FR3034992A1

FR3034992A1 - EX VIVO AUTOLOGUE PLASMATIC MEDIA PLASMINE RICH AND PROCESS FOR OBTAINING THE SAME

Info

Publication number: FR3034992A1
Application number: FR1553344A
Authority: FR
Inventors: Gerard Reboul
Original assignee: Arcadophta
Current assignee: Arcadophta
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2016-10-21
Also published as: WO2016166485A1

Abstract

L'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, caractérisé en ce que : - il présente une activité enzymatique, dite activité plasmine, telle que mesurée par un test de libération de para-nitro-aniline supérieure à 0,1 µmole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, - il comprend une proportion de protéine hétérologue inférieure à 600 µg par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, ledit test de libération consistant à : ○ mélanger dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine maintenu à la température de 37°C un substrat chromogène S-2251 à une concentration initiale dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine de l'ordre de 1 mM, puis ; ○ évaluer la vitesse initiale de libération de para-nitro-aniline par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine suite au mélange.The invention relates to an autologous plasmin-rich ex vivo plasma medium, characterized in that: it has an enzymatic activity, called plasmin activity, as measured by a para-nitroaniline release test greater than 0.1 μmol of para-nitroaniline released per minute and per milliliter (mL) of plasmin-rich autologous plasmatic ex vivo plasma medium, - it comprises a proportion of heterologous protein of less than 600 μg per milliliter (mL) of autologous ex vivo plasma medium rich in plasmin, said release test consisting in: ○ mixing in the plasma plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium maintained at a temperature of 37 ° C. an S-2251 chromogenic substrate at an initial concentration in the plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium of the order of 1 mM, then; ○ to evaluate the initial rate of release of para-nitroaniline per minute and per milliliter (mL) of plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium following mixing.

Description

1 MILIEU PLASMATIQUE EX VIVO AUTOLOGUE RICHE EN PLASMINE ET PROCÉDÉ D'OBTENTION L'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine pour son utilisation à titre de médicament et un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine pour son utilisation à titre de médicament pour le traitement de traction vitréo-maculaire en ophtalmologie. L'invention concerne aussi un procédé d'obtention d'un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine.The invention relates to an autologous plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium, such an autologous plasmin-rich autologous plasmatic medium for use as a medicament and a plasma medium of this kind. BACKGROUND OF THE INVENTION ex vivo plasmin-rich autolog for its use as a drug for the treatment of vitreo-macular traction in ophthalmology. The invention also relates to a process for obtaining such an autologous plasmin-rich autologous plasma medium.

Le traitement de trous maculaires en ophtalmologie résultant de contraintes par tractions tangentielles différentielles survenant entre le corps vitré et la rétine, nécessitent de libérer la rétine de ces contraintes. Des traitements connus sont principalement de nature chirurgicale et visent à séparer mécaniquement la rétine et le corps vitré.The treatment of macular holes in ophthalmology resulting from differential tangential traction constraints occurring between the vitreous body and the retina, requires releasing the retina from these constraints. Known treatments are mainly of a surgical nature and aim to mechanically separate the retina and the vitreous body.

On connaît en particulier (WO 2004/052228) une composition comprenant une forme tronquée d'une plasmine comprenant un domaine catalytique de la plasmine et l'utilisation d'une telle plasmine tronquée dans une méthode de traitement ou de prévention d'un trouble visuel. Une telle plasmine tronquée est une plasmine recombinante et ne peut pas être une protéine autologue.In particular (WO 2004/052228) a composition comprising a truncated form of a plasmin comprising a catalytic domain of plasmin and the use of such truncated plasmin in a method for treating or preventing a visual disorder is known (WO 2004/052228). . Such truncated plasmin is a recombinant plasmin and can not be an autologous protein.

En outre, une telle plasmine recombinante est complexe dans sa fabrication. Son coût est élevé, de sorte que des solutions alternatives à l'utilisation d'une plasmine recombinante dans une méthode de traitement thérapeutique sont recherchées, avec lesquelles par ailleurs, les risques inflammatoires seraient minimisés.In addition, such a recombinant plasmin is complex in its manufacture. Its cost is high, so that alternative solutions to the use of a recombinant plasmin in a therapeutic treatment method are sought, with which, moreover, the inflammatory risks would be minimized.

On connait aussi de WO 2010/125148 une composition de traitement ophtalmique obtenue par addition d'urokinase à un milieu plasmatique aux fins de conversion de plasminogène d'un plasma sanguin en plasmine. Un traitement ophtalmique mettant en oeuvre une telle composition provoque une réaction immunitaire chez le patient et décrit l'utilisation de dexaméthasone à titre de composé anti-inflammatoire. Une alternative à l'utilisation d'une telle composition est proposée par l'invention.Also known from WO 2010/125148 is an ophthalmic treatment composition obtained by adding urokinase to a plasma medium for the purpose of plasminogen conversion from a blood plasma to plasmin. Ophthalmic treatment employing such a composition elicits an immune response in the patient and describes the use of dexamethasone as an anti-inflammatory compound. An alternative to the use of such a composition is provided by the invention.

3034992 2 L'invention vise donc à pallier à l'ensemble de ces problèmes. Pour ce faire, l'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine caractérisé : - en ce qu'il comprend une proportion de protéine -notamment de 5 plasminogénase- hétérologue inférieure à 600 iug par millilitre (mL) de milieu plasmatique, - en ce qu'il présente une activité enzymatique, dite activité plasmine, telle que mesurée par un test de libération de para-nitro-aniline, supérieure à 0,1 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de 10 milieu plasmatique, ledit test de libération consistant à : o mélanger dans le milieu plasmatique maintenu à la température de 37°C un substrat chromogène S-2251 de formule (I) ci-après : NO2 15 à une concentration initiale de l'ordre de 1 mM dans le milieu plasmatique, o évaluer suite au mélange une vitesse initiale de libération de paranitro-aniline (en iumole de de para-nitro-aniline) par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Dans tout le texte, on adopte la terminologie suivante : 20 - l'expression « milieu plasmatique sanguin » désigne tout milieu liquide sensiblement exempt de cellules sanguines résultant directement d'une centrifugation de sang -notamment de sang humain- liquide non coagulé, dans des conditions adaptées pour permettre une séparation des cellules sanguines (hématies, leucocytes, plaquettes) et du milieu plasmatique sanguin ; 25 - le terme « plasminogénase » désigne toute enzyme présentant une activité enzymatique de conversion de plasminogène en plasmine par clivage d'une liaison peptidique du plasminogène ; 3034992 3 - l'expression « au moins sensiblement » indique, de façon habituelle, qu'une caractéristique structurelle -telle qu'une valeur- ou fonctionnelle, ne doit pas être prise comme marquant une discontinuité abrupte, qui n'aurait pas de sens physique, mais couvre non seulement cette structure ou cette fonction, mais 5 également des variations légères de cette structure ou de cette fonction qui produisent, dans le contexte technique considéré, un effet de même nature, sinon de même degré ; - le terme « hétérologue » qualifie une substance biologique provenant d'un tiers organisme vivant et susceptible d'être reconnue par le système 10 immunitaire d'un patient comme étant un corps étranger de nature à déclencher une réaction immunitaire. Cette définition s'étend à un milieu plasmatique « hétérologue », c'est-à-dire un milieu plasmatique comprenant au moins un composé susceptible d'être reconnu par le système immunitaire d'un patient comme étant un corps étranger de nature à déclencher une réaction immunitaire chez ledit 15 patient ; - le terme « autologue » qualifie un composé et s'étend à une composition, notamment à un milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, obtenu à partir d'un milieu plasmatique sanguin prélevé chez un patient unique, sensiblement exempt(e) de matière biologique issue d'un tiers organisme et 20 susceptible d'être administré(e) à ce même patient -notamment par voie intraveineuse- sans induire de réaction immunitaire et/ou inflammatoire significative chez ce patient. Un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est obtenu à partir du sang d'un patient unique et est propre et destiné au traitement exclusif de ce patient unique.The invention therefore aims to overcome all these problems. To this end, the invention relates to an autologous plasmin-rich autologous plasma medium characterized in that it comprises a proportion of heterologous plasminogenase protein-less than 600 μg per milliliter (ml) of plasmatic medium, in that it exhibits an enzymatic activity, called plasmin activity, as measured by a para-nitroaniline release test, greater than 0.1 iumole of para-nitroaniline released per minute and per milliliter (mL ) of plasma medium, said release test consisting in: mixing in the plasma medium maintained at the temperature of 37 ° C an S-2251 chromogenic substrate of formula (I) below: NO2 at an initial concentration of order of 1 mM in the plasma medium, o evaluate after mixing an initial rate of release of paranitroaniline (in iumole of para-nitroaniline) per minute and per milliliter (mL) of rich autologous ex vivo plasma medium.in plasmin. Throughout the text, the following terminology is used: "Blood Plasma Medium" refers to any liquid medium substantially free of blood cells directly resulting from centrifugation of blood-particularly unconcagulated human-liquid blood, in conditions adapted to allow separation of blood cells (red blood cells, leukocytes, platelets) and blood plasma medium; The term "plasminogenase" refers to any enzyme having an enzymatic activity for converting plasminogen to plasmin by cleaving a peptide bond of plasminogen; 3034992 3 - the expression "at least substantially" indicates, in the usual way, that a structural characteristic - such as a value - or functional value, should not be taken as marking an abrupt discontinuity, which would not make sense physical, but covers not only this structure or function, but also slight variations of this structure or function which produce, in the technical context considered, an effect of the same nature, if not of the same degree; the term "heterologous" describes a biological substance originating from a living third organism and capable of being recognized by the immune system of a patient as being a foreign body capable of triggering an immune reaction. This definition extends to a "heterologous" plasma medium, that is to say a plasma medium comprising at least one compound capable of being recognized by the immune system of a patient as being a foreign body of a nature to trigger an immune reaction in said patient; the term "autologous" qualifies a compound and extends to a composition, in particular to a plasmin-rich ex vivo plasma medium, obtained from a plasma blood medium taken from a single patient, substantially free of material A third organism-derived biologic may be administered to the same patient, particularly intravenously, without inducing a significant immune and / or inflammatory reaction in this patient. An autologous plasmin rich ex vivo plasma medium is obtained from the blood of a single patient and is clean and intended for the exclusive treatment of this unique patient.

25 L'invention concerne un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, c'est-à-dire un milieu plasmatique extrait du corps humain ou animal, qui est autologue, c'est-à-dire qui est obtenu à partir d'un milieu plasmatique sanguin d'un individu unique et administré au même individu sans apport irréversible de composé hétérologue dans le milieu plasmatique sanguin ex 30 vivo autologue riche en plasmine. Le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement exempt de substance -notamment de substance 3034992 4 biologique- hétérologue. Le milieu plasmatique ex vivo autologue est riche en plasmine, c'est-à-dire dont l'activité plasmine est supérieure à un niveau basal d'activité plasmine du milieu plasmatique sanguin à partir duquel a été obtenu le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine.The invention relates to an autologous plasmin rich ex vivo plasma medium, ie a plasma medium extracted from the human or animal body, which is autologous, i.e., which is obtained from a plasma plasmatic medium of a single individual and administered to the same individual without irreversible supply of heterologous compound in the autologous plasmoly-rich autologous plasma blood medium. The plasmin-rich autologous ex vivo plasmatic medium is substantially free of substance-especially biological-heterologous substance. The autologous ex vivo plasma medium is rich in plasmin, ie whose plasmin activity is greater than a basal level of plasmin activity of the plasma blood medium from which the rich autologous ex vivo plasma medium has been obtained. in plasmin.

5 Le substrat chromogène S-2251 est un tri-peptide de formule H-D-Val-Leu-Lys-pNA-2HCf et distribué par Chromogenix, Werfen France, Le Pré Saint Gervais, FRANCE. Avantageusement et selon l'invention, l'activité plasmine est comprise entre 0,1 et 0,5 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par 10 millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon l'invention, l'activité plasmine est de l'ordre de 0,2 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique 15 ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement -notamment totalement-exempt de cellules sanguines. Avantageusement et selon une variante de l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement exempt de tout composé anti-inflammatoire tel que, par exemple, la dexaméthasone.The S-2251 chromogenic substrate is a tri-peptide of the formula H-D-Val-Leu-Lys-pNA-2HCf and distributed by Chromogenix, Werfen France, Pre Saint Gervais, FRANCE. Advantageously and according to the invention, the plasmin activity is between 0.1 and 0.5 iumole of para-nitroaniline released per minute and per milliliter (ml) of plasmoly-rich autologous ex vivo plasma medium. Advantageously and according to the invention, the plasmin activity is of the order of 0.2 iumole of para-nitroaniline released per minute and per milliliter (mL) of plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium. Advantageously and according to the invention, the plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium is substantially completely free of blood cells. Advantageously and according to one variant of the invention, the plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium is substantially free of any anti-inflammatory compound such as, for example, dexamethasone.

20 Le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention se distingue : - du sang au moins par le fait qu'il est exempt de cellules sanguines, en particulier de cellules sanguines fonctionnelles ; - d'un plasma sanguin in vivo par le fait qu'il est exempt de cellules 25 sanguines, en particulier de cellules sanguines fonctionnelles ; - d'un plasma sanguin ex vivo au moins par le fait qu'il est riche en plasmine, et ; - du plasma sanguin riche en plasmine de WO 2010/125148 au moins par le fait qu'il est sensiblement exempte de plasminogénase hétérologue.The plasmin-rich autologous ex vivo plasmatic medium according to the invention is distinguished from: at least one blood in that it is free of blood cells, in particular functional blood cells; a blood plasma in vivo in that it is free of blood cells, in particular of functional blood cells; a blood plasma ex vivo at least by the fact that it is rich in plasmin, and; - Plasmin rich blood plasma of WO 2010/125148 at least in that it is substantially free of heterologous plasminogenase.

30 Selon l'invention, on détermine l'activité plasmine du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par mesure de la vitesse initiale 3034992 5 d'hydrolyse à 37°C du substrat chromogène S-2251 et d'apparition de la para-nitroaniline dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par une méthode dans laquelle : - dans une cuvette de mesure d'un spectrophotomètre, on mélange à 5 37°C un volume -notamment 0,4 mL- de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine préalablement dilué 10 fois dans un tampon salin aqueux et un même volume d'une solution de substrat chromogène S-2251 dans l'eau ultra-pure à une concentration de 2 mM de façon à former un milieu de mesure dans lequel la concentration initiale en substrat chromogène S-2251 est de 1 mM, puis ; 10 - à compter du mélange, on mesure et on enregistre (par exemple en continu) l'absorbance (ou densité optique, DO) à 405 nm du milieu de mesure maintenu à la température de 37°C, et ; - à partir de cet enregistrement, on évalue la vitesse initiale Vi de la réaction exprimée en A -abs / min, et on calcule l'activité plasmine -exprimée en 15 U/mL de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine- selon la formule (II) ci-après : Vi * Vm *no Activité plasmine = s*L*Vp ' dans laquelle : - Vi est la vitesse initiale -ou la dérivée première à l'origine, ou la pente 20 à l'origine- exprimée en Aabs / Mill ; - Vm est le volume (en mL) total du milieu de mesure ; - c est le coefficient d'extinction moléculaire de la para-nitro-aniline à 405 nm (10 000 M-1.cm-1) ; - L est la longueur (en cm) du trajet optique de la cuve de mesure 25 spectrophotométrique, et ; - Vp est le volume (en mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine introduit dans la cuve de mesure spectrophotométrique. Le cas échéant, on mesure à titre de contrôle l'activité plasmine basale d'un milieu plasmatique sanguin non enrichi en plasmine en 30 remplaçant dans le protocole ci-dessus le milieu plasmatique ex vivo autologue riche (II) 3034992 6 en plasmine par le même volume de milieu plasmatique sanguin duquel est issu le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. On déduit de la valeur d'activité plasmine du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine la valeur d'activité plasmine basale ainsi calculée.According to the invention, the plasmin activity of the plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium is determined by measuring the initial hydrolysis rate at 37.degree. C. of the S-2251 chromogenic substrate and the appearance of the nitroaniline in autologous plasmin-rich autologous plasma medium by a method in which: in a measuring cup of a spectrophotometer, a volume (especially 0.4 ml) of autologous ex vivo plasma medium is mixed at 37.degree. rich in plasmin previously diluted 10 times in aqueous saline buffer and the same volume of a chromogenic substrate solution S-2251 in ultrapure water at a concentration of 2 mM so as to form a measuring medium in which the initial concentration of S-2251 chromogenic substrate is 1 mM, then; From the mixture, the absorbance (or optical density, OD) at 405 nm of the measuring medium maintained at a temperature of 37 ° C. is measured and recorded (for example continuously); from this record, the initial rate Vi of the reaction expressed in A-abs / min is evaluated, and the plasmin activity expressed in 15 U / ml of plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium is calculated according to the formula (II) below: Vi * Vm * no plasmin activity = s * L * Vp 'in which: - Vi is the initial velocity -or the first derivative at the origin, or the slope 20 at the origin- expressed in Aabs / Mill; - Vm is the total volume (in mL) of the measuring medium; - c is the molecular extinction coefficient of para-nitroaniline at 405 nm (10,000 M-1.cm-1); L is the length (in cm) of the optical path of the spectrophotometric measuring vessel, and; - Vp is the volume (in mL) of plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium introduced into the spectrophotometric measuring cell. If desired, the basal plasmin activity of a non-plasmin enriched plasma plasma medium is monitored by replacing in the above protocol the autologous rich plasma ex vivo plasmid (II) medium by the same volume of plasma plasmatic medium from which the ex vivo plasmin-rich autologous plasma medium is derived. The plasmin activity value of the plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium is deduced from the calculated basal plasmin activity value.

5 Avantageusement et selon l'invention, la proportion de protéine -notamment de plasminogénase- hétérologue est inférieure à 400 iLt.g -notamment inférieure à 200 iug, de préférence inférieure à 100 iug, en particulier inférieure à 50 iug, plus préférentiellement inférieure à 25 iug- par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon 10 l'invention, la proportion de protéine -notamment de plasminogénase- hétérologue est inférieure à 10 µg/mL -en particulier inférieure à 5 µg/mL, de préférence inférieure à 2 µg/mL- de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Cette proportion de protéine hétérologue dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est adaptée pour limiter au maximum -voire ne pas 15 induire- de réaction immunitaire et/ou inflammatoire chez le patient donneur du milieu plasmatique sanguin et receveur du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est au moins sensiblement exempt de tout 20 germe microbien, en particulier de tout germe microbien pathogène. Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est stérile. On détermine le caractère stérile du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par tout moyen approprié de diagnostic microbiolo gigue.Advantageously and according to the invention, the proportion of protein-in particular heterologous plasminogenase is less than 400 μg, in particular less than 200 μg, preferably less than 100 μg, in particular less than 50 μg, more preferably less than 100 μg. 25 μg / ml (mL) of plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium. Advantageously and according to the invention, the proportion of protein-in particular of heterologous plasminogenase is less than 10 μg / ml-in particular less than 5 μg / ml, preferably less than 2 μg / ml of autologous ex vivo plasma medium. rich in plasmin. This proportion of heterologous protein in the plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium is adapted to limit as much as possible - not to induce - immune and / or inflammatory reaction in the donor patient of the plasma plasma medium and recipient of the ex vivo plasma medium. autologous rich in plasmin. Advantageously and according to the invention, the plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium is at least substantially free of any microbial germ, in particular of any pathogenic microbial germ. Advantageously and according to the invention, the plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium is sterile. The sterile nature of the plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium is determined by any suitable microbiological diagnostic means.

25 Avantageusement et selon l'invention, le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine est sensiblement apyrogène. On valide les conditions d'obtention d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine apyrogène par la mesure de la température corporelle d'un lapin ayant reçu une injection de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu à partir 30 d'une quantité de milieu plasmatique sanguin dudit lapin. L'absence d'augmentation de la température corporelle du lapin suite à l'injection traduit le 3034992 7 caractère apyrogène du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et valide les conditions de son obtention. L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention, pour son utilisation à titre de 5 médicament. L'invention vise donc toute indication thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention à titre de médicament. L'invention vise la première indication thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention. L'invention vise aussi toute deuxième indication 10 thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention comme médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale. L'invention vise aussi toute deuxième indication thérapeutique d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention comme médicament lors d'une intervention 15 chirurgicale intra-vitréenne d'un traitement en ophtalmologie. L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale.Advantageously and according to the invention, the plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium is substantially pyrogen-free. The conditions for obtaining a pyrogen-free autologous plasmin ex vivo plasma medium are validated by measuring the body temperature of a rabbit injected with plasmin-rich autologous plasmatic ex vivo plasma medium obtained from a amount of plasma plasma medium of said rabbit. The absence of an increase in body temperature of the rabbit following the injection reflects the pyrogen-free ex vivo plasmatic environment ex vivo rich in plasmin and validates the conditions for obtaining it. The invention also extends to an autologous plasma-rich autologous plasma ex vivo medium according to the invention for use as a medicament. The invention is therefore directed to any therapeutic indication of an autologous plasmin rich ex vivo plasma medium according to the invention as a medicament. The invention relates to the first therapeutic indication of an autologous ex vivo plasmin-rich plasma medium according to the invention. The invention is also directed to any second therapeutic indication of an autologous plasmin-rich autologous plasma medium according to the invention as a medicament in a therapeutic treatment of a cardiovascular pathology or during a surgical procedure. The invention is also directed to any second therapeutic indication of an autologous plasmin-rich autologous plasma medium according to the invention as a medicament during an intra-vitreous surgical procedure of a treatment in ophthalmology. The invention also extends to an autologous plasma-rich ex vivo plasma medium according to the invention for its use as a medicament in a therapeutic treatment of a cardiovascular pathology or during a surgical procedure.

20 L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique de traction vitréo-maculaire (TVM) en ophtalmologie. L'invention s'étend aussi à une composition thérapeutique 25 comprenant un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention et au moins un excipient en une quantité physiologiquement acceptable. L'invention s'étend aussi à une telle composition thérapeutique : - pour son utilisation comme médicament, 30 - pour son utilisation comme médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale, 3034992 8 - pour son utilisation comme médicament dans un traitement ophtalmologique, - pour son utilisation comme médicament dans un traitement d'une traction vitréo-maculaire (TVM), - pour son utilisation comme médicament dans un traitement ophtalmologique 5 en application oculaire intra-vitréenne par injection ou lors d'une intervention chirurgicale à l' oeil. L'invention s'étend aussi à un procédé de préparation d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'invention. L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un 10 milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, dans lequel : - on prépare un milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène à partir de sang d'un individu unique ; - on choisit une composition enzymatique comprenant au moins une enzyme, dite plasminogénase, de conversion en plasmine de plasminogène du 15 milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène, ladite plasminogénase étant liée à un support solide, insoluble en solution aqueuse ; - on met en contact la composition enzymatique et le milieu plasmatique sanguin pendant une durée et dans des conditions choisies pour permettre une conversion en plasmine de plasminogène du milieu plasmatique 20 sanguin et la formation d'un milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, puis ; - on réalise une séparation par filtration de la composition enzymatique et du milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, ladite séparation étant une séparation par filtration sur filtre présentant un seuil de coupure sensiblement égal à 0,22 ium et adaptée pour former le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en 25 plasmine exempt de composition enzymatique. Avantageusement et selon l'invention, pour préparer le milieu plasmatique sanguin, on procède à un prélèvement de sang du patient unique, puis à une séparation -notamment par centrifugation ou par fractionnement dans un procédé de micro-fluidique- du milieu plasmatique sanguin et des cellules sanguines 30 (plaquettes, hématies et leucocytes) dans des conditions aptes à empêcher la coagulation du sang. On réalise un tel prélèvement sanguin, par exemple en utilisant 3034992 9 un tube de prélèvement de type Vacutainer® (BD Diagnostics, Le Pont de Claix, France) comprenant un anticoagulant du type EDTA ou citrate de sodium. On procède ensuite à la séparation On réalise une étape de séparation du milieu plasmatique sanguin et des cellules sanguines (plaquettes, hématies et leucocytes) 5 par centrifugation à 4000 rpm pendant 15 min. On prélève le milieu plasmatique sanguin surnageant, par exemple par aspiration. Avantageusement et selon l'invention, au moins une plasminogénase -notamment chaque plasminogénase- est choisie dans le groupe formé des endopeptidases à sérine -notamment des endopeptidases à activité 10 antithrombotiques- de la classe EC 3.4.21 de la classification des enzymes. Avantageusement et selon l'invention, au moins une plasminogénase -notamment chaque plasminogénase- est choisie dans le groupe formé d'une urokinase, d'une streptokinase, d'une nattokinase et d'un activateur tissulaire du plasminogène (t-PA). Avantageusement et selon l'invention, au moins une plasminogénase est 15 l'urokinase U0633 (Sigma-Aldrich, Lyon, France). Avantageusement et selon l'invention, ladite au moins une plasminogénase est liée par au moins une liaison stable au support solide lorsque la composition enzymatique est immergée dans le milieu plasmatique sanguin. Avantageusement et selon l'invention, au moins une liaison 20 stable est choisie pour résister à une mise en contact avec une solution saline aqueuse de haute force ionique, notamment avec une solution aqueuse de NaCI 0,5 M. Avantageusement et selon l'invention, la composition enzymatique est formée d'une plasminogénase immobilisée sur un support solide 25 par une liaison stable choisie dans le groupe formé d'une liaison covalente, d'une liaison ionique, d'une liaison covalente de coordination (ou liaison dative) et d'une interaction hydrophobe de type van der Waals. Une telle liaison est qualifiée de liaison stable lorsqu'elle ne permet pas sensiblement de libération de plasminogénase dans le milieu plasmatique sanguin dans lequel la composition 30 enzymatique est immergée à 37°C pendant la conversion en plasmine de plasminogène du milieu plasmatique sanguin.The invention also extends to a plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium according to the invention for use as a medicament in a therapeutic vitreomacular traction therapy (TVM) in ophthalmology. The invention also extends to a therapeutic composition comprising a plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium according to the invention and at least one excipient in a physiologically acceptable amount. The invention also extends to such a therapeutic composition: for its use as a medicament, for its use as a medicament in a therapeutic treatment of a cardiovascular pathology or during a surgical procedure, for its use as a medicament for ophthalmic treatment, - for use as a medicament for treatment of vitreomacular traction (TVM), - for use as a medicament in ophthalmic treatment in intra-vitreous ocular injection application or when surgical intervention to the eye. The invention also extends to a process for the preparation of an autologous plasmin-rich autologous plasma medium according to the invention. The invention also relates to a method for preparing a plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium in which: - a plasma plasma medium comprising plasminogen from blood of a single individual is prepared; an enzymatic composition is chosen comprising at least one enzyme, referred to as plasminogenase, for converting plasminogen plasmin to the blood plasma medium comprising plasminogen, said plasminogenase being bound to a solid support, insoluble in aqueous solution; the enzymatic composition and the blood plasma medium are contacted for a time and under conditions selected to allow plasmin conversion of plasminogen of the blood plasma medium and the formation of a plasmin-rich ex vivo plasma medium, then; a separation is carried out by filtration of the enzymatic composition and of the plasma-rich ex vivo plasma medium, said separation being a filter filtration separation having a cut-off threshold substantially equal to 0.22 μm and adapted to form the plasma medium ex autologous rich in plasmin free of enzymatic composition. Advantageously and according to the invention, to prepare the blood plasma medium, blood is taken from the single patient and then separated - in particular by centrifugation or by fractionation in a microfluidic process - of the blood plasma medium and blood cells (platelets, red blood cells and leukocytes) under conditions capable of preventing blood clotting. Such a blood sample is made, for example by using a Vacutainer® sampling tube (BD Diagnostics, Le Pont de Claix, France) comprising an anticoagulant of the EDTA or sodium citrate type. The separation is then carried out. A separation step is carried out from the blood plasma medium and the blood cells (platelets, red blood cells and leucocytes) by centrifugation at 4000 rpm for 15 minutes. The supernatant blood plasma medium is removed, for example by aspiration. Advantageously and according to the invention, at least one plasminogenase-in particular each plasminogenase-is selected from the group consisting of serine endopeptidases-notably antithrombotic activity endopeptidases-of class EC 3.4.21 of the classification of enzymes. Advantageously and according to the invention, at least one plasminogenase - in particular each plasminogenase - is selected from the group consisting of a urokinase, a streptokinase, a nattokinase and a tissue plasminogen activator (t-PA). Advantageously and according to the invention, at least one plasminogenase is urokinase U0633 (Sigma-Aldrich, Lyon, France). Advantageously and according to the invention, said at least one plasminogenase is bound by at least one stable bond to the solid support when the enzymatic composition is immersed in the blood plasma medium. Advantageously and according to the invention, at least one stable bond is chosen to withstand contact with an aqueous salt solution of high ionic strength, in particular with an aqueous solution of 0.5M NaCl. Advantageously and according to the invention the enzymatic composition is formed of a solid-immobilized plasminogenase by a stable bond selected from the group consisting of a covalent bond, an ionic bond, a covalent coordination bond (or dative bond), and a hydrophobic interaction of van der Waals type. Such binding is termed a stable binding when it does not substantially allow release of plasminogenase into the blood plasma medium in which the enzyme composition is immersed at 37 ° C during conversion to plasmin plasminogen of the plasma blood medium.

3034992 10 Avantageusement et selon l'invention, ladite au moins une plasminogénase est liée au support solide par au moins une liaison covalente. Avantageusement et selon l'invention, le support solide de la composition enzymatique est choisi pour pouvoir être immergé dans le milieu 5 plasmatique sanguin et présente des dimensions adaptées pour permettre une séparation de la composition enzymatique et d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu par action de la composition enzymatique sur le milieu plasmatique sanguin. Avantageusement et selon l'invention, le support solide de la 10 composition enzymatique présente des dimensions adaptées pour permettre une séparation de la composition enzymatique et du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine sur un filtre présentant un seuil de coupure sensiblement égal à 0,22 ium. Avantageusement et selon l'invention, le support solide de la 15 composition enzymatique est à l'état divisé et formé de particules présentant trois dimensions s'étendant selon trois directions orthogonales entre elles, au moins deux des trois dimensions étant supérieures à 0,22 !am. Avantageusement et selon l'invention, le support solide est formé d'un matériau poreux présentant un diamètre moyen de pores compris entre 5 20 nm et 50 nm, de préférence compris entre 10 nm et 20 nm. Avantageusement et selon l'invention, le support solide -notamment le support solide à l'état divisé- est formé d'un matériau choisi dans le groupe formé des poly-glucosides et des polymères méthacrylates. Avantageusement, le support solide peut être formé des supports SEPABEADS® 25 EC-HFA/S et GE Healthcare Epoxy-activated SepharoseTM. Avantageusement, le support solide à l'état divisé est formé de particules sphériques de diamètre moyen compris entre 100 ium et 300 ium. Avantageusement et selon l'invention, on réalise la séparation du milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine et de la composition enzymatique 30 par filtration au moyen d'un filtre apte à retenir la composition enzymatique et à former le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et sensiblement 3034992 11 exempt de plasminogénase hétérologue. Avantageusement, la séparation du milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine et de la composition enzymatique est une séparation stérilisante et d'obtention du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et stérile.Advantageously and according to the invention, said at least one plasminogenase is bound to the solid support by at least one covalent bond. Advantageously and according to the invention, the solid support of the enzymatic composition is chosen so that it can be immersed in the blood plasma medium and has dimensions adapted to allow a separation of the enzymatic composition and an autologous ex vivo plasma medium rich in plasmin obtained by action of the enzymatic composition on the blood plasma medium. Advantageously and according to the invention, the solid support of the enzymatic composition has dimensions adapted to allow a separation of the enzymatic composition and plasmin-rich autologous plasma ex vivo medium on a filter having a cutoff threshold substantially equal to 0, 22 ium. Advantageously and according to the invention, the solid support of the enzymatic composition is in the divided state and formed of particles having three dimensions extending in three orthogonal directions to one another, at least two of the three dimensions being greater than 0.22. ! am. Advantageously and according to the invention, the solid support is formed of a porous material having an average pore diameter of between 5 nm and 50 nm, preferably between 10 nm and 20 nm. Advantageously and according to the invention, the solid support, in particular the solid support in the divided state, is formed from a material chosen from the group consisting of polyglucosides and methacrylate polymers. Advantageously, the solid support can be formed from SEPABEADS® EC-HFA / S and GE Healthcare Epoxy-activated Sepharose ™ supports. Advantageously, the solid support in the divided state is formed of spherical particles with a mean diameter of between 100 .mu.m and 300 .mu.m. Advantageously and according to the invention, the plasmin-rich ex vivo plasma medium is separated from the enzymatic composition by filtration by means of a filter able to retain the enzyme composition and to form the autologous ex vivo plasma medium rich in plasmin. plasmin and substantially free from heterologous plasminogenase. Advantageously, the separation of plasmin-rich ex vivo plasma medium and of the enzyme composition is a sterilizing separation and for obtaining autologous plasmin-rich and sterile ex vivo plasma medium.

5 Avantageusement et selon l'invention, le support solide est formé de particules présentant trois dimensions s'étendant selon trois directions orthogonales entre elles, au moins deux des trois dimensions étant supérieures à 0,22 ium. Avantageusement et selon l'invention, la durée de contact est 10 supérieure à 5 min, notamment comprise entre 5 min et 60 min. Avantageusement et selon l'invention, on met et on maintient en contact la composition enzymatique et le milieu plasmatique sanguin sous agitation et à la température de 37°C. Avantageusement et selon l'invention, on réalise au moins une 15 étape du procédé sous une hotte à flux laminaire. Avantageusement et selon l'invention, on réalise toutes les étapes sous une hotte à flux laminaire. Avantageusement et selon l'invention, on utilise une composition enzymatique stérile et on met le milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène en contact avec la composition enzymatique stérile 20 dans un récipient hermétiquement clos. On obtient un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine qui est stérile, sensiblement non immunogène et qui est notamment adapté pour pouvoir être utilisé en injection autologue dans le cadre de tout traitement préventif ou curatif d'une pathologie dans lequel une transformation de 25 plasminogénase en plasmine autologue est requise, par exemple dans le cadre du traitement d'une pathologie cardiovasculaire ou dans le cadre d'une intervention chirurgicale, en particulier lors d'une intervention intra-vitréale d'un traitement -notamment lors d'une intervention chirurgicale- de troubles vitréo-maculaires en ophtalmologie.Advantageously and according to the invention, the solid support is formed of particles having three dimensions extending in three directions orthogonal to each other, at least two of the three dimensions being greater than 0.22 .mu.m. Advantageously and according to the invention, the contact time is greater than 5 min, in particular between 5 min and 60 min. Advantageously and according to the invention, the enzymatic composition and the blood plasma medium are placed in contact and maintained under agitation at a temperature of 37.degree. Advantageously and according to the invention, at least one stage of the process is carried out under a laminar flow hood. Advantageously and according to the invention, all the steps are carried out under a laminar flow hood. Advantageously and according to the invention, a sterile enzymatic composition is used and the plasma plasma medium comprising plasminogen is contacted with the sterile enzymatic composition in a hermetically sealed container. An autologous plasmin-rich autologous plasmatic medium is obtained which is sterile, substantially non-immunogenic and which is especially suitable for use in autologous injection in the context of any preventive or curative treatment of a pathology in which a transformation of plasminogenase autologous plasmin is required, for example in the treatment of a cardiovascular pathology or in the context of a surgical intervention, in particular during an intra-vitreous intervention of a treatment - in particular during a surgical intervention - vitreo-macular disorders in ophthalmology.

30 L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine susceptible d'être obtenu par un procédé selon 3034992 12 l'invention. L'invention s'étend aussi à un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu directement par un procédé selon l'invention. L'invention concerne également un milieu plasmatique ex-vivo autologue riche en plasmine, un tel milieu plasmatique ex-vivo autologue riche en 5 plasmine pour son utilisation à titre de médicament, un tel milieu plasmatique ex-vivo autologue riche en plasmine pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement de troubles vitréo-maculaires et un procédé de préparation d'un tel milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après.The invention also extends to an autologous plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium obtainable by a method according to the invention. The invention also extends to an autologous plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium obtained directly by a method according to the invention. The invention also relates to an autologous plasmin-rich aut-vivo plasma medium, such an autologous plasma-rich autologous ex-vivo plasma medium for use as a medicament, such plasmin-rich autologous ex-vivo plasma medium for its use. as a medicament for treating vitreo-macular disorders and a method for preparing such an autologous plasmin-rich autologous plasma medium characterized in combination by all or some of the characteristics mentioned above or hereinafter.

10 D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et aux exemples illustratifs de l'invention donnés à titre indicatif et non limitatif. Plasminogénase immobilisée sur un support solide On prépare une composition enzymatique formée d'une 15 plasminogénase -notamment une urokinase- immobilisée sur un support solide par un procédé dans lequel on choisit un matériau solide à l'état divisé dans le groupe formé des matériaux hydrophiles poreux, notamment dans le groupe formé des matériaux hydrophiles poreux présentant des groupements surfaciques réactifs de greffage et de nature époxydique. On choisit par exemple le matériau solide dans le 20 groupe formé du matériau Epoxy-GE Healthcare (GE Healthcare Epoxy-activated SepharoseTM) et du matériau SEPABEADS® EC-EP/S (Resindion, Binasca, Italie). À titre d'exemple, le matériau solide est le SEPABEADS® EC-HFA/S (Resindion, Binasca, Italie) formé de particules de diamètre moyen compris entre 100 ium et 300 ium. Les particules du SEPABEADS® EC-HFA/S sont 25 formées de polyméthacrylate et fonctionnalisées en surface par des groupements amino-époxyde de formule (III) ci-après : OH H /1\10(i)< Support 0 (III) ; à raison d'au moins 75 iumoles de groupement amino-époxyde par gramme de support à l'état sec. La porosité moyenne du matériau solide est comprise entre 30 10 nm et 20 nm.Other objects, features and advantages of the invention will appear on reading the following description and illustrative examples of the invention given for information only and not limiting. Plasminogenase immobilized on a solid support An enzymatic composition formed of a plasminogenase-in particular a urokinase-immobilized on a solid support is prepared by a process in which a solid material in the divided state is selected from the group consisting of porous hydrophilic materials. , in particular in the group consisting of porous hydrophilic materials having reactive graft and epoxy surface groups. For example, the solid material is selected from the group consisting of GE Healthcare Epoxy-activated Sepharose ™ material and SEPABEADS® EC-EP / S material (Resindion, Binasca, Italy). By way of example, the solid material is SEPABEADS® EC-HFA / S (Resindion, Binasca, Italy) formed of particles of average diameter between 100 and 300 μm. The particles of SEPABEADS® EC-HFA / S are formed of polymethacrylate and surface-functionalized with amino epoxide groups of formula (III) below: ## STR1 ## at least 75 pmoles of aminoepoxide group per gram of support in the dry state. The average porosity of the solid material is between 10 nm and 20 nm.

3034992 13 Dans un procédé de fabrication d'une telle composition enzymatique, on hydrate une quantité de matériau solide sec à l'état divisé dans une composition aqueuse d'hydratation. La composition aqueuse d'hydratation peut être par exemple de l'eau osmosée, de l'eau « pour préparation injectable » (dite PPI) ou 5 du sérum physiologique stérile. Par exemple, on place 0,2 g de matériau solide déshydraté -par exemple 0,2 g de SEPABEADS® EC-HFA/S à l'état sec- dans 40 mL d'eau PPI pendant 1 heure à température ambiante, puis on réalise ensuite trois rinçages successifs du support hydraté avec 0,7 mL de sérum physiologique stérile à pH 6,8.In a method of making such an enzyme composition, an amount of dry solid material is hydrated in the divided state in an aqueous hydration composition. The aqueous hydration composition can be, for example, osmosis water, water "for injection" (so-called PPI) or sterile physiological saline. For example, 0.2 g of dehydrated solid material - for example 0.2 g of SEPABEADS® EC-HFA / S in the dry state - is placed in 40 ml of PPI water for 1 hour at room temperature, then then performs three successive rinses of the hydrated support with 0.7 mL of sterile physiological saline pH 6.8.

10 On met ensuite le matériau solide rincé en contact avec 0,7 mL d'une solution aqueuse -par exemple, du sérum physiologique stérile apyrogène ou une solution stérile d'irrigation intraoculaire BSS (Bioaqua®, « Balanced Salt Solution »)- de plasminogénase -par exemple d'urokinase ou de streptokinase, ou de nattokinase, ou d'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA)- 15 comprenant de l'ordre de 2 unités (2 U/mL) d'activité plasminogénase par mL de solution aqueuse. On maintient le contact entre le matériau solide et la plasminogénase pendant plusieurs heures de façon à former la composition enzymatique. On prélève le surnageant liquide de réaction, puis on rince 3 fois la 20 composition enzymatique ainsi obtenue avec 0,7 mL d'une solution de NaCI 1M dans de l'eau PPI, ou de préférence du sérum physiologique stérile. Préparation d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine On prélève stérilement une quantité de sang d'un patient à 25 soigner dans un tube de prélèvement (BD Vacutainer®, BD Diagnostics, Le Pont de Claix, France) comprenant un anticoagulant du type EDTA ou citrate de sodium. On réalise une étape de séparation des cellules sanguines et du milieu plasmatique sanguin par centrifugation à 4000 rpm pendant 15 min. On place stérilement 0,7 mL de ce milieu plasmatique sanguin 30 sous agitation, à 37°C et au contact d'une fraction aliquote de l'ordre de 0,2 g de composition enzymatique obtenue par un procédé décrit ci-dessus et pendant une 3034992 14 durée comprise entre 5 min et 60 min de façon à convertir du plasminogène du milieu plasmatique sanguin en plasmine et former le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. On sépare par filtration sur un filtre Millex PVDF (Millipore) de seuil de coupure de 0,22 ium, la composition enzymatique (rétentat) 5 et le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine (filtrat) et sensiblement exempt d'urokinase. On procède ensuite à une injection intraoculaire d'un volume, par exemple compris entre 50 it.11_, et 200 ILEL, de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine et stérile de façon à libérer les contraintes existant entre 10 le corps vitré et la rétine. Détermination de l'activité plasmine d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine On détermine l'activité enzymatique à 37°C de la plasmine (dite activité plasmine) du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine 15 obtenu ci-dessus par un suivi par spectrophotométrique de la libération de paranitro-aniline à partir du substrat S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNA-2HCf, Chromogenix, Werfen France, Le Pré Saint Gervais, FRANCE) sous l'action de la plasmine du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. Pour ce faire, on prépare dans une cuvette de mesure 20 spectrophotométrique un milieu de mesure à 37°C par mélange de 0,4 mL de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine dilué 10 fois dans un tampon salin (« Balanced salt solution ») et 0,4mL d'une solution comprenant du S-2251 (H-DVal-Leu-Lys-pNA-2HCf, Chromogenix, Werfen France, Le Pré Saint Gervais, FRANCE) à la concentration de 2 mM, de sorte que la concentration initiale de S- 25 2251 dans le milieu de mesure soit de l'ordre de 1 mM. À compter du mélange, on mesure l'évolution de l'absorbance (densité optique, D0405.) à 405 nm du milieu de mesure à 37°C pendant 5 minutes. On évalue la pente à l'origine de la courbe d'évolution de l'absorbance à 405 nm, c'est-à-dire la vitesse initiale Vi de la réaction exprimée en A -abs / min. L'activité plasmine du milieu plasmatique ex vivo 30 autologue riche en plasmine (exprimée en U/mL de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine) est donnée par la formule (II) : 3034992 15 io3vm. Activité plasmine = vi. (II) E.L.Vp dans laquelle : - Vi est la vitesse initiale de la réaction exprimée en Aabs Min ; - Vm est le volume (en mL) du milieu de mesure ; 5 - c est le coefficient d'extinction moléculaire (en M-1 cm-1) de la para- nitro-aniline à 405 nm ; - L est la longueur (en cm) du trajet optique de la cuve de mesure spectrophotométrique, et ; - Vp est le volume (en mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue 10 riche en plasmine introduit dans la cuve de mesure spectrophotométrique. L'activité plasmine (U/mL de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine) à 37°C du milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu après 15 min ou 60 min de contact entre la composition enzymatique et le milieu plasmatique sanguin mesurée en présence de substrat S- 15 2251 est comprise entre 0,116 et 0,148 U/mL pour un temps de contact de 15 min et comprise entre 0,200 et 0,218 U/mL pour un temps de contact de 60 min. Détermination de la quantité de plasminogénase -notamment d'urokinase- d'un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine On détermine la quantité de plasminogénase d'un milieu 20 plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine par dosage selon la technique immuno-enzymatique « ELISA » en utilisant un anticorps primaire spécifique de la plasminogénase (notamment un anticorps dirigé contre l'urokinase humaine -par exemple, l'anticorps de lapin ABcam ab24121-) et un anticorps secondaire quantifiable (par exemple, un anticorps de chèvre dirigé contre les IgG de lapin et 25 conjugué à la HRP (« Horse Raddish Peroxydase ») en présence d'Amplex®UltraRed. On réalise une courbe d'étalonnage à partir de quantités connues de plasminogénase dans du milieu plasmatique sanguin. La masse d'urokinase présente dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine obtenu par mise en contact de la composition 30 enzymatique et d'un milieu plasmatique sanguin pendant 60 minutes à la 3034992 16 température de 37°C, mesurée par la méthode immuno-enzymatique « ELISA », est inférieure à 30 ag par millilitre (mL) de milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine. EXEMPLE 1 - Préparation d'urokinase immobilisée 5 On hydrate 0,2 g de SEPABEADS® EC-HFA/S dans de l'eau PPI, puis on réalise ensuite trois rinçages successifs du matériau hydraté avec 0,7 mL de sérum physiologique stérile à pH 6,8. On met en contact le support ainsi rincé avec 0,7 mL d'une solution de plasminogénase (Urokinase humaine, U0633, Sigma-Aldrich, Lyon, France) dans du sérum physiologique, ladite solution 10 présentant une activité enzymatique de 2 U/mL On maintient le contact entre le support et l'enzyme pendant plusieurs heures. On élimine le surnageant liquide de réaction, puis on réalise trois rinçages successifs. On obtient une composition enzymatique formée d'urokinase immobilisée sur un support solide à l'état divisé. L'activité enzymatique de la composition enzymatique est de l'ordre de 0,172 à 15 0,196 U/mL La composition enzymatique permet de convertir du plasminogène d'un milieu plasmatique sanguin en plasmine sans apporter dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine, une quantité importante de protéase immunogène.The rinsed solid material is then contacted with 0.7 mL of an aqueous solution - e.g., sterile, pyrogen-free saline or sterile BSS (Bioaqua®, Balanced Salt Solution) intraocular irrigation solution. plasminogenase - for example urokinase or streptokinase, or nattokinase, or tissue plasminogen activator (t-PA) - comprising of the order of 2 units (2 U / mL) of plasminogenase activity per mL of aqueous solution. The solid material is maintained in contact with the plasminogenase for several hours to form the enzyme composition. The reaction liquid supernatant is removed, and the enzymatic composition thus obtained is then rinsed 3 times with 0.7 ml of a 1M NaCl solution in PPI water, or preferably sterile physiological saline. Preparation of an autologous plasmin-rich autologous plasmatic medium Sterile blood from a patient to be treated is sterilized in a sampling tube (BD Vacutainer®, BD Diagnostics, Le Pont de Claix, France) comprising an anticoagulant of EDTA type or sodium citrate. A step of separation of the blood cells and the blood plasma medium is carried out by centrifugation at 4000 rpm for 15 min. 0.7 ml of this blood plasma medium is sterilely placed with stirring at 37 ° C. and in contact with an aliquot of the order of 0.2 g of enzymatic composition obtained by a process described above and during a time ranging from 5 min to 60 min to convert plasminogen from the plasma blood medium to plasmin and form the plasmin-rich autologous plasmatic ex vivo plasma medium. A cut-off point of 0.22 .mu.l, the enzymatic composition (retentate) and the autologous plasmin rich ex vivo plasma medium (filtrate) and substantially free of urokinase are filtered off on a Millex PVDF filter (Millipore). An intraocular injection is then carried out of a volume, for example between 50% and 11% ILLEL, of plasmin-rich autologous plasmatic ex vivo plasma medium so as to release the stresses existing between the vitreous body and the plasma. retina. Determination of the Plasmin Activity of a Plasmmin-rich Autologous Ex Vivo Plasma Medium The enzymatic activity at 37 ° C. of plasmin (so-called plasmin activity) of the plasmin-rich autologous plasmatic ex vivo plasma medium obtained above was determined. a spectrophotometric monitoring of the release of paranitroaniline from the S-2251 substrate (HD-Val-Leu-Lys-pNA-2HCf, Chromogenix, Werfen France, Pré Saint Gervais, FRANCE) under the action of plasmin autologous ex vivo plasma medium rich in plasmin. To do this, a measuring medium at 37 ° C. is prepared in a spectrophotometric measuring cup by mixing 0.4 ml of plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium diluted 10 times in a saline buffer ("Balanced salt solution"). ) and 0.4mL of a solution comprising S-2251 (H-DVal-Leu-Lys-pNA-2HCf, Chromogenix, Werfen France, Pré Saint Gervais, FRANCE) at the concentration of 2 mM, so that the initial concentration of S-2251 in the measuring medium of the order of 1 mM. From the mixing, the evolution of the absorbance (optical density, OD 405) at 405 nm of the measuring medium at 37 ° C for 5 minutes was measured. The slope at the origin of the evolution curve of the absorbance at 405 nm is evaluated, that is to say the initial speed Vi of the reaction expressed in A-abs / min. The plasmin activity of the plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium (expressed in U / mL of plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium) is given by formula (II): ## EQU1 ## Plasmin activity = vi. (II) E.L.Vp wherein: - Vi is the initial rate of the reaction expressed in Aabs Min; - Vm is the volume (in mL) of the measuring medium; 5 - c is the molecular extinction coefficient (in M-1 cm-1) of para-nitroaniline at 405 nm; L is the length (in cm) of the optical path of the spectrophotometric measurement vessel, and; Vp is the volume (in mL) of plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium introduced into the spectrophotometric measurement vessel. Plasmin activity (U / mL plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium) at 37 ° C from the plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium obtained after 15 min or 60 min of contact between the enzyme composition and the measured blood plasma medium in the presence of S-substrate 2251 is between 0.116 and 0.148 U / mL for a contact time of 15 min and between 0.200 and 0.218 U / mL for a contact time of 60 min. Determination of the amount of plasminogenase - in particular urokinase - of a plasmin-rich autologous ex vivo plasma medium The amount of plasminogenase of a plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium is determined by assay according to the enzyme immunoassay technique. ELISA using a primary antibody specific for plasminogenase (including an antibody directed against human urokinase-for example, ABcam rabbit antibody ab24121-) and a quantifiable secondary antibody (eg, a goat antibody directed against Rabbit IgG conjugated to HRP ("Horse Raddish Peroxidase") in the presence of Amplex®UltraRed A calibration curve is made from known amounts of plasminogenase in blood plasma medium. in the plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium obtained by bringing the enzymatic composition into contact with a blood plasma medium pe The temperature of 37 ° C measured by the enzyme immunoassay method "ELISA" is less than 30 ag per milliliter (mL) of plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium. EXAMPLE 1 - Preparation of immobilized urokinase 0.2 g of SEPABEADS® EC-HFA / S are hydrated in PPI water, then three successive rinses of the hydrated material are carried out with 0.7 ml of sterile physiological saline. pH 6.8. The thus rinsed support is brought into contact with 0.7 ml of a solution of plasminogenase (human Urokinase, U0633, Sigma-Aldrich, Lyon, France) in physiological saline, said solution having an enzymatic activity of 2 U / ml. The contact between the carrier and the enzyme is maintained for several hours. The liquid reaction supernatant is removed, followed by three successive rinses. An enzymatic composition formed of urokinase immobilized on a solid support in the divided state is obtained. The enzymatic activity of the enzymatic composition is of the order of 0.172 to 0.196 U / ml. The enzymatic composition makes it possible to convert plasminogen from a plasmatic blood medium to plasmin without supplying the plasmin-rich autologous plasma ex vivo medium. a significant amount of immunogenic protease.

20 Dosage d'urokinase libre dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine Le dosage par la méthode immuno-enzymatique « ELISA » de la quantité d'urokinase libre présente dans le milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine montre une proportion d'urokinase hétérologue libre inférieure à 25 20 µg/mL et en moyenne de l'ordre de 10,0 µg/mLAssay of free urokinase in plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium The enzyme immunoassay "ELISA" of the amount of free urokinase present in the plasmin-rich autologous plasma ex vivo plasma medium shows a proportion of free heterologous urokinase less than 20 μg / mL and on average of the order of 10.0 μg / mL

Claims

REVENDICATIONS1/ - Milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine caractérisé : - en ce qu'il comprend une proportion de protéine hétérologue inférieure à 600 iug par millilitre (mL) de milieu plasmatique, - en ce qu'il présente une activité enzymatique, dite activité plasmine, telle que mesurée par un test de libération de para-nitro-aniline, supérieure à 0,1 iumole de para-nitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique, ledit test de libération consistant à : o mélanger dans le milieu plasmatique maintenu à la température de 37°C un substrat chromogène S-2251 de formule (I) ci-après : NO2 à une concentration initiale de l'ordre de 1 mM dans le milieu plasmatique, o évaluer suite au mélange une vitesse initiale de libération de para- nitro-aniline par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique.CLAIMS1 / - Plasmid-rich autologous plasma ex vivo plasma medium characterized in that it comprises a proportion of heterologous protein of less than 600 μg per ml (ml) of plasma medium, in that it exhibits an enzymatic activity, known as plasmin activity, as measured by a para-nitroaniline release test, greater than 0.1 iumole of para-nitroaniline released per minute per milliliter (mL) of plasma medium, said release test consisting of: o mix in the plasma medium maintained at a temperature of 37 ° C an S-2251 chromogenic substrate of formula (I) below: NO2 at an initial concentration of about 1 mM in the plasma medium, o evaluate further to mix an initial rate of release of para-nitroaniline per minute and per milliliter (mL) of plasma medium.

2/ - Milieu plasmatique selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activité plasmine est comprise entre 0,1 et 0,5 iumole de para-nitroaniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique.2 / - Plasma medium according to claim 1, characterized in that the plasmin activity is between 0.1 and 0.5 iumole of para-nitroaniline released per minute and per milliliter (mL) of plasma medium.

3/ - Milieu plasmatique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'activité plasmine est de l'ordre de 0,2 iumole de paranitro-aniline libérée par minute et par millilitre (mL) de milieu plasmatique.3 / - Plasma medium according to one of claims 1 or 2, characterized in that the plasmin activity is of the order of 0.2 iumole of paranitro-aniline released per minute and per milliliter (mL) of plasma medium.

4/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend une proportion de protéine hétérologue inférieure à 400 iLt.g par 25 millilitre (mL) de milieu plasmatique. 3034992 18 5/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la proportion de protéine hétérologue est inférieure à 10 iug par millilitre (mL) de milieu plasmatique. 6/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé 5 en ce qu'il est stérile. 7/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est apyrogène. 8/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 7, pour son utilisation à titre de médicament. 10 9/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 8, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique d'une pathologie cardiovasculaire ou lors d'une intervention chirurgicale. 10/ - Milieu selon l'une des revendications 1 à 9, pour son utilisation à titre de médicament dans un traitement thérapeutique de traction vitréo15 maculaire (TVM) en ophtalmologie. 11/ - Composition comprenant un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine selon l'une des revendications 1 à 10 et au moins un excipient en une quantité physiologiquement acceptable. 12/ - Procédé de préparation d'un milieu plasmatique ex vivo 20 autologue riche en plasmine selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel : - on prépare un milieu plasmatique sanguin comprenant du plasminogène à partir de sang d'un individu unique ; - on choisit une composition enzymatique comprenant au moins une enzyme, dite plasminogénase, de conversion en plasmine du plasminogène dudit milieu plasmatique sanguin, ladite plasminogénase étant liée à un support solide insoluble en solution aqueuse et formé d'un matériau poreux ; - on met en contact la composition enzymatique et ledit milieu plasmatique sanguin pendant une durée de contact et dans des conditions choisies pour permettre une conversion en plasmine du plasminogène dudit milieu plasmatique sanguin et la formation d'un milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine, puis ; 3034992 19 - on réalise une filtration dudit milieu plasmatique ex vivo riche en plasmine sur filtre présentant un seuil de coupure inférieur ou égal à 0,22 Lam de façon à obtenir un filtrat constituant un milieu plasmatique ex vivo autologue riche en plasmine stérile et exempt de composition enzymatique.4 / - Medium according to one of claims 1 to 3, characterized in that it comprises a proportion of heterologous protein less than 400 iLt.g per 25 milliliter (mL) of plasma medium. The medium according to one of claims 1 to 4, characterized in that the proportion of heterologous protein is less than 10 μg per milliliter (mL) of plasmatic medium. 6 / - Medium according to one of claims 1 to 5, characterized in that it is sterile. 7 / - Medium according to one of claims 1 to 6, characterized in that it is pyrogen-free. 8 / - Medium according to one of claims 1 to 7 for its use as a drug. 9 / - Medium according to one of claims 1 to 8 for its use as a medicament in a therapeutic treatment of a cardiovascular pathology or during a surgical procedure. 10 / - Medium according to one of claims 1 to 9 for its use as a drug in a therapeutic treatment vitreo15 macular traction (TVM) in ophthalmology. 11 / - Composition comprising an autologous plasmin-rich autologous plasma ex vivo medium according to one of claims 1 to 10 and at least one excipient in a physiologically acceptable amount. 12 / - A process for the preparation of an autologous plasmoly-rich autologous plasma ex vivo medium according to one of claims 1 to 10, in which: a plasmatic blood medium comprising plasminogen is prepared from blood of a single individual ; an enzymatic composition is chosen comprising at least one enzyme, called plasminogenase, for plasminogen conversion of plasminogen of said blood plasma medium, said plasminogenase being bound to an insoluble solid support in aqueous solution and formed of a porous material; the enzymatic composition and said blood plasma medium are brought into contact during a period of contact and under conditions chosen to allow a plasmin conversion of the plasminogen of said blood plasma medium and the formation of an ex vivo plasmatic medium rich in plasmin, and then ; - Filtration of said ex vivo plasmin-rich plasma medium is carried out on a filter having a cut-off threshold of less than or equal to 0.22 Lam so as to obtain a filtrate constituting an autologous plasmatic ex vivo autolytic rich in sterile plasmin and free of enzymatic composition.

5 13/ - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la durée de contact est supérieure à 5 min. 14/ - Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce qu'on met en contact la composition enzymatique et ledit milieu plasmatique sanguin sous agitation et à température de 37°C.5 13 / - Method according to claim 12, characterized in that the contact time is greater than 5 min. 14 / - Method according to one of claims 12 or 13, characterized in that the enzymatic composition and said blood plasma medium is brought into contact with stirring and at a temperature of 37 ° C.