17 correspondant au polypeptide MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK de la protéine eGFP,
- SEQ ID NO : 18 correspondant au polypeptide ATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL de la protéine eIF3f,
- SEQ ID NO : 19 correspondant au polypeptide MPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER de la protéine FERM,
- SEQ ID NO : 20 correspondant au polypeptide NFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL de la protéine MDA-7,
- SEQ ID NO : 21 correspondant au polypeptide GQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL de la protéine MDA-7 tronquée.
Les inventeurs disposent de ces séquences (SEQ ID NO : 17 à SEQ ID NO : 21) flanquées des sites de restriction XhoI et BamHI dans un plasmide pET15b. Elles ont été préalablement séquencées grâce au primer commercial pET_RP et leur profil de restriction a également été analysé par digestions simples et doubles afin de s’assurer de la possibilité de les extraire sans impacter la séquence qui devra être traduite.
Création de la banque de plasmides
Tout d’abord, les 8 plasmides Mdmut et les 5 plasmides donneurs des polypeptides d’intérêt ont été transformés dans des bactériesE. coliXL10 Gold. Pour cela, 25µl de bactéries ont été transformées avec 50 ng de plasmides par choc thermique 30 min dans la glace puis 40 sec à 42°C avant un passage dans la glace. Cette étape a été suivie d’une mise en culture liquide dans 100µL de milieu de culture SOC à 37°C pendant 1h puis d’un étalement sur boite de Pétri contenant du milieu LB (Lysogeny Broth) – Agar – Ampicilline et d’une incubation à 37°C sur la nuit. Le lendemain, une colonie isolée a été ensemencée dans 5 ml de milieu LB-Ampicilline et incubée à 37°C – 150 rpm sur la nuit. 2 ml de culture ont ensuite été centrifugés à 11000g et les plasmides ont été purifiés et élués dans 25µL d’eau grâce au kit Miniprep de Macherey Nagel selon le protocole du fabricant.
Les plasmides ainsi obtenus ont été préparés en vue du sous-clonage après double digestion par les enzymes de restriction XhoI et BamHI 2 µg de plasmide ont donc été digéré par 5 unités de chaque enzyme de restriction pendant 3h à 37°C. La migration des produits de digestion dans un gel d’agarose 0.6% - TAE 0.5X - Gel Red 1X pendant 1h30 à 75V a été suivi d’une purification des bandes d’intérêt grâce au kit PCR and Gel clean Up de Macherey Nagel selon le protocole du fabricant.
Les plasmides MDmut et MD11, qu’on peut qualifier de receveurs, ont donné leur squelette contenant les séquences CPP-mutants ou MD11 et les plasmides comprenant les polypeptides d’intérêt, qualifiés de donneurs, ont donné leur insert contenant la séquence des polypeptides d’intérêt.
Les inserts correspondant aux polypeptides d’intérêt ont pu être sous-clonés dans chacun des 8 plasmides MDmut, créant ainsi une nouvelle banque de 40 plasmides recombinants permettant la synthèse des protéines de fusion. Pour cela, une ligation a été effectué avec 3 fold molaire de chaque insert de polypeptides d’intérêt et 50 ng de plasmide mutant grâce à une T4 ADN ligase en 10 min à 22°C. Cette étape a été suivie de la transformation de 25µL de bactéries XL10 Gold avec la moitié du produit de ligation selon le même protocole que précédemment cité.
Les colonies transformées par les plasmides recombinants ont été pré-sélectionnées grâce à des PCR sur colonie. Pour réaliser cela, une enzyme commerciale au 2X prête à l’emploi a été utilisée en y diluant de moitié 10 μM d’amorces sens et antisens dans de l’eau stérile. Un piquage au cône de toutes les colonies de la boite a été effectué afin de contaminer 20 μl de mix PCR avant lancement du thermocycleur selon un programme adapté aux amorces (Lid = 110°C ; 1 : 3min – 94° ; 2 : 30 sec – 94° ; 3 : 30 sec – 60°C ; 4 : 1 min – 72°C ; 5 : GOTO 2 x 25 repeats ; 6 : 5min – 72°C ; 7 : Hold – 16°C). Par la suite la migration des produits PCR dans un gel d’agarose 1.5% - TAE 0.5X – Gel Red 1X pendant 40 min à 100V a été effectuée.
Après migration des produits PCR sur gel d’agarose, les échantillons issus des piquages de colonie ont été comparés aux échantillons contrôle positif (plasmide donneur) ou contrôle négatif (Eau). Une ou deux colonies ayant donné un amplicon de taille et d’aspect comparable au contrôle positif, ont ensuite été mises en culture afin d’amplifier et de purifier par l’utilisation d’un kit commercial « miniprep » les plasmides pour les envoyer au séquençage en double sens (amorces T7 et pET_RP) pour vérification de l’alignement de leur séquence par rapport à la séquence théorique.
De nouvelles bactéries E. coli XL10 Gold ont ensuite été retransformées à partir des échantillons plasmidiques validés en séquençage. Cette nouvelle transformation a permis la constitution d’un stock glycérol (congélation à -80°C de 750μl de culture sur la nuit de bactéries XL10 avec 25% de glycérol stérile) et d’un stock de plasmides recombinants concentrés, et purifiés par l’utilisation du kit « midiprep » Macherey Nagel selon le protocole du fabricant.
Dans chaque plasmide recombinant l’organisation des éléments de génie génétique est la suivante dans le sens 5’ vers 3’ :
NdeI Res Site – His Tag – TEV seq – site de clivage MMP2 – MD Seq - XhoI – PolyPep - BamHI
dans laquelle :
NdeI Res Site = site de restriction NdeI
His Tag = étiquette polyhistidine
TEV seq = séquence de clivage de la protéase Tev
Site de clivage MMP2 = séquence de clivage par la métalloprotéase 2 (ciblage des tumeurs)
MD Seq = la séquence MD11 (SEQ ID NO : 1) ou une séquence MDmut (SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 8)
XhoI = site de restriction XhoI
PolyPep = la séquence du polypeptide d’intérêt (SEQ ID NO : 17 à SEQ ID NO : 21)
BamHI = site de restriction BamHI
On obtient ainsi les séquences suivantes de protéines de fusion codées par les plasmides recombinants ainsi créés :
- SEQ ID NO : 22 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11, en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 23 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut1DelCys en fusion avec la protéine eGFP ( SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 24 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 11) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 25 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 26 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 27 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 28 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 29 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK pour le CPP (SEQ ID NO : 16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine eGFP (SEQ ID NO : 17).
- SEQ ID NO : 30 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11 en fusion avec la protéine eIF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 31 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut1DelCys en fusion avec la protéine eIF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 32 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 11) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine eIF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 33 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine eIF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 34 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine eIF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 35 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine eIF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 36 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine eIF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 37 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEATPAVPVSAPPATPTPVPAAAPASVPAPTPAPAAAPVPAAAPASSSDPAAAAAATAAPGQTPASAQAPAQTPAPALPGPALPGPFPGGRVVRLHPVILASIVDSYERRNEGAARVIGTLLGTVDKHSVEVTNCFSVPHNESEDEVAVDMEFAKNMYELHKKVSPNELILGWYATGHDITEHSVLIHEYYSREAPNPIHLTVDTSLQNGRMSIKAYVSTLMGVPGRTMGVMFTPLTVKYAYYDTERIGVDLIMKTCFSPNRVIGLSSDLQQVGGASARIQDALSTVLQYAEDVLSGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIVPDDFETMLNSNINDLLMVTYLANLTQSQIALNEKLVNL pour le CPP (SEQ ID NO : 16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine eIF3f ( SEQ ID NO : 18).
- SEQ ID NO : 38 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11 en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 39 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut1DelCys en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 40 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 11) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 41 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 42 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 43 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 44 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO :15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 45 qui correspond à la séquence MMHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEPKPINVRVTTMDAELEFAIQPNTTGKQLFDQVVKTIGLREVWYFGLHYVDNKGFPTWLKLDKKVSAQEVRKENPLQFKFRAKFYPEDVAEELIQDITQKLFFLQVKEGILSDEIYCPPETAVLLGSYAVQAKFGDYNKEVHKSGYLSSERLIPQRVMDQHKLTRDQWEDRIQVWHAEHRGMLKDNAMLEYLKIAQDLEMYGINYFEIKNKKGTDLWLGVDALGLNIYEKDDKLTPKIGFPWSEIRNISFNDKKFVIKPIDKKAPDFVFYAPRLRINKRILQLCMGNHELYMRRRKPDTIEVQQMKAQAREEKHQKQLER pour le CPP (SEQ ID NO : 16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine FERM (SEQ ID NO : 19).
- SEQ ID NO : 46 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11 en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 47 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut1DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 48 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 11) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 49 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 50 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 51 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 52 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 53 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLENFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNNTSCRLLQQEGLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 (SEQ ID NO : 20).
- SEQ ID NO : 54 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 9) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MD11 en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21).
- SEQ ID NO : 55 qui correspond à la séquence MMHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 10) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut1DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21).
- SEQ ID NO : 56 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 11) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2 en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21).
- SEQ ID NO : 57 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 12) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut2DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21).
- SEQ ID NO : 58 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKCRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 13) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3 en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21).
- SEQ ID NO : 59 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPKRYKNRVASRKRAKFKQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 14) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut3DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21).
- SEQ ID NO : 60 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKCRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 15) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4 en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21).
- SEQ ID NO : 61 qui correspond à la séquence MHHHHHHHHENLYFQSGALGLPRREKNRVAARKRAKFKNAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLLEGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNHHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL pour le CPP (SEQ ID NO : 16) comprenant les éléments de génie génétique et la séquence MDmut4DelCys en fusion avec la protéine MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 21).
Protocoles de production et purification des protéines de fusion
Les protocoles ci-après ont été mis au point par la technique « d’essais-erreur » sur chacun des paramètres suivants :
- Production : souche bactérienne de E. coli, temps, température, volume de culture, condition de stress (addition éthanol à 1, 3 ou 5%), densité optique d’induction de la production, concentration en inducteur de la production (IPTG, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) ;
- Lyse : méthode chimique et/ou mécanique, temps, puissance, répétition ;
- Purification : solubilisation ou non, tampon, affinité, pureté, type de colonne, conditions de renaturation, dialyse.
Production des protéines de fusion comprenant un CPP et le polypeptide eGFP
Les conditions optimales de production et purification des protéines de fusion comprenant un CPP mutant (MDmut) ou MD11 et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 22 à SEQ ID NO : 29) ont été définies telles que décrites ci-après.
Le meilleur rendement de production a été observé après culture de bactéries E. coli BL21(DE3) transformées par les plasmides recombinants codant les séquences SEQ ID NO : 22 à SEQ ID NO : 29 sur la nuit à 16°C après induction de la production avec 0,5 mM d’IPGT ajouté à DO260=1.
La lyse des bactéries a été optimale en 2 temps dans un tampon Tris – NaCl – imidazole. Tout d’abord, une lyse chimique au lysozyme à 1mg/ml pendant 30 min sur une roue pour une agitation douce a été réalisée à 4°C afin de préserver l’intégrité des protéines. Puis une lyse mécanique par 6 cycles de 30 sec de sonication d’abord 3 cycles à 30% de puissance puis 3 cycles à 70% de puissance a suivi, les lysats bactériens ayant été remis dans la glace au minimum 30 sec entre chaque sonication.
Après centrifugation, la fraction soluble a été passée sur colonne de Nickel et les protéines ont pu être éluées par compétition avec 500mM d’imidazole.
La pureté, la qualité et la quantité des protéines ont été analysées par SDS-PAGE et Western blot. Pour cela, 15 µl d’échantillon sont mélangés à 5 µL de tampon réducteur 4X et migrés dans un gel d’acrylamide à 12% pendant 1h à 30mA-150V. Les gels sont soit colorés au bleu de Coomassie pendant 2h à température ambiante (TA) sous agitation puis décolorés à l’eau, soit transférés sur une membrane de nitrocellulose 0.2 µm par le système Bio-Rad Mini-protean selon le protocole du fabricant sur le programme poids moléculaire mixte ou « Mixed Molecular Weight » en terminologie anglo-saxonne. Les membranes ont ensuite été bloquées au lait écrémé 5% - TBS 1X tween 0.1% pendant 2h à TA sous agitation puis incubées avec un Anticorps anti-His HRP (pour «HorseRadish Peroxidase »en terminologie anglo-saxonne) dilué au 1/50000 dans la solution de blocage. L’anticorps anti-His se fixe sur l’étiquette poly-histidine des protéines de fusion et HRP permet sa détection au ChemiDoc Imaging System (BioRad) par chimioluminescence.
La coloration au bleu de Coomassie des gels d’acrylamide nous a permis de constater que plus le rendement de production est important, moins la solubilisation des protéines est efficace. Cependant, les quantités de protéines solubilisées restent très importantes et suffisantes pour la purification de plusieurs milligrammes de protéines selon le protocole.
Le western-blot, quant à lui, nous a indiqué la présence d’agrégats protéiques dans les échantillons qui ont pu être éliminés par l’addition d’une étape de centrifugation à très haute vitesse.
Production des protéines de fusion comprenant un CCP et le polypeptide eIF3f
Les conditions optimales de production et purification des protéines de fusion comprenant un CPP mutant (MDmut) ou MD11 et le polypeptide eIF3f (SEQ ID NO : 30 à SEQ ID NO : 37) sont définies ci-après.
Le meilleur rendement de production a été observé après culture de bactéries E. coli BL21(DE3) transformées par les plasmides recombinants codant les séquences SEQ ID NO : 30 à SEQ ID NO : 37 sur la nuit à 16°C après induction de la production à 0,5 mM d’IPGT ajouté à DO=1.
La lyse des bactéries a été optimale en 2 temps dans un tampon MOPS – NaCl – imidazole. Tout d’abord, une lyse chimique au lysozyme à 1mg/ml pendant 30 min sur une roue pour une agitation douce a été réalisée à 4°C afin de préserver l’intégrité des protéines. Puis une lyse mécanique par 5 cycles de 30 sec de sonication à 70% de puissance a suivi, les lysats bactériens ayant été remis dans la glace au minimum 30 sec entre chaque sonication.
Aucun des protocoles testés n’a permis d’obtenir une quantité suffisante de protéines sous forme soluble. Après centrifugation, la fraction soluble a donc été éliminée et les corps d’inclusions ont été lavés dans 3 différents tampons de lavage (MOPS 20mM – NaCl 2M – Cystéine 15mM ; MOPS 20mM – NaCl 250mM – Cystéine 15mM – Tritton X100 2% ; MOPS 20mM – NaCl 250mM – Cystéine 15mM) puis solubilisés en condition dénaturante (MOPS 20mM – NaCl 250mM – Cystéine 15mM – Urée 8M). Les protéines ont été purifiées sur colonne de Nickel par compétition à l’imidazole (MOPS 20mM – NaCl 250mM – Cystéine 15mM – Urée 8M – Imidazole 500mM), les protéines ont été renaturées par la méthode de dilution au goutte à goutte (Na Citrate 50mM – MgCl22mM – DTT 2mM – NaCl 50mM – L-Argine 500mM – Tween 20 0,5%) puis dialysées en 2 temps (Na Citrate 50mM – MgCl22mM – DTT 2mM – NaCl 50mM – L-Argine 50mM – N-Lauryl Sarcosine 0,01% ; Na Citrate 50mM – NaCl 50mM – Glycérol 10%) pour être en solution dans un tampon compatible avec les expériences in cellulo et in vivo.
La pureté et la qualité des protéines ont été analysées par SDS-PAGE et Western blot avec le même protocole que celui utilisé pour les protéines de fusions comprenant la protéine eGFP et décrit dans la section précédente. Les échantillons de traitement ont quant à eux été dosés par la méthode microBCA selon le protocole du fabricant.
Dans les échantillons d’élution, de refolding et les dialysats une seule bande, marquée par l’anticorps anti-histidine en western blot, de 50kDa a été mise en évidence par la coloration du gel d’acrylamide au bleu de Coomassie. Les échantillons de traitement utilisés pour les expériences in vitro sont donc pures et de bonne qualité. En effet, l’absence de bande surnuméraire en Western blot a démontré l’absence de protéine dégradées et/ou agrégées dans les échantillons.
Production des protéines de fusion comprenant un CCP et le polypeptide MDA-7 ou MDA-7 tronquée
Les conditions optimales de production et purification des protéines de fusion comprenant un CPP mutant (MDmut) ou MD11 et le polypeptide MDA-7 (SEQ ID NO : 46 à SEQ ID NO : 53) ou le polypeptide de MDA-7 tronquée (SEQ ID NO : 54 à SEQ ID NO : 61) sont définies ci-après.
Le meilleur rendement de production a été observé après culture de bactéries E. coli BL21(DE3) transformées par les plasmides recombinants codant les séquences SEQ ID NO : 46 à SEQ ID NO : 61 sur la nuit à 16°C après induction de la production avec 1M d’IPGT ajouté à DO2 60>1.
La lyse des bactéries a été optimale en 2 temps dans un tampon Tris 50mM – NaCl 250 mM – imidazole 5 mM. Tout d’abord, une lyse chimique au lysozyme à 1mg/ml pendant 30 min sur une roue pour une agitation douce a été réalisée à 4°C afin de préserver l’intégrité des protéines. Puis une lyse mécanique par 5 cycles de 30 sec de sonication à 70% de puissance a suivi, les lysats bactériens ayant été remis dans la glace au minimum 30 sec entre chaque sonication.
Aucun des protocoles testés n’a permis d’obtenir une concentration suffisante de protéines sous forme soluble. Après centrifugation, la fraction soluble a donc été éliminée et les corps d’inclusions ont été lavés dans 3 différents tampons de lavage (Tris 50 mM – β-mercaptoéthanol 20 mM – Tritton X100 2% ; Tris 20 mM – β-mercaptoéthanol 20 mM ; Tris 50 mM – DTT 20mM – Guanidine HydroChloride 6M) puis solubilisés en condition dénaturante de Guanidine. Les protéines ont été purifiées sur colonne de Nickel par compétition à l’imidazole (Tris 50 mM – Guanidine HydroChloride 6M - Imidazole 500mM) et renaturées par la méthode de dilution au goutte à goutte (Tris 50 mM – Guanidine HydroChloride 1,4M – NaCl 50mM – L-Argine 500mM – Titton X100 0,5%) puis dialysées en 2 temps pour être en solution (Tris 50 mM – Guanidine HydroChloride 0,75M – NaCl 50mM – L-Argine 50mM – Tween20 0,5% ; Tris 50mM – NaCl 50 mM – Glycérol 10%) dans un tampon compatible avec les expériences in cellulo et in vivo.
La pureté et la qualité des protéines ont été analysées par SDS-PAGE et Western blot puis ces dernières ont été dosées par la méthode microBCA. Une seule bande, marquée par l’anticorps anti-histidine en western blot, a été mise en évidence par la coloration du gel d’acrylamide au bleu de Coomassie. Les échantillons de protéines de fusion CPP couplé au polypeptides MDA7 entier ou tronqué sont donc pures et de bonne qualité. En effet, l’absence de bande surnuméraire en Western blot a démontré l’absence de protéine dégradées et/ou agrégées dans les échantillons.
Analyse du potentiel de pénétration cellulaire des CPP
Afin de démontrer le haut potentiel de pénétration intracellulaire des CPP mutants MDmut, des analyses de cytométrie en flux et en microscopie à fluorescence ont été réalisées.
Les traitements par les protéines de fusion comprenant un CPP mutants et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 23 à SEQ ID NO : 29) ont été comparé au traitement par la eGFP seule, non lié à un transporteur, et aux traitements par les protéines de fusion comprenant soit le CPP MD11 (SEQ ID NO : 1) sans les éléments nouveaux de génie génétique et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 17), soit comprenant le CPP MD11 avec les nouveaux éléments de génie génétiques et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 22).
Pour dénombrer le nombre de cellules fluorescentes après traitement, des cellules HEK293 et B16-Ova ont été ensemencées puis traitées à 60% de confluence environ par 200 nM de protéines de fusion respectives en l’absence de sérum bovin pendant 4h. Elles ont ensuite été supplémentées avec 5% de sérum bovin et incubées sur la nuit. Le lendemain les cellules ont été trypsinées puis lavées au PBS 1X et passées au FACS pour analyses.
Un échantillon cellulaire non traité et supplémenté en Iodure de Propridium à 1μg/ml, a permis de calibrer le blanc et la plage de cellules vivantes. Pour les échantillons traités, un minimum de 25000 cellules vivantes a été analysé pour leur fluorescence verte.
Les résultats d’analyse indiquent le pourcentage de cellules GFP positives après traitement et sont présentés en dans laquelle :
- MD11-eGFP correspond à la protéine de fusion contrôle comprenant la séquence du CPP MD11 mais sans les éléments de génie génétique (SEQ ID NO : 1) et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 17) ;
- #1A-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MD11 avec les éléments de génie génétique et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 22) ;
- #2B-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut1DelCys et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 23) ;
- #3C-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut2 et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 24) ;
- #4D-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut2DelCys et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 25) ;
- #5E-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut3 et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 26) ;
- #6F-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut3DelCys et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 27) ;
- #7G-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut4 et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 28) ;
- #8H-eGFP correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut4DelCys et le polypeptide eGFP (SEQ ID NO : 29).
La cytométrie en flux nous a montré que globalement, dans les conditions de traitements actuelles avec un nombre de réplicas compris entre 3 et 5 par condition, le pouvoir de pénétration des protéines est plus important dans les cellules HEK293 que dans les cellules tumorales B16-Ova (B16). Pour les protéines de fusion MD11-eGFP et #5E-eGFP, nous sommes à la limite de la significativité p=0,057. Le même défaut de pénétration, par rapport à MD11-eGFP, est observé pour le mutant #4D-eGFP dans les deux lignées cellulaires.
Dans les cellules HEK293, les protéines de fusion comprenant un CPP mutant et le polypeptide eGFP ont une capacité de pénétration cellulaire préservée, dont une tendance non significative à la hausse pour #3C-eGFP, #5E-eGFP, #6F-eGFP et #7G-eGFP par rapport au contrôle (MD11-eGFP) avec un taux de cellules GFP-positives compris entre 73% et 82% contre 57%.
Dans les cellules B16-Ova (B16), la capacité de pénétration des mutants #3C-eGFP, #5E-eGFP, #6F-eGFP et #7G-eGFP est équivalente à celle de MD11-eGFP. En revanche la capacité de pénétration cellulaire des mutants #2B-eGFP, #4D-eGFP et #8H-eGFP est significativement plus faible entre 15% et 20% contre plus de 41%.
Par ailleurs, il est convenu que les protéines de fusion MD11-eGFP ou #1A-eGFP fournissent ici des résultats équivalents en tous points malgré le réarrangement d’éléments de génie génétique.
En parallèle, les mêmes cellules (HEK293 et B16-Ova) ont également été ensemencées sur des lames de verre équipées de chambres de culture puis traitées par les protéines de fusion MD11-eGFP, #1A-eGFP, #3C-eGFP, #5E-eGFP, #7G-eGFP ou le tampon pdt 4h en l’absence de sérum. Les cellules ont ensuite été lavées au PBS 1X puis à l’héparine et fixées au Paraformaldéhyde et observées au microscope à fluorescence. 5 plans focaux successifs espacés de 2µm ont été capturés afin de mettre en évidence la localisation intracellulaire des protéines.
Les images représentatives de la fluorescence des cellules après traitement sont données en .
L’efficacité de pénétration cellulaire des différents mutants étant inégale, certains signaux fluorescents ont dû être « forcés » pour être visibles mais tous ont été repérés comme intracellulaire. Cependant, les agrégats protéiques visualisés sur certaines images semblent quant à eux fixés aux membranes.
Analyse du potentiel thérapeutique antitumoral de la protéine de fusion comprenant CPP et polypeptide de eIF3f
Afin de démontrer le potentiel thérapeutique des CPP mutants MDmut fusionnés au facteur de régulation de la traduction eIF3f (SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 37) sur le mélanome, l’étude s’est poursuivie avec toujours les cellules HEK293 et B16-Ova.
La viabilité a été testée au Prestoblue®. Pour cela, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à bords noirs et fonds transparents puis, le lendemain, traitées à 60% de confluence à 0,25X de sérum de veau fœtal (SVF). Afin de calculer la concentration inhibitrice médiane (IC50) de chaque protéine de fusion, celles-ci ont été diluées selon une large gamme de concentration comprise entre 15 et 100 nM et incubées 24h ou 48h.
Les courbes de viabilité des cellules B16-Ova (B16) et HEK293 après 24h et 48h de traitement par les protéines de fusion sont illustrées en dans laquelle :
- 1E correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MD11 et le polypeptide eIF3f (SEQ ID NO : 30) ;
- 3E correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut2 et le polypeptide eIF3f (SEQ ID NO : 32) ;
- 5E correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut3 et le polypeptide eIF3f (SEQ ID NO : 34) ;
- 7E correspond à la protéine de fusion comprenant la séquence du CPP MDmut4 et le polypeptide eIF3f (SEQ ID NO : 36).
Ces tests ont montré que le CPP mutant 3E s’avère le moins efficace tant sur les cellules B16 que HEK293 après 24 ou 48h. L’IC50 à 24h des autres CPP mutants est identique à environ 50 nM pour les cellules B16 et 30 nM pour les HEK293. L’IC50 à 48h n’est pas significativement différente non plus et située entre 25 et 35 nM, concentration extrêmement faible qui corrobore une action directe et sans intermédiaire des protéines de fusion dans les cellules.
De manière plus générale, il est à noter que les modes de mise en œuvre et de réalisation de l’invention considérés ci-dessus ont été décrits à titre d’exemples non limitatifs et que d’autres variantes sont par conséquent envisageables.
Claims (15)
- Peptide comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 8.
- Molécule d’acide nucléique codant un peptide selon la revendication 1.
- Vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique codant un peptide selon la revendication 1.
- Cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique selon la revendication 2 ou un vecteur d’expression selon la revendication 3.
- Utilisation d’un peptide selon la revendication 1 ou d’une molécule d’acide nucléique selon la revendication 2 ou d’un vecteur d’expression selon la revendication 3 ou d’une cellule hôte selon la revendication 4, pour l’obtention d’un transporteur destiné à l'internalisation d'une molécule d'intérêt dans des cellules cibles.
- Combinaison comprenant un transporteur et une molécule d’intérêt, ledit transporteur étant un peptide selon la revendication 1.
- Protéine de fusion comprenant un transporteur qui est un peptide selon la revendication 1, et une molécule d’intérêt qui est un polypeptide d’intérêt.
- Molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon la revendication 7.
- Vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique codant pour la protéine de fusion selon la revendication 7.
- Cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique selon la revendication 8 ou un vecteur d’expression selon la revendication 9.
- Composition pharmaceutique comprenant une combinaison selon la revendication 6 ou une protéine de fusion selon la revendication 7 ainsi qu’un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
- Combinaison selon la revendication 6 ou protéine de fusion selon la revendication 7 ou composition pharmaceutique selon la revendication 11, pour son utilisation dans le traitement, le diagnostic ou la prévention de pathologies, notamment de cancers tels que mélanomes, cancer du sein, tumeurs du cerveau, glioblastomes, cancer du côlon, lymphomes.
- Combinaison selon la revendication 6, protéine de fusion selon la revendication 7, molécule d’acide nucléique selon la revendication 8, vecteur d’expression selon la revendication 9, cellule hôte selon la revendication 10 ou composition pharmaceutique selon la revendication 11 , dans laquelle la molécule d’intérêt comprend ou consiste en un polypeptide d’intérêt choisi parmi un polypeptide codant la protéine eGFP représenté par la séquence SEQ ID NO : 17, un polypeptide codant la protéine eIF3f représenté par la séquence SEQ ID NO : 18, un polypeptide codant la protéine FERM représenté par la séquence SEQ ID NO : 19, un polypeptide codant la protéine MDA-7 représenté par la séquence SEQ ID NO : 20, un polypeptide codant la protéine MDA-7 tronquée représenté par la séquence SEQ ID NO : 21 et un polypeptide représenté par une séquence ayant 80%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 21.
- Combinaison ou protéine de fusion ou composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 12, dans laquelle la molécule d’intérêt comprend ou consiste en un polypeptide d’intérêt choisi parmi un polypeptide codant la protéine eGFP représenté par la séquence SEQ ID NO : 17, un polypeptide codant la protéine eIF3f représenté par la séquence SEQ ID NO : 18, un polypeptide codant la protéine FERM représenté par la séquence SEQ ID NO : 19, un polypeptide codant la protéine MDA-7 représenté par la séquence SEQ ID NO : 20, un polypeptide codant la protéine MDA-7 tronquée représenté par la séquence SEQ ID NO : 21 et un polypeptide représenté par une séquence ayant 80%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 et SEQ ID NO : 21.
- Protéine de fusion selon la revendication 7 comprenant ou consistant en une séquence d’acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 23 à SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 31 à SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 39 à SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 47 à SEQ ID NO : 53 et SEQ ID NO : 55 à SEQ ID NO : 61.
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