FR2988604A1 - Compositions d'oligosaccharides, leur procede de preparation et leurs utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet des compositions d'oligosaccharides, leur procédé de préparation et leurs utilisations, notamment en cosmétique.
Description
COMPOSITIONS D'OLIGOSACCHARIDES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS UTILISATIONS La présente invention a pour objet des compositions d'oligosaccharides, leur procédé de préparation et leurs utilisations, notamment en cosmétique. La couche la plus superficielle de la peau est appelée Stratum Corneum et se caractérise par la différenciation terminale des kératinocytes provenant des kératinocytes prolifératifs issus de la couche basale. L'hydratation de la couche cornée est essentielle pour la peau et dépend de nombreux facteurs comme la composition en lipides extracellulaires (céramides, cholestérol, acides gras libres) sécrétés par les corps lamellaires des kératinocytes, de la teneur en NMF (Facteurs Naturels d'Hydratation) provenant de la filaggrine, et dépend également du gradient de pH cutané, élément important dans le fonctionnement général du Stratum Corneum. Tous ces facteurs sont altérés et diminués avec l'âge. Dans la peau, la filaggrine est un marqueur de différenciation tardif impliqué dans l'hydratation et la fonction barrière de l'épiderme. La filaggrine « filament-aggregating protein » interagit avec les filaments de kératine du stratum corneum et contribue ainsi à former une matrice de kératine (après action des transglutaminases) insoluble à laquelle les protéines de l'enveloppe cornée et les lipides peuvent s'attacher. La profilaggrine contenue dans les granules de keratohyaline est le précurseur de la filaggrine. Au cours de la différenciation la profilaggrine est clivée en monomères de filaggrine. La filaggrine a une double fonctionnalité au sein du stratum corneum. Elle catalyse la formation des ponts disulfures entre les filaments de kératine puis génère, à l'intérieur des cornéocytes moyens et superficiels, un pool concentré d'acides aminés libres et de dérivés qui constituent les NMF (facteur naturel d'hydratation). Ceux-ci offrent des sites de fixation pour les molécules d'eau et établissent de véritables ponts entre les kératines et l'eau, maintenant ainsi un minimum d'hydratation des couches moyennes et supérieures du stratum corneum. Les aquaporines (AQP) sont une classe de protéines membranaires qui forment des pores perméables aux molécules d'eau et au glycérol dans les membranes biologiques.
Dans la peau, l'aquaporine 3 (AQP3) est localisée dans les kératinocytes. Les souris dont le gène de l'aquaporine 3 a été invalidé présentent une perte d'élasticité de l'épiderme, une altération de la barrière cutanée ainsi qu'une diminution de la quantité d'eau contenue dans le stratum corneum à l'origine d'une sécheresse prononcée de la peau. L'ensemble de ces observations plaide en faveur d'un rôle de l'aquaporine 3 dans l'homéostasie hydrique de l'épiderme. En outre, une étude suggère que l'aquaporine 3, par sa perméabilité au glycérol et en interagissant avec la phospholipase D, pourrait également intervenir dans les mécanismes de prolifération et de différenciation des kératinocytes. Ainsi, un but de la présente invention consiste à fournir des compositions d'oligosaccharides permettant de stimuler l'expression de la filaggrine et/ou de l'aquaporine- 3. Un autre but de l'invention consiste à fournir des compositions comprenant des oligosaccharides pour leur utilisation en cosmétique, notamment pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière et l'hydratation.
L'invention a par conséquent pour objet l'utilisation d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, comprenant : - des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, - un milieu de culture desdites bactéries, et - une composition contenant des polysaccharides, produite par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture, lesdits polysaccharides étant de formule I suivante : f3-Kdop 2 3 ->3)-(3-D-Glcp-(1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1-> 2 (0Ac) 25 dans laquelle : Glc représente le glucose ; 6dTal représente le 6-déoxy-talose ; Kdo représente l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique ; 30 n est un nombre entier compris de 700 à 800 ; la concentration en polysaccharides dans ladite composition de moût de fermentation variant de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L ; ladite composition de moût de fermentation étant hydrolysée, pour la préparation d'une composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire 35 allant de 1 à 30 KDa ayant des propriétés cosmétiques.20 De manière inattendue, la demanderesse a maintenant trouvé que des compositions d'oligosaccharides, susceptibles d'être obtenues à partir de moûts de fermentation comprenant des polysaccharides, des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, et un milieu de culture desdites bactéries, avaient des propriétés cosmétiques, notamment l'amélioration et/ou le renforcement de la fonction barrière et l'hydratation. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite composition de moût de fermentation est hydrolysée et neutralisée. Selon un autre mode de réalisation avantageux, ladite composition de moût de fermentation est hydrolysée, éventuellement neutralisée et purifiée. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, lesdites bactéries sont de la souche Burkholderia caribensis MWAP71 ARD, déposée auprès de la CNCM le 09 février 2012 sous le numéro I-4598. L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa, à partir d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, ladite composition de moût de fermentation comprenant : - des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, - un milieu de culture desdites bactéries, et - une composition contenant des polysaccharides, produit par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture, lesdits polysaccharides étant de formule I suivante : f3-Kdop 2 3 ->3)-(3-D-Glcp-(1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1-> 2 dans laquelle : (0Ac) Glc représente le glucose ; 6dTal représente le 6-déoxy-talose ; Kdo représente l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique ; n est un nombre entier compris de 700 à 800 ; la concentration en polysaccharides dans ladite composition de moût de fermentation variant de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L ; ledit procédé comprenant une étape d'hydrolyse de ladite composition de moût de 5 fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat. Par composition de moût de fermentation, on entend une composition comprenant des bactéries, un milieu de culture approprié à leur prolifération et au moins un métabolite produit par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture. 10 On entend par « milieu de culture » une solution aqueuse contenant des éléments nutritifs, en particulier une source de carbone, une source d'azote, une source d'oligoéléments et une source de facteurs de croissance, nécessaires au métabolisme bactérien. Dans le cas de bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, ledit métabolite est ladite composition contenant 15 des polysaccharides. Le moût de fermentation comprend ainsi des bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, la composition contenant des polysaccharides, et le milieu de culture à l'issue de l'étape de croissance des bactéries et de production de la composition contenant les 20 polysaccharides, c'est-à-dire une solution aqueuse dans laquelle sont présents les éléments nutritifs et des métabolites (autres que la composition contenant des polysaccharides) éventuellement excrétés par la souche. Par « milieu de culture approprié à leur prolifération», on entend un milieu de culture adapté aux bactéries de l'espèce considérée, en particulier aux bactéries de la souche 25 considérée, c'est-à-dire un milieu de culture contenant les éléments nutritifs, organiques et minéraux, nécessaires à la synthèse de biomasse bactérienne. Par biomasse bactérienne, on entend la masse totale des bactéries présentes, à un moment donné, dans ledit moût de fermentation. Par hydrolyse, on entend une réaction à l'issue de laquelle au moins la chaîne 30 principale desdits polysaccharides, constituée par l'enchaînement du motif [->3)-3-D-Glcp- (1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1->], est coupée de façon à obtenir des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 Kda, préférentiellement de 1 à 15 KDa.
Ladite hydrolyse peut par exemple être acide, basique, thermique, acide et thermique, basique et thermique, enzymatique, ou enzymatique et thermique. Par hydrolyse acide, on entend une réaction d'hydrolyse réalisée en milieu aqueux acide, ladite réaction étant catalysée par les ions H+ présents dans ledit milieu.
Par hydrolyse basique, on entend une réaction d'hydrolyse réalisée en milieu aqueux basique. Par hydrolyse thermique, on entend une réaction d'hydrolyse réalisée en milieu aqueux, ledit milieu aqueux étant chauffé à une température supérieure à la température ambiante.
Par hydrolyse enzymatique, on entend une réaction d'hydrolyse catalysée par des enzymes. L'espèce Burkholderia caribensis, en particulier la souche Burkholderia caribensis MWAP71, a été isolée d'un échantillon de vertisol prélevé dans le sud-est de l'île de la Martinique.
La souche Burkholderia caribensis MWAP71 a été classée par le biais des outils de génétique moléculaire comme appartenant au genre Burkholderia et a été déposée le 09/02/12 auprès de la CNCM selon le traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement I-4598. Ladite souche a été identifiée après séquençage de son gène rrs qui code pour l'ADN ribosomal 16S et par hybridation ADN:ADN comme étant une Burkholderia caribensis sp. 20 nov. Cette souche présente les caractéristiques biochimiques décrites dans le tableau 1 ci-dessous : Test Résultat Etat Frais Bacilles mobiles Coloration de Gram Gram-négatif Oxydase + Catalase + NO3 (nitrate réductase) - N2 (nitrate réductase) - Glucose (ferm) - Arginine dihydrolase - Uréase - Hydrolyse de l'esculine - Gélatinase - Glucose (assimilation) + Arabinose (assimilation) + Mannose (assimilation) + Mannitol (assimilation) + N acétylglucose amine (assimilation) + Maltose (assimilation) - Gluconate (assimilation) + Caprate (assimilation) + Adipate (assimilation) - Malate (assimilation) + Tableau 1 : Caractéristiques biochimiques de la souche MWAP71 Sur milieu solide type PCA (Biomérieux France) et après 30 heures d'incubation à 30°C, la souche MWAP71 forme des colonies de couleur blanche, de type S et d'un diamètre 5 de 5 à lOmm. Le milieu de culture PCA (Plate Count Agar) est bien connu de l'homme du métier pour les dénombrements de flore totale aérobie. Sa composition est la suivante : peptones 5 g/1, extrait de levure 2,5 g/1, glucose 1 g/1, agar 15 g/l. L'observation microscopique (x100) d'une coloration de Gram d'une colonie de 10 MWAP71 ayant été cultivée sur milieu solide PCA (Biomérieux France) pendant 30 heures à 30°C, fait état d'un bacille court à Gram négatif. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite hydrolyse est acide. Un acide est alors ajouté à ladite composition de moût de fermentation. Ledit acide est un acide minéral ou organique soluble ou partiellement soluble dans l'eau. 15 Selon un autre mode de réalisation avantageux, ladite hydrolyse est thermique. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite hydrolyse est thermique et acide. Ledit acide est alors ajouté à ladite composition de moût de fermentation et ladite composition est chauffée avant, pendant, ou après l'ajout dudit acide, à une température 20 supérieure à la température ambiante. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite étape d'hydrolyse, l'hydrolyse étant acide ou acide et thermique, est réalisée à un pH allant de 0 à 3, en particulier de 1 à 2. Selon un autre mode de réalisation avantageux, ladite étape d'hydrolyse, l'hydrolyse étant thermique, est réalisée à une température allant de la température ambiante à 100°C, de 25 préférence à une température allant de 80 à 100°C.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans lequel ladite étape d'hydrolyse, l'hydrolyse étant acide et thermique, est réalisée à une température allant de la température ambiante à 100°C, de préférence à une température allant de 70 à 90°C. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'hydrolyse est enzymatique.
Des enzymes sont alors ajoutées à la composition de moût de fermentation, afin de catalyser la réaction d'hydrolyse. L'hydrolyse enzymatique peut être une hydrolyse enzymatique et thermique dans le cas où ladite composition est chauffée avant, pendant, ou après l'ajout desdites enzymes, à une température supérieure à la température ambiante.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'hydrolyse est réalisée en présence d'enzymes choisies dans le groupe comprenant les protéases et les glycosidases, en particulier les amylases. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite étape d'hydrolyse enzymatique est réalisée à une température allant de la température ambiante à 70°C.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes: - hydrolyse acide et éventuellement thermique de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, et - neutralisation dudit hydrolysat pour obtenir un hydrolysat neutralisé.
Par neutralisation, on entend que le pH est ajusté à la fin de l'hydrolyse, de telle façon que la réaction d'hydrolyse acide soit arrêtée. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : - hydrolyse de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - éventuellement neutralisation dudit hydrolysat pour obtenir un hydrolysat neutralisé, et - purification dudit hydrolysat, éventuellement neutralisé, pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides, de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa.
Par purification de l'hydrolysat, on entend que ledit hydrolysat est débarrassé des bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, ainsi que du milieu de culture desdites bactéries, c'est-à-dire qu'il contient moins de 0,01 % en masse de bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, et/ou moins de 0,5% en masse du milieu de culture. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes: - hydrolyse acide et éventuellement thermique de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - neutralisation dudit hydrolysat pour obtenir un hydrolysat neutralisé, et - purification dudit hydrolysat neutralisé pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides, de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes: - hydrolyse thermique ou enzymatique de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - purification dudit hydrolysat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides, de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le pH à l'issue de ladite étape neutralisation va de 6 à 8, en particulier de 7 à 8.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite purification se fait par au moins une filtration. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite purification se fait par au moins une filtration tangentielle. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite purification comprend les étapes suivantes : - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - éventuellement filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,0ûm, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle dudit hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat 30 sur une membrane allant de 10 à 30 KDa, de préférence une membrane de 10 KDa, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Par « surnageant, débarrassé desdites bactéries », on entend que le surnageant contient moins de 0,01% en masse de bactéries. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ladite purification comprend les étapes suivantes : - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,01.1m, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle dudit hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat sur une membrane allant de 10 à 30 KDa, de préférence une membrane de 10 KDa, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 15 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Selon un mode de réalisation avantageux, ladite composition contient des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 15 KDa. 20 Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé comprend les étapes suivantes : - hydrolyse de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - éventuellement neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, 25 - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - éventuellement filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,01.1m, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir 30 respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé comprend les étapes suivantes : - hydrolyse de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,0ûm, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 15 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé comprend les étapes suivantes : 20 - éventuellement revivification de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, pour obtenir des bactéries revivifiées, - culture de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, éventuellement revivifiées, dans un 25 milieu de culture approprié à leur prolifération, pour obtenir une première composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - éventuellement inoculation d'un fermenteur par ladite première composition de moût de fermentation obtenu à l'étape précédente, et fermentation, au cours de laquelle le fermenteur est mis en conditions propices à la croissance des bactéries et à la production de 30 polysaccharides de formule I, pour obtenir une deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - hydrolyse de ladite première ou deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - éventuellement neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - éventuellement filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,01.1m, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa. Ledit retentat contient moins de 0,5% en masse de milieu de culture. Ladite composition de moût de fermentation peut être obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes : - éventuellement revivification de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier la souche Burkholderia caribensis MWAP71, pour obtenir des bactéries revivifiées, - culture de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier la souche 20 Burkholderia caribensis MWAP71, éventuellement revivifiées, dans un milieu de culture approprié à leur prolifération, pour obtenir un premier moût de fermentation de Burkholderia caribensis comprenant une composition contenant des polysaccharides de formule I, - éventuellement inoculation d'un fermenteur contenant un milieu de production par ledit premier moût de fermentation obtenu à l'étape précédente, et fermentation, au cours de 25 laquelle le fermenteur est mis en conditions propices à la croissance des bactéries et à la production de polysaccharides de formule I, pour obtenir un deuxième moût de fermentation de Burkholderia caribensis comprenant une composition contenant des polysaccharides de formule I. Par revivification, on entend le fait de remettre les cellules bactériennes dans un été 30 physiologique permettant leur croissance, grâce à des conditions de culture adaptées, par opposition à leurs conditions de conservation, qui ne permettent pas leur croissance, par exemple en cryobanque à -80°C, ou dans du glycérol. Par « milieu de production », on entend un milieu de culture permettant la synthèse de biomasse bactérienne et la production de polysaccharides au sein du fermenteur.
Bien que les bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, possèdent naturellement la capacité de synthétiser ladite composition contenant des polysaccharides, elles ne la produisent qu'en faible quantité lorsqu'elles sont mises en culture sur boîtes de milieu solide.
Il est donc indispensable de développer un milieu de culture et des conditions opératoires permettant de maximiser la production de ladite composition par l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier de la souche Burkholderia caribensis MWAP71. Par « maximiser la production de ladite composition », on entend obtenir une composition de moût de fermentation dans laquelle la concentration en polysaccharide varie de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L. Le rapport entre le carbone et l'azote (C/N) présent dans le milieu de culture est un paramètre important du comportement de la souche face à une carence en éléments carbonés ou azotés. Avantageusement, le choix d'un ratio de la concentration massique de la source de carbone dans le milieu de culture, par exemple le glucose, sur la concentration massique de la source d'azote dans le milieu de culture, par exemple un extrait de levure, compris de 7 à 15 permet de maximiser la production de la composition contenant des polysaccharides de formule I. Le milieu de culture est de façon très avantageuse composé d'extrait de levure à 3 g/1 et de 23 g/1 de glucose soit un ratio de 7,6.
Selon un mode de réalisation avantageux, la température du milieu de production varie de la température ambiante à 40°C, en particulier de 28 à 32°C. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le pH du milieu de production est régulé de façon à varier de 6 à 7,5, en particulier de 6,5 à 7. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le milieu de production est tel que la pression partielle en oxygène dans ledit milieu est supérieure ou égale à 20%, en particulier supérieure ou égale à 30%. Par pression partielle en oxygène, on entend la concentration en oxygène (02) dissous dans la phase liquide. Cette pression partielle s'exprime en % de la concentration saturante en oxygène dans les conditions de travail considérées, telles que, de façon non limitative, la température, la pression, l'agitation. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé comprend les étapes suivantes : - revivification de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, pour obtenir des bactéries revivifiées, - culture de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, éventuellement revivifiées, dans un milieu de culture approprié à leur prolifération, pour obtenir une première composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - inoculation d'un fermenteur par ladite première composition de moût de fermentation obtenu à l'étape précédente, et fermentation, au cours de laquelle le fermenteur est mis en conditions propices à la croissance des bactéries et à la production de polysaccharides de formule I, pour obtenir une deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - hydrolyse de ladite première ou deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,0pm, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa.
Selon un mode de réalisation avantageux, lesdites bactéries sont de la souche Burkholderia caribensis MWAP71 ARD, déposée auprès de la CNCM le 09 février 2012 sous le numéro I-4598. L'invention concerne également un hydrolysat d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis susceptible d'être obtenu par le procédé décrit 30 précédemment. L'invention concerne également un hydrolysat neutralisé d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis susceptible d'être obtenu par le procédé décrit précédemment.
L'invention concerne également une composition contenant des oligosaccharides susceptible d'être obtenue par le procédé décrit précédemment. Ladite composition correspond audit hydrolysat, éventuellement neutralisé, purifié, c'est-à-dire débarrassé des bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en 5 particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, et du milieu de culture desdites bactéries. Ladite composition peut éventuellement être mise en solution dans l'eau, pour son utilisation ultérieure. La solution ainsi obtenu peut éventuellement être décolorée, par exemple à l'aide de 10 charbon actif, en particulier par passage sur une plaque de charbon actif. Le taux de matière sèche de ladite solution est préférentiellement compris entre 0,1 et 10%, en particulier entre 0,5 et 2%. La matière sèche de ladite solution peut être déterminée par la mesure de la perte en masse de l'échantillon après passage à l'étuve. 15 Le pH de ladite solution est préférentiellement compris entre 3 et 8, en particulier entre 4 et 7. Le taux de glucose de ladite solution, mesuré après hydrolyse acide totale des oligosaccharides, par HPLC, est préférentiellement compris entre 0,1 g/1 et 15 g/1, en particulier entrel g/1 et 10g/1. 20 L'invention concerne également une composition comprenant des oligosaccharides issus de bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, dans laquelle : - le taux de matière sèche est préférentiellement compris entre 0,1 et 10%, en particulier entre 0,5 et 2% ; 25 - le pH est compris entre 3 et 8, en particulier entre 4 et 7 ; - le taux de glucose de ladite solution, après hydrolyse acide totale des oligosaccharides, est préférentiellement compris entre 0,1 g/1 et 15 g/1, en particulier entrel g/1 et 10g/1. L'invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat d'une composition de 30 moût de fermentation de Burkholderia caribensis décrite précédemment pour la préparation d'une composition cosmétique. L'invention concerne également l'utilisation d'un hydrolysat neutralisé d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis décrite précédemment pour la préparation d'une composition cosmétique.
L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment pour la préparation d'une composition cosmétique. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour la préparation d'une composition cosmétique destinée à améliorer et/ou renforcer la fonction barrière de la peau, tel que mesurée selon un test de perte insensible en eau. Il est bien connu de l'homme du métier qu'un test de perte insensible en eau est un bon indicateur de la fonction barrière de la peau.
La perte insensible en eau peut être déterminée à l'aide d'un évaporimètre, mesurant la quantité d'eau évaporée. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour la préparation d'une composition cosmétique destinée à améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau.
Il est bien connu de l'homme du métier qu'un produit irritant va augmenter la perte insensible en eau alors qu'un produit hydratant va la diminuer. L'hydratation de la peau est ainsi une fonction biologique liée à la fonction barrière, et est liée aux résultats d'un test de perte insensible en eau. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour la préparation d'une composition cosmétique destinée à améliorer et/ou renforcer la fonction barrière et l'hydratation de la peau. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière de la peau. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau. L'invention concerne également l'utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment, pour améliorer et/ou renforcer la fonction barrière et l'hydratation de la peau. L' invention concerne également l'utilisation une composition cosmétique comprenant à titre de principe actif une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment.
Les compositions cosmétiques mentionnés plus haut sont par exemples des solutions, telles que des lotions, des émulsions liquides ou semi-liquides telles que des laits ou des émulsions de consistance molle telles que des crèmes ou des gels, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse ou inversement, des suspensions de consistance liquide, semi-liquide ou molle, ou des poudres. Ces compositions sont adaptées et préparées selon les méthodes usuelles connues de l'homme de l'art. Parmi les véhicules utilisés de façon usuelle dans les compositions cosmétiques mentionnées ci-dessus, on peut citer les tensio-actifs, les colorants, les parfums, les agents conservateurs, les émulsionnants, les stabilisateurs d'émulsion, les émollients, les hydratants, les cires naturelles ou synthétiques, les épaississants et/ou gélifiants, les humectants, les véhicules liquides tels que l'eau, des corps gras tels que les huiles naturelles ou synthétiques destinées à constituer la phase grasse des laits ou des crèmes, et leurs mélanges. L'invention concerne également une méthode de traitement cosmétique comprenant l'application par voie topique d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides décrite précédemment dans un véhicule cosmétologiquement acceptable.
DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 est un graphique représentant l'évolution de la densité optique corrigée à 600 nm au cours du temps d'un milieu de préculture inoculé par la souche MWAP71. La densité optique corrigée correspond à la densité optique à 600 nm (D0600), à laquelle on retranche la densité optique du milieu initial avant inoculation : D0600 corrigée = D0600(échantillon) - D0600(milieu de culture avant inoculation) La figure 2 est un graphique représentant l'évolution de la densité optique corrigée à 600 nm (losanges), de la viscosité mesurée à l'aide d'un rhéomètre RM 100 de la société LAMY (module 1, vitesse 25,8 s-1) (en cps, triangles) et de la concentration en glucose (en g/kg, carrés) au cours du temps, du moût de fermentation dans le fermenteur.
PARTIE EXPERIMENTALE La composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, comprenant : - des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de 5 la souche Burkholderia caribensis MWAP71, - un milieu de culture desdites bactéries, et - une composition contenant des polysaccharides, produite par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture, lesdits polysaccharides étant de formule I suivante : f3-Kdop 10 2 3 ->3)-(3-D-Glcp-(1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1-> 2 15 (0Ac) dans laquelle : Glc représente le glucose ; 20 6dTal représente le 6-déoxy-talose ; Kdo représente l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique ; n est un nombre entier compris de 700 à 800 ; la concentration en polysaccharide dans ladite composition de moût de fermentation variant de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L ; 25 peut être obtenue comme illustré ci-après. La préparation de ladite composition de moût de fermentation peut être réalisée par voie biotechnologique en fermenteur. Le procédé comprend alors deux étapes : la production de cellules bactériennes en fioles de petit volume, cette première culture, appelée pré-culture, servant ensuite à inoculer le fermenteur proprement dit où est réalisée la production de la 30 composition. La chaîne de pré-culture comprend deux étapes, la première étant la revivification de la souche bactérienne conservée dans une cryobanque à -80°C et la deuxième une étape de prolifération cellulaire dans le but d'inoculer le fermenteur. La revivification est réalisée en fioles de 500 ml à baffles contenant 50 ml de milieu de 35 culture appelé « milieu de pré-culture » dont la composition est la suivante (tableaux 2, 3 et 4) : Glucose 10 g/1 Extrait de levure 3 g/1 Solution minérale* 70 m1/1 Struktol® SB2020 0,1 g/1 Tableau 2: Composition du milieu de pré-culture Struktol® SB2020 (Schills Seilacher, Hamburg, Germany) est un agent anti-mousse. MgSO4,7H20 4 g/1 FeSO4,7H20 0,44 g/1 Solution Oligo- éléments** 20 m1/1 Tableau 3 : *Solution minérale H3B03 2,80 g/1 MnSO4,H20 1,30 g/1 Na2Mo04,2H20 0,75 g/1 ZnSO4,7H20 0,43 g/1 CoSO4,7H20 0,070 g/1 CuSO4 0,023 g/1 Tableau 4 : * *Solution Oligo-éléments Après une incubation d'une durée de 8h à 30°C sous une agitation de 110 RPM, 7 ml de cette culture sont transférés dans des fioles de 3 litres à baffles contenant 500 ml de « milieu de pré-culture » pour l'étape de prolifération cellulaire (production de l'inoculum pour le fermenteur). Ces fioles sont incubées pendant 14h à 30°C sous une agitation de 110 RPM. A chaque transfert, un contrôle bactériologique est effectué par une observation microscopique à l'état frais et par une coloration de Gram. Le profil de croissance de la souche MWAP71 en milieu de pré-culture et en fioles de petit volume est présenté en figure 1.
Après environ 15 heures de croissance, c'est-à-dire en milieu de phase de croissance, lesdites fioles contiennent la première composition de moût de fermentation. Ladite première composition de moût de fermentation peut être utilisée pour inoculer un fermenteur de grande capacité : de 150 litres à plusieurs dizaines de mètres cubes. La production de la deuxième composition de moût de fermentation peut être effectuée 20 dans un fermenteur de 150L contenant 100L de « milieu de production » dont la composition est la suivante (tableaux 5, 6 et 7) : Glucose 23 g/1 Extrait de levure 3 g/1 Solution minérale* 70 m1/1 Struktol® SB2020 0,1 g/1 Tableau 5: Composition du milieu de pré-culture MgSO4,7H20 4 g/1 FeSO4,7H20 0,44 g/1 Solution Oligo- éléments** 20 m1/1 Tableau 6 : *Solution minérale H3B03 2,80 g/1 MnSO4,H20 1,30 g/1 Na2Mo04,2H20 0,75 g/1 ZnSO4,7H20 0,43 g/1 CoSO4,7H20 0,070 g/1 CuSO4 0,023 g/1 Tableau 7 : * *Solution Oligo-éléments Le milieu de culture sans glucose est stérilisé en place dans le fermenteur, puis une solution concentrée de glucose stérilisée à part par l'action de la chaleur est ajoutée stérilement de manière à obtenir la concentration initiale en glucose désirée (23 g/1).
L'inoculation du fermenteur est réalisée par transfert stérile du contenu de 4 à 8 fioles de pré-culture, soit un taux d'inoculation de 2 à 4% vol/vol. Les conditions de culture appliquées lors de la production en fermenteur sont les suivantes : - Température : 30°C - pH : 6,5 à 7,0 régulé par ajout de NaOH 6% - p02 > 30% Afin de maintenir une oxygénation suffisante du milieu de culture (p02>30%), l'aération du fermenteur est maintenue entre 0,5 et 1 VVM, l'agitation est comprise entre 200 et 500 RPM (soit entre 1,7 et 4,3 m/s) et une pression de couverture est maintenue entre 0,5 et 1 bar. Au cours de la production, le suivi de la production de la biomasse bactérienne est réalisé par mesure de la densité optique à 600 nm (D0600), à laquelle on retranche la densité optique du milieu initial avant inoculation : D0600 corrigée = D0600(échantillon) - D0600(milieu de culture avant inoculation) Le suivi de la production de polymère est réalisé par mesure de la viscosité du moût de 5 fermentation par un rhéomètre Rhéomat RM 100 de la société LAMY (module 1, vitesse 25,8 s-1). Enfin, le suivi de la consommation du glucose est réalisé par dosage sur un analyseur de glucose YSI 2700 SELECT de la société YSI Life Sciences. Lorsque la concentration en glucose résiduel atteint zéro, la production est terminée. 10 L'évolution du moût de fermentation au cours du temps est illustrée à la figure 2. L'augmentation de la viscosité du milieu de culture traduit l'apparition au sein du fermenteur de la composition contenant les polysaccharides produite par la souche. Lorsque le glucose est totalement consommé, la fermentation est considérée comme terminée. A l'issue de ce processus de fermentation sur un fermenteur de 150 litres, il est obtenu 15 la deuxième composition de moût de fermentation comprenant les éléments nutritifs non consommés par la souche, la biomasse bactérienne de la souche MWAP71 et les métabolites produits par la souche dont la composition contenant les polysaccharides. A l'issue de l'étape de fermentation industrielle, on obtient les résultats 20 suivants (Tableau 8) : Durée de la fermentation 33,5 h Durée de la phase de production de polysaccharides 16 5 h û max (taux de croissance de la souche) 0,3 fil dS/dt Consommation moyenne en glucose 0,7 g/l/h dP/dt Productivité moyenne en polysaccharides 60 mPa.s/h Concentration finale en polysaccharides 4,3 g/1 Concentration finale en cellules 12 g/1 Tableau 8 : Résultats de la production de la deuxième composition de moût de fermentation en fermenteur.
La composition et les caractéristiques du moût de fermentation sont les suivantes (tableau 9) : Matière sèche du moût 1,65 % MS pH 6,5-7,0 DO 600nm finale 41,4 Viscosité finale (26 s1) 1030 mPa.s Tableau 9 : Composition et caractéristiques du moût de fermentation contenant le polymère natif.
Les exemples 1 à 4 qui suivent illustrent l'invention. EXEMPLES Exemple 1 : Préparation de la composition contenant des oligosaccharides. La composition contenant des oligosaccharides est obtenue selon le procédé suivant : - hydrolyse acide et thermique de la deuxième composition de moût de fermentation pendant 5 heures à 80°C à pH 1,6 par ajout d'acide chlorhydrique ; - neutralisation à pH = 7,4 par de la soude et refroidissement à 20°C ; - centrifugation à 4080 g pendant au moins 3 minutes pour séparer la biomasse bactérienne des oligosaccharides ; - filtration du surnageant de centrifugation sur une plaque cellulosique de porosité 0,3-1,0 µm; - filtration tangentielle sur une membrane de 10 Kda de surface de 1,02 m2 avec une pression transmembranaire (PTM) de 1 bar et récupération du permeat ; - filtration tangentielle sur une membrane de 1 Kda de surface de 1,02 m2 avec une pression transmembranaire (PTM) de 1 bar et récupération du retentat ; - décoloration du retentat par passage sur une plaque de charbon actif ; - dilution du produit à environ 1% de matière sèche. La composition contenant des oligosaccharides (principe actif) est obtenue sous la forme d'une solution aqueuse présentant les caractéristiques suivantes : pH : 6,86 (mesuré par méthode potentiomètrique à température ambiante).
Matière sèche : 1,06% (la matière sèche peut être déterminée par la mesure de la perte en masse de l'échantillon en présence de sable de fontainebleau après passage à l'étuve 105°C pendant 12 heures). Taux de glucose : 5 g/1 (mesuré après hydrolyse acide totale des oligosaccharides, par HPLC ; l'hydrolyse totale peut être obtenue par ajout de TFA, de façon à obtenir une solution à 4M en TFA, puis chauffage à 100°C pendant 4 heures). Exemple 2 : Etudes in vitro Des kératinocytes humains normaux sont cultivés en monocouche pendant 5 jours (37°C et 5% CO2) en présence d'un milieu de culture comprenant 10 mg de la solution d'oligosaccharides à 1% en matière sèche (exemple 1), par ml de milieu de culture, ou du milieu de culture seul pour les conditions témoins. L'expression de la filaggrine est mise en évidence par un immunomarquage (immuno cyto chimique ICC) utilisant un anticorps monoclonal anti filaggrine (Filaggrin (AE21) Santa Cruz Biotechnology) dirigé et purifié contre de la filaggrine de cheveux humains. Cet anticorps est décrit pour des applications de détection de filaggrine d'origine humaine en immunofluorescence et immunohistochimie. Cet anticorps primaire est associé à un anticorps secondaire permettant une détection du signal en fluorescence type FITC.
L'expression de l'aquaporine-3 est mise en évidence par un immunomarquage (immuno cyto chimique ICC) utilisant un anticorps polyclonal anti AQP3 (AQP 3 (H-80) Santa Cruz Biotechnology) dirigé et purifié spécifiquement contre l'AQP3 d'origine humaine au niveau de la partie N-terminale de la protéine. Cet anticorps est décrit pour des applications de détection de l'AQP3 en immunofluorescence, western blot, immunoprécipitation et Elisa.
Cet anticorps primaire est associé à un anticorps secondaire permettant une détection du signal en fluorescence type Rhodamine. La quantification de l'intensité de marquage de la fillagrine et de l'aquaporine 3 dans des kératinocytes humains normaux induit par les oligosaccharides issus de Burkholderia caribensis est réalisée à l'aide du logiciel d'analyse d'image Histolab de la société Mi crovi sion. Les résultats obtenus sur l'expression de la filaggrine sont consignés dans le tableau 10: Témoin 10 mg/m1 solution d'oligosaccharides à 1% en matière sèche Intensité (UI) 362 3888 Ecart type 101 832 p / témoin 0,0057 Tableau 10 : Expression de la filaggrine en présence ou non de la composition contenant les oligosaccharides. La composition contenant les oligosaccharides de Burkholderia caribensis stimule de manière significative l'expression de filaggrine. Les résultats obtenus sur l'expression de l'aquaporine-3 sont consignés dans le tableau 11: Témoin 10 mg/m1 solution d'oligosaccharides à 1% en matière sèche Intensité (UI) 2077 14419 Moyenne 265 3140 p / témoin 0,017 Tableau 11 : Expression de l'aquaporine-3 en présence ou non de la composition contenant les oligosaccharides. La composition contenant les oligosaccharides de Burkholderia caribensis stimule de manière significative l'expression d' aquaporine-3. Exemple 3 : Test in vivo Deux formulations d'émulsion sont préparées, l'une constituant le placebo, l'autre selon l'invention, constituant la formulation comprenant des oligosaccharides. La composition des deux formulations est consignée dans le tableau 12 : 15 20 Emulsion CMWA 10-0 Emulsion CMWA 10-1 (placebo) (invention) Xyliance 5% 5% Caprylic capric triglycerides 12% 12% Phenonip XB 0,4% 0,4% Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 0% 1% Aqua QSP 100% QSP 100% Tableau 12: composition des deux formulations utilisées dans le test in vivo. L'étude est réalisée sur 19 volontaires sains de sexe féminin et masculin présentant une peau normale au niveau des bras. Les mesures de perte insensibles en eau (PIE) sont effectuées avec un Vapometer® (Delphin) muni d'une sonde qui mesure le gradient de vapeur d'eau se mettant en place entre la surface cutanée et l'air ambiant. Cette mesure donne une information sur la qualité de la fonction barrière de la peau. Le protocole de l'étude est décrit ci-après : - trois jours avant le début de l'étude, les volontaires n'appliquent aucune crème au niveau des bras ; - on définit deux zones sur les avants bras, une zone qui sera traitée par la formulation contenant des oligosaccharides de Burkholderia caribensis et l'autre zone qui sera traitée par la formulation ne contenant pas l'actif (placebo) ; - on mesure la PIE à l'aide du Vapometer® à Jl/TO ; - à J1, la zone de peau définie sur chaque avant-bras est soumise à un traitement spécifique par la technique de Stripping à l'aide de l'applicateur de disques adhésifs (piston D.Squame® réf. Monaderm PDSQ GOA), le stripping permet d'induire une légère diminution de l'effet de barrière naturelle des couches superficielles de l'épiderme (stratum corneum) en enlevant quelques cellules en surface, au contact de l'adhésif ; on mesure alors la PIE à l'aide du Vapometer® juste après stripping (J1/Immédiat) ; - on applique les formulations sur leurs zones spécifiques ; les formulations sont appliquées telles quelles, par la technicienne, à l'aide d'un doigtier par massage digital doux jusqu'à absorption sur une surface de peau délimitée d'environ 16 cm2, à raison de 2 mg/cm2 ; - on remesure la PIE une heure après application de chaque formulation (J1/T1h) ; - les formulations sont appliqués deux fois par jour pendant 3 jours ; - à J3, on répète l'opération. Les effets des deux formulations ont été comparés entre eux, aux temps (Ji/Tlh(Ji/Immédiat-Ji/TO)). La comparaison des données de zones traitées par chaque formulation entre elles s'effectue par un test de Student pour séries appariées ou test de rang de Wilcoxon pour séries appariées (en cas de distribution non normale des données). Les résultats sont donnés dans le tableau ci-après (tableau 13) : Jour 1 Jour 3 APTE = J1/T1h-(J1/T APTE = J3/T1h-(J3/T immédiat-J1/TO)) immédiat-J1/TO)) (g/m2.h) (g/m2.h) Crème CMWA 10-0 (placebo) 1,2 3,4 Crème CMWA 10-1 0,4 -0,1 P= 0,641 0,039 Tableau 13 : résultats du test in vivo L'effet réparateur obtenu avec le produit Emulsion CMWA 10-1 est plus important après 3 jours d'application répétée sur peau strippée par rapport à celui obtenu avec le produit Emulsion CMWA 10-0. En conséquence, les Oligosaccharides de Burkholderia caribensis permettent de réparer significativement la barrière cutanée.
Exemple 4 : Formules Exemple 4.1 : Crème hydratante pour le corps La crème de formule suivante (tableau 14) :25 Phase Ingrédient % A Xyliance (Soliance) 4 Macadamia ternifolia seed oil 6 Kendi oil 0.5 Preservative QS B Aqua qsp 100 Soligel (Soliance) 0.1 Sodium Hyaluronate 2 C Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 1 D Manuka honey 0.5 Tableau 14: formule d'une crème hydratante pour le corps est obtenue comme suit : 1. Préparer séparément A et B, sous agitation et à 70°C. 2. Ajouter doucement B sur A sous émulseur à 3000 rpm. 5 3. Refroidir. 4. A 40°C ajouter C et D sous agitation lente à 40 rpm. Exemple 4.2 : Crème de jour La crème de formule suivante (tableau 15) : Phase Ingrédient % A Xyliance (Soliance) 3.5 Minerai oil 2 Caprylic/capric triglyceride 3 Isostearyl isostearate 3 Dimethicone 2 Prunus armeniaca (Apricot) Kernel oil 2 B Glyceryl stearate citrate 1,5 Preservative Qs Aqua qsp 100 Glycerin 2 Xanthan gum 0.7 C Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 1 D Parfum qs Tableau 15 : formule d'une crème de jour est obtenue comme suit : 1. Préparer séparément A et B, sous agitation et à 70°C. 2. Ajouter doucement B sur A sous émulseur à 3000 rpm. 3. Refroidir. 4. A 40°C ajouter C et D sous agitation lente à 40 rpm. Exemple 4.3 : Gel éclat visage Le gel de formule suivante (tableau 16) : Phase Ingrédient % A Aqua qsp 100 Tourmaline (Soliance) 1 Carbomer 0.7 Hydroxyethylcellulose 0.3 Preservative Qs B Sodium Hydroxyde Qs pH 7 C Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 1 Betaphroline 2 Tableau 16 : formule d'un gel éclat visage est obtenu comme suit : 1. Peser A et chauffer sous agitation lente à 70°C dans un Bain-Marie; 2. Ajuster le pH à 7 avec B; 3. Ajouter C dans AB sous agitation lente. Exemple 4.4 : Gel hydratant relaxant Le gel de formule suivante (tableau 17) :20 Phase Ingrédient % A Porphyraline (Soliance) qsp 100 Hydroxyethylcellulose 1 B Grevilline (Soliance) 5 Betaphroline 10 Solution aqueuse à 1% (matière sèche) en oligosaccharides de Burkholderia caribensis 1 Spring sea water 10 C Polysorbate 20 1,36 Parfum qs Preservative qs D Colorant CI 17200 qs Colorant CI 42090 qs Tableau 17 : formule d'un gel hydratant relaxant est obtenu comme suit : 1. Peser A et chauffer à 70°C sous agitation dans un Bain-Marie; 2. Laisser refroidir à température ambiante; 3. A 40°C, ajouter successivement les composés de B et agiter entre chaque ajout; 4. Peser C et mélanger jusqu'à homogénéisation parfaite; 5. A 35°C, ajouter C puis D et mélanger jusqu'à parfaite homogénéisation.10
Claims (13)
- REVENDICATIONS1. Utilisation d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, comprenant : - des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, - un milieu de culture desdites bactéries, et - une composition contenant des polysaccharides, produite par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture, lesdits polysaccharides étant de formule I suivante : f3-Kdop 2 3 ->3)-(3-D-Glcp-(1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1-> 2 (0Ac) n I dans laquelle : 20 Glc représente le glucose ; 6dTal représente le 6-déoxy-talose ; Kdo représente l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique ; n est un nombre entier compris de 700 à 800 ; la concentration en polysaccharides dans ladite composition de moût de fermentation variant 25 de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L ; ladite composition de moût de fermentation étant hydrolysée, pour la préparation d'une composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa ayant des propriétés cosmétiques, notamment une utilisation dans laquelle ladite composition de moût de fermentation est 30 hydrolysée et neutralisée, notamment une utilisation dans laquelle ladite composition de moût de fermentation est hydrolysée, éventuellement neutralisée et purifiée.
- 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle lesdites bactéries sont de la souche 35 Burkholderia caribensis MWAP71 ARD, déposée auprès de la CNCM le 09 février 2012 sous le numéro I-4598. 15
- 3. Procédé de préparation d'une composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa, à partir d'une composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, ladite composition de moût de fermentation comprenant : - des bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, - un milieu de culture desdites bactéries, et - une composition contenant des polysaccharides, produit par lesdites bactéries dans ledit milieu de culture, lesdits polysaccharides étant de formule I suivante : f3-Kdop 2 3 ->3)-(3-D-Glcp-(1->4)-(3-D-Glcp-(1->4)-a-L-6dTalp-(1-> 2 (0Ac) dans laquelle : Glc représente le glucose ; 6dTal représente le 6-déoxy-talose ; Kdo représente l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique ; n est un nombre entier compris de 700 à 800 ; la concentration en polysaccharides dans ladite composition de moût de fermentation variant de 3,5 à 20 g/L, de préférence entre 5 et 15g/L ; ledit procédé comprenant une étape d'hydrolyse de ladite composition de moût de 30 fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, notamment un procédé dans lequel ladite hydrolyse est : - acide, ladite étape d'hydrolyse étant en particulier réalisée à un pH allant de 0 à 3, plus particulièrement de 1 à 2, ou - thermique, ladite étape d'hydrolyse étant en particulier réalisée à une température 35 allant de la température ambiante à 100°C, plus particulièrement à une température allant de 80 à 100°C, ou- thermique et acide, ladite étape d'hydrolyse étant en particulier réalisée à un pH allant de 0 à 3, plus particulièrement de 1 à 2, et/ou à une température allant de la température ambiante à 100°C, plus particulièrement à une température allant de 70 à 90°C, ou - enzymatique, ladite étape d'hydrolyse étant en particulier réalisée en présence d'enzymes choisies dans le groupe comprenant les protéases et les glycosidases, plus particulièrement les amylases, et/ou à une température allant de la température ambiante à 70°C.
- 4. Procédé selon la revendication 3, comprenant les étapes suivantes : - hydrolyse de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - éventuellement neutralisation dudit hydrolysat pour obtenir un hydrolysat neutralisé, et - purification dudit hydrolysat, éventuellement neutralisé, pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides, de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa, notamment un procédé comprenant les étapes suivantes: - hydrolyse acide et éventuellement thermique de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - neutralisation dudit hydrolysat pour obtenir un hydrolysat neutralisé, notamment une neutralisation à l'issue de laquelle le pH va de 6 à 8, en particulier de 7 à 8, et - purification dudit hydrolysat neutralisé pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides, de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa, notamment un procédé dans lequel ladite purification se fait par au moins une filtration, en particulier une filtration tangentielle, notamment un procédé dans lequel ladite purification comprend les étapes suivantes : - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - éventuellement filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,4m, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle dudit hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat 30 sur une membrane allant de 10 à 30 KDa, de préférence une membrane de 10 KDa, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat,- filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa, en particulier de 1 à 15 KDa.
- 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, comprenant les étapes suivantes : - hydrolyse de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - éventuellement neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - éventuellement filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,01.1m, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa, notamment un procédé comprenant les étapes suivantes : - hydrolyse de ladite composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,01.1m, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat,- filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa.
- 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, comprenant les étapes suivantes : - éventuellement revivification de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, pour obtenir des bactéries revivifiées, - culture de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, éventuellement revivifiées, dans un milieu de culture approprié à leur prolifération, pour obtenir une première composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - éventuellement inoculation d'un fermenteur par ladite première composition de moût de fermentation obtenu à l'étape précédente, et fermentation, au cours de laquelle le fermenteur est mis en conditions propices à la croissance des bactéries et à la production de polysaccharides de formule I, pour obtenir une deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - hydrolyse de ladite première ou deuxième composition de moût de fermentation de 20 Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, - éventuellement neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - éventuellement filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque 25 cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,0ûm, pour obtenir un premier perméat, - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 30 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa, notamment un procédé comprenant les étapes suivantes :- revivification de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, pour obtenir des bactéries revivifiées, - culture de bactéries appartenant à l'espèce Burkholderia caribensis, en particulier des 5 bactéries de la souche Burkholderia caribensis MWAP71, éventuellement revivifiées, dans un milieu de culture approprié à leur prolifération, pour obtenir une première composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - inoculation d'un fermenteur par ladite première composition de moût de fermentation obtenu à l'étape précédente, et fermentation, au cours de laquelle le fermenteur est mis en 10 conditions propices à la croissance des bactéries et à la production de polysaccharides de formule I, pour obtenir une deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis, - hydrolyse de ladite première ou deuxième composition de moût de fermentation de Burkholderia caribensis pour obtenir un hydrolysat, 15 - neutralisation dudit hydrolysat obtenu à l'issue de l'étape précédente pour obtenir un hydrolysat neutralisé, - centrifugation dudit hydrolysat pour obtenir un surnageant, débarrassé desdites bactéries; - filtration dudit surnageant, éventuellement neutralisé, sur une plaque cellulosique, de préférence de porosité 0,3-1,01.1m, pour obtenir un premier perméat, 20 - filtration tangentielle de l'hydrolysat, éventuellement neutralisé ou dudit premier perméat, sur une membrane allant de 10 à 30 Kda, de préférence une membrane de 10Kda, pour obtenir respectivement un premier ou un deuxième perméat, - filtration tangentielle dudit premier ou deuxième perméat sur une membrane allant de 1 à 5 Kda, de préférence une membrane de 1Kda, pour obtenir un troisième perméat comprenant le 25 milieu de culture desdites bactéries et un rétentat, et récupération dudit retentat pour obtenir ladite composition contenant des oligosaccharides de masse moléculaire allant de 1 à 30 KDa.
- 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel lesdites bactéries sont de la souche Burkholderia caribensis MWAP71 ARD, déposée auprès de la CNCM le 09 30 février 2012 sous le numéro I-4598.
- 8. Composition contenant des oligosaccharides susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6.
- 9. Composition comprenant des oligosaccharides issus de bactéries de l'espèce Burkholderia caribensis dans laquelle : - le taux de matière sèche est préférentiellement compris entre 0,1 et 10%, en particulier entre 0,5 et 2% ; - le pH est compris entre 3 et 8, en particulier entre 4 et 7 ; - le taux de glucose de ladite solution, après hydrolyse acide totale des oligosaccharides, est préférentiellement compris entre 0,1 g/1 et 15 g/1, en particulier entrel g/1 et 10g/1.
- 10. Utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides selon la revendication 8 ou 9 pour la préparation d'une composition cosmétique, notamment : - d'une composition cosmétique destinée à améliorer et/ou renforcer la fonction barrière de la peau, tel que mesurée selon un test de perte insensible en eau, ou - d'une composition cosmétique destinée à améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau, ou - d'une composition cosmétique destinée à améliorer et/ou renforcer la fonction barrière et l'hydratation de la peau.
- 11. Utilisation d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides selon la revendication 8 ou 9 pour : - améliorer et/ou renforcer la fonction barrière de la peau, et/ou - améliorer et/ou renforcer l'hydratation de la peau.
- 12. Composition cosmétique comprenant à titre de principe actif une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides selon la revendication 8 ou 9.
- 13. Méthode de traitement cosmétique comprenant l'application par voie topique d'une composition comprenant ou contenant des oligosaccharides selon la revendication 8 ou 9 dans un véhicule cosmétologiquement acceptable. 30
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| WO2019124410A1 (fr) * | 2017-12-21 | 2019-06-27 | 株式会社サティス製薬 | Matière première cosmétique et produit cosmétique pour la peau l'utilisant |
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| FR2922412A1 (fr) * | 2007-10-23 | 2009-04-24 | Agro Ind Rech S Et Dev A R D S | Nouvelles molecules pour la stimulation des defenses naturelles des plantes et leurs formulations |
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| JPWO2019124410A1 (ja) * | 2017-12-21 | 2020-05-28 | 株式会社 サティス製薬 | 化粧料用原料とこれを配合してなる皮膚用化粧料 |
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