FR2984719A1 - Methode d'analyse de la progression de la cicatrisation d'une plaie a des niveaux microscopiques et macroscopiques - Google Patents

Abstract

La présente invention porte sur une méthode non-invasive d'analyse de la progression de la cicatrisation d'une plaie, comprenant les étapes suivantes: - fixer un dispositif non invasif de prélèvement sur le pourtour de la plaie ; - faire une observation macroscopique de la plaie et/ou de l'exsudat et/ou - prélever l'exsudat contenu dans ledit dispositif et analyser ledit exsudat.

Description

METHODE D'ANALYSE DE LA PROGRESSION DE LA CICATRISATION D'UNE PLAIE A DES NIVEAUX MICROSCOPIQUES ET MACROSCOPIQUES. Domaine d'application : La présente invention concerne une méthode d'analyse de la 5 progression de la cicatrisation d'une plaie en temps réel grâce à un dispositif médical, non invasif et adapté, qui protège la plaie et permet d'observer macroscopiquement la progression de la cicatrisation d'une plaie ainsi que de recueillir les exsudats de la plaie afin de réaliser un suivi cellulaire, mais aussi des 10 analyses biochimiques et moléculaires des métabolites et des microorganismes contenus dans lesdits exsudats. Art Antérieur : La cicatrisation d'une plaie est un processus physiopathologique naturel, les tissus humains et animaux étant 15 capables de réparer des lésions localisées par des processus de réparation et de régénération qui leur sont propres. La rapidité et la qualité de la cicatrisation d'une plaie dépendent de l'état général de l'organisme atteint, de l'étiologie de la plaie, de l'état et de la localisation de la plaie, et de la 20 survenue ou non d'une infection, ainsi que des facteurs génétiques prédisposant ou non à des troubles de la cicatrisation. La cicatrisation naturelle d'une plaie se déroule principalement selon trois phases successives, chacune de ces phases étant caractérisée par des activités cellulaires 25 spécifiques qui font progresser le processus de réparation selon des séquences chronologiques précises : la phase inflammatoire, la phase de granulation (ou phase proliférative), et la phase de maturation, donnant l'aspect définitif de la cicatrice. La première phase, la phase inflammatoire, débute dès la 30 rupture des vaisseaux sanguins qui déclenche la formation d'un caillot (coagulation du sang) principalement composé de fibrine et de fibronectine, et qui va constituer une matrice provisoire. Cette matrice comble en partie la lésion et va permettre la migration au sein de la zone lésée des cellules inflammatoires 35 recrutées pour assurer la détersion de la plaie. Les plaquettes présentes vont également libérer des facteurs (par exemple des cytokines, des facteurs de croissance) permettant le recrutement de cellules impliquées dans le processus cicatriciel. Cette phase se caractérise par l'infiltration et l'activation sur le site de la lésion, de nombreuses cellules inflammatoires (tels les polynucléaires neutrophiles), mais aussi des cellules assurant le nettoyage de la plaie ou détersion (tels les macrophages). La seconde phase correspond au développement du tissu de granulation. On observe d'abord une colonisation de la blessure par prolifération des fibroblastes. Puis, la migration des cellules endothéliales à partir des vaisseaux sains va permettre la néovascularisation, ou angiogenèse, du tissu lésé. Dans le tissu de granulation, les fibroblastes sont activés et vont se différencier en myofibroblastes présentant des propriétés contractiles importantes, générées par les microfilaments d'actine, permettant la contraction de la plaie. Ces microfilaments sont exprimés par une protéine : l'actine oc-musculaire lisse. Ces myofibroblastes jouent donc un rôle majeur dans la formation et la maturation du tissu de granulation qui va conduire à la cicatrisation de la lésion. Il y a ensuite migration des kératinocytes et reconstruction de l'épiderme.

Cette phase est initiée par une diminution de l'état inflammatoire de la lésion s'accompagnant d'une apoptose des cellules inflammatoires. La troisième phase du processus est une étape principalement de maturation visant à reconstruire un tissu fonctionnel le plus identique possible au tissu d'origine. Le tissu de granulation précédemment formé subit donc un remodelage. Une partie de la matrice extracellulaire est digérée par des protéases (essentiellement des métallo-protéases matricielles et des élastases), et on observe une réorganisation progressive de la matrice extracellulaire. Progressivement, le collagène de type III, majoritaire dans le tissu de granulation, est remplacé par le collagène de type I, principal composant matriciel du derme. A la fin de la phase de maturation, les fibroblastes, myofibroblastes et cellules vasculaires voient leur prolifération et/ou leur activité réduites. Puis, les cellules excédentaires meurent par apoptose. Parallèlement au remodelage de la matrice extracellulaire et à l'apoptose des cellules excédentaires. La phase inflammatoire est une phase essentielle de la cicatrisation et doit être transitoire. Dans certains cas, elle peut être prolongée par la présence de certains agents infectieux comme Staphylococcus aureus ou Pseudomonas aeruginosa ou par une pathologie préexistante comme le diabète, une déficience immunitaire ou encore une insuffisance veineuse. La résolution de l'inflammation est un point critique qui conditionne l'amorçage de la réparation tissulaire. Une perturbation de cette phase va engendrer un prolongement anormal de la phase inflammatoire et aboutir à la chronicité de la lésion en retardant la réparation tissulaire. La résolution de l'inflammation est un phénomène dynamique qui implique l'apoptose des cellules inflammatoires, leur élimination et l'apparition de médiateurs anti-inflammatoires, chimiotactiques et angiogéniques. Une manière d'évaluer le bon déroulement de cette période critique, qu'est la phase de résolution, est d'analyser les exsudats provenant de la plaie (cellules, médiateurs et métabolites). En effet, la chronicité inflammatoire se traduit par un afflux plus important de cellules inflammatoires, une production excessive de nombreuses cytokines et chimiokines inflammatoires et de protéases qui dégradent la matrice cellulaire. Inversement la phase de résolution implique l'apparition d'un certain type de macrophages responsables de la phagocytose des cellules inflammatoires apoptotiques. Ces macrophages sont aussi impliqués dans la production de médiateurs favorisant la phase de granulation ainsi que la réparation tissulaire. L'analyse de l'exsudat permettra au médecin d'évaluer la phase inflammatoire et sa résolution, et permettra ainsi de choisir de traiter la plaie par un agent thérapeutique adapté de manière à favoriser une meilleure cicatrisation. Traditionnellement, les plaies sont recouvertes par un pansement pour empêcher une contamination par des agents infectieux présents dans l'environnement, mais également pour maintenir la plaie dans un milieu humide favorisant la cicatrisation. Cependant, ce système de protection ne permet pas d'analyser les exsudats et de visualiser la cicatrisation en temps réel. De plus, l'exsudat s'accumule dans le pansement et sature le milieu absorbant du pansement. Le pansement doit donc être changé régulièrement pour éviter la macération de la plaie, ce qui implique un risque de contamination de la plaie qui est exposée momentanément à l'air libre. De plus, les pansements peuvent également adhérer, même faiblement à la plaie, et induire ainsi des lésions à la plaie lors de leur retrait. Ces nouvelles agressions engendrent une poursuite de l'inflammation, qui a pour conséquence de prolonger la phase inflammatoire et donc de modifier de façon substantielle la cinétique de cicatrisation. Des chambres implantables ont été mises au point pour étudier la cicatrisation de plaies du derme sur des animaux de laboratoires tels que la souris ou le porc. Cependant, ces chambres implantables sont insérées en partie sous la peau de l'animal et sont maintenues en place par des points de suture. Cette méthode est donc invasive, c'est à dire qu'elle présente comme inconvénient majeur de nécessiter un acte chirurgical d'implantation de la chambre en partie sous la peau de l'animal et risque donc de provoquer une réaction inflammatoire chez le sujet en question, en créant des agressions tissulaires lors de son implantation. Ces agressions tissulaires auront des conséquences néfastes sur le bon déroulement de la cicatrisation de l'animal. De plus, elles ont essentiellement été mises au point pour modéliser les mécanismes de cicatrisation chez l'animal comme par exemple, une souris ou le porc. Ainsi, avec de telles chambres invasives, il est impossible de réaliser un suivi visuel, cellulaire, biochimique et moléculaire fiable des plaies notamment durant les premiers jours qui suivent l'implantation de ces chambres.

Il existe donc un réel besoin en une méthode non-invasive de prélèvement d'exsudats purs à des fins d'analyse en temps réel utilisant un dispositif non invasif et permettant de visualiser la progression de la cicatrisation sans être nécessairement obligé d'ouvrir ledit dispositif, ni de le retirer.

Invention : Un premier objet de la présente invention est une méthode non-invasive d'analyse de la progression de la cicatrisation d'une plaie qui met en oeuvre un dispositif tel que décrit dans la demande de brevet N°FR 11 62295 déposée le 22 décembre 2011.

Ledit dispositif comprend notamment: une chambre ayant une paroi latérale, une extrémité inférieure ouverte et une extrémité supérieure, une ouverture d'accès étant disposée sur l'extrémité supérieure et/ou sur la paroi latérale de ladite chambre, ledit dispositif étant destiné à être en contact avec la peau et à circonscrire la plaie lors de son utilisation par l'intermédiaire d'une interface.

Préférentiellement, ledit dispositif comprend un moyen de fermeture amovible de la chambre, destiné à être disposé en position fermée, sur l'ouverture d'accès de la chambre. Cette méthode comprend les étapes suivantes: - fixer le dispositif non invasif sur le pourtour de la plaie ; - faire une observation macroscopique de la plaie et/ou de l'exsudat ; et/ou - prélever l'exsudat contenu dans ledit dispositif et analyser ledit exsudat.

Dans la première étape de mise en oeuvre de cette méthode, le dispositif de prélèvement est positionné de manière à circonscrire la plaie, ainsi ledit dispositif est fixé sur la peau saine autour de la plaie, par exemple grâce à une interface qui est adhésive. L'interface adhésive peut consister en un adhésif qui est appliqué soit directement sur le dispositif juste avant de le positionner autour de la plaie, soit sur une jupe en matériau souple conformable, ou bien le dispositif ou la jupe peuvent être pré-enduits par un adhésif lors de leur fabrication. Dans ce cas, l'interface adhésive est avantageusement protégée par une barrière protectrice qui devra être enlevée avant de positionner le dispositif autour de la plaie. Une fois le dispositif positionné au-dessus de la plaie, il convient d'exercer une pression suffisante sur la partie supérieure du dispositif jusqu'à la prise complète de l'adhésif et 30 à la fixation totale du dispositif autour de la plaie. Lors de l'étape de positionnement, et afin d'améliorer la tenue du dispositif autour de la plaie, on peut éventuellement enduire le pourtour de l'interface du dispositif ainsi que la peau au voisinage de la plaie et à proximité du dispositif par de 35 l'adhésif. Afin de faciliter l'étape de positionnement, il est préférable de visualiser la plaie afin de placer le dispositif sur la peau saine autour de la plaie. Pour cela, on peut notamment retirer le moyen de fermeture du dispositif avant de positionner ce dernier. En effet, le dispositif de prélèvement utilisé dans la méthode selon l'invention comprend un moyen de fermeture qui permet d'accéder facilement à la plaie sans avoir à retirer le dispositif. Ledit moyen de fermeture est fixé sur la partie supérieure de la chambre du dispositif ou sur la paroi latérale de la chambre du dispositif, notamment par un pas de vis, un clip, une goupille, un moyen de sertissage et/ou un système de baïonnette. Une fois que le dispositif est fixé sur la peau autour de la plaie par son interface adhésive, le moyen de fermeture du dispositif est replacé sur la chambre dudit dispositif, par exemple en le vissant ou à l'aide d'une goupille insérée dans des orifices adaptés placés sur le moyen de fermeture et sur la chambre du dispositif.

La visualisation de la plaie permettant un bon positionnement du dispositif peut également être réalisée sans ouvrir le dispositif, en regardant à travers le moyen de fermeture dudit dispositif, notamment lorsque le moyen de fermeture est réalisé en matériau transparent et/ou est muni d'une lentille transparente, éventuellement grossissante. Cette étape de positionnement du dispositif permet de le fixer autour de la plaie de manière temporaire et non-invasive. Le dispositif doit être fixé à la peau de manière suffisante pendant toute la durée de la cicatrisation. Il est à noter de plus que le dispositif est étanche au niveau de la zone d' interaction dispositif/peau du sujet. Ainsi, l'exsudat recueilli dans la chambre ne peut pas s'échapper par les bords dudit dispositif. La deuxième étape de la méthode selon l'invention est l'observation macroscopique de la plaie et/ou de l'exsudat.

Par observation macroscopique, la demanderesse entend toute analyse réalisée de manière externe, c'est-à-dire de manière non-invasive ou encore sans intervention sur le site en question, de la plaie et/ou de l'exsudat. Selon un mode de réalisation préféré, l'observation macroscopique de la plaie et/ou de l'exsudat comprend la détermination des paramètres physico-chimiques de ladite plaie et/ou dudit exsudat. Par paramètres physico-chimiques, on entend, au sens de la présente invention, différentes caractéristiques sensorielles de la plaie et/ou de l'exsudat, telles que notamment l'aspect de la plaie (couleur, texture, profondeur, superficie, odeur) et/ou l'aspect de l'exsudat (couleur, odeur, limpidité, viscosité). L'observation macroscopique de la plaie peut ainsi consister en un suivi visuel, voire olfactif, de l'état et de la progression de la cicatrisation de la plaie. Ainsi, une observation simple de la plaie pourra être effectuée à l'aide d'un appareil photographique, d'une caméra vidéo, ou bien tout simplement grâce à l'oeil humain. Une observation grossie pourra quant à elle être réalisée à l'aide d'une loupe, d'un dermoscope ou bien dans un autre registre, via une application pour « smartphone » comme par exemple l'application MOWA (« Mobile Wound Analyser »). Enfin, une observation offrant encore de meilleures résolutions visuelles pourra être mise en oeuvre à l'aide d'une microscopie biphotonique, d'une diffusion Raman, d'une microscopie confocale, d'un IRM, d'une échographie haute fréquence, ou encore par capillaroscopie. Ce dernier type de technologies permet une observation en profondeur de la plaie, de l'ordre de quelques centaines de micromètres, ce qui est impossible à l'oeil nu. Il est à noter que des moyens de suivi étalons seront envisagés pour chaque type de technique de visualisation macroscopique utilisé. Un des modes de réalisation préféré de la présente invention réside en une prise de photographie qui peut notamment être effectuée sans ouvrir le dispositif lorsque celui-ci est réalisé en matériau transparent et/ou est muni d'une lentille transparente, éventuellement grossissante. Ce mode de réalisation est particulièrement aisé à mettre en oeuvre. Dans le cas contraire, la prise de photographie est réalisée après avoir retiré le moyen de fermeture du dispositif, ledit moyen de fermeture étant remis en position fermée sur le dispositif une fois la photographie prise. La fréquence de la prise de photographie peut notamment être d'une photographie par jour, ce qui permet de visualiser la cinétique de la progression de la cicatrisation de la plaie. Les différentes photographies sont préférentiellement prises avec les mêmes réglages afin de pouvoir comparer les photographies entre elles. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, l'appareil photographique est positionné à la même distance de la plaie et avec le même angle pour chaque photographie, en utilisant par exemple un banc de photographie.

Selon un mode de réalisation préféré, la prise de la photographie peut être suivie ou simultanée à une comparaison avec un ou des moyens de suivi macroscopiques étalons. Ainsi, avant de prendre la photographie, on peut positionner à proximité du dispositif un moyen d'étalonnage tel que notamment un objet comprenant des graduations, et/ou un nuancier de teintes bien définies. Une fois les différentes photographies prises, le moyen d'étalonnage permet notamment de comparer les photographies, même lorsque les réglages de l'appareil photographique diffèrent, et de réaliser des mesures de la plaie sur les photographies. Selon un mode de réalisation préféré, des analyses biologiques sont réalisées sur l'exsudat pour caractériser et/ou quantifier les différentes populations cellulaires contenues. Il est également possible de déterminer la présence mais aussi de quantifier les métabolites et/ou les microorganismes contenus dans ledit exsudat. Afin de réaliser ces analyses pour le suivi de la progression de la plaie grâce à la méthode selon l'invention, l'exsudat contenu dans le dispositif peut être prélevé et ledit exsudat est analysé. L'analyse peut notamment être une évaluation plus spécifique des paramètres physico-chimiques de l'exsudat prélevé par rapport aux mêmes paramètres observés sans prélèvement de l'exsudat. Ainsi on pourra déterminer avec plus de précision le volume d'exsudat produit par la plaie, mais aussi tous les paramètres ayant trait aux propriétés propres dudit exsudat (pH, 1°C, couleur, odeur, limpidité, viscosité). Ledit prélèvement de l'exsudat peut notamment être effectué au moyen d'une pipette, munie d'un moyen d'aspiration tel qu'un cône, et/ou d'une seringue, soit après ouverture du moyen de fermeture du dispositif, soit au travers d'un septum positionné sur la paroi latérale de la chambre du dispositif ou sur le moyen de fermeture du dispositif. Le prélèvement de l'exsudat au travers du septum permet de conserver la stérilité du milieu interne du dispositif vis-à-vis du milieu extérieur dudit dispositif.

Lorsque l'exsudat contenu dans le dispositif est trop visqueux pour pouvoir être facilement prélevé à la seringue, on peut avantageusement rendre l'exsudat moins visqueux en injectant dans le dispositif une solution physiologique, comme par exemple du sérum physiologique ou encore une solution diluée de chlorure de sodium. Selon un mode de réalisation préféré, on peut aspirer et réinjecter plusieurs fois la solution composée d'exsudat dilué par la solution physiologique afin de bien laver le site de la plaie et de récupérer le maximum de cellules, métabolites et/ou microorganismes afin de faciliter les analyses ultérieures. Par métabolite, la demanderesse entend tous les composés organiques susceptibles d'être retrouvés dans une plaie, tels que par exemple, des protéines (protéines inflammatoires ou anti-inflammatoires, des facteurs de croissance, des protéines de la matrice extracellulaire comme le collagène ou la fibrine), des lipides (tels que des acides gras, des leucotriènes), de acides aminés, des hormones, de l'albumine, de l'urée. Par microorganismes, la demanderesse entend tous les microorganismes susceptibles d'être retrouvés sur une plaie, 15 infectée ou non, tels que par exemple, des bactéries (telles que celles composées par le genre Staphylococcus comme par exemple, S.aureus, S.epidermidis, S.pyogenes, par le genre Enterococcus, comme par exemple E.faecalis, par le genre Pseudomonas, comme par exemple P.aeruginosa, par la famille des Entérobactéries, du type 20 E.coli, Enterobacter species, Proteus species, Serratia species, ou encore par des bactéries du type anaérobique, comme Clostrium species ou Bacteroïdes species), des levures(Candida albicans), des virus (rétrovirus, adénovirus), ou encore des parasites (ectoparasites, endoparasites, mesoparasites), 25 Par cellules, la demanderesse entend toutes les cellules susceptibles d'être retrouvées sur une plaie, telles que notamment des cellules inflammatoires (granulocytes), des fibroblastes, ou encore des kératinocytes. L'exsudat prélevé est alors transféré dans un contenant 30 adapté, tel que notamment un tube à essai ou un flacon muni d'un septum. Selon un mode de réalisation particulier, lorsque le prélèvement de l'exsudat dans le dispositif est réalisé au travers d'un septum et que l'exsudat est transféré dans un flacon muni d'un septum, l'exsudat n'est pas en contact avec l'air libre ce 35 qui empêche sa contamination par des agents pathogènes extérieurs. Si le moyen de fermeture a été retiré pour réaliser le prélèvement de l'exsudat, ledit moyen de fermeture est remis en position fermée sur le dispositif après le prélèvement.

Les analyses biologiques qui peuvent être réalisées sur l'exsudat sont multiples et variées. Ainsi, dès le premier jour de la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, on peut effectuer un suivi phénotypique et fonctionnel des populations cellulaires, telles que notamment les cellules inflammatoires ou les cellules cutanées. Ces analyses, réalisées notamment à l'aide de la cytométrie en flux, permettent de suivre les différentes étapes de la cicatrisation dont plus particulièrement la phase inflammatoire, bien que le suivi de la deuxième phase, dite phase de granulation ou d'épidermisation (appelée également phase de prolifération) puisse également être réalisé. Ces analyses permettent de vérifier que la phase de granulation commence et que la phase inflammatoire ne persiste pas dans le temps, ce qui pourrait nuire à une bonne cicatrisation. Ainsi si l'on réalise un suivi par cytométrie en flux du nombre de granulocytes présents dans l'exsudat, on verra, au tout début de la phase inflammatoire que les granulocytes sont majoritaires. Si la phase inflammatoire se déroule correctement, quelques jours après la survenue de la plaie, le nombre de granulocytes aura fortement diminué, avec parallèlement une augmentation du nombre de monocytes et de fibroblastes qui permettent la formation du tissu de granulation. Si l'on constate que les granulocytes sont encore très nombreux trois jours après la survenue de la plaie, il est possible que la plaie présente un défaut dans la phase de résolution de l'inflammation qui peut trouver sa cause dans une infection bactérienne par exemple. Si le type de bactérie est identifié par l'analyse appropriée, le médecin pourra alors prescrire un traitement antibiotique, qui sera avantageusement injecté dans le dispositif afin d'être en contact avec la plaie et d'éliminer l'infection avant que des complications n'apparaissent. Les analyses réalisées sur l'exsudat peuvent également permettre d'établir un suivi des médiateurs produits pendant la cicatrisation, tels que notamment les cytokines inflammatoires IL12, ILl-(3, IL6...) et anti-inflammatoires (TGF-(3 et IL-35 10), les médiateurs lipidiques comme les leucotriènes, les prostaglandines ou encore les facteurs de croissance (VEGF, PDGF). Ces médiateurs peuvent notamment être quantifiés par un dosage ELISA. L'analyse de métabolites, et plus particulièrement de médiateurs contenus dans l'exsudat permet également de suivre l'avancée de la cicatrisation. Ainsi, par exemple, si l'exsudat contient un taux anormalement élevé en quantité de cytokines inflammatoires, cela indique que la phase inflammatoire n'est pas terminée ce qui peut nuire à la bonne cicatrisation de la plaie.

En effet, la présence prolongée de cytokines inflammatoires dans la plaie peut provoquer la dégradation de la matrice cellulaire et induire une chronicité de la plaie. La méthode selon l'invention peut également comprendre une étape supplémentaire de lavage de la plaie, par exemple par une solution physiologique classique du type sérum physiologique, Chlorure de Sodium, eau stérile, eau savonneuse, ou encore une solution de Lacate de Ringer mais aussi éventuellement par une solution comprenant un agent antibactérien et/ou un agent thérapeutique, auquel cas, la mise en contact de ces solutions sur le site cicatriciel sera prolongée, en comparaison à la mise en contact d'une solution de lavage dite classique sur le site cicatriciel. Ainsi, si l'on souhaite nettoyer la plaie, on peut mettre au contact de la plaie une solution physiologique classique, par exemple après l'étape de positionnement du dispositif. On laisse la solution agir quelques minutes et on l'enlève du dispositif. D'une autre façon, si l'on souhaite traiter la plaie, on peut mettre au contact de la plaie une solution contenant un agent thérapeutiquement actif, par exemple tous les jours après l'étape d'observation macroscopique de la plaie et/ou de l'exsudat ou bien éventuellement après l'étape d'analyse de l'exsudat. On laisse la solution agir plusieurs minutes voire heures ou encore jours et on l'enlève ensuite du dispositif si et seulement si la solution n'a pas été totalement absorbée au niveau de la plaie.

Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la méthode comprend une étape supplémentaire dans laquelle une solution de lavage ou une solution comprenant un ou plusieurs agents thérapeutiquement actifs est mise en contact avec la plaie à l'aide dudit dispositif. Ainsi, le dispositif utilisé dans la méthode permet de tester de nouveaux actifs, notamment des actifs cicatrisants ou antimicrobiens, directement au contact de la plaie. Ainsi, il sera possible d'utiliser diverses formes galéniques d'actifs, telles que notamment des solutions d'actifs permettant une action plus localisée sur la lésion, et plusieurs concentrations d'actifs. Ceci permettra donc de tester l'efficacité de certains actifs ainsi que de tester la tolérance de la plaie par rapport à la concentration de chacun des actifs. L'avantage majeur résidant bien évidemment dans la possibilité de tester une forme galénique particulière et atypique sur le site cicatriciel, c'est-à-dire non envisageable en temps normal sans l'aide dudit dispositif de la demanderesse, telle qu'une solution liquide d'agents actifs. De manière générale, les actifs sont choisis parmi : -les antibactériens tels que la polymyxine B, les pénicillines, l'acide clavulanique, les tétracyclines, la minocycline, la chlorotétracycline, les aminoglycosides, l'amikacine, la gentamicine, la néomycine, l'argent et ses sels (sulfadiazine argentique). -les antiseptiques tels que le mercurothiolate de sodium, l'éosine, la chlorhexidine, le borate de phénylmercure, l'eau oxygénée, la liqueur de Dakin, le triclosan, le biguanide, l'hexamidine, le thymol, le lugol, la povidone iodée, le merbromine, le chlorure de benzalkonium et de benzéthonium, l'éthanol et l'isopropanol. -les antiviraux tels l'acy clovir, la famciclovir, le ritonavir. -les antifongiques tels que l'amphotéricine B, la natamycine, 25 kétoconazole, clotrimazole, éconazole, bifonazole, fenticonazole, isoconazole, sulconazole, thiabendazole, tioconazole), les triazolés, les allylamines, la terbinafine, l'amorolfine, la naftifine, la buténafine. 30 -les antidouleurs tels que le paracétamol, la codéine, le dextropropoxyphène, le tramadol, la morphine et ses dérivés, les corticoïdes et ses dérivés. - les cicatrisants : le KSOS, le sucralfate, l'allantoïne, le collagène ou l'acide hyaluronique. 35 Un autre objet de l'invention est une méthode d'analyse de la cicatrisation d'une plaie chez un animal comprenant les étapes suivantes: - créer une plaie; oxiconazole, les polyènes, le nystatin, les imidazolés (miconazole, butoconazole, sertoconazole, - fixer le dispositif de prélèvement sur le pourtour de la plaie ; - faire une observation macroscopique de la plaie et/ou de l'exsudat ; et/ou - prélever l'exsudat contenu dans ledit dispositif et analyser ledit exsudat. La présente méthode, de même que la méthode précédemment décrite supra, sont réalisées sur l'animal. Par animal, on entend, au sens de la présente invention, un animal ou l'être humain.

L'animal chez lequel on veut étudier la progression de la cicatrisation peut notamment être une souris, un porc et/ou un rat. Il peut également s'agir de l'être humain, en particulier des personnes souffrant d'un trouble métabolique ou d'une pathologie (tel que un diabète, une immunodéficience, une malnutrition, ou encore une insuffisance veineuse) qui influence le phénomène de cicatrisation. Dans le cas du murin, avant de créer la plaie, ledit animal doit être préparé pour l'opération. Ainsi, on procède tout d'abord à l'anesthésie locale ou générale de l'animal. L'anesthésie peut notamment être réalisée par injection d'une solution anesthésiante pouvant être un mélange de kétamine et de xylazine. Après anesthésie de l'animal, on attend le temps nécessaire pour que l'anesthésie fasse effet. Si besoin, l'animal est ensuite tondu sur la zone où l'on souhaite créer la plaie. Cette étape-là est une étape dont on peut s'affranchir dans le cas de l'être humain. Néanmoins, selon les cas, elle peut être adaptée, et ceci au moyen d'une anesthésie locale de la zone de création de la plaie. On procède alors à la création d'une plaie sur l'animal. La plaie peut notamment être superficielle ou profonde c'est-à-dire 30 qu'elle va jusqu'à l'hypoderme ou jusqu'au tissu musculaire. Qu'elles soient superficielles ou profondes, la littérature décrit déjà plusieurs manières de réaliser une plaie. Les plaies peuvent être de natures différentes selon les domaines d'études qui sont privilégiés. 35 Dans la méthode selon l'invention, la plaie est créée mécaniquement, chimiquement, thermiquement et/ou par rayonnement. La plaie peut être créée mécaniquement à l'aide d'outils tels que des ciseaux, un emporte-pièce ou « biopsy punch ». Dans ce cas-là, on peut tracer la délimitation de la future lésion cutanée, en utilisant par exemple un marqueur et un patron. La peau de l'animal peut alors être pincée pour être coupée au ciseau ou à l'aide d'un scalpel, en suivant la ligne délimitant la lésion cutanée ou alors la peau peut être tendue afin d'y exercer une pression à l'aide d'un emporte-pièce ou « biopsy punch ». Des plaies superficielles peuvent également être créées mécaniquement. On peut notamment faire un « stripping » en apposant un adhésif puis en le retirant de la future zone de création de la plaie. En ainsi possible de à la surface de la également possible épiderme à l'aide création de lésion répétant l'opération plusieurs fois, il est créer une lésion plus ou moins superficielle peau. D'une manière semblable, il est d'effectuer un frottement prolongé sur l' d'outils tel qu'une râpe. D'autres moyens de peuvent également être considérés tels que chimiques. Une solution caustique (soude, notamment les produits acide nitrique...) peut être déposée sur la partie de la peau à léser. La concentration de l'agent utilisé ainsi que la durée d'exposition détermineront la profondeur des plaies. Ce type de blessure s'apparente aux brûlures (source chaude et/ou froide, électrique, rayonnement...) qu'il est également possible de reproduire. Ainsi, tout comme l'emploi de produits chimiques, la profondeur et l'étendue de la brûlure dépendra essentiellement de la durée et des propriétés physico-chimiques des outils ou solutions employés. De manière plus particulière, des systèmes de dépression pourront être employés afin de produire des décollements (bulles de succion) ou phlyctènes. On peut également envisager des procédures d'écrasement de la peau, mais aussi des procédures de ligature ou de section vasculaire, afin d'obtenir des plaies ischémiques. Il sera également possible de créer une plaie avec un appareil émettant un rayonnement, tel que le LASER ou des rayons ionisants de type p ou gamma. Le dispositif de prélèvement est alors fixé sur la peau saine autour de la plaie au moyen de son interface adhésive comme décrit 35 précédemment. L'observation macroscopique de la plaie est réalisée de façon préférentielle en prenant des photographies de la plaie comme décrit précédemment. Le suivi biologique de la plaie par prélèvement de l'exsudat contenu dans le dispositif et son analyse est réalisé comme décrit précédemment. Ainsi, on peut notamment réaliser le suivi phénotypique et fonctionnel de diverses populations cellulaires, telles que notamment les granulocytes, les lymphocytes, les monocytes, les fibroblastes, et/ou réaliser le suivi de métabolites contenus dans l'exsudat tels que notamment les cytokines, les médiateurs lipidiques, les facteurs de croissance, voire également le suivi de microorganismes, tel que décrit précédemment. De plus, il peut être intéressant d'étudier l'influence de divers facteurs pathologiques ou physiologiques sur la cicatrisation de la plaie sur l'animal. Ainsi, on peut comparer la cicatrisation d'un animal présentant un état physiologique particulier par rapport à celle d'un animal sain. De plus, puisque la méthode selon l'invention met en oeuvre un dispositif non- invasif, on peut réaliser un suivi fiable des médiateurs et des métabolites produits dès la création de la plaie chez l'animal, ce qui n'était pas possible avec les dispositifs invasifs implantés sous la peau de l'art antérieur. La méthode selon l'invention peut également comprendre une étape supplémentaire de lavage de la plaie par une solution physiologique comprenant un agent antibactérien et/ou un agent thérapeutique, telle que décrite précédemment. Ainsi, si l'on souhaite nettoyer la plaie, on peut mettre au contact de la plaie une solution comprenant un agent antibactérien, par exemple après l'étape de positionnement du dispositif. On laisse la solution agir quelques minutes et on l'enlève du dispositif. Au contraire, si l'on souhaite traiter la plaie, on peut mettre au contact de la plaie une solution contenant un agent thérapeutiquement actif, par exemple plusieurs minutes voire heures ou encore jours et ce tous les jours après l'étape de prise de la photographie et/ou après l'étape d'analyse de l'exsudat. On laisse la solution agir sur le site cicatriciel et on l'enlève du dispositif si et seulement si elle n'a pas été totalement absorbée au niveau de la plaie. Cette étape supplémentaire peut notamment permettre d'étudier l'influence et l'efficacité d'un agent thérapeutiquement actif sur la cicatrisation de la plaie de l'animal. Il sera ainsi possible, par exemple, d'appliquer la méthode selon l'invention à deux groupes d'animaux, un groupe de contrôle d'animaux qui n'est pas traité par un agent thérapeutiquement actif et un groupe test d'animaux qui reçoit un traitement avec agent thérapeutiquement actif, et ce tous les jours. En comparant les photographies prises entre les deux groupes d'animaux, et/ou en comparant les analyses biologiques des exsudats, on pourra vérifier si l'agent thérapeutiquement actif améliore la cicatrisation des plaies et adapter le dosage ou la fréquence d'administration du traitement. L'invention sera mieux comprise à la lumière des figures suivantes qui ne sont qu'illustratives et ne sauraient en rien 10 limiter l'invention. La figure 1 est une vue en coupe transversale d'un dispositif permettant la mise en oeuvre de l'invention. La figure 2 est une photographie d'une souris sur laquelle on a créé une plaie dorsale. 15 La figure 3 est une photographie de la souris de la figure 2 sur laquelle on a fixé la chambre d'un dispositif de prélèvement sur la peau saine autour de la plaie par un adhésif. La figure 4 est une photographie de la souris de la figure 3 sur laquelle on a fixé le moyen de fermeture sur la chambre du 20 dispositif au moyen d'une goupille. La figure 5 représente différentes photographies d'une plaie sur une souris saine, les photographies étant prises à différents intervalles de temps à partir du jour de la création de la plaie (JO) jusqu'au 14ème jour après la création de la plaie (J14). 25 La figure 6 représente les différents résultats de l'analyse par cytométrie en flux des populations cellulaires contenues dans l'exsudat issu d'une plaie sur une souris saine, les analyses étant réalisées à différents intervalles de temps à partir du ler jour après la création de la plaie (J1) jusqu'au 7ème jour après 30 la création de la plaie (J7). La figure 7 est un graphique représentant la quantité d'une cytokine anti-inflammatoire (TGF-(3), mesuré par dosage ELISA, contenues dans les exsudats issus de plaies dorsales chez des souris saines. 35 L'invention va être décrite plus en détails à l'aide des exemples suivants qui sont donnés à titre purement illustratif et non limitatif.

Exemples: Exemple 1 : Création d'une plaie et mise en place du dispositif sur la plaie dorsale de la souris. Afin de créer une plaie sur une souris telle que photographiée sur la Figure 2, la souris est d'abord anesthésiée par injection d'un mélange de kétamine et de xylazine par voie intra-péritonéale. Ensuite, on coupe la peau de la souris avec un ciseau, sur sa partie dorsale. On va placer sur la souris le dispositif (1) de la figure 1.

Le dispositif (1) est constitué d'une chambre tubulaire (2) comprenant une paroi latérale (3), et deux extrémités, inférieure (4) et supérieure (5), ouvertes. Ladite extrémité inférieure (4) de la chambre tubulaire (2) présente une collerette (6) externe en matériau souple. L'interface (7) du dispositif (1) est constituée d'une couche mince de colle chirurgicale, appliquée sur la surface inférieure de la collerette (6) de la chambre tubulaire (2). Un moyen de fermeture (8) du dispositif (1) est fixé à la partie supérieure de la chambre tubulaire (2) au moyen d'une goupille (9) .

On retire le moyen de fermeture du dispositif en le dégoupillant. On enlève la goupille (9) afin de retirer le moyen de fermeture (8) du dispositif (1). On enduit la surface inférieure de la collerette (6) de la chambre tubulaire (2) d'une couche mince de colle chirurgicale afin de constituer l'interface (7) du dispositif. Le dispositif (1) est positionné au-dessus de la plaie de manière à la circonscrire. On exerce une pression suffisante sur la partie supérieure du dispositif (1) jusqu'à la prise complète de l'adhésif sur la peau de la souris selon la figure 2. On enduit la surface extérieure et le pourtour de la collerette (6) du dispositif (1) ainsi que la peau à proximité du dispositif de colle chirurgicale jusqu'à prise complète de l'adhésif tel que photographié sur la figure 3. On replace le moyen de fermeture (8) sur le dispositif en insérant une goupille (9) et en l'insérant dans des orifices placés sur la chambre (2) du dispositif (1) et sur le moyen de fermeture (8) afin de maintenir ces deux éléments ensemble. Le dispositif (1) est alors fixé sur le dos de la souris tel que photographié sur la figure 3.

Exemple 2 : Suivi photographique de l'avancée de la cicatrisation d'une plaie dorsale chez la souris. On réalise l'analyse de la progression de la cicatrisation d'une plaie chez une souris saine sur laquelle on a créé une plaie selon l'exemple 1 et positionné un dispositif (1) toujours selon l'exemple 1. La souris est anesthésiée avec un gaz et disposée sur un banc de photographie comprenant des graduations régulières afin de réaliser un étalonnage. On enlève la goupille (9) afin de retirer le moyen de fermeture (8) du dispositif (1). On prend la photographie avec un appareil photographique classique, que l'on peut trouver dans le commerce. On replace le moyen de fermeture (8) sur le dispositif en chauffant une goupille (9) et en l'insérant dans des orifices placés sur la chambre (2) du dispositif (1) et sur le moyen de fermeture (8) afin de maintenir ces deux éléments ensemble. Une photographie par jour est prise, et ce dès le jour de la création de la plaie et pendant 14 jours. Les différentes photographies prises sont présentées sur la figure 4. Comme on l'observe sur les photographies, de JO à J5, correspondant à la phase inflammatoire et au démarrage de la phase proliférative, la taille de la plaie ne varie pas mais l'on assiste à la formation d'un tissu de granulation recouvrant progressivement le fascia musculaire mis à nu lors de l'excision du tissu cutané. De J5 à J14 la taille de la plaie diminue grâce au développement du tissu de granulation contenant les myofibroblastes permettant la contraction de la plaie. A J14, la plaie est quasiment refermée. Exemple 3 : Suivi cellulaire de l'avancée de la cicatrisation d'une plaie dorsale chez une souris saine. On réalise l'analyse de la progression de la cicatrisation d'une plaie sur une souris saine sur laquelle on a créé une plaie selon l'exemple 1 et positionné un dispositif de prélèvement toujours selon l'exemple 1. Avant de prélever l'exsudat, la souris est anesthésiée avec un gaz. Une solution physiologique est injectée à la seringue au travers d'un septum placé sur le moyen de fermeture du dispositif. On aspire et on réinjecte à la seringue trois fois l'exsudat dilué par la solution physiologique afin de bien laver le site de la plaie et de récupérer le maximum de cellules pour l'analyse.

L'exsudat dilué est prélevé à la pipette et est transféré dans un flacon muni d'un septum. Afin de déterminer la cinétique d'infiltration des granulocytes, caractérisés par l'expression des antigènes Ly6G et 5 7/4 à leur surface, les cellules sont incubées durant 15 minutes avec des anticorps anti-souris Ly6g et 7/4 chacun couplés à des fluorochromes. Enfin les cellules de l'exsudat sont de nouveau lavées. Les populations cellulaires de l'exsudat sont analysées par cytométrie en flux. Les données sont acquises par un cytomètre 10 FACScalibur (BD Biosciences) en utilisant le logiciel CellQuest Pro. Le prélèvement de l'exsudat et son analyse par cytométrie en flux sont réalisés 24 heures après la création de la plaie et répétés chaque jour pendant une semaine. Les résultats, présentant 15 les différentes intensités de fluorescence pour chaque anticorps, sont regroupés sur la figure 6. A J1 post-lésion, on observe un exsudat composé essentiellement de granulocytes, représentés par un fort marquage Ly6G et 7/4. Dès J2 post-lésion, on observe une diminution progressive du marquage Ly6G jusqu'à sa disparition 20 totale, tandis que le marquage 7/4 est conservé. Cette analyse des populations cellulaires composant l'exsudat permet de suivre la progression de la phase inflammatoire, caractérisée par l'infiltration des granulocytes, puis par leur disparition lors du démarrage de la phase proliférative.

25 Exemple 4 : Comparaison du nombre de cytokines anti- inflammatoires contenues dans l'exsudat issu d'une plaie dorsale d'une souris saine On réalise le suivi de l'avancée de la cicatrisation d'une plaie sur un groupe de 2 souris saines. Sur chacune des deux 30 souris, on créé une plaie selon l'exemple 1 et on positionne un dispositif de prélèvement toujours selon l'exemple 1. Avant de prélever l'exsudat, chaque souris est anesthésiée avec un gaz. Une solution physiologique de volume connu est injectée à la seringue au travers d'un septum placé sur la chambre du dispositif. On 35 aspire et on réinjecte à la seringue trois fois l'exsudat dilué par la solution physiologique afin de bien laver le site de la plaie, d'homogénéiser l'exsudat. L'exsudat dilué est prélevé à la seringue et est transféré dans un flacon muni d'un septum puis centrifugée afin de ne récupérer que le surnageant contenant les cytokines. Les cytokines inflammatoires et anti-inflammatoires contenues dans l'exsudat sont analysées par dosage ELISA et sont réalisés 48 heures après la création de la plaie et répétés chaque 5 jour pendant une semaine. Le dosage de la cytokine TGF-p est représenté sur la figure 6. On observe une forte progression du taux de cytokines anti-inflammatoires du type TGF-p dès J2 post-lésion. Cette surproduction de cette cytokine anti-inflammatoire atteint son maximum à J5 post lésion, date de la fin de la phase 10 inflammatoire, avant de revenir à un stade normal, à la fin du processus de cicatrisation.

Claims (8)

1. REVENDICATIONS1. Méthode non-invasive d'analyse de la progression de la cicatrisation d'une plaie, comprenant les étapes suivantes: - fixer un dispositif non invasif de prélèvement sur le pourtour de la plaie ; - faire une observation macroscopique de la plaie et/ou de l'exsudat et/ou - prélever l'exsudat contenu dans ledit dispositif et analyser ledit exsudat.
2. 2. Méthode d'analyse de la progression d'une plaie chez un animal comprenant les étapes suivantes: - créer une plaie; - fixer un dispositif non invasif de prélèvement sur le pourtour de la plaie ; - faire une observation macroscopique de la plaie et/ou de l'exsudat et/ou - prélever l'exsudat contenu dans ledit dispositif et analyser ledit exsudat.
3. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce 20 que ledit dispositif de prélèvement est fixé à la peau autour de la plaie au moyen d'une interface.
4. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, caractérisée en ce que la plaie est créée mécaniquement, chimiquement, thermiquement et/ou par rayonnement. 25
5. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'observation macroscopique de la plaie et/ou de l'exsudat comprend la détermination des paramètres physico-chimiques de ladite plaie ou dudit exsudat.
6. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, 30 caractérisée en ce que l'observation macroscopique est suivie ou simultanée à une comparaison avec un ou des moyens de suivi macroscopiques étalons.
7. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'exsudat est prélevé au travers d'un 35 septum positionné sur le dispositif de prélèvement.
8. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'analyse de l'exsudat permet de déterminer les métabolites, les composants cellulaires, et/ou les microorganismes contenus dans ledit exsudat et comprend la détermination des paramètres physico-chimiques dudit exsudat.