FR3068987A1 - PROCESS FOR PREPARING A BI-PHASIC BACTERIA CULTURE MEDIUM - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique (1) conditionné dans un tube (2) destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose comprenant les étapes successives suivantes dans lesquelles : a.1) on verse au fond du tube, un premier milieu aqueux apte à être congelé ou gélifié, et on incline le dit tube selon une inclinaison déterminée par rapport à la verticale, et a.2) on congèle ou gélifie ledit premier milieu jusqu'à former une première couche à l'état solide tel que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit tube, et b.1) on coule dans le tube, un deuxième milieu aqueux qui est un milieu de culture apte à former un milieu de culture solide, et on incline le dit tube selon une inclinaison déterminée (al) de son axe longitudinal (XX') par rapport à la verticale pour former une deuxième couche de dit deuxième milieu par-dessus ladite première couche, et b.2) on gélifie ledit deuxième milieu jusqu'à former une deuxième couche de dit milieu de culture solide gélosé.The present invention relates to a process for preparing a biphasic solid culture medium (1) packaged in a tube (2) for culturing bacteria under aerobic conditions comprising the following successive steps in which: a.1) poured into the bottom of the tube, a first aqueous medium capable of being frozen or gelled, and said tube is inclined at an inclination determined with respect to the vertical, and a.2) is frozen or gelled said first medium to form a first layer in the solid state such that the upper surface of the first layer has a determined inclination (a2) with respect to the axis (XX ') of said tube, and b.1) is poured into the tube, a second aqueous medium which is a culture medium capable of forming a solid culture medium, and said tube is inclined at a given inclination (a1) of its longitudinal axis (XX ') with respect to the vertical to form a second layer of said second millet above said first layer, and b.2) said second medium is gelled to form a second layer of said solid agar culture medium.
Description
PROCEDE DE PREPARATION D'UN MILIEU DE CULTURE BI-PHASIQUE DE BACTERIEPROCESS FOR THE PREPARATION OF A BI-PHASIC BACTERIA CULTURE MEDIUM
La présente invention concerne un procédé de préparation d'un milieu de culture gélosé - ci-après abrégé par « gélose » - pour cultiver les bactéries en conditions d'aérobiose.The present invention relates to a process for preparing an agar culture medium - hereinafter abbreviated as "agar" - for cultivating bacteria under aerobic conditions.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique conditionné dans un tube de culture de bactéries destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose, ainsi qu'un milieu de culture solide biphasique conditionné dans un dit tube et un procédé de culture de bactéries aérobie ou anaérobie avec un dit milieu de culture solide biphasique conditionné dans un dit tube.More particularly, the present invention relates to a process for the preparation of a biphasic solid culture medium conditioned in a bacteria culture tube intended for the culture of bacteria under aerobic conditions, as well as a biphasic solid culture medium conditioned in a said tube and a method of cultivating aerobic or anaerobic bacteria with a said solid biphasic culture medium conditioned in a said tube.
Lors de l'incubation des géloses ensemencées par des cultures bactériennes en aérobiose, les inventeurs ont observé une déshydratation des géloses au bout de 72 heures d'incubation. Or, certaines bactéries ont un temps de croissance plus long, supérieur à 72 heures, et qui peut aller jusqu'à 28 jours. Cette déshydratation réduit considérablement la possibilité d'une incubation longue de ces géloses empêchant ainsi les microbiologistes de réaliser des cultures de bactéries à croissance lente car la déshydratation des géloses entraîne une inhibition systématique de la croissance bactérienne. En effet, lors de la déshydratation de la gélose, il y a une perte d'eau du milieu de culture solide, ce qui a tendance à concentrer les éléments composants le milieu de culture tel que le sel par exemple. A une concentration trop importante, le sel tel que NaCI devient un inhibiteur car peu de bactéries sont halotolérantes. Par exemple, les bactéries halophiles peuvent tolérer une concentration de sel (NaCI) jusqu'à 200 g/L alors que les bactéries non halophiles ne peuvent tolérer qu'une concentration de 5 g/L.During the incubation of the agars inoculated with aerobic bacterial cultures, the inventors observed dehydration of the agars after 72 hours of incubation. However, some bacteria have a longer growth time, more than 72 hours, which can be up to 28 days. This dehydration considerably reduces the possibility of a long incubation of these agars, thus preventing microbiologists from producing cultures of slow-growing bacteria since the dehydration of the agars leads to systematic inhibition of bacterial growth. Indeed, during the dehydration of the agar, there is a loss of water from the solid culture medium, which tends to concentrate the elements making up the culture medium such as salt for example. At too high a concentration, salt such as NaCI becomes an inhibitor because few bacteria are halotolerant. For example, halophilic bacteria can tolerate a concentration of salt (NaCl) up to 200 g / L while non-halophilic bacteria can only tolerate a concentration of 5 g / L.
Cette conséquence peut ainsi entraîner une inhibition de la croissance bactérienne.This consequence can thus lead to an inhibition of bacterial growth.
Ce problème de déshydratation n'intervient qu'en aérobiose car les cultures anaérobies sont cultivées dans des boites fermées hermétiquement, empêchant ainsi l'évaporation et la déshydratation des milieux. Au contraire, les cultures aérobies sont cultivées à l'air libre, favorisant une perte d'eau des milieux, lors de leur incubation dans des enceintes à 37°C.This dehydration problem only occurs aerobically because anaerobic cultures are grown in hermetically sealed boxes, thus preventing evaporation and dehydration of the media. On the contrary, aerobic cultures are cultivated in the open air, promoting a loss of water from the media, during their incubation in enclosures at 37 ° C.
On entend ici par « aérobiose », une atmosphère d'incubation qui est de l'air ou qui contient de l'oxygène à teneur réduite par rapport à l'air.The term "aerobic" means here an incubation atmosphere which is air or which contains oxygen at a reduced content compared to air.
Dans WO2014/064359. et WO2015/162377, on a décrit des milieux de culture enrichis en agents antioxydants à savoir l'acide urique, l'acide ascorbique, le glutathion et l'hydrosulfure de sodium qui permettent d'améliorer et faciliter les conditions de croissance en culture acellulaire des bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène et notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant choisies parmi les bactéries suivantes :In WO2014 / 064359. and WO2015 / 162377, culture media enriched with antioxidant agents have been described, namely uric acid, ascorbic acid, glutathione and sodium hydrosulfide, which make it possible to improve and facilitate the conditions for growth in cell-free culture. bacteria whose growth is sensitive to oxygen tension and in particular bacteria which do not tolerate high oxygen tensions and for which optimal growth of the said bacteria requires an incubation atmosphere with relatively reduced oxygen content compared to the oxygen content of the air, said bacteria being chosen from the following bacteria:
- les bactéries anaérobies, y compris les bactéries anaérobies strictes, et- anaerobic bacteria, including strict anaerobic bacteria, and
- les bactéries microaérophiles du type citées ci-dessus.- microaerophilic bacteria of the type mentioned above.
Parmi les bactéries à croissance lente, on peut citer par exemple Mycobacterium genavensae (plusieurs semaines), Mycobacterium tubercuiosis (2-3 semaines), Bartoneiia quintana (21 jours environs), Bartoneiia henseiae (21 jours environs), Methanobrevibacter smithii (9-15 jours), ainsi que toutes les bactéries anaérobies strictes que l'on peut cultiver en aérobie (environ 5 jours minimum).Among the bacteria with slow growth, one can quote for example Mycobacterium genavensae (several weeks), Mycobacterium tubercuiosis (2-3 weeks), Bartoneiia quintana (around 21 days), Bartoneiia henseiae (around 21 days), Methanobrevibacter smithii (9-15 days), as well as all the strict anaerobic bacteria that can be grown aerobically (about 5 days minimum).
Actuellement, pour éviter cette déshydratation, les laboratoires incubent les géloses en chambre humide. Pour cela, des jarres en plastiques sont utilisées et un papier imbibé d'eau est ajouté dans la jarre dans laquelle les géloses ont été mises à incuber. La jarre est fermée hermétiquement et l'humidité reste ainsi prisonnière dans la jarre. Le problème de cette technique est le cout engendré par l'achat de ces jarres ainsi que place qui leur est consacré dans les étuves, ce qui peut être pénalisant lorsqu'il y a beaucoup de géloses à incuber.Currently, to avoid this dehydration, the laboratories incubate the agars in a humid chamber. For this, plastic jars are used and paper soaked in water is added to the jar in which the agars have been incubated. The jar is hermetically closed and the humidity remains trapped in the jar. The problem with this technique is the cost generated by the purchase of these jars as well as the space devoted to them in the ovens, which can be penalizing when there are many agars to incubate.
Pour pallier à cette déshydratation des milieux lors de leur incubation en aérobie, les inventeurs ont mis au point un procédé qui permet de réhydrater en permanence la gélose. Pour cela, les inventeurs ont élaboré un milieu de culture biphasique comprenant une gélose inclinée superposée à un milieu hydratant et un procédé de fabrication de cette gélose inclinée bi-phasique.To overcome this dehydration of the media during their aerobic incubation, the inventors have developed a process which makes it possible to permanently rehydrate the agar. For this, the inventors have developed a two-phase culture medium comprising an inclined agar superimposed on a moisturizing medium and a method of manufacturing this bi-phasic inclined agar.
On connaît des milieux de culture bi-phasique mais qui sont utilisés pour améliorer la croissance des mycobactéries, et ainsi diminuer le temps nécessaire pour la détection et augmenter son pourcentage de détection. Un milieu biphasique a été décrit pour la culture du complexe Mycobacterium tubercuiosis [1]. Un autre milieu biphasqiue permet de détecter le complexe Mycobacterium avium notamment dans le sang des patients atteints du VIH [2]. La phase solide du milieu est constituée du milieu 7H11 supplémenté en acide oléique albumine agar et la phase liquide est constituée d'un bouillon de BHI (Brain Heart Infusion). Dans les deux cas, ils comprennent un milieu liquide nutritif superposé par-dessus un milieu de culture solide ce qui empêche de réaliser une culture par ensemencement de bactérie sur milieu solide pour identifier la croissance de colonies sur milieu de culture solide.Bi-phasic culture media are known but which are used to improve the growth of mycobacteria, and thus decrease the time required for detection and increase its percentage of detection. A biphasic medium has been described for the culture of the Mycobacterium tubercuiosis complex [1]. Another biphasic medium makes it possible to detect the Mycobacterium avium complex, especially in the blood of patients with HIV [2]. The solid phase of the medium consists of the 7H11 medium supplemented with oleic acid albumin agar and the liquid phase consists of a BHI (Brain Heart Infusion) broth. In both cases, they comprise a nutritive liquid medium superimposed on a solid culture medium, which prevents culture by seeding bacteria on solid medium to identify the growth of colonies on solid culture medium.
Les inventeurs ont ainsi emprisonné la phase liquide hydratante du premier milieu sous la phase solide du deuxième milieu car lorsque la phase liquide est disposée dessus la phase solide, la surface libre d'ensemencement des bactéries aérobies par-dessus la gélose inclinée de la couche inférieure diminue voire disparait totalement en cas d'étalement du milieu de culture liquide sur toute la surface de la gélose lors de l'inclinaison du tube de culture. Ceci empêche d'observer la croissance de colonies de la bactérie ensemencée en surface du milieu de culture solide. Par ailleurs, pour les bactéries anaérobies incubées en aérobie, la présence de liquide à la surface de la gélose et plus précisément au fond du tube, favorise une croissance de ces bactéries anaérobies dans le liquide, plutôt qu'à la surface de la gélose de la deuxième couche. En effet, une certaine condition d'anaérobiose s'installe au fond du tube dans le liquide où l'oxygène est moins présent.The inventors have thus imprisoned the hydrating liquid phase of the first medium under the solid phase of the second medium because when the liquid phase is disposed above the solid phase, the free surface for seeding aerobic bacteria over the inclined agar of the lower layer decreases or even disappears completely if the liquid culture medium is spread over the entire surface of the agar when the culture tube is tilted. This prevents observation of the growth of colonies of the bacteria seeded on the surface of the solid culture medium. Furthermore, for anaerobic bacteria incubated aerobically, the presence of liquid on the surface of the agar and more precisely at the bottom of the tube, favors a growth of these anaerobic bacteria in the liquid, rather than on the surface of the agar. the second layer. Indeed, a certain condition of anaerobiosis settles at the bottom of the tube in the liquid where oxygen is less present.
Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un milieu de culture solide biphasique conditionné dans un récipient de culture de bactéries, de préférence un tube de culture de bactéries, destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes dans lesquelles :More specifically, the subject of the present invention is a process for preparing a two-phase solid culture medium packaged in a bacteria culture container, preferably a bacteria culture tube, intended for the culture of bacteria under aerobic conditions. characterized in that it comprises the following successive stages in which:
a.l) on verse au fond du récipient, un premier milieu aqueux qui est liquide ou coulable mais apte à être congelé ou gélifié, et simultanément ou après ce versement, on incline le dit récipient selon une inclinaison déterminée (al) de son axe (XX7) par rapport à la verticale, etal) pouring into the bottom of the container, a first aqueous medium which is liquid or flowable but capable of being frozen or gelled, and simultaneously or after this payment, the said container is tilted according to a determined inclination (al) of its axis (XX 7 ) relative to the vertical, and
a. 2) on congèle ou respectivement gélifie ledit premier milieu jusqu'à former une première couche du premier milieu à l'état congelé ou respectivement formant un gel qui a pris en masse telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX7) du dit récipient, etat. 2) said first medium is frozen or respectively gelated until forming a first layer of the first medium in the frozen state or respectively forming a gel which has solidified such that the upper surface of the first layer has a determined inclination (a2 ) relative to the axis (XX 7 ) of said container, and
b. l) on coule dans le récipient, un deuxième milieu aqueux qui est un milieu de culture gélosé d'une dite bactérie en conditions d'aérobiose, à l'état coulable mais apte à être gélifié et ainsi former un milieu de culture solide, et simultanément ou après ce coulage, on incline le dit récipient selon une inclinaison déterminée (al) de son axe (XX7) par rapport à la verticale pour former une deuxième couche de dit deuxième milieu à l'état coulable par-dessus ladite première couche du premier milieu solide à l'état congelé ou respectivement formant un gel, la surface supérieure de la dite deuxième couche étant inclinée (a2) par rapport à l'axe (XX7) du dit récipient de préférence parallèlement à la surface supérieure de la première couche, etb. l) a second aqueous medium is poured into the container, which is an agar culture medium of a said bacterium under aerobic conditions, in the flowable state but capable of being gelled and thus forming a solid culture medium, and simultaneously or after this pouring, said container is inclined at a determined inclination (a) of its axis (XX 7 ) relative to the vertical to form a second layer of said second medium in the flowable state over said first layer of the first solid medium in the frozen state or respectively forming a gel, the upper surface of said second layer being inclined (a2) relative to the axis (XX 7 ) of said container preferably parallel to the upper surface of the first layer, and
b.2) on gélifie ledit deuxième milieu jusqu'à former une deuxième couche de dit milieu de culture solide gélosé d'une dite bactérie solide formant un gel qui a pris en masse telle que la surface supérieure de la première couche présente une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX7) du dit récipient.b.2) said second medium is gelled until it forms a second layer of said solid culture medium agar of a said solid bacterium forming a gel which has solidified such that the upper surface of the first layer has a determined inclination (a2) relative to the axis (XX 7 ) of said container.
On comprend que :We understand that:
- à l'étape a.l) ou b.l), si le premier ou deuxième milieu est apte à être gélifié et à l'état coulable, cela signifie qu'il contient alors au moins un agent gélifiant et qu'il se trouve à cette étape à une température à laquelle - après avoir été chauffé pour être rendu coulable - il n' a pas encore suffisamment refroidi pour prendre en masse ou devenir trop visqueux pour être coulé, et- in step a1 or b1), if the first or second medium is capable of being gelled and in the flowable state, this means that it then contains at least one gelling agent and that it is at this step at a temperature at which - after being heated to be made pourable - it has not yet cooled sufficiently to solidify or become too viscous to be poured, and
- à l'étape a.2) ou b.2), le premier ou deuxième milieu apte à être gélifié, a refroidi et pris en masse de façon suffisamment visqueuse pour adhérer à la surface du récipient de sorte la surface supérieure de la première couche garde une inclinaison déterminée (a2) par rapport à l'axe (XX') du dit récipient quelle que soit l'inclinaison du récipient; et- In step a.2) or b.2), the first or second medium capable of being gelled, has cooled and solidified in a sufficiently viscous manner to adhere to the surface of the container so that the upper surface of the first layer keeps a determined inclination (a2) relative to the axis (XX ') of said container regardless of the inclination of the container; and
- al et a2 sont des angles complémentaires tel que al + a2=90°, et- al and a2 are complementary angles such that al + a2 = 90 °, and
- si à l'étape a.l), le dit premier milieu aqueux est un liquide ne contenant pas d'agent gélifiant, à l'étape a.2) il est congelé et après l'étape b.2) il redevient liquide après décongélation au bout d'un certain temps à température supérieure à la température de congélation.- If in step a1), said first aqueous medium is a liquid containing no gelling agent, in step a.2) it is frozen and after step b.2) it becomes liquid again after thawing after a certain time at a temperature above the freezing temperature.
De façon connue, un milieu de culture gélosé ou un milieu aqueux gélifié contient de 5 à 20% d'agents gélifiants.In known manner, an agar culture medium or an aqueous gelled medium contains from 5 to 20% of gelling agents.
En pratique, le dit récipient contenant le premier milieu contenant un agent gélifiant le cas échéant est soumis à un autoclavage en le chauffant à une température 121°C pendant 15 min qui permet de le stériliser et lui confère cette propriété de gélification lors du refroidissement après coulage à 56°C.In practice, said container containing the first medium containing a gelling agent if necessary is subjected to an autoclaving by heating it at a temperature 121 ° C for 15 min which makes it possible to sterilize it and gives it this gelling property during cooling after pouring at 56 ° C.
Selon la présente invention, on a découvert que la première couche de premier milieu aqueux liquide a pour effet une réhydratation progressive au cours du temps de la deuxième couche de milieu de culture solide selon le but de la présente invention.According to the present invention, it has been discovered that the first layer of first liquid aqueous medium has the effect of a gradual rehydration over time of the second layer of solid culture medium according to the object of the present invention.
Aux étapes a.l) et b.l), l'inclinaison du récipient permet :In steps a.l) and b.l), the inclination of the container allows:
- d'une part de garantir une épaisseur uniforme de la deuxième couche et donc une réhydratation homogène de celle-ci, eton the one hand, to guarantee a uniform thickness of the second layer and therefore a homogeneous rehydration of the latter, and
- d'autre part, augmenter la surface de contact de la deuxième couche avec la première couche et donc améliorer sa réhydratation par celle-ci, et- on the other hand, increase the contact surface of the second layer with the first layer and therefore improve its rehydration by the latter, and
- enfin, offrir une plus grande surface de travail apte à être ensemencée par des bactéries à cultiver sur la surface libre inclinée de la deuxième couche.- finally, offer a larger work surface capable of being sown with bacteria to be cultivated on the inclined free surface of the second layer.
On comprend que l'axe dudit récipient s'entend d'un axe de symétrie des parois latérales du récipient en élévation par rapport au fond, de préférence le dit récipient étant un récipient à fond plat et les parois latérales du récipient sont en élévation perpendiculairement au fond plat du dit récipient comme l'axe du dit récipient.It is understood that the axis of said container means an axis of symmetry of the side walls of the container in elevation relative to the bottom, preferably said container being a container with a flat bottom and the side walls of the container are in perpendicular elevation at the flat bottom of said container as the axis of said container.
On peut citer en particulier comme récipient de culture, un récipient de forme telle que la surface de contact de la deuxième couche avec les parois du récipient est supérieure, de préférence au moins le double par rapport à :Mention may in particular be made, as culture container, of a container such that the contact surface of the second layer with the walls of the container is greater, preferably at least double with respect to:
(a) d'une part, la surface de contact de la deuxième couche avec la première couche, et/ou (b) d'autre part, la surface de contact de la première couche avec les parois du récipient.(a) on the one hand, the contact surface of the second layer with the first layer, and / or (b) on the other hand, the contact surface of the first layer with the walls of the container.
Sur des boites de Pétri, cette condition n'est pas vérifiée.On Petri dishes, this condition is not verified.
On peut citer en particulier comme récipient de culture qui permette d'obtenir une gélose inclinée, tout récipient de préférence cylindrique et à fond plat, plus long que large, c'est à dire dont les parois latérales sont plus hautes que la largeur de la paroi de fond au-dessus de laquelle elles s'étendent.Mention may in particular be made, as culture container which makes it possible to obtain an inclined agar, any container preferably cylindrical and with a flat bottom, longer than wide, that is to say whose side walls are higher than the width of the bottom wall above which they extend.
Plus particulièrement, aux étapes a.l) et b.l), on verse une quantité de deuxième milieu supérieure à la quantité de premier milieu, de préférence les volumes respectifs de dit premier liquide par rapport au dit deuxième milieu étant tels que la surface libre de la deuxième couche s'étend depuis le fond dudit récipient jusqu'à proximité du bord supérieur du récipient.More particularly, in steps a1 and b1), an amount of second medium is poured greater than the amount of first medium, preferably the respective volumes of said first liquid with respect to said second medium being such that the free surface of the second layer extends from the bottom of said container to near the upper edge of the container.
Ceci permet que la surface de contact du deuxième milieu avec le récipient soit supérieure à celle du premier milieu et qu'ainsi l'adhérence de la deuxième couche solide sur les parois du récipient soit suffisante pour garantir que le premier milieu liquide ne déborde par-dessus la deuxième couche du dit milieu de culture en cours d'utilisation.This allows the contact area of the second medium with the container to be greater than that of the first medium and thus the adhesion of the second solid layer on the walls of the container is sufficient to guarantee that the first liquid medium does not overflow above the second layer of said culture medium in use.
Plus particulièrement encore, ledit récipient est un tube et aux étapes a.l) et b.l), le rapport des volumes des premier milieu /deuxième milieu est de 1/10 à 4/10 et on incline l'axe (XX') du tube d'un angle al de 50 à 75° par rapport à la verticale pour obtenir une inclinaison de la surface supérieure de la deuxième couche solide après l'étape b.2) d'un angle a2 de 15 à 40° par rapport à l'axe du tube.More particularly still, said container is a tube and in steps a1 and b1), the volume ratio of the first medium / second medium is from 1/10 to 4/10 and the axis (XX ′) of the tube d is inclined. 'an angle al of 50 to 75 ° relative to the vertical to obtain an inclination of the upper surface of the second solid layer after step b.2) of an angle a2 of 15 to 40 ° relative to the axis of the tube.
Ces quantités des premier milieu et deuxième milieu et angle d'inclinaison permettent en pratique d'étaler la surface de la deuxième couche depuis le fond du tube jusqu'à proximité du bord supérieur du tube pour un tube de culture standard à fond plat de 20 à 50 mL et de 14 à 20 cm de hauteur et 1.5 à 2.5 cm de diamètre.These quantities of the first medium and second medium and angle of inclination make it possible in practice to spread the surface of the second layer from the bottom of the tube to near the upper edge of the tube for a standard culture tube with a flat bottom of 20 at 50 mL and from 14 to 20 cm in height and 1.5 to 2.5 cm in diameter.
De préférence, les surfaces supérieures des deux couches de milieux ont le même angle d'inclinaison respectivement par rapport à la verticale et à l'horizontale. Ceci permet d'obtenir une épaisseur constante de la deuxième couche et ainsi éviter que la gélose supérieure ne s'affaisse du fait d'un poids localement excessif vis-à-vis de la quantité relativement réduite de liquide de la couche inférieure.Preferably, the upper surfaces of the two layers of media have the same angle of inclination relative to the vertical and the horizontal respectively. This makes it possible to obtain a constant thickness of the second layer and thus prevent the upper agar from sagging due to a locally excessive weight with respect to the relatively reduced quantity of liquid in the lower layer.
Dans un mode de réalisation, le dit premier milieu est de l'eau ou un milieu de culture liquide de bactérie ne contenant pas d'agent gélifiant. A l'étape a.2), ce premier milieu ne contenant pas de gélifiant est congelé à l'azote liquide à -196°C ou à -80°C, la congélation est tellement importante, de sorte que le temps que le deuxième milieu soit coulé et se solidifie, la première couche congelée n'a pas le temps de fondre.In one embodiment, said first medium is water or a liquid culture medium for bacteria which does not contain a gelling agent. In step a.2), this first medium not containing gelling agent is frozen with liquid nitrogen at -196 ° C or at -80 ° C, freezing is so important, so that the time that the second medium is poured and solidifies, the first frozen layer does not have time to melt.
Selon un autre mode de réalisation, le dit premier milieu est un milieu de culture gélosé de dite bactérie.According to another embodiment, said first medium is an agar culture medium of said bacteria.
Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu de culture de dite bactérie contenant les mêmes éléments nutritifs et/ou mêmes facteurs de croissance que le dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu. Ainsi, en plus d'hydrater le deuxième milieu, cela permet de lui apporter les nutriments et/ou facteurs de croissance qui ont pu être consommés par les bactéries sur la gélose.More particularly still, said first medium is a culture medium of said bacteria containing the same nutrients and / or same growth factors as said agar culture medium of said second medium. Thus, in addition to hydrating the second medium, this makes it possible to provide it with the nutrients and / or growth factors which may have been consumed by the bacteria on the agar.
Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu contenant un (ou des) premier (s) agent(s) gélifiants(s) dont la nature et/ou la quantité lui confère une viscosité et un pouvoir de rétention d'eau inférieurs à ceux du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactérie dudit deuxième milieu.More particularly still, the said first medium is a medium containing one (or more) gelling agent (s) whose nature and / or quantity gives it a lower viscosity and water retention power. to those of (or) second (s) gelling agent (s) of said agar culture medium agar of bacteria of said second medium.
Plus particulièrement encore, le(s) dit(s) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) confère(nt) au dit deuxième milieu solide une température de fusion supérieure à la température à laquelle le(s) premier (s) agent(s) gélifiants(s) permettent d'obtenir un premier milieu à l'état coulable sans qu'il ne prenne en masse.More particularly still, the said second gelling agent (s) confers on the said second solid medium a melting temperature higher than the temperature at which the first ) gelling agent (s) make it possible to obtain a first medium in the flowable state without it solidifying.
Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu aqueux contenant comme premiers agents gélifiants le composé kappa-carraghénane, de préférence avec l'amidon, K2HPO4 et CaCh, et le dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide contient de l'agar comme deuxième agent gélifiant.More particularly still, the said first medium is an aqueous medium containing as first gelling agents the kappa-carrageenan compound, preferably with starch, K2HPO4 and CaCh, and the said agar culture medium of bacteria of said second solid medium contains l agar as the second gelling agent.
Plus particulièrement encore, le dit premier milieu est un milieu gélifié contenant un (ou des) premier(s) agent(s) gélifiants(s) identique(s) au(x) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s) du dit milieu de culture gélosé de bactéries dudit deuxième milieu solide, mais en quantité inférieure à celle du (ou des) deuxième(s) agent(s) gélifiant(s), de préférence de l'agar.More particularly still, said first medium is a gelled medium containing one (or more) gelling agent (s) identical to the second gelling agent (s) of said agar culture medium of bacteria from said second solid medium, but in an amount less than that of (or) second (s) gelling agent (s), preferably agar.
La présente invention a également pour objet un milieu de culture biphasique contenant un milieu de culture solide incliné, conditionné dans un récipient de culture de bactérie, de préférence un tube de culture de bactéries, destiné à la culture de bactéries en conditions d'aérobiose obtenu par un procédé de préparation selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend :The present invention also relates to a biphasic culture medium containing an inclined solid culture medium, packaged in a bacteria culture container, preferably a bacteria culture tube, intended for the culture of bacteria under aerobic conditions obtained. by a preparation process according to the invention characterized in that it comprises:
- une première couche d'un dit premier milieu aqueux situé au fond dudit récipient, la surface supérieure de la dite première couche étant inclinée d'un angle al par rapport à l'axe (XX7) du dit récipient, le dit premier milieu étant un milieu à l'état congelé ou gélifié, ou de préférence à l'état liquide, et- A first layer of said first aqueous medium located at the bottom of said container, the upper surface of said first layer being inclined at an angle a with respect to the axis (XX 7 ) of said container, said first medium being a medium in the frozen or gelled state, or preferably in the liquid state, and
- une deuxième couche d'un dit deuxième milieu aqueux à l'état solide, la dite deuxième couche étant superposée par-dessus la dite première couche de sorte que la surface supérieure de la dite deuxième couche est inclinée par rapport à l'axe (XX7) du dit récipient parallèlement à la surface supérieure de la première couche, ledit deuxième milieu solide étant un dit milieu de culture gélosé de dite bactérie en conditions d'aérobiose.a second layer of a said second aqueous medium in the solid state, the said second layer being superimposed over the said first layer so that the upper surface of the said second layer is inclined relative to the axis ( XX 7 ) of said container parallel to the upper surface of the first layer, said second solid medium being a so-called agar culture medium of said bacteria under aerobic conditions.
La présente invention a également pour objet un procédé de culture de bactéries en conditions d'aérobiose à l'aide d'un milieu de culture biphasique conditionné dans un dit récipient selon l'invention dans lequel on ensemence la surface libre de la dite deuxième couche, de préférence disposée horizontalement, avec une dite bactérie en conditions d'aérobiose, puis laisse à incuber ledit récipient, dans une étuve à 37°C de préférence avec son axe (XX') disposé verticalement.The present invention also relates to a method of cultivating bacteria under aerobic conditions using a two-phase culture medium conditioned in a said container according to the invention in which the free surface of said second layer is seeded , preferably arranged horizontally, with a said bacterium under aerobic conditions, then leaves to incubate said container, in an oven at 37 ° C. preferably with its axis (XX ') arranged vertically.
D'autre caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée des exemples de réalisations suivants.Other characteristics and advantages of the invention will appear in the light of the detailed description of the following examples of embodiments.
La figure 1 représente schématiquement un tube de culture rempli d'un milieu de culture diphasique selon l'invention.FIG. 1 schematically represents a culture tube filled with a two-phase culture medium according to the invention.
Les inventeurs ont utilisé des tubes en verre stérile (tube à essai) standard à fond plat 20 mL et de 14.5 cm de hauteur (L) et 1.6 cm de diamètre (d) de chez Biorad (France) ou Bolium (France) comme support de leur milieu de culture. Si les tubes sont achetés stériles, les inventeurs peuvent couler leur milieu directement dans ces tubes. En revanche, si les tubes ne sont pas stériles, les inventeurs devront les autoclaver à vide à une chaleur de 134°C pendant 18 minutes dans des emballages poreux.The inventors used standard sterile glass tubes (test tube) with flat bottom 20 mL and 14.5 cm high (L) and 1.6 cm in diameter (d) from Biorad (France) or Bolium (France) as support of their culture medium. If the tubes are purchased sterile, the inventors can pour their medium directly into these tubes. On the other hand, if the tubes are not sterile, the inventors will have to autoclave them under vacuum at a heat of 134 ° C. for 18 minutes in porous packaging.
Exemple 1Example 1
Pour fabriquer une gélose bi-phasique, les inventeurs ont réalisé les étapes suivantes:To make a two-phase agar, the inventors carried out the following steps:
1) 2 mL d'un premier milieu de culture liquide 1-1 sont versés au fond 2a de tubes en verre stériles 2. Ce milieu de culture liquide est mis à congeler à 80°C durant 10 min, l'axe XX' du tube étant incliné de 60°par rapport la verticale YY' avec la surface libre du milieu de culture horizontale, de façon à obtenir une solidification sous forme inclinée du milieu de culture liquide (figure 1).1) 2 mL of a first liquid culture medium 1-1 are poured into the bottom 2a of sterile glass tubes 2. This liquid culture medium is frozen at 80 ° C for 10 min, the axis XX 'of the tube being inclined by 60 ° relative to the vertical YY 'with the free surface of the horizontal culture medium, so as to obtain solidification in inclined form of the liquid culture medium (FIG. 1).
2) 10 mL d'un deuxième milieu de culture gélosé 1-2, comprenant les mêmes composants que le premier milieu mais étant supplémenté en agar, sous forme solide a été autoclavé à 121°C pendant 15 minutes, puis coulé, à une température d'environ 56°C, dans les tubes contenant une première couche 1-1 du premier milieu de culture congelé, le tube étant incliné également de 60°par rapport la verticale YY' comme à l'étape 1). Les tubes ne sont pas refermés avec un bouchon 2c immédiatement après le coulage de la gélose. En effet, on attend que la gélose du deuxième milieu ait pris en masse et que la condensation, due à la chaleur dégagée par le deuxième milieu de culture lors de son coulage, ait disparu. On obtient ainsi une deuxième couche 1-2 gélose bi-phasique dont la surface supérieure libre la de la deuxième couche 1-2 du dit deuxième milieu de culture solide est de cc2 = 30° par rapport à l'axe XX' du tube, comme montré figure 1. En effet, la congélation à -80°C du premier milieu de culture liquide permet d'obtenir une congélation assez importante du liquide pour que celui-ci ne se liquéfie pas immédiatement lors du coulage de la gélose chaude du deuxième milieu de culture.2) 10 mL of a second agar culture medium 1-2, comprising the same components as the first medium but being supplemented with agar, in solid form was autoclaved at 121 ° C for 15 minutes, then poured, at a temperature about 56 ° C, in the tubes containing a first layer 1-1 of the first frozen culture medium, the tube also being inclined by 60 ° relative to the vertical YY 'as in step 1). The tubes are not closed with a stopper 2c immediately after pouring the agar. Indeed, it is expected that the agar of the second medium has solidified and that the condensation, due to the heat given off by the second culture medium during its pouring, has disappeared. A second layer 1-2 two-phase agar is thus obtained, the free upper surface 1a of the second layer 1-2 of said second solid culture medium is cc2 = 30 ° relative to the axis XX 'of the tube, as shown in Figure 1. Indeed, freezing at -80 ° C of the first liquid culture medium allows to obtain a fairly significant freezing of the liquid so that it does not liquefy immediately when pouring the hot agar of the second culture centre.
D'autre part, ces volumes de premier et deuxième milieu et cet angle d'inclinaison permet en pratique d'étaler la surface de la deuxième couche depuis le fond 2a du tube jusqu'à proximité du bord supérieur 2b du tube pour un tube de culture standard à fond plat de 20 mL et de 14,5 cm de hauteur et 1.6 cm de diamètre.On the other hand, these volumes of first and second medium and this angle of inclination makes it possible in practice to spread the surface of the second layer from the bottom 2a of the tube to near the upper edge 2b of the tube for a tube of standard culture with flat bottom, 20 mL and 14.5 cm high and 1.6 cm in diameter.
L'obtention de la gélose bi-phasique permet d'avoir une hydratation permanente du milieu de culture et ainsi une croissance optimale des bactéries ensemencées sur ce milieu de culture.Obtaining two-phase agar allows permanent hydration of the culture medium and thus optimal growth of the bacteria seeded on this culture medium.
Pour la congélation du premier milieu de culture liquide, au lieu de le congeler pendant 10 minutes à une température de moins 80°C, on peut le solidifier dans de l'azote liquide à -196°C. Ce processus prend moins de temps puisque la congélation a lieu en environ 1 minute. Pour cela, le tube en verre stérile est introduit en position inclinée dans l'azote liquide, et est ressorti environ 1 min plus tard. La deuxième étape, qui consiste à couler le deuxième milieu de culture solide sur cette première base reste la même que celle explicitée précédemment.For freezing the first liquid culture medium, instead of freezing it for 10 minutes at a temperature of minus 80 ° C, it can be solidified in liquid nitrogen at -196 ° C. This process takes less time since freezing takes place in about 1 minute. For this, the sterile glass tube is introduced in an inclined position in liquid nitrogen, and is released about 1 min later. The second step, which consists in pouring the second solid culture medium onto this first base, remains the same as that explained above.
Les milieux solides, Columbia et Schaedler comprenant les composants suivants dans un litre d'eau distillée sont utilisés de façon courante pour la culture des bactéries. Les bactéries lentes, citées ci-après ont été ensemencées sur ces milieux pris séparément mais lors de l'incubation en aérobie, les géloses se déshydratent. Lors de l'incubation prolongée de la gélose (>72h) il est observé une déshydratation du milieu de culture qui se traduit par une fissuration de la gélose et un dessèchement, jusqu'à obtenir une « galette » complètement sèche.Solid media, Columbia and Schaedler comprising the following components in one liter of distilled water are commonly used for the culture of bacteria. The slow bacteria, cited below, were seeded on these media taken separately, but during aerobic incubation, the agars dehydrate. During the prolonged incubation of the agar (> 72 h), a dehydration of the culture medium is observed, which results in cracking of the agar and drying, until a completely dry "pancake" is obtained.
En revanche, les résultats de culture étaient favorables sur des milieux biphasiques selon l'invention comprenant les composants de ces deux milieux sans agar pour le premier milieu et avec agar pour le deuxième milieu.On the other hand, the culture results were favorable on biphasic media according to the invention comprising the components of these two media without agar for the first medium and with agar for the second medium.
a) Milieu Columbiaa) Columbia environment
• Tris (Hydroxymethyl) Aminométhane HCl 2,86 g (0,286 %) • (Agar 15 g (1,5 %))• Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane HCl 2.86 g (0.286%) • (Agar 15 g (1.5%))
b) Milieu Schaedler:b) Schaedler environment:
Peptone trypticase-sojaPeptone trypticase-soy
PeptonePeptone
Extrait de levureYeast extract
Chlorhydrate de cystéine HémineHemin cysteine hydrochloride
GlucoseGlucose
Tampon TRIS (AgarTRIS buffer (Agar
10,0 g (1%)10.0 g (1%)
5,0 g (0,5 %)5.0 g (0.5%)
5,0 g (0,5 %)5.0 g (0.5%)
0,4 g (0,04 %)0.4 g (0.04%)
0,01 g (0,001 %) 5,0 g (0,5 %)0.01 g (0.001%) 5.0 g (0.5%)
0,75 g (0,075 %)0.75 g (0.075%)
13,5 g (1,35 %))13.5 g (1.35%))
Une colonie de la bactérie choisie parmi les bactéries lentes suivantes est repiquée sur le dit milieu et la gélose est mise à incuber à 37°C : Mycobacterium genavensae (plusieurs semaines), Mycobacterium tubercuiosis (2-3 semaines), Bartoneiia quintana (21 jours environs), Bartoneiia henseiae (21 jours environs), Methanobrevibacter smithii (9-15 jou rs).A colony of the bacteria chosen from the following slow bacteria is subcultured on the said medium and the agar is incubated at 37 ° C: Mycobacterium genavensae (several weeks), Mycobacterium tubercuiosis (2-3 weeks), Bartoneiia quintana (21 days surroundings), Bartoneiia henseiae (around 21 days), Methanobrevibacter smithii (9-15 days).
Exemple 2Example 2
La phase de congélation du premier milieu de culture liquide dans les tubes en verre stérile, que ce soit par le procédé de congélation à -80°C ou par le procédé de congélation à l'azote liquide, n'est pas facilement réalisable par un industriel, dans un but de commercialisation. Pour pallier cet inconvénient, les inventeurs ont testé la mise en oeuvre d'un premier milieu comprenant d'autres gélifiants que le deuxième milieu de culture, avec un pouvoir de rétention d'eau moindre que celui de l'agar afin de permettre ainsi d'hydrater la gélose, tout en ayant une légère gélification conférant une prise en masse suffisamment visqueuse du premier milieu pour assurer le support du coulage du deuxième milieu, permettant ainsi d'éviter la phase de congélation du premier milieu.The freezing phase of the first liquid culture medium in sterile glass tubes, whether by the freezing process at -80 ° C or by the freezing process with liquid nitrogen, is not easily achievable by a industrial, for marketing purposes. To overcome this drawback, the inventors have tested the implementation of a first medium comprising other gelling agents than the second culture medium, with a lower water retention capacity than that of agar in order to thus allow hydrate the agar, while having a slight gelation conferring a sufficiently viscous solidification of the first medium to provide support for the pouring of the second medium, thus making it possible to avoid the freezing phase of the first medium.
Dans ce but, les inventeurs ont testé comme autre gélifiant du premier milieu : la gomme kappa-carraghénane. La composition des premiers gélifiants (gélifiant du premier milieu) est la suivante, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour IL:To this end, the inventors have tested another gelling agent of the first medium: kappa-carrageenan gum. The composition of the first gelling agents (gelling agent of the first medium) is as follows, preferably in the following quantities and weight proportions for IL:
- Kappa-carraghénane : 4 g (0,4%)- Kappa-carrageenan: 4 g (0.4%)
K2HPO4 :K2HPO4:
CaCI2 :CaCI 2 :
Amidon :Starch:
0,83 g (0,083%)0.83 g (0.083%)
0,1 g (0,01%) g (0,5%).0.1 g (0.01%) g (0.5%).
K2HPO4, CaCI2 et l'amidon permettent une meilleure prise en masse de la gomme kappa-carraghénane. Ce mélange est autoclavé avant d'être coulé à une température d'environ 56°C.K2HPO4, CaCI2 and starch allow a better solidification of the kappa-carrageenan gum. This mixture is autoclaved before being poured at a temperature of around 56 ° C.
Le coulage des premier et deuxième milieux à 56°C est avantageux car les milieux ne gélifient qu'à 40°C pour le kappa-carraghénane et respectivement 35°C pour l'agar on reste en deçà de la température de fusion du premier milieu contenant kappa-carraghénane qui est supérieure à 65°C, la température de fusion du deuxième milieu contenant l'agar étant de 90°C .Pouring the first and second media at 56 ° C is advantageous because the media gels only at 40 ° C for kappa-carrageenan and 35 ° C for agar respectively, we remain below the melting temperature of the first medium containing kappa-carrageenan which is greater than 65 ° C, the melting temperature of the second medium containing the agar being 90 ° C.
En terme quantitatif, on met 15 g/L d'agar dans un milieu solide dont alors que pour avoir une gélification comparable, il faut 8 g/L de gomme kappacarraghénane.In quantitative terms, 15 g / L of agar are placed in a solid medium, whereas, to have a comparable gelation, 8 g / L of kappacarraghenane gum are required.
Ensuite, on place les tubes contenant le premier milieu coulé à chaud, en pente inclinée, à gélifier au réfrigérateur à 4°C durant 10 minutes. On obtient une première couche ou sous-couche gélifiée mais de viscosité relativement inférieure à celle du deuxième milieu solide ci-après.Then, the tubes containing the first hot poured medium are placed, at an inclined slope, to gel in the refrigerator at 4 ° C for 10 minutes. A first layer or gelled sublayer is obtained, but with a viscosity relatively lower than that of the second solid medium below.
Une fois ce délai passé, le deuxième milieu de culture solide, constitué d'agar comme gélifiant, a été autoclavé puis coulé, à une température d'environ 56°C, dans les tubes contenant la sous-couche de premier milieu de culture composé du mélange des premiers gélifiants, sous forme incliné également. On obtient une deuxième couche solidifiée de viscosité ou dureté supérieure à celle de la première couche grâce au deuxième gélifiant qu'est l'agar.Once this period had passed, the second solid culture medium, consisting of agar as a gelling agent, was autoclaved and then poured, at a temperature of approximately 56 ° C., into the tubes containing the sub-layer of the first compound culture medium. of the mixture of the first gelling agents, also in inclined form. A second solidified layer is obtained with a viscosity or hardness greater than that of the first layer thanks to the second gelling agent which is agar.
Les autres conditions et paramètres de mise en œuvre du procédé sont pour le reste, identiques à celles de l'exemple 1.The other conditions and parameters for implementing the process are, for the rest, identical to those of Example 1.
Les inventeurs ont obtenu une gélose bi-phasique contenant une sous couche constituée de premiers gélifiants avec un pouvoir moindre de rétention d'eau que l'agar. Cela permet une hydratation continue de la gélose du deuxième milieu de culture solide par relargage d'eau par les premiers gélifiants du premier milieu de culture.The inventors have obtained a two-phase agar containing an under layer consisting of first gelling agents with a lower water retention power than agar. This allows continuous hydration of the agar of the second solid culture medium by release of water by the first gelling agents from the first culture medium.
Ces différents procédés de fabrication d'une gélose inclinée bi-phasique ont ainsi permis d'avoir une hydratation continue de la gélose, permettant la culture des mêmes nombreuses bactéries avec les mêmes composants de milieux de culture que ceux décrits à l'exemple 1.These different processes for manufacturing a two-phase inclined agar have thus made it possible to have continuous hydration of the agar, allowing the culture of the same numerous bacteria with the same components of culture media as those described in Example 1.
Exemple 3Example 3
Les inventeurs ont testé la mise en œuvre d'un premier milieu comprenant le même gélifiant que le deuxième milieu de culture, mais à une concentration moindre pour permettre ainsi d'hydrater la gélose du deuxième milieu, tout en ayant une légère gélification conférant une prise en masse suffisamment visqueuse du premier milieu pour assurer le support du coulage du deuxième milieu, permettant ainsi d'éviter la phase de congélation du premier milieu.The inventors have tested the implementation of a first medium comprising the same gelling agent as the second culture medium, but at a lower concentration so as to allow the agar of the second medium to be hydrated, while having a slight gelling conferring a setting. sufficiently viscous in mass from the first medium to support the pouring of the second medium, thus avoiding the freezing phase of the first medium.
Dans ce but, les inventeurs ont testé des concentrations d'agar du premier milieu allant de 2.5 à 5 g/L d'agar. Ils ont obtenu une gélification mais beaucoup moins dure que lorsqu'ils ont mis une concentration plus élevée d'agar du deuxième milieu de 15 g/L d'agar.For this purpose, the inventors tested concentrations of agar of the first medium ranging from 2.5 to 5 g / L of agar. They obtained a gelling but much less hard than when they put a higher concentration of agar of the second medium of 15 g / L of agar.
Ensuite, on place les tubes contenant le premier milieu coulé à chaud à 56°C, en pente inclinée, à gélifier au réfrigérateur à 4°C durant 10 minutes. On obtient une première couche ou sous-couche gélifiée mais de viscosité relativement inférieure à celle du deuxième milieu solide ci-après.Then, the tubes containing the first medium poured hot at 56 ° C. are placed, on an inclined slope, to gel in the refrigerator at 4 ° C. for 10 minutes. A first layer or gelled sublayer is obtained, but with a viscosity relatively lower than that of the second solid medium below.
Une fois ce délai passé, le deuxième milieu de culture solide, constitué d'agar comme gélifiant, a été autoclavé puis coulé, à une température d'environ 56°C, dans les tubes contenant la sous-couche de premier milieu de culture composé du mélange des premiers gélifiants, sous forme incliné également. On obtient une deuxième couche solidifiée de viscosité ou dureté supérieure à celle de la première couche grâce au gélifiant qu'est l'agar.Once this period had passed, the second solid culture medium, consisting of agar as a gelling agent, was autoclaved and then poured, at a temperature of approximately 56 ° C., into the tubes containing the sub-layer of the first compound culture medium. of the mixture of the first gelling agents, also in inclined form. A second solidified layer is obtained with a viscosity or hardness greater than that of the first layer thanks to the gelling agent which is agar.
Les autres conditions et paramètres de mise en œuvre du procédé sont pour le reste, identiques à celles de l'exemple 1.The other conditions and parameters for implementing the process are, for the rest, identical to those of Example 1.
Les inventeurs ont obtenu une gélose bi-phasique contenant une sous couche constituée de premiers gélifiants avec un pouvoir moindre de rétention d'eau que l'agar. Cela permet une hydratation continue de la gélose du deuxième milieu de culture solide par relargage d'eau par les gélifiants du premier milieu de culture.The inventors have obtained a two-phase agar containing an under layer consisting of first gelling agents with a lower water retention power than agar. This allows a continuous hydration of the agar of the second solid culture medium by release of water by the gelling agents of the first culture medium.
Ces différents procédés de fabrication d'une gélose inclinée bi-phasique ont ainsi permis d'avoir une hydratation continue de la gélose, permettant la culture des mêmes nombreuses bactéries avec les mêmes composants de milieux de culture que ceux décrits à l'exemple 1.These different processes for manufacturing a two-phase inclined agar have thus made it possible to have continuous hydration of the agar, allowing the culture of the same numerous bacteria with the same components of culture media as those described in Example 1.
Exemple 4Example 4
Les milieux solides, Columbia et Schaedler comprenant les composants suivants dans un litre d'eau distillée sont utilisés de façon courante pour la culture des bactéries. Lors de l'ajout d'antioxydants à la recette de base de ces milieux, permet la culture de certaines bactéries anaérobie strictes en aérobiose. Les bactéries anaérobies cultivées en aérobie, citées ci-après ont été ensemencées sur ces milieux pris séparément mais lors de l'incubation en aérobie, les géloses se déshydratent. Lors de l'incubation prolongée de la gélose (>72h) il est observé une déshydratation du milieu de culture qui se traduit par une fissuration de la gélose et un dessèchement, jusqu'à obtenir une « galette » complètement sèche.Solid media, Columbia and Schaedler comprising the following components in one liter of distilled water are commonly used for the culture of bacteria. When adding antioxidants to the basic recipe of these environments, allows the cultivation of certain aerobic anaerobic bacteria. The anaerobic bacteria cultivated in aerobic, cited below were seeded on these media taken separately but during the aerobic incubation, the agars dehydrate. During prolonged incubation of the agar (> 72 h), a dehydration of the culture medium is observed, which results in cracking of the agar and drying, until a completely dry "pancake" is obtained.
En revanche, les résultats de culture étaient favorables sur des milieux biphasiques selon l'invention comprenant les composants de ces deux milieux sans agar pour le premier milieu et avec agar pour le deuxième milieu.On the other hand, the culture results were favorable on biphasic media according to the invention comprising the components of these two media without agar for the first medium and with agar for the second medium.
a) Milieu Columbiaa) Columbia environment
b) Milieu Schaedler:b) Schaedler environment:
• Peptone trypticase-soja • Peptone • Extrait de levure • Chlorhydrate de cystéine • Hémine • Glucose • Tampon TRIS • (Agar• Peptone trypticase-soy • Peptone • Yeast extract • Cysteine hydrochloride • Hemin • Glucose • TRIS buffer • (Agar
Antioxydants ajoutés à chacun de ces milieux :Antioxidants added to each of these environments:
• Acide ascorbique • Acide urique • Glutathion • Na2S• Ascorbic acid • Uric acid • Glutathione • Na2S
10,0 g (1 %)10.0 g (1%)
5,0 g (0,5 %)5.0 g (0.5%)
5,0 g (0,5 %)5.0 g (0.5%)
0,4 g (0,04 %) 0,01 g (0,001%)0.4 g (0.04%) 0.01 g (0.001%)
5,0 g (0,05%) 0,75 g (0,075%) 13,5 g (1,35 %)) g (0,1 %) 0,4 g (0,04 %) 0,1 g (0,01%) 0,5 g (0,05%)5.0 g (0.05%) 0.75 g (0.075%) 13.5 g (1.35%)) g (0.1%) 0.4 g (0.04%) 0.1 g (0.01%) 0.5 g (0.05%)
Une colonie de la bactérie choisie parmi les bactéries anaérobies cultivées en aérobie suivantes est repiquée sur le dit milieu gélosé et le tube est mis à incuber à 37°C sous atmosphère d'air : Clostridium massHioamazoniense, Finego/dia magna, Clostridium irregu/are, Clostridium butyricum ou encore Propionibacterium acnés.A colony of the bacteria chosen from the following aerobic anaerobic bacteria is subcultured on the said agar medium and the tube is incubated at 37 ° C. in an air atmosphere: Clostridium massHioamazoniense, Finego / dia magna, Clostridium irregu / are , Clostridium butyricum or Propionibacterium acnes.
On observe la croissance de colonies bactériennes en surface de la gélose.The growth of bacterial colonies on the surface of the agar is observed.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUESBIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
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1984 September1984 September
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