FR3083248A1 - KIT FOR DETECTION OF ALTERNARIOSIS AND DISCRIMINATION BETWEEN ALTERNARIA STRAINS OF THE ALTERNARIA SECTION AND THOSE OF THE PORRI SECTION - Google Patents

KIT FOR DETECTION OF ALTERNARIOSIS AND DISCRIMINATION BETWEEN ALTERNARIA STRAINS OF THE ALTERNARIA SECTION AND THOSE OF THE PORRI SECTION Download PDF

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Abstract

La présente invention a trait au domaine du diagnostic de terrain appliqué à la détection de pathogènes infectant les végétaux. Elle concerne une méthode de détection de l'Alternariose, notamment de la pomme de terre. Plus spécifiquement, cette méthode permet de détecter la présence d'un pathogène de genre Alternaria sp. responsable de l'Alternariose mais permet également de discriminer entre deux groupes de souches, celles de la section Alternaria et celles de la section Porri. Cette méthode est basée sur la technique d'amplification par recombinase polymérase qui permet de réaliser un diagnostic rapide sur le terrain, c'est-à-dire à proximité du champ de pomme de terre, et qui ne nécessite pas de formation spécifique du manipulateur.The present invention relates to the field of field diagnosis applied to the detection of pathogens infecting plants. It relates to a method for detecting Alternariasis, in particular potato. More specifically, this method makes it possible to detect the presence of a pathogen of the genus Alternaria sp. responsible for Alternariasis but also makes it possible to discriminate between two groups of strains, those of the Alternaria section and those of the Porri section. This method is based on the technique of amplification by recombinase polymerase which makes it possible to carry out a rapid diagnosis in the field, that is to say near the potato field, and which does not require specific training of the manipulator. .

Description

KIT DE DETECTION DE L’ALTERNARIOSE ET DE DISCRIMINATION ENTRE LES SOUCHES ALTERNARIA DE LA SECTION ALTERNARIA ET CELLES DE LA SECTION PORRIKIT FOR DETECTION OF ALTERNARIOSIS AND DISCRIMINATION BETWEEN ALTERNARIA STRAINS OF THE ALTERNARIA SECTION AND THOSE OF THE PORRI SECTION

Domaine de l’inventionField of the invention

La présente invention a trait au domaine du diagnostic de terrain appliqué à la détection de pathogènes infectant les végétaux. Elle concerne plus spécifiquement une méthode de détection de l’alternariose, en particulier de l’alternariose de 1a pomme de terre, et un kit de diagnostic mettant en œuvre cette méthode. La méthode permet de détecter la présence d’un pathogène de genre Alternaria sp. responsable de l’alternariose de la pomme de terre mais permet également de discriminer entre deux groupes de souches, celles de la section Alternaria et celles de la section Porri. Elle est basée sur la technique d’amplification par recombinase polymérase qui permet de réaliser un diagnostic rapide sur 1e terrain, c’est-à-dire à proximité des champs de pomme de terre, et qui ne nécessite pas de formation du manipulateur spécifique aux techniques de laboratoire.The present invention relates to the field of field diagnosis applied to the detection of pathogens infecting plants. More specifically, it relates to a method for detecting alternariasis, in particular alternaria to potatoes, and to a diagnostic kit implementing this method. The method detects the presence of a pathogen of the genus Alternaria sp. responsible for potato alternaria but also allows discrimination between two groups of strains, those of the Alternaria section and those of the Porri section. It is based on the technique of amplification by recombinase polymerase which makes it possible to carry out a rapid diagnosis in the field, that is to say near the potato fields, and which does not require training of the manipulator specific to the laboratory techniques.

Etat de la techniqueState of the art

En France, la production de pommes d© terre génère un chiffre d’affaire annuel de 2,2 milliards d’euros. Avec une production de 6,95 millions de tonnes par an et un niveau de qualité élevé, la France a un avantage compétitif lui conférant la place de 2ème exportateur mondial de pommes de terre. Cependant, depuis quelques années, la filière pomme de terre est de plus en plus touchée par l’alternariose deuxième maladie fongique en végétation après le mildiou - qui peut entraîner jusqu’à 20% de perte de rendement. Cette maladie est causée par des champignons du genre Alternaria. Ce parasite ne touche pas que la pomme de terre, il infecte également la tomate, te piment, l’aubergine, te pétunia et ta carotte. Ses spores entraînent des allergies chez les animaux et les humains.In France, the production of potatoes generates an annual turnover of 2.2 billion euros. With a production of 6.95 million tonnes per year and a high level of quality, France has a competitive advantage which gives it the position of 2nd world exporter of potatoes. However, in recent years, the potato industry has been increasingly affected by alternaria, the second fungal disease in vegetation after late blight - which can cause up to 20% loss of yield. This disease is caused by fungi of the genus Alternaria. This parasite does not only affect the potato, it also infects tomatoes, peppers, eggplant, petunia and carrots. Its spores cause allergies in animals and humans.

Le genre Alternaria est composé de multiples espèces pathogènes et saprophytes. Actuellement, 1e genre est divisé en 26 sections taxonomiques basées sur ta phylogénie moléculaire. Ces sections incluraient 299 espèces (2008)1 . Deux sections incluant des espèces d’Atternaria ont été identifiées comme saprophytes ou pathogènes de la pomme de terre :The genus Alternaria is composed of multiple pathogenic and saprophytic species. Currently, the genus is divided into 26 taxonomic sections based on molecular phylogeny. These sections would include 299 species (2008) 1 . Two sections including species of Atternaria have been identified as saprophytes or potato pathogens:

- la section Alternaria contenant des espèces dites « à petites spores » (A alternata, A. arborescens, A. tenuissima et A. dumosa) ; et- the Alternaria section containing so-called “small spore” species (A alternata, A. arborescens, A. tenuissima and A. dumosa); and

- la section Porri contenant des espèces dites « à larges spores » (A. solani, A. grandis, A. protenta, A. linariae).- the Porri section containing so-called “large spore” species (A. solani, A. grandis, A. protenta, A. linariae).

L’alternariose de la pomme de terre est doublement difficile à diagnostiquer. D'une part, ses symptômes se confondent avec de simples carences (macro ou oligoéléments) et d’autre part, il est impossible de différencier à l’œil entre les souches Alternaria de la section Alternaria et celles de la section Porri alors que leur pathogénicité diffère fortement.Potato alternaria is doubly difficult to diagnose. On the one hand, its symptoms are confused with simple deficiencies (macro or trace elements) and on the other hand, it is impossible to differentiate with the eye between the Alternaria strains of the Alternaria section and those of the Porri section while their pathogenicity differs strongly.

En effet, les souches de la section Alternaria ont peu d’impact sur les rendements alors que les souches de la section Porri présentent un réel danger pour les récoltes si la lutte fongicide n’est pas menée correctement, notamment si l’infection n’est pas traitée dès son apparition. De plus, les souches des deux sections présentent des résistances différentes aux fongicides.In fact, the strains of the Alternaria section have little impact on yields whereas the strains of the Porri section present a real danger for the crops if the fungicide control is not carried out correctly, especially if the infection does not is not treated as soon as it appears. In addition, the strains in the two sections show different resistance to fungicides.

Il existe donc un réel besoin de disposer d’un outil de diagnostic permettant de détecter rapidement la présence d’alternariose et de discriminer une infection en fonction de la section des souches impliquées.There is therefore a real need to have a diagnostic tool allowing to quickly detect the presence of alternariasis and to discriminate an infection according to the section of the strains involved.

Inconvénients de l’art antérieurDisadvantages of the prior art

A l’heure actuelle, le diagnostic ne peut se faire qu’en laboratoire, ce qui implique un temps de réponse élevé et donc une prise en charge tardive. Face à un risque potentiel, des traitements fongicides sont appliqués en préventif. Ces traitements massifs entraînent des risques d'apparition de résistance aux fongicides et contribuent à la pollution des cultures et des sols.Currently, the diagnosis can only be made in the laboratory, which implies a high response time and therefore late treatment. Faced with a potential risk, fungicide treatments are applied as a preventive. These massive treatments involve risks of the appearance of resistance to fungicides and contribute to the pollution of crops and soils.

1 Kirk PM, Cannon PF, Minter DW, Staipers JA., Dictionary of the Fungi., Wallingford, CABI, 2008,10e éd. (ISBN 0-85199-826-7), p. 22 1 PM Kirk, PF Cannon, Minter DW Staipers JA., Dictionary of the Fungi., Wallingford, CABI, 2008.10 ed. (ISBN 0-85199-826-7), p. 22

Avantages de l’inventionAdvantages of the invention

La présente invention répond au besoin du monde agricole en proposant un test ADN duplex destiné à être utilisé sur le terrain pour une détection rapide permettant de discriminer les deux sections de pathogènes Alternaria incriminés dans l’alternariose. Ce test s’appuie sur la méthode d’amplification par recombinase polymérase (ou RPA pour « Recombinase Polymerase Amplification »).The present invention meets the need of the agricultural world by proposing a duplex DNA test intended for use in the field for rapid detection making it possible to discriminate the two sections of Alternaria pathogens incriminated in alternaria. This test is based on the method of amplification by recombinase polymerase (or RPA for "Recombinase Polymerase Amplification").

La RPA est une alternative isotherme à la réaction en chaîne de la polymérase (PCR). En effet, fonctionnant de manière optimale à des températures basses de 3742°C, les réactions RPA ne requièrent pas l’utilisation d’un thermocycleur. La RPA est bien plus rapide qu’une PCR (20min contre 3h~4h avec révélation sur gel) et plus simple car tout les réactifs sont réunis dans un même tube lyophilisé donc conservable à T° ambiante. Cela fait de la RPA un excellent candidat pour la mise au point de tests moléculaires rapides et utilisables sur le terrain. Cette technique est bien connue de l’homme du métier et décrite notamment dans l’article de Oiaf Piepenburg et al. (PLOS Biology, July 2006, Volume 4, Issue 7, page 1115) ainsi que dans les documents US 7,666,598 B2, US2009/0029421 et US2012/0129173.RPA is an isothermal alternative to the polymerase chain reaction (PCR). Indeed, operating optimally at low temperatures of 3742 ° C, RPA reactions do not require the use of a thermal cycler. The RPA is much faster than a PCR (20 min against 3 h ~ 4 h with revelation on gel) and simpler because all the reagents are combined in the same lyophilized tube, therefore conservable at room temperature. This makes RPA an excellent candidate for the development of rapid molecular tests that can be used in the field. This technique is well known to those skilled in the art and described in particular in the article by Oiaf Piepenburg et al. (PLOS Biology, July 2006, Volume 4, Issue 7, page 1115) as well as in documents US 7,666,598 B2, US2009 / 0029421 and US2012 / 0129173.

La méthode selon l’invention a l’avantage de permettre la détection, grâce à un choix de couples amorces/sonde fonctionnant en duplex, de toutes les espèces de souches responsables de l’Alternariose de la pomme de terre, à savoir d’une part celles de la section Alternaria (A. alternats, A. arborescens, A. tenuissima et A. dumosa) et d’autre part celles de la section Porri (A. solani, A. grandis, A. protenta, A. linariae) tout en différenciant ces deux sections. Les souches identifiées sont les souches pathogènes les plus répandues à travers le monde. Ainsi, la méthode et le kit selon l’invention sont adaptés à la détection de ces souches sur pomme de terre mais aussi sur d’autres espèces végétales de solanées chez lesquelles les espèces pathogènes pour la pomme de terre le sont également (ex : tomate, piment, carotte...).The method according to the invention has the advantage of allowing the detection, thanks to a choice of primer / probe pairs operating in duplex, of all the species of strains responsible for potato alternaria, namely a those of the Alternaria section (A. alternats, A. arborescens, A. tenuissima and A. dumosa) and those of the Porri section (A. solani, A. grandis, A. protenta, A. linariae) while differentiating these two sections. The strains identified are the most widespread pathogenic strains around the world. Thus, the method and the kit according to the invention are suitable for the detection of these strains on potatoes but also on other plant species of solanaceae in which the pathogenic species for the potato are also (eg: tomato , chili, carrot ...).

Le test de diagnostic a été conçu pour permettre une utilisation par des personnes sans aucune expérience de laboratoire, sans équipement de protection particulier et sans risque pour l’environnement ou le manipulateur (sans composant toxique). Il permet d’obtenir un résultat en moins d’une heure (environ 30 min) et ce résultat est simple à interpréter (sous forme de bandelettes). La differentiation des deux sections (Altemaria et Pom) apporte une information précieuse sur tes espèces présentes permettant d’adapter les traitements fongicides. Si aucune espèce n’est présente, ou si la souche présente appartient à la section Altemaria, te test peut indiquer l’inutilité d’appliquer un traitement.The diagnostic test has been designed to allow use by people without any laboratory experience, without special protective equipment and without risk to the environment or the operator (without toxic component). It allows a result to be obtained in less than an hour (approximately 30 min) and this result is simple to interpret (in the form of strips). The differentiation of the two sections (Altemaria and Pom) provides valuable information on your present species, allowing you to adapt the fungicide treatments. If no species is present, or if the strain present belongs to the Altemaria section, the test may indicate the uselessness of applying a treatment.

Avec un résultat en 30 min, l’utilisateur pourra rapidement réagir au diagnostic dès l'apparition des premiers symptômes et adapter le traitement si nécessaire.With a result in 30 min, the user can quickly react to the diagnosis as soon as the first symptoms appear and adapt the treatment if necessary.

Sur 300 échantillons symptomatiques identifiés par des professionnels et testés par les inventeurs, la méthode selon l’invention a permis de révéler que moins de 30% de ces échantillons étaient en réalité porteurs de l’Alternariose. D'où la possibilité, grâce à la méthode selon l’invention, de limiter les traitements et surtout d’éviter tes traitements fongiques inutiles et potentiellement polluants.Out of 300 symptomatic samples identified by professionals and tested by the inventors, the method according to the invention has revealed that less than 30% of these samples were actually carriers of Alternaria. Hence the possibility, thanks to the method according to the invention, of limiting the treatments and above all of avoiding your unnecessary and potentially polluting fungal treatments.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTIONDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Un premier objet de l’invention concerne une méthode de détection de l’alternariose de la pomme de terre comprenant :A first subject of the invention relates to a method for detecting alternariosis in potatoes comprising:

a) le prélèvement d’un échantillon de feuille de pomme de terre suspectée d’être infectée par un pathogène responsable de l’alternariose ;a) taking a sample of a potato leaf suspected of being infected with a pathogen responsible for alternaria;

b) l’extraction de l’ADN dudit échantillon ;b) extracting DNA from said sample;

c) l’amplification duplex d’une séquence d’ADN spécifique aux champignons entraînant l’Alternariose et te marquage des amplicons ainsi générés par la méthode d’amplification par recombinase polymérase à l’aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4. et des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6c) duplex amplification of a DNA sequence specific to the fungi causing alternaria and labeling of the amplicons thus generated by the amplification method by recombinase polymerase using the primers of sequences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4. and sequence probes SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.6

d) la détermination de la présence d’un pathogène responsable de l'alternariose lorsqu’au moins une séquence amplifiée est détectée à l’aide de l’une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6.d) determining the presence of a pathogen responsible for alternariasis when at least one amplified sequence is detected using one of the sequence probes SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.6.

L’invention concerne, dans son acceptation la plus large, une méthode de détection de l’alternariose, notamment de la pomme de terre, comprenant :The invention relates, in its broadest acceptance, to a method for detecting alternaria, in particular potato, comprising:

a) le prélèvement d’un échantillon de feuille suspectée d’être infectée par un pathogène responsable de Γ Alternariosea) taking a sample of a leaf suspected of being infected with a pathogen responsible for Γ Alternariasis

b) l’extraction de l’ADN à partir dudit échantillonb) the extraction of DNA from said sample

c) l’amplification duplex dudit ADN par la méthode d’amplification par recombinase polymérase à l’aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 et de l’une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6.c) duplex amplification of said DNA by the method of amplification by recombinase polymerase using the primers of sequences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4 and one of the sequence probes SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.6.

d) la détermination de la présence d’un pathogène responsable de l’Alternariose lorsqu’au moins une séquence amplifiée est détectée à l'aide de l’une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6.d) determining the presence of a pathogen responsible for Alternariasis when at least one amplified sequence is detected using one of the sequence probes SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.6.

Pour la mise en œuvre de la méthode RPA, dans chaque couple d’amorces, l’un des deux amorces est marquée, par exemple à la biotine, alors que la sonde est marqué à l’aide d’un autre marqueur de type FAM ou diogoxigénine. La sonde peu en outre contenir un site abasique de type THF.For the implementation of the RPA method, in each pair of primers, one of the two primers is labeled, for example with biotin, while the probe is labeled using another marker of FAM type or diogoxigenin. The probe can also contain an abasic THF type site.

Cette méthode permet de déterminer si le plant de pomme de terre suspecté par l’agriculteur d’infection de type Alternariose l’est effectivement ou s’il s’agit d’une autre maladie ou d’un problème physiologique de la plante.This method is used to determine whether the potato plant suspected by the farmer of Alternariasis infection is actually suspected or whether it is another disease or physiological problem of the plant.

En effet, les deux couples d’amorces et les sondes utilisées en duplex permettent d’amplifier dans une même réaction toutes les souches Alternaria pathogènes décrites à l’heure actuelle, quelles soient de la section Alternaria ou de la section Porri. Ainsi, cette méthode permet de poser un diagnostic complet sur la présence d’une infection de type Alternariose.Indeed, the two pairs of primers and the probes used in duplex make it possible to amplify, in the same reaction, all the pathogenic Alternaria strains described at present, whether they are from the Alternaria section or from the Porri section. Thus, this method makes it possible to make a complete diagnosis on the presence of an infection of the Alternariose type.

Un second objet de l’invention concerne une méthode de discrimination appliquée à un plant de pomme de terre infecté par l’Alternariose, entre une infection causée par une souche Alternaria de la section Alternaria et une infection causée par une souche Alternaria de la section Porri consistant à mettre en œuvre la méthode de détection telle que définie précédemment, en considérant que :A second subject of the invention relates to a method of discrimination applied to a potato plant infected with Alternariasis, between an infection caused by an Alternaria strain from the Alternaria section and an infection caused by an Alternaria strain from the Porri section. consisting in implementing the detection method as defined above, considering that:

- te plant de pomme de terre est infecté par une souche Alternaria de la section Alternaria lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 5 reconnaît une séquence amplifiée ;- the potato plant is infected with an Alternaria strain from the Alternaria section when the sequence probe SEQ ID NO. 5 recognizes an amplified sequence;

- le plant de pomme de terre est infecté par une souche Alternaria de la section Porri lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 6 reconnaît une séquence amplifiée ;- the potato plant is infected with an Alternaria strain from the Porri section when the sequence probe SEQ ID NO. 6 recognizes an amplified sequence;

- le plant de pomme de terre est infecté par au moins une souche de la section Alternaria et au moins une souche de la section Porri lorsque les sondes de SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6 reconnaissent chacune une séquence amplifiée.- the potato plant is infected with at least one strain from the Alternaria section and at least one strain from the Porri section when the probes of SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.6 each recognize an amplified sequence.

L’invention concerne, dans son acceptation la plus large, une méthode de discrimination entre un plant végétal infecté par l’Alternariose dont l’infection est causée par une souche Alternaria de la section Alternaria et dont l’infection est causée par une souche Alternaria de la section Porri consistant à mettre en œuvre la méthode de détection telle que définie précédemment en considérant que :The invention relates, in its broadest acceptance, to a method of discrimination between a plant plant infected with Alternaria whose infection is caused by an Alternaria strain of the Alternaria section and whose infection is caused by an Alternaria strain of the Porri section consisting in implementing the detection method as defined above, considering that:

- le plant est infecté par une souche Alternaria de la section Alternaria lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 5 reconnaît une séquence amplifiée- the plant is infected with an Alternaria strain from the Alternaria section when the sequence probe SEQ ID NO. 5 recognizes an amplified sequence

- te plant est infecté par une souche Alternaria de la section Porri lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 6 reconnaît une séquence amplifiée ;- the plant is infected with an Alternaria strain from the Porri section when the sequence probe SEQ ID NO. 6 recognizes an amplified sequence;

- le plant est infecté par au moins deux souches Alternaria, à savoir au moins une souche de la section Alternaria et au moins une souche de la section Porri lorsque les sondes de SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6 reconnaissent chacune une séquence amplifiée.- the plant is infected with at least two Alternaria strains, namely at least one strain from the Alternaria section and at least one strain from the Porri section when the probes of SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.6 each recognize an amplified sequence.

Pour concevoir une telle méthode de diagnostic, tes inventeurs ont mis au point :To design such a diagnostic method, your inventors have developed:

- d’une part des couples amorces/sonde permettant d’amplifier de façon spécifique une séquence caractéristique de chacune des sous-espèces Alternaria de la section Alternaria puis de détecter avec une seule sonde les différents amplicons ;- on the one hand, the primers / probe pairs making it possible to specifically amplify a sequence characteristic of each of the Alternaria subspecies of the Alternaria section and then to detect with a single probe the different amplicons;

- d’autre part des couples amorces/sonde permettant d’amplifier de façon spécifique une séquence caractéristique de chacune des sous-espèces Alternaria de la section Porri puis de détecter avec une seule sonde les différents amplicons ;- on the other hand, the primers / probe pairs making it possible to specifically amplify a sequence characteristic of each of the Alternaria subspecies of the Porri section and then to detect with a single probe the different amplicons;

Puis, ils ont mis au point des conditions de réaction permettant un duplexage de deux réactions d’amplification et détection en choisissant un couple d’amorœs/sonde pour chacune des sections - les deux couples choisis devant être compatibles entre eux (pas de réaction/détection croisée) - et en définissant les conditions d’amplification et de détection appropriées pour tes deux réactions. De plus, tes sondes ont été marquées différemment de sorte à pouvoir tes détecter après hybridation avec les séquences amplifiées.Then, they developed reaction conditions allowing a duplexing of two amplification and detection reactions by choosing a pair of primers / probe for each of the sections - the two couples chosen having to be compatible with each other (no reaction / cross-detection) - and by defining the appropriate amplification and detection conditions for your two reactions. In addition, your probes have been labeled differently so that they can be detected after hybridization with the amplified sequences.

Dans un mode de réalisation préféré, les sondes sont marquées avec des étiquettes antigèniques, par exempte F AM, digoxigénine... Ainsi, tes sondes peuvent être révélées de manière différentielle grâce à des anticorps spécifiques, par exemple fixés sur tes membranes nitrocellulosique insérées dans tes cassettes de révélation.In a preferred embodiment, the probes are labeled with antigenic labels, for example F AM, digoxigenin ... Thus, your probes can be revealed in a differential manner thanks to specific antibodies, for example fixed on your nitrocellulosic membranes inserted in your revelation tapes.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la détection est ciblée sur l’Alternariose de la pomme de terre causée par un pathogène du genre Alternaria de la section Alternaria. Cette méthode comprend :In a particular embodiment of the invention, the detection is targeted at potato alternaria caused by a pathogen of the genus Alternaria of the Alternaria section. This method includes:

a) le prélèvement d’un échantillon de feuille de pomme de terre suspectée d’être infectée par un pathogène responsable de l’Alternariose ;a) taking a sample of a potato leaf suspected of being infected with a pathogen responsible for Alternaria;

b) l’extraction de l’ADN présent dans ledit échantillon ;b) extracting the DNA present in said sample;

c) l’amplification d’une séquence d’ADN spécifique par la méthode d’amplification par recombinase polymérase à l’aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 et d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 5;c) amplification of a specific DNA sequence by the recombinase polymerase amplification method using the primers of sequences SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2 and a probe of sequence SEQ ID NO. 5;

d) la détermination de la présence d’un pathogène responsable de l’Alternariose lorsqu’une séquence amplifiée est détectée à l’aide d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 5.d) determining the presence of a pathogen responsible for Alternariasis when an amplified sequence is detected using a sequence probe SEQ ID NO. 5.

Dans son acceptation la plus large, l’invention concerne aussi une méthode de détection de l’Alternariose causée par un pathogène du genre Altemaria de la section Alternaria comprenant :In its broadest acceptance, the invention also relates to a method for detecting alternaria caused by a pathogen of the genus Altemaria in the Alternaria section, comprising:

a) le prélèvement d’un échantillon de feuille suspectée d’être infectée par un pathogène responsable de l’Alternariose ;a) taking a sample of a leaf suspected of being infected with a pathogen responsible for Alternariasis;

b) l’extraction de l’ADN à partir dudit échantillon ;b) extracting DNA from said sample;

c) l’amplification dudit ADN par la méthode d’amplification par recombinase polymérase à l’aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 et d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 5 ;c) amplification of said DNA by the method of amplification by recombinase polymerase using the primers of sequences SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2 and a probe of sequence SEQ ID NO. 5;

d) la détermination de ia présence d’un pathogène responsable de l’Alternariose lorsqu’une séquence amplifiée est détectée à l’aide d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 5.d) the determination of the presence of a pathogen responsible for Alternariasis when an amplified sequence is detected using a probe with sequence SEQ ID NO. 5.

Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, la détection est ciblée sur la détection de l’Alternariose de la pomme de terre causée par un pathogène du genre Alternaria de la section Porri. Cette méthode comprend :In another particular embodiment of the invention, the detection is targeted at the detection of potato alternaria caused by a pathogen of the genus Alternaria of the Porri section. This method includes:

a) te prélèvement d’un échantillon de feuille de pomme de terre suspectée d’être infectée par un pathogène responsable de l’Alternariose ;a) taking a sample of a potato leaf suspected of being infected with a pathogen responsible for Alternaria;

b) l’extraction de l’ADN à partir dudit échantillon ;b) extracting DNA from said sample;

c) l’amplification dudit ADN par la méthode d’amplification par recombinase polymérase à l’aide des amorces de séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 et d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 6 ;c) amplification of said DNA by the recombinase polymerase amplification method using the primers of sequences SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4 and a probe of sequence SEQ ID NO. 6;

d) te détermination de la présence d'un pathogène responsable de l’Alternariose lorsqu’une séquence amplifiée est détectée à l’aide d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 6.d) determining the presence of a pathogen responsible for Alternariasis when an amplified sequence is detected using a sequence probe SEQ ID NO. 6.

Dans son acceptation la plus large, l’invention concerne aussi une méthode de détection de l’Alternariose causée par un pathogène du genre Alternaria de la section Parti comprenant :In its widest acceptance, the invention also relates to a method for detecting Alternaria caused by a pathogen of the genus Alternaria of the Party section comprising:

a) la mise à disposition d’un échantillon de feuille suspectée d’être infectée par un pathogène responsable de l’Alternariosea) the provision of a leaf sample suspected of being infected with a pathogen responsible for Alternariasis

b) l’extraction de l’ADN à partir dudit échantillonb) the extraction of DNA from said sample

c) l’amplification dudit ADN par te méthode d’amplification par recombinase polymérase à l’aide des amorces de séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 et d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 6 ;c) amplification of said DNA by the amplification method by recombinase polymerase using the primers of sequences SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4 and a probe of sequence SEQ ID NO. 6;

d) la détermination de la présence d’un pathogène responsable de l’Alternariose lorsqu’une séquence amplifiée est détectée à l’aide d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 6.d) determining the presence of a pathogen responsible for Alternariasis when an amplified sequence is detected using a sequence probe SEQ ID NO. 6.

Un troisième objet de l’invention concerne un kit de détection de la présence d’une Alternariose chez un plant de pomme de terre et de discrimination entre une infection causée par souches Alternaria de la section Alternaria et une infection causée par une souche Alternaria de la section Porri utilisable avec la méthode RPA et comprenant :A third subject of the invention relates to a kit for detecting the presence of Alternariasis in a potato plant and for discriminating between an infection caused by Alternaria strains from the Alternaria section and an infection caused by an Alternaria strain from the Porri section usable with the RPA method and comprising:

- Deux couples d’amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Alternaria appartenant aux sections Alternaria et Porri, ces deux couples d’amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et de séquences SEQ ID NO.3 et 4 respectivement ;- Two pairs of primers for amplification by RPA of the specific sequences of the different strains of Alternaria belonging to the Alternaria and Porri sections, these two pairs of primers being of sequences SEQ ID NO.1 and 2 and of sequences SEQ ID NO.3 and 4 respectively;

Deux sondes ADN de séquences SEQ ID NO. 5 et 6 spécifiques des séquences amplifiées grâce aux couples d’amorces de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO. 3 et 4 respectivement, ces deux sondes portant chacune des étiquettes antigèniques particulières ;Two DNA probes with sequences SEQ ID NO. 5 and 6 specific for the amplified sequences thanks to the pairs of primers of sequences SEQ ID NO.1 and 2 and SEQ ID NO. 3 and 4 respectively, these two probes each carrying specific antigenic labels;

Des bandelettes nitrocellulosiques sur lesquelles sont fixés des d’anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigèniques présentes sur les sondes.Nitrocellulose strips on which antibodies are fixed allowing the specific detection of the antigenic labels present on the probes.

Dans son acceptation la plus large, l’invention concerne aussi un kit de détection de la présence d’une Alternariose chez un plant végétal et de discrimination entre une infection causée par souches Alternaria de la section Alternaria et une infection causée par une souche Alternaria de la section Porri utilisable avec la méthode RPA et comprenant :In its broadest acceptance, the invention also relates to a kit for detecting the presence of Alternariasis in a plant plant and for discriminating between an infection caused by Alternaria strains of the Alternaria section and an infection caused by an Alternaria strain of the Porri section usable with the RPA method and comprising:

- Deux couples d’amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Alternaria, ces deux couples d’amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO.3 et 4 respectivement ;- Two pairs of primers for amplification by RPA of the specific sequences of the different strains of Alternaria, these two pairs of primers being of sequences SEQ ID NO.1 and 2 and SEQ ID NO.3 and 4 respectively;

Deux sondes ADN de séquences SEQ ID NO. 5 et 6 spécifiques des séquences amplifiées grâce aux couples d’amorces de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO. 3 et 4 respectivement, ces deux sondes portant chacune des étiquettes antigéniques particulières.Two DNA probes with sequences SEQ ID NO. 5 and 6 specific for the amplified sequences thanks to the pairs of primers of sequences SEQ ID NO.1 and 2 and SEQ ID NO. 3 and 4 respectively, these two probes each carrying specific antigenic labels.

- Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d’anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes.- Strips on which antibodies are fixed allowing the specific detection of the antigenic labels present on the probes.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, te kit est destiné à te détection de la présence d’une Alternariose causée par souches Alternaria de te section Alternaria chez un plant de pomme de terre. Ce kit est utilisable avec la méthode RPA et comprenant notamment:In a particular embodiment of the invention, the kit is intended for detecting the presence of an Alternariasis caused by Alternaria strains of the Alternaria section in a potato plant. This kit can be used with the RPA method and includes in particular:

- un couple d’amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d’Alternaria, ce couple d’amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2;- a pair of primers for amplification by RPA of the specific sequences of the different strains of Alternaria, this pair of primers being of sequences SEQ ID NO.1 and 2;

une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 5 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ;a DNA probe of sequence SEQ ID NO. 5 specific for the amplified sequences, this probe carrying a specific antigenic label;

- des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d’anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes.- strips on which antibodies are fixed allowing the specific detection of the antigenic labels present on the probes.

Dans son acceptation la plus large, l’invention concerne aussi un kit de détection de la présence d’une Alternariose causée par souches Alternaria de la section Alternaria chez un plant végétal utilisable avec te méthode RPA et comprenant :In its widest acceptance, the invention also relates to a kit for detecting the presence of an Alternariasis caused by Alternaria strains of the Alternaria section in a plant plant usable with the RPA method and comprising:

- Un couple d’amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d’Alternaria, ce couple d’amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2;- A pair of primers for amplification by RPA of the specific sequences of the different strains of Alternaria, this pair of primers being of sequences SEQ ID NO.1 and 2;

Une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 5 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ;A DNA probe of sequence SEQ ID NO. 5 specific for the amplified sequences, this probe carrying a specific antigenic label;

- Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d’anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes.- Strips on which antibodies are fixed allowing the specific detection of the antigenic labels present on the probes.

Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, le kit est destiné à la détection de la présence d’une Alternariose causée par souches Alternaria de la section Perri chez un plant de pomme de terre. Ce kit est utilisable avec ta méthode RPA et comprenant notamment :In another particular embodiment of the invention, the kit is intended for the detection of the presence of Alternariasis caused by Alternaria strains of the Perri section in a potato plant. This kit can be used with your RPA method and includes in particular:

un couple d amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d’Alternaria, ce couple d’amorces étant de séquences SEQ ID NO.3 et 4;a pair of primers for amplification by RPA of the specific sequences of the different strains of Alternaria, this pair of primers being of sequences SEQ ID NO.3 and 4;

une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 6 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ;a DNA probe of sequence SEQ ID NO. 6 specific for the amplified sequences, this probe bearing a specific antigenic label;

- des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d’anticorps permettant ta détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes.- strips on which antibodies are fixed allowing your specific detection of the antigenic labels present on the probes.

Dans son acceptation la plus large, l’invention concerne aussi un kit de détection de la présence d’une Alternariose causée par souches Alternaria de la section Porri chez un plant végétal utilisable avec la méthode RPA et comprenant :In its widest acceptance, the invention also relates to a kit for detecting the presence of Alternariasis caused by Alternaria strains of the Porri section in a plant plant usable with the RPA method and comprising:

- Un couple d’amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d’Alternaria, ce couple d’amorces étant de séquences SEQ ID NO.3et4:- A pair of primers for amplification by RPA of the specific sequences of the different strains of Alternaria, this pair of primers being of sequences SEQ ID NO.3et4:

Une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 6 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ;A DNA probe of sequence SEQ ID NO. 6 specific for the amplified sequences, this probe bearing a specific antigenic label;

Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d’anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes.Strips on which antibodies are fixed allowing the specific detection of the antigenic labels present on the probes.

Lorsque le kit révèle une infection de type Alternariose causée par une souche Porri, il est important de mettre rapidement en place un protocole de traitement antifongique approprié. Les kits selon l’invention constituent donc des outils d’aide à la décision (OAD) en vue d’un traitement antifongique à savoir : (i) s’il faut ou non traiter le champ de pommes de terre et dans I’affirmative, (ii) quel type de traitement est approprié en fonction du type de souche identifié.When the kit reveals an Alternariasis type infection caused by a Porri strain, it is important to quickly set up an appropriate antifungal treatment protocol. The kits according to the invention therefore constitute decision support tools (OAD) for antifungal treatment, namely: (i) whether or not to treat the potato field and if so , (ii) what type of treatment is appropriate depending on the type of strain identified.

Les souches responsables de l’Alternariose détectées par les méthodes et kits selon l’invention sont les souches de la section Alternaria de type A. alternate, A. arborescens, A. tenuissima et A. dumosa, et les souches de la section Porri de type A. solani, A. grandis, A. protenta, A. linariae.The strains responsible for Alternariasis detected by the methods and kits according to the invention are the strains of the Alternaria section of type A. alternate, A. arborescens, A. tenuissima and A. dumosa, and the strains of the Porri section of type A. solani, A. grandis, A. protenta, A. linariae.

PARTIE EXPERIMENTALEEXPERIMENTAL PART

La présente invention peut être mise en œuvre en proposant un kit de détection de terrain tel que le Flashdiag®ALT présenté dans cet exempte.The present invention can be implemented by proposing a terrain detection kit such as the Flashdiag®ALT presented in this example.

L’amplification des séquences spécifiques des pathogènes responsables de l’Alternariose de la pomme de terre est réalisée par la méthode d’amplification par recombinase polymérase telle que décrite dans Piepenburg O. et al. (PLOS Biology, July 2006, Volume 4, Issue 7, page 1115). Les éléments spécifiques développés dans te cadre de la présente invention sont les couples d’amorces et sondes décrites ci-après.Amplification of the specific sequences of the pathogens responsible for potato Alternaria is carried out by the amplification method by recombinase polymerase as described in Piepenburg O. et al. (PLOS Biology, July 2006, Volume 4, Issue 7, page 1115). The specific elements developed in the context of the present invention are the pairs of primers and probes described below.

L'une des amorces est liée à un marqueur biotine,One of the primers is linked to a biotin marker,

Pour l’amplication/ détection des souches de la section Alternaria:For the amplification / detection of strains from the Alternaria section:

- amorce sens ALT .aIt...F : [5’BiotinTEG] TGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCT (SEQ ID NO.1)- primer sense ALT .aIt ... F: [5’BiotinTEG] TGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCT (SEQ ID NO.1)

- amorce anti-sens ALT_alt_R : GTATCCCTACCTGATCCGAG (SEQ ID NO.2)- antisense primer ALT_alt_R: GTATCCCTACCTGATCCGAG (SEQ ID NO.2)

- sonde ALT_nfo_alt : 6-FAM]- ALT_nfo_alt probe: 6-FAM]

CCAGTAGGCCGGCTGCCAA[THF]TACTTTAAGGCGAGT [03 spacer] (SEQ ID NO.5)CCAGTAGGCCGGCTGCCAA [THF] TACTTTAAGGCGAGT [03 spacer] (SEQ ID NO.5)

Pour l’amplication/ détection des souches de la section Porri:For the application / detection of strains from the Porri section:

- amorce sens ALT_por_F : TTTCCTTTCACACGGACTGC. (SEQ ID NO.3)- primer direction ALT_por_F: TTTCCTTTCACACGGACTGC. (SEQ ID NO.3)

- amorce anti-sens ALT__por__R: [5’BiotinTEG]- antisense primer ALT__por__R: [5’BiotinTEG]

GTCGCCAGGGCATGATATCGCCAAC (SEQ ID NO.4) sonde ALT_nfo__por : [5’ Digoxigenin]GTCGCCAGGGCATGATATCGCCAAC (SEQ ID NO.4) probe ALT_nfo__por: [5 ’Digoxigenin]

CTTTCACACGGACTGCTGCAT[THF]CACCTGGTGCTTCCTC [C3 spacer] (SEQ ID NO.6)CTTTCACACGGACTGCTGCAT [THF] CACCTGGTGCTTCCTC [C3 spacer] (SEQ ID NO.6)

Le site THF correspond a un tétrahyfdrofurane utilisé pour créer un site abasique stable dans l’oligonucléotide.The THF site corresponds to a tetrahyfdrofuran used to create a stable abasic site in the oligonucleotide.

Le mix réactionnel pour une réaction dans lequel tes séquences d’intérêt sont amplifiés puis hybridées avec tes sondes spécifiques en duplex est décrit dans te Tableau 1.The reaction mix for a reaction in which your sequences of interest are amplified and then hybridized with your specific duplex probes is described in Table 1.

Tampon de réhydratation Stamp rehydration 14,75 μΙ - 14.75 μΙ - MgÔÀC (280mM) MgÔÀC (280mM) 1,25 μΙ 1.25 μΙ 16,8 mM 16.8 mM ÀLT alt.F(10pM) ÀLT alt.F (10pM) ï,26 μΙ ï, 26 μΙ 504 η Μ 504 η Μ ALT_alt__R (10pM) ALT_alt__R (10pM) 1,26 μΙ 1.26 μΙ 504 ηΜ 504 ηΜ ALTnfo_alt (10μΜ) ALTnfo_alt (10μΜ) 0,36 μΙ 0.36 μΙ 144 ηΜ 144 ηΜ ALT por_F (1 OpWI) ALT por_F (1 OpWI) 0,84 μΙ 0.84 μΙ 336 ηΜ 336 ηΜ ALTjaor_R (10pM) ALTjaor_R (10pM) 0,84 μΙ 0.84 μΙ 336 ηΜ 336 ηΜ SOL_nfo__por (10μΜ) SOL_nfo__por (10μΜ) 0,24 μΙ 0.24 μΙ 96 ηΜ 96 ηΜ

Tableau 1 : Mix réactionnel du Flashdiaq®ALTTable 1: Reaction mix of Flashdiaq®ALT

L© protocole final Flashdiag®ALT est composé des étapes suivantes :The final Flashdiag®ALT protocol consists of the following steps:

1. Prélèvement d un morceau de feuille présentant un symptôme avec un emporte-pièce1. Picking a piece of leaf showing a symptom with a cookie cutter

2. L’échantillon est placé dans un sachet d’extraction contenant 3ml de tampon d’extraction d’ADN2. The sample is placed in an extraction bag containing 3 ml of DNA extraction buffer

3. L’échantillon est broyé jusqu’à obtenir un broyât homogène3. The sample is ground until a homogenous ground product is obtained

4. Le broyât est prélevé à l’aide d’une pipette de transfert4. The ground material is removed using a transfer pipette

5. Le broyât est transféré dans une seringue 5ml équipée d’un filtre pour se débarrasser des débris végétaux5. The ground material is transferred to a 5ml syringe equipped with a filter to get rid of plant debris

6. Le broyât filtré est recueilli dans un tube6. The filtered ground material is collected in a tube

7. Un tube contenant le culot lyophilisé contenant les sondes et les amorces telle que définies cl-dessus et une bille magnétique est réhydraté avec un mélange de tampon de réhydratation et du MgOAc à l’aide d’une pipette à volume fixe équipée de cônes 200pl afin d’obtenir un mix réactionnel tel que décrit au Tableau 1.7. A tube containing the lyophilized pellet containing the probes and the primers as defined above and a magnetic bead is rehydrated with a mixture of rehydration buffer and MgOAc using a fixed volume pipette equipped with cones 200pl in order to obtain a reaction mix as described in Table 1.

8. L’ADN précédemment extrait est ensuite transféré dans te mix de réaction nécessaire à la réaction d amplification par recombinase polymérase préparé à l’étape 7, à l aide d’une oese et mélangé pendant environ 15 secondes.8. The DNA previously extracted is then transferred into the reaction mix necessary for the amplification reaction by recombinase polymerase prepared in step 7, using an oese and mixed for approximately 15 seconds.

9. Le tube est placé dans te bloc chauffant de type Twirla avec le programme suivant :9. The tube is placed in the Twirla type heating block with the following program:

-Température :39°C-Temperature: 39 ° C

-Durée :20min-Duration: 20min

-Temps d’agitation :5 sec-Stirring time: 5 sec

-Intervalle d’agitation :5 min-Shaking interval: 5 min

10. Une fois la réaction terminée, le tube est placé dans une cassette de type UStar (ref : D001-05 vendu par TwistDx) pour la révélation du résultat. Cette cassette comprend une bandelette de nitrocellulose sur laquelle sont fixés des anticorps capables de reconnaître les amplicons marqués à l’aide de FAM (sonde spécifique des amplicons de la section Alternaria), ou de la digoxigénine (sonde spécifique des amplicons de la section Porri).10. Once the reaction is complete, the tube is placed in a UStar type cassette (ref: D001-05 sold by TwistDx) to reveal the result. This cassette includes a nitrocellulose strip on which are fixed antibodies capable of recognizing the amplicons labeled using FAM (probe specific for amplicons in the Alternaria section), or digoxigenin (probe specific for amplicons in the Porri section) .

Le protocole complet dure donc environ 30-35min et fournit un résultat simple :The complete protocol therefore lasts around 30-35min and provides a simple result:

- Bande contrôle : Apparition à chaque test- Control strip: Appearance at each test

- Bande-test supérieure : Présence d’une espèce de la Section Alternaria- Upper test strip: Presence of a species from the Alternaria Section

- Bande-test inférieure : Présence d’une espèce de la Section Porri- Lower test strip: Presence of a Porri Section species

Le résultat obtenu grâce au kit Flashdiag®ALT est représenté à la Figure 1.The result obtained with the Flashdiag®ALT kit is shown in Figure 1.

Le prototype Flashdiag®ALT permet donc de détecter et différencier correctement tes espèces pathogènes d’Alternaria de la section Alternaria et la section Porri sans réactions croisées.The Flashdiag®ALT prototype therefore makes it possible to correctly detect and differentiate your pathogenic species of Alternaria from the Alternaria section and the Porri section without cross-reactions.

Claims (8)

REVENDICATIONS 1. Méthode de détection de l’alternariose, notamment de la pomme de terre, comprenant :1. Method for detecting alternaria, especially potato, comprising: a) le prélèvement d’un échantillon de feuille suspectée d’être infectée par un pathogène responsable de l’alternariosea) taking a sample of a leaf suspected of being infected with a pathogen responsible for alternaria b) l’extraction de l’ADN à partir dudit échantillonb) the extraction of DNA from said sample c) l’amplification duplex dudit ADN par la méthode d’amplification par recombinase polymérase à l’aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 et de l’une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6.c) duplex amplification of said DNA by the method of amplification by recombinase polymerase using the primers of sequences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4 and one of the sequence probes SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.6. d) la détermination de la présence d’un pathogène responsable de l’Alternariose lorsqu’au moins une séquence amplifiée est détectée à l’aide de l’une des sondes de séquences SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6.d) determining the presence of a pathogen responsible for Alternariasis when at least one amplified sequence is detected using one of the sequence probes SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.6. 2. Méthode de discrimination entre un plant végétal infecté par l’alternariose dont I infection est causée par une souche Alternaria de la section Alternaria et dont l’infection est causée par une souche Alternaria de la section Porri consistant à mettre en œuvre la méthode de détection telle que définie à la revendication 1 en considérant que :2. Method of discrimination between a plant plant infected with alternaria whose infection is caused by an Alternaria strain from the Alternaria section and whose infection is caused by an Alternaria strain from the Porri section consisting in implementing the method of detection as defined in claim 1, considering that: - le plant est infecté par une souche Alternaria de la section Alternaria lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 5 reconnaît une séquence amplifiée- the plant is infected with an Alternaria strain from the Alternaria section when the sequence probe SEQ ID NO. 5 recognizes an amplified sequence - le plant est infecté par une souche Alternaria de la section Porri lorsque la sonde de séquence SEQ ID NO. 6 reconnaît une séquence amplifiée ;- the plant is infected with an Alternaria strain from the Porri section when the sequence probe SEQ ID NO. 6 recognizes an amplified sequence; - le plant est infecté par au moins deux souches Alternaria, à savoir au moins une souche de la section Alternaria et au moins une souche de la section Rom lorsque les sondes de SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO.6 reconnaissent chacune une séquence amplifiée.- the plant is infected with at least two Alternaria strains, namely at least one strain from the Alternaria section and at least one strain from the Rom section when the probes of SEQ ID NO. 5 and SEQ ID NO.6 each recognize an amplified sequence. 3. Méthode de détection de l’alternariose causée par un pathogène du genre Alternaria de la section Alternaria comprenant :3. Method for detecting alternaria caused by a pathogen of the genus Alternaria from the Alternaria section, comprising: a) le prélèvement d’un échantillon de feuille suspectée d’être infectée par un pathogène responsable de l’Alternariose ;a) taking a sample of a leaf suspected of being infected with a pathogen responsible for Alternariasis; b) l’extraction de l’ADN à partir dudit échantillon ;b) extracting DNA from said sample; c) I amplification dudit ADN par la méthode d’amplification par recombinase polymérase à l’aide des amorces de séquences SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2 et d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 5 ;c) I amplification of said DNA by the amplification method by recombinase polymerase using the primers of sequences SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2 and a probe of sequence SEQ ID NO. 5; d) la détermination de la présence d’un pathogène responsable de l’Alternariose lorsqu’une séquence amplifiée est détectée à l’aide d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 5.d) determining the presence of a pathogen responsible for Alternariasis when an amplified sequence is detected using a sequence probe SEQ ID NO. 5. 4. Méthode de détection de l’alternariose causée par un pathogène du genre Alternaria de la section Porri comprenant :4. Method for detecting alternariasis caused by a pathogen of the genus Alternaria from the Porri section, comprising: a) la mise à disposition d’un échantillon de feuille suspectée d’être infectée par un pathogène responsable de l’alternariosea) the provision of a leaf sample suspected of being infected with a pathogen responsible for alternaria b) l’extraction de (’ADN à partir dudit échantillonb) extracting (’DNA from said sample c) I amplification dudit ADN par la méthode d’amplification par recombinase polymérase à l’aide des amorces de séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4 et d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 6 ;c) I amplification of said DNA by the method of amplification by recombinase polymerase using the primers of sequences SEQ ID NO.3 and SEQ ID NO.4 and a probe of sequence SEQ ID NO. 6; d) la détermination de la présence d’un pathogène responsable de l’alternariose lorsqu’une séquence amplifiée est détectée à l’aide d’une sonde de séquence SEQ ID NO. 6.d) determining the presence of a pathogen responsible for alternariasis when an amplified sequence is detected using a sequence probe SEQ ID NO. 6. 5. Kit de détection de la présence d’une alternariose chez un plant végétal et de discrimination entre une infection causée par souches Alternaria de la section Alternaria et une infection causée par une souche Alternaria de la section Porri utilisable avec la méthode RPA et comprenant :5. Kit for detecting the presence of alternariosis in a plant plant and for discriminating between an infection caused by Alternaria strains from the Alternaria section and an infection caused by an Alternaria strain from the Porri section usable with the RPA method and comprising: Deux couples d amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d Alternaria, ces deux couples d’amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO.3 et 4 respectivement ;Two pairs of primers for amplification by RPA of the specific sequences of the different strains of Alternaria, these two pairs of primers being of sequences SEQ ID NO.1 and 2 and SEQ ID NO.3 and 4 respectively; - Deux sondes ADN de séquences SEQ ID NO. 5 et 6 spécifiques des séquences amplifiées grâce aux couples d’amorces de séquences SEQ ID NO.1 et 2 et SEQ ID NO. 3 et 4 respectivement, ces deux sondes portant chacune des étiquettes antigéniques particulières.- Two DNA probes with sequences SEQ ID NO. 5 and 6 specific for the amplified sequences thanks to the pairs of primers of sequences SEQ ID NO.1 and 2 and SEQ ID NO. 3 and 4 respectively, these two probes each carrying specific antigenic labels. - Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d’anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes.- Strips on which antibodies are fixed allowing the specific detection of the antigenic labels present on the probes. 6. Kit de détection de la présence d’une alternariose causée par souches Alternaria de la section Alternaria chez un plant végétal utilisable avec la méthode RPA et comprenant :6. Kit for detecting the presence of alternaria caused by Alternaria strains from the Alternaria section in a plant plant usable with the RPA method and comprising: Un couple d amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d’Alternaria, ce couple d’amorces étant de séquences SEQ ID NO.1 et 2;A pair of primers for amplification by RPA of the specific sequences of the different strains of Alternaria, this pair of primers being of sequences SEQ ID NO.1 and 2; Une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 5 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ;A DNA probe of sequence SEQ ID NO. 5 specific for the amplified sequences, this probe carrying a specific antigenic label; - Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d’anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes.- Strips on which antibodies are fixed allowing the specific detection of the antigenic labels present on the probes. 7. Kit de détection de la présence d’une alternariose causée par souches Alternaria de la section Porri chez un plant végétal utilisable avec la méthode RPA et comprenant :7. Kit for detecting the presence of alternariasis caused by Alternaria strains from the Porri section in a plant plant usable with the RPA method and comprising: Un couple d amorces pour amplification par RPA des séquences spécifiques des différentes souches d'Alternaria, ce couple d’amorces étant de séquences SEQ ID NO.3 et 4;A pair of primers for amplification by RPA of the specific sequences of the different strains of Alternaria, this pair of primers being of sequences SEQ ID NO.3 and 4; Une sonde ADN de séquence SEQ ID NO. 6 spécifique des séquences amplifiées, cette sonde portant une étiquette antigénique particulière ;A DNA probe of sequence SEQ ID NO. 6 specific for the amplified sequences, this probe bearing a specific antigenic label; - Des bandelettes sur lesquelles sont fixés des d’anticorps permettant la détection spécifique des étiquettes antigéniques présentes sur les sondes.- Strips on which antibodies are fixed allowing the specific detection of the antigenic labels present on the probes. 8. Méthode selon l’une des revendications 1 à 4 ou kit selon l’une des revendications8. Method according to one of claims 1 to 4 or kit according to one of claims 5 à 7 dans lesquels les souches responsables de l’Alternariose sont choisies parmi les souches de la section Alternaria de type A. alternata, A. arborescens, A. tenuissima et A. dumosa, ou les souches de la section Porri de type A. solani, A. grandis, A. protenta, A. linariae.5 to 7 in which the strains responsible for Alternariasis are chosen from the strains of the Alternaria section of type A. alternata, A. arborescens, A. tenuissima and A. dumosa, or the strains of section Porri of type A. solani, A. grandis, A. protenta, A. linariae.
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