FR2959416A1 - Utilisation d'anticorps anti-cd71 pour la preparation d'un medicament - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un anticorps monoclonal anti-CD71 ou d'un fragment d'un susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes.

Description

Utilisation d'anticorps anti-CD71 pour la préparation d'un médicament La présente invention concerne l'utilisation d'anticorps anti-CD71 ou des fragments d'anticorps anti-CD71 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancers. Le CD71 est une glycoprotéine de type II qui existe sous forme d'un homodimère de 180 kDa. Le CD71 est un récepteur de la transferrine, une protéine responsable du transport du fer de l'intestin vers les réserves hépatiques et vers les réticulocytes. La ferrotransferrine, transferrine associée à Fe3+, est liée au CD71 à pH neutre, et est internalisée au compartiment endosomal à environ pH5. Les ions Fe3+ sont ensuite transportés vers le cytoplasme par un mécanisme inconnu. Après la libération des ions Fe3+, l'apotransferrine, transferrine sans Fe3+, reste fixée au CD71 à pH5 et retourne vers la membrane cellulaire à environ pH7,4. Aux conditions de pH neutre, l'apotransferrine n'a plus d'affinité pour le CD71. La dissociation du complexe formé par l'apotransferrine et le CD71 permet de commencer un autre cycle de transport. Le CD71 joue un rôle important dans la prolifération de cellules, car il contrôle la consommation du fer, un processus essentiel dans plusieurs voies métaboliques. Ce contrôle est mis en oeuvre par la liaison et l'endocytose de la transferrine par CD71. L'expression de CD71 est régulée post-transcriptionnellement par la stabilité de l'ARN de CD71, et le niveau intracellulaire du fer. A la présence d'un signal de la déficience en fer, IRP-1 et IRP-2 (iron response protein) se fixent sur des séquences spécifiques, désignées IREs (iron response elements), situées dans la région 5'UTR d'ARN du CD71. Cette fixation stabilise l'ARN de CD71. En revanche, lorsque le niveau du fer est suffisamment haut, l'affinité du IRP-1 et IRP-2 pour les IREs est diminuée et l'ARN de CD71 devient plus sensible à la dégradation par les RNases. Le myélome, connu également sous le nom de myélome multiple, ou maladie de Kahler, est un cancer des plasmocytes. Ceux-ci sont produits dans la rate et migrent dans la moelle osseuse. Les plasmocytes sont des lymphocytes B spécialisés qui produisent normalement les anticorps. Les plasmocytes normaux sont caractérisés par une incapacité de prolifération.

Néanmoins, lorsque ces cellules deviennent malignes, elles acquièrent une grande capacité de prolifération et sécrètent tous un même type d'immunoglobuline. Dans la plupart des cas, cette immunoglobuline est IgG ou IgA, mais elle peut être aussi IgD, IgE ou IgM. Par conséquent, le sang ou les urines des patients atteints d'un myélome présentent souvent une très grande quantité d'un seul type d'anticorps appelé paraprotéine. Lorsqu'un échantillon du sang ou d'urine d'un tel patient est analysé par électrophorèse, ces paraprotéines forment souvent un pic monoclonal. Parfois, au lieu de la sécrétion d'une immunoglobuline complète, les plasmocytes tumoraux sécrètent une partie incomplète de l'immunoglobuline dite « chaînes légères Kappa ou Lambda ». Dans ce dernier cas, il y a peu ou pas de pic monoclonal dans le sang, par contre il existe une hypogammaglobulémie sévère et une protéinurie dans les urines, faite de chaîne Kappa ou Lambda, nommée « BENCE JONES ». En France, l'incidence de cette maladie est d'environ 4000 nouveaux cas par an. La survie moyenne est de 5 ans, mais elle dépend du stade de la maladie. Les myélomes peuvent être divisés en 3 stades selon la classification de Durie et Salmon établie en 1986. Cette classification est basée sur la quantité de paraprotéine produite, la gravité de la lésion osseuse, le taux de calcium sanguin et l'insuffisance de production médullaire (hémoglobine). Le stade I correspond à un myélome de faible masse tumorale, alors que le stade III est un myélome de forte masse tumorale. Une éventuelle atteinte de la fonction rénale ajoute une sous classification, dans laquelle le stade A ne présente pas d'atteinte rénale et le stade B est caractérisé par une insuffisance rénale. Dans les dernières années, les nouveaux systèmes de classifications basés sur la détection de marqueurs génétiques permettent de préciser davantage le pronostic sur la survie d'un patient. Par exemple, la délétion du chromosome 13q (Fonseca et al., Blood 2003 ; 101 : 4569-4575) ou du locus 17p13 (locus pour un gène suppresseur de tumeurs) (Avet-Loiseau et al., Blood 2007 ; 109: 3489-3495) dans les plasmocytes peuvent annoncer un très mauvais pronostic. Le traitement classique du myélome repose principalement sur un traitement par chimiothérapie, qui a pour objectif de contrôler la prolifération des cellules tumorales. Actuellement, des agents chimiothérapeutique utilisés dans le traitement de myélomes sont des agents alkylants, comme le melphalan ou le cyclophosphamide, combinés souvent à des médicaments à la cortisone, tels que le prédnisone, ou des inhibiteurs des protéasomes, tels que le bortézomib (Velcade®), ou bien des agents anti-angiogéniques, tels que le thalidomide. Bien que ces médicaments aient apporté une certaine prolongation de survie des patients, les effets secondaires entraînés par ceux-ci sont aussi considérables. De plus, ces médicaments peuvent rarement apporter une guérison durable. Une autre approche de traitement de myélomes fait appel aux techniques d'autogreffe de cellules souches. Ces techniques consistent en l'utilisation des cellules souches saines provenant du sang périphérique ou de la moelle osseuse du sujet lui-même. Les cellules souches ainsi récupérées peuvent être congelées jusqu'au moment d'utilisation et ensuite décongelées et réinjectées ou retransplantées dans le corps du patient par voie intraveineuse. Environ deux semaines après l'injection, les cellules souches peuvent commencer à produire de nouvelles cellules sanguines et à régénérer la moelle osseuse. Au cours de ces 10 dernières années, l'autogreffe de cellules souches est devenue un traitement privilégié. Car, si les patients sont aptes à supporter ce traitement, cette méthode permet de donner une meilleure survie de ces patients. Cependant, étant donné qu'une autogreffe de cellules souches est souvent combinée avec une chimiothérapie avant la greffe, à haute dose, cette méthode peut entraîner des effets secondaires très graves, tels qu'une forte diminution des globules blancs. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouveaux médicaments ou nouvelle approches afin d'augmenter la survie des patients atteints des myélomes. Un premier aspect de l'invention a pour objectif de proposer un nouveau médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes. Un autre aspect de l'invention a pour but de fournir une méthode diagnostic in vitro de myélomes.

La présente invention concerne l'utilisation d'un anticorps monoclonal anti-CD71 ou d'un fragment d'un susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : - au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 13, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes. La présente invention repose sur une constatation inattendue faite par les Inventeurs, lors d'une étude sur le niveau d'expression du CD71 sur des lignées cellulaires tumorales de myélomes. En effet, le CD71 est surexprimé sur les plasmocytes qui deviennent malins. L'invention montre à la fois in vitro et in vivo que le blocage du CD71 par un anticorps anti-CD71 permet d'inhiber le développement de myélomes et de prolonger la survie des souris portant un myélome.

Plusieurs schémas de mécanismes peuvent être impliqués dans l'inhibition de développement de myélomes par un anticorps anti-CD71. Le premier mécanisme est l'inhibition de prolifération de cellules myélomeuses par blocage de la fourniture du fer aux cellules tumorales par intermédiaire de l'anticorps anti-CD71.

Un anticorps anti-CD71 peut également déclencher ou activer une réponse immunitaire, telle que la production des cytokines, ou l'induction d'une apoptose dans les cellules tumorales, cela permettant de détruire les cellules cancéreuses. Les cellules myélomeuses peuvent aussi être éliminées spécifiquement par des cellules 5 effectrices par le processus ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) ou CDC (complement-dependent cytotoxicity). Dans l'invention, le terme « anticorps » se réfère à une immunoglobuline, protéine multimérique constituée de 4 chaines participant à la réponse immunitaire acquise. Les immunoglobulines sont bien connues de l'homme de métier et sont constituées d'un 10 assemblage de deux dimères constitués chacun d'une chaine lourde et d'une chaine légère. Le complexe multimérique est assemblé par la liaison d'une chaine légère et d'une chaine lourde par un pont disulfure entre deux cystéines, les deux chaines lourdes étant elle-même également reliées entre elles par deux ponts disulfure. Chacune des chaines lourdes et des chaines légères est constituée d'une région constante 15 et d'une région variable. L'assemblage des chaines qui composent un anticorps permet de définir une scture tridimensionnelle caractéristique en Y, où - la base du Y correspond à la région constante Fc qui est reconnue par le complément et les récepteurs Fc, et - l'extrémité des bras du Y correspond à l'assemblage respectif des régions variables de 20 la chaine légère et variable de la chaine lourde. Plus précisément, chaque chaine légère est constituée d'une région variable (VL) et d'une région constante (CL). Chaque chaine lourde est constituée d'une région variable (VH) et d'une région constante constituée de trois domaines constants CH1, CH2 et CH3. L'association des deux domaines CH2 et CH3 compose le domaine Fc. 25 La région variable de la chaine légère est constituée de trois domaines déterminant la reconnaissance de l'antigène (CDR) entourées de quatre domaines charpentes (FR). Le repliement tridimensionnel de la région variable est tel que les 3 CDR sont exposés du même coté de la protéine et permettent la formation d'une structure spécifique reconnaissant un antigène déterminé. 30 L'expression « la capacité de se lier à l'antigène CD71 » signifie la capacité d'un anticorps de reconnaître et de se fixer de manière spécifique sur un antigène. Cette spécificité est conférée par la région variable de la chaîne légère ou de la chaîne lourde.

La capacité d'un anticorps de reconnaître et de se fixer de manière spécifique sur un antigène peut être testée par les techniques telles que l'ELISA, l'immunofluorescence indirecte, ou le western-blot. «Un fragment d'un susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71 » peut être un 5 fragment Fab, F(ab)'2, scFV, dimère de ScFv ou encore un diabody, un triabody ou un tetrabody Un fragment Fab est constitué d'une chaine légère comprenant une région constante d'une chaîne légère d'une immunoglobuline humaine et d'une région variable d'une immunoglobuline murine, et d'une chaine lourde comprenant une région constante d'une 10 chaine lourde d'une immunoglobuline humaine et d'une région variable d'une immunoglobuline murine. Un fragment F(ab)'2 est constitué de l'association par un pont disulfure de deux Fab décrits ci-dessus. Un fragment scFv est constitué de l'association d'une fragment variable de chaine 15 lourde et d'un fragment variable de chaine légère d'une immunoglobuline. Un dimère de ScFv est constitué de deux fragments ScFv liés covalemment, chaque ScFv étant eux même constitués d'un fragment variable d'une chaine lourde et d'un fragment variable d'une chaine légère. Un diabody est constitué de l'association non covalente de deux polypeptides contenant 20 eux-mêmes deux chaines variables de même nature (VL-VL et VH-VH) qui peuvent être de même spécificité ou de spécificité différentes. De la même manière, un triabody ou un tétrabody peut être constitué. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps monoclonal anti-CD71 ou d'un fragment d'un susdit anticorps capable de se lier à l'antigène 25 CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : - au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés codée par une séquence nucléique SEQ ID NO : 3, et - au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés codée par une séquence nucléique choisie parmi SEQ ID NO : 4 et 30 SEQ ID NO : 12, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes. Dans la présente invention, la séquence nucléique SEQ ID NO : 3 code la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1. Les séquences nucléiques SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 12 codant respectivement les séquences d'acides aminés SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 11.

La séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 13 est codée par la séquence nucléiques SEQ ID NO : 15.

Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps anti-CD71 tel que défini ci-dessus, où les régions constantes desdites chaînes légères et chaînes lourdes sont des régions constantes d'un anticorps humain. Ledit anticorps humain peut être un anticorps de type IgG, IgA, IgD, IgE, IgM. Ce mode de réalisation de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration 10 thérapeutique ou prophylactique chez l'homme. La région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est notamment la région constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgD, IgE, IgAl ou IgA2 humain. De manière avantageuse, la région constante de chacune des chaînes lourdes de 15 l'anticorps selon l'invention est la région constante d'une immunoglobuline humaine de type G1, car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC chez le plus grand nombre d'individus (humains). Avantageusement, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est la région constante de la chaîne x (kappa) ou X (lambda). 20 Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps anti-CD71 défini précédemment, dans lequel : - au moins la région constante d'une chaîne légère comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 14 25 - au moins la région constante d'une chaîne lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps anti-CD71 tel que défini ci-dessus, dans lequel : - au moins la région constante d'une chaîne légère comprend ou est constituée de la 30 séquence d'acides aminés codée par la séquence nucléique SEQ ID NO : 8, - au moins la région constante d'une chaîne lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés codée par une séquence nucléique choisie parmi SEQ ID NO : 7 ou SEQ ID NO: 10.

Dans la présente invention, la séquence nucléique SEQ ID NO : 8 code la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6. Les séquences nucléiques SEQ ID NO : 7 et SEQ ID NO : 10 codent respectivement les séquences d'acides aminés SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 9. La séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14 est codée par la séquence nucléique SEQ ID NO : 16.

Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CD71 pour la mise en oeuvre de l'invention peut être un anticorps où : - la région variable de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la 10 séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et - la région variable de chacune de ses chaînes lourdes comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - la région constante de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14, et 15 - la région constante de chacune de ses chaînes lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9.

Avantageusement, l'anticorps anti-CD71 pour la mise en oeuvre de l'invention est produit par l'hybridome BAl20g, déposé le 14 juin 2005 à la CNCM sous le numéro CNCM 20 I-3449.

Un anticorps monoclonal anti-CD71 pour la mise en oeuvre de la présente invention peut être produit par des méthodes conventionnelles connues de l'homme du métier, par exemple, la construction d'un vecteur d'ADN qui exprime : 25 - la chaîne lourde, ou - un fragment de la chaîne lourde, ou - la chaîne légère, ou - un fragment de la chaîne légère, ou - la chaîne lourde et la chaîne légère, ou 30 - un fragment de la chaîne lourde et un fragment de la chaîne légère. Ces vecteurs sont par exemple les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures, les chromosomes artificiels de bactéries et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage Pl, les vecteurs dérivés de virus.

Dans un mode de réalisation de l'invention, un fragment d'un anticorps anti-CD71 mis en oeuvre dans l'utilisation décrite ci-dessus peut être Fab, F(ab)'2, scFV, dimère de ScFv ou encore un diabody, un triabody ou un tétrabody. Ces fragments peuvent être des fragments recombinants, synthétiques, ou produits par clivage enzymatique selon les méthodes connues de l'homme du métier. Ces fragments peuvent aussi être produits par introduction d'un ou plusieurs codons stop dans le gène codant d'un anticorps anti-CD71. Par exemple, lorsqu'un codon stop est introduit après le domaine CH1 du gène codant la chaîne lourde, la chaîne ainsi produite est une chaîne lourde apte à former un fragment Fab avec une chaîne légère. En revanche, si un codon stop est ajouté après la région hinge située en aval du domaine CH1 d'une chaîne lourde, cette chaîne tronquée pourra constituer un fragment F(ab)'2 avec une chaîne légère.

Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'anticorps anti-CD71 mis en oeuvre dans l'utilisation décrite ci-dessus est couplé à une molécule bioactive.

Cette molécule bioactive peut être un radio-isotope, par exemple un émetteur des rayonnements gamme, un émetteur des rayonnements beta ou un émetteur des rayonnements alpha. Avantageusement, un radio-isotope couplé à l'anticorps anti-CD71 ou un fragment de l'anticorps anti-CD71 est un radio-isotope apte à être utilisé dans un but thérapeutique ou diagnostique, tel que Actinium 225, Actinium 227, Arsenic 72, Astate 211 (TEP (Tomographie par émission de positons)), Bismuth 212 ou 213, Brome 75 (TEP), Brome 77, Cobalt 55 (TEP), Cuivre 61 (TEP), Cuivre 64 (TEP et traitement), Cuivre 67(TEP), Iode 123 (TEP), Iode 131, Lutétium 177(TEP et traitement), Osmium 194, Radon 223, Rhénium 186, Ruthénium 105, Terbium 149, Thallium 228 et 229, Yttrium 90 et 91.

Ces radio-isotopes peuvent être directement liés à l'anticorps ou par l'intermédiaire d'un chélateur, tel que DTA (9,10-dithioanthracene), ou DTPA (diéthylène triamine penta acide). Une molécule bioactive peut être aussi un métal non-radioactif. Ladite molécule bioactive peut être aussi : - une toxine, par exemple la ricine, l'abrine, la toxine diphtérique, la protéine 30 antivirale de Phytolacca, ou un fragment fonctionnel d'une toxine ; - un acide nucléique tel qu'un ARN anti-sens, un siARN, ou un miARN ; - un agent cytotoxique, par exemple la mitomycine C, le méthotrexate, l'adriamycine, la doxorubicine, la daunorubicine, la vinblastine, la bléomycine, le taxol, la taxotere, la navelbine ; - une enzyme telle qu'une RNase ; - un vecteur galénique, par exemple des liposomes, des nanoparticules, des polymères, des émulsions cationiques, des émulsions anioniques, des émulsions neutres, ou des dendritomes ; - un autre anticorps ou un fragment d'un autre anticorps qui reconnaît un antigène autre que le CD71 ; - la biotine, l'avidine ou la streptavidine. Une molécule bioactive susmentionnée peut être directement liée à l'anticorps ou par intermédiaire d'un linker.

Un aspect particulier de l'invention concerne l'utilisation - d'un anticorps monoclonal anti-CD71 ou d'un fragment d'un susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : - au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 13 , et - des cellules effectrices, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes. Des cellules effectrices sont utilisées simultanément avec l'anticorps anti-CD71 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes. Ces cellules effectrices sont des cellules capables d'exprimer des récepteurs du domaine Fc, telles que des lymphocytes T humains, des lymphocytes NK humains, des monocytes humains, les granulocytes humains, ou des macrophages humains. L'interaction du récepteur de Fc sur les cellules de effectrices avec le domaine Fc de l'anticorps anti-CD71 permet d'induire une activité ADCC visant les cellules cibles, c'est-à-dire les cellules reconnues par l'anticorps spécifique, et de les éliminer par la suite.

Des cellules effectrices peuvent être des cellules autologues ou allogéniques. Avantageusement, des cellules effectrices sont des cellules provenant d'un patient ayant besoin d'un traitement de myélomes.

Des cellules effectrices sont séparées du sang périphérique prélevé d'un donneur ou d'un patient selon les méthodes conventionnelles bien connues de l'homme du métier (Boyum et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1976. 5:9-15). Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps anti-CD71 décrite ci-dessus et des cellules effectrices pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes, dans laquelle les régions constantes des chaînes légères et chaînes lourdes dudit anticorps sont des régions constantes d'un anticorps humain. Dans un mode de réalisation plus avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps anti-CD71 décrite ci-dessus et des cellules effectrices pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes, dans laquelle: - au moins la région constante d'une chaîne légère comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14, - au moins la région constante d'une chaîne lourde comprend ou est constituée de la 15 séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9.

Dans un mode de réalisation plus avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps anti-CD71 décrite ci-dessus et des cellules effectrices pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes, dans laquelle: 20 - la région variable de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et - la région variable de chacune de ses chaînes lourdes comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - la région constante de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la 25 séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14, et - la région constante de chacune de ses chaînes lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9.

Plus avantageusement, l'invention concerne l'utilisation des cellules effectrices et d'un 30 anticorps anti-CD71 produit de l'hybridome BAl20g, déposé le 14 juin 2005 à CNCM sous le numéro CNCM I-3449, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes.

Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps anti-CD71 décrite ci-dessus et des cellules effectrices pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes, dans laquelle l'anticorps est couplé à une molécule bioactive choisi parmi : - les radio-isotopes, - métaux non-radioactifs, - toxines choisies parmi la ricine, l'abrine, la toxine diphtérique, - les acides nucléiques choisis parmi les ARNs anti-sens, - les agents cytotoxiques choisis parmi la mitomycine C, le méthotrexate, 1' adriamycine, - les enzymes telles que les RNases, - la biotine, l'avidine ou la streptavidine.

Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps anti-CD71 décrit ci-dessus est destiné à la prévention ou au traitement d'un myélome choisi parmi le myélome de stade I (faible mass tumorale), le myélome de stade II (mass tumorale intermédiaire), ou le myélome de stade III (forte masse tumorale). La classification des myélomes est basée sur les critères établis par Docteur Durie et Docteur Salmon en 1986. Il s'agit d'une classification en fonction de la quantité de paraprotéine produite, la gravité de lésion osseuse, le taux de calcium sanguin et l'insuffisance de production médullaire (hémoglobine). Le stade I correspond à un myélome de faible masse tumorale, dans lequel touts les critères suivants sont présents : - Hémoglobine > 100 g/1 - Calcémie < 120 mg/1 (3 mmol/1) - Absence de lésion osseuse ou un plasmocytome osseux isolé - Taux d'Ig monoclonale faible : * IgG< 50 g/l * IgA < 30 g/l * Protéinurie de Bence Jones < 4 g/24 H. Le stade II ne répond pas à la définition ni du stade I, ni du stade III. Le stade III est un myélome de forte masse tumorale, qui présent d'au moins un des critères suivants : - Hémoglobine < 8,5 g/dl - Calcémie > 120 mg/1(>3 mmol/1) - Lésions osseuses multiples (> 3) - Taux élevé d'Ig monoclonale : * IgG > 70 g/l 5 * IgA > 50 g/l * Protéinurie de Bence Jones > 12 g/24 H

Un autre aspect de la présente invention a pour objet de proposer un anticorps anti-CD71 pour le traitement de myélomes. 10 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment d'un susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant - au moins la région variable d'une chaînes lourde comprenant ou constituée de la séquence 15 d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 13, pour le traitement de myélomes. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un anticorps monoclonal anti-20 CD71 ou d'un fragment d'un susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : - au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés codée par une séquence nucléique SEQ ID NO : 3, et - au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une 25 séquence d'acides aminés codée par une séquence nucléique choisie parmi SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 12, pour le traitement de myélomes. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un anticorps anti-CD71 pour le traitement de myélomes, dans lequel les régions constantes des dites chaînes légères et 30 chaînes lourdes sont des régions constantes d'un anticorps humain. Dans un mode de réalisation plus avantageux, l'invention concerne un anticorps anti-CD71, dans lequel : - au moins la région constante d'une chaîne légère comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14, - au moins la région constante d'une chaîne lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9, pour le traitement de myélomes. Dans un autre mode de réalisation plus avantageux, l'invention concerne un anticorps anti-CD71, dans lequel : - au moins la région constante d'une chaîne légère comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés codée par la séquence nucléique SEQ ID NO : 8, - au moins la région constante d'une chaîne lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés codée par une séquence nucléique choisie parmi SEQ ID NO : 7 ou 10 SEQ ID NO : 10, pour le traitement de myélomes.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un anticorps anti-CD71, dans lequel : 15 - la région variable de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et - la région variable de chacune de ses chaînes lourdes comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - la région constante de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la 20 séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14, et - la région constante de chacune de ses chaînes lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9, pour le traitement de myélomes.

25 Dans un mode de réalisation avantageux, l'anticorps mis en oeuvre pour le traitement de myélome est produit d'un hybridome BAl20g, déposé le 14 juin 2005 à CNCM sous le numéro CNCM I-3449.

L'anticorps anti-CD71 décrit ci-dessus et destiné au traitement de myélomes peut être 30 associé avec les récipients ou les véhicules pharmaceutiquement acceptable. L'anticorps anti-CD71 décrit ci-dessus et destiné au traitement de myélomes peut être administré par voie intraveineuse, par exemple par injection ou perfusion. Dans un mode de réalisation particulier, un anticorps anti-CD71 décrit ci-dessus pour le traitement de myélomes, est couplé à une molécule bioactive choisi parmi : - les radio-isotopes, - métaux non-radioactifs, - toxines choisies parmi la ricine, l'abrine, la toxine diphtérique, - les acides nucléiques choisis parmi les ARNs anti-sens, - les agents cytotoxiques choisis parmi la mitomycine C, le méthotrexate, 1' adriamycine, - les enzymes telles que les RNases, - la biotine, l'avidine ou la streptavidine Un autre aspect de l'invention concerne un produit contenant: - au moins un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment du susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : * au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et * au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 11, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit contenant: - au moins un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment du susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : * au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et * au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 13, et * les régions constantes des chaînes légères et chaînes lourdes provenant d'un anticorps humain, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné , comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit contenant: - au moins un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment du susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : * au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et * au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 13, et * au moins la région constante d'une chaîne légère comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 14, * au moins la région constante d'une chaîne lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné , comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit contenant: - au moins un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment du susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : * la région variable de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la 25 séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et * la région variable de chacune de ses chaînes lourdes comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et * la région constante de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14, et 30 * la région constante de chacune de ses chaînes lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné , comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit contenant: - l'anticorps anti-CD71 produit d'un hybridome BAl20g, déposé le 14 juin 2005 à 5 CNCM sous le numéro CNCM I-3449, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné , comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un 10 produit contenant : - l'anticorps anti-CD71 produit d'un hybridome BAl20g, déposé le 14 juin 2005 à CNCM sous le numéro CNCM I-3449, et - Velcadé .

15 Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un produit contenant: - au moins un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment du susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : * au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la 20 séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et * au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 13, - des cellules effectrices, et 25 - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné , comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit contenant : 30 - au moins un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment du susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : * au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et * au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 13, et * les régions constantes des chaînes légères et chaînes lourdes provenant d'un anticorps humain, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné , et - des cellules effectrices, comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit contenant: - au moins un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment du susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : * au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et * au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 11, et * au moins la région constante d'une chaîne légère comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 14, * au moins la région constante d'une chaîne lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné , - des cellules effectrices, comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un produit contenant: - au moins un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment du susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : * la région variable de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et * la région variable de chacune de ses chaînes lourdes comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et * la région constante de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14, et * la région constante de chacune de ses chaînes lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné , et - des cellules effectrices, comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le 10 temps en thérapie tumorale.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne un produit contenant: - l'anticorps anti-CD71 produit d'un hybridome BAl20g, déposé le 14 juin 2005 à 15 CNCM sous le numéro CNCM I-3449, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcadé , Melphalari , Prednisoné , - des cellules effectrices, comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale. 20 Un autre aspect de l'invention a pour objectif de fournir une méthode de diagnostic in vitro de myélomes. Cette méthode est basée sur la constatation inattendue faite par les Inventeurs que le CD71 est souvent surexprimé sur les cellules myélomateuses. Par conséquent, la 25 surexpression de CD71 sur les plasmocytes peut signifier que ces cellules deviennent malignes. Cette méthode comprend : (i) l'incubation d'un échantillon cellulaire prélevé d'un patient suspecté de présenter un myélome, avec un anticorps anti-CD71 ou d'un fragment d'un susdit anticorps capable de 30 se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : - au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 13, (ii) la mesure de la quantité d'antigènes CD71 présents sur la surface de cellules présentes dans ledit échantillon, (iii) la comparaison de la valeur obtenue dans l'étape précédente avec une valeur de référence établie dans un échantillon cellulaire sain.

Avantageusement, l'anticorps anti-CD71 utilisé dans cette méthode est un anticorps dans lequel : - la région variable de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2, et - la région variable de chacune de ses chaînes lourdes comprend ou est constituée de la 10 séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - la région constante de chacune de ses chaînes légères comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 14, et - la région constante de chacune de ses chaînes lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9. 15 Plus avantageusement, l'anticorps anti-CD71 utilisé dans cette méthode est produit d'un hybridome BAl20g, déposé le 14 juin 2005 à CNCM sous le numéro CNCM I-3449.

L'anticorps anti-CD71 utilisé dans cette méthode peut être utilisé directement ou couplé avec un marqueur. 20 Lorsque cet anticorps est utilisé directement, la présence de cet anticorps peut être détectée par un autre anticorps de détection, ce dernier étant lié à un marqueur, tel qu'un agent radioactif, ou une enzyme capable de catalyser un substrat émettant une radiation par fluorescence ou capable d'émettre une radiation à une longueur d'onde différente de celle d'absorption, ou tout autre marqueur permettant de détecter la fixation de l'anticorps de 25 détection sur l'anticorps anti-CD71. L'anticorps anti-CD71 mis en oeuvre dans cette méthode peut être couplé préalablement avec un marqueur permettant de détecter la fixation de cet anticorps sur les plasmocytes. Ce marqueur peut être un agent radioactif, ou une enzyme capable de catalyser un substrat émettant une radiation par fluorescence ou capable d'émettre une radiation à une longueur 30 d'onde différente de celle d'absorption, ou tout autre marqueur permettant de détecter la fixation de l'anticorps anti-CD71 sur les plasmocytes. L'invention est illustrée par les exemples et les figures suivantes. Les exemples ci-après visent à éclaircir l'objet de l'invention et illustrer des modes de réalisation avantageux, mais en aucun cas ne vise à restreindre la portée de l'invention.

Figure 1 : la figure 1 représente une courbe de calibration pour mesurer la capacité d'un anticorps à se fixer sur des cellules. L'axe des abscisses représente le logarithme de MFI (mean fluoresence intensity) d'anticorps secondaire couplé. L'axe des ordonnées représente le logarithme de la capacité d'un anticorps à se fixer sur des cellules. Les croix représentent les données réellement obtenues par la mesure. Figure 2 : la figure 2 représente la mesure de la survie de souris testées dans 5 groupes. Le groupe 1 (carré en noir) ne reçoit rien. Le groupe 2 (point noir) reçoit un anticorps irrelevant à 0.048 mg/kg/injection. Le groupe 3 (triangle) reçoit un anticorps irrelevant à 0.24 mg/kg/injection. Le groupe 4 (triangle inverse) reçoit de l'un anticorps anti-CD71 à 0.048 mg/kg/injection. Le groupe 5 (carré vide) reçoit de l'un anticorps anti-CD71 à 0.24 mg/kg/injection. L'axe des abscisses représente le nombre de jours après l'injection de cellules tumorales. L'axe des ordonnées représente le pourcentage de souris vivantes. Figure 3 : la figure 3 représente la mesure de la survie de souris testées dans 5 groupes. Le groupe 1 (carré en noir) reçoit deux fois par semaine une injection de 1,2 mg d'un anticorps irrelevant. Le groupe 2 (point noir) reçoit deux fois par semaine une injection de 1,2 mg de l'anticorps anti-CD71. Le groupe 3 (triangle) reçoit deux fois par semaine une injection de 1,2 mg de l'anticorps anti-CD71 et une injection de 0,5 mg/kg de VELCADE®. Le groupe 4 (triangle inverse) reçoit deux fois par semaine une injection de 0,5 mg/kg de VELCADE®. Le groupe 5 (carré vide) ne reçoit aucun traitement. L'axe des abscisses représente le nombre de jours après l'injection de cellules tumorales. L'axe des ordonnées représente le pourcentage de souris vivantes.

RESULTAT 1. Détection de l'antigène CD71 par l'anticorps anti-CD71 La détection de l'antigène CD71 par l'anticorps anti-CD71 a été mesurée sur la lignée cellulaire ARH-77, une lignée de myélome. Cette lignée cellulaire est cultivée en suspension à 37°C dans une atmosphère humidifiée (5% de CO2, 95% humidité). Le milieu de culture est RPMI (Réf. #BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgique) contenant 2mM L-glutamine et complété par 10% du sérum bovine foetal (Réf. #DE14-801E, Lonza). Une éventuelle contamination de la culture de cellules par des mycoplasmes est détectée à l'aide de MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit (Réf. #LT07-318, Lonza) selon les instructions du fabricant. Ce kit permet de réaliser un test biochimique sélectif qui met en évidence l'activité enzymatique de mycoplasmes. Le surnageant de culture cellulaire est récupéré et testé par MycoAlert® kit. Le test est répété deux fois et le résultat est comparé avec un control négatif et un control positif (Mycoalert® Assay Control Set, Réf. #LO07-518, Lonza). Des mycoplasmes viables sont lysés et des enzymes libérées réagissent avec le substrat de MycoAlert® kit, en catalysant la conversion d'ADP en ATP. La mesure du niveau d'ATP avant et après l'addition de substrat MycoAlert® permet d'obtenir un ratio indiquant la présence ou l'absence de mycoplasmes. La détection d'anticorps anti-CD71 est effectuée par cytométrie en flux (GUAVA Personal Cell Analysis-96 (PCA-96) Systems). Les données obtenues sont analysées par logiciel FCS Express (De Novo Software).

L'anticorps de contrôle négatif est IgGl (MAT002). L'anticorps de contrôle positif est un anticorps anti-CD71 provenant de la société MAT (MAT201). L'anticorps à tester est l'anticorps anti-CD71 produit par l'hybridome BAl20g, dilué à 10µg/ml, 1µg/ml, 0,1µg/ml, 0,05µg/ml, 0,01µg/ml, 0,005µg/ml. L'anticorps secondaire couplé est un anticorps anti-souris IgG PE. Le tampon de dilution et de lavage (PBS (tampon phosphate salin) 2% SVF (sérum de veau foetal)) est préparé à partir de 490m1 de PBS (wo Ca2+/Mg2+) et 10ml de SVF décomplémenté. PBS (Cambrex Biowhittaker BE 17-516F) est conservé à température ambiante jusqu'à l'utilisation. SVF (Cambrex Ref5SB0008) est conservé à -20°C jusqu'à l'utilisation. Le bleu de Trypan (Sigma T8154) est conservé à température ambiante. La concentration en anticorps de contrôle est de 10µg/ml.

Environ 100 000 cellules dans un volume de l00µ1 sont d'abord incubées respectivement avec l'anticorps anti-CD71 en différente dilution ou l'anticorps de contrôle. Les anticorps anti-CD71 sont ensuit révélés par un anticorps secondaire couplé à un agent fluorescent (anti-souris IgG-PE 1/100). Les résultats sont présentés dans le tableau 1 suivant. Tableau 1 Anticorps primaire CD71-% CD71+% MFI - 94,8 5,2 6,2 IgGl contrôle 10 µg/ml 96,3 3,7 4,9 Anti-CD7110µg/ml 5,3 94,7 32,4 Anti-CD711µg/ml 10,6 89,4 28,8 Anti-CD710,1µg/ml 25,2 74,8 17,6 Anti-CD710,05µg/ml 34,3 65,7 12,7 Anti-CD710,01µg/ml 59,9 40,1 6,6 Anti-CD710,005µg/ml 70,0 30,0 5,6 L'anticorps anti-CD71 peut se fixer spécifiquement sur la membrane cellulaire des cellules ARH-77 par rapport à l'anticorps de contrôle IgGl. Lorsque la concentration en anticorps anti-CD71 est supérieure à 1µg/ml, cet anticorps peut reconnaître environ 90% de cellules ARH-77 dans l'échantillon.

2. Détermination du nombre des antigènes CD71 sur la surface de cellules ARH-77 Le nombre des antigènes CD71 sur la surface de cellules de ARH-77 est déterminé par immunofluorescence indirecte à l'aide de kit QIFIKIT (Dakocytomation, Trappes, France) selon les instructions du fabricant. Le résultat de l'immunofluorescence est détecté par cytométrie en flux. Les cellules ARH-77 sont d'abord incubées respectivement avec l'anticorps anti- CD71 purifié à partir de l'hybridome BAl20g et un anticorps irrelevant (anti-souris IgGl) comme contrôle négatif. Les particules blanches fournies dans le kit sont utilisées pour établir le bruit de fond. Quatre populations de particules de référence, présentant un nombre différent d'anticorps de contrôle, sont utilisées pour établir la courbe de calibration. Les anticorps se fixant sur les cellules sont ensuite révélés par un deuxième anticorps couplé avec un agent fluorescent (anti-souris IgG-FITC). Les MFI (mean fluorescence intensity) mesurées pour les quatre populations de particules de référence permettent d'établir une courbe de calibration (figure 1). Cette courbe se varie selon l'appareil utilisé. Dans la présente expérience, la formule correspond à cette courbe est la suivante : Y=A*X2+B*X+C, dans laquelle : - A égale 0,013248 ; - B égale 449,282318 ; - C égale -31,588965 ; - X est MFI (mean fluorescence intensity) issue de la lecture de cytométrie en flux ; - Y est la capacité totale d'un anticorps de se fixer sur une population de cellules. On obtient la capacité d'anticorps anti-CD71 à se fixer de manière spécifique sur les cellules ARH-77 (SABC) selon la formule suivante : SABC=ABC-BAE, dans laquelle BAE représente le bruit de fond et ABC est la capacité de l'anticorps anti-CD71 à se fixer sur les cellules ARH-77. Le bruit de fond est la capacité d'un anticorps irrelevant à se fixer de manière non spécifique sur les cellules. Le tableau 2 suivant montre le résultat de la détermination du nombre de CD71 sur ARH-77.

Tableau 2 Anticorps MFI ABC BAE SABC IgGl contrôle 5µg/ml 5,2 - 2287 Anti-CD71 99,6 44826 - 42539 3. Test in vivo de l'efficacité anti-tumorale de l'anticorps anti-CD71 chez les souris à immunodéficience sévère combinée 3.1 Effet de l'anticorps anti-CD71 sur le poids des souris portant des cellules tumorales ARH-77

Les souris femelles à immunodéficience sévère combinée (SCID), âgées de 6 à 7 semaines, pesant de 16 à 20 g sont obtenues de Charles River (France). Les souris utilisées dans les expériences sont d'abord observées pendant 7 jours dans une unité de soin pour animaux exempt d'organismes pathogènes spécifiques (EOPS). Cette unité de soin pour animaux est autorisée par le ministère de l'agriculture et le ministère de la recherche français (Agreement No.A21231011). Les expériences animales sont mises en oeuvre selon la directive européenne sur l'expérimentation animale et la directive de la Grande Bretagne sur le bien- être des animaux utilisés dans la néoplasie expérimentale. Les cellules ARH-77 tumorales exprimant CD71 sur la surface cellulaire sont suspendues dans le milieu RPMI 1640 (Réf. #BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgique) contenant 2mM L-glutamine et complété par 10% du sérum bovine foetal (Réf. #DE14-801E, Lonza). 40 souris femelles à immunodéficience sévère combinée (SCID) ont d'abord subi une injection par la voie intraveineuse d'un volume de 0,2m1 du milieu RPMI 1640 contenant 5 millions de cellules tumorales ARH-77 suspendues. L'injection a été effectuée entre de 24 à 72 heures après l'exposition des souris testées dans cette expérience aux rayonnements gamma (1,8 Gy, 60Co, BioMEP sarl, France).

Le jour d'injection des cellules tumorales est considéré comme le jour 0. Le traitement commence au jour 5.

Les 40 souris sont ensuite séparées en 5 groupes : Le tableau 3 ci-dessous résume le programme de traitement pour chaque groupe.

Tableau 3 Groupe No. de Substance Dose Programme Volume souris testée de traitement d'injection 1 8 Aucun 2 8 Anticorps 0.048 mg/souris/inj Tous les 3 200µL/souris irrelevant jours avec un total de 4 injections 3 8 Anticorps 0,24 mg/souris/inj Tous les 3 200µL/souris irrelevant jours avec un total de 4 injections 4 8 Anticorps 0,048 mg/souris/inj Tous les 3 200µL/souris anti-CD7 1 jours avec un total de 4 injections 8 Anticorps 0.24 mg/souris/inj Tous les 3 200µL/souris anti-CD7 1 jours avec un total de 4 injections Le traitement a lieu aux jours 5, 8, 11 et 14. Les résultats sont présentés sur la figure 2.

Dans le groupe 1 (souris n'ayant reçu aucun traitement), une souris est trouvée morte au jour 28, les 7 autres sont sacrifiées entre le jour 25 et le jour 32 après l'injection des cellules ARH-77, du fait de la présence de signes pathologiques. Dans le groupe 2 (souris ayant reçu l'anticorps irrelevant à 0.048 mg/kg/injection), trois souris sont mortse au jour 35 et, 5 sont sacrifiées entre le jour 29 et 96 après l'injection 15 des cellules ARH-77 et ont été sacrifiées et enfin 2 souris ont été sacrifiées en fin d'étude au jour 106. Dans le groupe 3 (souris ayant reçu l'anticorps irrelevant à 0.24 mg/kg/injection), une souris est morte au jour 28, 6 sont sacrifiées entre le jour 29 et 32 après l'injection des cellules ARH-77 et ont été sacrifiées et enfin 1 souris a été sacrifiée en fin d'étude au jour 106. 20 Dans le groupe 4 (souris ayant reçu l'anticorps anti-CD71 à 0.048mg/kg/injection), une souris est trouvée morte au jour 102, deux sont sacrifiées au jour 57 et 67 car elles 5 présentaient des signes pathologiques et les 5 autres ont survécues à l'étude et sont sacrifiées au jour 106. Dans le groupe 5 (souris ayant reçu l'anticorps anti-CD71 à 0.24 mg/kg/injection) une souris est sacrifiée au jour 43 en raison de la présence de signes pathologiques et les 7 autres survivent à l'étude et sont sacrifiées au jour 106.

Pendant les expériences, les animaux serons tués par dislocation cervicale sous anesthésie par l'isoflurane si l'un des signes suivants présente : - les signes de souffrance (la cachexie, la faiblesse, la difficulté de mouvement 10 et de manger) ; - la toxicité composée (la convulsion) - une perte de 15% de poids corporel pendant 3 jours consécutifs ou de 20% de poids corporel dans une journée. Une autopsie par microscopie est effectuée sur touts les animaux sacrifiés ou morts 15 pendant ces expériences. L'autopsie porte sur le coeur, les poumons, le foie, la rate, le rein, et l'intestin. L'isoflurane forene (Minerve, Bondoufle, France) est utilisé pour anesthésier les souris avant les injections de cellules tumorales par voie intraveineuse et lors du sacrifice des animaux par dislocation cervicale. La viabilité, les signes cliniques et les comportements sont 20 notés chaque jour pendant les expériences. Le poids corporel de chaque souris est mesuré et noté deux fois par semaine.

3.2 Effet de l'anticorps anti-CD71 sur la survie des souris portant des cellules tumorales ARH-77 25 40 souris femelles à immunodéficience sévère combinée (SCID) ont d'abord subi une injection par la voie intraveineuse d'un volume de 0,2m1 du milieu RPMI 1640 contenant Cinq millions de ARH-77 cellules tumorales suspendues. L'injection a été effectuée entre de 24 à 72 heures après l'exposition du corps entier des souris aux rayonnements gamma (1,8 Gy, 60Co, INRA, Dijon, France). 30 Le jour d'injection de cellules tumorales est considéré comme jour 0 (DO). Les traitements par l'anticorps anti-CD71 et par l'anticorps irrelevant débutent au jour J-1. Le traitement par le Velcade® commence au jour 4 et ont donc lieu aux jours J4, J7, J11, J14, J18, J25, J28 et J32. Les 40 souris sont séparées en 5 groupes. Le tableau 4 ci-dessous résume le programme de traitement pour chaque groupe.

Tableau 4 Groupe No. de Substance Dose Programme Volume souris testée de traitement d'injection 1 8 Anticorps 1.2 mg/souris/inj Deux fois 200µL/souris irrelevant par semaine pendant 6 semaines 2 8 Anticorps 1.2 mg/souris/inj Deux fois 200µL/souris anti-CD7 1 par semaine pendant 6 semaines 3 8 Anticorps Anti-CD71 = 1.2 Deux fois Anti-CD71 = anti- mg/souris/inj par semaine 200µL/souris CD71+ Velcade® = 0.5 pendant 6 Velcade = Velcade® mg/kg/inj semaines l0ml/kg (anti-CD71) + deux fois par semaine pendant 4 semaines 4 8 Velcade® 0.5 mg/kg/inj deux fois par Velcade = semaine 10ml/kg pendant 4 semaines 8 aucun Le volume d'injection d'anticorps irrelevant et d'anticorps anti-CD71 est 200µL/souris/injection. Le volume d'injection de Velcade® (l0ml/kg) est ajusté à la plupart des individus.

Les souris survivantes pendant l'expérience sont sacrifiées au bout de 144 jours après l'injection de cellules tumorales. Une autopsie est réalisée sur toutes les souris trouvées mortes ou sacrifiées pendant l'expérience à cause de la présence de l'un des signes pathologiques précisés dans la partie ci-dessus.

Dans le groupe 1 (souris ayant reçu l'anticorps irrelevant), une souris est morte au 281eme jour, 5 souris ont présenté des signes pathologiques entre le 241eme jour et le 561eme jour après l'injection des cellules ARH-77 et ont été sacrifiées et enfin 2 souris ont été sacrifiées en fin d'étude à J144. 5 Dans le groupe 2 (Souris ayant reçu l'anticorps anti-CD71), une souris est trouvée morte au 421e' jour, une est sacrifiée au 98'ème jour car elle présentait des signes pathologiques et les 6 autres ont survécues à l'étude et sont sacrifiées à J144. Dans le groupe 3 (souris ayant reçu l'anticorps anti-CD71 et le Velcade, toutes les 5 souris survivent à l'étude et sont sacrifiées à J144. Dans le groupe 4 (souris ayant reçu le Velcade® seul), 1 souris est morte au 271e' jour, les 7 autres sont sacrifiées en raison de la présence de signes pathologiques entre le jour 24 et le jour 31. Les autopsies révèlent différents signes (tumeurs sur la vessie, l'ovaire, et le rein, petite rate ou encore inflammation sur des ganglions axillaires droits, et sur ganglions 10 inguinaux gauches). Dans le groupe 5 (souris n'ayant reçu aucun traitement), les souris sont sacrifiées entre le jour 24 et le jour 45 du fait de la présence de signes pathologiques.

Les résultats sont présentés sur la figure 3. Le tableau 5 ci-dessous compare la moyenne de survie des souris dans les 5 groupes morts ou sacrifiés avant la fin de l'expérience à cause de la présence des signes pathologiques précisés ci-dessus. Tableau 5 Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 Groupe 4 Groupe 5 G Le nombre de souris 6 2 0 8 8 morts avant la fin d'expérience La moyenne de 41,5 70 - 28,4 29,6 survie Déviation standard 15,3 39,6 - 3,1 7 La médiane de 55 - - 29,5 29 survie 20 Le traitement par l'anticorps anti-CD71 seul permet d'inhiber le développement d'un myélome chez les souris à immunodéficience sévère combinée et de prolonger la survie de souris de 29,6 jours, pour les souris non traitées, à plus de 70 jours pour les souris traitées par l'injection d'anticorps anti-CD71.

25 L'association d'anticorps anti-CD71 avec Velcade® présente un effet synergique sur 15 l'inhibition de développement de myélome et la prolongation de survie de souris atteinte, par rapport à l'utilisation d'anticorps anti-CD71 seul, ou de Velcade® seul (figure 3). Chez toutes les souris ayant reçu ce traitement, cette association a réussi à inhiber le développement de myélome.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation d'un anticorps monoclonal anti-CD71 ou d'un fragment d'un susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps 5 comprenant : - au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 13, 10 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de myélomes.
2. 2. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 2, dans lequel les régions constantes desdites chaînes légères et chaînes lourdes sont des régions constantes d'un anticorps humain. 15
3. 3. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 1 et 2, dans lequel - au moins la région constante d'une chaîne légère comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 14, - au moins la région constante d'une chaîne lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9. 20
4. 4. Utilisation d'un anticorps selon les revendications 1 à 3, dans lequel ledit fragment est Fab, F(ab)'2, Fd, scFV, dimère de ScFv, diabody, triabody ou tetrabody.
5. 5. Utilisation d'un anticorps selon les revendications 1 à 4, dans lequel ledit anticorps ou ledit 25 fragment d'anticorps est couplé à une molécule bioactive choisi parmi : - les radio-isotopes, - métaux non-radioactifs, - toxines choisies parmi la ricine, l'abrine, la toxine diphtérique, - les acides nucléiques choisis parmi les ARNs anti-sens, 30 - les agents cytotoxiques choisis parmi la mitomycine C, le méthotrexate, 1' adriamycine, - les enzymes telles que les RNases, - la biotine, l'avidine ou la streptavidine.
6. 6. Utilisation d'un anticorps selon les revendications 1 à 5, dans lequel le myélome est choisi parmi le myélome de stade I (faible masse tumorale), le myélome de stade II (masse tumorale intermédiaire), le myélome de stade III (forte masse tumorale).
7. 7. Produit contenant: - au moins un anticorps monoclonal anti-CD71 ou un fragment du susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant - au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 13, - un agent anticancéreux choisi parmi Velcade®, Melphalan®, Prednisone®. comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie tumorale.
8. 8. Produit selon la revendication 7, dans lequel les régions constantes des dites chaînes légères et chaînes lourdes sont des régions constantes d'un anticorps humain.
9. 9. Produit selon la revendication 8, dans lequel : - au moins la région constante d'une chaîne légère comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 14, - au moins la région constante d'une chaîne lourde comprend ou est constituée de la séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID NO : 9.
10. 10. Méthode de diagnostic in vitro de myélomes, comprenant : (i) l'incubation d'un échantillon cellulaire prélevé d'un patient suspecté de présenter un myélome, avec un anticorps anti-CD71 ou d'un fragment d'un susdit anticorps capable de se lier à l'antigène CD71, ledit anticorps ou ledit fragment du susdit anticorps comprenant : - au moins la région variable d'une chaîne lourde comprenant ou constituée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, et - au moins la région variable d'une chaîne légère comprenant ou constituée d'une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 13,(ii) la mesure de la quantité d'antigènes CD71 présents sur la surface de cellules présentes dans ledit échantillon, (iii) la comparaison de la valeur obtenue dans l'étape précédente avec une valeur de référence établie dans un échantillon cellulaire sain.