FR3047999A1 - BIOCATALYST FOR THE PRODUCTION OF ETHANOL FROM MAIZE - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, présentant au moins une activité protéase, une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, et une activité β-glucosidase, susceptible d'être obtenu par un procédé de fabrication de biocatalyseur comprenant une étape de fermentation en milieu solide d'un substrat par une souche d'Aspergillus tubingensis SCCO27 déposée le 1 er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961, ou un variant naturel de cette souche.The present invention relates to a biocatalyst for producing ethanol from starchy raw material, having at least one protease activity, a cellulase activity which is not a β-glucosidase activity, and a β-glucosidase activity, capable of being obtained by a process for producing a biocatalyst comprising a step of solid-state fermentation of a substrate with a strain of Aspergillus tubingensis SCCO27 deposited on February 1, 2016 with Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays Under the number CBS 136961, or a natural variant of this strain.

Description

Biocatalyseur pour la production d'éthanol à partir de maïs

La présente invention concerne des biocatalyseurs permettant d'accélérer et d'améliorer la production d'éthanol par fermentation de matières premières amylacées.

La diminution importante et rapide des ressources en énergies fossiles et les problèmes de pollution associés à leur utilisation sont à l'origine de la nécessité de trouver des sources d'énergie alternatives à ces carburants.

La biomasse issue des produits et/ou coproduits agricoles constitue désormais une source de carbone importante et d'intérêt pour remplacer les sources d'énergie fossiles. L'éthanol produit à partir des sucres fermentescibles contenus dans les végétaux peut ainsi être utilisé dans les véhicules dotés de moteurs à combustion. L'augmentation de cette utilisation a entraîné un développement rapide de la production du bioéthanol au cours des dernières années tant en Amérique du Nord qu'en Europe, en particulier à partir de cultures de blé et/ou de maïs ou de leurs coproduits agricoles.

La généralisation de l'utilisation de bioéthanol comme carburant reste cependant toujours recherchée pour lutter par exemple contre le réchauffement climatique.

Une telle généralisation impliquera cependant un besoin d'augmentation des cultures de blé et/ou de maïs destinées à la production de bioéthanol. Or, les surfaces cultivables mondiales restent limitées, générant des tensions entre les surfaces de cultures dédiées à la production d'éthanol et celles dédiées à l'alimentation humaine et animale.

Par conséquent, bien que les procédés de fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, en particulier à partir de farines de blé ou de maïs, soient désormais couramment utilisés par l'homme du métier, il existe toujours un besoin important d'augmentation des rendements de production de ces procédés. De plus, au vu des quantités visées, même une augmentation de 1% du rendement de production d'éthanol à partir de matière première amylacée est une augmentation particulièrement bénéfique, tant pour les producteurs que les agriculteurs.

Les présents inventeurs ont identifié, de manière surprenante, une souche d'Aspergillus tubingensis permettant de produire, par fermentation en milieu solide, un biocatalyseur dont la composition enzymatique permet, lorsqu'il est ajouté au cours de l'étape de fermentation, et/ou de propagation de levures, d'un procédé de fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée et notamment de maïs, d'accélérer de manière significative la production d'éthanol, d'augmenter la concentration finale en éthanol d'au moins 1% et de réduire la production de glycérol, un co-produit de l’éthanol.

Cette souche, dénommée souche SCC027, a été déposée le 1er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961.

En réalisant une étude de protéomique du biocatalyseur obtenu en utilisant cette souche, les inventeurs ont montré que celui-ci présentait une composition enzymatique originale, incluant des activités principalement protéases, cellulases et hémicellulases.

Ils ont également démontré que près de 90% de l'effet observé avec ce biocatalyseur sur la production d'éthanol était dû à une combinaison de 5 familles d'activités enzymatiques: les activités protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase, et plus particulièrement à une combinaison de 7 enzymes fongiques spécifiques : une aspergillopepsine A, une endoglucanase, une endoxylanase A, une endoxylanase C, une β-glucosidase A, une cellobiohydrolase et une polygalacturonase C.

Par ailleurs, toutes ces activités enzymatiques sont produites simultanément par la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 par fermentation. Le procédé de production de ce biocatalyseur est donc pratique à mettre en œuvre, puisqu'il ne nécessite pas de conditions de fermentation différentes selon les activités enzymatiques produites.

Les inventeurs ont de plus montré que la production de glycérol, coproduit du procédé de fabrication d'éthanol, était significativement diminuée en présence de ce biocatalyseur. Or le niveau de production de glycérol est un indicateur de la performance de la production d’éthanol par la levure. La réduction du glycérol peut aussi avoir des effets bénéfiques sur le procédé aval de production d’éthanol en conditions industrielles, en particulier sur l’évaporation des vinasses.

La présente invention concerne donc une souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 déposée le 1er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961.

La présente invention a également pour objet un variant naturel de la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 déposée le 1er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961, permettant de produire, par fermentation en milieu solide sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, un biocatalyseur qui, lorsqu'il est ajouté dans le milieu de saccharification-fermentation simultanées d'un procédé de fabrication d'éthanol à partir de farine de maïs, permet d'obtenir un Gain Ethanol au moins égal à celui obtenu dans les mêmes conditions avec un biocatalyseur produit par fermentation en milieu solide de la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza.

La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, comprenant les étapes suivantes : a) fournir un substrat, b) ensemencer le substrat fourni à l'étape a) avec la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 selon l'invention ou un variant naturel de celle-ci selon l'invention, et c) fermenter par fermentation en milieu solide ledit substrat avec la souche dans des conditions appropriées pour permettre la production simultanée par la souche d'une activité protéase, d'une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, et d'une activité β-glucosidase.

Un autre objet de la présente invention concerne un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, présentant au moins une activité protéase, une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, et une activité β-glucosidase, susceptible d'être obtenu par le procédé de fabrication de biocatalyseur selon l'invention.

La présente invention concerne également un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, ledit biocatalyseur comprenant : (i) au moins une activité protéase, (ii) au moins une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, (iii) au moins une activité xylanase, (iv) au moins une activité β-glucosidase, et (v) au moins une activité pectinase, lesdites activités protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase étant produites simultanément par la même souche de champignon filamenteux.

La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un biocatalyseur selon l'invention, pour la fabrication, par fermentation de matière première amylacée, d'éthanol.

Elle a également pour objet un procédé de fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée comprenant une étape de fermentation de la matière première amylacée par une levure en présence du biocatalyseur selon l'invention.

Description détaillée de l'invention Définitions

La nomenclature utilisée pour la classification des enzymes est la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB).

Par "protéase", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.4, qui clive les liaisons peptidiques.

De préférence, la protéase fongique est une endopeptidase. De manière particulièrement préférée, la protéase fongique est une ou un mélange de protéase(s) d'Aspergillus, en particulier une ou un mélange de protéase(s) d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement une ou un mélange de protéase(s) d'Aspergillus tubingensis, plus particulièrement une aspergillopepsine. De manière préférée entre toutes, la protéase fongique est une aspergillopepsine A.

Par "aspergillopepsine A", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.4.23.18, qui est une aspartate-endopeptidase, qui clive les liaisons peptidiques internes des protéines en conditions acides et avec une large spécificité. Cette enzyme possède typiquement au moins 60,4% d’identité de séquence avec Paspergillopepsin A-like aspartic endopeptidase" de séquence SEQ ID NO: 1, dont le numéro d’accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 145249508, issue du séquençage du génome de la souche d’Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "cellulase", on entend ici une enzyme qui clive les liaisons glycosidiques en β-D-1,4 de la cellulose, de la lichenine et des β-glucanes de céréales.

De préférence, la cellulase est une ou un mélange de cellulase(s) d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergillus niger. De manière préférée, la cellulase est une endoglucanase, une cellobiohydrolase ou un mélange de celles-ci.

Par "endoglucanase", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH6, de la classe EC 3.2.1.4 clivant les liaisons p-1,4-glycosidiques internes des chaînes de cellulose. De manière préférée cette enzyme possède au moins 43,6% d’identité de séquence avec Pendoglucanase" de séquence SEQ ID NO: 2, dont le numéro d’accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 350633077, issue du séquençage du génome de la souche d’Aspergillus niger ATCC 1015.

Par "cellobiohydrolase", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH7, de la classe EC 3.2.1.91 qui libère les molécules de cellobiose des extrémités non réductrices de chaînes de cellulose. Cette enzyme possède typiquement au moins 25,6% d’identité de séquence avec la "Probable 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase A" de séquence SEQ ID NO: 3, dont le numéro d’accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 294956478, issue du séquençage du génome de la souche d’Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "xylanase", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.2.1.8 de la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie

Moléculaire (IUBMB) qui dégrade les polymères de xyloses liés par des liaisons β-1-4, dégradant ainsi en particulier l'hémicellulose.

De préférence, la xylanase est une ou un mélange de xylanase(s) d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergilus tubingensis. De manière préférée, la xylanase est une endoxylanase de la classe EC 3.2.1.8. De manière particulièrement préférée la xylanase est une endoxylanase A, une endoxylanase C ou un mélange de celles-ci.

Par "endoxylanase A", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH11, de la classe EC 3.2.1.8 clivant les liaisons β-1,4-xylosidiques internes des chaînes de xylanes. Cette enzyme possède typiquement au moins 73,7 % d’identité de séquence avec l’"endo-1,4-beta-xylanase A" de séquence SEQ ID NO: 4, dont le numéro d’accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 145228427, issue du séquençage du génome de la souche d’Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "endoxylanase C", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH10, de la classe EC 3.2.1.8 clivant les liaisons β-1,4-xylosidiques internes des chaînes de xylanes. Cette enzyme possède typiquement au moins 71,2 % d’identité de séquence avec la '"Probable endo-1,4-beta-xylanase C" de séquence SEQ ID NO: 5, dont le numéro d’accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 292495278, issue du séquençage du génome de la souche d’Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "β-glucosidase", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH3, de la classe EC 3.2.1.21 clivant les liaisons β-1,4-glycosidiques externes des chaînes de cellulose avec libération de β-D-glucose.

De préférence, la β-glucosidase est une ou un mélange de β-glucosidase(s) d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergillus tubingensis. Plus particulièrement, la beta-glucosidase est une beta-glucosidase A.

De préférence la "β-glucosidase A" possède au moins 30,2 % d’identité de séquence avec la "beta-glucosidase A" de séquence SEQ ID NO: 6, dont le numéro d’accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 145254958, issue du séquençage du génome de la souche d’Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "pectinase", on entend ici une enzyme capable de dégrader la pectine, polysaccharide présent dans les parois cellulaires des plantes.

De préférence, la pectinase est une ou un mélange de pectinase(s) d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergillus tubingensis. De manière préférée, la pectinase est une polygalacturonase de la classe EC 3.2.1.15 de la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB), qui clive les liaisons glycosidiques a-1,4 entre les résidus d’acide galacturonique. Plus particulièrement la pectinase est une polygalacturonase C.

Par "polygalacturonase C", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH28, de la classe EC 3.2.1.15 clivant les liaisons a-1,4-galacturoniques internes des chaînes d’acides galacturoniques. Cette enzyme possède typiquement au moins 28,7 % d’identité de séquence avec Pendopolygalacturonase C" de séquence SEQ ID NO: 7, dont le numéro d’accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 145251107, issue du séquençage du génome de la souche d’Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Dans le cadre de l'invention, le nom d'une classe ou famille enzymatique (e.g. protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase) fait de préférence référence à l'activité enzymatique produite par cette famille, tandis que le nom d'une enzyme spécifique (e.g. aspergillopepsine A, endoxylanase A, endoxylanase C, polygalacturonase C) fait référence à la protéine en tant que telle.

Ainsi, une composition comprenant une famille enzymatique X comprend l'activité enzymatique X et éventuellement l'enzyme X, en tant que telle.

Les activités enzymatiques des enzymes mentionnées ci-dessus peuvent être déterminées par toute technique bien connue de l'homme du métier. Des exemples de méthode de détermination de chacune des classes enzymatiques mentionnées ci-dessus sont décrits dans la section "Activités enzymatiques" ci-dessous.

Le pourcentage d'identité tel que défini ici peut être calculé par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. De préférence, le pourcentage d'identité correspond au nombre d'acides aminés identiques obtenus pour un alignement apparié optimal (c'est-à-dire l'alignement maximisant le nombre d'acides aminés identiques) d'une séquence d'une protéine avec une protéine de référence, sur la totalité de leur longueur, divisé par le nombre total d'acides aminés de la plus grande des deux séquences alignées. L'alignement peut être réalisé manuellement ou à l'aide de programmes d'ordinateur tels que le programme EMBOSS-Needle program (Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453). Le pourcentage d'identité est de préférence calculé en utilisant le programme EMBOSS:needle (global) avec la matrice Blosum62 et les paramètres suivants: "Gap Open" égal à 10.0, "Gap Extend" égal à 0.5.

Dans le contexte de l'invention, les références Gl du NCBI citées sont celles qui étaient disponibles au 21 décembre 2015.

Souche d’Aspergillus tubingensis

La présente invention a pour objet une souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 déposée le 1er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961.

La présente invention a également pour objet un variant naturel de la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 déposée le 1er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961, permettant de produire, par fermentation en milieu solide sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, en particulier un mélange de son de blé et de tourteau de colza dans un rapport 30/70, un biocatalyseur qui, lorsqu'il est ajouté dans le milieu de saccharification-fermentation simultanées d'un procédé de fabrication d'éthanol à partir de farine de maïs, permet d'obtenir un Gain Ethanol au moins égal à celui obtenu dans les mêmes conditions avec un biocatalyseur produit par fermentation en milieu solide de la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, en particulier un mélange de son de blé et de tourteau de colza dans un rapport 30/70.

Par "variant naturel", on entend ici une souche obtenue sans manipulation génétique, à partir d'une souche naturelle de référence, la souche ainsi obtenue permettant de produire, par fermentation en milieu solide sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, en particulier un mélange de son de blé et de tourteau de colza dans un rapport 30/70, un biocatalyseur qui, lorsqu'il est ajouté dans le milieu de saccharification-fermentation simultanées d'un procédé de fabrication d'éthanol à partir de farine de maïs, permet d'obtenir un Gain Ethanol tel que décrit à la section "Fabrication d'éthanol" ci-dessous, au moins égal à celui obtenu dans les mêmes conditions avec un biocatalyseur produit par fermentation en milieu solide de la souche de référence sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, en particulier un mélange de son de blé et de tourteau de colza dans un rapport 30/70.

Le variant naturel peut ainsi être obtenu par croisement et/ou hybridation de souches d'Aspergillus et/ou par mutation spontanée et/ou par mutagénèse aléatoire, par exemple suite à une exposition à des conditions de stress, à un traitement UV ou à un traitement avec d’autres agents mutagènes.

Le patrimoine génétique d'un variant naturel n'a pas été modifié par génie génétique. Le variant naturel n'est donc pas un organisme génétiquement modifié.

Le "Gain Ethanol" est défini à la section "Fabrication d'éthanol" ci-dessous.

De préférence, le variant naturel selon l'invention permet de produire, dans les conditions décrites dans l'exemple 1, un biocatalyseur qui, lorsqu'il est ajouté dans le milieu de saccharification-fermentation simultanées d'un procédé de fabrication d'éthanol tel que décrit dans l'exemple 2, permet d'obtenir un Gain Ethanol tel que décrit à la section « Fabrication d’éthanol » au moins égal à celui obtenu dans les mêmes conditions avec un biocatalyseur produit dans les conditions décrites dans l'exemple 1, par la souche SCC027.

Procédé de fabrication de biocatalyseur

La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, comprenant les étapes suivantes : a) fournir un substrat, b) ensemencer le substrat fourni à l'étape a) avec la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 ou un variant naturel de celle-ci selon l'invention, et c) fermenter par fermentation en milieu solide ledit substrat avec la souche dans des conditions appropriées pour permettre la production simultanée par la souche d'une activité protéase, d'une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase et d'une activité β-glucosidase.

Substrat

Le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur est de préférence un coproduit agricole ou agro-industriel.

Par "coproduit agricole ou agro-industriel", on entend ici un produit créé au cours du même processus de transformation et en même temps qu'un produit agricole ou agroindustriel principal.

Le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur peut en particulier être un coproduit céréalier, un coproduit de culture oléagineuse, un coproduit de culture oléoprotéagineuse, un coproduit de culture saccharifère, un coproduit de procédés de la transformation de cultures céréalières, oléagineuses, oléoprotéagineuses, saccharifères, ou un mélange de ceux-ci.

Des exemples de substrats pouvant être utilisés pour produire le biocatalyseur selon l'invention incluent le son de blé, le tourteau de colza, le tourteau de soja, la pulpe de betterave, la radicelle d'orge, les drêches éthanolières de maïs, les drêches éthanolières de blé et des mélanges de ceux-ci.

De préférence, le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur est choisi dans le groupe constitué du son de blé, du tourteau de colza, la radicelle d'orge, la drèche éthanolière de maïs, et des mélanges de ceux-ci. De manière davantage préférée, le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur comprend du son de blé et/ou du tourteau de colza. De manière préférée entre toutes, le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur comprend ou consiste en un mélange de son de blé et de tourteau de colza.

Le son de blé et le tourteau de colza peuvent être présents dans ce mélange dans des proportions massiques allant de 10/90 (autrement dit 10% de son de blé pour 90% de tourteau de colza) à 50/50 (autrement dit 50% de son de blé pour 50% de tourteau de colza), de préférence de 15/85 (autrement dit 15% de son de blé pour 85% de tourteau de colza) à 45/55 (autrement dit 45% de son de blé pour 55% de tourteau de colza), de préférence de 20/80 (autrement dit 20% de son de blé pour 80% de tourteau de colza) à 40/60 (autrement dit 40% de son de blé pour 60% de tourteau de colza), de préférence de 25/75 (autrement dit 25% de son de blé pour 75% de tourteau de colza) à 35/65 (autrement dit 35% de son de blé pour 35% de tourteau de colza), de manière davantage préférée de 30/70 (autrement dit 30% de son de blé pour 70% de tourteau de colza).

Le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur peut être préalablement broyé.

Le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur est de préférence préhumidifié et traité thermiquement en vue de diminuer la flore endogène du substrat, de le pasteuriser ou le stériliser.

De manière particulièrement préférée, le substrat utilisé pour la fabrication du biocatalyseur est pré-humidifié de manière à atteindre une matière sèche de 35 à 90%, de préférence une matière sèche de 40 à 80%, de préférence une matière sèche de 45 à 70%, de préférence une matière sèche de 50 à 65%, de manière préférée à 55% de matière sèche.

Le traitement thermique peut consister en un chauffage, par exemple dans un autoclave, typiquement à 105°C par exemple pendant 35 min, ou une pasteurisation, typiquement à 105°C par exemple pendant 15 min. Il est également possible d'opérer un traitement thermique du substrat utilisé pour la production du biocatalyseur en y injectant de la vapeur d'eau.

De préférence, le pH est réglé lors de l'humidification dans une gamme de 4 à 5,5, de préférence à 4,9 par exemple avec de l'acide nitrique ou de l'acide sulfurique, afin de favoriser l’implantation du microorganisme cultivé et le démarrage de la fermentation en milieu solide. L'humidification est de préférence déterminée de manière à ce que la teneur en eau du substrat utilisé pour la production du biocatalyseur soit comprise entre 40 et 70% de la masse totale du substrat et de l'eau. Ainsi, le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur présente de préférence une matière sèche initiale comprise entre 30 et 60%, de manière préférée de 45%.

Ensemencement L'ensemencement du substrat utilisé pour la production du biocatalyseur peut être mis en œuvre avec tout inoculum approprié. La souche d'Aspergillus tubingensis utilisée lors de la fermentation en milieu solide peut ainsi être préalablement soumise à une étape de sporulation avant d'être inoculée sous forme de spores. La dose d'inoculum sera alors avantageusement d'au moins 5.106 spores viables/g de matière sèche initiale, de préférence au moins 107 spores viables/g de matière sèche initiale. Alternativement, la souche d'Aspergillus tubingensis utilisée lors de la fermentation en milieu solide peut être inoculée sous forme de mycélium. La dose d'inoculum sera alors avantageusement comprise entre 100 et 500 g de milieu de culture liquide comprenant le mycélium par kg de matière sèche initiale.

Fermentation en milieu solide

Par "fermentation en milieu solide", on entend ici la culture de microorganismes sur des supports solides humides, sur des supports inertes ou sur des substrats insolubles qui peuvent être utilisés comme source de carbone et d'énergie. Le processus de fermentation a lieu en absence ou quasi-absence d'eau libre dans l'espace entre les particules de substrat.

La fermentation en milieu solide peut être conduite dans tout réacteur approprié.

La fermentation en milieu solide est de préférence conduite pour un arrêt maîtrisé avant la sporulation de la souche d'Aspergillus tubingensis utilisée. La fermentation en milieu solide est ainsi de préférence conduite pendant une période de 1 à 4 jours, de préférence entre 20 h et 80 h, entre 35 h et 60 h, entre 40 h et 55 h, de manière particulièrement préférée entre 45 h et 50 h.

La température du milieu est de préférence maintenue entre 30°C et 36°Gt 0,5°C, de manière davantage préférée à 33°C± 0,5°C, ce qui correspond au domaine d'activité optimum des souches d'Aspergillus tubingensis utilisées pour produire le biocatalyseur.

La teneur en eau du substrat est de préférence sensiblement maintenue entre 45 et 60% au cours de la fermentation, de manière davantage préférée à 55%, par exemple en procédant périodiquement à des apports d'eau pour compenser la perte en eau du milieu. L'expression "sensiblement maintenue" signifie qu'il est tolérable que le taux d'humidité prenne une valeur s'écartant de 2 unités % de l'intervalle 45-60% pendant une relativement brève période entre deux ajustements successifs du taux d'humidité ou en fin de fermentation. Le taux d'humidité du substrat peut en effet avoir tendance à baisser au cours de la fermentation par évaporation sous l'effet de l'augmentation de température générée par la croissance fongique.

Une aération, de préférence en continu, est de préférence mise en place pendant la fermentation en milieu solide, afin d'apporter l'oxygène nécessaire à la fermentation et éviter l'accumulation excessive de dioxyde de carbone produit par la fermentation et/ou éviter l’accumulation excessive de chaleur.

Une agitation peut être conduite en vue d'éviter la formation de masses imperméables. L'agitation peut être mise en œuvre au moyen de bras agitateurs, de lames ou spatules ou de vis sans fin. L'agitation reste toutefois de préférence modérée. De préférence, l'agitation est discontinue, typiquement l'agitation est conduite toutes les 3 h à 13 h. L'étape c) de fermentation est mise en œuvre dans des conditions appropriées pour permettre la production simultanée par la souche d'une activité protéase telle que définie dans la section "Définitions" ci-dessus, d'une activité cellulase qui n'est pas une β-glucosidase et d'une activité β-glucosidase, telle que définie à la section "Définitions" ci-dessus.

Par "production simultanée" de plusieurs activités enzymatiques, on entend ici que les activités enzymatiques sont produites par la souche d’Aspergillus tubingensis au cours d'une seule étape de fermentation au cours de laquelle les conditions de fermentation (température, pH, composition du milieu, aération) permettent d’obtenir l’ensemble des activités enzymatiques recherchées. L'étape c) de fermentation est de préférence mise en œuvre dans des conditions appropriées pour permettre la production simultanée par la souche d'au moins 60 U d'activité protéase PAC par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 100 U d'activité protéase PAC par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 130 U d'activité protéase PAC par gramme de matière sèche initiale de substrat, d'au moins 60 U d'activité cellulase CMCell par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 110 U d'activité cellulase CMCell par gramme de matière sèche initiale de substrat, et d'au moins 100 U d'activité β-glucosidase β-Glu par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 200 U d'activité β-glucosidase β-Glu par gramme de matière sèche initiale de substrat.

De préférence, l'étape c) de fermentation est mise en œuvre dans des conditions appropriées pour permettre en outre la production simultanée par la souche - d'au moins 75 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 130 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 180 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, et/ou - d'au moins 2000 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 2900 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 3800 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 4500 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat. L'étape c) de fermentation est de préférence mise en œuvre dans des conditions pour permettre la production simultanée par la souche d'au moins une aspergillopepsine A, telle que définie dans la section "Définitions" ci-dessus, comme protéase, d'au moins une endoglucanase, telle que définie dans la section "Définitions" ci-dessus, comme cellulase, et d'au moins une β-glucosidase, telle que définie dans la section "Définition" ci-dessus.

Le produit de fermentation ainsi obtenu est un produit solide humide.

Par "matière sèche initiale de substrat" ou "MSi", on entend ici la masse de matière sèche de substrat utilisée pour réaliser la fabrication du biocatalyseur par fermentation en milieu solide, au début de cette fermentation. Au cours du procédé de fermentation en milieu solide, la croissance de microorganismes tels qu’Aspergillus consomme une partie du substrat, et génère donc une perte de matière sèche de substrat qui représente typiquement entre 15 et 30%, par exemple 20% de la matière sèche initiale.

Les quantités de biocatalyseurs, lors de leur utilisation telle que définie ci-dessous, sont rapportées à la quantité de matière sèche initiale de substrat correspondante.

Les niveaux d’activités enzymatiques sont rapportés à la quantité de matière sèche initiale de substrat correspondante, de telle sorte de pouvoir comparer les formes extraites et les formes brutes du biocatalyseur ou de comparer des biocatalyseurs issus de fermentation ou de souche avec des pertes de masse différentes.

Conditionnement du produit fermenté

Le biocatalyseur obtenu suite à la fermentation en milieu solide ci-dessus peut être sous forme brute ou extraite.

Par "forme brute", on entend ici que le biocatalyseur comprend au moins la protéase, la cellulase et la β-glucosidase, ainsi que la souche d'Aspergillus tubingensis utilisée pour la fermentation en milieu solide et le substrat mis en œuvre lors de la fermentation en milieu solide, éventuellement broyé. Cette forme brute contient typiquement des particules ayant un diamètre compris entre 50 pm et 5 mm selon le type de broyât généré.

Le biocatalyseur obtenu à l'issue de la fermentation en milieu solide peut en outre être séché ou congelé en vue de sa conservation.

Le séchage est de préférence réalisé à une température modérée pour ne pas affecter les activités enzymatiques, par exemple en étuve de préférence à 40°C, jusqu’à obtenir une humidité par exemple de 8%, ou par exemple de 10%.

La congélation est de préférence réalisée sur le produit fermenté humide, par exemple à -20 °C.

Le biocatalyseur obtenu à l'issue de la fermentation en milieu solide peut également subir un nouveau broyage avant d'être conditionné.

Par "forme extraite", on entend ici que la combinaison d'enzymes du biocatalyseur, en particulier au moins les protéase, cellulase et β-glucosidase, plus particulièrement au moins les protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase, plus particulièrement, au moins les aspergillopepsine A, endoglucanase, endoxylanase A, endoxylanase C, β-glucosidase A, cellobiohydrolase et polygalacturonase C, sont isolées de la souche d'Aspergillus tubingensis et du substrat mis en oeuvre lors de la fermentation en milieu solide avec la souche d'Aspergillus tubingensis par des procédés d’extractions pouvant mettre en œuvre toute technique bien connue de l'homme du métier, en particulier par extraction en solution aqueuse, extraction en solution alcoolique, extraction par solvants, homogénéisation haute pression, extraction supercritique, extraction par lits fluidisés, broyage, broyage cryogénique, décompression, cavitation, bullage, extraction par ultrasons, adsorption sur résines ou zéolites. La combinaison d'enzymes sous forme liquide peut être ensuite purifiée par toute technique bien connue de l’homme du métier, en particulier par centrifugation, filtration, ultrafiltration, chromatographie, utilisation de membranes ou précipitation.

Le biocatalyseur sous forme extraite peut en outre être stabilisé, séché ou congelé en vue de sa conservation.

La stabilisation du biocatalyseur peut être effectuée par tout moyen connu de l’homme du métier, tel que l’ajout de glycérol, de sorbate, de sel de potassium, etc.

Le séchage du biocatalyseur sous forme extraite peut être effectué par tout moyen connu de l’homme du métier, tel que la lyophilisation, l’atomisation, etc.

Biocatalyseur

La présente invention concerne un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, comprenant au moins une activité protéase, une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase et une activité β-glucosidase, telles que définies à la section "Définitions" ci-dessus, susceptible d'être obtenu par le procédé de fabrication de biocatalyseur selon l'invention.

Dans un mode de réalisation particulier, le biocatalyseur comprend comme protéase au moins une aspergillopepsine A. Dans un mode de réalisation particulier, le biocatalyseur comprend comme cellulase au moins une endoglucanase et/ou au moins une cellobiohydrolase. Dans un mode de réalisation particulier, le biocatalyseur comprend comme β-glucosidase au moins une β-glucosidase A. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le biocatalyseur comprend au moins une aspergillopepsine A, au moins une endoglucanase et au moins une β-glucosidase A.

Dans un mode de réalisation préféré, ladite activité protéase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 60 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 100 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 130 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat. Dans un autre mode de réalisation préféré, ladite activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 60 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 110 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat. Dans un autre mode de réalisation préféré, ladite activité β-glucosidase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 100 U β-Glu / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 200 U β-Glu / g de matière sèche initiale de substrat. L'expression "matière sèche initiale de substrat" est définie à la section "Procédé de fabrication de biocatalyseui’' ci-dessus.

De préférence, le biocatalyseur susceptible d'être obtenu par le procédé de fabrication selon l'invention comprend en outre au moins une activité xylanase et/ou au moins une activité pectinase, cesdites activités étant produites simultanément par la souche d'Aspergillus tubingensis.

De manière particulièrement préférée, le biocatalyseur susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention comprend en outre : - au moins 75 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 130 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 180 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, et/ou - au moins 2000 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 2900 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 3800 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 4500 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat.

De préférence, le biocatalyseur selon l'invention comprend comme xylanase une endoxylanase A, une endoxylanase C ou un mélange de celles-ci, et/ou comme pectinase une polygalacturonase C.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'ensemble des enzymes présentes dans le biocatalyseur selon l'invention sont produites simultanément par une seule souche de champignon filamenteux, en particulier une seule souche d'Aspergillus, en particulier une seule souche d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergillus tubingensis, de manière davantage préférée la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 ou un variant naturel de celle-ci tels que défini dans la section "Souche d'Aspergillus tubingensis" ci-dessus.

La présente invention concerne également un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, ledit biocatalyseur comprenant : (i) au moins une activité protéase, (ii) au moins une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, (iii) au moins une activité xylanase, (iv) au moins une activité β-glucosidase, et (v) au moins une activité pectinase, lesdites activités protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase étant produites simultanément la même souche de champignon filamenteux.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme protéase (i) au moins une protéase acide, de préférence au moins une aspergillopepsine, de manière préférée entre toutes au moins une aspergillopepsine A.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme cellulase (ii) au moins une endoglucanase, une cellobiohydrolase ou un mélange de celles-ci.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme xylanase (iii) au moins une endoxylanase ou un mélange d'endoxylanases, de manière préférée au moins une endoxylanase A, une endoxylanase C ou un mélange de celles-ci.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme β-glucosidase (iv) au moins une β-glucosidase A.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme pectinase (v) au moins une polygalacturonase, de manière préférée au moins une polygalacturonase C.

Dans un mode de réalisation préféré, le biocatalyseur selon l'invention comprend: (i) au moins une aspergillopepsine A, (ii) au moins une endoglucanase et une cellobiohydrolase, (iii) au moins une endoxylanase A et une endoxylanase C, (iv) au moins une β-glucosidase A, et (v) au moins une polygalacturonase C, lesdites aspergillopepsine A, endoglucanase, cellobiohydrolase, endoxylanase A, endoxylanase C, β-glucosidase A et polygalacturonase C, étant produites simultanément par la même souche de champignon filamenteux.

De préférence, ledit champignon filamenteux est un Aspergillus, de manière préférée un Aspergillus section nigri, plus particulièrement un Aspergillus tubingensis, de manière préférée entre toutes la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 ou un variant naturel de celle-ci tels que définis à la section "Souche dAspergillus tubingensis" ci-dessus.

De préférence, ladite au moins une activité protéase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 60 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 100 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 130 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat. De préférence, ladite au moins une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 60 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 110 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat. De préférence, ladite au moins une activité xylanase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 75 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 130 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 180 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat. De préférence, ladite au moins une activité β-glucosidase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 100 U β-Glu par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 200 U β-Glu par gramme de matière sèche initiale de substrat. De préférence, ladite au moins une activité pectinase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 2000 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 2900 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 3800 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 4500 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat.

De manière particulièrement préféré, le biocatalyseur selon l'invention comprend: (i) au moins une activité protéase à une dose d'au moins 60 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 100 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 130 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, (ii) au moins une activité cellulase à une dose d'au moins 60 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 110 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat, (iii) au moins une activité xylanase à une dose d'au moins 75 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 130 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 180 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, (iv) au moins une activité β-glucosidase à une dose d'au moins 100 U β-Glu / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 200 U β-Glu / g de matière sèche initiale de substrat; et (v) au moins une activité pectinase à une dose d'au moins 2000 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 2900 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 3800 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 4500 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, lesdites activités protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase étant produites simultanément par la même souche de champignon filamenteux, de préférence la même souche d'Aspergillus, en particulier la même souche d'Aspergillus section nigri, plus particulièrement la même souche d'Aspergillus tubingensis, plus particulièrement la même souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 ou un variant naturel de celle-ci tels que défini à la section "Souche d'Aspergillus tubingensis" ci-dessus.

Fabrication d'éthanol

La présente invention a également pour objet l'utilisation du biocatalyseur selon l'invention pour la fabrication, par fermentation de matière première amylacée, d'éthanol.

La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée comprenant une étape de fermentation de la matière première amylacée par une levure en présence du biocatalyseur selon l'invention. L'étape de fermentation du procédé de fabrication d'éthanol selon l'invention est de préférence une étape de saccharification-fermentation simultanée, en présence du biocatalyseur selon l'invention.

Par "matière première amylacée", on entend ici une céréale ou un tubercule, qui contient comme source de carbone majoritaire, de l’amidon. En particulier, par "matière première amylacée", on entend ici du maïs, blé, orge, sorgho, manioc, pomme de terre, seul ou en mélange. De préférence, la matière première amylacée est du maïs ou du blé. Dans un mode de réalisation particulier, la matière première amylacée est du maïs. Dans un autre mode de réalisation particulier, la matière première amylacée est du blé.

Le procédé de fabrication d'éthanol selon l'invention comprend de préférence les étapes suivantes: A) une étape de mélange d'une mouture de la matière première amylacée avec de l'eau, et optionnellement des vinasses clarifiées, B) optionnellement une étape de cuisson du mélange préparé à l'étape A), C) optionnellement une étape de pré-liquéfaction de l'amidon dudit mélange, D) une étape de liquéfaction de l'amidon, en présence d’enzymes de liquéfaction de l’amidon, permettant d'hydrolyser l'amidon en dextrines, E) optionnellement une étape de propagation de levures, et F) une étape de saccharification-fermentation simultanées des dextrines et/ou des sucres fermentescibles, en présence du biocatalyseur selon l'invention, d’enzymes de saccharification des dextrines et de levures, éventuellement propagées à l'étape E), de manière à produire de l'éthanol.

Etape A) de mélange

Le mélange contient typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche.

Etape B) de cuisson

Le mélange préparé à l'étape A), contenant typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche, est de préférence envoyé dans un jet-cooker typiquement entre 100 et 130°C, de préférence entre 105 et 120°C, de préférœice avec une injection de vapeur, de préférence pendant une durée de 5 à 20 min, de préférence pendant 15 min, de manière à gélatiniser et déstructurer l’amidon granulaire de la matière première en mélange.

Cette étape B) de cuisson est de préférence mise en œuvre lorsque la matière première amylacée est du maïs.

Etape C) de pré-liquéfaction

Le mélange, contenant typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche, est de préférence mis en présence d’un complexe enzymatique déviscosant.

Les enzymes de pré-liquéfaction utilisables pendant cette étape sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit typiquement d'enzymes de réduction de viscosité telles que des hémicellulases et/ou des bêta-glucanases.

Selon les enzymes utilisées, le pH peut être ajusté avec une solution d’acide ou de base, par exemple d’acide sulfurique ou d’hydroxyde d’ammonium. Le pH peut classiquement être ajusté entre 4,5 et 6,5, de préférence à 5,5.

La pré-liquéfaction est de préférence réalisée en appliquant une phase de montée en température de préférence de 15 min permettant d’atteindre une température typiquement de 55°C maintenue pendant 15 à 45 min,de préférence 30 min.

Les cuves dans lesquelles l'étape de pré-liquéfaction est réalisée peuvent en outre être agitées, de préférence en continu.

Cette étape C) de pré-liquéfaction est de préférence mise en œuvre lorsque la matière première amylacée est du blé.

Etape D) de liquéfaction

Le mélange préparé à l’étape A) et ayant optionnellement subi les étapes B) ou C), contenant typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche, est de préférence mis en présence d’enzymes de liquéfaction. Les enzymes de liquéfaction utilisables pendant cette étape sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit typiquement d'a-amylases, en particulier d'a-amylases bactériennes, de préférence des α-amylases bactériennes thermostables. D'autres enzymes peuvent en outre être utilisées au cours de cette étape.

Selon les enzymes utilisées, le pH peut être préalablement ajusté avec une solution d’acide ou de base, par exemple d’acide sulfurique ou d’hydroxyde d’ammonium. Le pH peut classiquement être ajusté entre 4,5 et 6,5, de préférence à 5,5. Selon l'enzyme utilisée, un sel de calcium peut également être ajouté pour améliorer la stabilité de l’enzyme.

La liquéfaction est de préférence réalisée à une température de 80 à 95°C, de préférence entre 85 et 90°C, pendant 60 à 150 min,de préférence 90 min.

Les cuves dans lesquelles l'étape de liquéfaction est réalisée peuvent en outre être agitées, de préférence en continu.

Etape E) de propagation de levures

Les levures utilisables pour la fabrication d'éthanol sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être en particulier des levures du genre Saccharomyces. De préférence, les levures utilisées pour la fabrication d'éthanol ne sont pas des organismes génétiquement modifiés.

De préférence, les levures sont introduites dans le milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées, à l'étape F) définie ci-dessous, après avoir subi une étape de propagation. Cette étape de propagation permet un développement des levures suffisant à l’inoculation du milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées à la dose mentionnée ci-dessus. L’étape de propagation est typiquement mise en oeuvre par la culture de levures sèches actives dans un moût liquéfié, contenant typiquement de 15 à 30% en masse de matière sèche, de préférence entre 20 et 25%, de préférence 20% en masse de matière sèche. Typiquement, l'étape de propagation selon l'invention présente les caractéristiques suivantes : • La température est comprise entre 30°C et 37°C, depréférence de 35°C. • Le pH peut être ajusté au début de l'étape de propagation avec un acide ou une base, par exemple de l'acide sulfurique ou de l’hydroxyde d’ammonium, de préférence entre 4,5 et 5,8, de préférence entre 5 et 5,5, de préférence à 5,3. De préférence, il n’y a pas d’ajustement du pH pendant la suite de l'étape de propagation. • L'ensemble est de préférence agité pendant toute la durée de l'étape de propagation, de manière à bien aérer le milieu. • Un ajout d’azote peut être réalisé, sous forme minérale ou organique, par exemple d’urée, de manière à apporter à la levure une source d’azote complémentaire. Par exemple un apport d’urée de 2 à 4 g/l de moût liquéfié peut être effectué, de préférence de 3 g/litre de moût liquéfié. • Le temps de propagation peut être compris entre 4 h et 24 h, de préférence entre 8h et 12h.

Le biocatalyseur selon l'invention peut être ajouté au cours de l'étape de propagation, au lieu de l'étape de saccharification-fermentation simultanées définie ci-dessous, de manière à garantir un apport, lors de l'étape de saccharification-fermentation simultanées, de l’ordre de 0,01 à 5 kg de matière sèche initiale de substrat de biocatalyseur par tonne de matière première amylacée, de préférence entre 0,4 et 1,2 kg de matière sèche initiale de substrat de biocatalyseur par tonne de matière première amylacée.

Etape F) de saccharification-fermentation simultanées

Lors de cette étape, le moût liquéfié selon l’étape D), contenant typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche, est de préférence mis en présence d’enzymes de saccharification. Les enzymes de saccharification utilisables pendant cette étape sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit typiquement de glucoamylase. D'autres enzymes peuvent en outre être utilisées au cours de cette étape.

Dans l'étape de saccharification-fermentation simultanées du procédé de fabrication d'éthanol selon l'invention, le moût de saccharification-fermentation est mis en présence de levures, éventuellement propagées par l'étape E) ci-dessus. Typiquement, l'étape de saccharification-fermentation simultanées selon l'invention présente les caractéristiques suivantes : • La température est comprise entre 30°C et 35°C, depréférence de 32°C. • Le pH peut être ajusté au début de l'étape de saccharification-fermentation simultanées avec un acide ou une base, par exemple de l'acide sulfurique ou de l’hydroxyde d’ammonium, de préférence entre 4,5 et 5,8, de préférence entre 5 et 5,5, de préférence à 5,3. De préférence il n’y a pas d’ajustement du pH pendant la suite de l'étape de saccharification-fermentation simultanées. • L'ensemble peut être agité pendant toute la durée de l'étape de saccharification-fermentation simultanées, de préférence en continu. • Un ajout d’azote peut être réalisé, sous forme minérale ou organique, par exemple d’urée, de manière à apporter à la levure une source d’azote complémentaire. Par exemple un apport d’urée de 1 g/l de moût liquéfié peut être effectué. • La durée de fermentation peut être comprise entre 20 h et 80 h, de préférence entre 40 h et 60 h. • De préférence, le biocatalyseur selon l'invention est présent au cours de l'étape de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées à une concentration de 0,01 à 5 kg de matière sèche initiale de substrat du biocatalyseur par tonne de matière première amylacée, de préférence entre 0,4 et 1,2 kg de matière sèche initiale de substrat du biocatalyseur par tonne de matière première amylacée.

Les levures utilisables pour la fabrication d'éthanol sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être en particulier des levures du genre Saccharomyces. De préférence, les levures utilisées pour la fabrication d'éthanol ne sont pas des organismes génétiquement modifiés.

Typiquement, le milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées est ensemencé avec environ 106 à environ 5.108 UFC (unités formant colonies) de levure par ml de milieu de saccharification-fermentation, de préférence environ 107 UFC de levure par ml de milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées.

De préférence, les levures sont introduites dans le milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées après avoir subi une étape de propagation E) telle que définie ci-dessus.

Le biocatalyseur selon l'invention peut être ajouté en partie au cours de l'étape de propagation E) définie ci-dessus et en partie au cours de l'étape de saccharification-fermentation simultanées F), de manière à garantir un apport total, lors de l'étape de saccharification-fermentation simultanées, de l’ordre de 0,01 à 5 kg de matière sèche initiale de substrat du biocatalyseur par tonne de matière première amylacée, de préférence entre 0,4 et 1,2 kg de matière sèche initiale de substrat du biocatalyseur par tonne de matière première amylacée.

La performance du procédé de fabrication d’éthanol est mesurée par la concentration d’éthanol dans le moût à la fin de l’étape de saccharification-fermentation simultanées, rapportée au taux de matière sèche de matière première amylacée.

Par "Gain Ethanol", on entend ici l'amélioration de la production d'éthanol, en particulier au terme d'une fermentation, de préférence d'une saccharification-fermentation simultanées, de préférence au terme de 51 h de fermentation, de préférence au terme de 51 h de saccharification-fermentation simultanées, conduite en présence d'un biocatalyseur obtenu avec la souche considérée, par rapport à la production d'éthanol dans les mêmes conditions en l'absence de biocatalyseur (témoin), typiquement déterminée par l'équation suivante :

Gain éthanol (%) = ([Ethanol] biocatalyseur - [Ethanol] ,érn0in) / [Ethanol] ,émoin

Les inventeurs ont montré que, de manière surprenante, l'utilisation du biocatalyseur selon l'invention permettait d'obtenir un rendement en éthanol plus élevé, une cinétique de production d'éthanol plus rapide, et une production de glycérol plus faible qu’en l’absence de biocatalyseur ou qu'en utilisant une composition enzymatique obtenue par fermentation en milieu solide avec une autre souche d'Aspergillus tubingensis présentant des activités enzymatiques différentes.

Mesure des activités enzymatiques

Activité xyianase

La mesure de l'activité xyianase peut typiquement être mise en œuvre sur xylane de bouleau lié à un chromophore, le Rémazol Brillant Blue R. L’hydrolyse de ce substrat par les activités xylanases libère en effet des oligomères liés au chromophore non précipitables après addition d’une solution d’éthanol dans le milieu réactionnel. La concentration en oligomères non précipitables est évaluée par une mesure de l’absorbance à 590 nm.

Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 130 pL d’une solution commerciale d’azo-xylane de Birchwood (MEGAZYME) à 10 g/L, 50 pL de solution enzymatique diluée dans du tampon acétate 0,4 M, pH 4,70. On effectue de préférence la réaction à 30°C pendant 23 minutes. La réaction est typiquement arrêtée par ajout de 500 pL d’éthanol à 96%. La densité optique du surnageant obtenu après centrifugation (10 minutes à 3000 tours/minute à 20°C) est lue à 590 nm.

Une unité d'activité xylanase (AXCn) peut alors être définie comme la quantité d'enzyme qui, diluée à raison de 1 unité/mL, à pH 4,70 et à 30°C, libère, à partir d’une solution de Rémazol Brillant Blue R xylane, des oligomères non précipitables dans l’éthanol tels que la densité optique du surnageant soit de 0,93 à 590 nm.

Activité protéase acide

La mesure de l'activité protéase acide peut typiquement être mise en oeuvre sur caséine. La caséine peut ainsi être hydrolysée en fragments peptidiques solubles dans l'acide trichloracétique (TCA).

Une unité PAC est typiquement définie comme étant la quantité d'enzyme qui libère à 40 °C et à pH 3,0 des peptides solubles en quantité telle que la densité optique à 275 nm de l'hydrolysat obtenu après précipitation au TCA est équivalente à celle d'une solution de tyrosine à 120 pg/mL.

Une technique de mesure appropriée de l'activité protéase acide est décrite ci-dessous.

Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 500 pL d’une solution de caséine limpide et filtrée à 12 g/L (tampon lactate 0,06 M, pH = 3), 100 pL de solution enzymatique diluée dans du tampon lactate à 0,05 M, pH = 3. On effectue de préférence la réaction à 40°C pendart 120 minutes. La réaction est typiquement arrêtée par ajout de 300 pL d’une solution d’acide trichloracétique à 10 %. La densité optique du surnageant obtenu après centrifugation, pendant 15 minutes à 3000 tours/minute à 20°C, est lue à 275 nm.

Activité polygalacturonase

La mesure de l'activité polygalacturonase peut typiquement être mise en oeuvre sur pectines. Les polygalacturonases hydrolysent en effet les chaînes de pectines de faible degré de méthylation et génèrent ainsi aux extrémités de la chaîne des groupements réducteurs sur les résidus d’acides galacturoniques constitutifs de la pectine. Ces groupements réducteurs peuvent être dosés avec le 2 cyano-acétamide. Le dosage est de préférence une cinétique en 40 minutes à 31 °C.

Une unité polygalacturonase (PG) est typiquement définie comme la quantité d'enzyme qui libère 1 pmole de groupements réducteurs en 1 min à 31 °C et à pH = 4,7, à partir de polygalacturonate de sodium.

Une technique de mesure appropriée de l'activité polygalacturonase est décrite ci-dessous.

Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 750 pL de tampon succinate à 0,1 M et pH = 4,7, 750 pL d’une solution aqueuse d’acide polygalacturonique d’orange commerciale (Sigma) à 6,5 g/L (ajustée à pH = 4,7 avec de la soude), 15 pL de solution enzymatique diluée dans du tampon succinate à pH = 4,7 supplémenté en sérum albumine bovine (0,1 g/L). On effectue de préférence une cinétique enzymatique à 31 °C en arrêtant la réaction à 10, 20, 30 et 40 minutes. Pour chaque temps, la réaction est typiquement arrêtée en ajoutant 70 pL du milieu réactionnel dans une solution d’arrêt composée de 140 pL de tampon borate (0,2 M, pH = 10) et de 70 pL d’une solution de 2 cyano-acétamide à 20 g/L. Une étape de révélation est réalisée par chauffage de l’échantillon pendant 12 minutes à 120 °C, puis en le refroidissant à -20 °C pendant 10 minutes. La densité optique du sumageant est lue à 280 nm contre de l’eau. Une gamme d’étalonnage construite avec une gamme de concentration en acide monogalacturonique permet de convertir les densités optiques obtenues en moles de groupements réducteurs équivalents.

Activité bêta-glucosidase

La mesure de l'activité β-Glucosidase (β-Glu) peut typiquement être mise en œuvre sur cellobiose. L’enzyme agit en effet sur ce composé en libérant du glucose.

Une unité β-Glu est définie comme étant la quantité d'enzymes qui catalyse la libération d'une micromole de glucose par minute dans les conditions de l'essai (50°C, pH = 4,8).

Une technique de mesure appropriée de l'activité β-Glucosidase est décrite ci-dessous.

Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 150 pL d’une solution de cellobiose à 5,13 g/L (tampon acétate à pH = 4,8), 150 pL de solution enzymatique diluée dans du tampon acétate 0,1 M à pH = 4,8. On effectue de préférence la réaction à 50°C pendant 30 minutes. La réaction est typiquement arrêtée en chauffant le milieu réactionnel à 100 °C pendant 10 minutes. Le milieu réactionnel est alors refroidi pendant 10 minutes dans l’eau froide. Après une centrifugation à 3000 rpm à 20 °C pendant 10 minutes, la concentration en glucose libérée dans le surnageant est alors dosée au moyen d’un kit enzymatique commercial de dosage du glucose.

Activité cellulase

La mesure de l'activité cellulase, en particulier endoglucanase, peut typiquement être mise en œuvre sur carboxyméthyl cellulose partiellement dépolymérisé et lié à un chromophore : le Rémazol Brilliant Blue R. L’hydrolyse du substrat libère en effet des oligomères de faible poids moléculaire liés au chromophore. Ceux-ci se retrouvent dans le surnageant après précipitation à l’éthanol et centrifugation. Une mesure de l’absorbance à 590 nm permet de déterminer l’activité cellulase.

Une unité cellulase sur carboxyméthyl cellulose (CMCell) peut être définie comme la quantité d’enzyme qui, diluée à raison de 1 U/ml et utilisée dans les conditions du dosage conduit à une libération d’oligomères non précipitables par la solution de précipitation, tels que la densité optique du surnageant soit de 1.

Une technique de mesure appropriée de l'activité cellulase est décrite ci-dessous. Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 100 pL de solution commerciale d’azo-CM-cellulose (MEGAZYME), 100 pL de solution enzymatique diluée dans du tampon acétate 0,1 M, pH 4,60. On effectue de préférence la réaction à 41 °C pendant 10 minutes. La réaction esttypiquement arrêtée par ajout de 500 pL de solution de précipitation (40 g d’acétate de sodium trihydraté et 4 g d’acétate de zinc dans 1 litre d’éthanol à 96%). La densité optique du surnageant obtenu après centrifugation (10 minutes à 3000 tours/minute à 20°C) est lue à 590 nm.

La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci-dessous.

Brève description des figures

Figure 1 : Abondance relative de 7 enzymes sélectionnées parmi l’ensemble des enzymes identifiées dans le biocatalyseur de l’exemple 1 par analyse de protéomique.

Figure 2: Suivi de la production de C02 en réacteurs au cours de la réaction de SSF d’un moût liquéfié de maïs industriel, en présence ou non du biocatalyseur selon l'invention, produit avec la souche SCC027 incorporé à 1,2 kg MSi/t de maïs, tel que décrit dans l'exemple 4.

Figure 3 : Effet des enzymes spécifiques du biocatalyseur selon l'invention, mises en oeuvre seules ou en mélange, par rapport à l’effet global du biocatalyseur selon l'invention, produit avec la souche SCC027, sur le gain Ethanol obtenu au terme de 51 h de SSF. La valeur 100% correspond à un gain Ethanol de 1,5% calculé entre la condition Témoin et la condition biocatalyseur.

Exemples

Exemple 1 : Production et caractérisation du biocatalyseur selon l'invention

Cet exemple décrit un procédé de production du biocatalyseur selon l'invention obtenu par fermentation en milieu solide avec la souche d’Aspergillus tubingensis SCC027. 10 kg de matière sèche initiale de substrat constitué d'un mélange de tourteau de colza et de son de blé, dans un ratio 70/30 sont utilisés.

Le substrat est prétraité par humidification à 60% de matière sèche puis prétraité en autoclave à 105°C pendant 35 min.

Le substrat est ensuite inoculé avec 1x107 spores viables d’Aspergillus tubingensis SCC027 / g de matière sèche initiale.

Le substrat présente une matière sèche initiale avant fermentation de 45%.

La fermentation en milieu solide est alors mise en oeuvre pendant 51 h dans les conditions suivantes :

- Température: 33°C± 0.5°C - Matière sèche: 45% ± 2%

Ventilation 35 HZ en continu - Agitation discontinue

Au terme de 51 h de fermentation, la culture est stoppée par ajout d’acide propionique, puis le milieu est séché à 45°C pendant 18 h, jusqüà obtenir une teneur en matière sèche < 10%.

Le biocatalyseur est broyé finement à l’aide d’un broyeur centrifuge Retsch ZM300, monté avec une grille de 0,85 mm (18000 rpm). Il est stocké à l’abri de la lumière et au froid (-20°C).

Pour son utilisation en saccharification-fermentation simultanées de matière première amylacée (voir exemples 2 à 6), le biocatalyseur peut être ajouté soit directement au moût sous forme de poudre, soit extrait dans l’eau (1/10 ou 1/20 p/v, agitation à température ambiante 10 à 15 min).

Pour les caractérisations enzymatiques, l’extrait aqueux du biocatalyseur est centrifugé (10 min, 3000 rpm, 20°C) afin de séparer les particules insolubles.

La détermination de la structure primaire des protéines, afin de les identifier, est réalisée par une analyse de protéomique selon la stratégie nommée «bottom-up» qui consiste à analyser les peptides constitutifs des protéines à identifier par spectrométrie de masse. Les protéines solubles ont subi, après une étape de réduction et d’alkylation, une digestion par la trypsine.

Les peptides ainsi obtenus, après purification sur microcolonne ZipTip C18, sont séparés par chromatographie liquide en phase inverse type nanoLC. Les séparations chromatographiques sont réalisées sur une colonne C18 75 pm de 50 cm avec une taille des particules de 5 pm (colonne Acclaim PepMap100 C18 de chez Thermoscientific). La nanoLC est une Ultimate 3000 Rapid Séparation LC Systems de chez Thermoscientific. Le gradient utilisé est un gradient binaire. La solution A est un mélange d’acétonitrile/acide formique 0,1 % (2/98, v/v). La solution B est un mélange d’acétonitrile/acide formique 0,1 % (90/10, v/v). Le débit est de 0,220 pL/min au niveau de la pompe nano et 15 pL/min au niveau de la pompe de chargement. La colonne est thermostatée à 35 °C.

Les peptides ainsi séparés sont séquencés par spectrométrie de masse haute résolution en tandem type LTQ-FT-ICR pour obtenir des informations précises sur la séquence en acides aminés. L’ionisation des peptides se fait par une source de type électrospray. Le voltage appliqué est de +1,70 kV. La méthode d’acquisition en spectrométrie de masse est une méthode dite data dépendant acquisition en top 7, avec exclusion dynamique, sauvegardé en mode LTQ centroid. La mesure des masses est réalisée avec une haute précision (de l’ordre du ppm) entre 470 et 2000 m/z.

Toutes les masses expérimentales sont comparées à des masses théoriques issues de banques de données protéiques où une digestion in silico a été réalisée. L’identification des protéines de l’échantillon se fait par comparaison des deux listes de masses. La quantification relative est réalisée en sommant l’intensité ou l’aire des 3 peptides majoritaires de la protéine identifiée. Le rapport de l’aire obtenue de chaque protéine sur la somme des aires de toutes les protéines identifiées permet d’estimer le niveau d’abondance de la protéine dans l’échantillon. Plus de 70 enzymes ont été identifiées par cette analyse.

Les différentes proportions de protéines identifiées par analyse de protéomique et sélectionnées pour l’invention sont représentées sur la Figure 1.

Cette figure montre que l'enzyme principale du biocatalyseur ainsi obtenu est une aspergillopepsine A (33,1%). Sont également présentes une endopolygalacturonase C (8,8%), une 1,4-p-D-glucane cellobiohydrolase (6,6%), une endo-1,4-p-xylanase A (3,6%), une endo-1,4-p-xylanase C (2,9%), une endoglucanase (2,5%) et une β-glucosidase (1,1%).

Les inventeurs ont également déterminé le niveau des différentes activités enzymatiques du biocatalyseur obtenu par ce protocole de production. Ils ont comparé ces différentes activités avec celles obtenues en utilisant d’autres souches d'Aspergillus tubingensis (A tubingensis A et B) et un variant naturel selon l'invention de la souche SCC027 dans un protocole de production similaire. Les activités enzymatiques ont été déterminées en mettant en œuvre les méthodes décrites ci-dessus.

Le tableau 1 récapitule les différentes activités enzymatiques mesurées.

Tableau 1 : Comparaison du profil enzymatique de biocatalyseurs obtenus avec la souche SCC027 et un variant naturel de SCC027 par rapport à d'autres souches d'A. tubingensis

TC: tourteau de colza SB: son de blé ND: non déterminé

Ces résultats montrent que le biocatalyseur obtenu grâce à la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 présente des activités enzymatiques différentes d'une composition obtenue avec d'autres souches d'Aspergillus tubingensis.

Exemple 2 : Utilisation du biocatalyseur selon l'invention dans la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en fiole

Cet exemple montre l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité d'éthanol produite.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d’éthanol

Le procédé de production d’éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici le maïs, est conditionnée, empâtée puis liquéfiée avant d’être soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. En parallèle, la levure est réhydratée avant d’être incorporée dans le moût pour l’étape de saccharification-fermentation simultanées.

Conditionnement de la matière première maïs

Le maïs entier a été conditionné de manière à obtenir une mouture, autrement dit une farine. Pour cela, le maïs a été broyé à l’aide d’un broyeur à marteau (Electra). La taille de la grille utilisée a été fixée à 0,8 mm. La mouture obtenue présente un taux d'humidité de 10% (+/- 2%). Sous forme de farine, la matière première est stockée à l’abri de la lumière dans un endroit sec à température ambiante.

Production du moût liquéfié de maïs L’étape de liquéfaction de la mouture de maïs permet d’hydrolyser l’amidon en dextrines. Le principe est de constituer un mélange de farine de maïs, d’eau et de vinasses claires de qualité industrielle et de le chauffer en présence d’enzymes de liquéfaction, de manière à obtenir un moût liquéfié. Ainsi, le moût se compose de 34% de farine de maïs, de 10% de vinasses claires et de 56% d’eau. Ce moût a été préparé en bioréacteur de 4L en verre à double enveloppe (Cloup), à température ambiante, sous agitation entre 250 et 350 rpm. Après homogénéisation le pH du moût a été ajusté à 5,5 (par ajout de H2S04) afin d’optimiser l’action des enzymes de liquéfaction. L’alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) a été ajoutée à 0,15 kg/t de maïs. Le moût a été porté à 90°C et liquéfié à cette même température pendant 2h dans le réacteur agité entre 200 et 300 rpm. Au terme de la liquéfaction, le moût a été refroidi à température ambiante et ajusté à pH 5,3 (par ajout de H2S04).

Production d'éthanol en fiole L’étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) a été faite en fioles bafflées. Il s’agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en caoutchouc hermétiques, présentant une sortie de C02 par aiguille de 1,2 mm de diamètre. La SSF a consisté à mettre en présence : • 140 g de moût liquéfié de maïs, à 30% de matière sèche, pH 5,3 ; • la levure sèche active Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32 °C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l’ordre de 1.107 UFC levures/ml de moût ; • de l’urée à 1 g/l de moût liquéfié de maïs ; • la glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 120 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n’a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 51 h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1, produit à partir de la souche SCC027 ou d’un de ses variants, a été ajouté en début de SSF à différentes concentrations. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n’a été effectué.

Chaque condition a été appliquée dans deux fioles distinctes (n=2). Résultats

En suivant l’évolution du poids de chacune des fioles, il est possible de déterminer la quantité de C02 produite au cours de la fermentation. Considérée dans l’équation stoechiométrique de la production d’éthanol à partir de glucose, la quantité de C02 produite permet d’estimer la production d’éthanol pour chacune des fermentations conduites en fiole. 1 mole glucose 2 moles de C02+ 2 moles d’éthanol Ainsi, en comparant la production d’éthanol au terme de 51 h de la fermentation dite « témoin » par rapport à celle de fermentations conduites en présence de biocatalyseurs (« condition »), il est possible de calculer le gain éthanol:

Gain éthanol (%) = ([Ethanol] condition - [Ethanol] témoin) / [Ethanol] témoin

Tableau 2 : Gains éthanol obtenus en fioles au terme de 51 h de SSF d’un moût liquéfié de maïs, en présence de biocatalyseur SCC027 ou d’un biocatalyseur obtenu avec l’un de ses variants naturels (variant SCC027-2), à différentes doses d’incorporation.

Comme le montre le tableau 2, la production d’éthanol au terme de 51 h de fermentation conduite en fiole est améliorée avec la mise en œuvre de biocatalyseurs obtenus avec la souche SCC027 ou ses variants. Le gain est variable selon la souche et selon la dose d’incorporation. Un gain en éthanol de 1,5% est obtenu avec la souche SCC027 à la dose d’incorporation de 1,2 kg MSi/t de maïs. Un variant de la souche SCC027 donne lieu à un gain éthanol similaire (1,4%) à la dose de 0,6 kg MSi/t de maïs, soit une dose deux fois moindre qu’avec la souche SCC027.

Exemple 3 : Avantage du biocatalyseur selon l'invention dans la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en fiole, par rapport à l’utilisation d’une protéase commerciale

Cet exemple montre l'effet bénéfique et avantageux du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité d'éthanol produite, comparativement à la mise en œuvre d’une protéase.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d’éthanol

Le procédé de production d’éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici du moût de maïs industriel, déjà liquéfié, est directement soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. La levure est réhydratée avant d’être incorporée au moût pour l’étape de saccharification-fermentation simultanées.

Production d'éthanol en fiole L’étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) est faite en fioles bafflées. Il s’agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en caoutchouc hermétiques, présentant une sortie de C02 par aiguille de 1,2 mm de diamètre. La SSF a consisté à mettre en présence : • 140 g de moût de maïs liquéfié industriellement, à 32% de matière sèche, pH 5,2; • la levure sèche active Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32 °C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l’ordre de 1.107 UFC levures/ml de moût ; • de l’urée à 1 g/l de moût liquéfié de maïs ; • la glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 120 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n’a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 52h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1, produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de fermentation à différentes concentrations. En comparaison, la protéase commerciale Lyvanol Acid® (Lyven -Soufflet Biotechnologies) a été ajoutée en début de fermentation, à différentes concentrations, de manière à garantir les mêmes apports en activité protéase (PAC) qu’avec le biocatalyseur produit avec la souche SCC027. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n’a été effectué. Chaque condition a été appliquée dans deux fioles distinctes (n=2). Résultats

En suivant l’évolution du poids de chacune des fioles, il est possible de déterminer la quantité de C02 produite au cours de la fermentation. Considérée dans l’équation stoechiométrique de la production d’éthanol à partir de glucose, la quantité de C02 produite permet d’estimer la production d’éthanol pour chacune des fermentations conduites en fiole. 1 mole glucose 2 moles de C02+ 2 moles d’éthanol Ainsi, en comparant la production d’éthanol au terme de 52 h de la fermentation dite « témoin » par rapport à celle de fermentations conduites en présence de biocatalyseurs (« condition »), il est possible de calculer le gain éthanol:

Gain éthanol (%) = ([Ethanol] condiiion - [Ethanol] ,émoin) / [Ethanol] lémoin

Tableau 3 : Gains éthanol obtenus en fiole au terme de 52h de SSF d’un moût liquéfié de maïs industriel en présence du biocatalyseur selon l’invention produit avec la souche SCC027 ou de la protéase commerciale Lyvanol Acid® (Lyven - Soufflet Biotechnologies) à différentes doses d’incorporation.

Cet exemple démontre l’avantage de la mise en œuvre du biocatalyseur comparativement à celle d’une protéase seule. Comme le montre le tableau 3, le potentiel de gain éthanol suit une courbe en cloche dans les deux cas. Il dépasse 1,5% avec l’utilisation du biocatalyseur selon l'invention tandis qu’il est maintenu sous le seuil de 1% avec l’utilisation de la protéase, même à des doses élevées. Un gain éthanol de 0,7% est atteint avec le biocatalyseur selon l'invention pour un apport d’activité protéase de trois à cinq fois inférieur à l’apport nécessaire de protéase commerciale pour le même gain éthanol.

Exemple 4 : Utilisation du biocatalyseur selon l'invention dans la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en fermenteur de laboratoire

Cet exemple montre l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité finale d'éthanol produit et sur la vitesse de production d’éthanol.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d’éthanol

Le procédé de production d’éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici du moût de maïs industriel, déjà liquéfié, est directement soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. La levure est réhydratée avant d’être incorporée au moût pour l’étape de saccharification-fermentation simultanées.

Production d'éthanol en fiole L’étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) a été réalisée en fermenteurs, modèle Biostat A+ (Sartorius). Il s’agit de réacteurs d’une capacité de 2,5 I, équipés en sortie d’un condenseur et d’un compteur gaz, modèle Milli GasCounter MGC-10 (Ritter), pour le suivi en ligne de la production de C02. La SSF a consisté à mettre en présence : • 2220 g de moût de maïs liquéfié industriellement, à 32% de matière sèche, pH 5,3; • la levure sèche active Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 g/l de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32°C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l’ordre de 1.107 UFC levures/ml de moût ; • de l’urée à1 g/l de moût liquéfié de maïs ; • la glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 350 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n’a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 51 h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1, produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de SSF à 1,2 kg MSi/t de maïs. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n’a été effectué.

Chaque condition a été appliquée dans deux bioréacteurs distincts (n=2). A la fin de la réaction de SSF des prélèvements sont réalisés en double et analysés par HPLC-RI (HPLC modulaire Waters Isocratic e1515, colonne Ion Exclusion Wat010295) pour mesurer les concentrations d’éthanol, de glycérol et de sucres résiduels présents dans le milieu. Résultats

La Figure 2 illustre l’effet significatif de la mise en oeuvre du biocatalyseur selon l’invention sur la vitesse de production de l’éthanol. En effet, pour les deux fermenteurs dans lesquels le biocatalyseur selon l’invention a été ajouté en début de fermentation, la vitesse de production de C02 est augmentée de manière significative par rapport aux fermenteurs témoin. La vitesse maximale de production de C02 en présence du biocatalyseur selon l’invention est 7,7 l/h alors qu’elle est de 6 l/h dans la condition témoin. La vitesse maximale est mesurée après 12 h de SSF en condition d’ajout de biocatalyseur, et après 13 h en condition témoin.

Le plateau de la production de C02 est atteint après 45 h de SSF en condition d’ajout de biocatalyseur, tandis qu’il n’a toujours pas été atteint après 51 h de SSF en condition témoin.

Tableau 4 : Concentrations en éthanol et glycérol après 51 h de SSF d’un moût liquéfié de maïs, en présence ou en l’absence du biocatalyseur SCC027 selon l’invention incorporé à 1,2 kg MSi/t de maïs.

Le tableau 4 ci-dessus confirme l’effet significatif de la mise en œuvre du biocatalyseur selon l’invention sur la production d’éthanol après 51 h de SSF. En effet, l’éthanol dosé dans les fermenteurs ayant contenu le biocatalyseur est plus élevé de 6 à 8% par rapport à l’éthanol dosé dans les fermenteurs témoin après 51 h de SSF, en précisant qu’à ce stade la réaction de SSF du témoin n’est pas terminée et n’a pas atteint son asymptote.

De plus, la production de glycérol est significativement diminuée en présence de biocatalyseur par rapport au témoin. En effet, au terme de 51 h de fermentation, le glycérol dosé est plus faible de 16%. Le glycérol est un co-produit de l’éthanol. Une moindre production de glycérol indique une modification de l’utilisation du glucose par la levure et confirme l’augmentation du rendement de conversion du glucose en éthanol par la levure.

Exemple 5 : Utilisation du biocatalyseur selon l'invention dans la production d'éthanol à partir de farine de blé, en fiole

Cet exemple montre l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de matières premières amylacées autres que le maïs, en particulier de farine de blé, en particulier sur la quantité d'éthanol produite et sur la vitesse de production d’éthanol.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d’éthanol

Le procédé de production d’éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici une mouture de blé industrielle, est liquéfiée avant d’être soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. En parallèle, la levure est réhydratée avant d’être incorporée au moût liquéfié pour l’étape de saccharification-fermentation simultanées.

Production du moût liquéfié de blé L’étape de liquéfaction de la mouture de blé permet d’hydrolyser l’amidon en dextrines. Le principe est de mélanger la farine de blé avec de l’eau et des vinasses claires, et chauffer le mélange en présence d’enzymes de liquéfaction, de manière à obtenir un moût liquéfié. Ainsi, le moût se compose de 28% de farine de blé, de 6% de vinasses claires et de 66% d’eau. Ce moût a été préparé en bioréacteur de 4 I en verre à double enveloppe (Cloup), à température ambiante, sous agitation à 250 rpm. Le pH du moût a été ajusté à 5,5 (par ajout de NaOH) afin d’optimiser l’action des enzymes de liquéfaction. Deux enzymes de liquéfaction ont été utilisées, à savoir l’alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) ajoutée à 0,15 kg/t de blé et le complexe hémicellulolytique déviscosant (Lyvanol Devisco Plus, Lyven-Soufflet Biotechnologies) ajouté à 0,15 kg/t de blé. Le moût a d’abord été préliquéfié à 55°C pendant 30 min en présence des enzynes puis liquéfié à 85°C pendant 1,5 h dans le réacteur maintenu sous agitation à 250 rpm. Au terme de la liquéfaction, le moût a été refroidi à température ambiante et ajusté à pH 4,5 (par ajout de H2S04).

Production d'éthanol en fiole L’étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) a été faite en fioles bafflées. Il s’agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en coton cardé. La SSF a consisté à mettre en présence : • 140 g de moût liquéfié de blé, à 27,5% de matière sèche, pH 4,5 ; • la levure sèche active Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de blé, après avoir été réhydratée 30 min à 32 °C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l’ordre de 1.107 UFC levures/ml de moût ; • de l’urée à 1 g/l de moût liquéfié de blé ; • la glucoamylase (Distillase CS, Genencor) à 0,29 kg/t de blé, de manière à saccharifier le moût liquéfié de blé.

Le moût ainsi constitué a été mis sous agitation à 105 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n’a été effectué. La SSF a été conduite pendant une durée de 48h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1, produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de fermentation à 3 kg MSi/t de blé. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n’a été effectué.

Chaque condition a été appliquée dans deux fioles distinctes (n=2). Résultats

Au cours de la réaction de SSF des prélèvements ont été réalisés et analysés par HPLC-Rl (HPLC modulaire Waters Isocratic E1515, colonne Ion Exclusion Wat010295) pour mesurer les concentrations d’éthanol, de glycérol et de sucres présents dans le milieu.

Tableau 5 : Concentrations en éthanol et glucose après 24 h, 40 h et 48 h de SSF d’un moût liquéfié de blé, en présence ou en l’absence du biocatalyseur SCC027 incorporé à 3 kg MSi/t de blé.

Le tableau 5 démontre l’effet bénéfique de la mise en œuvre du biocatalyseur sur la production d’éthanol à partir de blé. En effet, la production d’éthanol au terme de 48h de fermentation est augmentée significativement de 3,8%. La vitesse de production d’éthanol est également augmentée avec des différences de concentration d’éthanol significatives à 24 et 40 h de SSF, respectivement de 31% et 9%. L’effet cinétique de la mise en œuvre du biocatalyseur en fermentation est également visible sur la vitesse de consommation du glucose par la levure. Après 40 h de SSF la concentration de glucose dans le milieu contenant le biocatalyseur est similaire à la concentration mesurée dans le milieu témoin après 48 h de SSF, indiquant une accélération de la fin de la réaction d’environ 8 h.

Exemple 6 : Comparaison de l'effet du biocatalyseur selon l'invention par rapport à des compositions enzymatiques obtenues avec d'autres souches d'Aspergillus

Cet exemple montre que l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité d'éthanol produite, n’est pas observé avec d’autres compositions enzymatiques obtenues avec d’autres souches d’Aspergillus tubingensis que la souche SCC027 et ses variants.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d’éthanol

Le procédé de production d’éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici le maïs, est conditionnée, empâtée puis liquéfiée avant d’être soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. En parallèle, la levure est réhydratée avant d’être incorporée dans le moût pour l’étape de saccharification-fermentation simultanées.

Conditionnement de la matière première maïs

Le maïs entier a été conditionné de manière à obtenir une mouture, autrement dit une farine. Pour cela, le maïs a été broyé à l’aide d’un broyeur à marteau (Electra). La taille de la grille utilisée a été fixée à 0,8 mm. La mouture obtenue présente un taux d'humidité de 10% (+/- 2%). Sous forme de farine, la matière première est stockée à l’abri de la lumière dans un endroit sec à température ambiante.

Production du moût liquéfié de maïs L’étape de liquéfaction de la mouture de maïs permet d’hydrolyser l’amidon en dextrines. Le principe est de constituer un mélange de farine de maïs, d’eau et de vinasses claires et de le chauffer en présence d’enzymes de liquéfaction, de manière à obtenir un moût liquéfié. Ainsi, le moût se compose de 34% de farine de maïs, de 10% de vinasses claires et de 56% d’eau. Ce moût a été préparé en bioréacteur de 4L en verre à double enveloppe (Cloup), à température ambiante, sous agitation entre 250 et 350 rpm. Après homogénéisation le pH du moût a été ajusté à 5,5 (par ajout de H2S04) afin d’optimiser l’action des enzymes de liquéfaction. L’alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) a été ajoutée à 0,15 kg/t de maïs. Le moût a été porté à 90°C et liquéfié à cette même température pendant 2h dans le réacteur agité entre 200 et 300 rpm. Au terme de la liquéfaction, le moût a été refroidi à température ambiante et ajusté à pH 5,3 (par ajout de H2S04).

Production d'éthanol en fiole L’étape de saccharification-fermentation simultanée (SSF) a été faite en fioles bafflées. Il s’agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en caoutchouc hermétiques, présentant une sortie de C02 par aiguille de 1,2 mm de diamètre. La SSF a consisté à mettre en présence : • 140 g de moût liquéfié de maïs, à 30% de matière sèche, pH ajusté à 5,3 ; • la levure sèche Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32°C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l’ordre de 1.107 UFC levures/ml de moût ; • de l’urée à 1 g/l de moût liquéfié de maïs ; • la glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 120 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n’a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 51 h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1, produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de SSF à différentes concentrations. En comparaison, d’autres biocatalyseurs produits à partir des souches Aspergillus tubingensis B ou Aspergillus tubingensis A ont été ajoutés en début de SSF, à différentes concentrations. Dans la condition dite « témoin >>, aucun ajout de biocatalyseur n’a été effectué.

Chaque condition a été appliquée dans deux fioles distinctes (n=2). Résultats

En suivant l’évolution du poids de chacune des fioles, il est possible de déterminer la quantité de C02 produite au cours de la fermentation. Considérée dans l’équation stoechiométrique de la production d’éthanol à partir de glucose, la quantité de C02 produite permet d’estimer la production d’éthanol pour chacune des fermentations conduites en fiole. 1 mole glucose 2 moles de C02+ 2 moles d’éthanol Ainsi, en comparant la production d’éthanol au terme de 51 h de la fermentation dite « témoin >> par rapport à celle conduite en présence de biocatalyseur, il est possible de déterminer le gain éthanol.

Gain éthanol (%) = ([Ethanol]condition - [Ethanol]témoin) / [Ethanol]témoin

Tableau 6 : Gains éthanol obtenus en fiole au terme de 51 h de SSF d’un moût liquéfié de maïs, en présence du biocatalyseur selon l’invention obtenu avec la souche SCC027 ou d’autres biocatalyseurs obtenus avec des souches d’Aspergillus tubingensis A ou B (celles analysées dans l’exemple 1), à différentes doses d’incorporation.

L’effet bénéfique de la mise en œuvre du biocatalyseur SCC027 sur la production d’éthanol n’est pas retrouvé avec la mise en œuvre de biocatalyseurs obtenus par fermentations d’autres souches d’Aspergillus tubingensis, comme le montre le tableau 6. Aux mêmes doses d’incorporation et à doses plus élevées que SCC027, aucun biocatalyseur produit avec les autres souches testées n’a permis d’obtenir des gains éthanol significatifs après 51 h de SSF.

Exemple 7 : Comparaison de l’effet du biocatalyseur selon l'invention par rapport à des enzymes purifiées à partir de la souche SCC027

Cet exemple montre que l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité totale d'éthanol produite, résulte de la combinaison de nombreuses enzymes produites lors du procédé de fermentation en milieu solide de la souche.

Matériel et méthodes

Procédé de purification des enzymes du biocatalyseur SCC027 7 enzymes ont été purifiées à partir du biocatalyseur obtenu dans l’exemple 1 : l'aspergillopepsine A, la polygalacturonase C, l'endoxylanase A, l'endoglucanase, la β-glucosidase, l'endoxylanase C et la cellobiohydrolase (ces deux dernières ont été obtenues en mélange).

La purification de ces enzymes a été réalisée après extraction du biocatalyseur dans un tampon Histidine 0,02 M pH 6,0 (1:10), centrifugation et filtration. Plusieurs techniques de séparation ont été combinées : la chromatographie d’échange d’anions, la chromatographie d’interactions hydrophobes, la chromatographie d’exclusion stérique et la précipitation au sulfate d’ammonium ont été utilisées au cours du procédé de purification.

La chromatographie d’échange d’anions est effectuée sur une colonne montée manuellement de 50 ml de gel Sephadex Q FF (GE Healthcare).

La chromatographie se fait sur un ÀKTA prime plus à 4°C. Le débit est de 10 ml/min. Le gradient utilisé est un gradient binaire. Le tampon A est une solution d’Histidine 0,02 M pH 6,0. Le tampon B est une solution d’Histidine 0,02 M pH 6,0 et de chlorure de sodium 1,0 M. Les fractions collectées sont de 6 ml.

La chromatographie d’interactions hydrophobes est réalisée sur une colonne Hiprep phényl HP 16/10 20 mL (GE Healthcare). La chromatographie se fait sur un ÀKTA prime plus à 20°C. Le débit est de 3 ml/min. Le gradient utilisé est un gradient binaire. Le tampon A est une solution d’Histidine 0,02 M pH 6,0 et de sulfate d’ammonium 1,0 M. Le tampon B est une solution d’Histidine 0,02 M pH 6,0. Les fractions collectées sont de 6 mL.

La chromatographie d’exclusion stérique est réalisée sur une colonne Hiload Superdex 75 pg de 16 mm de diamètre et de 600 mm de longueur de chez GE Healthcare (120 ml de gel). La chromatographie se fait sur un ÀKTA purifier à 20°C. La phase mobile est une solution d’acétate d’ammonium 0,1 M pH 5,0. Le débit est de 1 ml/min. Le volume d’échantillon injecté est de 2 ml. Les fractions collectées sont de 2 ml.

Le mélange protéique est fractionné par précipitation au sulfate d’ammonium en cascade à 40 %, 55 %, 65 % et 100 % de saturation en sel. L’ajout de sulfate d’ammonium se fait progressivement, sous forme de pluie. La précipitation est effectuée 30 min sous agitation dans la glace. Le mélange précipité est centrifugé à 5000 g pendant 15 min à 4°C. Le volume de surnageant est mesuré et un nouvel ajout de sulfate d’ammonium est effectué pour atteindre le deuxième palier de saturation en sel. Ce mélange est à nouveau précipité 30 min dans la glace sous agitation. Ces étapes sont répétées pour les différents paliers.

Description générale du procédé de production d’éthanol

Le procédé de production d’éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici le maïs, est conditionnée, empâtée puis liquéfiée avant d’être soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. En parallèle, la levure est réhydratée avant d’être incorporée dans le moût de saccharification-fermentation simultanées.

Conditionnement de la matière première maïs

Le maïs entier a été conditionné de manière à obtenir une mouture, autrement dit une farine. Pour cela, le maïs a été broyé à l’aide d’un broyeur à marteau (Electra). La taille de la grille utilisée a été fixée à 0,8 mm. La mouture obtenue présente un taux d’humidité de 10% (+/- 2%). Sous forme de farine, la matière première est stockée à l’abri de la lumière dans un endroit sec à température ambiante.

Production du moût liquéfié de maïs L’étape de liquéfaction de la mouture de maïs permet d’hydrolyser l’amidon en dextrines. Le principe est de constituer un mélange de farine de maïs, d’eau et de vinasses claires et de le chauffer en présence d’enzymes de liquéfaction, de manière à obtenir un moût liquéfié. Ainsi, le moût se compose de 34% de farine de maïs, de 10% de vinasses claires et de 56% d’eau. Ce moût a été préparé en bioréacteur de 4L en verre à double enveloppe (Cloup), à température ambiante, sous agitation entre 250 et 350 rpm. Après homogénéisation le pH du moût a été ajusté à 5,5 (par ajout de H2S04) afin d’optimiser l’action des enzymes de liquéfaction. L’alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) a été ajoutée à 0,15 kg/t de maïs. Le moût a été porté à 90°C et liquéfié à cette même température pendant 2h dans le réacteur agité entre 200 et 300 rpm. Au terme de la liquéfaction, le moût a été refroidi à température ambiante et ajusté à pH 5,3 (par ajout de H2S04).

Production d'éthanol en fiole L’étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) a été faite en fioles bafflées. Il s’agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en caoutchouc hermétiques, présentant une sortie de C02 par aiguille de 1,2 mm de diamètre. La SSF a consisté à mettre en présence : • 140 g de moût liquéfié de maïs, à 30% de matière sèche, pH 5,3 ; • la levure sèche Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32°C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l’ordre de 1.107 UFC levures/ml de moût ; • de l’urée à 1 g/l de moût liquéfié de maïs ; • la glucoamylase (Spirizyme Excel XFIS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 120 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n’a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 51 h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1, produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de SSF à 1,2 kg MSi/t de maïs. En comparaison, une ou des fractions d’enzymes purifiées de la souche SCC027 a ou ont été ajoutée(s) en début de SSF, de manière à garantir les mêmes niveaux d’apports en activité(s) enzymatique(s) qu’avec le biocatalyseur obtenu avec la souche SCC027. Dans la condition dite « témoin >>, aucun ajout de biocatalyseur n’a été effectué. Résultats

En suivant l’évolution du poids de chacune des fioles, il est possible de déterminer la quantité de C02 produite au cours de la fermentation. Considérée dans l’équation stoechiométrique de la production d’éthanol à partir de glucose, la quantité de C02 produite permet d’estimer la production d’éthanol pour chacune des fermentations conduites en fiole. 1 mole glucose 2 moles de C02+ 2 moles d’éthanol Ainsi, en comparant la production d’éthanol au terme des 51 h de la fermentation dite « témoin » par rapport à celle conduite en présence de biocatalyseur, il est possible de déterminer le gain éthanol.

Gain éthanol (%) = ([Ethanol]condition - [Ethanol]lémoin) / [Ethanol]lémoin

Comme le montre la Figure 3, les inventeurs ont ainsi déterminé qu'avec un mélange d'aspergillopepsine A, d’endoglucanase et de β-glucosidase A, il était possible d’augmenter la production d’éthanol de 1,2% soit 80% du gain éthanol obtenu avec le biocatalyseur brut. Il est à noter qu'un mélange d'aspergillopepsine A et de β-glucosidase A permet d'atteindre 70% du gain éthanol obtenu avec le biocatalyseur, ce qui représente la meilleure combinaison de 2 enzymes parmi les enzymes testées produites par la souche SCC027, alors que cette combinaison ne correspond pas à la combinaison des deux enzymes majoritairement produites par cette souche.

Le mélange de 7 enzymes parmi les 70 enzymes identifiées du biocatalyseur (aspergillopepsine A, polygalacturonase C, endoxylanase A, endoglucanase, β-glucosidase A, endoxylanase C et cellobiohydrolase), permet d’augmenter la production d’éthanol à 51 h SSF de manière à atteindre près de 90% du gain en éthanol obtenu avec le biocatalyseur brut. L'effet optimal mesuré avec le biocatalyseur obtenu selon le procédé de l'invention avec la souche SCC027 est dû à la combinaison des multiples enzymes produites, dont les 7 enzymes purifiées à partir du biocatalyseur selon l’invention.

Biocatalyst for the production of ethanol from maize

The present invention relates to biocatalysts for accelerating and improving the production of ethanol by fermentation of starchy raw materials.

The rapid and rapid reduction of fossil energy resources and the pollution problems associated with their use are at the origin of the need to find alternative sources of energy for these fuels.

Biomass from agricultural products and / or co-products is now a significant source of carbon and interest in replacing fossil fuels. Ethanol produced from the fermentable sugars contained in the plants can thus be used in vehicles equipped with combustion engines. The increase in this use has resulted in a rapid increase in bioethanol production in recent years in both North America and Europe, particularly from wheat and / or maize crops or their agricultural byproducts.

The generalization of the use of bioethanol as fuel remains, however, still sought to fight for example against global warming.

Such generalization will, however, imply a need to increase wheat and / or maize crops for bioethanol production. However, the world's cultivable areas remain limited, generating tensions between the areas of cultures dedicated to the production of ethanol and those dedicated to food and feed.

Therefore, although processes for making ethanol from starchy feedstock, particularly from wheat or corn flour, are now commonly used by those skilled in the art, there is still a great need for increase in production yields of these processes. Moreover, given the quantities targeted, even a 1% increase in ethanol production yield from starchy raw material is a particularly beneficial increase for both producers and farmers.

The present inventors have surprisingly identified a strain of Aspergillus tubingensis for producing, by fermentation in a solid medium, a biocatalyst whose enzymatic composition makes it possible, when it is added during the fermentation stage, and or yeast propagation, a process for the manufacture of ethanol from starchy material and in particular maize, to significantly accelerate the production of ethanol, to increase the final ethanol concentration of at least 1% and reduce the production of glycerol, a co-product of ethanol.

This strain, called strain SCC027, was deposited on February 1st, 2016 with Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, the Netherlands) under the number CBS 136961.

By performing a proteomic study of the biocatalyst obtained using this strain, the inventors have shown that it has an original enzymatic composition, including activities mainly proteases, cellulases and hemicellulases.

They also demonstrated that nearly 90% of the effect observed with this biocatalyst on ethanol production was due to a combination of 5 families of enzymatic activities: the protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase and pectinase activities, and more particularly to a combination of 7 specific fungal enzymes: aspergillopepsin A, endoglucanase, endoxylanase A, endoxylanase C, β-glucosidase A, cellobiohydrolase and polygalacturonase C.

Moreover, all these enzymatic activities are produced simultaneously by the strain of Aspergillus tubingensis SCC027 by fermentation. The production process of this biocatalyst is therefore practical to implement, since it does not require different fermentation conditions depending on the enzymatic activities produced.

The inventors have furthermore shown that the production of glycerol, a co-product of the ethanol production process, was significantly reduced in the presence of this biocatalyst. However, the level of glycerol production is an indicator of the performance of ethanol production by yeast. The reduction of glycerol can also have beneficial effects on the downstream ethanol production process under industrial conditions, in particular on the evaporation of vinasses.

The present invention therefore relates to a strain of Aspergillus tubingensis SCC027 deposited on February 1, 2016 with the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, the Netherlands) under the number CBS 136961.

The subject of the present invention is also a natural variant of the strain of Aspergillus tubingensis SCC027 deposited on February 1, 2016 with the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands) under the number CBS 136961, allowing producing, by solid-state fermentation on a substrate comprising a mixture of wheat bran and rapeseed meal, a biocatalyst which, when added to the simultaneous saccharification-fermentation medium of an ethanol manufacturing process to from corn flour, provides Ethanol Gain at least equal to that obtained under the same conditions with a biocatalyst produced by solid-state fermentation of the strain of Aspergillus tubingensis SCC027 on a substrate comprising a mixture of wheat bran and rapeseed meal.

The present invention also relates to a process for manufacturing a biocatalyst for producing ethanol from starchy raw material, comprising the following steps: a) providing a substrate, b) seeding the substrate provided in step a) with the strain of Aspergillus tubingensis SCC027 according to the invention or a natural variant thereof according to the invention, and c) fermentation by fermentation in a solid medium said substrate with the strain under appropriate conditions to allow simultaneous production by the strain of protease activity, cellulase activity which is not β-glucosidase activity, and β-glucosidase activity.

Another subject of the present invention relates to a biocatalyst for producing ethanol from starchy feedstock, having at least one protease activity, a cellulase activity which is not a β-glucosidase activity, and a β-glucosidase activity, obtainable by the biocatalyst manufacturing process according to the invention.

The present invention also relates to a biocatalyst for making ethanol from starchy raw material, said biocatalyst comprising: (i) at least one protease activity, (ii) at least one cellulase activity that is not a β-glucosidase activity (iii) at least one xylanase activity, (iv) at least one β-glucosidase activity, and (v) at least one pectinase activity, said protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase and pectinase activities being produced simultaneously by the same strain of filamentous fungus.

The present invention also relates to the use of a biocatalyst according to the invention, for the manufacture, by fermentation of starchy feedstock, of ethanol.

It also relates to a process for producing ethanol from starchy raw material comprising a step of fermenting the starchy raw material with a yeast in the presence of the biocatalyst according to the invention.

Detailed description of the invention Definitions

The nomenclature used for the classification of enzymes is the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB).

By "protease" is meant here an enzyme of class EC 3.4, which cleaves the peptide bonds.

Preferably, the fungal protease is an endopeptidase. Particularly preferably, the fungal protease is one or a mixture of Aspergillus protease (s), in particular one or a mixture of protease (s) of Aspergillus genus nigri, more particularly one or a mixture of protease (s). Aspergillus tubingensis, more particularly aspergillopepsin. Most preferably, the fungal protease is Aspergillopepsin A.

By "aspergillopepsin A" is meant here an enzyme of the class EC 3.4.23.18, which is an aspartate endopeptidase, which cleaves the internal peptide bonds of proteins in acidic conditions and with a broad specificity. This enzyme typically has at least 60.4% sequence identity with Paspergillopepsin A-like aspartic endopeptidase of sequence SEQ ID NO: 1, whose accession number Gl of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) is 145249508, from sequencing of the genome of DSM Aspergillus niger strain CBS 513.88.

By "cellulase" is meant here an enzyme which cleaves the β-D-1,4 glycoside linkages of cellulose, lichenine and cereal β-glucans.

Preferably, the cellulase is one or a mixture of cellulase (s) of Aspergillus, in particular of Aspergillus genus nigri, more particularly Aspergillus niger. Preferably, the cellulase is an endoglucanase, a cellobiohydrolase or a mixture thereof.

By "endoglucanase" is meant here an enzyme of the GH6 glycoside hydrolase family, class EC 3.2.1.4 cleaving the internal p-1,4-glycosidic bonds of cellulose chains. Preferably, this enzyme has at least 43.6% sequence identity with Pendoglucanase of sequence SEQ ID NO: 2, whose accession number Gl of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) is 350633077, resulting from sequencing. of the genome of the Aspergillus niger strain ATCC 1015.

By "cellobiohydrolase" is meant here an enzyme of the GH7 glycoside hydrolase family, class EC 3.2.1.91 which releases cellobiose molecules non-reducing ends of cellulose chains. This enzyme typically has at least 25.6% sequence identity with the "Probable 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase A" of sequence SEQ ID NO: 3, including the accession number Gl of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) is 294956478, resulting from genome sequencing of the Aspergillus niger strain CBS 513.88 from DSM.

By "xylanase" is meant here an enzyme of class EC 3.2.1.8 of the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Biology

Molecular (IUBMB) which degrades xylose polymers linked by β-1-4 bonds, thus degrading hemicellulose in particular.

Preferably, the xylanase is one or a mixture of Aspergillus xylanase (s), in particular Aspergillus genus nigri, more particularly Aspergilus tubingensis. Preferably, the xylanase is an endoxylanase of class EC 3.2.1.8. Particularly preferably, the xylanase is an endoxylanase A, an endoxylanase C or a mixture thereof.

By "endoxylanase A" is meant here an enzyme of the family of glycoside hydrolases GH11, class EC 3.2.1.8 cleaving the internal β-1,4-xyloside bonds of xylan chains. This enzyme typically has at least 73.7% sequence identity with "endo-1,4-beta-xylanase A" of sequence SEQ ID NO: 4, including the accession number Gl of the National Center for Biotechnology. Information (NCBI) is 145228427, resulting from genome sequencing of the Aspergillus niger strain CBS 513.88 from DSM.

By "endoxylanase C" is meant here an enzyme of the GH10 glycoside hydrolase family, class EC 3.2.1.8 cleaving the internal β-1,4-xylosidic bonds of xylan chains. This enzyme typically has at least 71.2% sequence identity with the "probable endo-1,4-beta-xylanase C" of sequence SEQ ID NO: 5, including the accession number Gl of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) is 292495278, resulting from genome sequencing of the Aspergillus niger strain CBS 513.88 from DSM.

By "β-glucosidase" is meant here an enzyme of the GH3 glycoside hydrolase family, of the EC 3.2.1.21 class cleaving the external β-1,4-glycosidic linkages of cellulose chains with β-D-glucose release. .

Preferably, the β-glucosidase is one or a mixture of β-glucosidase (s) of Aspergillus, in particular Aspergillus genus nigri, more particularly Aspergillus tubingensis. More particularly, beta-glucosidase is beta-glucosidase A.

Preferably, "β-glucosidase A" has at least 30.2% sequence identity with "beta-glucosidase A" of sequence SEQ ID NO: 6, including the accession number Gl of the National Center for Biotechnology Information. (NCBI) is 145254958, from genome sequencing of DSM Aspergillus niger strain CBS 513.88.

By "pectinase" is meant here an enzyme capable of degrading pectin, a polysaccharide present in the cell walls of plants.

Preferably, the pectinase is one or a mixture of Aspergillus pectinase (s), in particular Aspergillus genus nigri, more particularly Aspergillus tubingensis. Preferably, the pectinase is a polygalacturonase class EC 3.2.1.15 of the nomenclature of enzymes of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), which cleaves the glycosidic linkages a-1,4 between the residues d galacturonic acid. More particularly, the pectinase is a polygalacturonase C.

By "polygalacturonase C" is meant here an enzyme of the GH28 glycoside hydrolase family, class EC 3.2.1.15 cleaving the internal α-1,4-galacturonic bonds of galacturonic acid chains. This enzyme typically has at least 28.7% sequence identity with Pendopolygalacturonase C- of sequence SEQ ID NO: 7, whose accession number Gl of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) is 145251107, resulting from the sequencing of genome of the Aspergillus niger strain CBS 513.88 from DSM.

In the context of the invention, the name of an enzymatic class or family (eg protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase and pectinase) preferably refers to the enzymatic activity produced by this family, while the name of a specific enzyme (eg Aspergillopepsin A, Endoxylanase A, Endoxylanase C, Polygalacturonase C) refers to the protein as such.

Thus, a composition comprising an enzymatic family X comprises the enzyme activity X and optionally the enzyme X, as such.

The enzymatic activities of the enzymes mentioned above can be determined by any technique well known to those skilled in the art. Examples of methods for determining each of the enzymatic classes mentioned above are described in the section "Enzyme Activities" below.

The percentage identity as defined herein can be calculated by many methods well known to those skilled in the art. Preferably, the percent identity corresponds to the number of identical amino acids obtained for optimal matched alignment (i.e., alignment maximizing the number of identical amino acids) of a sequence of a protein with a reference protein, over their entire length, divided by the total number of amino acids of the larger of the two aligned sequences. Alignment can be done manually or using computer programs such as the EMBOSS-Needle program (Needleman & Wunsch (1970) J. Mol Biol., 48: 443-453). The identity percentage is preferably calculated using the program EMBOSS: needle (global) with the matrix Blosum62 and the following parameters: "Gap Open" equal to 10.0, "Gap Extend" equal to 0.5.

In the context of the invention, the references NCBI G1 are those that were available on December 21, 2015.

Aspergillus tubingensis strain

The subject of the present invention is a strain of Aspergillus tubingensis SCC027 deposited on February 1, 2016 with the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, the Netherlands) under the number CBS 136961.

The subject of the present invention is also a natural variant of the strain of Aspergillus tubingensis SCC027 deposited on February 1, 2016 with the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands) under the number CBS 136961, allowing by solid-state fermentation on a substrate comprising a mixture of wheat bran and rapeseed meal, in particular a mixture of wheat bran and rapeseed cake in a 30/70 ratio, a biocatalyst which, when is added in the simultaneous saccharification-fermentation medium of a process for the production of ethanol from corn flour, makes it possible to obtain an Ethanol Gain at least equal to that obtained under the same conditions with a biocatalyst produced by fermentation in solid medium of the strain of Aspergillus tubingensis SCC027 on a substrate comprising a mixture of wheat bran and rapeseed meal, in particular a mixture of wheat bran and wheat bran. rapeseed in a 30/70 ratio.

By "natural variant" is meant here a strain obtained without genetic manipulation, from a natural reference strain, the strain thus obtained making it possible to produce, by fermentation in a solid medium, on a substrate comprising a mixture of wheat bran and rapeseed meal, in particular a mixture of wheat bran and rapeseed meal in a 30/70 ratio, a biocatalyst which, when added to the simultaneous saccharification-fermentation medium of a process for the manufacture of rapeseed ethanol from maize flour, makes it possible to obtain an Ethanol Gain as described in the section "Manufacture of ethanol" below, at least equal to that obtained under the same conditions with a biocatalyst produced by fermentation in a solid medium of the reference strain on a substrate comprising a mixture of wheat bran and rapeseed cake, in particular a mixture of wheat bran and rapeseed meal in a 30/70 ratio.

The natural variant can thus be obtained by cross-breeding and / or hybridization of Aspergillus strains and / or by spontaneous mutation and / or by random mutagenesis, for example following exposure to stress conditions, to a UV treatment or to a treatment with other mutagenic agents.

The genetic inheritance of a natural variant has not been modified by genetic engineering. The natural variant is therefore not a genetically modified organism.

"Ethanol Gain" is defined in the "Ethanol Manufacturing" section below.

Preferably, the natural variant according to the invention makes it possible to produce, under the conditions described in Example 1, a biocatalyst which, when it is added in the simultaneous saccharification-fermentation medium of an ethanol manufacturing process. as described in Example 2, makes it possible to obtain an Ethanol Gain as described in the "Manufacture of ethanol" section at least equal to that obtained under the same conditions with a biocatalyst produced under the conditions described in the example 1, by strain SCC027.

Biocatalyst manufacturing process

The present invention also relates to a method of manufacturing a biocatalyst for making ethanol from starchy raw material, comprising the steps of: a) providing a substrate, b) seeding the substrate provided in step a) with the strain Aspergillus tubingensis SCC027 or a natural variant thereof according to the invention, and c) fermentation by fermentation in a solid medium said substrate with the strain under appropriate conditions to allow the simultaneous production by the strain of a protease activity , a cellulase activity which is not a β-glucosidase activity and a β-glucosidase activity.

substratum

The substrate used for the production of the biocatalyst is preferably an agricultural or agro-industrial co-product.

By "agricultural or agro-industrial co-product" is meant a product created in the same process of transformation and at the same time as a major agricultural or agri-industrial product.

The substrate used for the production of the biocatalyst may in particular be a cereal co-product, an oleaginous co-product, an oilseed crop co-product, a sacchariferous co-product, a co-product of the processes for the transformation of cereal, oleaginous, oil-proteiniferous and sacchariferous crops. , or a mixture of these.

Examples of substrates that can be used to produce the biocatalyst according to the invention include wheat bran, rapeseed meal, soybean meal, beet pulp, barley rootrush, corn ethanol, cornstarch wheat ethanol and mixtures thereof.

Preferably, the substrate used for the production of the biocatalyst is selected from the group consisting of wheat bran, rapeseed meal, barley rootlet, ethanol cornseed, and mixtures thereof. More preferably, the substrate used for producing the biocatalyst comprises wheat bran and / or rapeseed cake. Most preferably, the substrate used for producing the biocatalyst comprises or consists of a mixture of wheat bran and rapeseed cake.

Wheat bran and rapeseed meal may be present in this mixture in mass proportions ranging from 10/90 (ie 10% wheat bran to 90% rapeseed meal) at 50/50 (ie 50% wheat bran for 50% rapeseed meal), preferably 15/85 (ie 15% wheat bran for 85% rapeseed cake) at 45/55 (ie 45% wheat bran for 55% rapeseed cake), preferably 20/80 (ie 20% wheat bran for 80% rapeseed cake) at 40/60 (ie 40% wheat bran for 60% oilcake). rapeseed), preferably from 25/75 (ie 25% wheat bran to 75% rapeseed meal) to 35/65 (ie 35% wheat bran to 35% rapeseed cake), so more preferred 30/70 (ie 30% wheat bran for 70% rapeseed cake).

The substrate used for the production of the biocatalyst can be ground beforehand.

The substrate used for the production of the biocatalyst is preferably pre-moistened and heat-treated to reduce the endogenous flora of the substrate, to pasteurize or sterilize it.

In a particularly preferred manner, the substrate used for the production of the biocatalyst is pre-moistened so as to reach a solids content of 35 to 90%, preferably a solids content of 40 to 80%, preferably a solids content of 45 to 70%. %, preferably a solids content of 50 to 65%, preferably 55% of dry matter.

The heat treatment may consist of heating, for example in an autoclave, typically at 105 ° C., for example for 35 minutes, or pasteurization, typically at 105 ° C., for example for 15 minutes. It is also possible to heat treat the substrate used for the production of the biocatalyst by injecting water vapor.

Preferably, the pH is adjusted during the humidification in a range from 4 to 5.5, preferably to 4.9, for example with nitric acid or sulfuric acid, in order to promote the implantation of the microorganism cultivated and starting the fermentation in solid medium. The humidification is preferably determined so that the water content of the substrate used for the production of the biocatalyst is between 40 and 70% of the total mass of the substrate and water. Thus, the substrate used for the production of the biocatalyst preferably has an initial dry matter of between 30 and 60%, preferably 45%.

Seeding Seeding of the substrate used for the production of the biocatalyst can be carried out with any appropriate inoculum. The strain of Aspergillus tubingensis used during the fermentation in solid medium can thus be previously subjected to a sporulation step before being inoculated in the form of spores. The inoculum dose will then advantageously be at least 5.106 viable spores / g of initial dry matter, preferably at least 107 viable spores / g of initial dry matter. Alternatively, the strain of Aspergillus tubingensis used during fermentation in solid medium can be inoculated as mycelium. The dose of inoculum will then advantageously be between 100 and 500 g of liquid culture medium comprising the mycelium per kg of initial dry matter.

Fermentation in a solid medium

By "solid state fermentation" is meant here the cultivation of microorganisms on wet solid supports, on inert carriers or on insoluble substrates that can be used as a source of carbon and energy. The fermentation process takes place in the absence or near-absence of free water in the space between the substrate particles.

Fermentation in solid medium can be carried out in any suitable reactor.

Fermentation in a solid medium is preferably conducted for controlled arrest prior to sporulation of the Aspergillus tubingensis strain used. The fermentation in solid medium is thus preferably carried out for a period of 1 to 4 days, preferably between 20 and 80 hours, between 35 and 60 hours, between 40 and 55 hours, particularly preferably between 45 hours and 45 hours. 50 h.

The temperature of the medium is preferably maintained between 30 ° C and 36 ° C and 0.5 ° C, more preferably at 33 ° C ± 0.5 ° C, which corresponds to the optimum range of activity of the strain strains. Aspergillus tubingensis used to produce the biocatalyst.

The water content of the substrate is preferably substantially maintained between 45 and 60% during the fermentation, more preferably 55%, for example by periodically carrying water to compensate for the loss of water in the medium. The term "substantially maintained" means that it is tolerable for the moisture content to be a value deviating by 2% units of the 45-60% range for a relatively short period of time between two successive adjustments of the rate of moisture or at the end of fermentation. The moisture content of the substrate may indeed have a tendency to decrease during fermentation by evaporation under the effect of the temperature increase generated by the fungal growth.

Aeration, preferably continuously, is preferably carried out during fermentation in solid medium, in order to provide the oxygen necessary for the fermentation and to avoid the excessive accumulation of carbon dioxide produced by the fermentation and / or avoid excessive accumulation of heat.

Stirring may be conducted to avoid the formation of impermeable masses. The agitation can be implemented by means of stirring arms, blades or spatulas or worm. The agitation, however, preferably remains moderate. Preferably, the stirring is discontinuous, typically stirring is conducted every 3 h to 13 h. The fermentation step c) is carried out under appropriate conditions to allow the simultaneous production by the strain of a protease activity as defined in the "Definitions" section above, of a cellulase activity which is not not β-glucosidase and β-glucosidase activity, as defined in the "Definitions" section above.

By "simultaneous production" of several enzymatic activities is meant here that the enzymatic activities are produced by the Aspergillus tubingensis strain in a single fermentation step during which the fermentation conditions (temperature, pH, composition of the medium, aeration) make it possible to obtain all the enzymatic activities sought. The fermentation step c) is preferably carried out under appropriate conditions to allow the simultaneous production by the strain of at least 60 U of PAC protease activity per gram of initial dry matter of substrate, preferably from minus 100 U of PAC protease activity per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 130 U of PAC protease activity per gram of initial substrate dry matter, of at least 60 U of CMCell cellulase activity per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 110 U CMCell cellulase activity per gram of initial substrate dry matter, and at least 100 U of β-Glu β-glucosidase activity per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 200 U β-Glu β-glucosidase activity per gram of initial substrate dry matter.

Preferably, the fermentation step c) is carried out under appropriate conditions to allow furthermore the simultaneous production by the strain of at least 75 U of xylanase activity AXCn per gram of initial dry matter of substrate, of preferably at least 130 U of AXCn xylanase activity per gram of initial substrate solids, preferably at least 180 U of AXCn xylanase activity per gram of initial substrate solids, and / or less than 2000 U of PG pectinase activity per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 2900 U of PG pectinase activity per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 3800 U of activity PG pectinase per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 4500 U of PG pectinase activity per gram of initial substrate dry matter. The fermentation step c) is preferably carried out under conditions to allow the simultaneous production by the strain of at least one aspergillopepsin A, as defined in the "Definitions" section above, as a protease, of at least one endoglucanase, as defined in the "Definitions" section above, as cellulase, and at least one β-glucosidase, as defined in the "Definition" section above.

The fermentation product thus obtained is a moist solid product.

By "initial substrate dry matter" or "MSi" is meant here the mass of substrate dry matter used to produce the biocatalyst by fermentation in solid medium, at the beginning of this fermentation. During the fermentation process in a solid medium, the growth of microorganisms such as Aspergillus consumes a portion of the substrate, and thus generates a loss of substrate dry matter which typically represents between 15 and 30%, for example 20% of the material. initial dry.

The amounts of biocatalysts, when used as defined below, are related to the amount of initial dry matter of the corresponding substrate.

The levels of enzymatic activities are related to the amount of initial dry matter of the corresponding substrate, so that the extracted forms can be compared with the raw forms of the biocatalyst, or biocatalysts from fermentation or strain can be compared with mass losses. different.

Packaging of the fermented product

The biocatalyst obtained after fermentation in solid medium above can be in raw form or extracted.

By "raw form" is meant here that the biocatalyst comprises at least protease, cellulase and β-glucosidase, as well as the strain of Aspergillus tubingensis used for the fermentation in solid medium and the substrate used during the preparation. fermentation in solid medium, possibly crushed. This raw form typically contains particles having a diameter of between 50 μm and 5 mm depending on the type of ground material generated.

The biocatalyst obtained after the fermentation in solid medium can also be dried or frozen for preservation.

The drying is preferably carried out at a moderate temperature so as not to affect the enzymatic activities, for example in an oven preferably at 40 ° C., until a humidity of for example 8% or, for example, 10% is obtained.

Freezing is preferably carried out on the moist fermented product, for example at -20 ° C.

The biocatalyst obtained after the fermentation in solid medium can also undergo a new grinding before being conditioned.

"Extracted form" here means that the combination of enzymes of the biocatalyst, in particular at least protease, cellulase and β-glucosidase, more particularly at least protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase and pectinase, more particularly at least aspergillopepsin A, endoglucanase, endoxylanase A, endoxylanase C, β-glucosidase A, cellobiohydrolase and polygalacturonase C, are isolated from the Aspergillus tubingensis strain and from the substrate used during fermentation in solid medium with the strain. of Aspergillus tubingensis by extraction processes that can implement any technique well known to those skilled in the art, in particular by extraction in aqueous solution, extraction in alcoholic solution, extraction by solvents, high pressure homogenization, supercritical extraction, extraction by fluidized beds, grinding, cryogenic grinding, decompression, cavitation, bubbling, ultrasonic extraction, adsorption on r resins or zeolites. The combination of enzymes in liquid form can then be purified by any technique well known to those skilled in the art, in particular by centrifugation, filtration, ultrafiltration, chromatography, use of membranes or precipitation.

The biocatalyst in extracted form may further be stabilized, dried or frozen for preservation.

The stabilization of the biocatalyst can be carried out by any means known to those skilled in the art, such as the addition of glycerol, sorbate, potassium salt, etc.

The drying of the biocatalyst in extracted form can be carried out by any means known to those skilled in the art, such as lyophilization, atomization, etc.

biocatalyst

The present invention relates to a biocatalyst for producing ethanol from starchy raw material, comprising at least one protease activity, a cellulase activity which is not a β-glucosidase activity and a β-glucosidase activity, as defined in the present invention. section "Definitions" above, obtainable by the biocatalyst manufacturing process according to the invention.

In a particular embodiment, the biocatalyst comprises as protease at least one aspergillopepsin A. In a particular embodiment, the biocatalyst comprises as cellulase at least one endoglucanase and / or at least one cellobiohydrolase. In a particular embodiment, the biocatalyst comprises at least one β-glucosidase A as β-glucosidase. In a particularly preferred embodiment, the biocatalyst comprises at least one aspergillopepsin A, at least one endoglucanase and at least one β-glucosidase. AT.

In a preferred embodiment, said protease activity is present in the biocatalyst at a dose of at least 60 UAP / g of initial dry matter of the substrate, preferably at a dose of at least 100 UAP / g of material. initial dry substrate, preferably at a dose of at least 130 UAP / g of initial dry matter substrate. In another preferred embodiment, said cellulase activity which is not a β-glucosidase activity is present in the biocatalyst at a dose of at least 60 U CMCell / g of initial dry matter of substrate, preferably at a dose of at least 110 U CMCell / g of initial dry matter of substrate. In another preferred embodiment, said β-glucosidase activity is present in the biocatalyst at a dose of at least 100 U β-Glu / g of initial dry matter of substrate, preferably at a dose of at least 200 U β-Glu / g of initial dry matter of substrate. The term "initial substrate dry matter" is defined in the "Biocatalyst Manufacturing Process" section above.

Preferably, the biocatalyst obtainable by the manufacturing method according to the invention further comprises at least one xylanase activity and / or at least one pectinase activity, said activities being produced simultaneously by the Aspergillus tubingensis strain.

In a particularly preferred manner, the biocatalyst that can be obtained by the process according to the invention also comprises: at least 75 U of xylanase activity AXCn per gram of initial dry matter of substrate, preferably at least 130 U of AXCn xylanase activity per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 180 U of AXCn xylanase activity per gram of substrate initial dry matter, and / or - at least 2000 U of PG pectinase activity per gram of dry matter initial substrate, preferably at least 2900 U PG pectinase activity per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 3800 U PG pectinase activity per gram of initial dry matter substrate, preferably at least 4500 U of PG pectinase activity per gram of initial substrate dry matter.

Preferably, the biocatalyst according to the invention comprises, as xylanase, an endoxylanase A, an endoxylanase C or a mixture thereof, and / or as a pectinase a polygalacturonase C.

In a particularly preferred embodiment, all the enzymes present in the biocatalyst according to the invention are simultaneously produced by a single strain of filamentous fungus, in particular a single Aspergillus strain, in particular a single strain of Aspergillus genus. nigri, more particularly Aspergillus tubingensis, more preferably the strain Aspergillus tubingensis SCC027 or a natural variant thereof as defined in the section "Aspergillus tubingensis strain" above.

The present invention also relates to a biocatalyst for making ethanol from starchy raw material, said biocatalyst comprising: (i) at least one protease activity, (ii) at least one cellulase activity that is not a β-glucosidase activity (iii) at least one xylanase activity, (iv) at least one β-glucosidase activity, and (v) at least one pectinase activity, said protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase and pectinase activities being produced simultaneously the same strain filamentous mushroom.

Preferably, the biocatalyst comprises as protease (i) at least one acid protease, preferably at least one aspergillopepsin, most preferably at least one aspergillopepsin A.

Preferably, the biocatalyst comprises as cellulase (ii) at least one endoglucanase, a cellobiohydrolase or a mixture thereof.

Preferably, the biocatalyst comprises as xylanase (iii) at least one endoxylanase or a mixture of endoxylanases, preferably at least one endoxylanase A, an endoxylanase C or a mixture thereof.

Preferably, the biocatalyst comprises, as β-glucosidase (iv), at least one β-glucosidase A.

Preferably, the biocatalyst comprises as pectinase (v) at least one polygalacturonase, preferably at least one polygalacturonase C.

In a preferred embodiment, the biocatalyst according to the invention comprises: (i) at least one aspergillopepsin A, (ii) at least one endoglucanase and one cellobiohydrolase, (iii) at least one endoxylanase A and one endoxylanase C, (iv) ) at least one β-glucosidase A, and (v) at least one polygalacturonase C, said aspergillopepsin A, endoglucanase, cellobiohydrolase, endoxylanase A, endoxylanase C, β-glucosidase A and polygalacturonase C, being produced simultaneously by the same strain of fungus. filamentous.

Preferably, said filamentous fungus is Aspergillus, preferably an Aspergillus section Nigri, more particularly an Aspergillus tubingensis, most preferably Aspergillus tubingensis strain SCC027 or a natural variant thereof as defined in section "Aspergillus tubingensis strain" above.

Preferably, said at least one protease activity is present in the biocatalyst at a dose of at least 60 UAP / g of initial dry matter of substrate, preferably at a dose of at least 100 UAP / g dry matter. initial substrate, preferably at a dose of at least 130 UAP / g of initial substrate dry matter. Preferably, said at least one cellulase activity which is not a β-glucosidase activity, is present in the biocatalyst at a dose of at least 60 U CMCell / g of initial dry matter of the substrate, preferably at least 110 U CMCell / g initial substrate dry matter. Preferably, said at least one xylanase activity is present in the biocatalyst at a dose of at least 75 U AXCn per gram of initial dry matter of substrate, preferably at least 130 U AXCn per gram of initial dry matter of the substrate, preferably at least 180 U AXCn per gram of initial dry matter of substrate. Preferably, said at least one β-glucosidase activity is present in the biocatalyst at a dose of at least 100 U β-Glu per gram of initial dry matter of substrate, preferably at least 200 U β-Glu per gram of material initial dry substrate. Preferably, said at least one pectinase activity is present in the biocatalyst at a dose of at least 2000 U PG per gram of initial dry matter of substrate, preferably at least 2900 U PG per gram of substrate initial dry matter, of preferably at least 3800 U PG per gram of initial substrate solids, preferably at least 4500 U PG per gram of initial substrate solids.

In a particularly preferred manner, the biocatalyst according to the invention comprises: (i) at least one protease activity at a dose of at least 60 UAP / g of initial dry matter of substrate, preferably at a dose of at least 100 U PAC / g of initial dry matter of substrate, preferably at a dose of at least 130 UAP / g of initial substrate dry matter, (ii) at least one cellulase activity at a dose of at least 60 U CMCell g / g initial substrate dry matter, preferably at least 110 U CMCell / g initial substrate solids, (iii) at least one xylanase activity at a dose of at least 75 U AXCn per gram of dry matter initial substrate, preferably at least 130 U AXCn per gram of initial dry matter substrate, preferably at least 180 U AXCn per gram of initial dry matter substrate, (iv) at least one β-glucosidase activity at a dose of at least 100 U β-Glu / g of initial dry matter e substrate, preferably at least 200 U β-Glu / g of initial dry matter substrate; and (v) at least one pectinase activity at a dose of at least 2000 U PG per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 2900 U PG per gram of initial substrate dry matter, preferably at least 3800 U PG per gram of initial dry matter of substrate, preferably at least 4500 U PG per gram of initial dry matter of substrate, said protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase and pectinase activities being produced simultaneously by the same strain of fungus filamentous, preferably the same strain of Aspergillus, in particular the same strain of Aspergillus section nigri, more particularly the same strain of Aspergillus tubingensis, more particularly the same strain of Aspergillus tubingensis SCC027 or a natural variant thereof as defined in the section "Aspergillus tubingensis strain" above.

Ethanol manufacturing

The subject of the present invention is also the use of the biocatalyst according to the invention for the manufacture, by fermentation of starchy raw material, of ethanol.

The present invention also relates to a process for producing ethanol from starchy raw material comprising a step of fermenting the starchy raw material with a yeast in the presence of the biocatalyst according to the invention. The fermentation step of the ethanol production process according to the invention is preferably a step of saccharification-simultaneous fermentation, in the presence of the biocatalyst according to the invention.

By "starchy raw material" is meant here a cereal or tuber, which contains starch as the major source of carbon. In particular, "starchy raw material" here means maize, wheat, barley, sorghum, cassava, potato, alone or as a mixture. Preferably, the starchy raw material is corn or wheat. In a particular embodiment, the starchy raw material is maize. In another particular embodiment, the starchy raw material is wheat.

The method of manufacturing ethanol according to the invention preferably comprises the following steps: A) a step of mixing a grinding of the starchy raw material with water, and optionally clarified vinasses, B) optionally a step cooking the mixture prepared in step A), C) optionally a step of pre-liquefaction of the starch of said mixture, D) a liquefaction step of the starch, in the presence of starch liquefying enzymes for hydrolyzing the starch into dextrins, E) optionally a yeast propagation step, and F) a simultaneous saccharification-fermentation step of the dextrins and / or fermentable sugars, in the presence of the biocatalyst according to the invention, saccharification enzymes of dextrins and yeasts, possibly propagated in step E), so as to produce ethanol.

Step A) mixing

The mixture typically contains 20 to 40% by mass of dry matter, preferably between 25 and 35%, preferably 30% by mass of dry matter.

Step B) cooking

The mixture prepared in stage A), typically containing from 20 to 40% by mass of dry matter, preferably between 25 and 35%, preferably 30% by mass of dry matter, is preferably sent in a jet-cooker. typically between 100 and 130 ° C, preferably between 105 and 120 ° C, preferably with steam injection, preferably for a period of 5 to 20 min, preferably for 15 min, in order to gelatinize and destructure the granular starch of the raw material mixed.

This cooking step B) is preferably carried out when the starchy raw material is maize.

Step C) pre-liquefaction

The mixture, typically containing from 20 to 40% by mass of dry matter, preferably between 25 and 35%, preferably 30% by mass of dry matter, is preferably placed in the presence of a dezosising enzyme complex.

The pre-liquefaction enzymes that can be used during this step are well known to those skilled in the art. These are typically viscosity reducing enzymes such as hemicellulases and / or beta-glucanases.

Depending on the enzymes used, the pH may be adjusted with an acid or base solution, for example sulfuric acid or ammonium hydroxide. The pH can typically be adjusted to 4.5 to 6.5, preferably 5.5.

The pre-liquefaction is preferably carried out by applying a temperature increase phase of preferably 15 min, making it possible to reach a temperature typically of 55 ° C maintained for 15 to 45 min, preferably 30 min.

Vats in which the pre-liquefaction step is carried out can further be stirred, preferably continuously.

This pre-liquefaction stage C) is preferably carried out when the starchy raw material is wheat.

Step D) Liquefaction

The mixture prepared in step A) and having optionally undergone steps B) or C), typically containing from 20 to 40% by mass of dry matter, preferably between 25 and 35%, preferably 30% by mass of material dry, is preferably brought into the presence of liquefying enzymes. The liquefaction enzymes that can be used during this step are well known to those skilled in the art. These are typically α-amylases, in particular bacterial α-amylases, preferably thermostable bacterial α-amylases. Other enzymes may be further used in this step.

Depending on the enzymes used, the pH may be adjusted beforehand with a solution of acid or base, for example sulfuric acid or ammonium hydroxide. The pH can typically be adjusted to 4.5 to 6.5, preferably 5.5. Depending on the enzyme used, a calcium salt may also be added to enhance the stability of the enzyme.

The liquefaction is preferably carried out at a temperature of 80 to 95 ° C, preferably between 85 and 90 ° C, for 60 to 150 min, preferably 90 min.

The tanks in which the liquefaction stage is carried out can also be stirred, preferably continuously.

Step E) of yeast propagation

The yeasts that can be used for the manufacture of ethanol are well known to those skilled in the art and may in particular be yeasts of the Saccharomyces genus. Preferably, the yeasts used for the manufacture of ethanol are not genetically modified organisms.

Preferably, the yeasts are introduced into the simultaneous fermentation or saccharification-fermentation medium, in step F) defined below, after having undergone a propagation step. This propagation step allows yeast development sufficient to inoculate the fermentation medium or simultaneous saccharification-fermentation at the dose mentioned above. The propagation stage is typically carried out by culturing active dry yeasts in a liquefied wort, typically containing from 15 to 30% by mass of dry matter, preferably between 20 and 25%, preferably 20% by weight of dry matter. Typically, the propagation step according to the invention has the following characteristics: The temperature is between 30 ° C. and 37 ° C., preferably 35 ° C. The pH can be adjusted at the beginning of the propagation stage with an acid or a base, for example sulfuric acid or ammonium hydroxide, preferably between 4.5 and 5.8, preferably between 5 and 5.5, preferably at 5.3. Preferably, there is no pH adjustment during the continuation of the propagation step. The assembly is preferably stirred throughout the duration of the propagation step, so as to aerate the medium. • A nitrogen addition may be carried out, in mineral or organic form, for example urea, so as to provide the yeast a complementary source of nitrogen. For example a supply of urea of 2 to 4 g / l of liquefied must can be carried out, preferably 3 g / liter of liquefied must. • The propagation time can be between 4 h and 24 h, preferably between 8h and 12h.

The biocatalyst according to the invention can be added during the propagation step, instead of the simultaneous saccharification-fermentation step defined below, so as to guarantee a contribution, during the saccharification-fermentation step. simultaneous, of the order of 0.01 to 5 kg of initial biocatalyst substrate dry matter per ton of starchy feedstock, preferably between 0.4 and 1.2 kg of initial biocatalyst substrate dry matter per ton of starchy raw material.

Step F) simultaneous saccharification-fermentation

During this step, the wort liquefied according to stage D), typically containing from 20 to 40% by mass of dry matter, preferably between 25 and 35%, preferably 30% by mass of dry matter, is preferably used. in the presence of saccharification enzymes. The saccharification enzymes that can be used during this step are well known to those skilled in the art. It is typically glucoamylase. Other enzymes may be further used in this step.

In the simultaneous saccharification-fermentation step of the ethanol production process according to the invention, the saccharification-fermentation must is placed in the presence of yeasts, possibly propagated by step E) above. Typically, the simultaneous saccharification-fermentation step according to the invention has the following characteristics: • The temperature is between 30 ° C and 35 ° C, preferably 32 ° C. The pH can be adjusted at the beginning of the simultaneous saccharification-fermentation stage with an acid or a base, for example sulfuric acid or ammonium hydroxide, preferably between 4.5 and 5.8. preferably between 5 and 5.5, preferably at 5.3. Preferably, there is no pH adjustment during the subsequent simultaneous saccharification-fermentation step. The whole can be stirred throughout the simultaneous saccharification-fermentation step, preferably continuously. • A nitrogen addition may be carried out, in mineral or organic form, for example urea, so as to provide the yeast a complementary source of nitrogen. For example, a urea supply of 1 g / l of liquefied must can be carried out. • The fermentation time may be between 20 hours and 80 hours, preferably between 40 hours and 60 hours. Preferably, the biocatalyst according to the invention is present during the simultaneous fermentation or saccharification-fermentation stage at a concentration of 0.01 to 5 kg of initial biocatalyst substrate dry matter per ton of starchy raw material. preferably between 0.4 and 1.2 kg of initial biocatalyst substrate dry matter per ton of starchy feedstock.

The yeasts that can be used for the manufacture of ethanol are well known to those skilled in the art and may in particular be yeasts of the Saccharomyces genus. Preferably, the yeasts used for the manufacture of ethanol are not genetically modified organisms.

Typically, the simultaneous fermentation or saccharification-fermentation medium is inoculated with about 106 to about 5 × 10 8 CFU (colony-forming units) of yeast per ml of saccharification-fermentation medium, preferably about 107 CFU of yeast per ml of fermentation medium. or simultaneous saccharification-fermentation.

Preferably, the yeasts are introduced into the simultaneous fermentation or saccharification-fermentation medium after having undergone a propagation step E) as defined above.

The biocatalyst according to the invention can be added partly during the propagation step E) defined above and partly during the simultaneous saccharification-fermentation step F), so as to guarantee a total supply, during the simultaneous saccharification-fermentation step, of the order of 0.01 to 5 kg of initial biocatalyst substrate dry matter per tonne of starchy raw material, preferably between 0.4 and 1.2 kg of material initial dry substrate of the biocatalyst per tonne of starchy raw material.

The performance of the ethanol production process is measured by the concentration of ethanol in the must at the end of the simultaneous saccharification-fermentation stage, relative to the dry matter content of the starchy raw material.

By "Ethanol Gain" is meant here the improvement of the production of ethanol, in particular after a fermentation, preferably simultaneous saccharification-fermentation, preferably after 51 hours of fermentation, preferably after 51 hours of simultaneous saccharification-fermentation, conducted in the presence of a biocatalyst obtained with the strain in question, compared to the production of ethanol under the same conditions in the absence of a biocatalyst (control), typically determined by the following equation:

Gain ethanol (%) = ([Ethanol] biocatalyst - [Ethanol], ethanol) / [Ethanol], emoin

The inventors have shown that, surprisingly, the use of the biocatalyst according to the invention makes it possible to obtain a higher ethanol yield, a faster ethanol production kinetics, and a lower glycerol production than the absence of biocatalyst or by using an enzyme composition obtained by fermentation in solid medium with another strain of Aspergillus tubingensis with different enzymatic activities.

Measurement of enzymatic activities

Xyianase activity

The measurement of the xyanase activity can typically be carried out on birch xylan bound to a chromophore, Rémazol Brillant Blue R. The hydrolysis of this substrate by the xylanase activities indeed releases non-precipitable chromophore-bound oligomers after addition. an ethanol solution in the reaction medium. The concentration of non-precipitable oligomers is evaluated by measuring the absorbance at 590 nm.

The reaction medium preferably used in this method is composed of 130 μl of a commercial solution of Birchwood azo-xylan (MEGAZYME) at 10 g / l, 50 μl of enzymatic solution diluted in 0.4 M acetate buffer, pH 4.70. The reaction is preferably carried out at 30 ° C for 23 minutes. The reaction is typically stopped by adding 500 μl of 96% ethanol. The optical density of the supernatant obtained after centrifugation (10 minutes at 3000 rpm at 20 ° C.) is read at 590 nm.

A unit of xylanase activity (AXCn) can then be defined as the amount of enzyme which, diluted at a rate of 1 unit / mL, at pH 4.70 and at 30 ° C., liberates, from a solution of Remazol Brillant Blue R xylane, oligomers not precipitable in ethanol such as the optical density of the supernatant is 0.93 to 590 nm.

Acid protease activity

The measurement of acid protease activity can typically be carried out on casein. The casein can thus be hydrolysed into peptide fragments soluble in trichloroacetic acid (TCA).

A PAC unit is typically defined as the amount of enzyme which liberates soluble peptides at 40 ° C and pH 3.0 such that the 275 nm optical density of the hydrolyzate obtained after TCA precipitation is equivalent to that of a tyrosine solution at 120 μg / mL.

An appropriate measurement technique for acidic protease activity is described below.

The reaction medium preferably used in this method is composed of 500 μl of a clear casein solution and filtered at 12 g / L (0.06 M lactate buffer, pH = 3), 100 μl of enzymatic solution diluted in lactate buffer. at 0.05 M, pH = 3. The reaction is preferably carried out at 40 ° C. for 120 minutes. The reaction is typically stopped by adding 300 μl of a 10% trichloroacetic acid solution. The optical density of the supernatant obtained after centrifugation for 15 minutes at 3000 rpm at 20 ° C. is read at 275 nm.

Polygalacturonase activity

The measurement of polygalacturonase activity can typically be carried out on pectins. Polygalacturonases hydrolyze pectin chains of low degree of methylation and thus generate at the ends of the chain reducing groups on the galacturonic acid residues constituting pectin. These reducing groups can be assayed with cyanoacetamide. The assay is preferably kinetic in 40 minutes at 31 ° C.

A polygalacturonase (PG) unit is typically defined as the amount of enzyme which liberates 1 pmole of reducing moieties in 1 min at 31 ° C and pH = 4.7 from sodium polygalacturonate.

An appropriate measurement technique of polygalacturonase activity is described below.

The reaction medium preferably used in this method is composed of 750 μl of 0.1 M succinate buffer and pH = 4.7, 750 μl of an aqueous solution of commercial polygalacturonic acid of orange (Sigma) at 6.5 g / L (adjusted to pH = 4.7 with sodium hydroxide), 15 μl of enzymatic solution diluted in succinate buffer at pH = 4.7 supplemented with bovine serum albumin (0.1 g / l). Enzyme kinetics are preferably carried out at 31 ° C by stopping the reaction at 10, 20, 30 and 40 minutes. For each time, the reaction is typically stopped by adding 70 μl of the reaction medium in a stop solution composed of 140 μl of borate buffer (0.2 M, pH = 10) and 70 μl of a solution of 2 cyano -acetamide at 20 g / L. A revelation step is performed by heating the sample for 12 minutes at 120 ° C and then cooling it to -20 ° C for 10 minutes. The optical density of the supernatant is read at 280 nm against water. A calibration range constructed with a monogalacturonic acid concentration range makes it possible to convert the obtained optical densities into moles of equivalent reducing groups.

Beta-glucosidase activity

Measurement of β-Glucosidase (β-Glu) activity can typically be performed on cellobiose. The enzyme indeed acts on this compound by releasing glucose.

A β-Glu unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the release of one micromole of glucose per minute under the conditions of the test (50 ° C, pH = 4.8).

An appropriate measurement technique of β-Glucosidase activity is described below.

The reaction medium preferably used in this method is composed of 150 μl of a solution of cellobiose at 5.13 g / L (acetate buffer at pH = 4.8), 150 μl of enzymatic solution diluted in 0.1 acetate buffer. M at pH = 4.8. The reaction is preferably carried out at 50 ° C for 30 minutes. The reaction is typically stopped by heating the reaction medium at 100 ° C for 10 minutes. The reaction medium is then cooled for 10 minutes in cold water. After centrifugation at 3000 rpm at 20 ° C for 10 minutes, the glucose concentration released into the supernatant is then assayed using a commercial enzyme glucose assay kit.

Cellulase activity

The measurement of the cellulase activity, in particular endoglucanase, can typically be carried out on partially depolymerized carboxymethyl cellulose linked to a chromophore: the Rémazol Brilliant Blue R. The hydrolysis of the substrate in fact releases bound low molecular weight oligomers to the chromophore. These are found in the supernatant after precipitation with ethanol and centrifugation. A measurement of the absorbance at 590 nm makes it possible to determine the cellulase activity.

A cellulase unit on carboxymethylcellulose (CMCell) can be defined as the amount of enzyme which, diluted at a rate of 1 U / ml and used under the conditions of the assay leads to a release of non-precipitable oligomers by the precipitation solution, such that the optical density of the supernatant is 1.

An appropriate measurement technique of cellulase activity is described below. The reaction medium preferably used in this method is composed of 100 μl of commercial solution of azo-CM-cellulose (MEGAZYME), 100 μl of enzymatic solution diluted in 0.1 M acetate buffer, pH 4.60. The reaction is preferably carried out at 41 ° C for 10 minutes. The reaction is typically stopped by addition of 500 μl of precipitation solution (40 g of sodium acetate trihydrate and 4 g of zinc acetate in 1 liter of 96% ethanol). The optical density of the supernatant obtained after centrifugation (10 minutes at 3000 rpm at 20 ° C.) is read at 590 nm.

The present invention will be further illustrated by the figures and examples below.

Brief description of the figures

Figure 1: Relative abundance of 7 enzymes selected from all the enzymes identified in the biocatalyst of Example 1 by proteomic analysis.

FIG. 2: Monitoring of the C02 Production in Reactors during the SSF Reaction of a Liquefied Mash of Industrial Corn, in the Presence or Not of the Biocatalyst According to the Invention, Produced with the SCC027 Strain Incorporated at 1.2 kg MSi corn, as described in Example 4.

3: Effect of the specific enzymes of the biocatalyst according to the invention, used alone or as a mixture, with respect to the overall effect of the biocatalyst according to the invention, produced with strain SCC027, on the ethanol gain obtained at the end of 51 hours of SSF. The 100% value corresponds to a 1.5% ethanol gain calculated between the control condition and the biocatalyst condition.

Examples

Example 1 Production and Characterization of the Biocatalyst According to the Invention

This example describes a production process of the biocatalyst according to the invention obtained by fermentation in solid medium with the strain of Aspergillus tubingensis SCC027. 10 kg of initial dry matter of substrate consisting of a mixture of rapeseed meal and wheat bran, in a 70/30 ratio are used.

The substrate is pretreated by humidification at 60% dry matter and then pretreated in an autoclave at 105 ° C. for 35 min.

The substrate is then inoculated with 1x107 viable spores of Aspergillus tubingensis SCC027 / g of initial dry matter.

The substrate has an initial dry matter before fermentation of 45%.

Fermentation in solid medium is then carried out for 51 hours under the following conditions:

- Temperature: 33 ° C ± 0.5 ° C - Dry matter: 45% ± 2%

Continuous 35 HZ ventilation - discontinuous agitation

After 51 hours of fermentation, the culture is stopped by adding propionic acid and the medium is then dried at 45 ° C. for 18 hours, until a dry matter content is obtained. <10%.

The biocatalyst is finely ground using a Retsch ZM300 centrifugal grinder mounted with a 0.85 mm (18,000 rpm) grid. It is stored away from light and cold (-20 ° C).

For its use in simultaneous saccharification-fermentation of starchy raw material (see examples 2 to 6), the biocatalyst can be added either directly to the must in the form of a powder or extracted in water (1/10 or 1/20 p / v, stirring at room temperature for 10 to 15 minutes).

For enzymatic characterizations, the aqueous extract of the biocatalyst is centrifuged (10 min, 3000 rpm, 20 ° C) to separate the insoluble particles.

The determination of the primary structure of the proteins, in order to identify them, is carried out by a proteomic analysis according to the so-called "bottom-up" strategy which consists in analyzing the constituent peptides of the proteins to be identified by mass spectrometry. Soluble proteins underwent, after a reduction and alkylation step, digestion with trypsin.

The peptides thus obtained, after purification on ZipTip C18 microcolumn, are separated by nanoLC-type reverse-phase liquid chromatography. The chromatographic separations are carried out on a 50 cm C18 75 μm column with a particle size of 5 μm (Acclaim PepMap100 C18 column from Thermoscientific). The nanoLC is an Ultimate 3000 Rapid Separation LC Systems from Thermoscientific. The gradient used is a binary gradient. Solution A is a mixture of acetonitrile / 0.1% formic acid (2/98, v / v). Solution B is a mixture of acetonitrile / formic acid 0.1% (90/10, v / v). The flow rate is 0.220 μL / min at the nano pump and 15 μL / min at the loading pump. The column is thermostated at 35 ° C.

The peptides thus separated are sequenced by high resolution mass spectrometry in tandem type LTQ-FT-ICR to obtain precise information on the amino acid sequence. The ionization of the peptides is done by a source of the electrospray type. The applied voltage is +1.70 kV. The method of acquisition in mass spectrometry is a method called data dependent acquisition in top 7, with dynamic exclusion, saved in LTQ centroid mode. Mass measurement is carried out with a high precision (of the order of the ppm) between 470 and 2000 m / z.

All experimental masses are compared to theoretical masses from protein databases where in silico digestion was performed. The identification of the proteins in the sample is done by comparing the two mass lists. Relative quantitation is performed by summing the intensity or area of the 3 major peptides of the identified protein. The ratio of the area obtained of each protein to the sum of the areas of all the proteins identified makes it possible to estimate the level of abundance of the protein in the sample. More than 70 enzymes were identified by this analysis.

The different proportions of proteins identified by proteomic analysis and selected for the invention are shown in FIG.

This figure shows that the main enzyme of the biocatalyst thus obtained is aspergillopepsin A (33.1%). Also present are endopolygalacturonase C (8.8%), 1,4-pD-glucan cellobiohydrolase (6.6%), endo-1,4-p-xylanase A (3.6%), 1,4-p-xylanase C (2.9%), endoglucanase (2.5%) and β-glucosidase (1.1%).

The inventors have also determined the level of the different enzymatic activities of the biocatalyst obtained by this production protocol. They compared these different activities with those obtained using other Aspergillus tubingensis strains (A tubingensis A and B) and a natural variant according to the invention of strain SCC027 in a similar production protocol. The enzymatic activities were determined by implementing the methods described above.

Table 1 summarizes the different enzymatic activities measured.

Table 1: Comparison of the enzymatic profile of biocatalysts obtained with strain SCC027 and a natural variant of SCC027 compared to other strains of A. tubingensis

TC: rape cake SB: wheat bran ND: not determined

These results show that the biocatalyst obtained with the strain of Aspergillus tubingensis SCC027 has enzymatic activities different from a composition obtained with other strains of Aspergillus tubingensis.

Example 2 Use of the Biocatalyst According to the Invention in the Production of Ethanol from Corn Flour, in a Vial

This example shows the beneficial effect of the biocatalyst according to the invention on the production of ethanol from corn flour, in particular on the amount of ethanol produced.

Material and methods

General description of the ethanol production process

The ethanol production process implemented comprises the following steps: the raw material, here maize, is packaged, pasted then liquefied before being subjected to a simultaneous saccharification-fermentation step. In parallel, the yeast is rehydrated before being incorporated into the must for the simultaneous saccharification-fermentation step.

Conditioning of the corn raw material

The whole maize has been conditioned to obtain a mill, that is, a flour. For this, the corn was milled using a hammer mill (Electra). The size of the grid used was set at 0.8 mm. The grind obtained has a moisture content of 10% (+/- 2%). In the form of flour, the raw material is stored away from light in a dry place at room temperature.

Production of liquefied corn must The stage of liquefaction of the corn mill makes it possible to hydrolyze the starch into dextrins. The principle is to form a mixture of corn flour, water and clear vinasse industrial grade and heat it in the presence of liquefaction enzymes, so as to obtain a liquefied must. Thus, the must consists of 34% corn flour, 10% clear vinasse and 56% water. This must was prepared in a 4L bioreactor in double-jacketed glass (Cloup), at ambient temperature, with stirring between 250 and 350 rpm. After homogenization, the pH of the must was adjusted to 5.5 (by addition of H2SO4) in order to optimize the action of the liquefying enzymes. Alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) was added at 0.15 kg / t of corn. The wort was brought to 90 ° C and liquefied at this same temperature for 2h in the stirred reactor between 200 and 300 rpm. At the end of the liquefaction, the must was cooled to ambient temperature and adjusted to pH 5.3 (by addition of H2SO4).

Vial Ethanol Production The Simultaneous Saccharification-Fermentation (SSF) step was performed in baffled vials. These are 250 ml baffled flasks, sealed with hermetically sealed rubber stoppers, with a CO2 outlet per 1.2 mm diameter needle. The SSF consisted of bringing together: • 140 g of liquefied corn must with 30% dry matter, pH 5.3; • the active dry yeast Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporated in 0.25 mg / ml of liquefied corn must, after being rehydrated for 30 min at 32 ° C. in a Tryptone Sel broth, to ensure an initial seeding of the order of 1.107 CFU yeasts / ml of must; • urea at 1 g / l of liquefied corn must; • glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) at 0.42 kg / t of maize, so as to saccharify liquefied corn must.

The SSF must thus constituted was stirred at 120 rpm. The temperature was kept constant throughout this step at 32 ° C. No pH maintenance was performed. The fermentation was conducted for a period of 51 hours.

Finally, the biocatalyst obtained in Example 1, produced from strain SCC027 or one of its variants, was added at the beginning of SSF at different concentrations. In the so-called "control" condition, no biocatalyst addition has been made.

Each condition was applied in two separate vials (n = 2). Results

By following the evolution of the weight of each of the flasks, it is possible to determine the amount of CO 2 produced during the fermentation. Considered in the stoichiometric equation of the production of ethanol from glucose, the quantity of CO2 produced makes it possible to estimate the production of ethanol for each of the fermentations conducted in flasks. 1 mole glucose 2 moles of CO 2 + 2 moles of ethanol Thus, by comparing the ethanol production at the end of 51 h of the so-called "control" fermentation compared to that of fermentations conducted in the presence of biocatalysts ("condition"), it is possible to calculate the ethanol gain:

Gain ethanol (%) = ([Ethanol] condition - [Ethanol] control) / [Ethanol] control

Table 2: Ethanol Gains Obtained in Vials After 51 Hours of SSF of a Liquefied Mash of Corn, in the Presence of the SCC027 Biocatalyst or a Biocatalyst Obtained with a Natural Variant (SCC027-2 Variant), different doses of incorporation.

As shown in Table 2, the production of ethanol after 51 hours of fermentation in a flask is improved with the use of biocatalysts obtained with strain SCC027 or its variants. The gain is variable depending on the strain and the incorporation dose. An ethanol gain of 1.5% is obtained with strain SCC027 at the incorporation dose of 1.2 kg MSi / t of corn. A variant of the strain SCC027 gives rise to a similar ethanol gain (1.4%) at the dose of 0.6 kg MSi / t of maize, ie a dose half as much as with the SCC027 strain.

Example 3 Advantage of the Biocatalyst According to the Invention in the Production of Ethanol from Corn Flour, in a Vial, Compared with the Use of a Commercial Protease

This example shows the beneficial and advantageous effect of the biocatalyst according to the invention on the production of ethanol from corn flour, in particular on the amount of ethanol produced, compared to the implementation of a protease.

Material and methods

General description of the ethanol production process

The ethanol production process implemented comprises the following steps: the raw material, here industrial maize must, already liquefied, is directly subjected to a simultaneous saccharification-fermentation step. The yeast is rehydrated before being incorporated into the must for the simultaneous saccharification-fermentation step.

Vial Ethanol Production The Simultaneous Saccharification-Fermentation (SSF) step is performed in baffled vials. These are 250 ml baffled flasks, sealed with hermetically sealed rubber stoppers, with a CO2 outlet per 1.2 mm diameter needle. The SSF consisted in bringing together: • 140 g of industrially liquefied corn must, at 32% dry matter, pH 5.2; • the active dry yeast Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporated in 0.25 mg / ml of liquefied corn must, after being rehydrated for 30 min at 32 ° C. in a Tryptone Sel broth, to ensure an initial seeding of the order of 1.107 CFU yeasts / ml of must; • urea at 1 g / l of liquefied corn must; • glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) at 0.42 kg / t of maize, so as to saccharify liquefied corn must.

The SSF must thus constituted was stirred at 120 rpm. The temperature was kept constant throughout this step at 32 ° C. No pH maintenance was performed. The fermentation was conducted for a period of 52 hours.

Finally, the biocatalyst obtained in Example 1, produced from strain SCC027, was added at the beginning of fermentation at different concentrations. In comparison, the Lyvanol Acid® commercial protease (Lyven-Souletlet Biotechnologies) was added at the beginning of fermentation, at different concentrations, in order to guarantee the same contributions in protease activity (PAC) as with the biocatalyst produced with strain SCC027. . In the so-called "control" condition, no biocatalyst addition has been made. Each condition was applied in two separate vials (n = 2). Results

By following the evolution of the weight of each of the flasks, it is possible to determine the amount of CO 2 produced during the fermentation. Considered in the stoichiometric equation of the production of ethanol from glucose, the quantity of CO2 produced makes it possible to estimate the production of ethanol for each of the fermentations conducted in flasks. 1 mole glucose 2 moles of CO 2 + 2 moles of ethanol Thus, by comparing the production of ethanol after 52 hours of the so-called "control" fermentation compared to that of fermentations conducted in the presence of biocatalysts ("condition"), it is possible to calculate the ethanol gain:

Gain ethanol (%) = ([Ethanol] condiiion - [Ethanol], emoin) / [Ethanol] lemoin

Table 3: Ethanol gains obtained in flask at the end of 52 hours of SSF of a liquefied wort of industrial corn in the presence of the biocatalyst according to the invention produced with the strain SCC027 or commercial Lyvanol Acid® protease (Lyven - Soufflet Biotechnologies) to different doses of incorporation.

This example demonstrates the advantage of using the biocatalyst compared to that of a protease alone. As shown in Table 3, the ethanol gain potential follows a bell curve in both cases. It exceeds 1.5% with the use of the biocatalyst according to the invention while it is kept below the threshold of 1% with the use of the protease, even at high doses. An ethanol gain of 0.7% is achieved with the biocatalyst according to the invention for a contribution of protease activity of three to five times less than the necessary contribution of commercial protease for the same gain ethanol.

EXAMPLE 4 Use of the Biocatalyst According to the Invention in the Production of Ethanol from Corn Flour, in a Laboratory Fermenter

This example shows the beneficial effect of the biocatalyst according to the invention on the production of ethanol from corn flour, in particular on the final amount of ethanol produced and on the rate of ethanol production.

Material and methods

General description of the ethanol production process

The ethanol production process implemented comprises the following steps: the raw material, here industrial maize must, already liquefied, is directly subjected to a simultaneous saccharification-fermentation step. The yeast is rehydrated before being incorporated into the must for the simultaneous saccharification-fermentation step.

Production of ethanol in a vial The simultaneous saccharification-fermentation step (SSF) was carried out in fermentors, model Biostat A + (Sartorius). These are reactors with a capacity of 2.5 I, equipped at the outlet of a condenser and a gas meter, model Milli GasCounter MGC-10 (Ritter), for online monitoring of C02 production. . The SSF consisted of bringing together: • 2220 g of industrially liquefied corn must, at 32% dry matter, pH 5.3; • the active dry yeast Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporated in 0.25 g / l of liquefied corn must, after being rehydrated for 30 minutes at 32 ° C. in a Tryptone Sel broth, to ensure an initial seeding of the order of 1.107 CFU yeasts / ml of must; • urea at 1 g / l of liquefied corn must; • glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) at 0.42 kg / t of maize, so as to saccharify liquefied corn must.

The SSF must thus constituted was stirred at 350 rpm. The temperature was kept constant throughout this step at 32 ° C. No pH maintenance was performed. The fermentation was conducted for a period of 51 hours.

Finally, the biocatalyst obtained in Example 1, produced from strain SCC027, was added at the beginning of the SSF to 1.2 kg MSi / t of corn. In the so-called "control" condition, no biocatalyst addition has been made.

Each condition was applied in two separate bioreactors (n = 2). At the end of the SSF reaction samples are taken in duplicate and analyzed by HPLC-RI (Modular Waters Isocratic HPLC e1515, Ion Exclusion Wat010295 column) to measure the concentrations of ethanol, glycerol and residual sugars present in the medium. . Results

Figure 2 illustrates the significant effect of the use of the biocatalyst according to the invention on the rate of production of ethanol. Indeed, for the two fermenters in which the biocatalyst according to the invention was added at the beginning of fermentation, the CO 2 production rate is significantly increased compared to control fermenters. The maximum rate of C02 production in the presence of the biocatalyst according to the invention is 7.7 l / h while it is 6 l / h in the control condition. The maximum speed is measured after 12 h of SSF in the condition of addition of biocatalyst, and after 13 h in control condition.

The plateau of CO2 production is reached after 45 h of SSF in the condition of adding biocatalyst, while it has not been reached after 51 h of SSF in control condition.

Table 4: Ethanol and glycerol concentrations after 51 hours of SSF of a liquefied cornmeal, in the presence or in the absence of the SCC027 biocatalyst according to the invention incorporated in 1.2 kg MSi / t of maize.

Table 4 above confirms the significant effect of the implementation of the biocatalyst according to the invention on the production of ethanol after 51 hours of SSF. In fact, the ethanol assayed in the fermenters containing the biocatalyst is 6 to 8% higher relative to the ethanol assayed in the control fermenters after 51 hours of SSF, specifying that at this stage the reaction of SSF the witness is not completed and has not reached his asymptote.

In addition, the production of glycerol is significantly decreased in the presence of biocatalyst compared to the control. Indeed, after 51 hours of fermentation, the glycerol assay is lower by 16%. Glycerol is a by-product of ethanol. A lower production of glycerol indicates a modification of the utilization of glucose by the yeast and confirms the increase of the efficiency of conversion of glucose into ethanol by the yeast.

Example 5 Use of the Biocatalyst According to the Invention in the Production of Ethanol from Wheat Flour in a Vial

This example shows the beneficial effect of the biocatalyst according to the invention on the production of ethanol from starchy raw materials other than corn, in particular wheat flour, in particular on the quantity of ethanol produced and on the speed ethanol production.

Material and methods

General description of the ethanol production process

The ethanol production process implemented comprises the following steps: the raw material, here an industrial wheat flour, is liquefied before being subjected to a simultaneous saccharification-fermentation step. In parallel, the yeast is rehydrated before being incorporated into the liquefied must for the simultaneous saccharification-fermentation stage.

Production of liquefied wheat must The stage of liquefaction of the wheat mill makes it possible to hydrolyze the starch into dextrins. The principle is to mix the wheat flour with water and clear vinasse, and to heat the mixture in the presence of liquefying enzymes, so as to obtain a liquefied must. Thus, the must consists of 28% wheat flour, 6% clear vinasse and 66% water. This must was prepared in a 4 liter glass bioreactor (Cloup) at room temperature, with stirring at 250 rpm. The pH of the must was adjusted to 5.5 (by addition of NaOH) in order to optimize the action of the liquefying enzymes. Two liquefaction enzymes were used, namely alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) added to 0.15 kg / t of wheat and the hemicellulolytic complex unscrewing (Lyvanol Devisco Plus, Lyven-Soufflet Biotechnologies) added to 0 15 kg / t of wheat. The wort was first preredicated at 55 ° C for 30 min in the presence of the enzymes and then liquefied at 85 ° C for 1.5 h in the stirred reactor at 250 rpm. At the end of the liquefaction, the must was cooled to room temperature and adjusted to pH 4.5 (by addition of H2SO4).

Vial Ethanol Production The Simultaneous Saccharification-Fermentation (SSF) step was performed in baffled vials. These are 250 ml baffle vials, closed with carded cotton stoppers. The SSF consisted in bringing together: • 140 g of liquefied wheat must with 27.5% dry matter, pH 4.5; The active dry yeast Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporated in 0.25 mg / ml of liquefied wheat must, after being rehydrated for 30 minutes at 32 ° C. in a Tryptone Sel broth, to ensure an initial seeding of the order of 1.107 CFU yeasts / ml of must; • urea at 1 g / l of liquefied wheat must; • glucoamylase (Distillase CS, Genencor) at 0.29 kg / t of wheat, so as to saccharify the liquefied must of wheat.

The wort thus formed was stirred at 105 rpm. The temperature was kept constant throughout this step at 32 ° C. No pH maintenance was performed. The SSF was conducted for 48 hours.

Finally, the biocatalyst obtained in Example 1, produced from strain SCC027, was added at the beginning of fermentation to 3 kg MSi / t of wheat. In the so-called "control" condition, no biocatalyst addition has been made.

Each condition was applied in two separate vials (n = 2). Results

During the SSF reaction, samples were taken and analyzed by HPLC-R1 (Modular Waters Isocratic E1515 HPLC, Ion Exclusion Wat010295 column) to measure the concentrations of ethanol, glycerol and sugars present in the medium.

Table 5: Concentrations of ethanol and glucose after 24 h, 40 h and 48 h of SSF of a liquefied wort of wheat, in the presence or absence of the biocatalyst SCC027 incorporated at 3 kg MSi / t of wheat.

Table 5 demonstrates the beneficial effect of the implementation of the biocatalyst on ethanol production from wheat. Indeed, the production of ethanol after 48 hours of fermentation is significantly increased by 3.8%. The rate of ethanol production is also increased with significant differences in ethanol concentration at 24 and 40 hours of SSF, respectively 31% and 9%. The kinetic effect of the implementation of the biocatalyst in fermentation is also visible on the yeast glucose consumption rate. After 40 h of SSF, the concentration of glucose in the medium containing the biocatalyst is similar to the concentration measured in the control medium after 48 h of SSF, indicating an acceleration of the end of the reaction of about 8 h.

Example 6 Comparison of the Effect of the Biocatalyst According to the Invention Relative to Enzymatic Compositions Obtained with Other Aspergillus Strains

This example shows that the beneficial effect of the biocatalyst according to the invention on the production of ethanol from corn flour, in particular on the amount of ethanol produced, is not observed with other enzyme compositions obtained with other strains of Aspergillus tubingensis than strain SCC027 and its variants.

Material and methods

General description of the ethanol production process

The ethanol production process implemented comprises the following steps: the raw material, here maize, is packaged, pasted then liquefied before being subjected to a simultaneous saccharification-fermentation step. In parallel, the yeast is rehydrated before being incorporated into the must for the simultaneous saccharification-fermentation step.

Conditioning of the corn raw material

The whole maize has been conditioned to obtain a mill, that is, a flour. For this, the corn was milled using a hammer mill (Electra). The size of the grid used was set at 0.8 mm. The grind obtained has a moisture content of 10% (+/- 2%). In the form of flour, the raw material is stored away from light in a dry place at room temperature.

Production of liquefied corn must The stage of liquefaction of the corn mill makes it possible to hydrolyze the starch into dextrins. The principle is to constitute a mixture of corn flour, water and clear vinasse and to heat it in the presence of liquefying enzymes, so as to obtain a liquefied must. Thus, the must consists of 34% corn flour, 10% clear vinasse and 56% water. This must was prepared in a 4L bioreactor in double-jacketed glass (Cloup), at ambient temperature, with stirring between 250 and 350 rpm. After homogenization, the pH of the must was adjusted to 5.5 (by addition of H2SO4) in order to optimize the action of the liquefying enzymes. Alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) was added at 0.15 kg / t of corn. The wort was brought to 90 ° C and liquefied at this same temperature for 2h in the stirred reactor between 200 and 300 rpm. At the end of the liquefaction, the must was cooled to ambient temperature and adjusted to pH 5.3 (by addition of H2SO4).

Production of ethanol in a vial The step of saccharification-simultaneous fermentation (SSF) was done in baffled vials. These are 250 ml baffled flasks, sealed with hermetically sealed rubber stoppers, with a CO2 outlet per 1.2 mm diameter needle. The SSF consisted of bringing together: • 140 g of liquefied corn must with 30% dry matter, pH adjusted to 5.3; • dry yeast Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporated in 0.25 mg / ml of liquefied corn must, after being rehydrated for 30 min at 32 ° C. in a Tryptone Sel broth, to ensure an initial seeding of the order 1.107 CFU yeasts / ml of must; • urea at 1 g / l of liquefied corn must; • glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) at 0.42 kg / t of maize, so as to saccharify liquefied corn must.

The SSF must thus constituted was stirred at 120 rpm. The temperature was kept constant throughout this step at 32 ° C. No pH maintenance was performed. The fermentation was conducted for a period of 51 hours.

Finally, the biocatalyst obtained in Example 1, produced from strain SCC027, was added at the beginning of SSF at different concentrations. In comparison, other biocatalysts produced from the strains Aspergillus tubingensis B or Aspergillus tubingensis A were added at the beginning of SSF at different concentrations. In the so-called "control" condition, no biocatalyst addition has been made.

Each condition was applied in two separate vials (n = 2). Results

By following the evolution of the weight of each of the flasks, it is possible to determine the amount of CO 2 produced during the fermentation. Considered in the stoichiometric equation of the production of ethanol from glucose, the quantity of CO2 produced makes it possible to estimate the production of ethanol for each of the fermentations conducted in flasks. 1 mole glucose 2 moles of CO 2 + 2 moles of ethanol Thus, by comparing the production of ethanol after 51 hours of the so-called "control" fermentation compared with that conducted in the presence of a biocatalyst, it is possible to determine the ethanol gain.

Gain ethanol (%) = ([Ethanol] condition - [Ethanol] control) / [Ethanol] control

Table 6: Ethanol Gains Obtained in a Vial after 51 Hours of SSF of a Liquefied Corn Mash, in the Presence of the Biocatalyst According to the Invention Obtained with the SCC027 Strain or Other Biocatalysts Obtained with Strains of Aspergillus tubingensis A or B (those analyzed in Example 1), at different incorporation doses.

The beneficial effect of using the SCC027 biocatalyst on ethanol production is not found with the use of biocatalysts obtained by fermentations of other strains of Aspergillus tubingensis, as shown in Table 6. At the same doses of incorporation and at higher doses than SCC027, no biocatalyst produced with the other strains tested allowed significant ethanol gains to be obtained after 51 h of SSF.

EXAMPLE 7 Comparison of the Effect of the Biocatalyst According to the Invention Compared to Enzymes Purified from the SCC027 Strain

This example shows that the beneficial effect of the biocatalyst according to the invention on the production of ethanol from corn flour, in particular on the total amount of ethanol produced, results from the combination of numerous enzymes produced during the production process. fermentation in solid medium of the strain.

Material and methods

Process for purification of the enzymes of the biocatalyst SCC027 7 enzymes were purified from the biocatalyst obtained in Example 1: aspergillopepsin A, polygalacturonase C, endoxylanase A, endoglucanase, β-glucosidase, endoxylanase C and cellobiohydrolase (the latter two were obtained as a mixture).

Purification of these enzymes was performed after extraction of the biocatalyst in 0.02 M Histidine buffer pH 6.0 (1:10), centrifugation and filtration. Several separation techniques were combined: anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, size exclusion chromatography and ammonium sulfate precipitation were used during the purification process.

The anion exchange chromatography is performed on a manually mounted column of 50 ml of Sephadex Q FF gel (GE Healthcare).

Chromatography is done on an ATKTA prime plus at 4 ° C. The flow rate is 10 ml / min. The gradient used is a binary gradient. Buffer A is 0.02 M Histidine solution pH 6.0. Buffer B is a solution of 0.02 M Histidine pH 6.0 and 1.0 M sodium chloride. The collected fractions are 6 ml.

Hydrophobic interaction chromatography was performed on a Hiprep phenyl HP 16/10 column (GE Healthcare). Chromatography is done on an ATKTA prime plus at 20 ° C. The flow rate is 3 ml / min. The gradient used is a binary gradient. Buffer A is a solution of 0.02 M Histidine pH 6.0 and 1.0 M ammonium sulfate. Buffer B is 0.02 M Histidine solution pH 6.0. The collected fractions are 6 mL.

Size exclusion chromatography was performed on a 75 μg Hiload Superdex column 16 mm in diameter and 600 mm long from GE Healthcare (120 ml gel). Chromatography is carried out on an ATKA purify at 20 ° C. The mobile phase is a solution of 0.1 M ammonium acetate pH 5.0. The flow rate is 1 ml / min. The sample volume injected is 2 ml. The fractions collected are 2 ml.

The protein mixture is fractionated by ammonium sulfate precipitation in a cascade of 40%, 55%, 65% and 100% salt saturation. Ammonium sulphate is added gradually in the form of rain. The precipitation is carried out for 30 min with stirring in ice. The precipitated mixture is centrifuged at 5000 g for 15 min at 4 ° C. The supernatant volume is measured and a new addition of ammonium sulfate is made to reach the second salt saturation plateau. This mixture is again precipitated 30 min in the ice with stirring. These steps are repeated for the different levels.

General description of the ethanol production process

The ethanol production process implemented comprises the following steps: the raw material, here maize, is packaged, pasted then liquefied before being subjected to a simultaneous saccharification-fermentation step. In parallel, the yeast is rehydrated before being incorporated into the simultaneous saccharification-fermentation must.

Conditioning of the corn raw material

The whole maize has been conditioned to obtain a mill, that is, a flour. For this, the corn was milled using a hammer mill (Electra). The size of the grid used was set at 0.8 mm. The grind obtained has a moisture content of 10% (+/- 2%). In the form of flour, the raw material is stored away from light in a dry place at room temperature.

Production of liquefied corn must The stage of liquefaction of the corn mill makes it possible to hydrolyze the starch into dextrins. The principle is to constitute a mixture of corn flour, water and clear vinasse and to heat it in the presence of liquefying enzymes, so as to obtain a liquefied must. Thus, the must consists of 34% corn flour, 10% clear vinasse and 56% water. This must was prepared in a 4L bioreactor in double-jacketed glass (Cloup), at ambient temperature, with stirring between 250 and 350 rpm. After homogenization, the pH of the must was adjusted to 5.5 (by addition of H2SO4) in order to optimize the action of the liquefying enzymes. Alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) was added at 0.15 kg / t of corn. The wort was brought to 90 ° C and liquefied at this same temperature for 2h in the stirred reactor between 200 and 300 rpm. At the end of the liquefaction, the must was cooled to ambient temperature and adjusted to pH 5.3 (by addition of H2SO4).

Vial Ethanol Production The Simultaneous Saccharification-Fermentation (SSF) step was performed in baffled vials. These are 250 ml baffled flasks, sealed with hermetically sealed rubber stoppers, with a CO2 outlet per 1.2 mm diameter needle. The SSF consisted of bringing together: • 140 g of liquefied corn must with 30% dry matter, pH 5.3; • dry yeast Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporated in 0.25 mg / ml of liquefied corn must, after being rehydrated for 30 min at 32 ° C. in a Tryptone Sel broth, to ensure an initial seeding of the order 1.107 CFU yeasts / ml of must; • urea at 1 g / l of liquefied corn must; • glucoamylase (Spirizyme Excel XFIS, Novozymes) at 0.42 kg / t of maize, so as to saccharify liquefied corn must.

The SSF must thus constituted was stirred at 120 rpm. The temperature was kept constant throughout this step at 32 ° C. No pH maintenance was performed. The fermentation was conducted for a period of 51 hours.

Finally, the biocatalyst obtained in Example 1, produced from strain SCC027, was added at the beginning of the SSF to 1.2 kg MSi / t of corn. In comparison, one or more fractions of purified enzymes of strain SCC027 was or were added at the beginning of SSF, so as to guarantee the same levels of contributions in enzymatic activity (s) that with the biocatalyst obtained with strain SCC027. In the so-called "control" condition, no biocatalyst addition has been made. Results

By following the evolution of the weight of each of the flasks, it is possible to determine the amount of CO 2 produced during the fermentation. Considered in the stoichiometric equation of the production of ethanol from glucose, the quantity of CO2 produced makes it possible to estimate the production of ethanol for each of the fermentations conducted in flasks. 1 mole glucose 2 moles of CO 2 + 2 moles of ethanol Thus, by comparing the ethanol production at the end of the 51 h of the so-called "control" fermentation compared with that carried out in the presence of a biocatalyst, it is possible to determine the gain ethanol.

Gain ethanol (%) = ([Ethanol] condition - [Ethanol] lemoin) / [Ethanol] lemoin

As shown in Figure 3, the inventors have thus determined that with a mixture of aspergillopepsin A, endoglucanase and β-glucosidase A, it was possible to increase the production of ethanol by 1.2% or 80%. % of the ethanol gain obtained with the crude biocatalyst. It should be noted that a mixture of aspergillopepsin A and β-glucosidase A makes it possible to reach 70% of the ethanol gain obtained with the biocatalyst, which represents the best combination of 2 enzymes among the tested enzymes produced by strain SCC027. , whereas this combination does not correspond to the combination of the two enzymes mainly produced by this strain.

The mixture of 7 enzymes among the 70 identified biocatalyst enzymes (aspergillopepsin A, polygalacturonase C, endoxylanase A, endoglucanase, β-glucosidase A, endoxylanase C and cellobiohydrolase) makes it possible to increase the production of ethanol at 51 hrs SSF. to achieve nearly 90% of the gain in ethanol obtained with the crude biocatalyst. The optimal effect measured with the biocatalyst obtained according to the process of the invention with strain SCC027 is due to the combination of the multiple enzymes produced, including the 7 enzymes purified from the biocatalyst according to the invention.

Claims (10)

REVENDICATIONS 1. Souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 déposée le 1er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961.1. Aspergillus tubingensis strain SCC027 deposited on 1 February 2016 with Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, the Netherlands) under number CBS 136961. 2. Variant naturel de la souche d'Aspergillus tubingensis telle que définie dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il produit, par fermentation en milieu solide sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, un biocatalyseur qui, lorsqu'il est ajouté dans le milieu de saccharification-fermentation simultanées d'un procédé de fabrication d'éthanol à partir de farine de maïs, induit un Gain Ethanol au moins égal à celui obtenu dans les mêmes conditions avec un biocatalyseur produit par fermentation en milieu solide de la souche d‘Aspergillus tubingensis SCC027 sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza.2. Natural variant of the strain of Aspergillus tubingensis as defined in claim 1, characterized in that it produces, by fermentation in a solid medium on a substrate comprising a mixture of wheat bran and rapeseed meal, a biocatalyst which, when added to the simultaneous saccharification-fermentation medium of a process for producing ethanol from corn flour, induces an Ethanol Gain at least equal to that obtained under the same conditions with a biocatalyst produced by solid-state fermentation of the strain Aspergillus tubingensis SCC027 on a substrate comprising a mixture of wheat bran and rapeseed cake. 3. Procédé de fabrication d'un biocatalyseur pour fabrication d’éthanol à partir de matière première amylacée, comprenant les étapes suivantes : a) fournir un substrat, b) ensemencer le substrat fourni à l'étape a) avec la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 selon la revendication 1 ou un variant naturel de celle-ci selon la revendication 2, et c) fermenter par fermentation en milieu solide ledit substrat avec la souche dans des conditions appropriées pour permettre la production simultanée par la souche d'une activité protéase, d'une activité cellulase et d'une activité β-glucosidase.3. A process for manufacturing a biocatalyst for making ethanol from starchy raw material, comprising the following steps: a) providing a substrate, b) seeding the substrate provided in step a) with the Aspergillus strain tubingensis SCC027 according to claim 1 or a natural variant thereof according to claim 2, and c) fermentation by fermentation in a solid medium said substrate with the strain under appropriate conditions to allow simultaneous production by the strain of a protease activity , cellulase activity and β-glucosidase activity. 4. Procédé de fabrication selon la revendication 3, dans lequel le substrat est sélectionné dans le groupe constitué de son de blé, de tourteau de colza, de tourteau de soja, de pulpe de betterave, de radicelle d'orge, de drêches éthanolières de maïs, de drêches éthanolières de blé et des mélanges de ceux-ci.The manufacturing method according to claim 3, wherein the substrate is selected from the group consisting of wheat bran, rapeseed meal, soybean meal, beet pulp, barley rootlet, ethanol beans. corn, ethanol grains and mixtures thereof. 5. Biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, présentant au moins une activité protéase fongique, une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, et une activité β-glucosidase, obtenu par le procédé selon la revendication 3 ou 4.5. A biocatalyst for producing ethanol from starchy feedstock, having at least one fungal protease activity, a cellulase activity which is not a β-glucosidase activity, and a β-glucosidase activity obtained by the process according to claim 3 or 4. 6. Biocatalyseur selon la revendication 5, comprenant au moins une aspergillopepsine A une endoglucanase et une β-glucosidase A.6. Biocatalyst according to claim 5, comprising at least one aspergillopepsin A endoglucanase and β-glucosidase A. 7. Utilisation du biocatalyseur selon la revendication 5 ou 6, pour la fabrication, par fermentation de matière première amylacée, d'éthanol.7. Use of the biocatalyst according to claim 5 or 6, for the manufacture, by fermentation of starchy feedstock, of ethanol. 8. Utilisation selon la revendication 7, dans laquelle la matière première amylacée est du maïs.8. Use according to claim 7, wherein the starchy raw material is maize. 9. Procédé de fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée comprenant une étape de fermentation de la matière première amylacée par une levure en présence du biocatalyseur selon la revendication 5 ou 6.9. A process for producing ethanol from starchy raw material comprising a step of fermenting the starchy raw material with a yeast in the presence of the biocatalyst according to claim 5 or 6. 10. Procédé de fabrication d'éthanol selon la revendication 9, comprenant les étapes suivantes: A) une étape de mélange d'une mouture de la matière première amylacée avec de l'eau, et optionnellement des vinasses clarifiées, B) optionnellement une étape de cuisson du mélange préparé à l'étape A), C) optionnellement une étape de pré-liquéfaction de l'amidon dudit mélange, D) une étape de liquéfaction de l'amidon, en présence d'enzymes de liquéfaction de l'amidon, permettant d’hydrolyser l'amidon en dextrines, E) optionnellement une étape de propagation de levures, et F) une étape de saccharification-fermentation simultanées des dextrines et/ou des sucres fermentescibles, en présence du biocatalyseur selon la revendication 5 ou 6, d'enzymes de saccharification des dextrines et de levures, éventuellement propagées à l'étape E), de manière à produire de l'éthanol.10. A method of manufacturing ethanol according to claim 9, comprising the following steps: A) a step of mixing a grinding of the starchy raw material with water, and optionally clarified vinasses, B) optionally a step cooking the mixture prepared in step A), C) optionally a step of pre-liquefaction of the starch of said mixture, D) a liquefaction step of the starch, in the presence of starch liquefying enzymes , for hydrolyzing the starch into dextrins, E) optionally a yeast propagation step, and F) a simultaneous saccharification-fermentation step of the dextrins and / or fermentable sugars, in the presence of the biocatalyst according to claim 5 or 6 of saccharification enzymes of dextrins and yeasts, possibly propagated in step E), so as to produce ethanol.