FR2978774A1 - Methodes de detection des contaminants des circuits de production de polymeres de glucose - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet un procédé de détection des contaminants des polymères de glucose, contaminants susceptibles d'agir en synergie les uns avec les autres pour déclencher une réaction inflammatoire, caractérisé en ce qu'il comprend un test de réponse inflammatoire in vitro à l'aide de lignées cellulaires modifiées.

Description

METHODES DE DETECTION DES CONTAMINANTS DES CIRCUITS DE PRODUCTION DE POLYMERES DE GLUCOSE

La présente est invention est relative à des méthodes de détection des contaminants des circuits de production de polymères de glucose, plus particulièrement ceux destinés à la dialyse péritonéale. Par extension, ce procédé permet également la détection des contaminants des circuits de production de polymères de glucose destinés à la nutrition entérale et parentérale, voire à la nutrition des nouveaux nés.

L'invention a également pour objet les moyens d'identification des contaminants pro-inflammatoires.

Arrière-plan technologique de l'invention La société Demanderesse a choisi de développer son invention dans un domaine connu pour la dangerosité des contaminants susceptibles d'être amenés par les polymères de glucose, contaminants à l'origine de réactions inflammatoires très néfastes pour la santé humaine : celui de la dialyse péritonéale. La dialyse péritonéale est un type de dialyse qui a pour objectif d'éliminer les déchets tels que l'urée, la créatinine, l'excès de potassium ou l'excédent d'eau que les reins ne parviennent pas ou plus à épurer du plasma sanguin. Ce traitement médical est indiqué en cas d'insuffisance rénale chronique terminale. C'est une épuration intracorporelle qui utilise le péritoine comme membrane de dialyse. Les déchets toxiques du sang traversent la membrane semi-perméable du péritoine, vers une solution appelée dialysat. Le dialysat est introduit dans la cavité péritonéale par un cathéter permanent. II existe deux types de dialyse péritonéale : - La DPCA (dialyse péritonéale continue ambulatoire), traitement qui se base sur le passage de 4 poches de dialysat par jour selon prescription médicale - La DPA (dialyse péritonéale automatisée), traitement nocturne continu qui correspond à environ 15 litres de dialysat par 8 heures selon prescription médicale.

Les dialysats les plus couramment utilisés sont composés d'une solution tampon (du lactate ou du bicarbonate) à pH acide (5,2 - 5,5) ou physiologique (7,4) à laquelle sont ajoutés des électrolytes (sodium, calcium, magnésium, chlore) et un agent osmotique (du glucose ou un polymère de glucose, tel que l'« icodextrine » présent dans la solution pour dialyse péritonéale ambulatoire EXTRANEAL commercialisée par la société BAXTER).

Le polymère de glucose, tel l'icodextrine mentionné ci-avant, est préféré au glucose comme agent osmotique, car en raison de sa petite taille, le glucose qui traverse rapidement le péritoine mène à la perte de gradient osmotique dans les 2 à 4 heures d'infusion. Les polymères de glucose standard sont produits par hydrolyse acide ou enzymatique d'amidon de céréales ou de tubercules. L'hydrolyse acide de l'amidon, totalement aléatoire, ou son hydrolyse enzymatique un peu plus ordonnée, fournissent des mélanges de glucose (monomère) et des chaînes de glucose qui comportent des molécules très courtes (oligomères), de faible Degré de Polymérisation (ou D.P.), aussi bien que des molécules très longues (polymères), de D.P. élevé.

Les polymères de glucose ont par ailleurs un poids moléculaire extrêmement varié. Dans le domaine plus particulier de l'utilisation des polymères du glucose destinés à la dialyse péritonéale continue et ambulatoire, il est très vite apparu que ces hydrolysats d'amidon (mélange de glucose, d'oligomères et de polymères de glucose) ne pouvaient pas être utilisés tels quels.

La demande de brevet européen EP 207.676 enseigne qu'il est préféré des polymères de glucose formant des solutions limpides et incolores à 10 % dans l'eau, ayant un poids moléculaire moyen en poids (Mw) de 5.000 à 100.000 daltons et un poids moléculaire moyen en nombre (Mn) inférieur à 8.000 daltons. De tels polymères de glucose comprennent aussi de façon préférée au moins 80 % de polymères du glucose dont le poids moléculaire est compris entre 5.000 et 50.000 daltons, peu ou pas de glucose ou de polymères du glucose de DP inférieur ou égal à 3 (poids moléculaire 504) et peu ou pas de polymères de glucose de poids moléculaire supérieur à 100.000 (DP voisin de 600). En d'autres termes, les polymères de glucose préférés sont des polymères de glucose de faible indice de polymolécularité (valeur obtenue en calculant le rapport Mw/Mn). Les procédés proposés dans cette demande de brevet EP 207.676 pour obtenir ces polymères de glucose de faible indice de polymolécularité à partir d'hydrolysats d'amidon consistent : - soit à effectuer une précipitation fractionnée d'une maltodextrine à l'aide d'un solvant miscible à l'eau, - soit à effectuer une filtration moléculaire de cette même maltodextrine au travers de différentes membranes possédant un seuil de coupure ou d'exclusion adéquat. Dans les deux cas, ces procédés visent à éliminer à la fois les polymères de très haut poids moléculaire et les monomères ou oligomères de faible poids moléculaire.

Ces procédés ne donnent toutefois pas satisfaction tant du point de vue de leur mise en oeuvre que du point de vue des rendements et de la qualité des produits qu'ils permettent d'obtenir. Soucieuse de mettre au point un procédé de fabrication d'un polymère de glucose complètement soluble dans l'eau et de faible indice de polymolécularité préférentiellement inférieur à 2,5, ayant de préférence un Mn inférieur à 8.000 daltons et possédant un Mw compris entre 12.000 et 20.000 daltons, procédé qui soit dépourvu des inconvénients de l'art antérieur, la société Demanderesse, s'est attachée à résoudre ce problème dans son brevet EP 667.356, en partant d'un amidon hydrolysé, plutôt que d'une maltodextrine.

Le polymère de glucose obtenu par fractionnement chromatographique contient alors de préférence moins de 3 % de glucose et de polymères de glucose de DP inférieur ou égal à 3 et moins de 0,5 % de polymères de glucose de DP supérieur à 600. II est finalement désormais admis par les experts du domaine de la dialyse péritonéale que ces polymères de glucose, utilisés pour leur pouvoir osmotique, donnent toute satisfaction. II est cependant à déplorer des risques de contamination microbienne de ces préparations destinées à la dialyse péritonéale. II est en effet connu que les circuits de production des polymères de glucose peuvent être contaminés par des microorganismes, ou par des substances pro-inflammatoires contenus dans lesdits microorganismes. II est par exemple décrit en amidonnerie la contamination des amidons de maïs ou de blé par des microorganismes de type levures, moisissures et bactéries, et plus particulièrement par des bactéries acidothermophiles de type Alicyclobacillus acidocaldarius (bactéries extrémophiles qui se développent dans les zones chaudes et acides du circuit).

Le risque majeur pour le patient qui reçoit ces produits contaminés est alors la péritonite. Le soupçon clinique de la péritonite est diagnostiqué lors du développement d'un trouble dans le dialysat associé avec les manifestations cliniques variables que sont la douleur abdominale, la nausée, le vomissement, la diarrhée et la fièvre.

Ces épisodes de péritonite sont provoqués par des infections bactériennes intrapéritonéales, et le diagnostic est habituellement facilement établi par les cultures positives de dialysat. La « péritonite stérile », également décrite en tant que péritonite aseptique, chimique, ou culture-négative, est quant à elle typiquement provoquée par un irritant chimique ou un corps étranger.

Depuis l'introduction de l'icodextrine pour la préparation de solutions de dialyse péritonéale, des cas isolés de péritonite aseptique ont été rapportés, pouvant être liés à des causes diverses et notamment l'induction par des substances pro-inflammatoires potentiellement présentes.

Les épisodes inflammatoires aseptiques sont donc des complications majeures observées après injections de solutions de dialyse. Si une partie de ces épisodes inflammatoires est liée à un problème d'ordre chimique (injection accidentelle de contaminants chimiques ou mauvais dosages de certains composés), la majorité des cas est directement associée à la présence de contaminants d'origine microbienne présents dans les solutions servant à la préparation des solutions de dialyse. Les lipopolysaccharides (LPS) et les peptidoglycanes (PGN) sont les principaux contaminants d'origine microbienne présentant un risque élevé de déclencher une inflammation lorsqu'ils sont présents à l'état de trace. Les tests standards préconisés par la Pharmacopée permettent théoriquement d'écarter les lots chargés en contaminants de ce type et présentant donc un risque sanitaire. Toutefois, ces tests ne sont pas satisfaisants, puisque des épisodes inflammatoires aseptiques sont encore reportés, alors que les solutions avaient été déclarées saines. Ainsi, malgré l'attention constante des acteurs du domaine pour diminuer le risque de contaminations, notamment en améliorant sa détection, il reste toujours un besoin d'améliorer les performances de la détection de contaminants pouvant induire une inflammation.

Description détaillée de l'invention II est du mérite de la société Demanderesse d'avoir pris en compte la présence de molécules susceptibles d'exacerber la réponse inflammatoire induite par d'autres contaminants, en particulier le LPS ou les PGN, notamment par un mécanisme de coopération entre les TLRs et les récepteurs NOD. En effet, la seule considération de l'effet des contaminants isolés sur l'inflammation est réductrice. Contrairement au LPS qui est un ligand reconnu par les récepteurs de type TLR4 (acronyme anglo-saxon de Toi/ Like Receptor) des lymphocytes, le PGN (mais également de nombreux glycolipides et lipopeptides) est un ligand reconnu par les récepteurs de type TLR2 qui induit une réponse inflammatoire faible dans les modèles in vitro et in vivo, ce qui implique que ces molécules doivent être présentes à des concentrations plus importantes pour être détectées.

Ainsi, dans des modèles utilisant des cellules mononucléaires (PBMC, monocytes/macrophages primaires ou lignées monocytaires), le LPS induit une réponse significative pour des concentrations de l'ordre du ng/mL, alors que des concentrations 100 fois plus élevées en PGN sont nécessaires pour obtenir une réponse similaire (ratio p/p).

En outre, alors que les PGN solubles (MM 125 kDa) induisent une réponse inflammatoire via l'activation de TLR2, les dérivés de petite taille, unités monomériques et muramyl-dipeptide (MDP), interagissent avec des récepteurs intracellulaires de type NOD. Ces dérivés, considérés isolément, sont peu inflammatoires in vitro et donnent une réponse significative pour des valeurs» 1 µg/mL.

Par contre, la présence de ces molécules a un effet synergique sur la réponse inflammatoire, par un mécanisme de coopération entre les TLRs et les récepteurs NOD, et ce quelque soit le modèle expérimental utilisé (souris, lignées de monocytes/macrophages, cellules mononucléaires du sang). En plus du MDP et des molécules apparentées, les peptides microbiens de type f-MLP (tripeptide formyl-Met-Leu-Phe) ont également une activité synergique importante. A l'origine, ces peptides ont été identifiés pour leur activité chimio-attractante sur les leucocytes, alors qu'ils sont incapables d'induire une réponse cytokinique perse. Cependant, lorsqu'ils sont associés à des agonistes des TLRs, ils contribuent à augmenter la production de cytokines en sensibilisant les cellules cibles.

II est donc important de ne pas négliger ces "petites molécules", car elles peuvent rendre compte indirectement des épisodes inflammatoires aseptiques en exacerbant les effets de traces de PGN et/ou de LPS. Ces dernières années, de nombreux tests utilisant des cellules primaires se sont développés pour remplacer les modèles animaux dans les tests de réponse inflammatoire.

Toutefois, ces modèles in vitro sont sujets à une importante variabilité inter- individuelle, ce qui peut être responsable de biais expérimentaux. A l'inverse, les lignées cellulaires monocytaires donnent des réponses constantes, ce qui explique pourquoi les tests actuellement en développement utilisent de plus en plus ce type de cellules en culture.

II est également important de noter que la réponse inflammatoire exacerbée est visible pour les cytokines de la phase aiguë de l'inflammation, telles que TNP-Cc, l'IL-113 et les chimiokines telles que CCLS/RANTES, mais pas ou peu pour l'IL-6. Ainsi, les méthodes basées sur la production de cette dernière ne sont adaptées pour détecter des contaminants en mélange dans une solution.

Ainsi, la société Demanderesse a abouti aux conclusions suivantes: (i) il est difficile de détecter des contaminants bactériens présents à l'état de traces dans des solutions biologiques, (ii) il est important de ne pas se limiter à la détection des PGN et du LPS, en raison des effets synergiques, et (iii) il est nécessaire de développer de nouvelles méthodes de détection sensibles et reproductibles. II est donc du mérite de la société Demanderesse d'avoir développé des méthodes sensibles et efficaces de détection des contaminants microbiens ayant une action pro- inflammatoire, en deçà du seuil de sensibilité des procédures actuellement utilisées et/ou décrites dans la littérature, et ultérieurement d'identifier la famille, voire la nature, des molécules pro-inflammatoires présentes sous formes de traces dans les lots provenant des circuits de production. En effet, une méthode très sensible de mesure des réponses inflammatoires in vitro permettra de retenir ou non des lots sur la base de taux de contamination "non significatifs", au sens où ces taux seront inférieurs aux niveaux actuellement mesurables par les tests de la Pharmacopée. Ces lots pourront être proposés pour entrer dans la composition de solutions à usage thérapeutique chez l'Homme (e.g. solutions de dialyse péritonéale).

De plus, l'identification des molécules responsables des réponses inflammatoires devra permettre de détecter les sources de contaminations au cours des procédés de fabrication, et d'apporter des modifications correctrices pour diminuer les niveaux de contaminants, voire les éliminer.

Le procédé conforme à l'invention porte donc sur un procédé de détection des contaminants pro-inflammatoires des polymères de glucose, en particulier ceux destinés à la préparation de solution pour dialyse péritonéale, comprenant un test de réponse inflammatoire in vitro. Les polymères de glucose peuvent être destinés à la dialyse péritonéale, la nutrition entérale et parentérale et l'alimentation des nouveaux nés. Comme mentionné précédemment, certaines molécules d'origine bactérienne, tels que le MDP et le f-MLP, sont de faibles inducteurs inflammatoires, mais ils peuvent agir en combinaison ou en synergie et augmenter la réponse induite par d'autres contaminants. Cette propriété repose sur le fait que ces molécules agissent via l'entremise de récepteurs autres que les TLRs.

Hormis le LPS qui réagit avec TLR4, la majorité des molécules à potentiel inflammatoire susceptibles d'être présents dans les lots sont des agonistes de TLR2. Ces contaminants sont difficilement détectables, car ils sont présents en faibles concentrations et la réponse inflammatoire qu'ils vont déclencher est le plus souvent proche du bruit de fond. Par conséquent, la présence de molécules à activité synergique peut exacerber la réponse inflammatoire induite par les ligands des TLR2, ce qui peut être mis à profit pour détecter de faibles doses de contaminants. Des échantillons contaminés en MDP (agoniste de NOD2), f-MLP (ligand d'un récepteur à peptide microbien), voire en LPS (pour déclencher une synergie TLR4/TLR2) vont de ce fait déclencher une réponse inflammatoire in vitro. Ainsi, les contaminants pro-inflammatoires détectés par le procédé de l'invention sont susceptibles de déclencher, séparément ou en combinaison, une réaction inflammatoire. De manière particulière, ces contaminants peuvent être, lorsqu'ils sont considérés séparément, de faibles inducteurs inflammatoires mais induire une réaction inflammatoire importante lorsqu'ils sont en combinaison. Le procédé selon l'invention permet de considérer l'effet de l'ensemble des contaminants présents dans la préparation de polymères de glucose considérée et pas uniquement l'effet particulier de chacun d'eux. Le procédé selon l'invention comprend au moins un test de réponse inflammatoire in vitro à l'aide d'une lignée cellulaire permettant de détecter au moins un facteur de la réponse inflammatoire. Selon un premier mode de réalisation, la lignée cellulaire utilisée dans le test de réponse inflammatoire est un macrophage ou une lignée cellulaire différenciée en macrophage. De manière particulier, la lignée cellulaire est productrice de TNF-a, de la chimiokine CCL5/RANTES et/ou de CXCL8/IL-8. De préférence, le test est réalisé avec des cellules THP-1 différenciées en macrophages. Le test de réponse inflammatoire in vitro peut être basé sur la production de TNF-OE, de la chimiokine CCL5/RANTES et/ou de CXCL8/IL-8 dans les cellules THP-1 différenciées en macrophages, étant donné que l'effet synergique (effet obtenu par la combinaison des différents contaminants) est surtout marqué pour les cytokines de la phase aiguë de l'inflammation (TNP-Cc, IL-113, chimiokines telles que CCL5/RANTES), mais pas pour des cytokines de la phase retardée, telles que l'IL-6. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le test de réponse inflammatoire consiste à mettre les cellules de la lignée cellulaire, de préférence des macrophages, en présence d'une préparation de polymères de glucose susceptibles de contenir des contaminants pro-inflammatoires et à mesurer la production de cytokines de la phase aigue de l'inflammation, notamment TNF-a, IL-113, IL-8 et/ou des chimiokines, notamment la CCL5/RANTES, la production de ces cytokines indiquant que la préparation contient des contaminants susceptibles de déclencher une réaction inflammatoire. Dans un mode de réalisation tout particulièrement préféré, le test comprend la mesure de la production de TNF-a et/ou de CCL5/RANTES, de préférence de CCL5/RANTES. Afin d'augmenter la réponse cellulaire induite par des contaminants pro-inflammatoires, par exemple des LPS et/ou des PGN, un composant permettant d'agir en synergie avec les contaminants peut être ajouté l'échantillon à tester. En effet, cela peut permettre de détecter de plus faible doses de contaminants. De préférence, ce composant peut être le MDP et des molécules apparentées, des peptides microbiens de type f-MLP et/ou le LPS. De manière encore plus préféré, ce composant est le MDP et/ou le LPS. Dans un mode de réalisation préféré, le MDP est ajouté à l'échantillon à une concentration de plus de 1 pg/mL, de préférence d'au moins 2, 5, 7,5 ou 10 pg/mL, par exemple à une concentration comprise entre 10 et 100 pg/mL. Dans un mode de réalisation tout particulièrement préféré, le MDP est ajouté à l'échantillon à une concentration de 10 pg/mL. Dans un autre mode de réalisation préféré, le f-MLP est ajouté à l'échantillon à une concentration de plus de 10 nM, de préférence d'au moins 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nM. Dans encore un autre mode de réalisation préféré, le LPS peut être ajouté à l'échantillon à une concentration d'au moins 10 pg/ml, par exemple à une concentration de 25 pg/mL. Dans un mode de réalisation préféré, la préparation de polymères de glucose testée présente une concentration de polymères de glucose de 5 à 50 mg/mL, de préférence entre 5 et 10, 20, 30 ou 40 mg/mL. Dans un mode de réalisation particulier, la préparation de polymères de glucose testée présente une concentration de polymères de glucose d'environ 5 mg/mL.

Selon un second mode de réalisation, la lignée cellulaire utilisée pour réaliser le test d'inflammation in vitro, est une lignée permettant de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée. De manière particulière, cette lignée cellulaire peut être obtenue par transfection stable avec un ou plusieurs vecteurs codant pour un ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée. L'activité d'un récepteur de l'immunité innée peut être détectée, par exemple, en utilisant un gène rapporteur qui est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée audit récepteur. De manière préférée, ce gène rapporteur code pour une protéine colorée ou fluorescente ou pour une protéine dont l'activité peut être mesurée avec ou sans substrat. De manière particulière, le gène rapporteur code pour une phosphatase alcaline. De manière préférée, la lignée cellulaire permet de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs TLR ou NOD, tels que le récepteur TLR2, 3, 4, 5, 7, 8 ou 9 ou NOD2. De préférence, la lignée cellulaire permet de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs choisis parmi TLR2, TLR4 et NOD2. Les lignées cellulaires utilisées peuvent être par exemple des lignées HEK-BIueTM (commercialisée par la société InvivoGen), modifiées par transfection stable avec des vecteurs codant pour des récepteurs de l'immunité innée. Ces cellules peuvent être également co-transfectées avec un gène rapporteur produisant, par exemple, une forme sécrétée de la phosphatase alcaline (acronyme anglo-saxon SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase), dont la synthèse est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée au(x) récepteur(s) exprimé(s) dans la même lignée cellulaire. Les lignées cellulaires peuvent, par exemple, être choisies dans le groupe constitué de la lignée HEK-BIueTM hTLR2 (lignée qui répond spécifiquement aux agonistes du TLR2), la lignée HEK-BIueTM hNOD2 (lignée qui répond efficacement au MDP et molécules apparentées) et la lignée Raw-BIueTM (lignée de macrophages de souris transfectée pour exprimer une phosphatase alcaline). Ces lignées sont détaillées plus avant dans cette description. L'utilisation de telles lignées permet donc de remplacer les dosages des cytokines par un test enzymatique (activité phosphatase), et de cibler certaines familles de molécules d'origine bactérienne en fonction du(es) récepteur(s) exprimé(s) par la lignée. En outre, ces lignées permettent de détecter des contaminants à des seuils très bas, notamment pour les agonistes de TLR2 (PGN, LTA, LM, ...) et NOD2 (MDP et molécules apparentées). Selon ce second mode de réalisation, le test de réponse inflammatoire in vitro consiste à mettre les cellules de la lignée cellulaire permettant de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée, en présence d'une préparation de polymères de glucose susceptibles de contenir des contaminants pro-inflammatoires et à mesurer l'activité du récepteur ou du signal du gène rapporteur qui lui est associé. La détection de cette activité ou de ce signal indique que la préparation contient des contaminants susceptibles d'activer un ou des récepteurs de l'immunité innée et de déclencher une réaction inflammatoire.

Dans un mode de réalisation préféré, la préparation de polymères de glucose testée présente une concentration de polymères de glucose de 5 à 50 mg/mL, de préférence entre 5 et 10, 20, 30 ou 40 mg/mL. Dans un mode de réalisation particulier, la préparation de polymères de glucose testée présente une concentration de polymères de glucose d'environ 5 mg/mL.

Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape consistant à identifier le(s) contaminant(s) susceptible(s) de déclencher une réaction inflammatoire. Pour cela, une lignée cellulaire permettant de détecter l'activité d'un récepteur ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée telle que décrite ci-dessus, est mise en présence de la préparation de polymères de glucose à tester. L'activité du récepteur ou le signal du gène rapporteur associé à ce récepteur est mesuré. La détection de cette activité ou de ce signal indique la présence dans la préparation d'un contaminant qui est un agoniste du récepteur.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend les étapes consistant à (a) réaliser au moins un test de réponse inflammatoire in vitro consistant à mettre les cellules d'une lignée cellulaire, de préférence des macrophages, en présence d'une préparation de polymères de glucose susceptibles de contenir des contaminants pro- inflammatoires et à mesurer la production de cytokines de la phase aigue de l'inflammation, notamment TNF-a, IL-1(3, IL-8 et/ou des chimiokines telles que CCLS/RANTES, la production de ces cytokines indiquant que la préparation contient des contaminants susceptibles de déclencher une réaction inflammatoire, et (b) dans le cas où la préparation contient de contaminants, mettre en présence une lignée cellulaire permettant de détecter l'activité d'un récepteur ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée telle que décrite ci-dessus, avec la préparation et détecter l'activité du récepteur ou le signal du gène rapporteur associé à ce récepteur, la détection de cette activité ou de ce signal indiquant la présence dans la préparation d'un contaminant qui est un agoniste du récepteur.

Ce procédé permet donc non seulement détecter la présence de contaminants pro-inflammatoires dans une préparation de polymères de glucose, mais également d'obtenir des informations sur la nature de ces contaminants. II est notamment possible de définir si ces contaminants sont des agonistes de récepteurs TLR ou NOD tels que TLR2, TLR4 ou NOD2. Selon un mode de réalisation préféré, plusieurs lignées peuvent être utilisées pour apporter des informations complémentaires à celles obtenues, par exemple, avec les tests de réponses cytokiniques dans les cellules THP-1 différenciées : - lignée HEK-BIueTM hTLR2 : cette lignée répond spécifiquement aux agonistes du TLR2. Elle permet notamment le dosage des PGN.

Son utilisation permet donc de connaître la part de ces contaminants dans le déclenchement des réponses inflammatoires. En outre, le traitement des solutions par le lysozyme et/ou la (3-glucanase permet d'éliminer le PGN et/ou les (3-glucanes, et de connaître ainsi l'importance des autres agonistes du TLR2 susceptibles d'être présents dans les lots contaminés (glycolipides et lipopeptides). - lignée HEK-BIueTM hNOD2 : cette lignée répond efficacement au MDP et molécules apparentées (EC50 MDP = 35 ± 5 ng/mL), alors que des taux compris entre 1 et 10 µg/mL sont nécessaires dans les modèles utilisant des lignées monocytaires et des PBMC. L'utilisation de cette lignée permet donc de les détecter à des concentrations faibles. Cette analyse est d'autant plus intéressante que la présence de PGN suppose que ses produits de dégradation soient aussi présents, et qu'ils puissent agir de façon synergique avec les agonistes des TLRs. - lignée HEK-BIueTM NuII2: il s'agit d'une lignée contrôle, dont l'utilisation est nécessaire pour vérifier que les solutions de polymères de glucose n'induisent pas la production de l'enzyme par un mécanisme intrinsèque. - lignée Raw-BIueTM : il s'agit d'une lignée de macrophages de souris transfectée par la SEAP. L'avantage de cette lignée est qu'elle exprime de façon naturelle la quasi-totalité des récepteurs de l'immunité innée. Elle sert de témoin positif dans les tests, puisqu'elle est censée répondre à tout type de contaminants microbiens. L'invention a également pour objet les moyens d'identification des contaminants pro-inflammatoires. Les dosages des LPS et PGN réalisés par tout moyen connu de l'homme du métier, et les tests de "réponses inflammatoires" tels que décrits ci-dessus, par exemple en utilisant les cellules HEK-BIueTM, permettent d'identifier la nature des principaux contaminants (LPS, PGN, (3-glucanes, MDP et molécules apparentées) et d'estimer leur part dans l'induction de la réponse inflammatoire.

Les autres contaminants susceptibles d'être présents dans les lots à tester sont essentiellement des glycolipides et lipopeptides agonistes de TLR2 ou des peptides microbiens. - pour les glycolipides et lipopeptides, une procédure de fractionnement basé sur leur caractère amphiphile est réalisée pour les récupérer et les concentrer. Un traitement par un mélange chloroforme/méthanol permet d'extraire ces molécules des solutions de polymères de glucose et de les concentrer après évaporation du chloroforme. Une fois les molécules récupérées, elles sont reprises dans un volume minimum de DMSO (ou tout autre solvant non toxique pour les cellules) puis analysées dans les tests de réponses inflammatoires décrites précédemment. Ainsi, l'utilisation d'une lignée cellulaire permettant de détecter l'activité d'un récepteur tel que TLR2, par exemple la lignée HEK-BIueTM hTLR2, permet de confirmer ou non la présence de traces d'agonistes de TLR2 autres que le PGN dans les lots à analyser.

Les composés peuvent également être testés dans un modèle utilisant des cellules exprimant tous les types de récepteurs telles que les cellules Raw-BIueTM, mais dans ce cas, les solutions de polymères de glucose sont au préalable traitées sur Detoxi-gel, de façon à éliminer les traces de LPS. En fonction des quantités récupérées, une analyse plus fine des contaminants est réalisée. Dans ce cas, le traitement avec le mélange chloroforme/méthanol permet d'extraire les produits qui sont ensuite fractionnées sur résine C18 et/ou de colonne de charbon. Les composés sont alors élués par un gradient eau/acétonitrile. En fonction de la pureté des fractions et de la quantité de matériel, une analyse plus poussée permet de déterminer la nature biochimique de ces composés, voire leur structure. - pour les peptides microbiens, une étape d'ultra-filtration sur filtre 5 kDa permet de les extraire des solutions de polymères de glucose. Si nécessaire, un passage sur colonne de charbon permet de débarrasser le filtrat des composés plus hydrophobes de taille < 5 kDa.

Les solutions sont ensuite concentrées puis testées pour leurs propriétés biologiques. Ces peptides étant chimio-attractants pour les leucocytes, leur présence peut être détectée dans un test de migration cellulaire in vitro disponible au Laboratoire. II se peut que les polymères de glucose soient contaminés par d'autres molécules connues pour déclencher des réponses inflammatoires, telles que la flagelline, une protéine agoniste de TLR5, et les dérivés d'acides nucléiques et molécules apparentées, agonistes des TLR3, 7, 8 et 9 (les trois premiers sont impliqués dans les réactions à des composés d'origine virale, alors que le TLR9 est activé par des ADN d'origine bactérienne). En ce cas, les lignées cellulaires permettant de détecter l'activité de ces différents TLRs, notamment des lignées HEK-BIueTM, sont disponibles et peuvent être utilisées pour analyser l'impact de ces molécules dans les réponses inflammatoires. De plus, la présence de composés oligonucléotidiques peut être confirmée ou non par des analyses biochimiques. Le procédé de l'invention permet la détection des contaminants de polymères de glucose destinés à la dialyse péritonéale, contaminants susceptibles d'agir en synergie les uns avec les autres pour déclencher une réaction inflammatoire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un test de réponse inflammatoire in vitro à l'aide de lignées cellulaires modifiées. La présente invention fournit également une méthode de quantification des peptidoglycanes dans un échantillon, en particulier de polymères de glucose destinés à la dialyse péritonéale, comprenant l'incubation de l'échantillon avec une lignée cellulaire permettant de détecter l'activité du récepteur TLR2 et la mesure de l'activation de la voie de signalisation associée à TLR2, permettant ainsi de déterminer la quantité de peptidoglycanes contenue dans l'échantillon. Notamment, cette lignée est une lignée modifiée par transfection (de préférence transfection stable) avec un vecteur codant pour le récepteur TLR2. De préférence, cette lignée n'exprime pas d'autres récepteurs de l'immunité innée. En outre, cette lignée peut contenir un gène rapporteur qui est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée au récepteur TLR2. De manière préférée, ce gène rapporteur code pour une protéine colorée ou fluorescente ou pour une protéine dont l'activité peut être mesurée avec ou sans substrat. De manière particulière, le gène rapporteur code pour une phosphatase alcaline. Ces cellules peuvent par exemple être co-transfectées avec un gène rapporteur produisant, par exemple, une forme sécrétée de la phosphatase alcaline (acronyme anglo-saxon SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase), dont la synthèse est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée au récepteur TLR2. Cette lignée peut par exemple être la lignée HEKBIueTM hTLR2.

Pour déterminer la quantité de peptidoglycanes contenue dans l'échantillon sur la base de la mesure de l'activation de la voie de signalisation associée à TLR2, une courbe doses-réponses a été préalablement ou simultanément établit avec une gamme étalons comprenant des concentrations croissantes de peptidoglycanes. Préalablement au dosage, l'échantillon à doser peut facultativement avoir été partiellement épuré afin d'éliminer par exemple d'éventuels contaminants gênants. Des glycopeptides et lipopeptides peuvent être éliminés de l'échantillon par extraction chloroformique. Après centrifugation, le dosage sera réalisé sur la phase aqueuse, normalement débarrassée des contaminants à caractère lipophile. Un fractionnement sur micro-concentrateur sur filtre de seuils 30 ou 50 kDa peut être réalisé, le dosage étant ensuite réalisé sur le rétentat. Un traitement préalable à la (3-glucanase peut permettre d'affiner le dosage en éliminant les molécules apparentées. Ce même procédé peut être également mis en oeuvre pour la détection des contaminants de polymères de glucose destinés à la nutrition entérale et parentérale, voire même à la nutrition des nouveaux nés.

L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, lesquels se veulent illustratifs et non limitatifs.

Brève Description des Figures Figure 1: Production de RANTES en réponse au PGN et au LPS dans des cellules THP-1 sensibilisées. La courbe « Différence » a été obtenue en retranchant la réponse intrinsèque de l'agent de sensibilisation. Figure 2 : Production de TNF-a en réponse au PGN et au LPS dans des cellules THP-1 sensibilisées. La courbe « Différence » a été obtenue en retranchant la réponse intrinsèque de l'agent de sensibilisation. Figure 3 : Effet de l'adition de MDP (10 µg/mL) dans les solutions de polymères (50 mg/mL). Figure 4 : Réponses induites par une solution de PGN avec ou sans filtration (0,22 µm). Figure 5 : Effet de l'addition de MDP dans les solutions de polymères non filtrées (50 mg/mL). Figure 6 : Effet de la concentration en polymère sur la réponse RANTES induite par le PGN. Figure 7 : Mesure de l'activité de la SEAP produites par les cellules HEK-Blue en réponse au PGN.

Figure 8 : Production de SEAP par les cellules HEK-TLR2 en réponse aux polymères de glucose. Figure 9 : Effet de la filtration sur la réponse des cellules HEK-TLR2 au PGN. Figure 10 : Production de SEAP par les cellules HEK-TLR2 en réponse aux polymères de glucose non filtrés. Les valeurs de PGN indiquées ont été calculées à partir de la courbe présentée en Figure 7.

Exemple 1 : Préparation des polymères de glucose destinés à la dialyse péritonéale La matière première pour l'obtention des polymères de glucose selon l'invention est produite à partir d'amidon de maïs waxy de la manière suivante : - nettoyage du maïs de manière à garder exclusivement les grains de maïs entier, - trempe du maïs ainsi nettoyé en présence d'acide lactique de manière à assouplir les grains, - broyage humide, puis séparation des différents constituants, i.e. germe, enveloppe cellulosique, protéines et amidon, - nettoyage de l'amidon à contre courant avec de l'eau sanitisée de manière à purifier l'amidon aussi bien physico-chimiquement que bactériologiquement, - centrifugation et séchage de l'amidon, - mise en suspension de l'amidon dans une eau sanitisée à une matière sèche finale de 40 % et à une Température de 45°C à 50°C, - acidification de la suspension d'amidon par addition d'HCI à un pH < 2, et accroissement de la température jusqu'à 115 à 120°C pendant 6 à 8 minutes, - floculation des protéines et des matières grasses à ce pH, - neutralisation de la suspension à pH 5, - filtration de la suspension sur terre de diatomées (de manière à retenir les protéines, les matières grasses et la cellulose résiduelles), - déminéralisation sur résine cationique forte et résine anionique faible, - traitement au charbon actif à une Tp de 70-80°C et à un pH de 4 à 4,5; ce qui élimine les impuretés colorées et réduit le niveau d'impuretés microbiologiques. Le charbon actif poudre étant ajouté à une concentration comprise entre 0,2 et 0,5% sur sec est retenu sur un filtre céramique de 10 µm chargé auparavant avec un agent filtrant, - concentration par passage sur évaporateur à film tombant, - atomisation de la solution concentrée dans un atomiseur de type MSD commercialisée par la société NIRO. Cet hydrolysat d'amidon est conforme à la monographie de la pharmacopée européenne (réf Maltodextrines : 1542). o pH : 4,0 - 7,0 pour une solution à solution 10 %, o I. d. : conforme, o Perte à la dessiccation : 6 % max o DE:<20 o Cendres sulfuriques : 0,5 % max o S02 : 20 ppm max o Métaux lourds : < 10 ppm o E. coli : absent / g o Salmonelles : absent / 10 g o Germes viables totaux : 100 CFU/g max (EP 1000 CFU/g) o Moisissures : 100 CFU/g max En complément, sont analysés les lots produits sur les valeurs de : - contamination en levures + moisissures : 150 CFU/10 g max, soit 15 / g max - germes aérobies : 500 CFU/10 g max, soit 50/g max - endotoxines (test LAL gel clot en point final) : 20 EU/g max - peptidoglycanes : 2700 ng/g max Les conditions d'obtention des polymères de glucose conformes à l'invention à partir de l'hydrolysat d'amidon ainsi obtenu sont les suivantes : 1) Préparation de l'eau / Qualité de l'eau - purification de l'eau par filtration sur 3 µm ; traitement sur charbon actif, déminéralisation sur résines échangeuses de cations et d'anions, et filtration à nouveau (UA), - deux réservoirs utilisés : o 10 m3 pour la dissolution de l'hydrolysat d'amidon, les étapes de rinçage et nettoyage de l'atomiseur, o 60 m3 pour le procédé principal (nettoyage des réservoirs, ses suspensions de charbon actif et de la chromatographie 3) Chromatographie - solubilisation de l'hydrolysat d'amidon avec de l'eau purifiée de manière à obtenir une MS de 35 - 45 % à une température comprise entre 60 - 85°C, - filtration stérilisante de l'hydrolysat d'amidon par passage sur 0,45 µm puis 0,22 µm, réalisée à un P < 3 bars, - séparation chromatographique par exclusion stérique (SEC) réalisée à l'aide d'un système continu composé de 6 séries de double plateaux de 1 m3 de résine chacun. La résine mise en oeuvre est une PCR145K commercialisée par la société Purolite.

La solution qui traverse cette résine présente une température comprise entre 75 et 85°C à 35-45 % de MS. La durée de chaque séquence définit le procédé. Dans le cas présent, la durée de chaque séquence est de 15 minutes.

Le contrôle est effectué par une analyse de distribution du poids moléculaire et l'analyse du rendement de chromatographie, de la manière suivante : (Quantité de matière sèche de la fraction voulue)/ (Quantité de matière sèche de l'alimentation) Les poids moléculaires les plus faibles interagissent avec la résine et les haut poids moléculaires sont élués à l'eau purifiée. La concentration est effectuée par évaporation en film tombant à une MS de 35 - 45 %. On réalise un traitement thermique à une température de 120°C pendant 2 minutes, On ajoute le charbon actif entre 0,5 et 1,5 % de la masse totale de l'hydrolysat d'amidon à 75°C avec des résines cationiques (1 à 3 I) pour contrôler le pH (4 - 4,5) et anioniques (5 à 10 I) pour contrôler le pH (5,5 - 6), On filtre sur filtres à manches en polypropylène avec P < 5 bars, en 5 à 6 heures par lot. On effectue une seconde et une troisième filtration sur 1,5 et 0,45 µm, puis sur 0,22 et 0,1 µm, et une ultrafiltration sur membrane d'un seuil de coupure de l'ordre de 40.000 Da Pour l'atomisation : alimentation à 500 kgs /h avec une solution à 40% de MS et à 250°C dans un atomiseur de type MSD commercialisé par la société Niro. Le produit atomisé présente à sa sortie une humidité inférieure à 6 %. On refroidit le produit alors en lit d'air fluidisé comprenant 3 zones de refroidissement alimentée par de l'air à 40, 30 et 20°C. Le produit obtenu est ensuite tamiser sur 800µm afin de retirer les agrégats. De l'ordre de 500 kgs de produit fini sont obtenus à partir de 800 kgs de maltodextrines départ, soit un rendement de l'ordre de 60%. La détermination de la contamination éventuelle du circuit est réalisée par l'analyse de la teneur en peptidoglycanes et endotoxines sur le produit fini. Pour exemple, les teneurs habituellement observées et mesurées sur les lots du produit fini (exprimés par g de polymère de glucose) sont pour les critères spécifiés ci-dessus les suivants : - Levures et moisissures : 0 / g - Germes aérobies : 0/g - Endotoxines (test LAL gel clot en point final) : à 0,3 EU/g. - Peptidoglycanes : < 3 ng/g B. acidocaldarius : 1/g Exemple 2: Utilisation des lignées cellulaires "sensibilisées" THP-1 humaines promonocytaires Matériels & Méthodes Les cellules THP-1 (88081201, ECACC) sont cultivées en routine au Laboratoire.

Pour les expériences d'activation pro-inflammatoire, les cellules sont différenciées pendant 3 jours en présence de phorbol ester (PMA). En particulier, les cellules sont mises en culture dans 200 µl de milieu complet (0,75 106 cellules/mL) en présence de 20 nM de PMA pendant 72 h. Des échantillons de polymères de glucose sont préparés selon l'exemple 1.

Tableau 1 : Echantillon de polymères de glucose. 1 10- 1 10- 1 10- MM MM MP MP MC 10- LY LY 01 02 03 10-04 10-05 10-06 10-07 08 10-09 10-10 LPS < 0,3 < 1,2 9,6 < 0,3 38,4 9.6 < 0,15 < 0,15 (EU/g) 0,3 0,3 PGN < 20 755 27 < 20 2755 < 20 4613 16288 < 20 208 (ng/g) La solution de dilution des standards est 1-10-01 avec < 0,3 EU/g de LPS (LAL), < 20 ng/g de PGN (Wako) et utilisée à la concentration de 5 mg/mL finale. Les mesures sont ensuite effectuées sur une première série d'échantillons 15 correspond à différents lots sélectionnés sur la base des taux de contamination par le PGN, le LPS et les [3-glucanes. Une deuxième série provient de prélèvements effectués aux différentes étapes du même procédé de fabrication d'un lot de polymères de glucose. Les kits ELISA de dosage de TNF-OE, de CCL5/RANTES et de l'IL-8 sont achetés par le 20 Laboratoire chez AbCys, les agonistes standards (PGN, LTA, LM, PAM3(cys), FSL-1, LPS, f-MLP et MDP) chez InvivoGen. Le test de mesure de l'activité SEAP est distribué par InvivoGen. Les cellules THP-1 différenciées (0,75.106 cellules/mL) sont mises en culture dans 200 µl de milieu complet, puis incubées en présence des différents échantillons à tester. 25 Chaque analyse est réalisée en triplicate. Les surnageants cellulaires sont collectés afin de doser les cytokines sécrétées après 8 h de stimulation pour le TNP-Cc, et 20 h pour le RANTES. Les dosages ELISA sont réalisés selon les indications données par le fabricant.

Résultats Les premiers essais ont consisté à analyser les réponses des cellules THP-1 "sensibilisées" en réponse à des doses croissantes de PGN et de LPS. Le MDP a été testé aux doses de 1, 10 et 100 pg/mL. La dose minimale n'induit pas d'effet synergique. Par contre, les doses de 10 et 100 pg/mL ont une activité synergique similaire sur la production des cytokines en réponse aux PGN et LPS. Pour la suite de l'étude, la dose de 10 pg/mL de MDP a été retenue. L'effet synergique du LPS a été analysé en ajoutant une dose sub-optimale (25 pg/mL) à des doses croissantes de PGN. L'effet synergique entre les deux agonistes est bien observé. La réponse a été quantifiée en mesurant la production de RANTES (Figure 1) et de TNF-a (Figure 2). Dans tous les cas, la synergie est nettement visible pour le dosage de RANTES, avec une sensibilité élevée. Ce dosage sera donc privilégié et conservé pour la suite des expérimentations.

Ces premiers résultats montrent que la sensibilisation des cellules THP-1 avec le MDP, avec dosage en retour de RANTES, est particulièrement efficace pour détecter de faibles taux de PGN et de LPS. En théorie, ces seuils de détection devraient permettre de détecter les contaminants présents dans les produits Roquette (Tableau 2).

Tableau 2 : Seuils de détection et EC50 pour le PGN et le LPS. PGN PGN + MDP PGN + LPS LPS LPS + MDP (10 pg/mL) (25 pg/mL) (10 µg/m L) Sensibilité 0,02 0,002 pg/mL 0,01 pg/mL 0,005 ng/mL 0,002 ng/mL pg/mL EC50 2 pg/mL 1 pg/mL 1 pg/mL 1 ng/mL 0,4 ng/mL Seuil de détection 400 40 ng/g 200 ng/g 0,1 ng/g 0,04 ng/g (soit (50 mg/mL) ng/g (soit 1 EU/g) 0,4 EU/g) Les essais avec les cellules THP-1 sensibilisées par le MDP ont donc été réalisés ensuite avec les dix échantillons Roquette (Figure 3). Une réponse inflammatoire (production de RANTES et de TNF-a) n'est observée que 25 dans l'échantillon 10-07, qui est le seul fortement chargé en LPS. Les PGN ne sont pas détectés, alors qu'ils sont normalement présents en quantités dosables. Une différence majeure entre les solutions préparées avec les standards de PGN et les échantillons de polymères de glucose du Tableau 1 est la présence d'une étape de filtration. 19 En effet, les standards sont préparés stérilement puis dilués dans une solution préparée avec le polymère 10-01, qui a été filtrée au préalable. En revanche, les autres polymères ont été filtrés sur filtre 0,22 µm avant d'être ajoutés hétérogènes et ils peuvent atteindre des tailles imposantes (> 106 Da). Ces derniers sont peu solubles, ce qui affecte leur pouvoir pro-inflammatoire mais favorise leur élimination par filtration. Par contre, les PGN solubles, et par conséquent actifs, ont une masse moyenne de 120 kDa. La comparaison des réponses induites par une même solution de PGN montre que la filtration réduit de plus de 50 % la réponse attendue (Figure 4). II est donc envisageable que le test Wako permette de doser tous les PGN, alors que les tests cellulaires présentent l'avantage de ne détecter que le PGN actifs. Pour vérifier cette hypothèse, des essais ont été réalisés avec des solutions de polymères préparées de façon aseptique mais sans étape de filtration (Figure 5). Dans ce cas, le polymère 10-07 donne encore une réponse très positive (LPS), alors que les autres échantillons sont peu ou non réactifs. On observe quand même une réponse supérieure au bruit de fond pour le 10-05 et les deux composés LY (10-09 et 10-10). Aucune relation n'a été observée entre ces faibles réponses et les taux de PGN dosés par le test Wako (voir tableau 1). Un autre paramètre susceptible d'optimiser le dosage est la concentration du polymère lorsqu'il est ajouté aux cellules.

Pour tester ce paramètre, les inventeurs ont analysé la réponse RANTES induite par du PGN standard dilué dans du milieu de culture seul (contrôle) ou additionné du polymère 10-01 à 5 mg/mL (valeur utilisée dans les tests doses-réponses des figures 1 et 2) et 50 mg/mL (valeur utilisée pour les tests avec les polymères). Alors que la concentration 5 mg/mL ne modifie pas de façon significative la réponse RANTES par rapport au contrôle, la présence du polymère à 50 mg/mL réduit au moins de moitié la réactivité des cellules, ce qui est surtout visible pour les faibles taux de PGN (Figure 6). II est donc préférable d'optimiser la concentration en polymère à utiliser, de façon à définir des conditions permettant de réduire au maximum cette atténuation tout en apportant suffisamment de produits pour avoir une réponse cellulaire détectable.

Exemple 2 : Utilisation des lignées cellulaires HEK-BIueTM (hTLR2, hNOD2, Null2) et Raw-BIueTM (InvivoGen) Les cellules HEK-BIueTM et Raw-BIueTM sont cultivées au Laboratoire selon les conditions décrites par le fournisseur.

Pour les cellules HEK-BIueTM et Raw-BIueTM, l'activité enzymatique libérée par activation des récepteurs de l'immunité innée est mesurée par un test colorimétrique selon les recommandations du fournisseur. Les mesures sont ensuite effectuées sur une première série d'échantillons correspondant à différents lots sélectionnés sur la base des taux de contamination par le PGN, le LPS et les [3-glucanes. Une deuxième série provient de prélèvements effectués aux différentes étapes du même procédé de fabrication d'un lot de polymères de glucose.

Exemple 3 : Méthode de dosage des peptidoglycanes Le dosage est basé sur la reconnaissance spécifique des PGN par une lignée exprimant le récepteur TLR2 et sur la production d'une activité enzymatique mesurable via l'activation de la voie de signalisation associée à TLR2. Procédures expérimentales Les lignées cellulaires HEK-BIueTM (InvivoGen) sont des lignées modifiées par transfection stable avec des vecteurs codant pour des récepteurs de l'immunité innée. Ces cellules sont également co-transfectées avec un gène rapporteur produisant une forme sécrétée de la phosphatase alcaline (SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase), dont la synthèse est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée au(x) récepteur(s) exprimé(s) dans la même lignée cellulaire. Pour les expériences relatives à ce dosage, deux lignées sont utilisées : - lignée HEK-BIueTM hTLR2 : cette lignée répond spécifiquement aux agonistes du TLR2. Son utilisation permettra donc de connaître le taux de ces contaminants peptidoglycanes. - lignée HEK-BIueTM NuII2: il s'agit d'une lignée contrôle, dont l'utilisation permet de vérifier que les solutions de polymères de glucose n'induisent pas la production de l'enzyme par un mécanisme intrinsèque. Ce sont des lignées contrôles. Etablissement de la courbe doses-réponses La courbe doses-réponses est réalisée avec un peptidoglycane standard (Figure 7).

Les cellules HEK-BIueTM sont incubées avec des concentrations croissantes en standard, et la réponse cellulaire est mesurée par quantification de l'activité enzymatique produite. Le résultat est une courbe classique de réponse cellulaire de type sigmoïde. - La partie (A) correspond aux réponses obtenues avec des concentrations faibles en PGN, en-deçà de celles donnant une activation efficace de TLR2. Cette zone non linéaire correspond donc au seuil limite de détection de la méthode. Facultativement, de façon à inclure la variabilité de la méthode, on estime ce seuil de détection à trois fois la valeur du bruit de fond («réponse» obtenue en absence de stimulus). - La partie (B) est la plus intéressante car on observe une réponse linéaire. Cette zone de réponses efficaces permet de déterminer une relation directe entre la réponse cellulaire et le taux de PGN. II s'agit donc de la zone de dosage. - La partie (C) correspond à une saturation de la réponse cellulaire en présence de concentrations trop fortes en PGN. II y a en fait une saturation des récepteurs TLR2. Dans le cas d'échantillons susceptibles d'être fortement contaminés en PGN, il suffit donc de réaliser plusieurs dilutions en série de façon à toujours se localiser dans la zone de linéarité. A l'inverse, des concentrations faibles en PGN nécessitent une étape de concentration de l'échantillon si l'on veut augmenter la sensibilité du dosage. Préparation des échantillons Les dosages des PGN sont réalisés sur des solutions de polymères de glucose. L'échantillon nécessitant la quantification de PGN est incubé avec des cellules HEK-BIueTM hTLR2, et la réponse cellulaire est mesurée par quantification de l'activité enzymatique produite. En se reportant à la courbe doses-réponses, on détermine la quantité de PGN contenu dans l'échantillon. Matériels & Méthodes Cellules : lignées HEK-BIueTM (hTLR2, NuII2). Les cellules seront cultivées au Laboratoire selon les conditions décrites par le fournisseur. Notamment, elles ont été cultivées en routine dans du milieu DMEM contenant 4,5 g/L glucose, 10% (v/v) SVF décomplémenté, 50 U/mL pénicilline, 50 pg/mL streptomycine, 2 mM glutamine et 100 pg/mL de normocine. La zéocine (100µg/mL) a été utilisée pour assurer une pression de sélection du plasmide codant la SEAP. Pour les cellules HEK-TLR2, une sélection supplémentaire du plasmide codant pour TLR2 a été assurée en ajoutant dans le milieu l'antibiotique HEK-Blue Sélection. Les cellules ont été repiquées 2 fois par semaine. A 75% de confluence, les cellules ont été décrochées et remises en suspension à une densité de 0,28.106 cellules/mL. 180µL de la suspension cellulaire ont été répartis dans les puits de culture (boite de 96 puits), soit 50.000 cellules / puits.

Echantillons : - Une première série d'échantillons correspond à différents lots sélectionnés sur la base des taux de contamination par le PGN, le LPS et les (3-glucanes. Elle permet d'établir une courbe étalon et d'effectuer des contrôles. Une deuxième série provient de prélèvements effectués aux différentes étapes du même Process de fabrication d'un lot de polymères de glucose. Elle correspond aux échantillons à doser. - Les agonistes standards (PGN, LPS et MDP) et le test de mesure de l'activité SEAP sont achetés par le Laboratoire chez InvivoGen. Stimulation des cellules et mesure de la réponse cellulaire : Les cellules sont incubées en présence des différents échantillons à tester. Notamment, 20 µL d'échantillon (PGN, polymères) ont été ajoutés dans chaque puits. La stimulation a duré de 16 à 24 h. Chaque analyse a été réalisée en triplicate. Les surnageants cellulaires sont collectés afin de doser l'activité enzymatique libérée (test colorimétrique) selon les recommandations du fournisseur. Notamment, la mesure de l'activité de la SEAP a été réalisée en mélangeant 180 µL de Quanti- blue (1 sachet pour 100 mL H2O préalablement chauffé à 37°C) et 20 µL de surnageant de culture. Le développement de la coloration (du rose au bleu) s'est fait à 37°C et la lecture a été réalisée à différents intervalles à 620 nm. Résultats Les premiers essais ont consisté à analyser les réponses des cellules HEK-TLR2 et HEK- Null à de doses croissantes de PGN et en présence des deux concentrations en polymère 10-01 utilisées précédemment. La réponse a été quantifiée en mesurant l'activité de la SEAP produite dans les surnageants des deux types cellulaires en réponse au PGN (Figure 7). La réponse des cellules HEK-TLR2 au PGN est plus sensible que celle obtenue en utilisant les cellules THP-1 (d'au moins un log). Ici aussi, une quantité trop élevée en polymères peut gêner la réponse des cellules. Une concentration à 5 mg/mL permet une quantification de PGN avec une linéarité parfaite entre 1 et 100 ng/mL (soit entre 200 et 20 000 ng/g de produits). Pour comparaison, le test Wako est adapté pour des concentrations > 20 ng/g, alors que les tests cellulaires classiques permettent de détecter à partir de 4000 ng/g. Les tests ont été réalisés avec des échantillons contaminés de polymères de glucose filtrés (Figure 8). Bien que le seuil de sensibilité soit en-deçà des taux de PGN contaminants, le dosage ne permet pas de retrouver de réponse au PGN. Ce résultat était toutefois attendu, puisque comme précédemment, la filtration des échantillons sur filtre 0,22 µm réduit la réponse de plus de 50% (Figure 9).

Les essais ont donc été reproduits avec des échantillons non filtrés (Figure 10). La méthode appliquée à des échantillons non filtrés permettent de faire ressortir quatre produits qui avaient été identifiés comme étant contaminés par du PGN (voir tableau 1). On peut noter que le polymère 10-07 ne répond pas, alors qu'il donnait une réponse très forte avec les cellules THP-1. Ce résultat confirme que la réponse était bien due à la présence d'un taux élevé de LPS. La méthode est donc bien spécifique des ligands TLR2 et permet de détecter des produits contaminés par le PGN. Par contre, il n'y a pas de corrélation entre les taux de PGN mesurés par la méthode Wako et les amplitudes des réponses cellulaires au PGN. Sur la base de ces premiers résultats, il peut être supposé que la méthode basée sur l'utilisation des cellules HEKTLR2 permet de détecter des PGN actifs.

Les deux méthodes décrites dans les exemples 2 et 3 permettent de détecter les contaminants à activité pro-inflammatoire. Cela peut expliquer les différences observées entre les réponses cellulaires et les dosages quantitatifs (LAL et Wako).

En effet, les PGN sont très hétérogènes en taille. Les formes les plus lourdes (> 106 Da) sont peu solubles et donc peu réactives dans les tests cellulaires. Par contre, elles sont dosées par le test Wako. Les PGN de taille intermédiaire (- 100 kDa) sont très solubles et sont de puissants inducteurs de TLR2. Malgré des taux faibles, ils sont susceptibles de déclencher une forte réponse inflammatoire. Enfin, les formes monomériques sont reconnues par le récepteur NOD2. Comme le MDP, elles sont donc peu pro-inflammatoires mais peuvent agir en synergie avec d'autres contaminants. Cette dispersion de taille et donc d'activité présente un inconvénient majeur pour faire la relation entre le taux de contamination et le risque de développer une réponse inflammatoire lorsque des dosages quantitatifs classiques sont utilisés (LAL et Wako).

A titre d'illustration, les échantillons MP10-07 et MC10-08 sont très chargés en PGN (4613 et 16288 ng/mg, respectivement), mais ne donne pas de réponse cellulaire marquée avec les cellules HEK-TLR2. A l'inverse, les échantillons 110-02 et LY10-10 sont peu contaminés (755 et 208 ng/g) mais sont les plus réactifs en réponse cellulaire. Ces deux échantillons sont des produits finaux, qui ont donc subi entre autres des étapes de micro-filtration et de tamisage moléculaire. II est donc envisageable que les PGN présents dans ces deux produits soient solubles et donc très réactifs. A l'inverse, les échantillons MP10-07 et MC10-08 contiennent probablement des PGN de grande taille, qui seront éliminés en cours de production du produit final.35

Claims (20)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de détection des contaminants pro-inflammatoires de polymères de glucose, lesdits contaminants étant susceptibles de déclencher, séparément ou en combinaison, une réaction inflammatoire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un test de réponse inflammatoire in vitro à l'aide d'une lignée cellulaire permettant de détecter au moins un facteur de la réponse inflammatoire.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les polymères de glucose sont choisis dans le groupe des polymères de glucose destinés à la dialyse péritonéale, la nutrition entérale et parentérale et l'alimentation des nouveaux nés, et sont plus particulièrement les polymères de glucose destinés à la dialyse péritonéale.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la lignée cellulaire est un macrophage, de préférence une lignée cellulaire différenciée en macrophage, de manière plus préférée la lignée THP-1 différenciée en macrophage.
4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la lignée cellulaire est productrice de TNF-C(, de CCL5/RANTES et/ou de CXCL8/IL-8.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le test de réponse inflammatoire consiste à mettre les cellules de la lignée cellulaire en présence d'une préparation de polymères de glucose susceptibles de contenir des contaminants pro-inflammatoires et à mesurer la production de cytokines de la phase aigue de l'inflammation, la production de ces cytokines indiquant que la préparation contient des contaminants susceptibles de déclencher une réaction inflammatoire.
6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cytokines de la phase aigue de l'inflammation sont choisies dans le groupe constitué de TNF-a, IL-8, IL-1(3 et des chimiokines telles que CCL5/RANTES, de préférence la cytokine est RANTES.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on ajoute à la préparation de polymères de glucose une molécule choisie parmi le muramyl-dipeptide (MDP) et desmolécules apparentées, des peptides microbiens de type f-MLP (tripeptide formyl-Met-Leu-Phe) et des lipopolysaccharides (LPS), de préférence du MDP ou des LPS.
8. 8. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la lignée cellulaire 5 permet de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisée en ce que la lignée cellulaire est obtenue par transfection stable avec un ou plusieurs vecteurs codant pour un ou plusieurs récepteurs de l'immunité innée.
10. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que la lignée cellulaire permet de détecter l'activité d'un ou plusieurs récepteurs TLR ou NOD.
11. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisée en ce que la lignée cellulaire 15 permet de détecter l'activité d'un récepteur TLR2.
12. 12. Procédé selon la revendication 10, caractérisée en ce que la lignée cellulaire permet de détecter l'activité d'un récepteur NOD2. 20
13. 13. Procédé selon la revendication 10, caractérisée en ce que la lignée cellulaire permet de détecter l'activité d'un récepteur TLR4.
14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé en ce que dans la lignée cellulaire, un gène rapporteur est sous la dépendance directe de la voie de 25 signalisation associée au(x) récepteur(s) de l'immunité innée, de préférence un gène rapporteur codant pour une protéine colorée ou fluorescente ou pour une protéine dont l'activité peut être mesurée avec ou sans substrat, de manière encore plus préférée pour une phosphatase alcaline. 30
15. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, caractérisé en ce que le test de réponse inflammatoire consiste à mettre les cellules de la lignée cellulaire en présence d'une préparation de polymères de glucose susceptibles de contenir des contaminants pro-inflammatoires et à mesurer l'activité du récepteur ou le signal du gène rapporteur, la détection de cette activité ou de ce signal indiquant que la préparation contient 10des contaminants susceptibles d'activer un ou des récepteurs de l'immunité innée et de déclencher une réaction inflammatoire.
16. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la préparation de polymères de glucose testée présente une concentration de polymères de 5 à 50 mg/mL.
17. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape consistant à identifier ou à quantifier le(s) contaminant(s) susceptible(s) de déclencher une réaction inflammatoire.
18. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le(s) contaminant(s) susceptible(s) de déclencher une réaction inflammatoire sont identifiés ou quantifiés en mettant la préparation de polymères de glucose en présence des cellules d'une lignée cellulaire telle que définie dans l'une quelconque des revendications 8 à 15 et en mesurant l'activité du récepteur ou le signal du gène rapporteur, la détection de cette activité ou de ce signal indiquant la présence dans la préparation d'un contaminant qui est un agoniste du récepteur.
19. 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le procédé permet la quantification de peptidoglycanes (PGN) dans lequel la lignée cellulaire mise en oeuvre permet de détecter l'activité d'un récepteur TLR2.
20. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que, dans la lignée cellulaire, un gène rapporteur est sous la dépendance directe de la voie de signalisation associée au récepteur de l'immunité TLR2.