FR3002237A1 - METHODS FOR THE PRODUCTION OF DOUBLE-STRANDED AAV VIRAL PARTICLES - Google Patents
METHODS FOR THE PRODUCTION OF DOUBLE-STRANDED AAV VIRAL PARTICLES Download PDFInfo
- Publication number
- FR3002237A1 FR3002237A1 FR1351295A FR1351295A FR3002237A1 FR 3002237 A1 FR3002237 A1 FR 3002237A1 FR 1351295 A FR1351295 A FR 1351295A FR 1351295 A FR1351295 A FR 1351295A FR 3002237 A1 FR3002237 A1 FR 3002237A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- aav
- viral
- particles
- vectors
- production
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
L'invention concerne des méthodes pour la production de particules virales AAV double brin utilisant le système de cellules d'insecte / baculovirus pour la fabrication de quantités suffisantes de produit pour des applications thérapeutiques telles que la thérapie génique et/ou la vaccination à ADN, dans des utilisations lors d'essais cliniques ou commerciales.The invention relates to methods for producing double-stranded AAV viral particles using the insect cell / baculovirus system for the manufacture of sufficient quantities of product for therapeutic applications such as gene therapy and / or DNA vaccination, in uses in clinical or commercial trials.
Description
1VIETHODES POUR LA PRODUCTION DE PARTICULES VIRALES AAV DOUBLE BRIN DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne des méthodes pour la production de particules virales AAV double brin utilisant le système de cellules d'insecte / baculovirus pour la fabrication de quantités suffisantes de produit pour des applications thérapeutiques telles que la thérapie génique et/ou la vaccination à ADN, dans des utilisations lors d'essais cliniques ou commerciales. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE Les principaux types de vecteurs utilisés aujourd'hui en thérapie génique sont les vecteurs viraux, dont les vecteurs recombinants de virus adéno associé ("recombinant adeno-associated virus" ou "rAAV"). De nombreux essais chez l'animal ont démontré que ces vecteurs peuvent transduire efficacement des tissus tels que le système nerveux central, le muscle, le foie, la rétine et que l'expression du transgène persiste à long termel'2'3. De plus, les vecteurs rAAV présentent l'avantage d'être non pathogènes pour l'homme donc peu dangereux. Dans les vecteurs rAAV, les gènes rep et cap encadrés par les séquences ITR (inverted terminal repeat) codant respectivement pour les protéines régulatrices de la réplication et les protéines structurales de la capside sont excisés et remplacés par le transgène (gène thérapeutique). Les séquences ITR sont conservées et sont les éléments nécessaires pour la réplication et l'encapsidation du génome viral. Pour produire des vecteurs rAAV, la procédure classique consiste à co-transfecter des cellules humaines 293 adhérentes avec un plasmide vecteur rAAV, le plasmide rep-cap sans les ITR et le plasmide auxiliaire contenant les gènes adénoviraux nécessaires à la réplication du virus AAV. Les vecteurs sont généralement purifiés et concentrés par centrifugation ou par chromatographie4'5'6. Cette procédure est lourde à mettre en oeuvre et relativement inefficace pour générer des lots d'AAV à haut titre, sans contamination et en grande quantité nécessaires pour des essais précliniques chez des modèles animaux de grande taille ou pour des essais cliniques.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to methods for the production of double-stranded AAV viral particles using the insect / baculovirus cell system for the manufacture of sufficient quantities of product for the purpose of the invention. therapeutic applications such as gene therapy and / or DNA vaccination, for clinical or commercial use. BACKGROUND ART The main types of vectors used today in gene therapy are the viral vectors, including the recombinant vectors of adeno-associated virus ("recombinant adeno-associated virus" or "rAAV"). Numerous animal tests have shown that these vectors can efficiently transduce tissues such as the central nervous system, muscle, liver, retina and that transgene expression persists long term'2'3. In addition, the rAAV vectors have the advantage of being non-pathogenic for humans and therefore not very dangerous. In the rAAV vectors, the rep and cap genes flanked by the inverted terminal repeat (ITR) sequences coding respectively for the replication regulatory proteins and the capsid structural proteins are excised and replaced by the transgene (therapeutic gene). The ITR sequences are conserved and are the necessary elements for the replication and encapsidation of the viral genome. In order to produce rAAV vectors, the conventional procedure is to co-transfect human 293 cells adherent with an rAAV vector plasmid, the rep-cap plasmid without the ITRs and the helper plasmid containing the adenoviral genes necessary for replication of the AAV virus. The vectors are generally purified and concentrated by centrifugation or chromatography. This procedure is cumbersome and relatively inefficient to generate high-titre, contamination-free, and large quantities of AAVs for preclinical testing in large animal models or for clinical trials.
Les vecteurs rAAV sont actuellement utilisés dans de nombreux essais cliniques de thérapie génique en phase I/II pour le traitement de l'hémophilie B, le déficit en alpha-1 antitrypsine, la maladie de Parkinson, les maladies de dystrophie musculaire comme l'alphasarcoglycanopathie et l'amaurose congénitale de Leberi'7". De nouveaux modes de production et de purification ont été développés pour augmenter à la fois le titre, c'est-à-dire la concentration relative en vecteurs et la qualité des vecteurs tout en assurant une adaptation à grande échelle pour un procédé GMP. A ce jour, les systèmes les plus utilisés reposent sur 1) l'utilisation de lignées stables d'encapsidation, 2) l'infection en suspension des cellules d'insectes sf9 par des vecteurs baculovirus d'expression, ou 3) l'infection en suspension des cellules d'hamster BHK par des vecteurs HSV (herpès simplex)1"1. Les cellules sf9 sont notamment utilisées aujourd'hui pour produire des vecteurs AAV simple brin à l'échelle industrielle. Le génome de l'AAV est composé d'une molécule d'ADN simple brin de 4,7 kb (inactif) dont la conversion en conformation double brin (forme active) est une étape limitante qu'il est possible de contourner en produisant des vecteurs AAV « double brin » notés scAAV (self complementary)12,13. Bien que ce nouveau type de vecteur soit très efficace et expérimenté en phase I/II pour l'essai clinique dans l'hémophilie B, la production des vecteurs scAAV n'est encore à ce jour réalisée qu'en utilisant le système traditionnel de transfection transitoire des cellules HEK293 en adhérence, un système de production inefficace pour le traitement par thérapie génique d'un grand nombre de patients atteints d'hémophilie6. De plus, dus à des problèmes inhérents au vecteur double brin : i) la proportion de particules virales AAV vides, c'est-à-dire de particules dépourvues d'ADN viral est largement prédominante et représente plus de 90%, un produit inactif contribuant à l'immunogénicité du vecteur ; ii) le génome viral n'est pas exclusivement sous forme d'ADN double brin. La présente invention vise à pallier ces problèmes et à fournir un procédé pour la production de particules rAAV double brin avec une amélioration du ratio de particules contenant de l'ADN viral par rapport aux particules vides avec une proportion augmentée de particules contenant un génome double brin.RAAV vectors are currently used in many Phase I / II gene therapy clinical trials for the treatment of hemophilia B, alpha-1 antitrypsin deficiency, Parkinson's disease, muscular dystrophy diseases such as alphasarcoglycanopathy and Leberi'7 "congenital amaurosis." New modes of production and purification have been developed to increase both the titre, ie, the relative vector concentration and the quality of the vectors while ensuring A large-scale adaptation for a GMP process To date, the most widely used systems rely on 1) the use of stable encapsidation lines, 2) the suspension infection of sf9 insect cells by baculovirus vectors expression, or 3) suspension infection of BHK hamster cells by HSV (herpes simplex) 1 "1 vectors. The sf9 cells are especially used today to produce single-stranded AAV vectors on an industrial scale. The genome of AAV is composed of a 4.7 kb single-stranded DNA molecule (inactive) whose conversion into double-stranded conformation (active form) is a limiting step that can be circumvented by producing AAV "double-stranded" vectors rated scAAV (self complementary) 12,13. Although this new type of vector is very effective and tested in phase I / II for the clinical trial in hemophilia B, the production of scAAV vectors is still only achieved using the traditional transfection system. transient adherence of HEK293 cells, an inefficient production system for gene therapy treatment of large numbers of patients with haemophilia6. In addition, due to the problems inherent in the double-stranded vector: i) the proportion of empty AAV viral particles, that is particles devoid of viral DNA is largely predominant and represents more than 90%, an inactive product contributing to the immunogenicity of the vector; ii) the viral genome is not exclusively in the form of double-stranded DNA. The present invention aims to overcome these problems and to provide a method for the production of double-stranded rAAV particles with an improvement in the ratio of particles containing viral DNA to empty particles with an increased proportion of particles containing a double-stranded genome .
RESUIVIE DE L'INVENTION L'invention concerne un procédé pour la production d'un vecteur AAV double brin (scAAV) à haut titre et à grande échelle, comprenant la mise en culture en suspension de cellules d'insectes infectées par un ou plusieurs baculovirus recombinants codant les protéines Rep et Cap d'AAV et codant pour un génome viral d'AAV contenant un transgène d'intérêt, ledit génome viral d'AAV étant susceptible de former un génome double brin dans la particule virale. L'invention permet la production à grande échelle de vecteurs de thérapie génique de grade humain dans le respect des bonnes pratiques de fabrication. Ce procédé permet d'envisager une production industrielle de vecteurs scAAV de thérapie génique. L'invention concerne plus particulièrement un procédé pour la production d'un vecteur scAAV, comprenant: a) l'introduction, dans une cellule d'insecte, des séquences nucléotidiques suivantes au moyen d'au moins un vecteur baculoviral: - une séquence codant un transgène d'intérêt compris entre des ITR d'AAV, la séquence étant choisie de manière à produire un génome AAV double brin; - au moins une séquence codant des protéines de capside d'AAV; et - au moins une séquence codant des protéines Rep d'AAV; b) la culture de ladite cellule d'insecte dans des conditions permettant la production d'un vecteur rAAV et la récolte dudit vecteur rAAV. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la cellule d'insecte est une cellule sf9. Selon un autre mode particulier de réalisation, les séquences nucléotidiques sont introduites dans la cellule d'insecte au moyen d'au moins deux vecteurs baculoviraux. Selon un autre mode de réalisation, les protéines de capside produites sont des protéines de capside d'un AAV de sérotype 9. Selon un mode de réalisation supplémentaire, des protéines de Rep de sérotype 2 sont mises en oeuvre. Selon un autre mode de réalisation, le vecteur rAAV est un vecteur pseudotypé (par exemple un vecteur scAAV2/9, c'est-à-dire un vecteur AAV comprenant un génome viral double brin de sérotype 2 encapsidé dans une particule virale AAV de sérotype 9. Selon une caractéristique avantageuse, le procédé selon l'invention permet de générer plus de 20 % de particules virales rAAV pleines, en particulier plus de 30 %, plus de 40 %, plus de 50 %, plus de 60, 70 %, voire plus de 80 % de particules virales rAAV pleines, c'est-à-dire comprenant un génome AAV encapsidé à l'intérieur desdites particules. Selon une autre caractéristique avantageuse, le procédé de l'invention permet la production de particules rAAV pleines essentiellement composées de génome viral sous forme double brin (par exemple au moins 20, 30, 40 ou au moins 50 % des particules contiennent un génome double brin). La production d'une telle proportion de particules pleines, qui plus est contenant de l'ADN double brin, n'a jamais été montrée au suggérée dans l'état de la technique. LEGENDE DES FIGURES La figure 1 présente (A) une photographie d'un gel SDS-Page coloré au nitrate d'argent et (B) une photographie d'un western blot réalisé sur une membrane de nitrocellulose avec un anticorps monoclonal B1 permettant l'identification des protéines virales Vp. Les échantillons sont déposés en duplicat à 5.109 vg et 101° vg, le puits 1 et 2 correspondent à un lot contrôle interne (ssAAV8-GFP, produit avec le système sf9), les puits 3 et 4 correspondent au lot de scAAV 9 n°A.11003.DEV produit dans les cellules sf9, les puits 5 et 6 correspondent à un autre lot (n°12D0106) de scAAV9 produit dans les cellules sf9 et les puits 7 et 8 correspondent au lot de scAAV9 produit dans des cellules HEK293F (lot n°12D0055). La figure 2 est un graphique montrant le profil de distribution en ultracentrifugation analytique du lot de scAAV9 n°A.12026.DEV#4 produit avec le système sf9 (trait pointillé) et du lot 12D0055 produit avec le système HEK293 (en trait plein) La figure 3 est un graphique montrant le profil de distribution en ultracentrifugation analytique de 3 lots scAAV9-SMN produits avec le système sf9. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention concerne des procédés pour la production d'un vecteur rAAV recombinant double brin (ou self-complementary AAV - scAAV - en anglais). Le procédé repose sur l'utilisation du système cellule d'insecte / baculovirus qui est utilisé aujourd'hui pour la production de vecteurs AAV simple brin à l'échelle industrielle mais qui n'avait jamais été utilisé pour la production de vecteurs scAAV. Les inventeurs ont pu montrer que ce système permet la production de particules virales scAAV de meilleure qualité lorsque qu'elles sont comparées à celles produites par le système classique utilisant des cellules HEK293 transfectées au moyen de plasmides codant tous les éléments nécessaires pour la production d'un rAAV. Les inventeurs ont notamment pu montrer que le procédé selon l'invention permet de générer une proportion élevée de particules virales rAAV pleines et que les particules produites sont essentiellement composées de génome viral sous forme double brin. Une telle qualité dans la production de vecteurs scAAV était totalement inattendue et présente des avantages pour la production à grande échelle de virus scAAV destinés à la thérapie génique. Les éléments du vecteur produit selon l'invention peuvent être dérivés de tout sérotype d'AAV. En particulier, chaque élément peut être dérivé d'un AAV de sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Par ailleurs, les éléments constitutifs du vecteurs rAAV ne sont pas nécessairement tous dérivés du même sérotype. Ainsi, un vecteur rAAV peut être composé d'un génome dérivé d'un AAV de sérotype 2, par exemple, encapsidé par des protéines de capside dérivées d'un AAV de sérotype 9. On parle alors d'un vecteur pseudotypé. Les séquences codant pour les protéines Rep peuvent également être dérivées de tout sérotype d'AAV. Selon un mode particulier de réalisation, la séquence codant les protéines de capside est dérivée d'un AAV de sérotype 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Selon une variante spécifique, la séquence code des protéines de capside d'AAV de sérotype 9 (AAV9). Selon un mode particulier de réalisation, la séquence codant les protéines Rep est dérivée d'un AAV de sérotype 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Selon une variante spécifique, la séquence code des protéines de capside d'AAV de sérotype 2 (AAV2). Selon un mode particulier de réalisation, la séquence codant le génome viral d'AAV contenant le transgène d'intérêt est dérivée d'un AAV de sérotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Selon une variante spécifique, le génome viral est dérivé d'un génome d'AAV2. Le génome viral d'AAV est codé par une séquence comprenant le transgène d'intérêt flanqué de séquences ITR d'AAV. Les moyens d'obtenir un génome AAV double brin sont bien connus de l'homme du métier. Il pourra notamment se référer aux informations des références 12 et 13 ci-dessous, de McCarty et al. et de Wang et al. En résumé, la suppression du Site Terminal de Résolution (trs) au niveau d'un des deux ITR a pour autre caractéristique de ne pas séparer le brin formé du brin néonatal et ainsi de permettre la production d'un génome viral AAV sous forme double brin. Néanmoins, ce système n'est pas efficace et la cellule humaine, qui est la cellule hôte naturelle du système de régulation de l'AAV, est capable de séparer et de former un génome viral AAV simple brin. Par ailleurs, il a été décrit que dans ce système, la production de particules AAV contenant un génome AAV est faible et ne représente que 20% de la totalité des particules virales6. Le transgène d'intérêt peut correspondre à une protéine ou à un ARN dont l'expression est souhaitée dans une cellule de mammifère. Le transgène d'intérêt peut en particulier coder une protéine ou un ARN ayant un intérêt thérapeutique. L'homme du métier a à sa disposition une grande quantité d'information sur les protéines ou ARN dont l'expression peut avoir un intérêt pour compenser l'absence d'expression ou l'expression anormale de ladite protéine, ou pour réguler l'expression d'une telle protéine ou d'un ARN. A titre illustratif, les exemples montrent la production d'une particule rAAV double brin dont le transgène d'intérêt est la protéine SMN. Cette protéine est mutée dans l'amyotrophie spinale. Un scAAV produit selon l'invention permettrait l'expression d'une protéine sauvage restaurant la fonction absente due à la mutation chez un patient. Les différentes séquences codant les éléments constitutifs d'une particule virale AAV sont introduites dans un ou plusieurs baculovirus recombinants différents. Ainsi, selon une alternative, les différentes séquences listées ci-dessus peuvent être introduites dans un seul et même baculovirus recombinant. Selon un mode de réalisation alternatif, deux baculovirus recombinants sont utilisés, l'un codant les protéines Rep et Cap d'AAV (de sérotype(s) identique ou différents) et l'autre portant le génome viral de l'AAV. Selon un autre mode de réalisation, trois baculovirus sont utilisés, chacun portant l'une des trois séquences mentionnées ci-avant. Les gènes codant les protéines de l'AAV peuvent être placés sous le contrôle des promoteurs du baculovirus, régulés par les cellules d'insectes16' 17. La cellule d'insecte utilisée peut être toute cellule permettant la production d'un rAAV. On peut citer à titre d'exemple les cellules sf9 et sf21. Selon un mode particulier de réalisation, la cellule utilisée est une cellule sP9. La production des vecteurs AAV est basée sur l'infection des cellules avec un ou plusieurs des baculovirus décrits ci-dessus. La culture peut être réalisée en suspension, dans un milieu approprié. A titre de milieu approprié pour la culture de cellules sP9, on peut citer le milieu SP900III (Life technologies/Invitrogen). Les cellules sont cultivées dans un bioréacteur de volume approprié, par exemple supérieur à 100 mL, notamment supérieur à 500 mL, à 1 L, à 2 L, à 5 L, à 10 L, voire supérieur à 50 L. Selon un mode particulier de réalisation, les cellules sont infectées par le ou les baculovirus recombinant à une densité comprise entre 0,01.106 et 5.106 cellules/mL, en particulier à une densité cellulaire comprise entre 0,8.106 et 2.106 cellules/mL, et à une multiplicité d'infection (MOI) comprise entre 0,01 et 0,1 en particulier à une MOI de 0,05. La culture cellulaire est ensuite maintenue en suspension dans des conditions de culture permettant la production d'un AAV recombinant. Si la cellule d'insecte utilisée est une cellule 09, elles seront maintenues en suspension à environ 27°C pendant 96 à 144 heures. Les vecteurs sont ensuite purifiés. La purification peut comprendre une première étape de lyse des cellules. La lyse peut comprendre des étapes de lyse chimique, mécanique ou enzymatique, notamment chimique. Selon une variante de réalisation, une lyse chimique est mise en oeuvre, par addition d'une solution de détergent aux cellules, notamment de Triton-X100. L'ADN est ensuite dégradé par digestion enzymatique, notamment par addition de benzonase. L'étape de purification peut notamment également comprendre une étape de clarification (e.g. sur filtre 0,45 pm). Les particules virales peuvent ensuite être davantage purifiées sur colonne(s) de chromatographie ou par ultracentrifugeuse ou par une combinaison des deux approches. Selon un mode particulier de réalisation, cette étape de purification sur colonne(s) comprend une ou plusieurs chromatographies échangeuses d'ions. Selon un mode spécifique de réalisation, les chromatographies échangeuses d'ions emploient successivement: 1) une résine cationique, par exemple SP sepharose (GE Healthcare); 2) une résine anionique en mode négatif, par exemple Fractogele EMDTMAE, MerckMillipore), puis 3) une résine anionique telle que la résine POROS 50HQ (Life Technologies Invitrogen). Les particules virales rAAV peuvent ensuite être concentrées et formulées dans un tampon, notamment tampon PBS, par exemple par filtration tangentielle (TFF) pour être à une concentration finale d'environ> 1-11 u vg/ml. Ces particules concentrées peuvent être filtrées, notamment sur un filtre de 0,2 p.m. Selon un aspect particulier, l'invention se rapporte donc également à un procédé de purification de particules rAAV comprenant la soumission d'un lysat cellulaire contenant des particules rAAV aux étapes successives suivantes: - une étape de chromatographie sur résine cationique en mode capture; - une étape de chromatographie sur résine anionique en mode négatif; puis - une étape de chromatographie sur résine anionique en mode capture. Le lysat cellulaire soumis à ces étapes de chromatographie peut être issus des étapes de production développées ci-dessus. Selon un autre aspect, l'invention concerne également un ensemble de particules scAAV, en particulier scAAV9, produit et éventuellement purifiées selon les modalités décrites ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne une composition comprenant des particules rAAV double brin, au moins 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, voire au moins 80 % des particules étant pleines, c'est-à-dire comprenant un génome AAV encapsidé à l'intérieur desdites particules et ces particules étant essentiellement composées de génome viral sous forme double brin, i.e. au moins 30 %, en particulier au moins 40 %, voire au moins 50% des particules contiennent un génome viral sous forme double brin. L'invention sera davantage détaillée dans les exemples ci-dessous qui décrivent un mode de réalisation particulier, non limitatif, de l'invention. EXEMPLES Matériels et Méthodes 1. Culture cellulaire a. Système de cellules d'insecte (sf9) La production des vecteurs scAAV9-SMN avec le système sf9/baculovirus est basée sur l'infection des cellules d'insectes sf9 dont la culture est réalisée en suspension dans le milieu SP900III. Brièvement, dans un bioréacteur de 10L, lorsque la concentration cellulaire est comprise entre 0,8.106 à 2.106 cellules/ml, les cellules sont infectées à une MOI de 0,05 par deux baculovirus, l'un codant pour les protéines Rep de sérotype 2 et Cap de sérotype 9 du vecteur AAV et l'autre pour le génome viral de l'AAV (transgène scSMN). La culture cellulaire est maintenue en suspension à 27°C entre 96h et 144h. b. Système de cellules humaines (HEK293F) La production des vecteurs scAAV9-SMN avec le système HEK293F/plasmide est basée sur la transfection de ces cellules dont la culture est réalisée en suspension dans un milieu dépourvu en protéine animale (F17). Brièvement, dans un bioréacteur de 10L, les cellules sont transfectées à la concentration cellulaire de 106 cellules/mi par 3 plasmides: - le plasmide auxiliaire pXX6 contenant les gènes de l'adenovirus essentiels pour la réplication du vecteur AAV - le plasmide codant pour les protéines Rep de sérotype 2 et Cap de sérotype 9 du vecteur AAV - le plasmide codant pour le génome viral du vecteur AAV (transgène scSMN) avec 20 mg total de plasmide en quantité équimolaire et 25 mL de PEIpr0TM à 1 mg/m1 (Polyplus). La culture cellulaire est maintenue en suspension à 37°C pendant 72h. 2. Purification La purification des vecteurs AAV est réalisée à partir de 2 L de culture et se déroulent en 2 grandes étapes dont la première est légèrement différente pour les 2 types de culture. a) Etape 1 Système cellules d'insecte (sf9) : Les cellules et les baculovirus sont lyses chimiquement par addition d'une solution de Triton-X100 à 0,5% puis l'ADN cellulaire est dégradé par addition de benzonase (25U/m1 de culture). La solution est ensuite clarifiée sur filtre 0,45p.m. A cette étape, l'échantillon est dénommé « vrac » et titré par qPCR en utilisant une sonde et deux amorces spécifiques du génome viral AAV. La séquence nucléotidique de la sonde est 5'- TAGTTAATGATTAACCC-3' (SEQ ID NO:1), celle de l'amorce 1 (sens) est 5'- CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG-3' (SEQ ID NO:2) et de l'amorce 2 (antisens) est 5'- GTAGATAAGTAGCATGGC-3' (SEQ ID NO:3). Système cellules humaines (HEK293F) : La culture est concentrée, formulée dans 500 ml par filtration tangentielle (TFF), les cellules sont ensuite lysées mécaniquement et l'ADN cellulaire est dégradé par addition de benzonase (SOU/mi de culture). La solution est ensuite clarifiée sur filtre 0,45p.m. A cette étape, l'échantillon est dénommé « vrac » et titré par qPCR en utilisant la sonde et les amorces dont les séquences sont fournies ci-dessus. b) Etape 2 Les étapes de chromatographies échangeuses se décompose en trois parties : Le lysat filtré sur membrane 0,45 i.tm est dilué dans un tampon MES 50 mM pH 6.0 puis chargé sur une résine cationique (SP sepharose, GE healthcare) ; l'élution est effectuée, avec variante de réalisation, à forte concentration en sel jusqu'à 200 mM. L'éluât de chromatographie est dilué dans un tampon Trizma base 50 mM afin d'avoir une concentration en sel d'environ 25 mM et un pH 8.0 avant d'être chargé en mode négatif sur une résine anionique (Fractogele EMDTMAE, Merck-Millipore). La fraction non retenue est collectée et le pH est ajusté à pH 9.0 puis la solution est chargée sur une résine anionique (POROS 50HQ, Life tehnologies Invitrogen) utilisée comme une étape de capture. L'élution est réalisée à forte concentration en sel. Les particules virales AAV sont concentrées et formulées dans un tampon PBS par filtration tangentielle (TFF) utilisant un seuil de coupure de 100KDa pour être à une concentration finale d'environ i0h1 vg/ml et filtrées sur 0,21.1m. 3. Analyses et caractérisation du vecteur scAAV9 a) Titration en génome viral (vg/ml) - qPCR Le titre en génome viral (vg/mL) des échantillons représentant des intermédiaires de purification et des produits purifiés a été déterminé par PCR quantitative en utilisant le couple sonde/amorcel/amorce2 correspondant à un amplicon situé dans la région ITR du plasmide transgène dont les séquences sont fournies ci-dessus. b) Pureté : SDS-PAGE, coloration au nitrate d'argent Le degré de pureté des vecteurs AAV a été évalué en réalisant un gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) suivie d'une coloration au nitrate d'argent. Tous les échantillons ont été déposés à vg équivalent (5.109 vg et 1019 vg), la masse molaire des protéines a été déterminée à l'aide d'un marqueur de protéines standards de masses molaires connues. c) Identité des protéines virales Vp de l'AAV: Western blot Les protéines virales de la capside de l'AAV (Vp 1, Vp2 et Vp3) ont été identifiées en réalisant un gel SDS-PAGE suivie d'un transfert sur membrane de nitrocellulose et d'une détection par immunofluorescence avec l'anticorps monoclonal Bi. Tous les échantillons ont été déposés à vg équivalent (5.10° vg et 1010 vg), la masse molaire des protéines a été déterminée à l'aide d'un marqueur de protéines standards de masses molaires connues. d) Analyse des particules virales AAV vides et pleines : Ultracentrifugation analytique Le coefficient de sédimentation des différentes particules virales d'AAV (vide, pleine, agrégat) et autres populations présentes (subparticules, protéines contaminantes, agrégat) dans les produits purifiés a été déterminé par centrifugation en temps réel. La centrifugation des échantillons a été réalisée à une vitesse de 16000 rpm en utilisant 1041 ou 400 11.1 de vecteurs purs non dilués, la sédimentation a été suivie par absorbance à la longueur d'onde de 276 nm, le coefficient de sédimentation des différentes populations a été obtenu en utilisant le logiciel SEDFIT. Résultats 1. Culture cellulaire et titre en génome viral à l'étape 1 de purification. Dans un volume de bioréacteur de 10L, deux lots de cellules humaines HEK293F (n° 12D0004 et 12D0082) a été transfecté et deux lots de cellules d'insectes sf9 (n° A.12026.DEV et 12D0066) ont été infectés, puis 2L de culture ont été purifiés par filtration. A cette étape, la production des particules virales d'AAV a été quantifiée par PCR quantitative (tableau 1). Le vrac 12D0055 et 12D0082 ont été obtenus respectivement à partir de la culture 12D0004 et 12D0082 (HEK293F), le vrac A.12026.DEV-4 à partir de la culture A.12026.DEV (sf9) et les 3 vracs 12D0066, 12D0070 et 12D0068 à partir de la culture 12D0066 (09). A cette étape de purification, les 2 systèmes de culture montrent une productivité similaire de particules virales d'AAV en termes de génomes viraux produits par cellule (de l'ordre de 104 vg/cellule) et de quantité totale de génomes viraux (environ 1013 vg). 2. Caractérisation du vecteur scAAV9-SMN final (après étape 2 de purification) La purification des vracs a été poursuivie par 3 chromatographies successives à échange d'ions (étape 2) en appliquant un procédé décrit dans la littérature pour l'obtention de vecteurs AAV de grade précliniques et cliniques14. Cependant, la résine anionique POROS 50HQ, décrite comme non appropriée pour purifier les vecteurs AAV9 produits avec la méthode classique (cellules humaines HEK293 adhérentes), s'est révélée efficace pour capturer les vecteurs AAV9 produits en suspension. Nous avons ainsi obtenu des préparations virales scAAV9-SMN dont le titre en génome viral, la pureté, l'identité et la quantification des particules virales vides et pleines ont été déterminés. A partir des 6 vracs récoltés à l'étape 1, deux lots avec le système HEK293F et quatre lots avec le système sf9 ont été générés, le lot 12D0106 ayant été obtenu en réunissant les vracs 12D0066 et 12D0070 (tableau 2). a) Titration en génome viral (vg/ml) Les 2 systèmes conduisent à une productivité similaire en ce qui concerne le nombre de génome viral (de l'ordre de 1011 à 1012 vg) et donc de particules virales d'AAV9 contenant le transgène d'intérêt SMN (dénommées particules d'AAV pleines). b) Pureté et identité Le profil en SDS-Page et Western blot de 2 lots 12D0106 et A.12026.DEV-4 (système sf9) sont identiques avec la présence des 3 protéines virales Vpl, Vp2 et Vp3 de masses molaires respectivement de 87 kDa, 72kDa et 62 kDa et les quantités relatives de 1 :1 :10, correspondant à celles attendues et au contrôle interne (figlA et 1B). Ceci montre que les vecteurs scAAV9-produits avec le système sf9 sont purs et que la particule virale est conforme. Le profil en SDS-Page et en Western blot du lot 12D0055 (système HEK293F) montre la présence de très nombreuses protéines dont certaines sont reconnues par l'anticorps B1 et qui correspondent à protéines virales dégradées (figlA et 1B). Ceci indique que le vecteur scAAV9 produit avec le système HEK293F n'est pas pur. Le procédé de chromatographie mis en place aujourd'hui et identique aux 2 systèmes de culture, ne permet pas d'obtenir des lots purs de vecteurs scAAV9 produits avec le système HEK293F. c) Analyse des particules d'AAV vides et pleines Il a été décrit dans la littérature que la densité est approximativement de 1,32 g/cm3 (équivalent à 60S) pour les particules virales AAV vides, c'est-à-dire les vecteurs dépourvus de génome viral et de 1,45 g/cm3 (équivalent à 110S) pour les particules virales AAV pleines, c'est-à-dire ceux contenant un génome viral de taille maximale de 4800 bases15. Sachant que la différence de densité est suffisamment significative pour les distinguer par centrifugation, nous avons aujourd'hui mis en place une méthode pour séparer analytiquement par ultracentrifugation et quantifier les différentes espèces présentes dans une préparation virale d'AAV. L'analyse en ultracentrifugation analytique des vecteurs scAAV9-SMN a été réalisée dans un premier temps en comparant un lot produit en système sf9 (A.12026.DEV-4) avec le lot 12D0055 produit en système HEK293 (figure 2). Le profil de distribution des espèces permet d'identifier 2 catégories de populations: a) < 60S correspondant à des protéines virales non assemblées et/ou contaminants. Cette population est quasiment absente dans le lot A.12026.DEV-4 alors qu'elles sont présentes en quantité non négligeable dans le lot 12D0055. Ces impuretés ont également été détectées en SDS-Page (figure 1). b) 60S - 110S correspondant à des particules virales AAV intactes La population « 60S-110S » se décline en 2 sous-populations avec les particules virales d'AAV vides à 65S et les particules virales d'AAV pleines entre 80S et 110S avec le génome viral sous la forme simple brin à 90S et sous la forme double brin à 105S. Ces valeurs sont spécifiques aux vecteurs scAAV9-SMN et seront redéfinies en fonction du type du génome. De façon très inattendue, nous avons détecté très peu de particules virales d'AAV vides avec le système sf9 comparée au système HEK293. De plus, les particules virales AAV pleines sont nettement plus enrichies en génome sous forme double brin (105S) avec le système sf9 comparée au système HEK293. Le profil de distribution du lot 12D0082 est identique à celui du lot 12D0055, ce qui confirme que le système HEK293 produit essentiellement très peu de particules AAV pleines (< 25%) avec seulement 10% de particules virales contenant le génome sous forme double brin. Une seconde expérience avec les 3 lots de vecteurs scAAV9-SMN produits en système sf9 (A.12026.DEV-4, 12D0106, 12D0068) a été réalisée de la même façon par ultracentrifugation analytique (figure 3). Ces 3 lots montrent tous un profil de distribution similaire et confirme que le système sf9 permet de produire des particules virales d'AAV essentiellement composées de particules d'AAV pleines (>80%) avec une très forte proportion de génome viral sous forme double brin (>50%).SUMMARY OF THE INVENTION The invention relates to a method for the production of a large-scale, high-titre double-stranded AAV vector (scAAV), comprising culturing in suspension of insect cells infected with one or more baculoviruses. recombinant proteins encoding the AAV Rep and Cap proteins and encoding an AAV viral genome containing a transgene of interest, said AAV viral genome being capable of forming a double-stranded genome in the viral particle. The invention enables the large-scale production of human-grade gene therapy vectors in accordance with good manufacturing practices. This method makes it possible to envisage an industrial production of scAAV gene therapy vectors. The invention relates more particularly to a method for the production of a scAAV vector, comprising: a) introducing, into an insect cell, the following nucleotide sequences using at least one baculovirus vector: a coding sequence a transgene of interest comprised between AAV RTIs, the sequence being selected to produce a double-stranded AAV genome; at least one sequence encoding AAV capsid proteins; and at least one sequence encoding AAV Rep proteins; b) culturing said insect cell under conditions permitting the production of an rAAV vector and harvesting said rAAV vector. According to a particular embodiment of the invention, the insect cell is a sf9 cell. According to another particular embodiment, the nucleotide sequences are introduced into the insect cell by means of at least two baculovirus vectors. According to another embodiment, the capsid proteins produced are capsid proteins of a serotype 9 AAV. According to a further embodiment, serotype 2 Rep proteins are used. According to another embodiment, the rAAV vector is a pseudotyped vector (for example a scAAV2 / 9 vector, that is to say an AAV vector comprising a double-stranded viral genome of serotype 2 packaged in a serotype AAV viral particle. 9. According to an advantageous characteristic, the method according to the invention makes it possible to generate more than 20% of rAAV viral particles, in particular more than 30%, more than 40%, more than 50%, more than 60, 70%, or more than 80% of full rAAV viral particles, that is to say comprising an AAV genome packaged inside said particles According to another advantageous characteristic, the method of the invention allows the production of solid rAAV particles essentially consisting of a double-stranded viral genome (eg at least 20, 30, 40 or at least 50% of the particles contain a double-stranded genome) The production of such a proportion of solid particles, moreover containing Double DNA the strand, has never been shown to the suggested in the state of the art. FIGURE LEGEND FIG. 1 shows (A) a photograph of a silver nitrate stained SDS-Page gel and (B) a photograph of a western blot made on a nitrocellulose membrane with a B1 monoclonal antibody allowing identification of viral proteins Vp. The samples are deposited in duplicate at 5 × 10 9 and 101 °, well 1 and 2 correspond to an internal control lot (ssAAV8-GFP, produced with the sf9 system), wells 3 and 4 correspond to the lot of scAAV 9 no. A.11003.DEV produced in sf9 cells, wells 5 and 6 correspond to another batch (no. 12D0106) of scAAV9 produced in sf9 cells and wells 7 and 8 correspond to the lot of scAAV9 produced in HEK293F cells ( lot no. 12D0055). Figure 2 is a graph showing the analytic ultracentrifugation distribution profile of the batch of scAAV9 # A.12026.DEV # 4 produced with the sf9 system (dashed line) and lot 12D0055 produced with the HEK293 system (solid line) Figure 3 is a graph showing the analytic ultracentrifugation distribution profile of 3 scAAV9-SMN lots produced with the sf9 system. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to methods for producing a double strand recombinant rAAV vector (or self-complementary AAV - scAAV). The method relies on the use of the insect cell / baculovirus system which is used today for the production of single-strand AAV vectors on an industrial scale but which has never been used for the production of scAAV vectors. The inventors have been able to show that this system allows the production of better quality scAAV viral particles when compared to those produced by the conventional system using HEK293 cells transfected with plasmids encoding all the elements necessary for the production of an rAAV. The inventors have in particular been able to show that the method according to the invention makes it possible to generate a high proportion of solid rAAV viral particles and that the particles produced are essentially composed of viral genome in double-stranded form. Such quality in the production of scAAV vectors was totally unexpected and has advantages for the large scale production of scAAV viruses for gene therapy. The elements of the vector produced according to the invention may be derived from any serotype of AAV. In particular, each element can be derived from an AAV of serotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11. Furthermore, the constituent elements of the rAAV vector are not necessarily all derived from the same serotype. Thus, an rAAV vector may be composed of a genome derived from a serotype 2 AAV, for example, packaged with capsid proteins derived from a serotype 9 AAV. This is called a pseudotyped vector. The coding sequences for the Rep proteins can also be derived from any AAV serotype. According to one particular embodiment, the sequence encoding the capsid proteins is derived from an AAV of serotype 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11. According to a specific variant, the Serotype 9 AAV Capsid Protein (AAV9) coding sequence. According to one particular embodiment, the sequence coding for the Rep proteins is derived from an AAV of serotype 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11. According to a specific variant, the sequence serotype 2 AAV capsid protein code (AAV2). According to a particular embodiment, the sequence encoding the AAV viral genome containing the transgene of interest is derived from an AAV of serotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11. According to a specific variant, the viral genome is derived from an AAV2 genome. The viral AAV genome is encoded by a sequence comprising the transgene of interest flanked by AAV ITR sequences. The means for obtaining a double-stranded AAV genome are well known to those skilled in the art. In particular, he may refer to the information in references 12 and 13 below, by McCarty et al. and Wang et al. In summary, the deletion of the Resolution Terminal Site (trs) at one of the two ITRs has another characteristic of not separating the strand formed from the neonatal strand and thus allowing the production of an AAV viral genome in double form. strand. Nevertheless, this system is not efficient and the human cell, which is the natural host cell of the AAV regulatory system, is capable of separating and forming a single-stranded AAV viral genome. Furthermore, it has been reported that in this system the production of AAV particles containing an AAV genome is low and accounts for only 20% of the total virus particles6. The transgene of interest may be a protein or RNA whose expression is desired in a mammalian cell. The transgene of interest can in particular encode a protein or an RNA having a therapeutic interest. Those skilled in the art have at their disposal a large amount of information on the proteins or RNA whose expression may be of interest to compensate for the lack of expression or the abnormal expression of said protein, or for regulating the expression of such a protein or RNA. By way of illustration, the examples show the production of a double-stranded rAAV particle whose transgene of interest is the SMN protein. This protein is mutated in spinal muscular atrophy. A scAAV produced according to the invention would allow the expression of a wild-type protein restoring the function absent due to mutation in a patient. The different sequences encoding the constitutive elements of an AAV viral particle are introduced into one or more different recombinant baculoviruses. Thus, according to one alternative, the various sequences listed above can be introduced into a single recombinant baculovirus. According to an alternative embodiment, two recombinant baculoviruses are used, one encoding the AAV Rep and Cap proteins (of the same or different serotype (s)) and the other carrying the viral AAV genome. According to another embodiment, three baculoviruses are used, each carrying one of the three sequences mentioned above. The genes encoding the AAV proteins may be placed under the control of baculovirus promoters, regulated by insect cells 16 '. The insect cell used may be any cell capable of producing rAAV. By way of example, mention may be made of the sf9 and sf21 cells. According to a particular embodiment, the cell used is an sP9 cell. The production of AAV vectors is based on the infection of cells with one or more of the baculoviruses described above. The culture can be carried out in suspension, in a suitable medium. As a suitable medium for the culture of sP9 cells, mention may be made of SP900III medium (Life Technologies / Invitrogen). The cells are cultured in a bioreactor of appropriate volume, for example greater than 100 ml, especially greater than 500 ml, 1 L, 2 L, 5 L, 10 L, or even greater than 50 L. According to a particular mode the cells are infected with the recombinant baculovirus (s) at a density of between 0.01 × 10 6 and 5 × 10 6 cells / ml, in particular at a cell density of between 0.8 × 10 6 and 2 × 10 6 cells / ml, and at a multiplicity of infection (MOI) of between 0.01 and 0.1, in particular at an MOI of 0.05. The cell culture is then kept in suspension under culture conditions allowing the production of a recombinant AAV. If the insect cell used is a cell 09, they will be held in suspension at about 27 ° C for 96 to 144 hours. The vectors are then purified. The purification may comprise a first step of lysing the cells. The lysis may comprise chemical, mechanical or enzymatic lysis, in particular chemical lysis steps. According to an alternative embodiment, a chemical lysis is carried out, by adding a detergent solution to the cells, especially Triton-X100. The DNA is then degraded by enzymatic digestion, in particular by the addition of benzonase. The purification step may in particular also comprise a clarification step (e.g., on a 0.45 μm filter). The viral particles can then be further purified on a chromatography column (s) or ultracentrifuge or a combination of both approaches. According to a particular embodiment, this column purification step (s) comprises one or more ion exchange chromatograms. According to a specific embodiment, the ion exchange chromatography successively use: 1) a cationic resin, for example SP Sepharose (GE Healthcare); 2) a negative mode anionic resin, for example Fractogele EMDTMAE, MerckMillipore), then 3) an anionic resin such as the resin POROS 50HQ (Life Technologies Invitrogen). The rAAV viral particles can then be concentrated and formulated in a buffer, in particular PBS buffer, for example by tangential filtration (TFF) to be at a final concentration of approximately> 1-11 μg / ml. These concentrated particles can be filtered, in particular on a 0.2 μm filter. According to a particular aspect, the invention therefore also relates to a process for purifying rAAV particles comprising subjecting a cell lysate containing rAAV particles to the steps following successive steps: a step of cationic resin chromatography in capture mode; an anionic resin chromatography step in negative mode; then - an anionic resin chromatography step in capture mode. The cell lysate subjected to these chromatography steps may be derived from the production steps developed above. According to another aspect, the invention also relates to a set of scAAV particles, in particular scAAV9, produced and optionally purified according to the modalities described above. More particularly, the invention relates to a composition comprising double-stranded rAAV particles, at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, or even at least 80% of the particles being solid, that is, ie comprising an AAV genome packaged inside said particles and these particles being essentially composed of viral genome in double-stranded form, ie at least 30%, in particular at least 40%, or even at least 50% of the particles contain a viral genome in double-stranded form. The invention will be further detailed in the examples below which describe a particular, non-limiting embodiment of the invention. EXAMPLES Materials and Methods 1. Cell culture a. Insect Cell System (sf9) The production of the scAAV9-SMN vectors with the sf9 / baculovirus system is based on the infection of the sf9 insect cells cultured in suspension in SP900III medium. Briefly, in a 10L bioreactor, when the cell concentration is between 0.8.106 to 2.106 cells / ml, the cells are infected at an MOI of 0.05 with two baculoviruses, one coding for serotype 2 Rep proteins. and serotype 9 cap of the AAV vector and the other for the viral genome of AAV (transgene scSMN). The cell culture is kept in suspension at 27 ° C between 96h and 144h. b. Human Cell System (HEK293F) The production of the scAAV9-SMN vectors with the HEK293F / plasmid system is based on the transfection of these cells, the culture of which is carried out in suspension in a medium lacking animal protein (F17). Briefly, in a 10L bioreactor, the cells are transfected at the cell concentration of 10 6 cells / ml with 3 plasmids: the auxiliary plasmid pXX6 containing the adenovirus genes essential for the replication of the AAV vector; the plasmid coding for the AAV serotype 2 and AAV vector serotype 9 Rep proteins - the plasmid encoding the viral genome of the AAV vector (scSMN transgene) with 20 mg of plasmid in equimolar amount and 25 ml of PEIprO ™ at 1 mg / ml (Polyplus) . The cell culture is kept in suspension at 37 ° C for 72h. 2. Purification The purification of the AAV vectors is carried out from 2 L of culture and take place in two large stages, the first of which is slightly different for the two types of culture. a) Step 1 Insect Cell System (sf9): Cells and baculoviruses are chemically lysed by addition of a 0.5% Triton-X100 solution and then the cellular DNA is degraded by the addition of benzonase (25U / m1 of culture). The solution is then clarified on a 0.45 μm filter. At this stage, the sample is called "bulk" and titrated with qPCR using a probe and two specific primers of the AAV viral genome. The nucleotide sequence of the probe is 5'-TAGTTAATGATTAACCC-3 '(SEQ ID NO: 1), that of primer 1 (sense) is 5'-CTCCATCACTAGGGGTTCCTTG-3' (SEQ ID NO: 2) and the Primer 2 (antisense) is 5'-GTAGATAAGTAGCATGGC-3 '(SEQ ID NO: 3). Human cell system (HEK293F): The culture is concentrated, formulated in 500 ml by tangential filtration (TFF), the cells are then mechanically lysed and the cellular DNA is degraded by adding benzonase (SOU / mi culture). The solution is then clarified on a 0.45 μm filter. At this stage, the sample is called "bulk" and titrated with qPCR using the probe and primers whose sequences are provided above. b) Step 2 The exchange chromatography steps are divided into three parts: The membrane-filtered lysate 0.45 .mu.m is diluted in a 50 mM MES buffer pH 6.0 and then loaded onto a cationic resin (SP Sepharose, GE Healthcare); the elution is carried out, with variant embodiment, with a high salt concentration of up to 200 mM. The chromatography eluate is diluted in a 50 mM Trizma base buffer in order to have a salt concentration of about 25 mM and a pH 8.0 before being loaded in negative mode on an anionic resin (Fractogele EMDTMAE, Merck-Millipore ). The non-retained fraction is collected and the pH is adjusted to pH 9.0 and the solution is loaded onto an anionic resin (POROS 50HQ, Life tehnologies Invitrogen) used as a capture step. Elution is carried out with high salt concentration. The AAV viral particles are concentrated and formulated in PBS buffer by tangential filtration (TFF) using a cut-off threshold of 100KDa to be at a final concentration of about 10h1 vg / ml and filtered over 0.21.1m. 3. Analysis and Characterization of the scAAV9 Vector a) Titration in Viral Genome (vg / ml) - qPCR The viral genome titre (vg / ml) of the samples representing purification intermediates and purified products was determined by quantitative PCR using the probe / amorcel / primer pair corresponding to an amplicon located in the ITR region of the transgene plasmid whose sequences are provided above. b) Purity: SDS-PAGE, silver nitrate staining The degree of purity of the AAV vectors was evaluated by carrying out an electrophoresis gel of the proteins under denaturing conditions (SDS-PAGE) followed by a staining with nitrate of money. All the samples were deposited at the equivalent (5 × 10 9 and 1019 μg), the molecular weight of the proteins was determined using a standard protein marker of known molar masses. c) Identity of the viral proteins Vp of AAV: Western blot The viral proteins of the capsid of AAV (Vp 1, Vp2 and Vp3) were identified by carrying out an SDS-PAGE gel followed by a transfer on membrane of nitrocellulose and immunofluorescence detection with monoclonal antibody Bi. All samples were plated at 5% equivalent (5.10 ° and 1010 μg), the protein molecular weight was determined using a standard protein marker of known molar masses. d) Analysis of empty and solid AAV viral particles: Analytical ultracentrifugation The sedimentation coefficient of the various AAV viral particles (empty, solid, aggregate) and other present populations (subparticles, contaminating proteins, aggregate) in the purified products was determined by real-time centrifugation. The centrifugation of the samples was carried out at a speed of 16000 rpm using 1041 or 400 11.1 undiluted pure vectors, the sedimentation was followed by absorbance at the wavelength of 276 nm, the sedimentation coefficient of the different populations was obtained using the SEDFIT software. Results 1. Cell Culture and Title in Viral Genome at Purification Step 1 In a 10L bioreactor volume, two batches of human HEK293F cells (# 12D0004 and 12D0082) were transfected and two batches of sf9 insect cells (# A.12026.DEV and # 12D0066) were infected, followed by 2L of culture were purified by filtration. At this stage, the production of the AAV viral particles was quantified by quantitative PCR (Table 1). Bulk 12D0055 and 12D0082 were obtained respectively from crop 12D0004 and 12D0082 (HEK293F), bulk A.12026.DEV-4 from crop A.12026.DEV (sf9) and 3 bulks 12D0066, 12D0070 and 12D0068 from culture 12D0066 (09). At this purification step, the 2 culture systems show a similar productivity of AAV viral particles in terms of viral genomes produced per cell (of the order of 104 vg / cell) and of total amount of viral genomes (approximately 1013 vg). 2. Characterization of the final scAAV9-SMN vector (after purification step 2) The purification of the bulk was continued by 3 successive ion exchange chromatographies (step 2) by applying a method described in the literature for obtaining vectors. AAVs of preclinical and clinical grade14. However, the POROS 50HQ anionic resin, described as not suitable for purifying the AAV9 vectors produced with the conventional method (adherent human HEK293 cells), has been shown to be effective in capturing the AAV9 vectors produced in suspension. We thus obtained scAAV9-SMN viral preparations whose title in viral genome, the purity, the identity and the quantification of empty and full viral particles were determined. From the 6 bulks collected in step 1, two batches with the HEK293F system and four batches with the sf9 system were generated, the batch 12D0106 having been obtained by combining the bulks 12D0066 and 12D0070 (Table 2). a) Titration in viral genome (vg / ml) The two systems lead to a similar productivity as regards the number of viral genome (of the order of 1011 to 1012 vg) and thus of viral particles of AAV9 containing the transgene of interest SMN (referred to as full AAV particles). b) Purity and Identity The SDS-Page and Western blot profile of 2 lots 12D0106 and A.12026.DEV-4 (system sf9) are identical with the presence of the 3 viral proteins Vp1, Vp2 and Vp3 of respectively 87 molar masses. kDa, 72kDa and 62 kDa and the relative amounts of 1: 1: 10, corresponding to those expected and internal control (figlA and 1B). This shows that the scAAV9-vectors produced with the sf9 system are pure and that the virus particle is compliant. The SDS-Page and Western blot profile of lot 12D0055 (HEK293F system) shows the presence of a large number of proteins, some of which are recognized by antibody B1 and which correspond to degraded viral proteins (figlA and 1B). This indicates that the scAAV9 vector produced with the HEK293F system is not pure. The chromatography method set up today and identical to the 2 culture systems, does not allow to obtain pure batches of scAAV9 vectors produced with the HEK293F system. c) Analysis of empty and solid AAV particles It has been described in the literature that the density is approximately 1.32 g / cm3 (equivalent to 60S) for empty AAV viral particles, i.e. vectors lacking viral genome and 1.45 g / cm3 (equivalent to 110S) for solid AAV viral particles, that is to say those containing a viral genome with a maximum size of 4800 bases15. Knowing that the difference in density is sufficiently significant to distinguish them by centrifugation, we have today implemented a method to analytically separate by ultracentrifugation and quantify the different species present in an AAV viral preparation. Analytical ultracentrifugation analysis of the scAAV9-SMN vectors was performed initially by comparing a batch produced in system sf9 (A.12026.DEV-4) with lot 12D0055 produced in HEK293 system (FIG. 2). The distribution profile of the species makes it possible to identify 2 categories of populations: a) <60S corresponding to unassembled viral proteins and / or contaminants. This population is almost absent in lot A.12026.DEV-4 while they are present in a significant amount in lot 12D0055. These impurities were also detected in SDS-Page (FIG. 1). b) 60S-110S corresponding to intact AAV viral particles The "60S-110S" population is divided into 2 subpopulations with empty AAV viral particles at 65S and full AAV viral particles between 80S and 110S with the viral genome in single-stranded form at 90S and double-stranded at 105S. These values are specific to the scAAV9-SMN vectors and will be redefined according to the genome type. Very unexpectedly, we detected very few empty AAV virus particles with the sf9 system compared to the HEK293 system. In addition, the solid AAV viral particles are significantly more enriched in the double-stranded (105S) genome with the sf9 system compared to the HEK293 system. The distribution profile of lot 12D0082 is identical to lot 12D0055, which confirms that the HEK293 system produces essentially very few solid AAV particles (<25%) with only 10% of viral particles containing the double-stranded genome. A second experiment with the 3 batches of scAAV9-SMN vectors produced in system sf9 (A.12026.DEV-4, 12D0106, 12D0068) was carried out in the same way by analytical ultracentrifugation (FIG. 3). These 3 batches all show a similar distribution profile and confirm that the sf9 system produces AAV viral particles essentially composed of solid AAV particles (> 80%) with a very high proportion of viral genome in double-stranded form. (> 50%).
Culture cellulaire Purification: Etape 1 Type Lot N° Cellule/mi Vrac N° Volume Titre Titre Total Vg (L) (vg/ml) (vg/cellule) HEK293F 12D0004 1,0E+06 12D0055 0,5 4,0E+10 4,0E+04 2,0E+13 12D0082 1,0E+06 12D0082 2 1,2E+10 1,2E+04 2,4E+13 sf9 A.12026.DEV 1,0E+06 A.12026.DEV-4 2 2,2E+10 1,3E+04 4,5E+13 12D0066 1,9E+06 12D0066 2 1,9E+10 1,0E+04 3,8E+13 12D0070 2 2,0E+10 1,0E+04 4,0E+13 12D0068 2 6,4E+09 3,4E+03 1,3E+13 Tableau 1 : Description de la concentration cellulaire dans le bioréacteur de 10L avant transfection ou infection, des volumes (L) et des titres en génomes viraux (vg/ml) obtenus après la purification (étape 1) de 2L culture cellulaire. Culture cellulaire Purification Type Lot N° Etape 1 Etape 2 Vrac N° Lot N° Vol (ml) Titre Total Vg (vg/mL) HEK293F 12D0004 12D055 12D0055 0,6 1,6E+12 9,5E+11 12D0082 12D0082 12D0082 0,8 5,1E+11 4,1E+11 sf9 A.12026.DEV A.12026.DEV-4 A*12026 DE 1,2 1,4E+12 1,7E+12 V-4 . 12D0066 12D0066 12D0106 0,8 9,4E+11 7,5E+11 12D0070 12D0068 12D0068 0,5 1,6E+12 8,0E+11 Tableau 2 : Description du volume, du titre en génomes viraux (vg/ml), quantité totale de génomes viraux de particules d'AAV9 (vg) obtenus après l'étape 2 de purification Références bibliographiques 1 Grieger JC, Samulski RJ. Adeno-associated virus vectorology, manufacturing, and clinical applications. Methods Enzymol 2012; 507: 229-254. 2 Asokan A, Schaffer DV, Samulski RJ. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Mol Ther 2011; 20: 699-708. 3 Wright JF, Wellman J, High KA. Manufacturing and regulatory strategies for clinical AAV2-hRPE65. Curr Gene Ther 2010; 10: 341-349. 4 Burova E, Ioffe E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther 2005; 12 Suppl 1: S517.Cell Culture Purification: Step 1 Type Lot No. Cell / Medium Bulk No. Volume Title Title Total Vg (L) (vg / ml) (vg / cell) HEK293F 12D0004 1.0E + 06 12D0055 0.5 4.0E + 10 4.0E + 04 2.0E + 13 12D0082 1.0E + 06 12D0082 2 1.2E + 10 1.2E + 04 2.4E + 13 sf9 A.12026.DEV 1.0E + 06 A.12026.DEV- 4 2 2,2E + 10 1,3E + 04 4,5E + 13 12D0066 1,9E + 06 12D0066 2 1,9E + 10 1,0E + 04 3,8E + 13 12D0070 2 2,0E + 10 1,0E +04 4.0E + 13 12D0068 2 6.4E + 09 3.E + 03 1.3E + 13 Table 1: Description of cell concentration in the 10L bioreactor before transfection or infection, volumes (L) and titres in viral genomes (vg / ml) obtained after the purification (step 1) of 2L cell culture. Cell Culture Purification Type Batch No. Step 1 Step 2 Bulk Batch No. Vol (ml) Title Total Vg (vg / mL) HEK293F 12D0004 12D055 12D0055 0.6 1.6E + 12 9.5E + 11 12D0082 12D0082 12D0082 0 , 8 5.1E + 11 4.1E + 11sf9 A.12026.DEV A.12026.DEV-4A * 12026 OF 1.2 1.4E + 12 1.7E + 12V-4. 12D0066 12D0066 12D0106 0.8 9.4E + 11 7.5E + 11 12D0070 12D0068 12D0068 0.5 1.6E + 12 8.0E + 11 Table 2: Description of volume, titre in viral genomes (vg / ml), total amount of viral genomes of AAV9 (vg) particles obtained after purification step 2 References 1 Grieger JC, Samulski RJ. Adeno-associated virus vectorology, manufacturing, and clinical applications. Methods Enzymol 2012; 507: 229-254. 2 Asokan A, Schaffer DV, Samulski RJ. The AAV toolkit vector: poised at the clinical crossroads. Mol Ther 2011; 20: 699-708. 3 Wright JF, Wellman J., High KA. Manufacturing and regulatory strategies for clinical AAV2-hRPE65. Curr Gene Ther 2010; 10: 341-349. 4 Burova E, Ioffe E. Chromatographic purification of recombinant adenovirus and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther 2005; 12 Suppl 1: S517.
Grieger JC, Choi VW, Samulski RJ. Production and characterization of adeno- associated viral vectors. Nat Protoc 2006; 1: 1412-1428.JC Grieger, VW Choi, Samulski RJ. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc 2006; 1: 1412-1428.
6 Allay JA et al. Good manufacturing practice production of self-complementary serotype 8 adeno-associated viral vector for a hemophilia B clinical trial. Hum Gene Ther 2011; 22: 595-604.6 Allay JA et al. Good manufacturing practice self-complementary serotype 8 adeno-associated viral vector for a hemophilia B clinical trial. Hum Gene Ther 2011; 22: 595-604.
7 Nathwani AC et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. N Engl J Med 2012; 365: 2357-2365.7 Nathwani AC et al. Adenovirus-associated vector-mediated gene transfer in hemophilia B. N Engl J Med 2012; 365: 2357-2365.
8 Simonelli F et al. Gene therapy for Leber's congenital amaurosis is safe and effective through 1.5 years after vector administration. Mol Ther 2010; 18: 643-650.Simonelli F et al. Gene therapy for Leber's congenital amaurosis is safe and effective through 1.5 years after vector administration. Mol Ther 2010; 18: 643-650.
9 Flotte TR et al. Phase 2 clinical trial of a recombinant adeno-associated viral vector expressing alphal-antitrypsin: interim results. Hum Gene Ther 2011; 22: 1239-1247.9 Fleet TR et al. Phase 2 clinical trial of a recombinant adeno-associated viral vector expressing alphal-antitrypsin: interim results. Hum Gene Ther 2011; 22: 1239-1247.
10 Cecchini S, Virag T, Kotin RM. Reproducible high yields of recombinant adeno- associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Hum Gene Ther 2011; 22: 1021-1030.Cecchini S, Virag T, Kotin RM. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Hum Gene Ther 2011; 22: 1021-1030.
11 Davidoff AM et al. Purification of recombinant adeno-associated virus type 8 vectors by ion exchange chromatography generates clinical grade vector stock. J Virol Methods 2004; 121: 209-215.11 Davidoff AM et al. Purification of recombinant adeno-associated virus type 8 J Virol Methods 2004; 121: 209-215.
12 McCarty DM et al. Adeno-associated virus terminal repeat (TR) mutant generates self- complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo. Gene Ther 2003; 10: 2112-2118.McCarty DM et al. Adeno-associated virus terminal repeat (TR) mutant generics self-complementary vectors to overcome the spleen-limiting step to in vivo transduction. Gene Ther 2003; 10: 2112-2118.
13 Wang Z et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno- associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther 2003; 10: 2105-2111.Wang Z et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno- associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther 2003; 10: 2105-2111.
14 Zhou J et al. PEG-modulated column chromatography for purification of recombinant adeno-associated virus serotype 9. J Virol Methods 2011; 173: 99-107. 15 de la Maza LM, Carter BJ. Heavy and light particles of adeno-associated virus. J Virol 1980; 33: 1129-1137.Zhou J et al. PEG-modulated column chromatography for recombinant adeno-associated virus serotype 9 purification. J Virol Methods 2011; 173: 99-107. 15 of the Maza LM, Carter BJ. Heavy and light particles of adeno-associated virus. J Virol 1980; 33: 1129-1137.
16 Galibert L et al. Latest developments in the large-scale production of adeno-associated virus vectors in insect cells toward the treatment of neuromuscular diseases. J Invertebr Pathol 2011; 107 Suppl: S80-93.Galibert L et al. Latest developments in the broad-scale production of adeno-associated viruses in insect cells towards the treatment of neuromuscular diseases. J Invertebr Pathol 2011; 107 Suppl: S80-93.
17 Virag T, Cecchini S, Kotin RM. Producing recombinant adeno-associated virus in foster cells: overcoming production limitations using a baculovirus-insect cell expression strategy. Hum Gene Ther 2009; 20: 807-817.17 Virag T, Cecchini S, Kotin RM. Recombinant production of adeno-associated virus in foster cells: overcoming production limitations using a baculovirus-insect cell expression strategy. Hum Gene Ther 2009; 20: 807-817.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR1351295A FR3002237B1 (en) | 2013-02-15 | 2013-02-15 | METHODS FOR THE PRODUCTION OF DOUBLE-STRANDED AAV VIRAL PARTICLES |
PCT/EP2014/052978 WO2014125101A1 (en) | 2013-02-15 | 2014-02-15 | Methods for the production of double-stranded aav viral particles |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR1351295A FR3002237B1 (en) | 2013-02-15 | 2013-02-15 | METHODS FOR THE PRODUCTION OF DOUBLE-STRANDED AAV VIRAL PARTICLES |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR3002237A1 true FR3002237A1 (en) | 2014-08-22 |
FR3002237B1 FR3002237B1 (en) | 2017-12-15 |
Family
ID=49054625
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR1351295A Expired - Fee Related FR3002237B1 (en) | 2013-02-15 | 2013-02-15 | METHODS FOR THE PRODUCTION OF DOUBLE-STRANDED AAV VIRAL PARTICLES |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR3002237B1 (en) |
WO (1) | WO2014125101A1 (en) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX356669B (en) | 2009-05-02 | 2018-06-08 | Genzyme Corp | Gene therapy for neurodegenerative disorders. |
CN107646052A (en) * | 2015-01-20 | 2018-01-30 | 建新公司 | For characterizing the analytical supercentrifugation of recombinant virus particle |
US11015173B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAV1 |
US11028372B2 (en) | 2015-12-11 | 2021-06-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for AAVRH10 |
ES2934848T3 (en) | 2015-12-11 | 2023-02-27 | Univ Pennsylvania | Scalable purification method for AAV8 |
WO2017160360A2 (en) | 2015-12-11 | 2017-09-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for aav9 |
US20220273815A1 (en) * | 2019-04-13 | 2022-09-01 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Enhanced transduction of aav vectors encoding micrornas |
CN113862257B (en) * | 2021-08-30 | 2024-01-16 | 南京贝思奥生物科技有限公司 | Method and kit for rapidly detecting size of viral genome |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007084773A2 (en) * | 2006-01-20 | 2007-07-26 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Enhanced production of infectious parvovirus vectors in insect cells |
WO2008016391A2 (en) * | 2006-01-31 | 2008-02-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same |
WO2011012724A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Association Institut De Myologie | Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of aav vectors |
WO2011094198A1 (en) * | 2010-01-28 | 2011-08-04 | The Children's Hospital Of Philadelphia Research Institute, Abramson Research Center | A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy |
WO2011122950A1 (en) * | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. | Monomeric duplex aav vectors |
-
2013
- 2013-02-15 FR FR1351295A patent/FR3002237B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-02-15 WO PCT/EP2014/052978 patent/WO2014125101A1/en active Application Filing
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007084773A2 (en) * | 2006-01-20 | 2007-07-26 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Enhanced production of infectious parvovirus vectors in insect cells |
WO2008016391A2 (en) * | 2006-01-31 | 2008-02-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same |
WO2011012724A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Association Institut De Myologie | Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of aav vectors |
WO2011094198A1 (en) * | 2010-01-28 | 2011-08-04 | The Children's Hospital Of Philadelphia Research Institute, Abramson Research Center | A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy |
WO2011122950A1 (en) * | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. | Monomeric duplex aav vectors |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TAMAS VIRAG ET AL: "Producing Recombinant Adeno-Associated Virus in Foster Cells: Overcoming Production Limitations Using a Baculovirus-Insect Cell Expression Strategy", HUMAN GENE THERAPY, vol. 20, no. 8, August 2009 (2009-08-01), pages 807 - 817, XP055052744, ISSN: 1043-0342, DOI: 10.1089/hum.2009.092 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR3002237B1 (en) | 2017-12-15 |
WO2014125101A1 (en) | 2014-08-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FR3002237A1 (en) | METHODS FOR THE PRODUCTION OF DOUBLE-STRANDED AAV VIRAL PARTICLES | |
US11732245B2 (en) | Scalable purification method for AAV9 | |
EP3387117B1 (en) | Scalable purification method for aav8 | |
KR102598289B1 (en) | Baculovirus System - Method for Enhancing Biological Potency of Produced Recombinant Adeno-Associated Virus | |
CN102791852B (en) | Method for the purification of adenovirus particles | |
EP3535388B1 (en) | Adeno-associated virus purification methods | |
JP6345423B2 (en) | Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of single color vision and other diseases | |
JP6588008B2 (en) | Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of single color vision and other diseases | |
KR20190005886A (en) | Regulatable polynucleotide | |
JP2021505133A (en) | Manipulated DNA-binding protein | |
JP2010213696A (en) | Method for generating high titer helper-free preparation of recombinant aav vector | |
EP2737072B1 (en) | Baculovirus system for the expression of a gene therapy vector | |
US20220364114A1 (en) | Controlled expression of viral proteins | |
CN110876269B (en) | Compositions and methods for treating hereditary optic neuropathy | |
KR20210152514A (en) | Engineered Producer Cell Lines and Methods of Making and Using the Same | |
EP3494127B1 (en) | Baculovirus expression system | |
CN117083070A (en) | Proparvovirus and tetrapparvovirus compositions and methods for gene therapy | |
JP2024511409A (en) | Size exclusion chromatography analysis of empty and complete AAV capsids | |
KR20230124682A (en) | In vitro assembly of anellovirus capsid encapsulating RNA | |
US20230212528A1 (en) | Materials and methods for viral purification | |
EP3943512A1 (en) | Fusion protein for enhancing gene editing and use thereof | |
CN116887865A (en) | In vitro assembly of RNA-encapsulating finger ring viral capsids | |
WO2020234632A1 (en) | Method for removal of nucleic acids impurities from liquid composition comprising genetically engineered particles or proteins |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 4 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 5 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 6 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 8 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 9 |
|
ST | Notification of lapse |
Effective date: 20221005 |