FR2988096A1 - Production d'acide eicosapentaenoique et/ou d'acide arachidonique en mode mixotrophe par euglena - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte à de nouvelles souches de microalgues appartenant au genre Euglena permettant une production de lipides, notamment d'EPA et/ou d'ARA, en mode mixotrophe, ainsi qu'à un procédé de sélection et de culture de telles souches, utilisant un apport de lumière variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs.

Description

L'invention se rapporte à un procédé de culture en mode mixotrophe, notamment en présence d'un éclairement discontinu et/ou variable de lumière, d'une microalgue du genre Euglena, en particulier de l'espèce d'Euglena gracilis. Le procédé permet d'obtenir un haut rendement en biomasse et un enrichissement des microalgues ainsi cultivées en lipides et plus particulièrement en acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou en acide arachidonique (ARA). Le procédé permet ainsi de sélectionner des souches d'Euglena gracilis à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en lipides et plus particulièrement en acides gras polyinsaturés. L'invention se rapporte aussi à une nouvelle souche de microalgue appartenant à l'espèce Euglena gracilis, particulièrement adaptée à la production d'acides gras. Cette nouvelle souche d'Euglena gracilis est utile pour produire de l'EPA (acide éicosapentaénoïque) et de l'acide arachidonique (ARA) en mode mixotrophe.

Préambule Les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.

Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres. La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont généralement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matière organique ne leur est pas favorable et n'améliore pas leur croissance. Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à-dire en exploitant la matière organique.

D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.

Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme coexistent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang, C. et al. (2000) ; Biochemical Engineering Journal, 6 :87-102].

Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de secréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés. Parmi ces acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés de la série des oméga-3 (PUFA-w3), en particulier l'acide 20 éicosapentaénoïque (EPA ou C20:5 w3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6 w3), et de la série des oméga-6 (PUFA-w6), en particulier l'acide arachidonique (AA ou ARA ou encore acide eicosatétraènoïque C20:4 w6), ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques. 25 Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, incorporation dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité 30 de pêche intensive.

De nouvelles sources de ces acides gras tels que l'EPA et l'ARA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés. Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les microalgues offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante, et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, elles ne présentent pas d'odeur désagréable et leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol. Enfin, les lipides produits par les microalgues ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt. A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore 15 largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que ces dernières recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. (2010) ; Hydrobiologia, 639:153- 20 171]. La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Parmi les espèces des différentes classes composant ces phylums, qui produisent des acides gras, il existe des variations importantes en ce qui concerne la teneur des microalgues en acides gras polyinsaturés. 25 Par ailleurs, les proportions relatives de lipides, notamment d'EPA et d'ARA dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture. Les principales microalgues d'intérêt, productrices d'EPA et d'ARA, sont des espèces marines. Cependant, parmi les centaines de milliers d'espèces de microalgues marines, seul un faible nombre présentent une 30 teneur élevée de ces deux acides gras à la fois et une capacité suffisante à être cultivée in vitro. Les espèces d'intérêt sont principalement des Bacillariophytes (ou diatomées) issues du phytoplancton marin. Elles se caractérisent généralement par une production active d'EPA. Bien que riches en acide a-linolénique (C18:3 w3), les microalgues d'eau douce ne contiennent généralement pas d'EPA [Pencreac'h et al. 5 (2004) Les microalgues marines : source alternative d'EPA et de DHA, Lipides, 11(2) :118-222]. En revanche, la production d'ARA est assez rare pour des algues marines. De telles microalgues incluent, mais ne sont pas limitées à Euglenophytes (par exemple, Euglena), Rhodophytes (par exemple, 10 Porphyridium) et Chlorophytes (par exemple, Parietochloris). Plusieurs souches de microalgues d'eau douce sont capables de synthétiser et d'accumuler de l'acide arachidonique. Entre autres, les triglycérides de la Chlorophyte Parietochloris incisa, une algue isolée du Mont Tateyama au Japon, sont naturellement riches en acide arachidonique. 15 L'ARA est majoritairement présent sous forme de triglycérides qui constituent la classe de lipides dominante [Bigogno C. et al. (2002) ; Lipid and fatty acid composition of the green oleaginous alga Parietochloris incisa, the richest plant source of arachidonic acid, Phytochemistry, 60(5): 497-503]. Pour mettre en oeuvre la production des acides gras par des 20 microalgues à l'échelle industrielle, plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Par exemple, les cultures peuvent être réalisées en condition autotrophe, mixotrophe ou hétérotrophe selon la souche, la température, les conditions de lumière et la taille des fermenteurs. Par exemple, les cultures peuvent également être réalisées dans des conteneurs d'un litre, 25 dans un laboratoire, dans des photobioréacteurs, et dans des conteneurs de 100 000 litres ou bien dans des bassins ouverts (plusieurs hectares). Toutefois, les dépenses énergétiques et autres ressources telles que la main d'ceuvre et la facilité de poursuivre la culture doivent être prises en compte en développant des conditions de culture idéales. 30 En tout état de cause, il est souhaitable que les microalgues soient cultivées dans les conditions optimales pour augmenter le rendement de(s) l'acide(s) gras à produire. Ainsi, il est préférable d'avoir un rendement le plus élevé possible (par exemple au-delà de 30 g/I de matière sèche et plus de 15% d'acides gras par rapport à la matière sèche). La demande de brevet internationale WO 03/079810 divulgue des cultures de Parietochloris incisa pour la production d'ARA destiné à des produits alimentaires pour animaux. Ces cultures ont été réalisées dans des conditions autotrophes avec un rendement d'ARA d'au moins 10% d'ARA en poids par rapport au poids de ces cellules. Les demandes de brevet japonais JP9252764 et JP60087798 décrivent ainsi des souches de Monodus subterraneus cultivées en mode 10 autotrophe pouvant accumuler une quantité d'EPA allant jusqu'à 3,8 % de leurs poids sec. Ces souches ont été cultivées en conditions de laboratoire, c'est-à-dire dans des milieux de culture inorganiques, en flacons ou en bioréacteurs de faible capacité volumétrique avec un apport lumineux continu. 15 Dans la perspective d'une exploitation industrielle, un tel mode de culture s'avère inadapté. En effet, pour être rentable, la production de biomasse doit pouvoir être réalisée dans des photo-bioréacteurs fermés de grande dimension. Or, un tel mode de culture est difficile à réaliser en mode autotrophe, car lorsque la densité des cellules augmente 20 dans le milieu de culture, les cellules ont de plus en plus de difficulté à capter la lumière provenant de l'extérieur du réacteur. Il est alors nécessaire de brasser activement le milieu de culture, ce qui nécessite une importante dépense énergétique. Il serait souhaitable de pouvoir obtenir des rendements en EPA 25 et ARA plus importants pour une exploitation industrielle plus efficace et rentable. Euglena est un genre commun de Protistes flagellés et fait partie de la famille des Euglénoïdes qui ne possèdent pas de paroi rigide, ce qui leur donne une mobilité de forme caractéristique au cours 30 de leur déplacement, qui s'appelle le mouvement euglénoïde. Les Euglènes peuvent perdre leurs chloroplastes et donner des individus dépigmentés hétérotrophes peu différents des protozoaires flagellés. Les Euglènes possèdent un stigma, tache orangée qui remplit le rôle de photorécepteur et permet au micro-organisme de se diriger. Les flagelles sont présents en permanence chez les Euglènes. Le métabolisme des Euglènes est polyvalent. En présence de lumière, elles sont autotrophes, et en l'absence de lumière ou après la perte de leur chloroplaste, elles deviennent hétérotrophes et sont en particulier capables de métaboliser le lactate [Lechevalier, Hubert A. (1977) ; Fungi, Algae, Protozoa, and Viruses, CRC Handbook of Microbiology, 2ème édition, Vol. Il, p. 874, Floride, Laskin, Allen I.] Dans l'article scientifique "Biomass production in mixotrophic culture of Euglena gracilis under acidic condition and its growth energetics", Biotechnology Letters Vol. 23, No. 15, 1223-1228, il a été démontré que le rendement de biomasse obtenu avec Euglena gracilis cultivée en conditions mixotrophes (avec lumière continue) est de 15 à 19 % supérieur au rendement obtenu avec une culture en conditions hétérotrophes. Des niveaux élevés de chlorophylle de 39,4 mg par litre et de caroténoïdes de 13,8 mg par litre ont en outre été obtenus dans les cultures mixotrophes. Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de microalgue de l'espèce Euglena gracilis, cultivables en mode mixotrophe, permettant, dans les conditions de la présente invention, une production à haut rendement d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA et ARA.

Une souche (FCC 540) représentative des nouvelles souches d'Euglena gracilis ainsi isolées et sélectionnées, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro d'accession CCAP 1224/49. Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, avec une gamme de variations d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques. L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures ou de moindre intensité lumineuse, perçue généralement comme stressante par les microalgues, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Euglena gracilis une production élevée de biomasse, de lipides et plus particulièrement d'acides gras polyinsaturés. Cette mise en oeuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle d'acides gras polyinsaturés, en particulier d'EPA et ARA, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes de culture autotrophes. Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après. Description détaillée La présente invention a donc pour objet un procédé de culture 20 des microalgues du genre Euglena, notamment de l'espèce Euglena gracilis, en mode mixotrophe, dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps. L'éclairement présente des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 30 pmol. m-2. s-1 et 400 pmol. m-2. s', ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure. Ces conditions 25 de culture permettent d'apporter une quantité définie de lumière. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairement discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes. L'éclairement peut être notamment sous forme de flashs. Ce procédé a pour avantage d'augmenter le rendement 30 en biomasse obtenu de la culture. Il a aussi pour avantage d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou acide arachidonique (ARA). Ce procédé peut également être utilisé pour sélectionner des souches du genre Euglena, en particulier de l'espèce Euglena gracilis, à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés, notamment de l'EPA (acide éicosapentaénoïque) et/ou de l'ARA (acide arachidonique). La culture en mode mixotrophe de cette microalgue s'effectue préférentiellement en présence de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM d'un substrat carboné organique.

L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante. Ce substrat carboné organique comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange : du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol. Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention. Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en oeuvre de nouvelles souches de microalgues du genre Euglena (Phylum: Euglenoza, Ordre: Euglenales, Famille: Euglenaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 pE, dans un milieu minéral, par exemple le milieu Euglena [Andersen, R.A.; Jacobson, D.M. & Sexton, J.P. (1991) - Provasoli-Guillard Center for Culture of Marine Phytoplankton, Catalogue of Strains. 98pp. West Boothbay Harbor, Maine, USA] dans lequel est ajouté un substrat carboné organique.

De préférence, le substrat carboné organique comprend du glucose et/ou du lactate, dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM. Ces nouvelles souches d'Euglena, plus particulièrement d'Euglena gracilis, peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention décrit plus loin. Une souche représentative des souches d'Euglena gracilis selon l'invention est la souche FCC 540 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP, sous le numéro CCAP 1224/49. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives de biomasse ainsi que des lipides, et plus particulièrement de I'EPA et de l'ARA quand elles sont cultivées en mode mixotrophe avec un apport en lumière variable et/ou discontinu, selon l'invention. Selon les analyses taxonomiques en cours, la souche CCAP 1224/49 appartient à l'espèce Euglena gracilis. L'invention porte sur toute souche de l'espèce Euglena gracilis, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, telles que l'ARA et I'EPA. L'invention porte aussi sur toute espèce de microalgue du genre Euglena, capable de croître en conditions de culture mixotrophe telles que décrites dans la présente demande, et capable de produire des acides gras, tels que l'ARA et l'EPA. Les souches d'Euglena gracilis isolées selon l'invention permettent de produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives de biomasse ainsi que de lipides riches en EPA et/ou ARA, ledit EPA et/ou ARA pouvant représenter plus de 10 %, plus de 20%, plus de 30%, ou plus de 50% des lipides totaux contenus dans les microalgues. Dans la présente invention, la biomasse obtenue avec la souche FCC 540, isolée par le demandeur, d'une culture en conditions mixotrophes en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu, notamment sous forme de flashs, est de 10 à 60 %, plus généralement de 20 à 50 %, supérieure à celle d'une culture avec la même souche effectuée en mode mixotrophe classique. Par mode mixotrophe classique, on entend des conditions de culture avec un milieu de culture identique, mais avec un apport de lumière naturelle (culture en extérieur) ou un apport de lumière continu et constant. L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Euglena, notamment de l'espèce Euglena gracilis en mode mixotrophe, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps, par exemple, sous forme de flashs, notamment en vue de produire des acides gras polyinsaturés, tels que l'EPA et l'ARA. L'invention a ainsi pour objet un procédé de sélection des microalgues du genre Euglena, notamment de l'espèce Euglena gracilis à caractère mixotrophe, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés tels que l'EPA et l'ARA, en présence d'un éclairement variable et/ou discontinu au cours du temps. Il est apparu qu'un éclairement variable et/ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en oeuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu et/ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la croissance et à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer, en partie, par le fait que dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement. Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper 25 plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées. Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairement lumineux de courte durée, c'est-à-dire de 30 moins de 30 minutes. La durée du flash peut être de moins de 15 minutes, de préférence de moins de 5 minutes ou plus préférentiellement encore de moins de 1 minute. L'éclairement lumineux, ou le flash, est généralement d'une durée supérieure à 15 secondes. La durée du flash est généralement comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute. En général, le nombre de flashs est compris entre environ 2 et 200, préférentiellement entre 10 et 150, plus préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement encore entre 20 et 50 par heure. Le nombre de flashs par heure est choisi en fonction de l'intensité et la durée des flashs (voir ci-dessous). En général, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs est entre 5 et 500 pmol. m-2. s-1, de préférence entre 50 et 400 pmol. m-2. s-1, et plus préférentiellement entre 150 et 300 pmol. m-2. s-1. Par définition, 1 pmol. m-2. s1 correspond à 1pE m-2. s' (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature. Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière est régulière et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues. Selon l'invention, quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (pmol. ITI-2. S-1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement entre 5 et 400 pmol. m-2. s', de préférence entre 70 et 300 pmol. m-2. s-1, et plus préférentiellement entre 100 et 200 pmol. m-2. s'. Ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, en conditions d'éclairement variable, par exemple, les valeurs 50 pmol. m-2. s-1 et 100 pmol. m-2. s-1 plusieurs fois chaque heure, plus préférentiellement les valeurs 50 et 200 pmol. m-2. s'. Alternativement, en conditions d'éclairement discontinu, ladite intensité lumineuse peut atteindre successivement, plusieurs fois dans l'heure, par exemple, les valeurs 0 et 50 pmol. m-2. s-1, préférentiellement les valeurs 0 et 100 pmol. m-2. s-1 ou plus préférentiellement encore les valeurs 0 et 200 pmol. m-2. s-1. Selon un mode de l'invention et quelles que soient les conditions d'éclairement, l'intensité de la lumière apportée à la culture varie en fonction de la densité cellulaire. Plus la culture devient dense, plus la lumière peut être intense. La densité cellulaire est le nombre de cellules par ml et elle est mesurée selon les techniques connues de l'homme de l'art. Au stade initial de la culture quand la densité cellulaire est entre environ 105 et 5 x105 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être comprise entre 5 et 15 pmol. m-2. s-1, de préférence, entre 5 et 10 pmol. m-2. s-1. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 15 et 200 pmol. m-2. s-1, par exemple, de préférence, entre 20 et 50 pmol. m-2. s-1. Quand la culture, au stade final, atteint une densité entre 107 et 108 cellules par ml, l'intensité lumineuse peut être augmentée jusqu'à entre 50 et 400 pmol. m-2. s-1 par exemple, de préférence, entre 50 et 150 pmol. m-2. s1. Selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture dans l'heure reste entre certaines valeurs. Elle est comprise 20 entre environ 2000 et 300 000 pmol. m-2, préférentiellement entre environ 4000 et 200 000 pmol. m-2, par heure. Selon un mode de l'invention, la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 10 pmol. m-2. s-1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure 25 de 9000 pmol. m-2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 20 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 20 pmol. m-2. s-1. Ce dernier donne un apport total de lumière par heure de 12 000 pmol. m2. Selon un autre mode de l'invention, la culture est illuminée avec 45 flashs par heure, chaque 30 flash ayant une durée de 15 secondes et une intensité de 5 pmol. m-2. s', ce qui donne un apport total de lumière par heure de 3375 pmol. m-2.

Comme décrit pour l'intensité lumineuse ci-dessus, et selon un mode de l'invention, la quantité de lumière apportée à la culture par heure peut varier en fonction de la densité cellulaire. Au stade initial de la culture, quand la densité cellulaire est 105 et 5 x105 cellules par ml, l'apport total 5 de lumière dans l'heure est généralement compris entre environ 1500 et 6000 pmol. m-2, de préférence, entre 2000 et 5000 pmol. m-2. Quand la culture atteint une densité entre 106 et 107 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 6000 et 50 000 pmol. m-2, de préférence, entre 12 000 et 45 000 pmol. rr1-2, 10 par exemple. Au stade final de la culture, à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml, l'apport total de lumière dans l'heure peut être augmenté jusqu'à entre 45 000 et 200 000 pmol. m-2, par exemple, de préférence, entre 50 000 et 150 000 pmol. m-2 Selon un mode de l'invention, au stade initial de la culture 15 (à une densité cellulaire entre 105 et 5 x105 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 5 et 10 pmol. m-2. s-1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 2250 pmol. m-2 à 4500 pmol. m-2 Puis au stade intermédiaire (à une densité cellulaire entre 106 et 107 cellules 20 par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 15 et 50 pmol. m-2. s1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 13 500 à 45 000 pmol. m-2. Puis, au stade final de la culture (à une densité cellulaire entre 107 et 108 cellules par ml), la culture est illuminée avec 30 flashs par heure, 25 chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité entre 50 et 150 pmol. m-2. s-1, ce qui donne un apport total de lumière par heure de 45 000 à 135 000 pmol. m-2 L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. 30 Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.

Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue et/ou variable, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA et d'ARA. Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches du genre Euglena, en particulier de l'espèce Euglena gracilis à caractère mixotrophe, similaires à celle isolée par le demandeur et déposée à la CCAP sous le numéro CCAP 1224/49, et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés. Ce procédé de culture est caractérisé en ce qu'il comprend des étapes suivantes : a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Euglena dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 pmol. m-2. s' et 400 pmol. m-2. s-1, ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure, b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations, en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées. Par étape de récupération, on entend plus particulièrement l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations. Pour réaliser la sélection des souches, différentes souches du genre Euglena, en particulier de l'espèce Euglena gracilis, peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte, avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et/ou variable et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et/ou variable et aux substrats carbonés offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acides gras polyinsaturés plus abondants dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'EPA et/ou ARA). Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'une population hétérogène et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue et/ou variable présentant une gamme d'intensité lumineuse et une fréquence spécifiques, avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture. Le procédé de culture selon l'invention permet également de produire des lipides.

Dans ce cas, le procédé selon l'invention comporte en outre les étapes suivantes : d) une étape de récupération des lipides des microalgues, et éventuellement e) l'extraction d'acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou acide arachidonique (ARA) des lipides récupérés. Le procédé de culture selon l'invention peut s'appliquer également à toute espèce du genre Euglena, capable de croître dans les conditions mixotrophes selon l'invention, et capable de produire l'EPA et/ou l'ARA. Le procédé de culture selon l'invention permet d'optimiser 25 la production de la biomasse obtenue de la culture. Il permet également d'enrichir les microalgues ainsi cultivées en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou en acide arachidonique (ARA). L'invention a donc également pour but l'optimisation de la production 30 de biomasse, ainsi que la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Euglena à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire les lipides, en particulier l'EPA et/ou l'ARA. Les souches de l'espèce Euglena gracilis sont spécialement concernées. Les méthodes d'extraction sélective des lipides dont l'EPA et l'ARA 5 sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par [Bligh, E.G. et Dyer, W.J. (1959); A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol., 37:911-917]. L'invention porte également sur les microalgues du genre Euglena gracilis, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que 10 précédemment décrit. Ces microalgues sont enrichies en acides gras polyinsaturés. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 15 % ou 20%, souvent plus de 30 % et parfois même plus de 50 % d'EPA et/ou d'ARA par rapport au pourcentage total de lipides.

Exemple 1 Les cultures d'Euglena gracilis FCC 540 sont réalisées dans 5 des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1N). La température de culture est fixée à 22°C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon 10 la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au mini = 100 rpm et au maxi = 250 rpm et Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente. L'intensité ainsi que les cycles de lumière sont contrôlés par 15 un automate dédié et supervisés par station informatique. Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 rpm) en enceinte thermostatée (22°C) et éclairée entre 80 et 100 uE. Pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu Euglena medium [Starr, R.C. & Zeikus, J.A. (1993) - UTEX - 20 The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. J. Phycol. Suppl. 29]. Le substrat carboné organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est le glucose à des concentrations entre 100 mM et 150 mM. 25 Suivi des cultures : La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFC, Whatman, puis séchage en étuve sous vide, à 65°C et -0,8 bar, pendant 24h minimum avant pesée). Concernant la quantification des lipides totaux, 108 cellules/mL 30 ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier.

Eclairement : La culture est illuminée avec 30 flashs par heure, chaque flash ayant une durée de 30 secondes et une intensité de 80 pmol. m-2. s-1. L'apport de lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu 5 par des lampes LED réparties autour de la paroi externe du fermenteur. Une horloge déclenche ces LED pour des temps d'éclairement ou des pulses.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Procédé comprenant l'étape suivante : a) la culture en mode mixotrophe d'une ou plusieurs souches du genre Euglena dans des conditions d'éclairement discontinu et/ou variable au cours du temps, l'éclairement présentant des variations d'intensité dont l'amplitude est comprise entre 5 pmol. m-2. s' et 400 pmol. m-2. s-1, ces variations ayant lieu entre 2 et 200 fois par heure.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la microalgue est de l'espèce Euglena gracilis.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la culture s'effectue en présence d'un substrat carboné organique à une concentration de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM, le substrat carboné organique étant choisi parmi l'amidon, le lactate, le lactose, le saccharose, l'acétate, le glycérol, le glucose et les dérivés de cellulose et un mélange de ces molécules.
4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit substrat carboné organique présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de glucose.
5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'amplitude des variations d'intensité est comprise entre 30 et 400 pmol. m-2. s-1, de préférence entre 70 et 300 pmol. m-2. s-1, et plus préférentiellement entre 100 et 200 pmol. m-2. s-1.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'un flash a une durée comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
8. 8. Procédé selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisé 10 en ce que le nombre de flashs est entre 10 et 150, préférentiellement entre 15 et 100, et plus préférentiellement entre 20 et 50 fois par heure.
9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'apport total de lumière par heure en micromoles 15 des photons est entre 2000 à 200 000 pmol. m-2.
10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : b) une étape de maintien de ladite culture sur plusieurs générations 20 en présence d'un substrat carboné organique dans le milieu de culture, et éventuellement c) une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées, et éventuellement d) une étape de récupération des lipides des microalgues, et 25 éventuellement e) l'extraction d'acide éicosapentaénoïque (EPA) et/ou d'acide arachidonique (ARA) des lipides récupérés.
11. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ladite microalgue de l'espèce Euglena gracilis 30 correspond à la souche FCC 540, déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 1224/49.
12. 12. Microalgue du genre Euglena susceptible d'être obtenue par le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. 13. Microalgue du genre Euglena selon la revendication 12, caractérisée en ce que ses lipides totaux comprennent plus de 15%, de préférence plus de 30 %, de préférence plus de 40 % et plus préférentiellement plus de 50 % d'EPA et/ou d'ARA par rapport au pourcentage total de lipides.
14. 14. Microalgue caractérisée en ce qu'elle consiste en une souche isolée de l'espèce Euglena gracilis correspondant à la souche FCC 540, déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 1224/49.