FR3030049A1

FR3030049A1 - Systeme d'analyse et de culture cellulaire, procede d'analyse et de culture cellulaire associe et methode de fabrication de la puce associee

Info

Publication number: FR3030049A1
Application number: FR1462259A
Authority: FR
Inventors: Andrew David Griffiths
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2016-06-17
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: FR3030049B1

Abstract

L'invention concerne un système d'analyse et de culture cellulaire (40) comprenant : - une source d'un premier fluide comprenant un premier réactif, - une puce (44) comprenant un conduit d'entrée comportant une première entrée (18) reliée à la source et une sortie, au moins un conduit de passage (12) du premier fluide, dans lequel débouche la sortie du conduit d'entrée. La puce (44) comprend en outre, pour chaque conduit de passage (12) un réservoir (14), débouchant dans le conduit de passage (12). Le réservoir (14) contient une solution pré-chargée, comprenant un deuxième réactif apte à réagir avec le premier réactif dans le conduit de passage (12).

Description

1 Système d'analyse et de culture cellulaire, procédé d'analyse et de culture cellulaire associé et méthode de fabrication de la puce associée La présente invention concerne un système d'analyse et de culture cellulaire. Dans le domaine de la culture cellulaire, il est connu de faire croître des colonies cellulaires sur la surface de plaques comprenant un milieu de croissance gélifié par un agent gélifiant notamment de l'agar agar. Un système couramment utilisé comporte des plaques d'agar agar disposées dans des boîtes de Petri. Les cellules individuelles sont étalées sur la surface des plaques et se multiplient jusqu'à former une colonie cellulaire. Une colonie est un amas de cellules. Les cellules sont, par exemple, des micro-organismes comme des bactéries, des levures ou des fungi. Les systèmes sur plaques permettent de quantifier et d'identifier les microorganismes.

Les micro-organismes peuvent être identifiés à partir de nombreuses méthodes : par exemple, une analyse de la morphologie des colonies, une vérification de la capacité de croissance d'une colonie sur un milieu sélectif, un marquage sélectif, une mesure de spectroscopie de masse ou autre. La croissance de colonies bactériennes sur un milieu sélectif contenant un antibiotique est utilisée, par exemple, pour déterminer la résistance d'une bactérie à l'antibiotique. Cependant, la formation de colonies visibles à l'oeil nu c'est-à-dire de macro- colonies nécessite une incubation de plus de dix heures selon le temps de réplication du micro-organisme. En effet, la croissance radiale des macro-colonies est sensiblement linéaire puisqu'elle est limitée par la diffusion des nutriments. Par exemple, le temps de réplication de Escherichia coli est de dix-sept minutes et le taux de croissance radial linéaire de la colonie a été mesuré à 0,013 micro mètres (pm) par seconde. Des temps d'incubation plus courts peuvent être souhaités ou même essentiels, par exemple, pour identifier rapidement des micro-organismes pathogènes. Par exemple, l'identification rapide de résistance à un antibiotique d'une bactérie permet au patient d'être traité rapidement avec des antibiotiques plus adaptés. Pour réduire les temps d'incubation, il est connu de chercher à détecter des micro- colonies, c'est-à-dire de plus petites colonies non visibles à l'oeil nu. L'extension radiale de micro-colonies est supposée exponentielle puisque la croissance n'est pas limitée par la diffusion de nutriments.

3030049 2 Les micro-colonies peuvent être détectées à partir de diverses méthodes incluant des étapes de coloration, des marquages vitaux de fluorescence ou des mesures de bioluminescence permettant de détecter l'adénosine-triphosphate (ATP). Des colonies immergées c'est-à-dire les colonies qui croissent à l'intérieur du gel 5 et non sur leur surface peuvent également être analysées. La publication « the effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria » parue dans Journal of Applied Microbiology, 83(1), 76-84 décrit une étude de colonies immergées. Il existe un besoin pour une détection rapide, une quantification et une 10 caractérisation de colonies de micro-organismes immergées. En outre, il existe un besoin de quantifier simultanément la croissance de micro-colonies immergées pour un ensemble de milieux sélectifs. A cet effet, l'invention a pour objet un système d'analyse et de culture cellulaire comprenant : 15 - une source d'un premier fluide comprenant un premier réactif, - une puce comprenant : - un conduit d'entrée comportant une première entrée reliée à la source et une sortie, - au moins un conduit de passage du premier fluide, dans lequel débouche 20 la sortie du conduit d'entrée, caractérisé en ce que la puce comprend en outre, pour chaque conduit de passage : - un réservoir, le réservoir débouchant dans le conduit de passage, le réservoir contenant une solution pré-chargée, la solution pré-chargée comprenant un deuxième réactif apte à réagir avec le premier réactif dans le conduit de passage.

25 Le système d'analyse et de culture cellulaire selon l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prise(s) isolément ou suivant toute combinaison techniquement possible : - le premier réactif et le deuxième réactif sont aptes à former un gel dans le conduit de passage, de préférence, un gel adapté à la culture de cellules, notamment un 30 gel d'alginate ; - le premier fluide comprend, en outre, une pluralité de cellules en suspension, la solution pré-chargée du réservoir comprenant un milieu sélectif de croissance des cellules ; - le système comprend un outil d'imagerie propre à former une image d'une partie 35 du conduit de passage et avantageusement propre à détecter des micro-colonies dans le conduit de passage ; 3030049 3 - le conduit de passage du premier fluide est étendu selon une direction longitudinale et les dimensions transverses du conduit de passage du premier fluide au voisinage du réservoir sont inférieures à 1 mm ; - le système comprend un module d'injection configuré pour injecter le premier 5 fluide dans le conduit d'entrée en aval de la source et pour entrainer le premier fluide dans le conduit de passage ; - la puce comprend une pluralité de conduits de passage parallèles, dans lesquels débouche la sortie du conduit d'entrée, la puce comprenant pour chaque conduit de passage, un réservoir propre débouchant dans le conduit de passage, le premier fluide 10 comprenant avantageusement, en outre, une pluralité de cellules en suspension, la solution pré-chargée de chaque réservoir comprenant un deuxième réactif sélectif dans chaque réservoir, notamment un milieu sélectif de croissance des cellules distinct ; - l'outil d'analyse est propre à permettre l'analyse de la croissance de micro-colonies ; 15 - pour le ou chaque conduit de passage, le réservoir est disposé au-dessus du conduit de passage, le réservoir débouchant dans le conduit de passage par une ouverture inférieure d'aire horizontale avantageusement inférieure à l'aire horizontale du conduit de passage. L'invention a également pour objet un procédé d'analyse et de culture cellulaire 20 comprenant les étapes suivantes : - fourniture d'un système d'analyse et de culture cellulaire, tel que précédemment décrit ; - injection du premier fluide dans le conduit d'entrée à partir de la source de premier fluide ; 25 - passage du premier fluide dans le conduit de passage jusqu'au réservoir ; - réaction du premier réactif du premier fluide et du deuxième réactif de la solution pré-chargée dans le conduit de passage, de préférence la réaction permettant la formation d'un gel dans le conduit de passage. Le procédé selon l'invention peut comprendre l'une ou plusieurs des 30 caractéristiques suivantes : - le premier fluide comprend une pluralité de cellules en suspension, et le procédé comprend les étapes suivantes : - formation d'une image d'une partie du conduit de passage, et - détection de micro-colonies dans le conduit de passage ; 35 - le premier fluide comprend une pluralité de cellules en suspension, la solution du réservoir comprenant un milieu sélectif de croissance des cellules et le procédé comprend 3030049 4 une étape de détermination d'un paramètre représentatif de l'effet du milieu sélectif sur au moins une cellule ; - les cellules sont marquées par des marquages vitaux de fluorescence ; - le procédé comprend une détection des micro-colonies comprenant 5 avantageusement des étapes de coloration, des marquages vitaux de fluorescence ou des mesures de bioluminescence permettant de détecter l'adénosine-triphosphate (ATP) ; et - la puce comprend une pluralité de conduits de passage parallèles, dans lesquels débouche la sortie du conduit d'entrée, la puce comprenant pour chaque conduit de 10 passage, un réservoir propre débouchant dans le conduit de passage, le premier fluide comprenant avantageusement, en outre, une pluralité de cellules en suspension, la solution pré-chargée de chaque réservoir comprenant un deuxième réactif sélectif dans chaque réservoir, notamment un milieu sélectif de croissance des cellules distinct, le procédé comprenant le passage du premier fluide dans le conduit de passage en regard 15 de chaque réservoir, et la réaction du premier réactif sélectivement avec le deuxième réactif de chaque solution pré-chargée dans le conduit de passage. L'invention a également pour objet une méthode de fabrication d'une destinée à être intégrée dans le système d'analyse et de culture cellulaire, tel que précédemment décrit : 20 - fourniture d'une demi-puce supérieure comprenant un réservoir ; - chargement du réservoir avec une solution comprenant un deuxième réactif ; - fermeture de la demi-puce supérieure par une demi-puce inférieure, de façon à former une puce comprenant un conduit d'entrée comportant une première entrée apte à être reliée à une source d'un premier fluide comprenant un premier réactif, et une sortie, 25 au moins un conduit de passage dans lequel débouche la sortie du conduit d'entrée, et dans laquelle le réservoir débouche dans le conduit de passage. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple, et faite en se référant aux dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 est une représentation schématique d'un système d'analyse et de 30 culture cellulaire selon l'invention ; - la figure 2 est une vue en coupe suivant un plan vertical II de la puce du système de la figure 1 ; - la figure 3 est une vue prise en coupe suivant un plan axial inférieur horizontal III de la puce de la figure 2 ; 35 - la figure 4 est une vue en coupe selon un plan axial médian horizontal IV de la puce de la figure 2 ; 3030049 5 - la figure 5 est une vue en coupe suivant un plan axial supérieur horizontal V de la puce de la figure 2, - la figure 6 est une vue en coupe suivant un plan frontal de la demi-puce supérieure de la figure 2, 5 - la figure 7 est une vue en coupe suivant un plan transversal de la demi-puce supérieure de la figure 2, - la figure 8 est une vue analogue à la figure 6 d'une demi-puce supérieure suivant un troisième mode de réalisation, - la figure 9 est une vue analogue à la figure 7 de réalisation de la demi-puce 10 supérieure de la figure 8. Dans la description qui va suivre, les termes « amont » et « aval » et les termes « entrée » et « sortie » sont utilisés en référence aux sens normaux de circulation des fluides dans le système. Le terme « longitudinal » est défini par rapport à la direction du conduit de 15 passage de la puce. La direction d'élévation Z est définie par rapport à l'épaisseur de la puce. La direction longitudinale X est sensiblement perpendiculaire à la direction d'élévation Z. La direction transversale Y, est sensiblement perpendiculaire aux directions longitudinales X et d'élévation Z, de sorte que ces trois directions forment un repère orthonormé.

20 Les termes « inférieurs » et « supérieurs » sont définis par rapport à la direction d'élévation Z. On appelle plan « axial » les plans qui s'étendent selon la direction longitudinale X et la direction transversale Y. On appelle plan « frontal», les plans qui s'étendent selon la direction d'élévation Z 25 et la direction longitudinale X On appelle plan « transversal », les plans perpendiculaires à la direction longitudinal c'est-à-dire les plans qui s'étendent selon la direction Y et la direction d'élévation Z. Par exemple la direction transversale Y et la direction longitudinale X définissent 30 dans un plan axial horizontal et la direction d'élévation Z s'étend verticalement. Par ailleurs, on entend par le terme « diamètre », l'étendue maximale du conduit considéré dans un plan transversal, par exemple le diamètre d'un cercle dans le cas où la section transversale du canal est circulaire ou la diagonale d'un rectangle dans le cas où la section transversale du canal est rectangulaire.

35 La figure 1 illustre un premier système d'analyse et de culture cellulaire 1 3030049 6 Le premier système d'analyse et de culture cellulaire 1 est par exemple prévu pour évaluer la croissance de colonies de cellules dans un milieu. Par exemple, il permet d'étudier l'action d'un antibiotique sur la croissance de colonies de bactéries. Les cellules sont par exemple des micro-organismes, comme des bactéries, des 5 levures ou des fungi. Le système d'analyse et de culture cellulaire 1 comprend une puce 2 et une source 4 d'un premier fluide. En outre, le système d'analyse et de culture cellulaire 1 comprend un module d'injection 6 et un outil de mesure 8. En complément, le système d'analyse et de culture cellulaire 1 comprend un incubateur.

10 La puce 2 comprend un conduit d'entrée 10, un conduit de passage 12, un réservoir 14 et un conduit de sortie 16. La puce est par exemple réalisée dans un matériau perméable à l'eau et à l'air, par exemple du polydiméthylsiloxane (PDMS). En variante, la puce est réalisée en un matériau non perméable à l'eau et à l'air, comme un matériau plastique dur ou du verre.

15 Le conduit d'entrée 10 comporte une première entrée 18, une portion longitudinale 20 et une sortie 22. La première entrée 18 est reliée à la source 4. Le conduit de passage 12 comporte une entrée 24 reliée à la sortie 22 du conduit d'entrée et une sortie 26. La sortie 22 du conduit d'entrée 10 débouche dans l'entrée 24 du conduit de passage 12.

20 Le conduit de sortie 16 comporte une entrée 28 et une sortie principale 30. La sortie 26 du conduit de passage 12 débouche dans l'entrée 28 du conduit de sortie 16. Le réservoir 14 débouche dans le conduit de passage 12. Le réservoir 14 contient une solution pré-chargée. La source 4 comprend, par exemple, un récipient comprenant un premier fluide.

25 Dans la figure 1, la source 4 est externe à la puce 2. Le premier fluide contient un premier réactif. Le premier réactif est, par exemple, un agent de gélification comme de l'alginate. La solution pré-chargée comprend un deuxième réactif apte à réagir avec le premier réactif dans le conduit de passage 12.

30 Le premier réactif et le deuxième réactif sont par exemple aptes à former un gel dans le conduit de passage 12. Ce gel est par exemple propice à la croissance de micro-colonies. Par exemple, le premier réactif est de l'alginate de sodium et le deuxième réactif est du chlorure de calcium ; ces réactifs sont aptes à former un gel d'alginate de calcium. Le module d'injection 6 est configuré pour injecter le premier fluide dans le conduit 35 d'entrée 10 en aval de la source 4 et pour entrainer le premier fluide dans le conduit de passage 12.

3030049 7 Le module d'injection 6 comprend, par exemple, un pousse-seringue ou un contrôleur de flux basé sur la pression. Par exemple, le module d'injection 6 est propre à appliquer une différence de pression entre la première entrée 18 du conduit d'entrée 10 et la sortie principale 30.

5 L'outil de mesure 8 est, par exemple, un outil d'imagerie propre à former une image d'une partie du conduit de passage. En particulier, l'outil d'imagerie permet de visualiser la partie du conduit de passage 21 au niveau où le premier réactif réagit avec le deuxième réactif. Le fonctionnement du système 1 d'analyse va maintenant être décrit.

10 La source 4 est fournie. La puce 2 est fournie avec le réservoir 14 pré-rempli avec la solution pré-chargée comprenant le deuxième réactif. Le premier fluide est injecté dans le conduit d'entrée 10 à partir de la source 4 de premier fluide au moyen du module d'injection 6. Le premier fluide est mis en circulation dans le conduit de passage 12 jusqu'au 15 réservoir 14 par le module d'injection 6. Le premier fluide arrive au niveau du réservoir 14. Le premier fluide est mis en circulation dans le conduit d'entrée 10 puis dans le conduit de passage 12 par application d'une différence de pression imposée entre la première entrée 18 et la sortie principale 30 par le module d'injection 8.

20 Quand le conduit de passage 12 est rempli, la circulation du premier fluide est stoppée par le module d'injection 8. La solution pré-chargée diffuse depuis le réservoir 14 jusque dans le conduit de passage 12. Le premier réactif réagit avec le deuxième réactif dans le conduit de passage 21.

25 La réaction entre le premier réactif et le deuxième réactif forme un gel dans le conduit de passage 12. La zone du conduit de passage 12 où s'effectue la réaction entre le premier réactif et le deuxième réactif est par exemple observée par au moyen de l'outil de mesure 8. Dans une première application du premier système d'analyse et de culture 30 cellulaire 1, le premier fluide comprend un échantillon contenant une pluralité de cellules en suspension. La pluralité de cellules en suspension est constituée, par exemple, de micro-organismes à étudier. En variante ou en complément, le premier fluide contient également un milieu de culture. Les différents constituants du premier fluide sont par exemple mélangés dans le 35 récipient de la source 4 avant leur injection dans la puce 2.

3030049 8 Au cours de la réaction entre le premier et le deuxième réactif, des cellules sont immergées dans le gel en formation. La puce 2 est avantageusement placée dans un incubateur après le remplissage du conduit de passage 12. L'incubateur maintient par exemple la puce 2 à une 5 température constante adaptée à la croissance des colonies. En variante ou en complément, notamment lorsque la puce est en matériau perméable comme le PDMS, l'incubateur maintient la puce 2 à une hydrométrie constante adaptée à la croissance des colonies. Les cellules se multiplient dans le gel et forment des micro-colonies.

10 Les micro-colonies peuvent être visualisées par imagerie microscopique à travers la puce 4 par exemple par l'outil de mesure 8. Avantageusement les micro-colonies sont révélées par des agents de marquage. Le cas échéant, le milieu de culture comprend les agents de marquage et l'outil de mesure est adapté au marquage utilisé.

15 Les agents de marquages sont, par exemple, des colorants ou des marqueurs vitaux fluorescents ou de bioluminescence. Dans un exemple, le premier fluide contient de la luciférase « firefly » ou son substrat la D-luciférine permettant de détecter l'ATP. Par exemple, l'outil de mesure est apte à mesurer l'intensité de fluorescence dans la longueur d'onde correspondant aux marquages utilisés.

20 Dans une deuxième application, le premier fluide comprend un échantillon contenant une pluralité de cellules en suspension, et la solution pré-chargée du réservoir 14 comprend un milieu sélectif de croissance des cellules. Le procédé d'analyse comprend une étape de détermination d'un paramètre représentatif de l'effet du milieu sélectif sur au moins une cellule. Par exemple, si le milieu 25 sélectif comprend un antibiotique, le compte du nombre de colonies en croissance permet de déterminer un paramètre représentatif de l'effet de l'antibiotique sur la cellule. En outre, une étude de la dispersion de taille des colonies permet d'obtenir des informations complémentaires sur l'effet du milieu sélectif. Un deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 40 va à présent être décrit 30 en référence aux figures 2 à 7. Le deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 40 diffère du premier système d'analyse et de culture cellulaire 1 en ce que le système 40 comprend deux sources distinctes dont une source 4 pour le premier fluide et une source pour l'échantillon contenant une pluralité de cellules en suspension. En outre, le conduit d'entrée 10 comporte une deuxième entrée 42 reliée à la source d'échantillon.

35 Le deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 40 diffère également en ce que la puce 44 comprend une pluralité de conduits de passage 12 parallèles et pour 3030049 9 chaque conduit de passage 12, un réservoir 14 distinct, comprenant une solution pré-chargée associée au conduit de passage 12. La sortie du conduit d'entrée 10 débouche dans chacun des conduits de passage 12. La structure de la puce 44 va être détaillée en référence aux figures 2 à 5.

5 La puce 44 présente une forme de bloc rectangulaire allongé selon l'axe longitudinal X et aplati selon la direction d'élévation Z. La puce 44 présente une paroi inférieure 46 et une paroi supérieure 48. La première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 30 débouchent par la paroi supérieure 48 comme représenté sur la figure 5.

10 La paroi inférieure 46 de la puce 44 est optiquement transparente au moins au niveau des conduits de passage 12 et au moins dans la plage de longueur d'onde utile pour l'outil de mesure 8. En référence à la figure 2, la première entrée 18 présente dans le sens amont vers aval, un premier canal droit de connexion 50 et une chambre 52.

15 Le premier canal droit 50 est étendu selon la direction d'élévation Z. La chambre 52 définit un logement présentant un premier volume. Le fond inférieur de la chambre 52 débouche dans la portion longitudinale 20 du conduit d'entrée 10. La chambre 52 permet l'alimentation en fluide pour remplir les conduits de passage 12.

20 La deuxième entrée 42 présente, dans le sens amont vers aval, une ouverture évasée 54 et un deuxième canal droit 56. L'ouverture évasée 54 présente la forme d'un entonnoir de section axiale horizontale carrée. Cette forme est avantageuse car elle permet l'insertion rapide de l'échantillon dans la puce 44 et son guidage vers le conduit 12.

25 Le deuxième canal droit 56 est étendu selon la direction d'élévation Z. Le deuxième canal droit 56 débouche dans la portion longitudinale 20 du conduit d'entrée 10. La deuxième entrée 42 débouche ainsi perpendiculairement dans la portion longitudinale 20 du conduit d'entrée 10. La jonction entre la deuxième entrée 42 et la portion longitudinale 20 est située en 30 aval de la jonction entre la première entrée 18 et la portion longitudinale 20. En outre le diamètre de la portion longitudinale 20 augmente en aval de la jonction entre la deuxième entrée 42 et la portion longitudinale 20. En aval de la jonction entre la deuxième entrée 42 et la portion longitudinale 20, la portion longitudinale du conduit d'entrée 10 présente avantageusement des dimensions 35 adaptées pour obtenir dans les conditions d'opération prévues un flux laminaire et un nombre de Reynolds peu élevé, par exemple, strictement inférieur à 10.

3030049 10 La sortie 22 du conduit d'entrée 10 est avantageusement en forme de pointe divergente vers l'aval, de sorte à distribuer le premier fluide et l'échantillon dans les différents conduits de passage 12 et à le répartir entre les conduits 12. La sortie 22 du conduit d'entrée 10 débouche dans chaque entrée 24 d'un conduit 5 de passage 12. Sur la figure 3, on observe plusieurs conduits de passage 12 parallèles, notamment un nombre compris entre 1 et 10. Les conduits de passage 12 sont délimités par des parois latérales 60. Les parois latérales 60 sont étanches de façon à isoler chaque conduit de passage 10 12 du conduit de passage 12 adjacent. Chaque conduit de passage 12 s'étend sensiblement selon une direction longitudinale X. La section de chaque conduit de passage 12 dans un plan transversal est par exemple carrée. Le diamètre de cette section est avantageusement inférieur à 1 mm.

15 Dans une variante, la section est circulaire. La longueur de chaque conduit de passage 12 est avantageusement supérieure à 1 cm. En outre la distance entre les conduits de passage 12 les plus éloignés est avantageusement inférieure au champ de l'outil d'imagerie 8 de sorte que tous les 20 conduits de passages 12 sont observables simultanément. En variante, si la distance entre les conduits de passage 12 les plus éloignés est plus large, l'outil d'imagerie prend une série d'images permettant de couvrir l'ensemble des conduits de passage 12. Chaque conduit de passage 12 est associé à un réservoir 14 propre.

25 Avantageusement, chaque réservoir 14 est pré-rempli avec un milieu sélectif différent. Les milieux sélectifs peuvent, par exemple, comprendre du milieu contenant différents antibiotiques à différentes concentrations. Chaque réservoir 14 comprend une entrée a et une sortie [3 telle que représentée sur les figures 6 et 7. Les entrées a et sorties [3 de réservoirs 14 sont scellées et non 30 représentées sur les figures 2 à 5. Chaque réservoir 14 s'étend selon une direction longitudinale au-dessus du conduit de passage 12 associé. Le réservoir 14 débouche dans le conduit de passage 12 par une ouverture inférieure d'aire horizontale avantageusement inférieure ou égale à l'aire horizontale du 35 conduit de passage 12. Avantageusement, les dimensions et le positionnement de l'ouverture inférieure du réservoir 14 sont adaptés pour limiter la diffusion du contenu des 3030049 11 réservoirs 14 d'un conduit de passage 12 à un autre. Par exemple, l'ouverture inférieure du réservoir 14 est centrée entre l'entrée 24 et la sortie 26 du conduit de passage 12 associé. Dans la puce du deuxième système 40, les réservoirs 14 sont fermés par une 5 membrane 62 destinée à séparer les réservoirs 14 des conduits de passage 12. La membrane 62 permet de délimiter le volume du réservoir 14. L'ouverture inférieure du réservoir 14 est ainsi fermée par la membrane 62, comme illustré sur les figures 2, 6 et 7. La membrane 62 sépare chaque réservoir 14 du conduit de passage 12 associé. Avantageusement, la membrane 62 est imperméable tant que le conduit de passage est 10 sec. Puis la membrane 62 est perméable si le conduit de passage 12 comporte un fluide : elle est propre à laisser diffuser une partie de la solution pré chargée, par exemple le deuxième réactif. Chaque sortie 26 du conduit de passage 12 débouche dans l'entrée 28 du conduit de sortie 16.

15 L'entrée 28 du conduit de sortie 16 présente une forme de pointe convergente de sorte à recevoir les fluides des différents conduits de passage 12. Le conduit de sortie 16 comporte, en outre, une chambre 64 entre l'entrée 28 du conduit de sortie 16 et la sortie principale 30. La sortie principale 30 présente un canal s'étendant selon la direction d'élévation.

20 L'entrée 28 du conduit de sortie 16 débouche dans le fond de la chambre 64 du conduit de sortie 16. La chambre 64 du conduit de sortie présente avantageusement un volume similaire à la chambre 52 de la première entrée 18. La chambre 64 du conduit de sortie permet la récupération de l'excès de fluide introduit pour remplir les conduits de passage 12.

25 En outre, la solution pré-chargée comprend un milieu de culture sélectif. Par exemple, le réservoir 14 comprend un antibiotique à une concentration choisie. Le réservoir 14 est avantageusement pré-chargé avant le chargement de l'échantillon. Un exemple de méthode fabrication de la puce 44 va maintenant être décrit en référence aux figures 6 et 7.

30 La puce 44 telle que représentée sur la figure 2 est avantageusement formée d'une demi-puce inférieure 70 et une demi-puce supérieure 72. Une partie de la demi-puce supérieure 72 est représentée sur les figures 6 et 7. Les deux demi-puces 70, 72 lorsqu'elles sont assemblées forment la puce 44 représentée sur les figures 2 à 5.

35 Chaque demi-puce 70, 72 comporte une paroi inférieure et une paroi supérieure.

3030049 12 La paroi inférieure de la demi-puce inférieure 70 est la paroi inférieure 46 de la puce 44. La paroi supérieure de la demi-puce supérieure 72 est la paroi supérieure 48 de la puce 44. La paroi inférieure de la demi-puce supérieure est destinée à être en contact avec 5 la paroi supérieure de la demi-puce inférieure. Chaque demi-puce 70, 72 présente des formes complémentaires de sorte à définir les conduits 10, 12, 16 lorsque les demi-puces 70, 72 sont assemblées pour former la puce 44 entière. La première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 30 débouchent 10 dans la paroi supérieure 48 de la demi-puce supérieure 72. La demi-puce supérieure 72 comporte en outre les réservoirs 14. Les deux demi-puces 70, 72 sont, par exemple, réalisées dans le même matériau, par exemple, un élastomère, notamment du polydiméthylsiloxane (PDMS). Les deux demi-puces 70, 72 sont par exemple collées, par exemple, avec un 15 traitement plasma. Dans un premier temps, une demi-puce supérieure 72 est fournie. La demi-puce supérieure 72 est assemblée à la demi-puce inférieure 70, de façon à former une puce 44 dans laquelle chaque réservoir 14 débouche dans un conduit de passage 12.

20 Chaque réservoir 14 est chargé avec une solution comprenant un deuxième réactif. Chaque solution est injectée dans le réservoir 14 par son entrée a, par exemple au moyen du module d'injection 8. Avantageusement, l'étape de remplissage de chaque réservoir 14 est effectuée après le collage de la demi-puce inférieure 70 sur la demi-puce supérieure 72.

25 En variante, la demi-puce inférieure 70 est collée à la demi-puce supérieure 72 après le remplissage. En attendant l'utilisation de la puce 44 avec les réservoirs 14 pré-remplis, les entrées a et sorties [3 des réservoirs 14, la première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 44 sont scellées de façon à limiter l'évaporation ou les fuites lors de 30 déplacements de la puce 44 ou pendant le stockage de la puce 44. Lorsque le conduit de passage 12 situé sous la membrane 62 est rempli de fluide, la membrane 62 laisse diffuser la solution pré-chargée du réservoir 14 associé jusque dans le conduit de passage 12. Le fonctionnement du deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 40 va 35 maintenant être décrit. Le fonctionnement diffère du fonctionnement précédemment décrit 3030049 13 en ce que chaque réservoir 14 est pré-rempli avec une solution pré-chargée comprenant le deuxième réactif. Les entrées a et sorties [3 des réservoirs 14, la première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 30 sont par exemple scellées lors de la conservation de la 5 puce. Le cas échéants, la première entrée 18, la deuxième entrée 42 et la sortie principale 40 sont descellées. Les entrées a et sorties [3 des réservoirs 14 restent avantageusement scellées. L'échantillon de cellules est chargé par la deuxième entrée 42. Le premier fluide est chargé depuis la source 4 par la première entrée 18. Le premier fluide et l'échantillon 10 sont mis en circulation par le module d'injection 6. En particulier, la chambre 52 de la première entrée 18 est remplie de premier fluide. Le premier fluide et l'échantillon sont transportés dans le conduit d'entrée 10 après la zone de jonction.

15 Le premier fluide arrive dans chaque conduit de passage 12 jusqu'au niveau des réservoirs 14. La circulation est stoppée quand le conduit de passage 14 est rempli de fluide. La puce 44 est par exemple placée dans un incubateur. Chaque solution pré-chargée diffuse depuis les réservoirs 14 jusque dans le 20 conduit de passage 12. Dans l'exemple où chaque réservoir 14 contient un milieu sélectif différent, l'observation des colonies dans chaque conduit de passage 12 permet de comparer l'effet de chaque milieu sélectif. La puce permet d'obtenir des données multiples dans des conditions similaires.

25 Le deuxième système d'analyse et de culture cellulaire 44 permet d'analyser plusieurs milieux sélectifs en même temps à partir du même échantillon et dans les mêmes conditions de culture. Ceci est très avantageux pour limiter les variations expérimentales et avoir des données plus représentatives. Un troisième système d'analyse et de culture cellulaire va à présent être décrit. La 30 puce de ce troisième système diffère de la puce 44 du deuxième système en ce que le réservoir 14 n'est pas délimité par une membrane 62. La puce de ce troisième système d'analyse est avantageusement formée d'une demi-puce inférieure 70 et une demi-puce supérieure 84. La demi-puce supérieure 84 de ce troisième système d'analyse est illustrée sur les figures 8 et 9.

35 En outre, tel que représentée sur la figure 9, chaque réservoir 14 présente dans un plan transversal, une section transversale en forme de T. Les branches 82 horizontales 3030049 14 du T s'étendent selon la direction Y. Ces branches 82 facilitent la retenue de la solution pré-chargée dans le réservoir 14. Le tronc vertical du T permet la jonction avec le conduit de passage 12. En variante, les réservoirs 14 présentent une section transversale en forme de rectangle ou autre.

5 Une méthode de fabrication de la puce du troisième système d'analyse et de culture cellulaire 80 va maintenant être décrite, en regard des figures 8 et 9. Dans un premier temps, une demi-puce supérieure 84 est fournie. La demi-puce supérieure 84 diffère de la demi-puce supérieure 72 précédemment décrite en ce qu'elle ne comporte pas de membrane 62. En outre, les réservoirs 14 de la demi-puce présentent 10 une section transversale en forme de T. La méthode diffère en ce que le remplissage des réservoirs 14 est effectué avant la fermeture de la demi-puce supérieure 84 par la demi-puce inférieure 70. La demi-puce supérieure 84 est fermée temporairement par une paroi de barrage 86.

15 Dans un exemple, quand la demi-puce supérieure 84 est fabriquée dans un matériau dur, la paroi de barrage 86 est avantageusement en matériau élastomérique, de façon à voir une étanchéité entre la demi-puce supérieure 84 et la paroi de barrage 86 par simple application de pression. Inversement, si la demi-puce supérieure 84 est en matériau élastomérique, la paroi de barrage 86 est en matériau dur.

20 Une pression est appliquée pour sceller la paroi de barrage 86 contre la demi-puce supérieure 84. La méthode diffère en ce que chaque réservoir 14 est chargé avec une solution comprenant en outre des précurseurs d'un gel de maintien. Le gel de maintien est propre à maintenir la solution pré-chargée dans le réservoir 25 14 tant que le conduit de passage 12 est sec. Puis le gel de maintien est propre à relarguer une partie de la solution pré-chargée, si le conduit de passage 12 comporte un fluide. Après le remplissage, les entrées a et sorties [3 des réservoirs 14 sont scellées. Un gel de maintien est formé dans les réservoirs 14 à partir des précurseurs de gel 30 de maintien. Le reste de la solution pré-chargée, notamment le deuxième réactif reste maintenu dans le gel de maintien. Dans un exemple, le gel de maintien est un gel de gélatine. Le réservoir 14 est chargé avec une solution comprenant de la gélatine. Le réservoir 14 est chargé à une température où le précurseur de gel de maintien est fluide. Puis la température est 35 diminuée en dessous de la température de gélification du gel de maintien de sorte que le 3030049 15 gel de maintien se forme dans le réservoir. En variante, le gel de maintien est un gel d'agar agar formé à partir d'un refroidissement d'une solution d'agar agar. Dans un autre exemple, le gel de maintien est un gel de polyacrylamide. Après le remplissage du réservoir 14 avec une solution comprenant des agents de réticulations. Le 5 gel de maintien est formé après un temps d'attente permettant la diffusion des agents de réticulation. Dans un autre exemple, le gel est un hydrogel de Poly(éthylène-glycol)-diacrylate (PEGDA). Après le remplissage des réservoirs 14, une irradiation aux rayons UV est appliquée sur la demi-puce 84 pour permettre la formation et la réticulation des hydrogels 10 de PEG-DA dans les réservoirs 14. La paroi de barrage 86 est ensuite retirée. Puis la demi-puce inférieure 70 est assemblée à la demi-puce supérieure 84 pour fermer la puce. Lorsque le conduit de passage 12 situé sous le réservoir 14 est rempli de fluide, le 15 gel de maintien laisse diffuser la solution pré-chargée du réservoir 14 associé jusque dans le conduit de passage 12. Les systèmes d'analyse et de culture cellulaire 1, 40, 80 selon l'invention permettent donc de réaliser une observation de culture de cellules immergées en micro-colonie. De plus, le système 40, 80 permet de tester différentes conditions de culture 20 simultanément. Dans un exemple particulier, chaque réservoir 14 est pré-rempli avec une solution d'antibiotique avec une concentration différente. Ceci permet d'effectuer une gamme afin de connaitre la concentration efficace pour limiter la croissance d'une colonie bactérienne particulière et de déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) de l'antibiotique.

25 Le système et le procédé selon l'invention sont très avantageux pour déterminer rapidement et détecter rapidement l'efficacité et les gammes d'efficacités de milieu sélectif à l'encontre de la croissance de micro-organismes. A l'inverse, le système permet également de connaitre les conditions améliorant la croissance de micro-organismes.

30 En outre, d'autres facteurs peuvent également être testés en modifiant la composition de la solution préchargée ou du premier fluide. En variante ou en complément, avant le remplissage des conduits de passage 12, chaque réservoir 14 maintient la solution pré-chargée par des forces capillaires. Par exemple, le réservoir 14 contient un support poreux pour le maintien de la solution 35 préchargée. Dans ce cas la forme du réservoir 14 est adaptée pour renforcer l'effet de capillarité.

3030049 16 En variante, les cellules sont des cellules de culture primaires issues d'une biopsie d'un organisme. En variante, les cellules sont des cellules cancéreuses ou des cellules de lignées cellulaires. En variante, le nombre et la disposition des conduits de passage 12 sont 5 différents. En variante chaque réservoir 14 s'étend selon une direction longitudinale au-dessous du conduit de passage 12 associé. En variante d'autres compositions de polymères sont utilisés pour fabriquer des gels compatibles avec l'invention, soit le gel dans le conduit de passage 12, soit le gel de 10 maintien. Les gels sont des gels en polymères naturels, des gels en polymères synthétiques ou des combinaisons de gels de polymères synthétiques et naturels. Une liste non exhaustive de polymères permettant la formation de gels compatible avec des applications biomédicales est décrite dans l'article « hydrogels for biomedical 15 applications » de Hoffman AS paru en 2002 dans Advanced Drug Delivery Reviews. Le gel de maintien et le gel produit par la réaction du premier réactif et du deuxième réactif est par exemple un gel physique, c'est-à-dire un gel dont la structure en réseau est maintenue par des enchevêtrements moléculaires et/ou par des forces secondaires incluant des forces hydrophobiques, des forces ioniques ou 20 des forces de liaison hydrogène. Les gels de maintien et les gels formés par la réaction du premier réactif et du deuxième réactif sont en variante des gels chimiques c'est-à-dire des gels contenant des réseaux réticulés par des liaisons covalentes. Ces gels peuvent être synthétisés de différentes façons.

25 Les gels physiques sont, par exemple, former par chauffage d'une solution de polymère. En variante, le gel physique est formé par refroidissement d'une solution de polymères comme pour un gel d'agarose ou de gélatine dans l'eau. En variante, le gel physique est formé par réticulation d'un polymère dans 30 une solution aqueuse par application de cycles de congélation/décongélation aboutissant à la formation de microcristaux de polymères, comme pour un gel de PVA dans une solution aqueuse. En variante, le gel physique est formé par diminution du pH, notamment pour former un gel maintenu par liaison hydrogène entre deux polymères différents dans 35 une solution aqueuse.

3030049 17 En variante, le gel physique est un coacervat formé par mélange d'une solution de polyanion et d'une solution de polycation, comme de l'alginate de sodium avec de la polylysine). En variante, le gel physique est formé par addition d'une solution de 5 polyélectrolite à un ion multivalent de charge opposée, comme par exemple la solution du polyélectrolite de d'alginate de sodium à laquelle est ajoutée l'ion multivalent Ca2+ avec du chlorure. Les gels chimiques sont par exemple formés par réticulation de polymères à l'état solide ou en solution.

10 Par exemple, les gels chimiques sont formés par radiation en lumière visible ou aux ultraviolets.En variante, le gel chimique est formé par réticulation chimique, comme, par exemple le collagène qui est traité avec du glutaraldéhyde ou un biépoxyde. Le gel chimique est par exemple formé en utilisant des réactifs à plusieurs 15 fonctions. Le gel chimique est par exemple formé en polymérisant un monomère avec un réticulant en solution. En variante, le gel chimique est formé en copolymérisant un monomère avec un macromère multifonctionnel. En variante le gel chimique est formé par polymérisation d'un monomère 20 avec un polymère solide différent pour former un gel IPN. En variante le gel chimique est formé par conversion chimique d'un polymère hydrophobe en hydrogel. Le gel de maintien dans les réservoirs 14 est par exemple formé par l'une quelconque des méthodes précédentes.

25 En revanche, le gel formé dans le conduit de passage 12 est formé par des méthodes de gélification compatible avec la présence de cellules. Les méthodes de gélification qui risquent d'endommager les types cellulaires comme les méthodes basées sur un chauffage au-dessus de 37°, ou sur des cycles de congélation/décongélation ne sont pas appliquées pour la création des gels dans 30 les conduits de passage 12. Avantageusement, le gel formé dans les conduits de passage 12 est soit un gel d'alginate de calcium formé en mélangeant une solution aqueuse de chlorure de calcium avec une solution d'alginate de sodium soit un hydrogel de PEG DA formé en mélangeant du PEG DA avec un photo initiateur par exemple le 2,2 diméthoxy 2- 35 phényl acétophénone. Le gel PEG DA est ensuite avantageusement exposé à la lumière visible pour réticuler. En variante, le gel est exposé aux UVs.

3030049 18 Avantageusement, le premier réactif est le polymère et le deuxième réactif est un agent de réticulation ou un initiateur. Le polymère est conduit depuis la source 4 jusqu'au conduit de passage 12 et l'agent de réticulation ou l'initiateur diffuse depuis le gel préformé dans les réservoirs 14.

5 En variante, le polymère est le premier réactif et l'agent de réticulation ou le photo-initiateur est le deuxième réactif.

Claims

REVENDICATIONS1.- Système d'analyse et de culture cellulaire (1, 40) comprenant : - une source (4) d'un premier fluide comprenant un premier réactif, - une puce (2, 44) comprenant : - un conduit d'entrée (10) comportant une première entrée (18) reliée à la source et une sortie (20), - au moins un conduit de passage (12) du premier fluide, dans lequel débouche la sortie (20) du conduit d'entrée (10), caractérisé en ce que la puce (2, 44) comprend en outre, pour chaque conduit de passage (12): - un réservoir (14), le réservoir (14) débouchant dans le conduit de passage (12), le réservoir (14) contenant une solution pré-chargée, la solution pré-chargée comprenant un deuxième réactif apte à réagir avec le premier réactif dans le conduit de passage (12). 15
2.- Système (1, 40) selon la revendication 1, dans lequel le premier réactif et le deuxième réactif sont aptes à former un gel dans le conduit de passage (12), de préférence, un gel adapté à la culture de cellules, notamment un gel d'alginate. 20
3.- Système (1, 40) selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel le premier fluide comprend, en outre, une pluralité de cellules en suspension, la solution pré-chargée du réservoir (14) comprenant un milieu sélectif de croissance des cellules.
4.- Système (1, 40) selon l'une quelconque des revendications précédentes, 25 comprenant un outil d'imagerie (8) propre à former une image d'une partie du conduit de passage (12) et avantageusement propre à détecter des micro-colonies dans le conduit de passage 12.
5- Système (1, 40) selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 30 lequel le conduit de passage (12) du premier fluide est étendu selon une direction longitudinale (X) et les dimensions transverses du conduit de passage (12) du premier fluide au voisinage du réservoir (14) sont inférieures à 1 mm.
6.- Système (1, 40) selon l'une quelconque des revendications précédentes, 35 comprenant un module d'injection (6) configuré pour injecter le premier fluide dans le 3030049 20 conduit d'entrée (10) en aval de la source (4) et pour entrainer le premier fluide dans le conduit de passage (12).
7.- Système (1, 40) selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 5 lequel la puce (2, 44) comprend une pluralité de conduits de passage (12) parallèles, dans lesquels débouche la sortie (20) du conduit d'entrée (10), la puce (2, 44) comprenant pour chaque conduit de passage (12), un réservoir (14) propre débouchant dans le conduit de passage (12), le premier fluide comprenant avantageusement, en outre, une pluralité de cellules en suspension, la solution pré-chargée de chaque réservoir 10 (14) comprenant un deuxième réactif sélectif dans chaque réservoir, notamment un milieu sélectif de croissance des cellules distinct.
8.- Procédé d'analyse et de culture cellulaire comprenant les étapes suivantes : - fourniture d'un système d'analyse et de culture cellulaire (1, 40) selon l'une quelconque des revendications précédentes ; - injection du premier fluide dans le conduit d'entrée (10) à partir de la source (4) de premier fluide ; - passage du premier fluide (4) dans le conduit de passage (12) jusqu'au réservoir (14); - réaction du premier réactif du premier fluide et du deuxième réactif de la solution pré-chargée dans le conduit de passage (2), de préférence la réaction permettant la formation d'un gel dans le conduit de passage (12).
9.- Procédé d'analyse et de culture cellulaire selon la revendication 8, dans lequel le premier fluide comprend une pluralité de cellules en suspension, et le procédé comprend les étapes suivantes : - formation d'une image d'une partie du conduit de passage (12), et - détection de micro-colonies dans le conduit de passage (12).
10.- Méthode de fabrication d'une puce destinée à être intégrée dans le système d'analyse et de culture cellulaire (1, 40), selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 : - fourniture d'une demi-puce supérieure (72, 84) comprenant un réservoir (14) ; - chargement du réservoir (14) avec une solution comprenant un deuxième réactif ; - fermeture de la demi-puce supérieure (72, 84) par une demi-puce inférieure (70), de façon à former une puce comprenant un conduit d'entrée (10) comportant une 3030049 21 première entrée (18) apte à être reliée à une source d'un premier fluide comprenant un premier réactif, et une sortie (20), au moins un conduit de passage (12) dans lequel débouche la sortie (20) du conduit d'entrée (10), et dans laquelle le réservoir (14) débouche dans le conduit de passage (12). 5