FR3058141A1 - NOVEL CONJUGATES COMPRISING SEMICONDUCTOR NANOCRYSTALS AND THEIR PREPARATION METHOD - Google Patents
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- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
Abstract
La présente invention concerne des conjugués comprenant un nanocristal semi-conducteur ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques et une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle.The present invention relates to conjugates comprising a semiconductor nanocrystal having on the surface one or more metal ions and a biological molecule carrying at least one sulfhydryl group.
Description
Titulaire(s) : UNIVERSITE PARIS-SUD,CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE,UNIVERSITE DE STRASBOURG COMMISSARIAT A L'ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES ALTERNATIVES.Holder (s): PARIS-SUD UNIVERSITY, NATIONAL CENTER FOR SCIENTIFIC RESEARCH, UNIVERSITY OF STRASBOURG COMMISSION FOR ATOMIC ENERGY AND ALTERNATIVE ENERGIES.
Mandataire(s) : PONTET ALLANO & ASSOCIES.Agent (s): PONTET ALLANO & ASSOCIES.
(64) NOUVEAUX CONJUGUES COMPRENANT DES NANOCRISTAUX SEMI-CONDUCTEURS ET LEUR METHODE(64) NOVEL CONJUGATES COMPRISING SEMICONDUCTOR NANOCRYSTALS AND THEIR METHOD
DE PREPARATION.OF PREPARATION.
(67) La présente invention concerne des conjugués comprenant un nanocristal semi-conducteur ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques et une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle.(67) The present invention relates to conjugates comprising a semiconductor nanocrystal having on the surface one or more metal ions and a biological molecule carrying at least one sulfhydryl group.
FR 3 058 141 - A1FR 3 058 141 - A1
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NOUVEAUX CONJUGUES COMPRENANT DES NANOCRISTAUX SEMICONDUCTEURS ET LEUR METHODE DE PREPARATIONNOVEL CONJUGATES COMPRISING SEMICONDUCTOR NANOCRYSTALS AND THEIR PREPARATION METHOD
La présente invention concerne de nouveaux conjugués comprenant des nanocristaux semi-conducteurs, leur méthode de préparation, et leurs utilisations.The present invention relates to new conjugates comprising semiconductor nanocrystals, their preparation method, and their uses.
Les nanocristaux semi-conducteurs, notamment les points quantiques semi-conducteurs, font partie d'une famille de nanomatériaux. Comparés à des fluorophores classiques, tels que des fluorophores organiques ou des protéines fluorescentes, les points quantiques présentent plusieurs avantages techniques, tels que la photostabilité, la haute luminosité, la possibilité de moduler la couleur selon la taille des points quantiques, un spectre d'émission étroit et un spectre d'absorption large (Biju et al., Chem. Soc. Rev., 2010, 39, 3031-3056). Grâce à ces propriétés, les points quantiques semi-conducteurs attirent de plus en plus l’attention pour leurs potentiels dans les applications biotechnologiques et médicales. A ce jour, les points quantiques sont souvent utilisés comme un matériau luminescent ou fluorescent pour être intégré dans un biosenseur pour l'imagerie ou le diagnostic in vitro ou in vivo.Semiconductor nanocrystals, especially semiconductor quantum dots, are part of a family of nanomaterials. Compared to conventional fluorophores, such as organic fluorophores or fluorescent proteins, quantum dots have several technical advantages, such as photostability, high brightness, the possibility of modulating color according to the size of quantum dots, a spectrum of narrow emission and a broad absorption spectrum (Biju et al., Chem. Soc. Rev., 2010, 39, 3031-3056). Thanks to these properties, semiconductor quantum dots are attracting increasing attention for their potentials in biotechnology and medical applications. To date, quantum dots are often used as a luminescent or fluorescent material to be integrated into a biosensor for imaging or in vitro or in vivo diagnosis.
De plus, les propriétés photophysiques et nanométriques des points quantiques les rendent idéal pour une application dans la technique de transfert d’énergie par résonance de type Forster (Forster résonance energy transfer ou FRET) qui consiste en une transmission d'énergie entre deux fluorophores (un donneur d'énergie et un accepteur d'énergie) à une distance très proche l'un de l'autre. Cette dernière influence directement l'efficacité de FRET et doit être inférieure à 20 nm. Les points quantiques peuvent être utilisés soit comme donneur d'énergie, soit comme accepteur d'énergie selon les combinaisons avec différents fluorophores.In addition, the photophysical and nanometric properties of the quantum dots make them ideal for application in the technique of energy transfer by Forster resonance type (Forster resonance energy transfer or FRET) which consists of an energy transmission between two fluorophores ( an energy donor and an energy acceptor) at a distance very close to each other. The latter directly influences the efficiency of FRET and must be less than 20 nm. Quantum dots can be used either as an energy donor or as an energy acceptor depending on the combinations with different fluorophores.
Dans ces applications, les points quantiques sont souvent utilisés sous forme de conjugués, dans lesquels un point quantique est combiné avec une molécule biologique, telle qu’un anticorps, qui est reconnue spécifiquement par une cible biologique, telle qu’un antigène, afin de diriger ledit conjugué vers un site particulier selon la nécessité.In these applications, quantum dots are often used in the form of conjugates, in which a quantum dot is combined with a biological molecule, such as an antibody, which is specifically recognized by a biological target, such as an antigen, in order to direct said conjugate to a particular site as necessary.
Ce type de conjugué peut être notamment utilisé dans un immunodosage basé sur la technique FRET, qui est une technique utilisant le phénomène de transfert d'énergie produite lorsqu'un donneur d'énergie et un accepteur d'énergie sont rapprochés à l'aide de la reconnaissance entre une molécule biologique et sa cible, par exemple celle entre un anticorps et un antigène ou entre un ligand et son récepteur. Cette technique peut être utilisée pour indiquer la présence de ladite cible ou pour déterminer une reconnaissance entre une molécule biologique et sa cible potentielle.This type of conjugate can be used in particular in an immunoassay based on the FRET technique, which is a technique using the phenomenon of transfer of energy produced when an energy donor and an energy acceptor are brought together using recognition between a biological molecule and its target, for example that between an antibody and an antigen or between a ligand and its receptor. This technique can be used to indicate the presence of said target or to determine recognition between a biological molecule and its potential target.
Cependant, la taille d'un tel système d’immunodosage est souvent considérable, puisqu'il doit comprendre une molécule biologique, sa cible, un donneur d'énergie et un point quantique en tant qu'accepteur d'énergie. Du fait de la distance éloignée entre le donneur et l'accepteur, l'efficacité de la transmission d'énergie dans un tel système est sensiblement limitée.However, the size of such an immunoassay system is often considerable, since it must include a biological molecule, its target, an energy donor and a quantum dot as an energy acceptor. Due to the distant distance between the donor and the acceptor, the efficiency of energy transmission in such a system is significantly limited.
La distance entre ladite molécule biologique et le point quantique affecte en partie la distance de FRET. Cependant, à ce jour, l’utilisation d’un agent de couplage est toujours nécessaire pour la conjugaison d’un anticorps au point quantique.The distance between said biological molecule and the quantum dot partly affects the distance of FRET. However, to date, the use of a coupling agent is still necessary for the conjugation of an antibody at the quantum point.
Le brevet européen EPI 115 888 décrit un conjugué comprenant un point quantique semi-conducteur et une biomolécule, dans lequel ladite biomolécule est liée au point quantique via un acide carboxylique thiol, tel que l'acide mercaptoacétique, en tant qu’agent de couplage. La bio-molécule, par exemple un anticorps, est liée au groupe carboxylique dudit agent de couplage, alors que le point quantique est fixé au groupe thiol dudit agent de couplage.European patent EPI 115,888 describes a conjugate comprising a semiconductor quantum dot and a biomolecule, wherein said biomolecule is linked to the quantum dot via a thiol carboxylic acid, such as mercaptoacetic acid, as a coupling agent. The biomolecule, for example an antibody, is linked to the carboxylic group of said coupling agent, while the quantum dot is fixed to the thiol group of said coupling agent.
Les autres agents de couplage connus dans l’art sont, par exemple, les NHS-esters, les composés comportant un groupe maléimide, les composés comportant un groupe haloacétyle, ou les composés possédant une fonction hydrazide.Other coupling agents known in the art are, for example, NHS-esters, compounds having a maleimide group, compounds having a haloacetyl group, or compounds having a hydrazide function.
On peut utiliser le N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) comme agent de couplage en combinaison avec le l-éthyl-3-(3diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDO) pour conjuguer des protéines et des points quantiques portant les groupements carboxyles; la conjugaison entre un point quantique portant les groupements amines et une protéine portant au moins un groupement sulfhydryle peut être mise en œuvre en utilisant sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidométhyl)cyclohexane-l-carboxylate (sulfoSMCC) comme agent de couplage.N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) can be used as a coupling agent in combination with l-ethyl-3- (3dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDO) to conjugate proteins and quantum dots carrying the carboxyl groups; the conjugation between a quantum dot carrying the amine groups and a protein carrying at least one sulfhydryl group can be implemented using sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfoSMCC).
Par ailleurs, la conjugaison entre les points quantiques et les protéines peut aussi être obtenue par une reconnaissance biologique, par exemple celle entre la streptavidine et la biotine.Furthermore, the conjugation between the quantum dots and the proteins can also be obtained by biological recognition, for example that between streptavidin and biotin.
Du fait de l'utilisation d'un agent de couplage, la distance entre le point quantique et la molécule biologique est augmentée, ce qui constitue une barrière technique pour obtenir un biosenseur de haute sensibilité.Due to the use of a coupling agent, the distance between the quantum dot and the biological molecule is increased, which constitutes a technical barrier to obtain a high-sensitivity biosensor.
Il y a par conséquent une nécessité de mettre à disposition de nouveaux conjugués « point quantique - molécule biologique » ayant une distance réduite entre ces deux parties et de développer une nouvelle méthode de fabrication de ces conjugués.There is therefore a need to make available new "quantum dot - biological molecule" conjugates having a reduced distance between these two parts and to develop a new method of manufacturing these conjugates.
La présente invention a pour objet un conjugué entre un nanocristal semi-conducteur et une molécule biologique.The present invention relates to a conjugate between a semiconductor nanocrystal and a biological molecule.
Ledit conjugué comprend ou consiste en :Said conjugate comprises or consists of:
- un nanocristal semi-conducteur ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, Pt2+, Hg2+, Al3+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+, et- a semiconductor nanocrystal having on the surface one or more metal ions chosen from the group comprising Fe 2+ , Fe 3+ , Co 2+ , Ni 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Pb 2+ , Sn 2 + , Sn 4+ , Cu + , Ag + , Au + , Hg 2+ , Cs + , Pd 2+ , Cd 2+ , Pt 2+ , Hg 2+ , Al 3+ , In 3+ , Ga 3+ , As 3+ , As 5+ , Bi 3+ , Sb 3+ Se 2+ , Te 2+ , and
- une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle, ladite molécule biologique étant liée directement aux susdits ions métalliques situés à la surface dudit nanocristal par ledit groupement sulfhydryle.- A biological molecule carrying at least one sulfhydryl group, said biological molecule being linked directly to the above metal ions located on the surface of said nanocrystal by said sulfhydryl group.
On entend par « nanocristal semi-conducteur » des nanoparticules en matériaux semi-conducteurs ayant des propriétés électroniques et optiques uniques et un diamètre inférieur à 100 nm, notamment de 1 à 100 nm.The term “semiconductor nanocrystal” is understood to mean nanoparticles made of semiconductor materials having unique electronic and optical properties and a diameter of less than 100 nm, in particular from 1 to 100 nm.
Dans un mode de réalisation avantageux, ledit nanocristal semiconducteur est un point quantique.In an advantageous embodiment, said semiconductor nanocrystal is a quantum dot.
Le terme « point quantique » se réfère aux nanocristaux semiconducteurs ayant un diamètre inférieur à 10 nm.The term "quantum dot" refers to semiconductor nanocrystals having a diameter of less than 10 nm.
Lesdits nanocristaux ou points quantiques semi-conducteurs comportent un cœur constitué d'au moins un matériau semi-conducteur appartenant au groupe IV, II-VI, II-VI2, IV-VI, III-V, I-VII, II3-VI2, I-III-VI2 ou un alliage de ceux-ci. Lesdits nanocristaux ou points quantiques peuvent également appartenir à la famille des pérovskites ABX3.Said semiconductor nanocrystals or quantum dots comprise a core made up of at least one semiconductor material belonging to group IV, II-VI, II-VI 2 , IV-VI, III-V, I-VII, II3-VI2 , I-III-VI2 or an alloy thereof. Said nanocrystals or quantum dots can also belong to the family of ABX3 perovskites.
Un matériau semi-conducteur du groupe IV est un composé constitué d'un élément ou d'une combinaison de deux éléments du groupe IVa du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple les nanoparticules de carbone, de silicium ou de germanium.A group IV semiconductor material is a compound made up of an element or a combination of two elements of group IVa of the periodic table. By way of example, mention may be made of carbon, silicon or germanium nanoparticles.
Un matériau semi-conducteur du groupe II-VI est un composé contenant :A group II-VI semiconductor material is a compound containing:
- un élément choisi parmi les éléments du groupe Ilb du tableau périodique ou un élément du groupe VlIIb en état 2+, et- an element chosen from elements in the Ilb group of the periodic table or an element from the VlIIb group in state 2+, and
- un élément choisi parmi les éléments du groupe Via du tableau périodique.- an element chosen from the elements of the Via group of the periodic table.
On peut citer à titre d'exemple de matériaux semi-conducteurs du groupe II-VI, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, NiS, CoS, PdS, FeS.By way of example, mention may be made of group II-VI semiconductor materials, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, NiS, CoS, PdS, FeS.
Un matériau semi-conducteur du groupe II-VI2 est un composé contenant :A group II-VI2 semiconductor material is a compound containing:
- un élément choisi parmi les éléments du groupe VlIIb du tableau périodique en état 2+, et- an element chosen from the elements of group VlIIb of the periodic table in state 2+, and
- au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe Via du tableau périodique.- at least one element chosen from the elements of the Via group of the periodic table.
On peut citer à titre d'exemple de matériaux semi-conducteurs du groupe II-VI2, FeS2, N1S2, C0S2, ou PdS2.By way of example, mention may be made of group II-VI2, FeS2, N1S2, C0S2, or PdS2 semiconductor materials.
Un matériau semi-conducteur du groupe IV-VI est un composé contenant au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe IVa du tableau périodique et au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe Via du tableau périodique. A titre d'exemple de matériaux semi-conducteurs de ce groupe, on peut citer PbSe, PbS, PbTe, SnS, SnSe, SnTe.A semiconductor material of group IV-VI is a compound containing at least one element chosen from the elements of group IVa of the periodic table and at least one element chosen from the elements of the group Via of the periodic table. Examples of semiconductor materials from this group include PbSe, PbS, PbTe, SnS, SnSe, SnTe.
Un matériau semi-conducteur du groupe III-V est un composé contenant :A group III-V semiconductor material is a compound containing:
- un élément choisi parmi les éléments du groupe Ilia du tableau périodique, et- an element chosen from the elements of the Ilia group of the periodic table, and
- un élément choisi parmi les éléments du groupe Va du tableau périodique.- an element chosen from the elements of group Va of the periodic table.
On peut citer à titre d'exemple de matériaux semi-conducteurs du groupe III-V, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb.By way of example, mention may be made of group III-V semiconductor materials, GaN, GaP, GaAs, GaSb, InP, InAs, InSb.
Un matériau semi-conducteur du groupe I-VII est un composé contenant au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe Ib du tableau périodique et au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe Vlla du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple CuCI.A semiconductor material of group I-VII is a compound containing at least one element chosen from the elements of group Ib of the periodic table and at least one element chosen from the elements of group Vlla of the periodic table. CuCI may be cited as an example.
Un matériau semi-conducteur du groupe II3-VI2 est un composé contenant :A group II3-VI2 semiconductor material is a compound containing:
- au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe Ilb du tableau périodique ou les éléments du groupe VUIb du tableau périodique en état 2+, et- at least one element chosen from the elements of the group Ilb of the periodic table or the elements of the group VUIb of the periodic table in state 2+, and
- au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe Via du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple Zn3P2 et Cd3P2.- at least one element chosen from the elements of the Via group of the periodic table. By way of example, mention may be made of Zn3P2 and Cd3P2.
Un matériau semi-conducteur du groupe I-III-VI2 est un composé contenant :A group I-III-VI2 semiconductor material is a compound containing:
- un élément choisi parmi les éléments du groupe Ib du tableau périodique,- an element chosen from the elements of group Ib of the periodic table,
- un élément choisi parmi les éléments du groupe Ilia du tableau périodique, ou un élément du groupe VlIIb du tableau périodique en état 3+, et- an element chosen from the elements of the Ilia group of the periodic table, or an element of the VlIIb group of the periodic table in state 3+, and
- au moins un élément choisi parmi les éléments du groupe Via du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple AgInS2, CuInS2, CuFeS2, et CuInSe2.- at least one element chosen from the elements of the Via group of the periodic table. By way of example, mention may be made of AgInS2, CuInS2, CuFeS2, and CuInSe2.
Un matériau semi-conducteur de la famille des pérovskites ABX3 est un composé contenant au moins un cation A choisi parmi un ion méthylammonium (MA), le cation formamidinium (FA) et le cation césium, au moins un élément B choisi parmi les métaux divalents du tableau périodique et au moins un élément X choisi parmi les éléments du groupe Vlla du tableau périodique. On peut citer à titre d'exemple MAPbb, MASnb et CsPbBrs.A semiconductor material from the ABX3 perovskite family is a compound containing at least one cation A chosen from a methylammonium ion (MA), the formamidinium cation (FA) and the cesium cation, at least one element B chosen from divalent metals of the periodic table and at least one element X chosen from the elements of group Vlla of the periodic table. Examples include MAPbb, MASnb and CsPbBrs.
Dans un mode de réalisation avantageux, le cœur dudit nanocristal ou dudit point quantique est du CdSe, du CdTe, de l'InP de ΙΊηΖηΡ, du CuInS2, du AgInS2 ou du CsPbBn.In an advantageous embodiment, the core of said nanocrystal or of said quantum dot is CdSe, CdTe, InP of ΙΊηΖηΡ, CuInS2, AgInS2 or CsPbBn.
Le cœur d'un nanocristal ou point quantique de l'invention peut être enrobé par une coquille en matériau semi-conducteur différent de celui du cœur. La coquille qui forme une couche à l'extérieur du cœur doit pouvoir inactiver le cœur et possède un écart énergique par rapport au cœur. Ladite coquille est liée au cœur par des liaisons covalentes.The core of a nanocrystal or quantum dot of the invention can be coated with a shell made of a semiconductor material different from that of the core. The shell which forms a layer outside the heart must be able to inactivate the heart and has an energetic distance from the heart. Said shell is linked to the heart by covalent bonds.
Un tel nanocristal est un nanocristal à structure « cœur/coquille ».Such a nanocrystal is a nanocrystal with a “core / shell” structure.
Conformément à la présente invention, lorsque le cœur est constitué par au moins un matériau semi-conducteur du groupe II-VI, II-VI2, IV-VI, III-V,In accordance with the present invention, when the core consists of at least one group II-VI, II-VI2, IV-VI, III-V semiconductor material,
I-VII, II3-VI2, I-III-VI2, ABX3 ou un alliage entre eux, et comporte sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, Pt2+, Hg2+, Al3+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+, la présence d'une coquille n'est pas nécessaire.I-VII, II3-VI2, I-III-VI2, ABX3 or an alloy between them, and comprises on the surface one or more metal ions chosen from the group comprising Fe 2+ , Fe 3+ , Co 2+ , Ni 2 + , Cu 2+ , Zn 2+ , Pb 2+ , Sn 2+ , Sn 4+ , Cu + , Ag + , Au + , Hg 2+ , Cs + , Pd 2+ , Cd 2+ , Pt 2+ , Hg 2+ , Al 3+ , In 3+ , Ga 3+ , As 3+ , As 5+ , Bi 3+ , Sb 3+ Se 2+ , Te 2+ , the presence of a shell is not necessary .
En revanche, lorsque le cœur est constitué uniquement par un ou plusieurs matériaux semi-conducteurs du groupe IV, ledit point quantique comporte une coquille constituée par au moins un matériau semi-conducteur du groupe II-VI, IV-VI, II-VI2, III-V, I-VII, II3-VI2, I-III-VI2, ABX3 ou un alliage entre eux et ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, Pt2+, Hg2+, Al3+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+.On the other hand, when the core consists solely of one or more semiconductor materials from group IV, said quantum dot comprises a shell made up of at least one semiconductor material from group II-VI, IV-VI, II-VI2, III-V, I-VII, II3-VI2, I-III-VI2, ABX 3 or an alloy between them and having on the surface one or more metal ions chosen from the group comprising Fe 2+ , Fe 3+ , Co 2 + , Ni 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Pb 2+ , Sn 2+ , Sn 4+ , Cu + , Ag + , Au + , Hg 2+ , Cs + , Pd 2+ , Cd 2+ , Pt 2+ , Hg 2+ , Al 3+ , In 3+ , Ga 3+ , As 3+ , As 5+ , Bi 3+ , Sb 3+ Se 2+ , Te 2+ .
Dans un mode de réalisation particulier, le nanocristal ou point quantique dans un conjugué de la présente invention est un nanocristal ou point quantique à structure « cœur/coquille ».In a particular embodiment, the nanocrystal or quantum dot in a conjugate of the present invention is a nanocrystal or quantum dot with a structure "core / shell".
Plus particulièrement, la coquille dudit nanocristal ou point quantique comporte les ions métallique choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, Pt2+, Hg2+, Al3+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+.More particularly, the shell of said nanocrystal or quantum dot comprises the metal ions chosen from the group comprising Fe 2+ , Fe 3+ , Co 2+ , Ni 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Pb 2+ , Sn 2+ , Sn 4+ , Cu + , Ag + , Au + , Hg 2+ , Cs + , Pd 2+ , Cd 2+ , Pt 2+ , Hg 2+ , Al 3+ , In 3+ , Ga 3+ , As 3+ , As 5+ , Bi 3+ , Sb 3+ Se 2+ , Te 2+ .
Dans un mode de réalisation avantageux, la coquille dudit nanocristal ou dudit point quantique est constituée de ZnS, de Zn(Se,S), de CdS ou de (Cd,Zn)S.In an advantageous embodiment, the shell of said nanocrystal or of said quantum dot consists of ZnS, Zn (Se, S), CdS or (Cd, Zn) S.
Dans un mode de réalisation plus avantageux, le nanocristal ou le point quantique de l'invention est (CdSe)ZnS, dont le cœur est du CdSe et la coquille est du ZnS.In a more advantageous embodiment, the nanocrystal or the quantum dot of the invention is (CdSe) ZnS, whose core is CdSe and the shell is ZnS.
Pour un nanocristal de l'invention ayant la structure « cœur/coquille », le diamètre du cœur est de préférence de 1 à 10 nm, notamment de 1,5 - 6 nm ; l'épaisseur de la coquille est de préférence de 0,5 à 10 nm, notamment de 1 à 3 nm.For a nanocrystal of the invention having the “core / shell” structure, the diameter of the core is preferably from 1 to 10 nm, in particular from 1.5 - 6 nm; the thickness of the shell is preferably from 0.5 to 10 nm, in particular from 1 to 3 nm.
Un nanocristal ou un point quantique de la présente invention peut être préparé par toutes méthodes connues dans l'art antérieur, telles que la méthode de préparation dans un solvant aqueux (Rajh et al., J.Phys Chem. 1993, Vol. 97, no.46, pp. 11999-12003), la méthode organométallique (Murray et al., JACS, 1993, vol. 115, no. 19, pp. 8706-8715), la synthèse hydrothermale (Yang et al., Materials letters. 2008, Vol 62n no. 17-18, pp. 2564-2566) ou la synthèse assistée par micro-onde (Correa-Duarte et al., Langmuir, 1998, vol. 14, no. 22, pp. 6430-6435).A nanocrystal or a quantum dot of the present invention can be prepared by any methods known in the prior art, such as the method of preparation in an aqueous solvent (Rajh et al., J. Phys Chem. 1993, Vol. 97, no.46, pp. 11999-12003), the organometallic method (Murray et al., JACS, 1993, vol. 115, no. 19, pp. 8706-8715), hydrothermal synthesis (Yang et al., Materials letters . 2008, Vol 62n no. 17-18, pp. 2564-2566) or microwave-assisted synthesis (Correa-Duarte et al., Langmuir, 1998, vol. 14, no. 22, pp. 6430-6435 ).
Dans un mode de réalisation, un nanocristal ou un point quantique d'un conjugué de la présente invention est fonctionnalisé par un agent de fonctionnalisation comportant un groupement sulfhydryle.In one embodiment, a nanocrystal or a quantum dot of a conjugate of the present invention is functionalized by a functionalizing agent comprising a sulfhydryl group.
Ledit agent de fonctionnalisation permet d'augmenter la solubilité et la stabilité des points quantiques dans une solution aqueuse, notamment lorsque ledit nanocristal ou point quantique est préparé par une méthode utilisant un solvant organique.Said functionalizing agent makes it possible to increase the solubility and the stability of the quantum dots in an aqueous solution, in particular when said nanocrystal or quantum dot is prepared by a method using an organic solvent.
Ledit agent de fonctionnalisation peut être choisi parmi la cystéine, la pénicillamine, l’acide dihydrolipoïque, l'acide mercaptoacétique, l'acide mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, le glutathion ou un poly(éthylèneglycol) comportant un groupement sulfhydryle.Said functionalizing agent can be chosen from cysteine, penicillamine, dihydrolipoic acid, mercaptoacetic acid, mercaptopropionic acid, mercaptosuccinic acid, glutathione or a poly (ethylene glycol) comprising a sulfhydryl group.
La fonctionnalisation par un susdit agent peut être mise en œuvre par toute méthode connue dans l'art, par exemple par la méthode décrite par Mohammad-Rezaei et al. (Luminescence 2013, 28: 503-509) ou par l'échange de ligand (Reinhart et Johansson, Chem. Mater., 2015, 27 (21), pp 7313-7320).The functionalization by a said agent can be implemented by any method known in the art, for example by the method described by Mohammad-Rezaei et al. (Luminescence 2013, 28: 503-509) or by ligand exchange (Reinhart and Johansson, Chem. Mater., 2015, 27 (21), pp 7313-7320).
Un susdit agent de fonctionnalisation est lié au point quantique par son groupement sulfhydryle.A said functionalizing agent is linked to the quantum dot by its sulfhydryl group.
On entend par « une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle » soit une molécule biologique contenant naturellement au moins un groupement sulfhydryle soit une molécule dans laquelle un groupement sulfhydryle est introduit artificiellement par une méthode biologique ou chimique dans une molécule biologique naturellement ne comportant pas de groupement sulfhydryle, ledit groupement sulfhydryle étant lié directement à ladite molécule biologique par une liaison covalente, sans par intermédiaire d'un agent de couplage.The term “a biological molecule carrying at least one sulfhydryl group” is either a biological molecule naturally containing at least one sulfhydryl group or a molecule in which a sulfhydryl group is introduced artificially by a biological or chemical method into a biological molecule naturally not comprising of sulfhydryl group, said sulfhydryl group being linked directly to said biological molecule by a covalent bond, without via a coupling agent.
Par exemple, une molécule biologique contenant naturellement au moins un groupement sulfhydryle peut être une protéine contenant au moins une cystéine.For example, a biological molecule naturally containing at least one sulfhydryl group can be a protein containing at least one cysteine.
Conformément à la présente invention, la molécule biologique contenue dans un conjugué de l'invention est un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, une glycoprotéine, un polypeptide, un peptide ou un acide nucléique.According to the present invention, the biological molecule contained in a conjugate of the invention is an antibody, an antibody fragment, a protein, a glycoprotein, a polypeptide, a peptide or a nucleic acid.
Ladite molécule biologique peut être un produit naturel d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne ou viral, obtenu par extrait, ou un produit synthétique comme par exemple un produit recombinant obtenu par bio-ingénierie ou un produit synthétisé par une méthode chimique.Said biological molecule can be a natural product of human, animal, plant, bacterial or viral origin, obtained by extract, or a synthetic product such as for example a recombinant product obtained by bioengineering or a product synthesized by a chemical method.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit fragment d'anticorps est un fragment choisi parmi F(ab')2, Fab, Fv, scFv ou Fc.In a particular embodiment, said antibody fragment is a fragment chosen from F (ab ') 2, Fab, Fv, scFv or Fc.
Dans un mode de réalisation avantageux, ladite molécule biologique est un anticorps, un fragment F(ab')2 ou un fragment Fab.In an advantageous embodiment, said biological molecule is an antibody, an F (ab ') 2 fragment or a Fab fragment.
On entend par « fragment F(ab')2 » un fragment d’anticorps bivalent constitué de deux chaînes légères entières et de deux fragments des chaînes lourdes contenant respectivement le domaine VH et le domaine CH1, lesdites chaînes et lesdits fragments étant liés par des ponts disulfures. Un fragment F(ab')2 peut être obtenu par la digestion d'un anticorps par la pepsine.The term "fragment F (ab ') 2" means a bivalent antibody fragment consisting of two whole light chains and two heavy chain fragments containing the VH domain and the CH1 domain respectively, said chains and said fragments being linked by disulfide bridges. A F (ab ') 2 fragment can be obtained by digestion of an antibody with pepsin.
On entend par « fragment Fab » un fragment d’anticorps monovalent constitué d'une chaîne légère entière et d'un fragment de la chaîne lourde contenant le domaine VH et le domaine CH1, ladite chaîne légère et ledit fragment étant liés par des ponts disulfures. Un fragment Fab peut être obtenu par la digestion d'un anticorps par la papaïne.“Fab fragment” is understood to mean a monovalent antibody fragment consisting of an entire light chain and a heavy chain fragment containing the VH domain and the CH1 domain, said light chain and said fragment being linked by disulfide bridges . A Fab fragment can be obtained by the digestion of an antibody with papain.
On entend par « fragment Fv » un fragment d'anticorps monovalent formé par un domaine VL et un domaine VH, les domaines VL et VH étant liés par des ponts disulfures.The term “Fv fragment” is intended to mean a monovalent antibody fragment formed by a VL domain and a VH domain, the VL and VH domains being linked by disulfide bridges.
On entend par « scFv » un peptide contenant un domaine VL et un domaine VH d'un anticorps.By “scFv” is meant a peptide containing a VL domain and a VH domain of an antibody.
On entend par « Fc » un fragment d'anticorps formé par deux chaînes peptidiques constituant les domaines CH2 et CH3, lesdites deux chaînes peptidiques étant liées par des ponts disulfures. Un fragment Fc peut être obtenu par la digestion d'un anticorps par la papaïne.“Fc” is understood to mean an antibody fragment formed by two peptide chains constituting the CH2 and CH3 domains, said two peptide chains being linked by disulfide bridges. An Fc fragment can be obtained by the digestion of an antibody with papain.
Un fragment d'anticorps contenant au moins un groupement sulfhydryle peut être obtenu en réagissant un susdit fragment d'anticorps avec un agent réducteur pour interrompre partiellement les ponts disulfures.An antibody fragment containing at least one sulfhydryl group can be obtained by reacting a said antibody fragment with a reducing agent to partially interrupt the disulfide bridges.
Contrairement aux conjugués décrits dans l'art antérieur, une molécule biologique dans un conjugué de la présente invention est liée directement à un ion métallique situé à la surface du point quantique par un groupement sulfhydryle porté par ladite molécule biologique, sans par l’intermédiaire d’un agent de couplage.Unlike the conjugates described in the prior art, a biological molecule in a conjugate of the present invention is linked directly to a metal ion located on the surface of the quantum dot by a sulfhydryl group carried by said biological molecule, without via 'a coupling agent.
Grâce à cette caractéristique technique, le conjugué de la présente invention permet de réduire la distance entre la molécule biologique et le point quantique et d'améliorer la limite de détection de la cible de la molécule biologique.Thanks to this technical characteristic, the conjugate of the present invention makes it possible to reduce the distance between the biological molecule and the quantum dot and to improve the limit of detection of the target of the biological molecule.
Par exemple, l'utilisation d'un conjugué de la présente invention dans un immunodosage basé sur le FRET peut diminuer la limite de détection de l’antigène spécifique de la prostate (PSA) à 0,08 ng/mL par rapport à la limite de détection obtenue par les conjugués connus dans l'art utilisant un agent de couplage. Par exemple, la limite de détection d'un conjugué QD705-Fab utilisant un agent de couplage de type sulfo-EMCS est de 2ng/ml_ (Bhuckory et al. Sensors, 2016, 16(2), 197). Un autre conjugué QD705-Mall-Fab utilisant MALdPEG3- acide lipoïque comme agent de couplage est de 0,8 ng/mL (Mattera et al. Nanoscale, 2016, vol.8, num.21, pp. 11275-11283).For example, the use of a conjugate of the present invention in a FRET-based immunoassay can lower the detection limit for prostate specific antigen (PSA) to 0.08 ng / mL from the limit detection obtained by conjugates known in the art using a coupling agent. For example, the detection limit of a QD705-Fab conjugate using a coupling agent of the sulfo-EMCS type is 2ng / ml_ (Bhuckory et al. Sensors, 2016, 16 (2), 197). Another QD705-Mall-Fab conjugate using MALdPEG3- lipoic acid as coupling agent is 0.8 ng / mL (Mattera et al. Nanoscale, 2016, vol.8, num. 21, pp. 11275-11283).
Un conjugué de la présente invention peut être utilisé dans le domaine du diagnostic in vitro ou in vivo et dans le domaine du traitement thérapeutiqueA conjugate of the present invention can be used in the field of in vitro or in vivo diagnosis and in the field of therapeutic treatment
La présente invention concerne également un biosenseur comprenant un conjugué tel que décrit dans la présente invention.The present invention also relates to a biosensor comprising a conjugate as described in the present invention.
Un conjugué ou un biosenseur tel que décrit dans la présente invention peut être utilisé dans l’imagerie fluorescente pour le diagnostic in vivo, par exemple pour le diagnostic du cancer, notamment le cancer de prostate. La présence de la cible de la molécule biologique du conjugué est indiquée par l’émission directe ou indirecte d’une fluorescence par le point quantique activé par une source énergique.A conjugate or a biosensor as described in the present invention can be used in fluorescent imaging for in vivo diagnosis, for example for the diagnosis of cancer, in particular prostate cancer. The presence of the target of the biological molecule of the conjugate is indicated by the direct or indirect emission of fluorescence by the quantum dot activated by an energy source.
Dans un mode de réalisation, un biosenseur de l’invention consiste en un conjugué de la présente invention.In one embodiment, a biosensor of the invention consists of a conjugate of the present invention.
Un tel biosenseur peut être utilisé comme agent de contraste fluorescent dans le diagnostic in vivo.Such a biosensor can be used as a fluorescent contrast agent in in vivo diagnosis.
Dans un autre mode de réalisation particulière, un biosenseur selon l'invention consiste en :In another particular embodiment, a biosensor according to the invention consists of:
un conjugué tel que décrit dans la présente invention, dans lequel ladite molécule biologique est un premier anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un premier épitope spécifique d'un antigène, un deuxième anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un deuxième épitope spécifique dudit antigène et marqué par un deuxième fluorophore.a conjugate as described in the present invention, in which said biological molecule is a first antibody or antibody fragment directed against a first epitope specific for an antigen, a second antibody or antibody fragment directed against a second epitope specific for said antigen and labeled with a second fluorophore.
Dans ce système, ledit conjugué et ledit deuxième anticorps ou fragment d’anticorps marqué constituent un système de FRET dans lequel le point quantique et ledit deuxième fluorophore fonctionnent comme un donneur d’énergie et un accepteur d’énergie.In this system, said conjugate and said second labeled antibody or antibody fragment constitute a FRET system in which the quantum dot and said second fluorophore function as an energy donor and an energy acceptor.
La présence d'une cible qui est reconnue simultanément par un anticorps ou un fragment d’anticorps du conjugué de l’invention et par un deuxième anticorps ou fragment d’anticorps induit le rapprochement entre le donneur d’énergie et l’accepteur d’énergie et conduit finalement au transfert d’énergie entre le donneur d’énergie et l’accepteur d’énergie.The presence of a target which is recognized simultaneously by an antibody or an antibody fragment of the conjugate of the invention and by a second antibody or antibody fragment induces the rapprochement between the energy donor and the acceptor of energy and ultimately leads to energy transfer between the energy donor and the energy acceptor.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit deuxième fluorophore est un lanthanide. De préférence, ledit fluorophore est un ion d'un lanthanide choisi parmi Tb3+, Eu3+, Sm3+, Dy3+, Er3+, Tm3+ ou Ho3+.In a particular embodiment, said second fluorophore is a lanthanide. Preferably, said fluorophore is an ion of a lanthanide chosen from Tb 3+ , Eu 3+ , Sm 3+ , Dy 3+ , Er 3+ , Tm 3+ or Ho 3+ .
Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit deuxième fluorophore est l'ion Tb3+, plus particulièrement un complexe de terbium Lumi4®-Tb, qui a une longue durée de vie en état excité.In a more particular embodiment, said second fluorophore is the Tb 3+ ion, more particularly a terbium complex Lumi4®-Tb, which has a long lifetime in an excited state.
La présente invention concerne également l’utilisation d'un conjugué de la présente invention ou un biosenseur tel que décrit ci-dessus pour la mise en œuvre d'un transfert d’énergie par résonance de type Forste (Forster résonance energy transfer).The present invention also relates to the use of a conjugate of the present invention or a biosensor as described above for the implementation of a Forste resonance energy transfer.
Un autre objet de la présente invention est de proposer un nouveau procédé de préparation d'un conjugué tel que décrit dans la présente invention. Ce procédé permet de conjuguer directement une molécule biologique avec un point quantique sans présence de groupement chimique comme liaison entre ladite molécule biologique et ledit point quantique.Another object of the present invention is to provide a new process for the preparation of a conjugate as described in the present invention. This method makes it possible to directly conjugate a biological molecule with a quantum dot without the presence of a chemical group as a bond between said biological molecule and said quantum dot.
En effet, contre toute attente, une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle peut être liée directement à un ion métallique choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, Pt2+, Hg2+, Al3+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+ par une liaison métallique. Par conséquent, lorsque ces ions métalliques sont situés à la surface d'un nanocristal semi-conducteur, une molécule biologique portant au moins un groupement sulfhydryle peut être fixée directement audit nanocristal sans besoin d'utiliser un agent de couplage.Against all expectations, a biological molecule carrying at least one sulfhydryl group can be linked directly to a metal ion chosen from the group comprising Fe 2+ , Fe 3+ , Co 2+ , Ni 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Pb 2+ , Sn 2+ , Sn 4+ , Cu + , Ag + , Au + , Hg 2+ , Cs + , Pd 2+ , Cd 2+ , Pt 2+ , Hg 2+ , Al 3+ , In 3+ , Ga 3+ , As 3+ , As 5+ , Bi 3+ , Sb 3+ Se 2+ , Te 2+ by a metal bond. Consequently, when these metal ions are located on the surface of a semiconductor nanocrystal, a biological molecule carrying at least one sulfhydryl group can be attached directly to said nanocrystal without the need to use a coupling agent.
Ledit procédé comprend une étape consistant à mélanger ladite molécule biologique avec un nanocristal ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+, Pt2+, Hg2+, Al3+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+ pour obtenir un susdit conjugué.Said method comprises a step consisting in mixing said biological molecule with a nanocrystal having on the surface one or more metal ions chosen from the group comprising Fe 2+ , Fe 3+ , Co 2+ , Ni 2+ , Cu 2+ , Zn 2 + , Pb 2+ , Sn 2+ , Sn 4+ , Cu + , Ag + , Au + , Hg 2+ , Cs + , Pd 2+ , Cd 2+ , Pt 2+ , Hg 2+ , Al 3+ , In 3+ , Ga 3+ , As 3+ , As 5+ , Bi 3+ , Sb 3+ Se 2+ , Te 2+ to obtain the above conjugate.
Le mélange peut être effectué dans une solution aqueuse à température ambiante.The mixing can be carried out in an aqueous solution at room temperature.
Une molécule biologique peut naturellement comporter au moins un groupement sulfhydryle, notamment lorsque ladite molécule comporte au moins une cystéine.A biological molecule can naturally comprise at least one sulfhydryl group, in particular when said molecule comprises at least one cysteine.
Ledit groupement sulfhydryle peut être également introduit artificiellement dans une molécule biologique par une méthode biologique ou chimique.Said sulfhydryl group can also be introduced artificially into a biological molecule by a biological or chemical method.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de préparation d'un conjugué tel que décrit dans la présente invention dans lequel ladite molécule biologique est un anticorps ou un fragment d'anticorps, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :In one embodiment, the invention relates to a method for preparing a conjugate as described in the present invention in which said biological molecule is an antibody or an antibody fragment, said method comprising the following steps:
(i) faire réagir un anticorps ou un fragment d'anticorps avec un agent réducteur pour obtenir un anticorps ou un fragment d'anticorps partiellement réduit portant au moins un groupement sulfhydryle, (ii) mélanger ledit anticorps ou ledit fragment d'anticorps partiellement réduit avec un nanocristal semi-conducteur ayant sur la surface un ou plusieurs ions métalliques choisis dans le groupe comprenant Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Sn2+, Sn4+, Cu+, Ag+, Au+, Hg2+, Cs+, Pd2+, Cd2+,(i) reacting an antibody or an antibody fragment with a reducing agent to obtain an antibody or a partially reduced antibody fragment carrying at least one sulfhydryl group, (ii) mixing said antibody or said partially reduced antibody fragment with a semiconductor nanocrystal having on the surface one or more metal ions chosen from the group comprising Fe 2+ , Fe 3+ , Co 2+ , Ni 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Pb 2+ , Sn 2 + , Sn 4+ , Cu + , Ag + , Au + , Hg 2+ , Cs + , Pd 2+ , Cd 2+ ,
Pt2+, Hg2+, Al3+, In3+, Ga3+, As3+, As5+, Bi3+, Sb3+ Se2+, Te2+ pour obtenir un susdit conjugué.Pt 2+ , Hg 2+ , Al 3+ , In 3+ , Ga 3+ , As 3+ , As 5+ , Bi 3+ , Sb 3+ Se 2+ , Te 2+ to obtain the above conjugate.
L'utilisation d'un agent réducteur dans l'étape (i) dudit procédé permet d'interrompre partiellement les ponts disulfures situés entre les chaînes légères et lourdes, d'une part, et entre deux chaînes lourdes, d'autre part.The use of a reducing agent in step (i) of said process makes it possible to partially interrupt the disulphide bridges located between the light and heavy chains, on the one hand, and between two heavy chains, on the other hand.
Conformément à la présente invention, un agent réducteur est choisi parmi le groupe comprenant le tris(2-carboxyéthyl)phosphine, le 2mercaptoéthylamine, le 2-mercaptoéthanol et le dithiothreitol.According to the present invention, a reducing agent is chosen from the group comprising tris (2-carboxyethyl) phosphine, 2mercaptoethylamine, 2-mercaptoethanol and dithiothreitol.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit procédé comprend en outre avant l'étape (ii), une étape (ii') de fonctionnalisation d'un susdit nanocristal semi-conducteur par un agent de fonctionnalisation comportant un groupement sulfhydryle, choisi parmi le groupe comprenant la cystéine, la pénicillamine, l’acide dihydrolipoïque, l'acide mercaptoacétique, l'acide mercaptopropionique, l'acide mercaptosuccinique, le glutathion ou par un poly(éthylèneglycol) comportant un groupement sulfhydryle.In a particular embodiment of the invention, said method further comprises before step (ii), a step (ii ') of functionalization of said abovementioned semiconductor nanocrystal with a functionalization agent comprising a sulfhydryl group, chosen from the group comprising cysteine, penicillamine, dihydrolipoic acid, mercaptoacetic acid, mercaptopropionic acid, mercaptosuccinic acid, glutathione or with a poly (ethylene glycol) comprising a sulfhydryl group.
La présente invention est illustrée plus en détail par les figures et les exemples ci-après.The present invention is illustrated in more detail by the figures and examples below.
Figure 1: cette figure illustre la liaison directe du fragment Fab, par son groupement sulfhydryle, sur la surface du point quantique contenant du ZnS, ledit point quantique étant fonctionnalisé par la pénicillamine.Figure 1: this figure illustrates the direct bond of the Fab fragment, by its sulfhydryl group, on the surface of the quantum dot containing ZnS, said quantum dot being functionalized by penicillamine.
Figures 2A et 2B: La figure 2A illustre la courbe de calibration d'un immunodosage basé sur le FRET. L'augmentation de la quantité d'antigène TPSA (total prostate spécifie antigen) dans une solution contenant Tb-anticorps et les conjugués de la présente invention conduit à l'augmentation du signal FRET. La figure 2B montre la limite de détection de ce système d'immunodosage basé sur le FRET. La limite de détection obtenue est de 0,08 ng/mL.Figures 2A and 2B: Figure 2A illustrates the calibration curve for a FRET-based immunoassay. Increasing the amount of TPSA (total prostate specifies antigen) antigen in a solution containing Tb-antibody and the conjugates of the present invention leads to an increase in the FRET signal. Figure 2B shows the detection limit of this FRET-based immunoassay system. The detection limit obtained is 0.08 ng / mL.
ExemplesExamples
Exemple 1 : Conjugaison directe de l'anticorps anti-TPSA avec les points quantiques CdSe/ZnSExample 1: Direct Conjugation of the Anti-TPSA Antibody with the CdSe / ZnS Quantum Points
Un anticorps dirigé contre TPSA (total prostate spécifie antigen) est utilisé dans l'exemple. Le fragment F(ab')2 et le fragment Fab sont préparés par « Pierce™ Mouse IgG Fab and F(ab')2 préparation kit » conformément aux instructions du fournisseur.An antibody against TPSA (total prostate specifies antigen) is used in the example. The F (ab ') 2 fragment and the Fab fragment are prepared by "Pierce ™ Mouse IgG Fab and F (ab') 2 preparation kit" in accordance with the supplier's instructions.
Le ratio molaire initial entre les points quantiques et les anticorps est :20.The initial molar ratio between quantum dots and antibodies is: 20.
200 mM du chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) est préparé en dissolvant 0,0057 g de (TCEP) dans 100 pL de l'eau déionisée.200 mM of tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) is prepared by dissolving 0.0057 g of (TCEP) in 100 μL of deionized water.
Les anticorps ou les fragments d'anticorps sont incubés avec le TCEP en température ambiante pendant 30 min pour partiellement réduire les ponts disulfures. 3,75 pL du TCEP sont ajoutés dans 150 pL d'une solution d'anticorps pour obtenir une solution dont la concentration finale en TCEP est d'environ 5 mM. L'incubation est réalisée sous agitation à 30 tpm.Antibodies or antibody fragments are incubated with TCEP at room temperature for 30 min to partially reduce the disulfide bridges. 3.75 μL of TCEP are added to 150 μL of an antibody solution to obtain a solution whose final concentration in TCEP is approximately 5 mM. The incubation is carried out with shaking at 30 rpm.
Après la réaction, le TCEP en excès est purifié par la colonne de purification ayant un seuil de coupure à 30kDa (Millipore®) et dans un tampon 1XPBS à pH7,5. La colonne est ensuite lavée deux fois par 4 mL du tampon 1XPBS à pH7,5 avec centrifugation à 4000g. Le volume final de l'anticorps ou du fragment d'anticorps collecté est de 150 pL.After the reaction, the excess TCEP is purified by the purification column having a cut-off threshold at 30 kDa (Millipore®) and in a 1XPBS buffer at pH 7.5. The column is then washed twice with 4 ml of 1XPBS buffer at pH 7.5 with centrifugation at 4000 g. The final volume of the antibody or of the antibody fragment collected is 150 μL.
L'anticorps ou le fragment d'anticorps collecté après la purification est mélangé avec 100 pL des points quantiques tels que décrits dans la présente d'invention. Le mélange est incubé pendant 4 heures à l'obscurité et à température ambiante sous agitation à 30 tpm.The antibody or antibody fragment collected after purification is mixed with 100 µL of the quantum dots as described in the present invention. The mixture is incubated for 4 hours in the dark and at room temperature with shaking at 30 rpm.
Après la conjugaison, les anticorps ou les fragments d'anticorps qui ne sont pas liés aux points quantiques sont lavés par lmL du tampon 1XPBS à pH 7,5 dans une colonne de purification ayant le seuil de coupure à 100 kDa (Millipore®) et ensuite centrifugé à 1000 g. Le lavage est répété 4 fois.After conjugation, the antibodies or antibody fragments which are not linked to the quantum dots are washed with 1 ml of the 1XPBS buffer at pH 7.5 in a purification column having the cut-off threshold at 100 kDa (Millipore®) and then centrifuged at 1000 g. The washing is repeated 4 times.
La solution collectée est centrifugée à 4000g pendant 5 minutes. Le surnageant obtenu après la centrifugation est conservé à 4°C.The collected solution is centrifuged at 4000g for 5 minutes. The supernatant obtained after centrifugation is stored at 4 ° C.
Exemple 2 : Détection de TPSAExample 2: TPSA detection
Les conjugués QD-IgG, QD-F(ab')2, and QD-Fab sont produits selon l'exemple 1.The QD-IgG, QD-F (ab ') 2, and QD-Fab conjugates are produced according to Example 1.
L'immunodosage basé sur le FRET est mis en œuvre dans une solution contenant ledit conjugué et un deuxième anticorps anti-PSA marqué par un complexe de terbium. Après l'ajout du PSA dans ladite solution, l'apparition d'un signal de transmission d'énergie du Tb aux points quantiques confirme la fonctionnalité du système d'immunodosage utilisant ledit conjugué (Figures 2A et 2B). La limite de détection de l'antigène PSA obtenue par ce système est de 0,08 ng/mL, alors que la limite de détection des conjugués utilisant des agents de couplage est au moins 10 fois supérieur (Mattera et al. Nanoscate, 2016, vol.8, num.21, pp. 11275-11283).The FRET-based immunoassay is implemented in a solution containing said conjugate and a second anti-PSA antibody labeled with a terbium complex. After the addition of the PSA in said solution, the appearance of an energy transmission signal from Tb to the quantum dots confirms the functionality of the immunoassay system using said conjugate (FIGS. 2A and 2B). The detection limit for the PSA antigen obtained by this system is 0.08 ng / mL, while the detection limit for conjugates using coupling agents is at least 10 times higher (Mattera et al. Nanoscate, 2016, vol. 8, num. 21, pp. 11275-11283).
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|---|---|---|---|---|
| US20200129779A1 (en) * | 2018-10-31 | 2020-04-30 | Beijing Boe Display Technology Co., Ltd. | Implant, diagnosis and treatment device, and method of emitting laser |
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