FR2995082A1 - METHOD FOR DETERMINING THE ENERGY OF DESTABILIZING THE CONFORMATION OF A PROTEIN - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une méthode de détermination de l'énergie de déstabilisation de la conformation d'une protéine. Ladite méthode étant du type selon laquelle : on fournit, à l'intérieur d'une solution, une protéine comprenant un enchaînement d'acides aminés, ladite protéine présentant une conformation correspondant à une position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement ; et, on introduit un composé oxydoréductible dans ladite solution. Ensuite, on fournit successivement des quantités croissantes d'énergie à ladite solution pour pouvoir modifier ladite position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement, et de manière à déstabiliser la conformation de ladite protéine, tandis que ledit composé oxydoréductible interagit avec ladite protéine déstabilisée pour provoquer l'apparition d'un signal lorsque l'on applique un champ électrique à ladite solution; et, on enregistre la quantité d'énergie correspondant à l'apparition dudit signal de manière à pouvoir déterminer l'énergie de déstabilisation de ladite conformation.The invention relates to a method for determining the destabilizing energy of the conformation of a protein. Said method being of the type according to which: within a solution, a protein comprising a chain of amino acids is provided, said protein having a conformation corresponding to a given relative position of the amino acids of said sequence; and, an oxidoreductable compound is introduced into said solution. Then, increasing amounts of energy are successively supplied to said solution in order to be able to modify said given relative position of the amino acids of said sequence, and so as to destabilize the conformation of said protein, while said oxidoreductable compound interacts with said destabilized protein to cause the appearance of a signal when an electric field is applied to said solution; and, the amount of energy corresponding to the appearance of said signal is recorded so as to be able to determine the destabilizing energy of said conformation.
Description
Méthode de détermination de l'énergie de déstabilisation de la conformation d'une protéine La présente invention se rapporte à une méthode permettant de déterminer les conditions dans lesquelles la conformation d'une protéine se déstabilise. Une protéine est une macromolécule biologique comprenant au moins un enchaînement d'acides aminés déterminant la structure primaire de la protéine. Celle-ci, dans un milieu donné, tend à se replier sur elle-même pour former une structure tridimensionnelle suivant les conditions dudit milieu. Cet état conformationnel résulte des interactions, d'une part des acides aminés entre eux, et d'autre part des acides aminés avec le milieu. Aussi, l'énergie d'interactions des acides aminés entre eux, et celle de leurs interactions avec le milieu est-elle révélatrice de la conformation de la protéine.The present invention relates to a method for determining the conditions under which the conformation of a protein is destabilized. A protein is a biological macromolecule comprising at least one sequence of amino acids determining the primary structure of the protein. This, in a given medium, tends to fold on itself to form a three-dimensional structure according to the conditions of said medium. This conformational state results from the interactions, on the one hand amino acids between them, and on the other hand amino acids with the medium. Also, the interaction energy of the amino acids with each other, and that of their interactions with the medium is indicative of the conformation of the protein.
La méthode selon l'invention permet de déterminer cette quantité d'énergie, en déstabilisant la conformation de la protéine. Elle vise à rompre au moins une partie des interactions qui s'établissent entre les acides aminés, et entre ceux-ci et le milieu. Il est connu de pouvoir modifier la conformation d'une protéine en la chauffant, et à l'extrême de la déplier entièrement. En effet, en la chauffant, à partir d'un certain seuil propre à chacune d'elles dans un milieu donné, les interactions entre les acides aminés, du type forces de van der Waals, liaisons hydrogènes, ou autres interactions électriques de faible intensité, se relâchent et se rompent.The method according to the invention makes it possible to determine this quantity of energy, by destabilizing the conformation of the protein. It aims to break at least some of the interactions that are established between the amino acids, and between them and the medium. It is known to be able to modify the conformation of a protein by heating it, and at the extreme to unfold it entirely. Indeed, by heating it, starting from a certain threshold proper to each of them in a given medium, the interactions between the amino acids, of the van der Waals forces type, hydrogen bonds, or other low intensity electrical interactions , relax and break.
En outre, il est connu de coupler les effets de l'énergie thermique sur les protéines avec une technique d'analyse fluorescente. On pourra notamment se reporter au document W01997042500, lequel décrit la mise en oeuvre de sondes moléculaires fluorescentes capables de se lier partiellement ou totalement à la protéine elle-même partiellement ou totalement dépliée et d'émettre en conséquence, dans ce seul cas, un signal fluorescent après avoir été excitées par une onde électromagnétique d'une longueur d'onde définie. Ainsi, on fournit une protéine en solution et on y ajoute une sonde moléculaire du type précité formant alors un agent révélateur. Ensuite, on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique à ladite protéine de manière à pouvoir libérer les uns des autres les acides aminés interagissant entre eux, tandis que la sonde moléculaire fluorescente vient elle-même interagir avec les acides aminés ainsi libérés en induisant un signal fluorescent.In addition, it is known to couple the effects of thermal energy on proteins with a fluorescent analysis technique. Reference may in particular be made to the document WO01997042500, which describes the use of fluorescent molecular probes able to bind partially or totally to the protein itself partially or totally unfolded and to emit accordingly, in this case alone, a signal fluorescent after being excited by an electromagnetic wave of a defined wavelength. Thus, a protein is provided in solution and a molecular probe of the aforementioned type is added thereto, forming a developer. Then, increasing amounts of thermal energy are provided to said protein so as to release the interacting amino acids from each other, while the fluorescent molecular probe itself interacts with the amino acids thus released by inducing a fluorescent signal.
De la sorte, en mesurant parallèlement l'intensité du signal fluorescent en fonction de la quantité d'énergie thermique fournie, on détermine une quantité d'énergie correspondant au changement conformation nel de la protéine lorsque le signal fluorescent augmente significativement. Toutefois, de telles méthodes sont délicates à mettre en oeuvre car elles sont basées sur la mesure d'une concentration d'un agent révélateur dans un milieu en appréciant la quantité de photons qu'il émet. De plus, le récepteur optique permettant d'apprécier la quantité de photons est fragile et coûteux. Il est de plus malaisé de conduire des expérimentations simultanément en grand nombre dans un milieu trouble.In this way, by measuring in parallel the intensity of the fluorescent signal as a function of the quantity of thermal energy supplied, an amount of energy corresponding to the conformational change nel of the protein is determined when the fluorescent signal increases significantly. However, such methods are difficult to implement because they are based on the measurement of a concentration of a developer in a medium by appreciating the amount of photons it emits. In addition, the optical receiver to assess the amount of photons is fragile and expensive. It is also difficult to conduct experiments simultaneously in large numbers in a cloudy environment.
Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est de fournir une méthode permettant non seulement de pouvoir réaliser un grand nombre d'expérimentations simultanées dans tout type de milieu indépendamment de sa turbidité, mais aussi de pouvoir les réaliser à un coût avantageux.Also, a problem that arises and that aims to solve the present invention is to provide a method not only to perform a large number of simultaneous experiments in any type of medium regardless of its turbidity, but also to be able to achieve them. a cost advantage.
Dans ce but, la présente invention propose une méthode de détermination de l'énergie de déstabilisation de la conformation d'une protéine, ladite méthode étant du type selon laquelle : on fournit, à l'intérieur d'une solution, une protéine comprenant un enchaînement d'acides aminés, ladite protéine présentant une conformation correspondant à une position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement ; puis on introduit un agent révélateur dans ladite solution ; et, on fournit successivement des quantités croissantes d'énergie à ladite solution pour pouvoir modifier ladite position relative donnée des acides aminés dudit enchaînement, et de manière à déstabiliser la conformation de ladite protéine, tandis que ledit agent révélateur interagit avec ladite protéine déstabilisée pour provoquer l'apparition d'un signal ; et on enregistre la quantité d'énergie correspondant à l'apparition dudit signal de manière à pouvoir déterminer l'énergie de déstabilisation de ladite conformation. Selon l'invention, on fournit un composé oxydoréductible comme agent révélateur ; et on applique un champ électrique à ladite solution pour pouvoir détecter la variation d'un courant électrique formant ledit signal. Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans la mise en oeuvre d'un composé oxydoréductible comme agent révélateur. Ce composé oxydoréductible est électrochimiquement détectable dans une solution lorsqu'il est libre. La structure primaire d'une protéine correspond à l'enchaînement successif de ses acides aminés. Lorsqu'elle est native, sa conformation, où la position relative de ses acides aminés les uns par rapport aux autres, correspond a priori à la structure thermodynamiquement la plus stable. Cette conformation résulte de facteurs intrinsèques à la protéine et de facteurs extrinsèques. Les premiers sont notamment liés aux interactions électriques de faible intensité entre les acides aminés, et les secondes au solvant. Native, la protéine présente une structure tertiaire, repliée sur elle-même, et biologiquement fonctionnelle. Des sites de complexation possibles ou d'interaction potentiels avec le composé oxydoréductible sont masqués. En revanche, lorsque la conformation de la protéine se modifie, et qu'au moins une partie des acides aminés de l'enchaînement d'acides aminés n'interagissent plus les uns avec les autres ni avec le solvant, les sites de complexation deviennent libres. Le composé oxydoréductible peut alors venir s'y fixer, et conséquemment il devient électrochimiquement indétectable. Partant, à température ambiante, la protéine en solution avec le composé oxydoréductible, ne forment pas ou très peu de complexe avec ce dernier et le signal électrochimique qui en résulte après l'application d'un champ électrique, est dû à la concentration initiale du composé oxydoréductible introduit dans la solution. En revanche, lorsqu'une quantité donnée d'énergie est fournie, et en particulier de l'énergie thermique, les acides aminés sont entraînés en mouvement dans la solution et leurs positions relatives se modifient. Aussi, la conformation de la protéine se déstabilise et à l'extrême, la protéine retrouve sa structure primaire. Le composé oxydoréductible peut alors venir se lier aux sites de complexation laissés vacants lors de la déstabilisation, de telle sorte que la fraction de composé oxydoréductible liée, n'est plus électrochimiquement détectable, et que le signal électrochimique est abaissé.For this purpose, the present invention provides a method for determining the destabilizing energy of the conformation of a protein, said method being of the type in which: within a solution, a protein comprising a amino acid sequence, said protein having a conformation corresponding to a given relative position of the amino acids of said sequence; then introducing a developer into said solution; and, successively, increasing amounts of energy are supplied to said solution in order to be able to modify said given relative position of the amino acids of said sequence, and in such a way as to destabilize the conformation of said protein, whereas said developer agent interacts with said destabilized protein to cause the appearance of a signal; and the amount of energy corresponding to the appearance of said signal is recorded so as to be able to determine the destabilizing energy of said conformation. According to the invention, an oxidoreductable compound is provided as a developer; and applying an electric field to said solution to be able to detect the variation of an electric current forming said signal. Thus, a feature of the invention lies in the implementation of an oxidoreducible compound as a developer. This oxidoreductable compound is electrochemically detectable in a solution when it is free. The primary structure of a protein corresponds to the successive sequence of its amino acids. When it is native, its conformation, where the relative position of its amino acids with respect to each other, corresponds a priori to the thermodynamically most stable structure. This conformation results from factors intrinsic to the protein and extrinsic factors. The former are particularly related to low-intensity electrical interactions between amino acids, and seconds to solvent. Native, the protein has a tertiary structure, folded on itself, and biologically functional. Potential complexation sites or potential interaction with the redox compound are masked. On the other hand, when the conformation of the protein changes, and at least a part of the amino acids of the amino acid sequence no longer interact with each other or with the solvent, the complexing sites become free. . The oxidoreducible compound can then become attached to it, and consequently it becomes electrochemically undetectable. Therefore, at room temperature, the protein in solution with the oxidoreducible compound, do not form or very little complex with the latter and the electrochemical signal that results after the application of an electric field, is due to the initial concentration of oxidoreducible compound introduced into the solution. On the other hand, when a given amount of energy is provided, and in particular thermal energy, the amino acids are moved into the solution and their relative positions change. Also, the conformation of the protein is destabilized and to the extreme, the protein finds its primary structure. The oxido-reducible compound can then bind to the complexation sites left vacant during the destabilization, so that the fraction of oxidoreductable compound bound is no longer electrochemically detectable, and the electrochemical signal is lowered.
De la sorte, puisqu'on mesure aisément la concentration du composé oxydoréductible contenu dans la solution, grâce à l'application d'un champ électrique, on détermine alors précisément, l'instant ou la quantité d'énergie thermique fournie provoque la déstabilisation ou le changement de conformation de la protéine. De plus, la mise en oeuvre d'un dispositif permettant d'appliquer un champ électrique à la solution et de mesurer le courant qui en résulte, est bien moins coûteuse que celle d'un détecteur optique. L'appareillage est au surplus robuste en comparaison du détecteur optique.In this way, since the concentration of the oxidoreducible compound contained in the solution is easily measured by the application of an electric field, it is then precisely determined when the quantity of heat energy supplied causes the destabilization or the conformational change of the protein. In addition, the implementation of a device for applying an electric field to the solution and measuring the resulting current is much less expensive than that of an optical detector. The apparatus is in addition robust in comparison with the optical detector.
De préférence, des quantités croissantes d'énergie thermique sont fournies, car c'est la forme d'énergie la plus aisée à mettre en oeuvre et à faire croître progressivement. D'autres formes d'énergie sont envisageables. Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention particulièrement avantageux, on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique de manière à accroître la température de ladite solution d'au moins 0,5°C par minute. On accroît par exemple la température de la solution de 1 °C par minute, de manière à obtenir une vitesse de montée en température qui soit en adéquation avec les constantes de réaction de complexation du composé oxydoréductible et des sites de complexation. En outre, on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique de manière à accroître la température de ladite solution de 25°C à 70°C. La température de la solution peut être portée au-delà de 90 °C. Cependant la déstabilisation de conformation des protéines, ou bien le passage d'une conformation à une autre, intervient généralement à une température inférieure à 70 °C. Cela permet de diminuer les temps d'analyse et d'améliorer la productivité de la méthode. De plus, on applique séquentiellement ledit champ électrique à intervalles de temps réguliers. Ainsi, la température de la solution croît de manière sensiblement linéaire avec le temps, et à intervalles de temps réguliers on applique un champ électrique à la solution et on en mesure le courant électrique qui en résulte. De préférence, on met en oeuvre une technique voltammétrique pour détecter les variations de courant électrique, et par exemple, une technique de voltammétrie cyclique à vagues carrées, laquelle permet d'obtenir une bonne réponse électronique et par conséquent une bonne mesure du signal. Par ailleurs, on dresse, d'une part la courbe de l'intensité dudit courant électrique en fonction des quantités d'énergie thermique croissantes, et d'autre part la courbe dérivée associée, de manière à pouvoir révéler une valeur caractéristique de ladite énergie de déstabilisation de ladite conformation. Cette quantité d'énergie caractéristique correspond à une température de transition de forme Tf, représentative de la protéine étudiée et de sa conformation. Selon une première variante d'exécution de l'invention, que l'on décrira plus en détail dans la suite de la description, on fournit en outre une première solution complémentaire contenant le seul composé oxydoréductible et une seconde solution complémentaire contenant ledit composé oxydoréductible et la protéine sous une autre conformation correspondant à une autre position relative des acides aminés dudit enchaînement, et on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique et on applique un champs électrique, simultanément à ladite solution et auxdites solutions complémentaires. Par exemple, ladite autre conformation correspond à la structure primaire de la protéine où elle est entièrement dépliée. De la sorte, on mesure simultanément l'intensité du courant électrique qui traverse les solutions à mesure que l'on augmente leur température, et on peut déterminer ainsi plus précisément la conformation de la protéine étudiée. En outre, selon une seconde variante d'exécution, on fournit une autre solution contenant ladite protéine et l'un de ses ligands, et on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique et on applique un champ électrique, simultanément à ladite solution et à ladite autre solution. De la sorte, et ainsi qu'on l'expliquera ci-après plus en détail, on vérifie que le ligand est bien un facteur de stabilisation de la protéine, lorsque les deux courbes résultantes sont décalées. À l'inverse, lorsque les deux courbes résultantes sont superposées, cela permet de vérifier que le ligand ne correspond pas à celui de la protéine observée, ou bien qu'il n'est pas un facteur stabilisant. Selon une variante de réalisation de l'invention, ladite une solution comprend un premier solvant et on fournit en outre une autre solution comprenant ladite protéine et ledit composé oxydoréductible dans un deuxième solvant, et on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique et on applique un champ électrique, simultanément auxdites solutions. De la sorte, on mesure l'impact du solvant sur l'énergie de déstabilisation de la conformation d'une protéine.Preferably, increasing amounts of thermal energy are provided because it is the easiest form of energy to be used and to progressively grow. Other forms of energy are possible. According to a particularly advantageous embodiment of the invention, increasing amounts of thermal energy are provided so as to increase the temperature of said solution by at least 0.5 ° C per minute. For example, the temperature of the solution is increased by 1 ° C. per minute, so as to obtain a rate of rise in temperature which is in adequacy with the complexing reaction constants of the oxidoreducible compound and the complexation sites. In addition, increasing amounts of thermal energy are provided so as to increase the temperature of said solution from 25 ° C to 70 ° C. The temperature of the solution can be raised above 90 ° C. However, the conformational destabilization of the proteins, or the passage from one conformation to another, generally occurs at a temperature below 70 ° C. This reduces the analysis time and improves the productivity of the method. In addition, said electric field is sequentially applied at regular time intervals. Thus, the temperature of the solution increases substantially linearly with time, and at regular time intervals an electric field is applied to the solution and the resulting electric current is measured. Preferably, a voltammetric technique is used to detect variations in electrical current, for example a cyclic square wave voltammetry technique, which makes it possible to obtain a good electronic response and consequently a good measurement of the signal. On the other hand, the curve of the intensity of said electric current is plotted as a function of the increasing amounts of heat energy, and also the associated derivative curve, so as to reveal a characteristic value of said energy. destabilizing said conformation. This characteristic amount of energy corresponds to a transition temperature of Tf form, representative of the studied protein and its conformation. According to a first variant embodiment of the invention, which will be described in more detail in the following description, there is further provided a first complementary solution containing the only oxidoreducible compound and a second complementary solution containing said oxidoreductable compound and the protein in another conformation corresponding to another relative position of the amino acids of said sequence, and increasing amounts of thermal energy are provided and an electric field is applied simultaneously to said solution and said complementary solutions. For example, said other conformation corresponds to the primary structure of the protein where it is fully unfolded. In this way, the intensity of the electric current passing through the solutions is simultaneously measured as their temperature is increased, and the conformation of the protein under study can be determined more precisely. In addition, according to a second variant embodiment, there is provided another solution containing said protein and one of its ligands, and increasing amounts of thermal energy are provided and an electric field is applied simultaneously to said solution and to said other solution. In this way, and as will be explained hereinafter in more detail, it is verified that the ligand is indeed a stabilizing factor of the protein, when the two resulting curves are shifted. On the other hand, when the two resulting curves are superimposed, this makes it possible to verify that the ligand does not correspond to that of the protein observed, or that it is not a stabilizing factor. According to an alternative embodiment of the invention, said one solution comprises a first solvent and another solution comprising said protein and said oxidoreductable compound is also provided in a second solvent, and increasing amounts of thermal energy are supplied and applied. an electric field simultaneously with said solutions. In this way, the impact of the solvent on the destabilizing energy of the conformation of a protein is measured.
Par ailleurs, ledit composé oxydoréductible est de préférence un complexe d'un métal de transition et avantageusement, le composé Osmium(2+), bis([2,2'-bipyridine]-4,4'-diamine-KN1,KN1') (dipyrido[3,2-a:2',3'- c]phenazine-KN4,KN5)-, (0C-6-21)- (9CI). Les complexes de l'iridium peuvent également être mis en oeuvre, ou encore les complexes du ruthénium.Moreover, said oxidoreductable compound is preferably a complex of a transition metal and advantageously, the compound Osmium (2+), bis ([2,2'-bipyridine] -4,4'-diamine-KN1, KN1 ' ) (dipyrido [3,2-a: 2 ', 3'-c] phenazine-KN4, KN5) -, (OC-6-21) - (9Cl). The iridium complexes can also be used, or the ruthenium complexes.
D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après d'un mode de réalisation particulier de l'invention, donné à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - les Figures la et lb illustrent les courbes de mise en oeuvre de la méthode selon l'invention appliquée à des premières solutions ; - les Figures 2a et 2b illustrent les courbes de mise en oeuvre de la méthode selon l'invention appliquées à des deuxièmes solutions ; - les Figures 3a et 3b illustrent les courbes d'une méthode comparative appliquées aux deuxièmes solutions ; - les Figures 4a et 4b, illustrent les courbes de la méthode comparative appliquée à des troisièmes solutions ; et, - les Figures 5a et 5b illustrent les courbes de mise en oeuvre de la méthode selon l'invention appliquée aux troisièmes solutions. La méthode de détermination de la quantité d'énergie apte à provoquer la dénaturation d'une protéine conforme à l'invention nécessite la mise en oeuvre d'un ensemble comportant des moyens de contrôle et de mesure. Ainsi, elle comprend au moins une micro-cuvette, adaptée à recevoir à l'intérieur, une protéine en solution avec un composé oxydoréductible. Cette micro-cuvette déjà connus selon l'art antérieur, présente un fond, sur lequel sont présentes, une électrode, une contre-électrode, et une électrode de référence, obtenues par exemple par sérigraphie et respectivement reliées à un potentiostat. En outre, elle est prise en sandwich entre un module à effet Pelletier qui la supporte et un couvercle chauffant relié à un générateur. Ainsi, le module à effet Pelletier, permet de céder une quantité d'énergie thermique donnée au contenu de la micro-cuvette. Par ailleurs, le générateur et le potentiostat sont contrôlés par un micro-ordinateur, lequel contient un programme d'ordinateur et des moyens d'enregistrement.Other features and advantages of the invention will appear on reading the following description of a particular embodiment of the invention, given by way of indication but not limitation, with reference to the accompanying drawings in which: Figures la and lb illustrate the implementation curves of the method according to the invention applied to first solutions; - Figures 2a and 2b illustrate the implementation curves of the method according to the invention applied to second solutions; FIGS. 3a and 3b illustrate the curves of a comparative method applied to the second solutions; FIGS. 4a and 4b illustrate the curves of the comparative method applied to third solutions; and, - Figures 5a and 5b illustrate the implementation curves of the method according to the invention applied to the third solutions. The method for determining the amount of energy capable of causing the denaturation of a protein according to the invention requires the implementation of an assembly comprising control and measurement means. Thus, it comprises at least one microcuvette, adapted to receive inside, a protein in solution with an oxidoreducible compound. This microcuvette, already known according to the prior art, has a bottom, on which are present, an electrode, a counter-electrode, and a reference electrode, obtained for example by screen printing and respectively connected to a potentiostat. In addition, it is sandwiched between a Pelletier effect module that supports it and a heated lid connected to a generator. Thus, the effect module Pelletier, allows to transfer a given amount of thermal energy to the contents of the microcuvette. In addition, the generator and the potentiostat are controlled by a microcomputer, which contains a computer program and recording means.
Ainsi, la micro-cuvette, constitue un moyen de réception apte à recevoir une solution contenant des protéines et le composé oxydoréductible. Le module à effet Pelletier et le générateur sont aptes à être pilotés par l'intermédiaire du micro-ordinateur. Le composé oxydo-réductible, et en l'espèce le complexe de l'osmium : bis([2,2'-bipyridine]-4,4'-diamine-KN1,KN1') (dipyrido[3,2-a:2',3'-c]phenazine- KN4,KN5)-, (0C-6-21)- (9CI) dont le numéro CAS est 392658-63-8, est de formule I : R = NH2 Formule I D'autres composés oxydoréductibles, et notamment des complexes métalliques, sont envisageables, et en particulier avec le ruthénium à la place de l'osmium. D'autres ligands sont aussi susceptibles d'être mis en oeuvre comme le composé Osmium(2+), bis(4,4'-dimethy1-2,2'-bipyridine- KN1,KN1')(dipyrido[3,2-a:2',3'-c]phenazine-KN4,KN5)-, (0C-6-21)- (9CI) dont le numero CAS est 392658-64-9 et le composé Osmium(2+), bis(2,2'-bipyridineKN1,KN1')(dipyrido[3,2-a:2',3'-c]phenazine-KN4,KN5)-, (0C-6-21)- dont le numero CAS est 355395-37-8. Encore d'autres composés oxydoréductibles sont envisageables comme des dérivés quinoliques, des dérivés flaviniques (FAD, FMN), des viologenes, des anthraquinones, ou encore du bleu de méthylène et ses dérivés.Thus, the microcuvette is a receiving means capable of receiving a solution containing proteins and the oxidoreducible compound. The Pelletier effect module and the generator are able to be controlled via the microcomputer. The oxido-reducible compound, and in this case the complex of osmium: bis ([2,2'-bipyridine] -4,4'-diamine-KN1, KN1 ') (dipyrido [3,2-a: 2 ', 3'-c] phenazine-KN4, KN5) -, (OC-6-21) - (9CI), CAS number 392658-63-8, is of formula I: R = NH2 Formula I D' other oxidoreducible compounds, and especially metal complexes, are possible, and in particular with ruthenium instead of osmium. Other ligands are also capable of being used, such as the compound Osmium (2+), bis (4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridine-KN1, KN1 ') (dipyrido [3,2- a: 2 ', 3'-c] phenazine-KN4, KN5) -, (OC-6-21) - (9CI), the CAS number of which is 392658-64-9 and the compound Osmium (2+), bis ( 2,2'-bipyridine KN1, KN1 ') (dipyrido [3,2-a: 2', 3'-c] phenazine-KN4, KN5) -, (OC-6-21) - CAS number 355395- 37-8. Still other oxidoreducible compounds are conceivable as quinoline derivatives, flavin derivatives (FAD, FMN), viologenes, anthraquinones, or methylene blue and its derivatives.
Exemple 1 Selon un premier exemple, on mettra en oeuvre la Glucose Oxydase, une flavoprotéine, et on visualisera ses changements de conformation, entre un état natif où elle est repliée sur elle-même et où les acides aminés qui la constituent interagissent les uns avec les autres, et un état dénaturé où elle est dépliée et où les acides aminés sont libres les uns par rapport aux autres, en fonction de la quantité d'énergie qu'on lui fournit. La Glucose Oxydase est une protéine d'une masse de 160 kDa (kilodalton). Cette protéine tend à se dénaturer majoritairement suivant les conditions de force ionique et de pH entre 56°C et 64°C. Trois solutions notées A, B et C ont été préparées. Le pH est ajusté à 7,4 avec du tampon phosphate à 0,01 mol.L-1. La première solution A contient uniquement un composé, ou sonde, oxydoréductible comme agent révélateur, à une concentration de 5.10-6 mol.L-1.EXAMPLE 1 According to a first example, use will be made of Glucose Oxidase, a flavoprotein, and its conformational changes will be visualized between a native state where it is folded back on itself and where the amino acids which constitute it interact with each other. the others, and a denatured state in which it is unfolded, and where the amino acids are free from each other, according to the quantity of energy supplied to it. Glucose Oxidase is a protein with a mass of 160 kDa (kilodalton). This protein tends to denature predominantly according to the conditions of ionic strength and pH between 56 ° C and 64 ° C. Three solutions rated A, B and C were prepared. The pH is adjusted to 7.4 with phosphate buffer at 0.01 mol.L-1. The first solution A contains only a compound, or probe, oxidoreducible as a developer, at a concentration of 5.10-6 mol.L-1.
La deuxième solution B contient la sonde oxydoréductible à la même concentration que la première solution A et la protéine à l'état natif à une concentration de 10-5 mol.L-1. La troisième solution C contient la sonde oxydoréductible à la même concentration de 5.10-6 mol.L-1 et la protéine préalablement dénaturée. La dénaturation a été réalisée par une incubation à 95°C en solution aqueuse pendant une heure. A chacune de ces solutions A, B et C on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique de 20°C à 95°C selon une rampe de température de 1°C par minute. Aussi, on prévoit trois micros-cuvettes du type précité de manière à respectivement recevoir les trois solutions A, B et C.The second solution B contains the oxidoreducible probe at the same concentration as the first solution A and the protein in the native state at a concentration of 10-5 mol.L-1. The third solution C contains the oxidoreducible probe at the same concentration of 5.10-6 mol.L-1 and the previously denatured protein. Denaturation was performed by incubation at 95 ° C in aqueous solution for one hour. Each of these solutions A, B and C provides increasing amounts of thermal energy from 20 ° C to 95 ° C in a temperature ramp of 1 ° C per minute. Also, there are three micro-bowls of the aforementioned type so as to respectively receive the three solutions A, B and C.
On peut de la sorte appliquer une différence de potentiel entre les deux électrodes de chacune des micros-cuvettes et mesurer un courant qui en résulte. Cette mesure de courant permet alors de déterminer la concentration en sonde oxydoréductible libre. Selon ce protocole, on mesure simultanément le courant électrique et la température de la solution.In this way, it is possible to apply a potential difference between the two electrodes of each of the microtubes and to measure a current which results therefrom. This measurement of current then makes it possible to determine the concentration of free oxidoreductable probe. According to this protocol, the electric current and the temperature of the solution are simultaneously measured.
Dans le présent exemple elle est réalisée tous les 0,7°C, soit toutes les 42 secondes, et une centaine de mesures est ainsi générée pour chaque échantillon A, B et C. Les résultats de cet exemple sont reportés sur les diagrammes des Figures 1a et 1b.In the present example, it is carried out every 0.7 ° C, ie every 42 seconds, and a hundred measurements are thus generated for each sample A, B and C. The results of this example are plotted on the diagrams of the Figures. 1a and 1b.
Sur la figure la, sont reportés, en abscisse la température et en ordonnée l'intensité du courant. Ainsi, une courbe supérieure 10, correspond alors à la première solution A, contenant uniquement la sonde oxydoréductible. Une courbe inférieure 12 correspond à la troisième solution C contenant la sonde oxydoréductible et la protéine dénaturée et une courbe intermédiaire 14 correspond à la deuxième solution B contenant la sonde oxydoréductible et la protéine à l'état natif. Ainsi, la courbe supérieure 10 traduit l'augmentation du courant dans la solution lorsque l'énergie thermique fournie augmente, ce qui est naturel puisque la mobilité des molécules est alors accrue. S'agissant de la deuxième solution B, en présence de la protéine non dénaturée, ou à l'état natif, seule une faible fraction de la sonde oxydoréductible se complexe à la protéine, et la courbe intermédiaire 14 montre qu'à 20° C, le courant est alors sensiblement plus faible que pour la première solution B. En outre, en présence de la protéine dénaturée, pour la troisième solution C, une plus grande fraction de la sonde oxydoréductible est complexée à la protéine. Aussi, à 20°C, la courbe inférieure 12 est à une valeur de courant bien inférieur aux deux autres courbes 10, 14. Cet abaissement du courant s'explique par l'augmentation du nombre de sites de complexation sur la protéine entre sa forme native et sa forme dénaturée. La sonde oxydoréductible complexée à la protéine n'est alors plus détectable électrochimiquement. Lorsque l'on fournit des quantités croissantes d'énergie thermique aux trois solutions A, B et C, on observe différents comportements. S'agissant plus précisément de la deuxième solution B incluant la protéine non dénaturée, et correspondant à la courbe intermédiaire 14 sur la figure 1 a, on observe une augmentation du courant sensiblement parallèle à la courbe supérieure 10 jusqu'à un premier extremum 16 entre 50 et 55°C, puis une décroissance du courant jusqu'à un second extremum 18 au voisinage de 70° C et enfin une nouvelle croissance du courant sensiblement parallèle à la courbe inférieure 12 jusqu'à un point commun des trois courbes 20 à 94°C.In the figure la, are reported, in abscissa the temperature and in ordinate the intensity of the current. Thus, an upper curve 10 then corresponds to the first solution A, containing only the oxidoreducible probe. A lower curve 12 corresponds to the third solution C containing the oxidoreducible probe and the denatured protein and an intermediate curve 14 corresponds to the second solution B containing the oxidoreducible probe and the protein in the native state. Thus, the upper curve 10 represents the increase of the current in the solution when the thermal energy supplied increases, which is natural since the mobility of the molecules is then increased. Regarding the second solution B, in the presence of the undenatured protein, or in the native state, only a small fraction of the oxidoreducible probe complexes with the protein, and the intermediate curve 14 shows that at 20 ° C. the current is then substantially lower than for the first solution B. In addition, in the presence of the denatured protein, for the third solution C, a larger fraction of the oxidoreducible probe is complexed with the protein. Also, at 20 ° C, the lower curve 12 is at a current value much lower than the other two curves 10, 14. This lowering of the current is explained by the increase in the number of complexation sites on the protein between its shape. native and its denatured form. The oxidoreductable probe complexed with the protein is then no longer detectable electrochemically. When increasing amounts of thermal energy are provided to the three solutions A, B and C, different behaviors are observed. With regard more specifically to the second solution B including the undenatured protein, and corresponding to the intermediate curve 14 in FIG. 1a, an increase in the current substantially parallel to the upper curve 10 is observed up to a first extremum 16 between 50 and 55 ° C, then a decrease of the current to a second extremum 18 in the vicinity of 70 ° C and finally a new growth of the current substantially parallel to the lower curve 12 to a common point of the three curves 20 to 94 ° C.
La double inflexion de la courbe intermédiaire 14, entre les deux extremums 16, 18, s'explique par un changement de conformation important de la protéine, conduisant à une dénaturation progressive et aboutissant à une augmentation du nombre de site de complexation pour la sonde oxydoréductible. Ainsi, la protéine commence à se dénaturer lorsque la quantité d'énergie thermique fournit est comprise entre 50 et 55°C, le composé oxydoréductible vient alors se complexer avec les sites de complexation qui se libèrent progressivement, et sa concentration détectable dans la solution diminue alors.The double inflection of the intermediate curve 14, between the two extremums 16, 18, is explained by an important conformational change of the protein, leading to a progressive denaturation and resulting in an increase in the number of complexation sites for the oxidoreducible probe. . Thus, the protein begins to denature when the amount of thermal energy supplied is between 50 and 55 ° C, the oxidoreducible compound then comes to complex with the complexing sites which are released gradually, and its detectable concentration in the solution decreases. so.
L'expérience réalisée avec la troisième solution C où la protéine est préalablement dénaturée, la courbe inférieure 12 est monotone et de forme exponentielle entre 20° C et 94°C. Elle rejoint la courbe intermédiaire 14 à une valeur de température voisine de 80°C. Elle traduit l'absence de changement de conformation de cette forme de protéine préalablement dénaturée, durant la montée en température. En effet, lorsque la protéine est préalablement dénaturée, tous les sites de complexation sont a priori libres, de sorte que le composé oxydoréductible, vient tous les occuper, et que sa concentration apparente dans la solution révélée par la mesure électrochimique, et minimale. Au fur et à mesure des apports d'énergie thermique, le composé oxydoréductible tend à quitter les sites de complexation, il redevient électrochimiquement détectable. Par conséquent, la mesure du courant électrique augmente. Sur la figure 1 b, sont illustrées les dérivées primaires des courbes illustrées sur la figure 1 a. Ainsi, la dérivée de la courbe supérieure 10 présente la référence 10', la dérivée de la courbe inférieure 12 présente la référence 12' et la dérivée de la courbe intermédiaire 14 présente la référence 14'. Ainsi on définit une température de transition de forme Tf, valant ici pour la courbe dérivée 14' de la courbe intermédiaire 14 et correspondant à la valeur de température où la dérivée est la plus négative. Elle est ici, dans cet exemple, de 60°C. L'expérience de cet exemple 1, a été répétée plusieurs fois permettant à chaque fois de retrouver des courbes similaires. Une augmentation de la vitesse de montée en température décale la température de transition de forme Tf vers une valeur plus élevée et inversement pour une vitesse plus faible vers une valeur Tf plus faible. Ce résultat est en adéquation avec une cinétique lente de dénaturation. La dénaturation thermique de la Glucose Oxydase étant irréversible, cela se traduit lors de l'application d'une rampe descendante en température sur un échantillon contenant initialement une protéine non dénaturée à une évolution du signal similaire se confondant à celui obtenu pour un échantillon contenant initialement la protéine dénaturée, et sur laquelle une rampe montante en température a été appliquée. Exemple 2 Cet exemple vise à comparer la méthode mise en oeuvre conformément à la présente invention et les méthodes classiques de fluorescence. On mettra également en oeuvre la Glucose Oxydase. Méthode électrochimique conforme à l'invention Aussi, quatre solutions D, E, F et G ont été préparées. Le pH est ajusté à 7,4 avec du tampon phosphate à 0,01 mol.L-1. Le volume est ajusté à 4011L avec de l'eau et des adjuvants. La solution D contient la sonde oxydoréductible à une concentration de 3x10-6 mol.L-1 et la protéine Glucose Oxydase native à une concentration de 10-5 mol.L-1. La solution E contient la sonde oxydoréductible à la même concentration et la protéine préalablement dénaturée thermiquement. La dénaturation a été réalisée par une incubation à 95°C en solution aqueuse pendant 1 heure. La solution F ainsi que la solution G contiennent la sonde oxydoréductible à la même concentration et la protéine préalablement dénaturée chimiquement ; respectivement par l'urée et la guanidine hydrochloride, des dénaturants chimiques connus, à fortes concentrations. A chacune de ces quatre solutions, des quantités progressives d'énergie thermique sont fournies selon une rampe de température de 1°C par minute de manière à augmenter la température des solutions de 25°C à 95°C. Une mesure de courant permettant de déterminer la concentration en sonde oxydoréductible libre est réalisée tous les 1,8°C, selon un protocole analogue à l'exemple 1 ci-dessus. Une centaine de points de mesure sont ainsi générés pour chaque expérience. Les résultats sont reportés sur le graphique de la figure 2a, où sont portées quatre courbes 22, 24, 26 et 28 correspondant respectivement aux quatre solutions D, E, F et G.The experiment carried out with the third solution C where the protein is previously denatured, the lower curve 12 is monotonous and exponential form between 20 ° C and 94 ° C. It joins the intermediate curve 14 at a temperature value close to 80 ° C. It reflects the absence of conformational change of this form of previously denatured protein, during the rise in temperature. Indeed, when the protein is previously denatured, all complexation sites are a priori free, so that the oxidoreducible compound, all occupy, and its apparent concentration in the solution revealed by the electrochemical measurement, and minimal. As thermal energy is added, the oxidoreducible compound tends to leave the complexation sites and becomes electrochemically detectable again. As a result, the measurement of the electric current increases. In FIG. 1b, the primary derivatives of the curves illustrated in FIG. 1a are illustrated. Thus, the derivative of the upper curve 10 has the reference 10 ', the derivative of the lower curve 12 has the reference 12' and the derivative of the intermediate curve 14 has the reference 14 '. Thus, a shape transition temperature Tf is defined, here valid for the derived curve 14 'of the intermediate curve 14 and corresponding to the temperature value where the derivative is the most negative. Here, in this example, it is 60 ° C. The experiment of this example 1, was repeated several times allowing each time to find similar curves. An increase in the rate of rise in temperature shifts the shape transition temperature Tf to a higher value and vice versa for a lower speed to a lower value Tf. This result is consistent with slow kinetics of denaturation. Since the thermal denaturation of Glucose Oxidase is irreversible, this results in the application of a descending ramp in temperature on a sample initially containing an undenatured protein with a similar signal evolution merging with that obtained for a sample containing initially the denatured protein, and on which a rising ramp in temperature has been applied. Example 2 This example compares the method implemented in accordance with the present invention and conventional fluorescence methods. Glucose Oxidase will also be used. Electrochemical method according to the invention Also, four solutions D, E, F and G were prepared. The pH is adjusted to 7.4 with phosphate buffer at 0.01 mol.L-1. The volume is adjusted to 4011L with water and adjuvants. Solution D contains the oxidoreducible probe at a concentration of 3x10-6 mol.L-1 and the native Glucose Oxidase protein at a concentration of 10-5 mol.L-1. Solution E contains the oxidoreducible probe at the same concentration and the thermally denatured protein. Denaturation was performed by incubation at 95 ° C in aqueous solution for 1 hour. Solution F and solution G contain the oxidoreducible probe at the same concentration and the previously chemically denatured protein; respectively by urea and guanidine hydrochloride, known chemical denaturants, at high concentrations. To each of these four solutions, incremental amounts of thermal energy are provided at a temperature ramp of 1 ° C per minute so as to increase the temperature of the solutions from 25 ° C to 95 ° C. A measurement of the current making it possible to determine the concentration of free oxidoreductable probe is carried out every 1.8 ° C., according to a protocol analogous to Example 1 above. A hundred measurement points are generated for each experiment. The results are shown in the graph of FIG. 2a, where four curves 22, 24, 26 and 28 are plotted corresponding respectively to the four solutions D, E, F and G.
Ainsi, lorsque la protéine est non dénaturée, s'agissant de la solution D, seule une faible fraction de la sonde oxydoréductible se complexe à la protéine, sur les rares sites de complexation accessibles, ce qui entraîne un faible abaissement de courant, par rapport à une solution qui ne comprendrait que la sonde oxydoréductible. Cette observation est conforme à l'exemple 1 ci- dessus. Dans une première phase de montée en température, la courbe 22 croît jusqu'à un premier extremum 30, traduisant l'agitation thermique subie par les porteurs de charge contenus dans la solution. Ensuite, à partir du premier extremum 30, au fur et à mesure que la température augmente, la protéine change de conformation et tend à se dénaturer en libérant ainsi progressivement les sites de complexation. La sonde oxydoréductible vient alors s'y complexer et sa concentration dans la solution diminue. En conséquence, le courant électrique mesuré diminue également, jusqu'à un second extremum 32. Ensuite, la courbe 22 s'infléchit à nouveau et croît sensiblement parallèlement aux courbes 24, 26, 28 de la protéine dénaturée. En présence de la protéine dénaturée, s'agissant des solutions E, F et G, une plus grande fraction de la sonde oxydoréductible est complexée à la protéine, et partant, la concentration apparente en sonde oxydoréductible est plus faible, et le courant qui en résulte moins élevé.Thus, when the protein is undenatured, with regard to the solution D, only a small fraction of the oxidoreducible probe complexes with the protein, on the rare accessible complexation sites, which leads to a slight lowering of the current, relative to to a solution that would only include the redox probe. This observation is in accordance with Example 1 above. In a first phase of temperature rise, the curve 22 increases to a first extremum 30, reflecting the thermal agitation undergone by the charge carriers contained in the solution. Then, from the first extremum 30, as the temperature increases, the protein changes conformation and tends to denature, thereby gradually releasing the complexation sites. The oxidoreducible probe then becomes complex and its concentration in the solution decreases. As a result, the measured electric current also decreases to a second extremum 32. Thereafter, the curve 22 flexes again and grows substantially parallel to the curves 24, 26, 28 of the denatured protein. In the presence of the denatured protein, with regard to solutions E, F and G, a larger fraction of the oxidoreducible probe is complexed with the protein, and hence the apparent concentration of the oxidoreducible probe is lower, and the current which is results lower.
Cette différence est clairement observée à 25°C entre la courbe 22 correspondant à la solution D et les courbes 24, 26 et 28 correspondant respectivement aux solutions E, F et G. La figure 2b illustre les dérivés primaires des courbes représentées sur la figure 2a. Aussi, la courbe 22' de la dérivée primaire de la courbe 22 représentée sur la figure 2a, présente une valeur minimale 34 permettant de définir une température de transition de forme Tf correspondant à la valeur de température où la dérivée est la plus négative et en l'espèce de 65°C. Méthode par détection de fluorescence La même protéine Glucose Oxydase, est introduite en solution avec une concentration identique à la concentration des solutions précédentes et un fluorophore le SYPRO® Orange (Invitrogen) est ajouté. Il est de couleur orange et est sensible à l'environnement de la protéine et en particulier à l'exposition des acides aminés en surface, et donc à sa structure spatiale en solution aqueuse, ce qui permet de suivre la cinétique de dénaturation de la protéine. Les données de fluorescence sont collectées durant l'augmentation progressive de la température et elles génèrent un profil de fluorescence spécifique de la protéine.This difference is clearly observed at 25 ° C. between the curve 22 corresponding to the solution D and the curves 24, 26 and 28 respectively corresponding to the solutions E, F and G. FIG. 2b illustrates the primary derivatives of the curves represented in FIG. . Also, the curve 22 'of the primary derivative of the curve 22 shown in FIG. 2a has a minimum value 34 making it possible to define a shape transition temperature Tf corresponding to the temperature value where the derivative is the most negative and in the species of 65 ° C. Fluorescence detection method The same Glucose Oxidase protein is introduced in solution with a concentration identical to the concentration of the preceding solutions and a SYPRO® Orange fluorophore (Invitrogen) is added. It is orange in color and is sensitive to the environment of the protein and in particular to the exposure of amino acids at the surface, and therefore to its spatial structure in aqueous solution, which makes it possible to follow the kinetics of denaturation of the protein. . The fluorescence data are collected during the gradual increase in temperature and they generate a fluorescence profile specific for the protein.
Deux solutions H et I ont été préparées. Un tampon de réaction, la sonde fluorescente et la protéine étudiée sont mis en solution dans de l'eau jusqu'à un volume de 20pL. La première solution H ne contient que la sonde fluorescente à une concentration donnée. La seconde solution I contient la sonde fluorescente à la même concentration et la protéine native à une concentration de 10-5 mol.L-1. De l'énergie thermique est fournit à chacune de ces solutions H, I, selon une rampe de température de l'ordre de 1°C par minute, de 25°C à 99°C. Une mesure de fluorescence tous les 0.4°C permet de sonder en fonction de la montée en température et par conséquent du temps, la concentration apparente de la sonde fluorescente sensible à la structure native ou non de la protéine. Environ 185 points de mesure sont ainsi générés pour chaque expérience. Les résultats sont reportés sur le graphique de la figure 3a. On observe un premier faisceau 40 de courbes sensiblement parallèles et correspondant à quatre expériences identiques réalisées avec la première solution H, et un second faisceau 42 de quatre courbes sensiblement parallèles et correspondant à la seconde solution I. Ainsi, à 25°C, en présence de la protéine native, ou non dénaturée, soit la seconde solution I, la sonde fluorescente est naturellement « quenchée » c'est-à-dire qu'il n'y a pas ou peu de signal en fluorescence, comme l'illustre la courbe 42. Toutefois, on observera que, par rapport à la première solution H, la seconde solution I contenant la protéine native, présente une fluorescence sensiblement supérieure. Dans une première phase d'augmentation de la température, jusqu'à 50°C environ, le signal fluorescent demeure sensiblement constant. Ensuite, lorsque la température croît au-dessus de 50°C, et jusqu'à 70°C environ, la protéine se dénature et le coeur hydrophobe de la protéine tend à être exposé, ce qui libère ses sites actifs. La sonde de fluorescence interagit alors avec ces sites et voit ainsi son environnement changer, et en conséquence un signal fluorescent apparaît et augmente fortement.Two solutions H and I were prepared. A reaction buffer, the fluorescent probe and the protein studied are dissolved in water to a volume of 20 μL. The first solution H contains only the fluorescent probe at a given concentration. The second solution I contains the fluorescent probe at the same concentration and the native protein at a concentration of 10-5 mol.L-1. Thermal energy is supplied to each of these solutions H, I, according to a temperature ramp of the order of 1 ° C per minute, from 25 ° C to 99 ° C. A fluorescence measurement every 0.4 ° C can probe depending on the rise in temperature and therefore time, the apparent concentration of the fluorescent probe sensitive to the native structure of the protein or not. About 185 measurement points are generated for each experiment. The results are shown in the graph of Figure 3a. A first beam 40 of substantially parallel curves is observed corresponding to four identical experiments carried out with the first solution H, and a second beam 42 of four substantially parallel curves corresponding to the second solution I. Thus, at 25 ° C., in the presence of the native or non-denatured protein, ie the second solution I, the fluorescent probe is naturally "quenched" that is to say that there is no or little signal in fluorescence, as illustrated by FIG. curve 42. However, it will be observed that, with respect to the first solution H, the second solution I containing the native protein, has a substantially higher fluorescence. In a first phase of increasing the temperature, up to about 50 ° C., the fluorescent signal remains substantially constant. Then, when the temperature rises above 50 ° C, and up to about 70 ° C, the protein denatures and the hydrophobic core of the protein tends to be exposed, which releases its active sites. The fluorescence probe then interacts with these sites and thus sees its environment change, and as a result a fluorescent signal appears and increases strongly.
Sur la figure 3b apparaît un graphique des courbes dérivées du second faisceau de courbes 42' représentées sur la figure 3a, et il permet de définir à un extremum 44, la température de transition de forme Tf, qui est de 65,5°C. On observe que cette température est très voisine de celle qui avait été déterminée selon la méthode électrochimique objet de l'invention. Exemple 3 La T4 DNA ligase est une enzyme catalysant la reconstitution de la liaison phosphoester entre le carbone 3'-OH et le phosphate-5' de deux nucléotides voisins sur un brin d'ADN. Cette enzyme, ou protéine, peut aussi bien lier les extrémités à bouts francs ou à bouts cohésifs. L'ATP est un cofacteur essentiel au bon déroulement de son fonctionnement. La protéine présente une masse de 55 293 Da (Dalton). Méthode par détection de fluorescence Aussi, quatre solutions J, K, L et M sont préparées. Un tampon de réaction, la sonde fluorescente, ou agent révélateur, est à la même concentration dans tous les essais. La protéine T4 DNA ligase avec ou sans son ligand, l'ATP, sont mis en solution dans un tampon de réaction complété avec de l'eau jusqu'à un volume de 20pL. La première solution J ne contient que la sonde fluorescente. La deuxième solution K contient uniquement le ligand et la sonde fluorescente, mais pas la protéine. La troisième solution L contient la protéine, la T4 DNA ligase, à une concentration donnée et la sonde fluorescente. Et la quatrième solution M contient la protéine à la même concentration, le ligand à savoir l'ATP et la sonde fluorescente. A chacune de ces solutions, sont fournis des quantités d'énergie thermique selon une rampe de température de l'ordre de 1°C par minute de manière à les porter d'une température initiale de 25°C jusqu'à 99°C. Une mesure de la fluorescence tous les 0,4°C permet de sonder en fonction de la montée en température, la concentration apparente de la sonde fluorescente sensible à la structure native ou non de la protéine. Environ 200 points de mesure sont ainsi générés pour chaque expérience. Les résultats sont ainsi reportés sur la figure 4a. Quatre essais ont été conduits pour chacune des solutions J, K, L et M.FIG. 3b shows a graph of the curves derived from the second beam of curves 42 'shown in FIG. 3a, and it makes it possible to define at an extremum 44, the shape transition temperature Tf, which is 65.5 ° C. It is observed that this temperature is very close to that which was determined according to the electrochemical method object of the invention. Example 3 T4 DNA ligase is an enzyme catalyzing the reconstitution of the phosphoester bond between the 3'-OH carbon and the 5 'phosphate of two neighboring nucleotides on a DNA strand. This enzyme, or protein, can also bind ends with straight ends or cohesive ends. ATP is a cofactor essential to the smooth running of its operation. The protein has a mass of 55,293 Da (Dalton). Fluorescence Detection Method Also, four solutions J, K, L and M are prepared. A reaction buffer, fluorescent probe, or developer, is at the same concentration in all tests. The T4 DNA ligase protein with or without its ligand, ATP, is dissolved in a reaction buffer supplemented with water to a volume of 20 μL. The first solution J contains only the fluorescent probe. The second solution K contains only the ligand and the fluorescent probe, but not the protein. The third solution L contains the protein, T4 DNA ligase, at a given concentration and the fluorescent probe. And the fourth solution M contains the protein at the same concentration, the ligand namely ATP and the fluorescent probe. To each of these solutions, quantities of thermal energy are provided according to a temperature ramp of the order of 1 ° C. per minute so as to bring them from an initial temperature of 25 ° C. to 99 ° C. A measurement of the fluorescence every 0.4 ° C makes it possible to probe, as a function of the rise in temperature, the apparent concentration of the fluorescent probe sensitive to the native or non-native structure of the protein. About 200 measurement points are generated for each experiment. The results are thus reported in FIG. 4a. Four tests were conducted for each of the solutions J, K, L and M.
Un premier faisceau 50 de quatre courbes sensiblement parallèles et verticales entre 35 et 45 °C, correspond aux quatre essais pour la solution L, laquelle contient uniquement la protéine et la sonde fluorescente. Un deuxième faisceau 52 de quatre courbes sensiblement parallèles et vertical entre 40 et 50°C, et décalé sensiblement de 4 à 5°C correspond aux quatre essais pour la solution M, incluant la protéine, le ligand à savoir l'ATP et la sonde fluorescente. En revanche, deux autres faisceaux confondus et horizontaux 54, 56 de quatre courbes sensiblement parallèles, correspondent aux deux autres solutions J et K, ne contenant pas la protéine. Le premier faisceau 50, correspondant à la solution L incluant la protéine native mais pas le ligand, présente à 30 °C un signal de fluorescence faible car, la sonde fluorescente est naturellement « quenchée ». Il est toutefois sensiblement supérieur à celui des solutions J et K, car une faible fraction de sonde fluorescente est en interaction avec la T4 DNA ligase lui permettant d'exalter un signal fluorescent. Quand la protéine commence à se dénaturer en réponse à une augmentation de la température, vers 30°C pour le premier faisceau 50 et vers 40°C pour le deuxième faisceau 52, le coeur hydrophobe de la protéine tend à être exposé. La sonde de fluorescence interagit alors avec ce dernier et commence à être détectable. La fluorescence croît alors exponentiellement. Les données sont enregistrées en temps réel et l'on peut définir un point où 50% des protéines sont sous une forme dénaturée. La température de transition de forme Tf, pour le premier faisceau 50 correspondant à la protéine sans son ligand, est de 43°C, tandis qu'elle est de 47.5°C pour le deuxième faisceau 52 correspondant à la protéine avec son ligand. Ces valeurs apparaissent plus clairement sur les courbes dérivées 50', 52' correspondantes illustrées sur le diagramme de la figure 4b, et elles correspondent respectivement à leur deux extremum 58, 60. Aussi, un décalage de 4,5°C apparaît entre ces deux extremums. Par conséquent, puisque la quantité d'énergie thermique nécessaire pour modifier la conformation de la protéine lorsqu'elle est en présence de son ligand est supérieure à celle qui est nécessaire en l'absence de son ligand, on en déduit naturellement qu'elle est plus stable en présence de son ligand. Méthode électrochimique conforme à l'invention L'expérience est réalisée de manière analogue par détection électrochimique, selon l'invention. Seules les troisième et quatrième solution L et M sont testées et la sonde fluorescente est remplacée par la sonde oxydoréductible à raison de 30.10-6 mol.L-1. En outre, le volume des solutions est ajusté dans ce cas à 40pL. Ainsi, la troisième solution L comporte la protéine, la T4 DNA ligase, et le composé oxydoréductible, tandis que la quatrième solution M inclut au surplus le ligand ATP. Une mesure de courant permettant de déterminer la concentration en sonde oxydoréductible libre est réalisée tous les 0,7°C, selon un protocole analogue à l'exemple 1. A chacune de ces deux solutions L et M, des quantités progressives d'énergie thermique sont fournies selon une rampe de température de 1°C par minute de manière à augmenter la température des solutions de 25°C à 95°C. Une centaine de points de mesure sont ainsi générés pour chaque expérience. Les résultats sont reportés sur le graphique de la figure 5a. Ainsi, apparaît sur cette figure 5a, un premier faisceau supérieur 60 de deux courbes correspondant à deux essais réalisés sur la quatrième solution M, et un second faisceau inférieur 62 de deux courbes correspondant à deux essais réalisés sur la troisième solution L. L'intensité du courant électrique traversant la quatrième solution M est supérieure à celle traversant la troisième solution L, jusqu'à un point d'intersection des deux faisceaux de courbes 60, 62 où elles sont identiques, lequel pour une intersection est précédé d'une inflexion 66 du premier faisceau supérieur 60. Les faisceaux de courbes 60' et 62' des dérivées primaires des courbes représentées sur la figure 5a, font apparaître deux extremums de 38,2 °C et de 30 43 °C correspondant respectivement à la température de transition de forme Tf, de la protéine sans son ligand et de la protéine avec son ligand. Ce décalage de 4,8 °C est en accord avec celui de 4,5 °C observé avec la méthode par détection de fluorescence, et il montre que l'on peut déterminer dans quelles conditions thermodynamiques, une protéine peut être stabilisée par son ligand.5A first beam 50 of four substantially parallel and vertical curves between 35 and 45 ° C, corresponds to the four tests for solution L, which contains only the protein and the fluorescent probe. A second beam 52 of four substantially parallel curves and vertical between 40 and 50 ° C, and shifted substantially from 4 to 5 ° C corresponds to the four tests for the solution M, including the protein, the ligand namely ATP and the probe fluorescent. On the other hand, two other confluent and horizontal beams 54, 56 of four substantially parallel curves correspond to the two other solutions J and K, which do not contain the protein. The first beam 50, corresponding to the solution L including the native protein but not the ligand, has at 30 ° C a weak fluorescence signal because the fluorescent probe is naturally "quenched". However, it is significantly greater than that of solutions J and K, because a small fraction of fluorescent probe is in interaction with T4 DNA ligase to exalt a fluorescent signal. When the protein starts to denature in response to an increase in temperature, at about 30 ° C for the first beam 50 and about 40 ° C for the second beam 52, the hydrophobic core of the protein tends to be exposed. The fluorescence probe then interacts with the latter and begins to be detectable. The fluorescence then grows exponentially. The data is recorded in real time and a point can be defined where 50% of the proteins are in a denatured form. The shape transition temperature Tf, for the first beam 50 corresponding to the protein without its ligand, is 43 ° C, while it is 47.5 ° C for the second beam 52 corresponding to the protein with its ligand. These values appear more clearly on the corresponding derived curves 50 ', 52' shown in the diagram of FIG. 4b, and they respectively correspond to their two extremum 58, 60. Also, an offset of 4.5 ° C. appears between these two extrema. Therefore, since the amount of thermal energy required to modify the conformation of the protein when it is in the presence of its ligand is greater than that which is necessary in the absence of its ligand, it is naturally deduced that it is more stable in the presence of its ligand. Electrochemical method according to the invention The experiment is carried out analogously by electrochemical detection according to the invention. Only the third and fourth solution L and M are tested and the fluorescent probe is replaced by the oxidoreducible probe at a rate of 30.10-6 mol.L-1. In addition, the volume of the solutions is adjusted in this case to 40 pL. Thus, the third solution L comprises the protein, the T4 DNA ligase, and the oxidoreducible compound, while the fourth solution M additionally includes the ATP ligand. A measurement of current making it possible to determine the concentration of free oxidoreductable probe is carried out every 0.7 ° C., according to a protocol analogous to Example 1. To each of these two solutions L and M, progressive quantities of thermal energy are provided in a temperature ramp of 1 ° C per minute to increase the temperature of the solutions from 25 ° C to 95 ° C. A hundred measurement points are generated for each experiment. The results are shown in the graph of Figure 5a. Thus, appears in this FIG. 5a, a first upper beam 60 of two curves corresponding to two tests carried out on the fourth solution M, and a second lower beam 62 of two curves corresponding to two tests carried out on the third solution L. The intensity the electric current passing through the fourth solution M is greater than that crossing the third solution L, to a point of intersection of the two bundles of curves 60, 62 where they are identical, which for an intersection is preceded by an inflection 66 of the first upper bundle 60. The bundles of curves 60 'and 62' of the primary derivatives of the curves shown in FIG. 5a, show two extremums of 38.2 ° C. and 43 ° C. respectively corresponding to the transition temperature of Tf form, the protein without its ligand and the protein with its ligand. This 4.8 ° C shift is consistent with the 4.5 ° C observed with the fluorescence detection method, and shows that under which thermodynamic conditions a protein can be stabilized by its ligand can be determined. .5
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|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LIANG-HONG GUO ET AL: "Chemical-Induced Unfolding of Cofactor-Free Protein Monitored by Electrochemistry", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 78, no. 17, 1 September 2006 (2006-09-01), pages 6275 - 6278, XP055062265, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/ac060351h * |
| MARUYAMA K ET AL: "DNA SENSOR WITH A DIPYRIDOPHENAZINE COMPLEX OF OSMIUM(II) AS AN ELECTROCHEMICAL PROBE", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 74, no. 15, 1 August 2002 (2002-08-01), pages 3698 - 3703, XP001132448, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/AC011148J * |
Also Published As
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| WO2014033410A1 (en) | 2014-03-06 |
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