FR3121577A1 - Stabilizing composition, process using said composition for the manufacture of control products for analyzes of biological samples in mammals, and control products resulting from the implementation of said process - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne une composition stabilisante destinée à être utilisée dans le cadre d’un procédé de traitement et de stabilisation des cellules d’eucaryotes pour la fabrication et la réalisation d’échantillons ou de produits de contrôles, destinés aux laboratoires d’analyses médicales ou vétérinaires pour les diverses analyses de prélèvements biologiques issus de l’homme et/ou de l’animal, et en particulier de prélèvements de liquides biologiques (sang, urine, liquides d’épanchement, etc.), le procédé de traitement et de stabilisation desdites cellules utilisant ladite composition, et les produits de contrôle issus de la mise en œuvre dudit procédé.The invention relates to a stabilizing composition intended to be used in the context of a process for the treatment and stabilization of eukaryotic cells for the manufacture and production of samples or control products, intended for medical analysis laboratories. or veterinarians for the various analyzes of biological samples taken from humans and/or animals, and in particular samples of biological fluids (blood, urine, effusion fluids, etc.), the method of treatment and stabilization of said cells using said composition, and the control products resulting from the implementation of said method.
Description
L’invention concerne une composition stabilisante destinée à être utilisée dans le cadre d’un procédé de traitement et de stabilisation des cellules d’eucaryotes pour la fabrication et la réalisation d’échantillons ou produits de contrôle, destinés aux laboratoires d’analyses médicales ou vétérinaires pour les diverses analyses de prélèvements biologiques issus de l’homme et/ou de l’animal, et en particulier de prélèvements de liquides biologiques (sang, urine, liquides d’épanchement, etc.).The invention relates to a stabilizing composition intended to be used in the context of a process for the treatment and stabilization of eukaryotic cells for the manufacture and production of samples or control products, intended for medical analysis laboratories or veterinarians for the various analyzes of biological samples taken from humans and/or animals, and in particular samples of biological fluids (blood, urine, effusion fluids, etc.).
L’invention concerne également le procédé utilisant ladite composition pour le traitement et la stabilisation desdites cellules d’eucaryotes. Enfin, elle vise aussi les échantillons ou produits de contrôle issus de la mise en œuvre de ce procédé.The invention also relates to the method using said composition for the treatment and stabilization of said eukaryotic cells. Finally, it also covers samples or control products resulting from the implementation of this process.
Les laboratoires d’analyses de biologie médicale, qu’il s’agisse de laboratoires d’analyses de biologie médicale humaine ou de laboratoires d’analyses vétérinaires, sont tenus de contrôler très régulièrement leurs méthodes et les réactifs employés afin de disposer de résultats fiables.Medical biology analysis laboratories, whether human medical biology analysis laboratories or veterinary analysis laboratories, are required to very regularly check their methods and the reagents used in order to obtain reliable results. .
Les échantillons de contrôle constituent des matériaux de référence suffisamment homogènes et stables vis-à-vis de propriétés définies et spécifiées dans le cadre d’une utilisation souhaitée et prévue (mesurage, examen de pathologie, etc.). Ces propriétés définies constituent elles-mêmes des valeurs de références ou constantes, et peuvent être de plusieurs types : biochimiques, cellulaires, corps étrangers (parasites, bactéries,…). L’échantillon de contrôle est ainsi spécialisé pour la mesure, l’évaluation et/ou l’observation de différents paramètres et permet de caractériser et/ou de valider les résultats de l’analyste. Lorsque qu’un laboratoire reçoit une substance à analyser telle que du liquide biologique prélevé sur un humain ou un animal, l’analyste est ainsi en capacité de comparer les composantes de ladite substance prélevée avec les constantes parfaitement définies de l’échantillon de contrôle. La constatation d’une ou plusieurs modifications desdites constantes dans la substance prélevée par rapport à celles de l’échantillon de contrôle, permet le diagnostic d’une pathologie éventuelle dont les paramètres auront été préalablement définis.The control samples constitute sufficiently homogeneous and stable reference materials with respect to defined and specified properties within the framework of a desired and planned use (measurement, pathology examination, etc.). These defined properties themselves constitute reference values or constants, and can be of several types: biochemical, cellular, foreign bodies (parasites, bacteria, etc.). The control sample is thus specialized for the measurement, evaluation and/or observation of different parameters and makes it possible to characterize and/or validate the results of the analyst. When a laboratory receives a substance to be analyzed such as biological fluid taken from a human or an animal, the analyst is thus able to compare the components of the said substance taken with the perfectly defined constants of the control sample. The observation of one or more modifications of the said constants in the sampled substance compared to those of the control sample, allows the diagnosis of a possible pathology whose parameters will have been defined beforehand.
Par exemple, dans le cadre de l’analyse des urines ou ECBU (Examen cytobactériologique des urines), le contrôle habituellement proposé au biologiste doit présenter les caractéristiques d’une urine qui sont, en plus du pH urinaire :
- Présence de cellules : leucocytes et/ou hématies
- Présence de cristaux
- Présence de divers types de microorganismes : bactéries et champignons
- Paramètres biochimiques définis : acétone, albumine, sucre.
- Presence of cells: leukocytes and/or red blood cells
- Presence of crystals
- Presence of various types of microorganisms: bacteria and fungi
- Defined biochemical parameters: acetone, albumin, sugar.
Cet ensemble de caractéristiques défini à des concentrations données doit être présent dans le produit contrôle.This defined set of characteristics at given concentrations must be present in the control product.
Il en est de même pour tous les types de prélèvements et liquides biologiques. Le produit de contrôle est adapté en fonction du type de prélèvement et des caractéristiques attendues pour l’analyse et/ou le diagnostic recherché.The same is true for all types of samples and biological fluids. The control product is adapted according to the type of sample and the characteristics expected for the analysis and/or the diagnosis sought.
La présente invention s’intéresse plus particulièrement aux constantes de type « cellulaires » et permet de disposer d’un matériel de référence, stable dans le temps et suffisamment fiable pour constituer un échantillon de contrôle durable, destiné à être comparé aux paramètres cellulaires relevés dans le cadre d’un prélèvement biologique sur un mammifère, tel que par exemple un prélèvement sanguin ou un autre liquide biologique (urine, liquide d’épanchement…).The present invention is more particularly concerned with "cellular" type constants and makes it possible to have a reference material, stable over time and sufficiently reliable to constitute a durable control sample, intended to be compared with the cellular parameters recorded in in the context of a biological sample taken from a mammal, such as for example a blood sample or another biological liquid (urine, effusion liquid, etc.).
Les différences de cellules observées entre l’échantillon de contrôle et l’échantillon prélevé (en nombre, qualité, type, etc.), peut permettre le diagnostic d’une pathologie, ou peut conforter le diagnostic pathologique issu d’autres données par exemple avec les résultats d’analyses effectuées sur les constantes biochimiques et/ou les bactéries infectieuses du même patient. Par exemple, pour une étude cytobactériologique des urines (ECBU), un examen direct du prélèvement au microscope ou au cytomètre de flux permet de détecter une hématurie (présence de globules rouges en quantité supérieure à 5.10³/ml) et/ou une leucocyturie (présence de globules blancs en quantité supérieure à 10³/ml). A la présence de cellules comme les hématies, les leucocytes, les macrophages ou autres types de cellules, correspond souvent une pathologie donnée.The differences in cells observed between the control sample and the sample taken (in number, quality, type, etc.), can allow the diagnosis of a pathology, or can confirm the pathological diagnosis from other data, for example with the results of analyzes carried out on the biochemical constants and/or the infectious bacteria of the same patient. For example, for a cytobacteriological study of urine (ECBU), a direct examination of the sample under the microscope or with a flow cytometer makes it possible to detect hematuria (presence of red blood cells in a quantity greater than 5.10³/ml) and/or leucocyturia ( presence of white blood cells in a quantity greater than 10³/ml). The presence of cells such as red blood cells, leukocytes, macrophages or other types of cells often corresponds to a given pathology.
La présente invention permet de répondre au besoin des biologistes en produits de contrôle de qualité.The present invention makes it possible to meet the need of biologists for quality control products.
Etat de la techniqueState of the art
Il existe des méthodes connues de fixation et de stabilisation de cellules, comme il existe également des méthodes par exemple de traitement du sang total pour fournir un échantillon adapté à la détermination des valeurs des cellules sanguines. Ces méthodes se sont principalement développées dans le milieu de l’hématologie qui utilise des automates capables de numérer les diverses familles de cellules sanguines (système Beckman Coulter, système Abbot,…). Ces automates nécessitent des contrôles journaliers. Les brevets CA 2382119 C « Hematology Contol and System for Multi-Parameter Hematology Measurements », US4579824A « Hematology Control » et EP 73554B1 « Treatment of Whole Blood for Determination of Red Blood Cell Volumes » donnent diverses technologies de traitement et stabilisation des cellules. Ces méthodologies sur le contrôle des cellules sanguines se rencontrent également dans le domaine vétérinaire, par exemple le contrôle à partir de cellules sanguines de porc (1) « Porcine Blood as control materials for animals blood cell analysis » qui présente un système de contrôle utilisant des cellules sanguines de porc avec une stabilité de 5 semaines.There are known methods of fixing and stabilizing cells, as there are also methods, for example, of processing whole blood to provide a sample suitable for determining blood cell values. These methods have mainly been developed in the field of hematology, which uses automatons capable of counting the various families of blood cells (Beckman Coulter system, Abbot system, etc.). These machines require daily checks. Patents CA 2382119 C “Hematology Control and System for Multi-Parameter Hematology Measurements”, US4579824A “Hematology Control” and EP 73554B1 “Treatment of Whole Blood for Determination of Red Blood Cell Volumes” give various cell treatment and stabilization technologies. These blood cell control methodologies are also found in the veterinary field, for example control using pig blood cells (1) "Porcine Blood as control materials for animals blood cell analysis" which presents a control system using porcine blood cells with 5 week stability.
Mais aujourd’hui, il n’existe pas de produits de contrôle de cellules présentant des caractéristiques de reproductibilité et de stabilité d’au moins sur plusieurs mois, ni de méthode de préparation de tels produits. Or, le marché actuel en est très en attente. Aussi, notre équipe spécialisée dans le séchage, la lyophilisation et la conservation dans le temps de nombreux microorganismes, a mis au point une composition innovante ainsi qu’un procédé de stabilisation utilisant cette composition, pour la fabrication de produits de contrôle de qualité présentant la possibilité de distinguer et de compter les diverses cellules d’un liquide biologique prélevé. Les essais de mise au point ont été effectués principalement sur les urines. Mais le modèle de réalisation est transposable aux autres prélèvements biologiques de mammifères, et notamment aux prélèvements de liquides biologiques tels que sang, liquide articulaire, synovial, etc. Un bon contrôle correspond au mieux au type de prélèvement ou liquide biologique auquel il doit être comparé.But today, there are no cell control products with characteristics of reproducibility and stability of at least several months, nor any method of preparing such products. However, the current market is very much waiting for it. Also, our team specializing in the drying, freeze-drying and preservation over time of many microorganisms, has developed an innovative composition as well as a stabilization process using this composition, for the manufacture of quality control products with the possibility of distinguishing and counting the various cells of a sampled biological fluid. Development tests were carried out mainly on urine. However, the production model can be transposed to other biological samples from mammals, and in particular to samples of biological fluids such as blood, joint fluid, synovial fluid, etc. A good control corresponds best to the type of sample or biological fluid to which it must be compared.
Le produit ou échantillon de contrôle issu de la mise en œuvre du procédé selon l’invention sera adapté à chaque type de liquides biologiques prélevés chez les mammifères tels que par exemple : urine, liquide céphalo rachidien, ponction synoviale, ponction pleurale et ponction péricardique, etc. ou tout autre liquide biologique pour lequel l’on recherche la présence éventuelle et anormale de cellules.The product or control sample resulting from the implementation of the method according to the invention will be adapted to each type of biological fluids taken from mammals such as for example: urine, cerebrospinal fluid, synovial puncture, pleural puncture and pericardial puncture, etc or any other biological fluid for which the possible and abnormal presence of cells is sought.
L’invention a trait à une composition ou solution stabilisante comprenant notamment des sels tels que l’acétate de sodium, le barbital sodé, le chlorure de sodium, et le citrate trisodique, solubilisés dans de l’eau distillée. L’utilisation de cette composition dans le cadre de notre procédé de traitement et de stabilisation des cellules d’eucaryotes permet la fabrication et la réalisation d’échantillons de contrôles hautement stables, qualitatifs et durables dans le temps (au-delà de un mois et avantageusement au moins 6 mois).The invention relates to a stabilizing composition or solution comprising in particular salts such as sodium acetate, sodium barbital, sodium chloride, and trisodium citrate, dissolved in distilled water. The use of this composition as part of our process for the treatment and stabilization of eukaryotic cells allows the manufacture and production of highly stable, qualitative and durable control samples over time (more than one month and advantageously at least 6 months).
L’invention vise également ledit procédé utilisant ladite composition. Ce procédé se décompose schématiquement en 3 étapes successives :
- Préparation des cellules d’eucaryotes
- Fixation desdites cellules par traitement au glutaraldéhyde
- Stabilisation des cellules dans une dilution finale utilisant la composition de stabilisation selon l’invention
- Preparation of eukaryotic cells
- Fixation of said cells by treatment with glutaraldehyde
- Stabilization of cells in a final dilution using the stabilization composition according to the invention
On obtient ainsi un produit ou échantillon de contrôle, stable dans le temps, et comportant une quantité déterminée de cellules visibles au microscope et au cytomètre de flux pour une lecture quantitative et qualitative précise.A product or control sample, stable over time, and comprising a determined quantity of cells visible under the microscope and on the flow cytometer for precise quantitative and qualitative reading is thus obtained.
Enfin, l’invention concerne aussi les échantillons ou produits de contrôle issus de la mise en œuvre de ce procédéFinally, the invention also relates to samples or control products resulting from the implementation of this process.
La présente invention s’attache à fournir un produit contrôle pour la détection et la numération des éléments cellulaires, et en particulier les leucocytes et/ou les hématies présents dans le liquide biologique à analyser, sans toutefois être limitée à ce type de cellules.The present invention sets out to provide a control product for the detection and counting of cellular elements, and in particular the leukocytes and/or red blood cells present in the biological liquid to be analyzed, without however being limited to this type of cell.
La composition selon l’invention comprend au moins :
- De la glycine ou équivalent connu en soi
- Des composés sucrés tels que D-Sorbitol et Glucose ou équivalents connus en eux-mêmes
- De l’acétate de sodium
- Du barbital sodé ou 5,5 diéthylbarbiturate de sodium
- Du chlorure de sodium
- Du citrate trisodique
- Du 8 hydroxyquinoléine
- De l’acide citrique monohydrate
- Glycine or equivalent known per se
- Sweet compounds such as D-Sorbitol and Glucose or equivalents known per se
- sodium acetate
- Sodium barbital or sodium 5.5 diethylbarbiturate
- sodium chloride
- trisodium citrate
- 8 hydroxyquinoline
- Citric acid monohydrate
L’ensemble est solubilisé dans de l’eau distillée et la solution obtenue est homogénéisée.The whole is dissolved in distilled water and the solution obtained is homogenized.
De façon avantageuse, la composition stabilisante comprend au moins les composés suivants, solubilisés dans de l’eau distillée :
- Glycine
- D. sorbitol
- Glucose
- Acétate de sodium
- 5,5 diéthylbarbiturate de sodium
- NaCl
- Citrate trisodique
- 8 hydroxyquinoléine
- Acide citrique monohydrate
- wisteria
- D. sorbitol
- Glucose
- sodium acetate
- Sodium 5.5 diethylbarbiturate
- NaCl
- Trisodium citrate
- 8 hydroxyquinoline
- Citric acid monohydrate
Plus particulièrement, la composition comprend au moins les composés suivants, aux concentrations indiquées :
- Glycine : 3 g/litre
- D. sorbitol : 2,7 g/l
- Glucose : 2,8 g/l
- Acétate de sodium : 1,9 g/l
- 5,5 diéthylbarbiturate de sodium : 2,9 g/l
- NaCl : 2,6 g/l
- Citrate trisodique : 8,1 g/l
- 8 hydroxyquinoléine : 0,1 g/l
- Acide citrique monohydrate : 0,72 g/l,
- Glycine: 3 g/litre
- D. sorbitol: 2.7 g/l
- Glucose: 2.8 g/l
- Sodium acetate: 1.9 g/l
- 5.5 sodium diethylbarbiturate: 2.9 g/l
- NaCl: 2.6 g/l
- Trisodium citrate: 8.1 g/l
- 8 hydroxyquinoline: 0.1 g/l
- Citric acid monohydrate: 0.72 g/l,
Le procédé selon l’invention comporte les étapes successives suivantes :
- Étape 1 : Préparation à savoir séparation et purification des cellules d’eucaryotes
- Étape 2 : Fixation desdites cellules par traitement au glutaraldéhyde
- Étape 3 : Stabilisation des cellules dans une dilution finale utilisant la composition de stabilisation selon les revendications 1 à 3
- Step 1: Preparation i.e. separation and purification of eukaryotic cells
- Step 2: Fixing said cells by treatment with glutaraldehyde
- Step 3: Stabilization of cells in a final dilution using the stabilization composition according to claims 1 to 3
Les étapes 1) et 2) sont classiques et utilisent des méthodes globalement connues. Nous avons toutefois recherché une solution pour adapter au cadre de notre procédé, les méthodes de fixation des cellules par glutaraldéhyde communément exposées par l’art antérieur, afin d’optimiser la stabilisation finale des cellules par notre composition stabilisante.Steps 1) and 2) are conventional and use globally known methods. However, we have sought a solution to adapt to the framework of our process, the methods of cell fixation by glutaraldehyde commonly exposed by the prior art, in order to optimize the final stabilization of the cells by our stabilizing composition.
Etape 1 : préparation des cellules: Step 1: cell preparation :
L’étape de préparation des cellules consistent à séparer, isoler et purifier les cellules qui devront constituer le produit de contrôle.The cell preparation step consists in separating, isolating and purifying the cells which will constitute the control product.
Il existe différentes méthodes de préparation et de purification des cellules d’eucaryotes issues de l’homme ou de l’animal. On peut citer par exemple les techniques de séparation des cellules par colonne d’immunochromatographie. D’autres méthodes existent. Elles sont plus ou moins longues et complexes à mettre en œuvre, et parfois coûteuses. En fonction du type de cellules que l’on souhaitera isoler, il pourra être préféré une technique plutôt qu’une autre.There are different methods for preparing and purifying eukaryotic cells from humans or animals. We can cite, for example, the techniques of cell separation by immunochromatography column. Other methods exist. They are more or less long and complex to implement, and sometimes expensive. Depending on the type of cells to be isolated, one technique may be preferred over another.
Les cellules eucaryotes isolées et purifiées proviennent de prélèvements sanguins de mammifères et sont des globules rouges et/ou des globules blancs ou leucocytes à savoir des monocytes, des polynucléaires et/ou des lymphocytesThe isolated and purified eukaryotic cells come from mammalian blood samples and are red blood cells and/or white blood cells or leukocytes, namely monocytes, polymorphonuclear cells and/or lymphocytes
Afin d’illustrer cette étape, nous avons choisi une technique de préparation relativement simple, adaptée à la préparation des cellules leucocytaires :
Du sang frais de donneur est récupéré sur anticoagulant, il est traité dans les 24h qui suivent le prélèvement. La poche de sang est homogénéisée manuellement et le sang est récupéré dans des tubes coniques adaptés pour une centrifugation de 20 minutes à 600 g. Le plasma est ensuite éliminé et les globules blancs ou leucocytes sont récupérés à l’interface du plasma et des globules rouges (anneau blanc-rosé correspondant à la couche leuco plaquettaire). Les globules blancs sont recueillis dans des tubes coniques adaptés à la centrifugation et lavés 2 fois dans du sérum physiologique par centrifugation de 8 minutes à 300 g pour chaque lavage, afin d’éliminer les plaquettes et l’excès de globules rouges.In order to illustrate this step, we have chosen a relatively simple preparation technique, suitable for the preparation of leukocyte cells:
Fresh donor blood is recovered on anticoagulant, it is processed within 24 hours of collection. The blood bag is homogenized manually and the blood is collected in conical tubes suitable for centrifugation for 20 minutes at 600 g. The plasma is then eliminated and the white blood cells or leukocytes are recovered at the interface of the plasma and the red blood cells (white-pink ring corresponding to the buffy coat). The white blood cells are collected in conical tubes suitable for centrifugation and washed twice in physiological saline by centrifugation for 8 minutes at 300 g for each wash, in order to eliminate platelets and excess red blood cells.
Etape 2 : Fixation des cellules, préparées tel que précédemment :
Là encore, il existe d’ores et déjà plusieurs techniques de fixation connues de l’homme du métier, notamment en utilisant divers aldéhydes comme le glutaraldéhyde ou le formaldéhyde. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux techniques de fixation au glutaraldéhyde et avons relevé que les concentrations de glutaraldéhyde utilisées variaient de 0,075% à 10% selon les auteurs (voir Références « littérature » : 1, 2, 3, 4). Dans notre cas, nous avons obtenu de bons résultats finaux en sélectionnant le glutaraldéhyde concentré en solution aqueuse à 0,39% pour une performance optimale Step 2: Fixing the cells, prepared as before:
Here again, there are already several fixing techniques known to those skilled in the art, in particular by using various aldehydes such as glutaraldehyde or formaldehyde. We were more particularly interested in glutaraldehyde fixation techniques and noted that the concentrations of glutaraldehyde used varied from 0.075% to 10% depending on the authors (see “Literature” references: 1, 2, 3, 4). In our case, we obtained good final results by selecting concentrated glutaraldehyde in aqueous solution at 0.39% for optimal performance.
Nous exposons ci-après la technique de fixation par traitement au glutaraldéhyde que nous avons mise en œuvre pour fixer les cellules leucocytaires précédemment préparées :We present below the fixation technique by treatment with glutaraldehyde that we have implemented to fix the previously prepared leukocyte cells:
Le culot de cellules leucocytaires lavées est repris par une solution de glutaraldéhyde à 0,39% dans du sérum physiologique. Après homogénéisation, nous laissons agir le glutaraldéhyde 17 heures à 4°C. Ensuite, les cellules sont récupérées par simple centrifugation de 20 minutes à 600 g. Les cellules sont ensuite lavées une fois dans du sérum physiologique (centrifugation 600g pendant 20 minutes). Les leucocytes sont alors prêts pour être diluées dans notre solution de stabilisation.The pellet of washed leukocyte cells is taken up in a 0.39% solution of glutaraldehyde in physiological saline. After homogenization, we let the glutaraldehyde act for 17 hours at 4°C. Then, the cells are recovered by simple centrifugation for 20 minutes at 600 g. The cells are then washed once in physiological saline (centrifugation at 600 g for 20 minutes). The leukocytes are then ready to be diluted in our stabilization solution.
Toutefois, avant leur dilution, une numération précise des leucocytes est effectuée par une série de dilutions dans du sérum physiologique au microscope au moyen d’une cellule de comptage de type Malassez. Ceci permet d’établir la concentration exacte des cellules à introduire dans le flacon contrôle final.However, before their dilution, an accurate count of leukocytes is carried out by a series of dilutions in physiological saline under the microscope using a Malassez type counting cell. This makes it possible to establish the exact concentration of cells to be introduced into the final control vial.
Etape 3 : Stabilisation des cellules
Les cellules fixées sont ajoutées à la dilution désirée dans du sérum physiologique, pour être ensuite diluées dans la composition stabilisante A un volume de cellules fixées diluées dans du sérum physiologique, un volume équivalent de notre solution ou composition stabilisante est ajouté pour constituer une dilution finale. La solution obtenue est homogénéisée et est prête à être conditionnée de façon stérile dans tout contenant adapté connu en soi, par exemple des flacons préalablement stérilisés, et distribuée. Step 3: Cell stabilization
The fixed cells are added to the desired dilution in physiological serum, to then be diluted in the stabilizing composition To a volume of fixed cells diluted in physiological serum, an equivalent volume of our solution or stabilizing composition is added to constitute a final dilution . The solution obtained is homogenized and is ready to be packaged in a sterile manner in any suitable container known per se, for example previously sterilized bottles, and distributed.
Etudes de stabilité :
Nos études de stabilité ont été effectuées à 4-8°C (stockage dans un réfrigérateur classique). Trois types d’études ont été effectués :
- Sur des leucocytes seuls
- Sur des globules rouges seuls
- Sur un mélange leucocytes / globules rouges
Our stability studies were carried out at 4-8°C (storage in a conventional refrigerator). Three types of studies were carried out:
- On leukocytes alone
- On red blood cells alone
- On a leukocyte / red blood cell mixture
Pour ces études, 3 concentrations de cellules ont été testées :
- 10 cellules/µl
- 50 cellules/µl
- 200 cellules/µl
- 10 cells/µl
- 50 cells/µl
- 200 cells/µl
Les concentrations de leucocytes et globules rouges sont traitées de 3 façons :
- Préparation A : étude de stabilité avec la solution stabilisante sur des cellules n’ayant pas été fixées
- Préparation B : étude de stabilité avec la solution stabilisante sur des cellules ayant été fixées au glutaraldéhyde concentré à 0,39%
- Préparation C : étude de stabilité avec du sérum physiologique sur des cellules ayant été fixées au glutaraldéhyde concentré à 0,39%
- Preparation A: stability study with the stabilizing solution on cells that have not been fixed
- Preparation B: stability study with the stabilizing solution on cells having been fixed with glutaraldehyde concentrated at 0.39%
- Preparation C: stability study with physiological saline on cells having been fixed with concentrated 0.39% glutaraldehyde
Les analyses des numérations (aspect quantitatif au cytomètre de flux) ont été couplées à des analyses qualitatives : aspect des cellules au microscope optique.Count analyzes (quantitative aspect with a flow cytometer) were coupled with qualitative analyses: appearance of the cells under an optical microscope.
Les résultats obtenus sont affichés dans le tableau 1.
[Tableau 1] : Traitement et étude de stabilité des leucocytes - Aspects quantitatifs et qualitatifs
Aspect quantitatif
(comptage au cytomètre de flux)
2
4
Bonne numération
Plus de comptage
6
Plus de comptage
Bonne numération
Baisse de 5à10%
Plus de comptage
8
Plus de comptage
Plus de comptage
Aspect qualitatif
(microscope optique)
2
Cellules normales
à partir de 1 mois
4
Lyse partielle
Lyse totale
6
Lyse totale
Lyse totale
8
Lyse totale
Lyse totale
** Préparation B : solution stabilisante avec fixation au glutaraldéhyde
*** Préparation C : fixation au glutaraldéhyde et stabilisation avec du sérum physiologiqueThe results obtained are displayed in Table 1.
[Table 1] : Treatment and study of leukocyte stability - Quantitative and qualitative aspects
Quantitative aspect
(flow cytometer count)
2
4
Good count
More counting
6
More counting
Good count
5 to 10% drop
More counting
8
More counting
More counting
Qualitative aspect
(optical microscope)
2
normal cells
from 1 month
4
Partial lysis
Total lysis
6
Total lysis
Total lysis
8
Total lysis
Total lysis
** Preparation B: stabilizing solution with glutaraldehyde fixation
*** Preparation C: fixation with glutaraldehyde and stabilization with physiological serum
Selon les résultats obtenus avec les 3 types de traitement (fixation et stabilisation) du tableau 1, la fixation des cellules au glutaraldéhyde est essentielle, notamment pour garder une bonne morphologie des cellules.According to the results obtained with the 3 types of treatment (fixation and stabilization) of table 1, the fixing of the cells with glutaraldehyde is essential, in particular to maintain a good morphology of the cells.
La solution stabilisante telle que décrite dans le présent exposé est essentielle pour conserver une bonne concentration et une bonne morphologie des cellules. Nous obtenons une stabilité de 6 mois à 4-8°C (perte de 5 à 10% acceptable au microscope ou au cytomètre de flux). Ladite solution est donc essentielle à la bonne stabilisation des cellules.The stabilizing solution as described in this presentation is essential to maintain a good concentration and a good morphology of the cells. We obtain a stability of 6 months at 4-8°C (loss of 5 to 10% acceptable under the microscope or flow cytometer). Said solution is therefore essential for the proper stabilization of the cells.
Nous avons également effectués des essais identiques avec les globules rouges. Nos essais ont donné des résultats très proches de ceux obtenus avec les leucocytes. Au bout de 8 mois, certains globules rouges prennent un aspect crénelé.We also carried out identical tests with red blood cells. Our tests have given results very close to those obtained with leukocytes. After 8 months, some red blood cells take on a crenulated appearance.
Nous avons enfin effectué une 3èmeexpérience correspondant à un mélange de leucocytes et de globules rouges. Ces essais étaient importants car la présence à la fois de globules rouges et de leucocytes constitue la majorité des cas des ECBU. Il y a en effet toujours un mélange globules rouges/leucocytes dans les urines présentant des cellules, les globules rouges étant cependant à une concentration nettement inférieure à celle des leucocytes.Finally, we carried out a 3rd experiment corresponding to a mixture of leukocytes and red blood cells. These tests were important because the presence of both red blood cells and leukocytes constitute the majority of cases of ECBU. There is indeed always a mixture of red blood cells/leukocytes in the urine presenting cells, the red blood cells being however at a concentration clearly lower than that of the leukocytes.
Cette 3èmeexpérience a confirmé les 2 précédentes avec une stabilité de 6 mois avec le maintien d’une quantité et d’une qualité des 2 types de cellules.This 3 rd experiment confirmed the 2 previous ones with a stability of 6 months with the maintenance of a quantity and a quality of the 2 types of cells.
En conclusion, nous avons établi un système innovant pour la conservation des cellules eucaryotes type leucocytes et/ou globules rouges, aussi bien en quantité qu’en qualité. Cette nouvelle méthodologie peut entrer dans un processus d’établissement de contrôles de qualité stables destinés à l’ensemble des laboratoires d’analyses humaines et vétérinaires.In conclusion, we have established an innovative system for the conservation of eukaryotic cells such as leukocytes and/or red blood cells, both in quantity and in quality. This new methodology can enter into a process of establishing stable quality controls intended for all human and veterinary analysis laboratories.
Cette innovation peut non seulement être utilisée dans le cas de contrôles d’ECBU mais également dans le cadre de contrôles d’analyses cytologiques des prélèvements et liquides biologiques.This innovation can not only be used in the case of ECBU controls but also in the context of cytological analysis controls of samples and biological fluids.
Les principaux prélèvements biologiques pouvant présenter des cellules indicatrices d’infection/inflammation sont le prélèvement cervico-vaginal, le prélèvement urétral, le prélèvement d’une lésion génitale, le prélèvement broncho-pulmonaire.The main biological samples that may present cells indicative of infection/inflammation are the cervico-vaginal sample, the urethral sample, the sample from a genital lesion, the broncho-pulmonary sample.
Les principaux liquides biologiques sont le sang, la lymphe, l’urine, le liquide cérébrospinal ou céphalorachidien, le liquide synovial ou articulaire, le liquide pleural (cavité pleurale autour de chacun des 2 poumons), le liquide péritonéal (cavité péritonéale autour des intestins) et le liquide péricardique (cavité péricardique autour du cœur).The main biological fluids are blood, lymph, urine, cerebrospinal or cerebrospinal fluid, synovial or joint fluid, pleural fluid (pleural cavity around each of the 2 lungs), peritoneal fluid (peritoneal cavity around the intestines ) and pericardial fluid (pericardial cavity around the heart).
Les liquides péricardique, articulaire, pleural et péritonéal constituent les liquides d’épanchement en médecine pour lesquels le taux de leucocytes est un élément important pour le diagnostic de la pathologie.The pericardial, articular, pleural and peritoneal fluids constitute the effusion fluids in medicine for which the leukocyte level is an important element for the diagnosis of the pathology.
Prenons comme exemple le liquide articulaire pour lequel la quantité de leucocytes par ml donne une idée sur les principales pathologies : voir tableau 2.
[Tableau 2]: Principales pathologies associée au nombre de leucocytes présents dans un liquide articulaire (Référence « littérature » 5)
[Table 2]: Main pathologies associated with the number of leukocytes present in joint fluid (“Literature” reference 5)
Parfois le biologiste est amené à étudier de plus près la population des leucocytes en différenciant les polynucléaires des cellules mononuclées (lymphocytes et monocytes). Pour cela il effectue un étalement sur lame de verre du liquide biologique et effectue une coloration de cette lame qui lui permet de différencier les sous-types cellulaires au microscope (par exemple dans le cas des liquides articulaires inflammatoires, les polynucléaires représentent plus de 70% des leucocytes).Sometimes the biologist is led to study the leukocyte population more closely by differentiating polymorphonuclear cells from mononuclear cells (lymphocytes and monocytes). To do this, he spreads the biological fluid on a glass slide and stains this slide, which allows him to differentiate the cell subtypes under the microscope (for example, in the case of inflammatory joint fluids, polynuclears represent more than 70% leukocytes).
Ainsi de cette observation il apparaît d’autres possibilités afin d’affiner les contrôles de qualité sur les types de cellules : nous pouvons par exemple effectuer des essais de fixation/stabilisation plus spécifiques sur les sous-populations leucocytaires.Thus from this observation there appear other possibilities in order to refine the quality controls on the types of cells: we can for example carry out more specific fixation/stabilization tests on the leukocyte subpopulations.
Au lieu de fixer/stabiliser l’ensemble des leucocytes qui comprennent polynucléaires, lymphocytes et monocytes, nous pourrions séparer ces 3 sous-populations et les traiter selon notre méthode innovante afin de proposer des contrôles de qualité beaucoup plus spécifiques.Instead of fixing/stabilizing all the leukocytes which include polymorphonuclear cells, lymphocytes and monocytes, we could separate these 3 subpopulations and treat them according to our innovative method in order to offer much more specific quality controls.
Il existe des méthodes couramment utilisées pour séparer et obtenir les sous-familles leucocytaires :
- Extraction des cellules mononuclées (monocytes et lymphocytes) par la « méthode Ficoll-Hypaque » (6) à l’aide de ficoll, un polysaccharide hydrophile qui sépare le sang en couches que l’on peut ainsi récupérer par centrifugation en gradient de densité (7).
- Extraction des polynucléaires par la méthode Dextran/Ficoll à partir du sang total (8).
- Extraction of mononuclear cells (monocytes and lymphocytes) by the "Ficoll-Hypaque method" (6) using ficoll, a hydrophilic polysaccharide which separates the blood into layers which can thus be recovered by density gradient centrifugation ( 7).
- Extraction of polynuclear cells by the Dextran/Ficoll method from whole blood (8).
Une autre possibilité très simple pour l’obtention de macrophages (monocytes) est de travailler non pas à partir du sang total mais à partir du Lavage Broncho Alvéolaire (LBA). Le LBA est un outil diagnostique peu invasif qui permet de caractériser la santé des alvéoles pulmonaires. Et ce prélèvement biologique a la particularité de présenter 85% de macrophages correspondant à une bonne santé des alvéoles pulmonaires.Another very simple possibility for obtaining macrophages (monocytes) is to work not from whole blood but from Lavage Broncho Alveolar (LBA). BAL is a minimally invasive diagnostic tool that can characterize the health of the pulmonary alveoli. And this biological sample has the particularity of presenting 85% of macrophages corresponding to good health of the pulmonary alveoli.
Dès que ce taux de macrophages baisse :
- Au profit de lymphocytes (> 25%), le diagnostic suggéré est une pneumonie virale, une pneumonie interstitielle lymphoïde…
- Au profit de polynucléaires (> 3%), le diagnostic suggéré est une pneumonie bactérienne, une collagénose…
- In favor of lymphocytes (> 25%), the suggested diagnosis is viral pneumonia, lymphoid interstitial pneumonia…
- In favor of polymorphonuclear (> 3%), the suggested diagnosis is bacterial pneumonia, collagenosis…
Nous avons donc utilisé ce type de prélèvement pour étudier notre méthode fixation/stabilisation sur les macrophages. A cette fin, nous avons obtenu plusieurs LBA de patients sains que nous avons mélangés en une seule solution. Cette solution a été lavée 3 fois avec du sérum physiologique (3 centrifugations de 20 minutes à 600 g).We therefore used this type of sample to study our fixation/stabilization method on macrophages. To this end, we obtained several LBAs from healthy patients which we mixed into a single solution. This solution was washed 3 times with physiological serum (3 centrifugations of 20 minutes at 600 g).
La solution finale comportait :
- 88% de macrophages
- 12% de lymphocytes
- et de rares polynucléaires
- 88% macrophage
- 12% lymphocytes
- and rare polymorphonuclear
Nous avons établi 3 types de dilutions correspondant à :
- 10 cellules/µl
- 50 cellules/µl
- 200 cellules/µl
- 10 cells/µl
- 50 cells/µl
- 200 cells/µl
Les 3 dilutions, après vérification à la cellule de Malassez, comportaient bien un taux de macrophages supérieur à 80% et autour de 15% pour les lymphocytes. Les 3 dilutions ont subi les étapes de fixation/stabilisation précédemment décrites. Et une étude visuelle au microscope optique de chaque dilution a été effectuée 2, 4, 6 et 8 mois plus tard (stockage à 4-8°C).The 3 dilutions, after checking with the Malassez cell, did indeed contain a rate of macrophages greater than 80% and around 15% for the lymphocytes. The 3 dilutions underwent the fixing/stabilization steps previously described. And a visual study under an optical microscope of each dilution was carried out 2, 4, 6 and 8 months later (storage at 4-8°C).
Les résultats retransmis dans le tableau 3 permettent de confirmer que notre méthode est efficace non seulement sur les globules rouges et les leucocytes, mais également sur les sous-populations de leucocytes comme les macrophages (monocytes) dans ce cas.
[ Tableau 3 ] : Traitement et étude de stabilité des macrophages - Aspects quantitatifs* et qualitatifs**
à 4-8°c
%macrophages
%lymphocytes
82
18
75
25
89
11
%macrophages
%lymphocytes
80
20
80
20
87
23
%macrophages
%lymphocytes
78
22
71
29
88
22
%macrophages
%lymphocytes
84
16
69
31
88
22
%macrophages
%lymphocytes
79
21
72
28
81
19
** Aspect morphologique des cellules au microscope optique : une légère modification des cellules est à noter après 8 mois de stockage.The results reported in Table 3 confirm that our method is effective not only on red blood cells and leukocytes, but also on leukocyte subpopulations such as macrophages (monocytes) in this case.
[ Table 3 ] : Treatment and stability study of macrophages - Quantitative* and qualitative** aspects
at 4-8°C
%macrophages
%lymphocytes
82
18
75
25
89
11
%macrophages
%lymphocytes
80
20
80
20
87
23
%macrophages
%lymphocytes
78
22
71
29
88
22
%macrophages
%lymphocytes
84
16
69
31
88
22
%macrophages
%lymphocytes
79
21
72
28
81
19
** Morphological appearance of the cells under the optical microscope: a slight modification of the cells is to be noted after 8 months of storage.
Nous avons donc établi une méthode de fixation/stabilisation permettant l’obtention de suspensions de cellules sanguines eucaryotes stables 6 mois à 4-8°C.We have therefore established a fixation/stabilization method allowing the production of eukaryotic blood cell suspensions stable for 6 months at 4-8°C.
Cette méthodologie a été démontrée sur des globules rouges, des globules blancs ou leucocytes et des macrophages ou monocytes. Les cellules provenant du sang constituent des paramètres cytologiques utilisés de façon classique pour le diagnostic biologique de certaines pathologies. Dans ce cadre, cela intéresse les urines, divers prélèvements biologiques ainsi que les liquides biologiques.This methodology has been demonstrated on red blood cells, white blood cells or leukocytes and macrophages or monocytes. Cells from the blood constitute cytological parameters conventionally used for the biological diagnosis of certain pathologies. In this context, this concerns urine, various biological samples as well as biological fluids.
Cette méthode de préparation peut être transposée à d’autres types de cellules eucaryotes issus de mammifères.This method of preparation can be transposed to other types of eukaryotic cells derived from mammals.
Enfin, l’invention concerne les produits de contrôle issus de la mise en œuvre du procédé précédemment décrit. Ces produits de contrôle sont destinés notamment à être utilisés pour la réalisation d’analyses cytologiques des urines, prélèvements biologiques et liquides biologiques issus de mammifères, pour la médecine humaine et la médecine vétérinaire. Ils sont en capacité de comporter des concentrations données constantes de globules rouges, de globules blancs ou leucocytes et plus précisément de monocytes, polynucléaires et lymphocytes après 8 mois de stockage à 4-8°C. De même, ils conservent des caractéristiques qualitatives, comme les morphologies cellulaires, stables à la fois pour les globules rouges notamment, les globules blancs ou leucocytes et plus précisément les monocytes, polynucléaires et lymphocytes après 8 mois de stockage à 4-8°C.Finally, the invention relates to the control products resulting from the implementation of the method described above. These control products are intended in particular to be used for carrying out cytological analyzes of urine, biological samples and biological fluids from mammals, for human medicine and veterinary medicine. They are able to contain constant given concentrations of red blood cells, white blood cells or leukocytes and more specifically monocytes, polymorphonuclear cells and lymphocytes after 8 months of storage at 4-8°C. Likewise, they retain qualitative characteristics, such as cell morphologies, which are stable both for red blood cells in particular, white blood cells or leukocytes and more specifically monocytes, polymorphonuclear cells and lymphocytes after 8 months of storage at 4-8°C.
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2004 Romanian J. Biophys. 14 (5): 53-58.
Claims (10)
- Glycine
- D. sorbitol
- Glucose
- Acétate de sodium
- 5,5 diéthylbarbiturate de sodium
- NaCl
- Citrate trisodique
- 8 hydroxyquinoléine
- Acide citrique monohydrate
- wisteria
- D. sorbitol
- Glucose
- sodium acetate
- Sodium 5.5 diethylbarbiturate
- NaCl
- Trisodium citrate
- 8 hydroxyquinoline
- Citric acid monohydrate
- Glycine : 3 g/litre
- D. sorbitol : 2,7 g/l
- Glucose : 2,8 g/l
- Acétate de sodium : 1,9 g/l
- 5,5 diéthylbarbiturate de sodium : 2,9 g/l
- NaCl : 2,6 g/l
- Citrate trisodique : 8,1 g/l
- 8 hydroxyquinoléine : 0,1 g/l
- Acide citrique monohydrate : 0,72 g/l,
- Glycine: 3 g/litre
- D. sorbitol: 2.7 g/l
- Glucose: 2.8 g/l
- Sodium acetate: 1.9 g/l
- 5.5 sodium diethylbarbiturate: 2.9 g/l
- NaCl: 2.6 g/l
- Trisodium citrate: 8.1 g/l
- 8 hydroxyquinoline: 0.1 g/l
- Citric acid monohydrate: 0.72 g/l,
- Étape 1 : Préparation à savoir séparation et purification des cellules d’eucaryotes
- Étape 2 : Fixation desdites cellules par traitement au glutaraldéhyde
- Étape 3 : Stabilisation des cellules dans une dilution finale utilisant la composition de stabilisation selon l’invention
- Step 1: Preparation i.e. separation and purification of eukaryotic cells
- Step 2: Fixing said cells by treatment with glutaraldehyde
- Step 3: Stabilization of the cells in a final dilution using the stabilization composition according to the invention
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