FR2958042A1 - Process for carrying in-vitro evaluation of filling product e.g. collagen, applied on surface of skin of e.g. face of patient, involves measuring physical, chemical or biological parameters of in-vitro dermis or in-vitro skin - Google Patents
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Abstract
Description
L'invention se rapporte au domaine des produits de comblement, et à l'évaluation de leur activité. L'utilisation de produits de comblement (aussi appelés "fillers") s'est développé de façon importante au cours de ces dernières années. Ils représentent une solution alternative intéressante dans le traitement ou la diminution des signes du vieillissement. Les principaux signes cliniques du vieillissement cutané sont notamment l'apparition de ridules et/ou de rides, en augmentation avec l'âge. Ces rides peuvent être profondes, moyennes ou superficielles, et touchent en particulier les sillons nasogéniens, la zone périorbitaire, le contour des lèvres, le front (ride du lion); ces rides et ridules se traduisent par une dépression ou des sillons à la surface de la peau. De plus, on constate avec l'âge une perte de volume de la partie supérieure du visage, notamment au niveau des pommettes et des joues. Par ailleurs, il existe différentes situations où il est souhaitable de remédier à la perte de tissus et de combler des dépressions cutanées telles que des déplétions fibroblastiques, les blessures, l'ablation chirurgicale partielle de tissus (par exemple dans les cas de tumeur), y compris le comblement des « dépressions » cutanées secondaires à la prise d'un traitement entraînant une lipodystrophie qui se caractérise le plus souvent par une lipoatrophie faciale et pour favoriser la cicatrisation. Les produits de comblement sont injectés dans les tissus cutanés ou sous-cutanés, par voie sous-cutanée ou intradermique. Il s'agit ainsi d'implant dermique, c'est-à-dire des substances injectées directement dans la peau en vue de remédier aux désordres intervenant aux différents niveaux cutanés ou sous-cutanés (derme, hypoderme, etc.). Il peut s'agir d'une injection en un site unique, ou dans un nombre de points limité des tissus cutanés ou sous-cutanés. On réalise alors un nappage sous-cutané, sous- dermique et/ou intradermique de ladite composition, précisément au niveau de la zone corporelle à traiter. Ce comblement peut être réalisé par l'utilisation de produits non résorbables, tels que des gels de polyacrylamide ou des particules de polyméthylméthacrylate (PMMA) Néanmoins, ces composés peuvent entrainer des réactions d'intolérance du type inflammation ou hypersensibilité. On privilégie l'utilisation de composants résorbables, tels que les protéines, les graisses le collagène ou l'acide hyaluronique. Mais ces composés sont dégradés assez rapidement dans l'organisme, ce qui réduit leur efficacité. Pour y remédier il faut donc procéder à une réticulation plus ou moins poussée de ces composants.35 Il est donc souhaitable de pouvoir évaluer les propriétés physico-chimiques et/ou les modifications biologiques susceptibles d'être provoquées par l'injection des produits de comblement avant leur utilisation in vivo chez l'homme. The invention relates to the field of fillers, and the evaluation of their activity. The use of fillers (also called "fillers") has developed significantly in recent years. They represent an interesting alternative solution in the treatment or the diminution of the signs of aging. The main clinical signs of skin aging include the appearance of fine lines and / or wrinkles, increasing with age. These wrinkles can be deep, medium or superficial, and particularly affect the nasolabial folds, the periorbital area, the contour of the lips, the forehead (lion's wrinkle); these lines and wrinkles result in depression or furrows on the surface of the skin. In addition, with age, there is a loss of volume of the upper part of the face, especially at the cheekbones and cheeks. In addition, there are various situations where it is desirable to remedy the loss of tissue and to fill skin depressions such as fibroblastic depletions, wounds, partial surgical removal of tissue (for example in tumor cases), including the filling of cutaneous "depressions" secondary to treatment leading to lipodystrophy which is most often characterized by facial lipoatrophy and to promote healing. The fillers are injected into the cutaneous or subcutaneous tissues, subcutaneously or intradermally. This is a dermal implant, that is to say substances injected directly into the skin to remedy disorders occurring at different levels of the skin or subcutaneous (dermis, hypodermis, etc.). It may be an injection into a single site, or in a limited number of points of the cutaneous or subcutaneous tissues. Subcutaneous, subdermal and / or intradermal lapping of said composition is then carried out precisely at the level of the body area to be treated. This filling can be achieved by the use of non-resorbable products, such as polyacrylamide gels or polymethylmethacrylate (PMMA) particles. Nevertheless, these compounds can cause intolerance reactions of the inflammation or hypersensitivity type. The use of absorbable components such as proteins, fats, collagen or hyaluronic acid is preferred. But these compounds are degraded fairly quickly in the body, which reduces their effectiveness. To remedy this, it is necessary to carry out a more or less extensive crosslinking of these components. It is therefore desirable to be able to evaluate the physicochemical properties and / or the biological modifications likely to be caused by the injection of the filling products. before their use in vivo in humans.
Pour des raisons éthiques, il n'est pas souhaitable de tester ce type de produit chez l'animal. L'utilisation d'équivalent de peau à base de biomatériaux connus n'est pas satisfaisante car l'injection de produit de comblement à travers l'équivalent de peau provoque une rupture de l'épiderme et une désorganisation de la structure. En effet, la conception actuelle des équivalents de peau ne permet pas une épaisseur suffisante pour une évaluation d'une quantité moyenne de produit de comblement par la méthode d'injection. For ethical reasons, it is not desirable to test this type of product in animals. The use of skin equivalents based on known biomaterials is not satisfactory because the injection of fillers through the skin equivalent causes rupture of the epidermis and disorganization of the structure. Indeed, the current design of the skin equivalents does not allow sufficient thickness for an evaluation of an average amount of filling product by the injection method.
Le brevet US 4,481,001 décrit un modèle de peau pour tester l'injection intra-dermique d'un produit de comblement tel qu'un collagène réticulé, à base de matériaux synthétiques. Ce modèle comprend une couche élastomère mimant le tissu sous-cutané, un équivalent de derme constitué d'un gel de silicone élastomère et une couche d'élastomère à haut pouvoir tenseur mimant un épiderme. Ce modèle ne contient pas de cellules vivantes et ses constituants étant très différents de ceux de la peau, il ne peut permettre d'anticiper les réactions induites par l'injection de produit de comblement in vivo. U.S. Patent 4,481,001 discloses a skin model for testing intradermal injection of a filler such as cross-linked collagen based on synthetic materials. This model comprises an elastomeric layer mimicking the subcutaneous tissue, a dermis equivalent consisting of an elastomeric silicone gel and a layer of high tensile elastomer mimicking an epidermis. This model does not contain living cells and its constituents being very different from those of the skin, it can not allow to anticipate the reactions induced by the injection of filling product in vivo.
Il existe donc un besoin de disposer d'un modèle tri-dimensionnel in vitro pouvant mimer la réalité cosmétique pour évaluer l'effet des matériaux de comblement aussi bien sur un plan biophysique, biomécanique ou biologique. There is therefore a need to have a three-dimensional model in vitro that can mimic the cosmetic reality to evaluate the effect of filling materials on a biophysical, biomechanical or biological level.
De manière inattendue, il a été trouvé dans le cadre de la présente invention qu'il était possible d'obtenir un tel modèle en incorporant le produit de comblement au cours de la reconstruction de l'équivalent de peau. Plus particulièrement, il est désormais possible d'obtenir un modèle tridimensionnel contenant des cellules vivantes telles que des fibroblastes et permettant d'évaluer in vitro le comportement des produits de comblement lorsqu'ils seront injectés in vivo, en incorporant le produit de comblement dans la matrice extra-cellulaire avant la contraction des fibroblastes conduisant à la lattice. Unexpectedly, it has been found in the context of the present invention that it was possible to obtain such a model by incorporating the filler during the skin equivalent reconstruction. More particularly, it is now possible to obtain a three-dimensional model containing living cells such as fibroblasts and making it possible to evaluate in vitro the behavior of the filler products when they are injected in vivo, by incorporating the filler into the extracellular matrix before contraction of fibroblasts leading to lattice.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé d'évaluation in vitro d'un produit de comblement, caractérisé en ce qu'il comprend au moins (i) une étape de mélange dudit produit de comblement avec des constituants d'un équivalent de matrice extracellulaire pour préparer un équivalent de derme in vitro, les constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire étant, au moins partiellement, différents du produit de comblement, (ii) une étape de mesure d'au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de derme ou d'un équivalent de peau in vitro le contenant. This is why the subject of the present invention is a process for the in vitro evaluation of a filler, characterized in that it comprises at least (i) a step of mixing said filler with constituents of a filler. extracellular matrix equivalent for preparing a dermis equivalent in vitro, the components of the extracellular matrix equivalent being, at least in part, different from the filler, (ii) a step of measuring at least one physical, chemical parameter or biological equivalent of dermis or an in vitro skin equivalent containing it.
Le procédé pourra en particulier comprendre, avant l'étape (ii), une étape de préparation d'un équivalent de peau in vitro à partir de l'équivalent de derme, comprenant le produit de comblement. The method may in particular comprise, before step (ii), a step of preparing an in vitro skin equivalent from the dermis equivalent, comprising the filling product.
De préférence, l'équivalent de derme comprend au moins du collagène et des fibroblastes, en particulier des fibroblastes contractés. Avantageusement, les fibroblastes sont vivants. L'équivalent de derme est ainsi constitué d'un gel continu comprenant au moins du collagène, au sein duquel sont répartis les fibroblastes vivants. Avantageusement, l'équivalent de derme comprend une matrice dite "libre", c'est-à dire dans laquelle les fibroblastes sont orientés selon des axes qui peuvent être différents les uns des autres; en particulier, dans un tel équivalent de derme, le pourcentage des fibroblastes orientés longitudinalement par rapport à la surface de l'équivalent de derme est inférieur à 50%. L'invention concerne également un équivalent de peau in vitro susceptible d'être obtenu comme produit intermédiaire dans le procédé d'évaluation du produit de comblement, et son procédé de préparation. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un tel équivalent de peau pour l'évaluation de produits de comblement. Preferably, the dermis equivalent comprises at least collagen and fibroblasts, in particular contracted fibroblasts. Advantageously, the fibroblasts are alive. The dermis equivalent thus consists of a continuous gel comprising at least collagen, in which live fibroblasts are distributed. Advantageously, the dermis equivalent comprises a so-called "free" matrix, that is to say in which the fibroblasts are oriented along axes that may be different from each other; in particular, in such a dermis equivalent, the percentage of fibroblasts oriented longitudinally with respect to the surface of the dermis equivalent is less than 50%. The invention also relates to an in vitro skin equivalent obtainable as an intermediate product in the filler product evaluation method, and to a process for its preparation. The invention also relates to the use of such a skin equivalent for evaluating filler products.
Les constituants de la matrice extracellulaire seront proches de ceux trouvés dans la peau, et seront adaptés par l'homme du métier. The constituents of the extracellular matrix will be close to those found in the skin, and will be adapted by those skilled in the art.
L'équivalent de derme comporte au moins une matrice de collagène de type I dans laquelle sont répartis les fibroblastes. Elle peut contenir en outre d'autres constituants de la matrice extracellulaire. Par `constituant de matrices extracellulaires', on désigne notamment des molécules telles que les collagènes en particulier le collagène IV, les laminines, l'entactine, la fibronectine, les protéoglycanes, les glycosaminoglycans, l'acide hyaluronique, l'élastine, la fibrilline. Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, l'équivalent de derme contient au moins du collagène IV et de la laminine; de préférence, il contient aussi de l'entactine. Les concentrations de ces différents constituants pourront être adaptées par l'homme du métier et seront par exemple pour la laminine comprises entre 1 et 15% du volume final, pour le collagène IV entre 0,3 et 4,5% du volume final et pour l'entactine entre 0,05 et 1% du volume final. De préférence, les constituants de la matrice extracellulaire comprennent au moins du collagène I, du collagène III ou leurs mélanges. Le collagène utilisé peut être du collagène d'origine bovine, de queue de rat ou de 5 poisson ou toute autre source de collagène natif ou produit par génie génétique permettant une contraction en présence de fibroblastes. L'épaisseur de l'équivalent de derme pourra varier mais sera en général d'au moins 0,05 cm, notamment d'environ 0,05 à 2 cm mais pourra être augmenté sans inconvénient. De même, son diamètre sera adapté par l'homme du métier d'environ 3 mm à 20 cm ou plus. 10 L'équivalent de derme peut contenir un mélange de fibroblastes papillaires et réticulaires, en toutes proportions. Selon une des variantes de l'invention, l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes papillaires, selon une autre variante l'équivalent de derme comprend essentiellement des fibroblastes réticulaires. Selon un mode de réalisation avantageux, on prépare un équivalent de peau in vitro contenant l'équivalent de derme et comportant en outre un équivalent d'épiderme contenant des kératinocytes. The dermis equivalent comprises at least one type I collagen matrix in which the fibroblasts are distributed. It may further contain other constituents of the extracellular matrix. The term "extracellular matrix constituent" denotes molecules such as collagens, in particular collagen IV, laminins, entactin, fibronectin, proteoglycans, glycosaminoglycans, hyaluronic acid, elastin and fibrillin. . According to one embodiment of the invention, the dermis equivalent contains at least collagen IV and laminin; preferably, it also contains entactin. The concentrations of these various constituents may be adapted by those skilled in the art and will for example be for laminin between 1 and 15% of the final volume, for collagen IV between 0.3 and 4.5% of the final volume and for entactin between 0.05 and 1% of the final volume. Preferably, the constituents of the extracellular matrix comprise at least collagen I, collagen III or mixtures thereof. The collagen used may be collagen of bovine origin, rat tail or fish, or any other source of native or genetically engineered collagen allowing contraction in the presence of fibroblasts. The thickness of the dermis equivalent may vary but will generally be at least 0.05 cm, in particular about 0.05 to 2 cm but may be increased without inconvenience. Similarly, its diameter will be adapted by those skilled in the art from about 3 mm to 20 cm or more. The dermis equivalent may contain a mixture of papillary and reticular fibroblasts in all proportions. According to one of the variants of the invention, the dermis equivalent essentially comprises papillary fibroblasts, according to another variant the dermis equivalent essentially comprises reticular fibroblasts. According to an advantageous embodiment, an in vitro skin equivalent containing the dermis equivalent and further comprising an epidermal equivalent containing keratinocytes is prepared.
20 De préférence, l'équivalent d'épiderme est différencié stratifié, et comprend au moins une couche superficielle et au moins une couche basale. Avantageusement, les kératinocytes reproduisent les caractéristiques d'un épiderme in vivo, à savoir un épithélium multicouche stratifié avec une couche basale au contact de l'équivalent de derme et dont les strates supérieures témoignent d'une différenciation, reproduisant de la profondeur 25 vers la périphérie une couche supra-basale (ou couche épineuse), une couche granuleuse (stratum granulosum) et une couche cornée (stratum corneum) d'un épiderme. Les kératinocytes utilisés dans l'équivalent d'épiderme peuvent être préparés selon toute méthode connue de l'art antérieur. On peut citer à titre d'exemple la culture à 30 partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau normale ou pathologique. Préférentiellement, selon l'invention les kératinocytes utilisés sont préparés à partir d'épiderme dissocié provenant de prélèvement de peau humaine normale ou pathologique, en particulier selon la méthode décrite dans Asselineau et al. (Exp. Oeil 35 Res., 159(2): 536-9, 1985). 15 Par produit de comblement, on entend tout matériau naturel ou synthétique, solide ou liquide en mélange avec du solide (autre matériau), susceptible d'être injecté dans les tissus mous, en particulier cutané ou sous-cutané du visage ou du corps pour en modifier la forme ou les contours. Il peut s'agir de produits de comblement résorbables ou permanents. La durée totale de présence du produit en présence des cellules peut varier par exemple de 18 à 22 jours. De tels produits de comblement peuvent être choisis parmi les biopolymères, les polymères synthétiques et les cellules ou transplants autologues ou allogéniques. A titre d'exemples de produits de comblement, on peut citer: - Biopolymères : • Acides hyaluroniques biotechnologiques ou aviaires, réticulés ou non (de 8 à 25 mg/ml, le plus souvent : 20mg/ml et le plus souvent à PM 3MDa ; commercialisés par exemple sous les marques Evenor®, Restylane® de QMed, Juvederm® de Cornéal) • Collagènes humains, bovins ou porcins ; réticulés ou non (ex: 35 ou 65 mg/ml ; ex2 : EvolenceTM, Cosmoplast®...) • Elastine (à partir de la tropoelastine humaine biotechnologique) - Polymères synthétiques et autres : • Polyacrylamide (ex: Aquamid®) • Acide polylactique (ex: Newfill®) • Acide polyvinylique • Hydroxyapatite de calcium ou triphosphate de Calcium (particules de 10 à 80pm, peut-être contenues dans de l'acide hyaluronique ou gel de polysaccharide ; ex : Atléan®, RadiesseTM) • Polyméthylmétacrylate (ex Artefill®, microsphères contenues dans du collagène bovin) • Alkylimides - Cellules ou transplants (autologues/allogenic) • Fibroblastes humains (ex: Isolagen TherapyTM, 10 millions de cellules autologues injectées) • Graisse ( injection de graisse autologue) Preferably, the epidermis equivalent is differentiated stratified, and comprises at least one surface layer and at least one basal layer. Advantageously, the keratinocytes reproduce the characteristics of an epidermis in vivo, namely a stratified multilayer epithelium with a basal layer in contact with the dermis equivalent and whose upper strata show a differentiation, reproducing from depth to depth. periphery a supra-basal layer (or thorny layer), a granular layer (stratum granulosum) and a horny layer (stratum corneum) of an epidermis. The keratinocytes used in the epidermis equivalent may be prepared according to any known method of the prior art. For example, culture from dissociated epidermis from normal or pathological skin sampling may be mentioned. Preferably, according to the invention, the keratinocytes used are prepared from dissociated epidermis originating from normal or pathological human skin samples, in particular according to the method described in Asselineau et al. (Eye Exp., Res., 159 (2): 536-9, 1985). By filling product is meant any natural or synthetic material, solid or liquid mixed with solid (other material), which can be injected into the soft tissues, in particular the cutaneous or subcutaneous surface of the face or the body for change the shape or contours. These may be absorbable or permanent fillers. The total duration of presence of the product in the presence of the cells may vary, for example, from 18 to 22 days. Such fillers may be selected from biopolymers, synthetic polymers and autologous or allogeneic cells or transplants. By way of examples of filling products, mention may be made of: Biopolymers: Biological or biotechnological hyaluronic acids, crosslinked or otherwise (from 8 to 25 mg / ml, most often: 20 mg / ml and most often at 3MDa PM) for example, marketed under the brands Evenor®, Restylane® by QMed, Juvederm® from Cornéal) • Human, bovine and porcine collagens; crosslinked or not (eg 35 or 65 mg / ml, ex2: EvolenceTM, Cosmoplast® ...) • Elastin (from biotechnological human tropoelastin) - Synthetic and other polymers: • Polyacrylamide (eg Aquamid®) • Acid polylactic (eg Newfill®) • Polyvinyl acid • Calcium hydroxyapatite or calcium triphosphate (particles from 10 to 80 μm, possibly contained in hyaluronic acid or polysaccharide gel, eg Atléan®, RadiesseTM) • Polymethylmethacrylate ( ex Artefill®, microspheres contained in bovine collagen) • Alkylimides - Cells or transplants (autologous / allogenic) • Human fibroblasts (eg Isolagen TherapyTM, 10 million autologous cells injected) • Fat (autologous fat injection)
Des produits de comblement pouvant être évalués selon l'invention seront notamment choisis parmi l'acide hyaluronique modifié ou non, le collagène, l'élastine, l'acide polylactique, les biopolymères, les polymères synthétiques et les cellules ou transplants autologues ou allogéniques et leurs mélanges Les cellules seront notamment choisies parmi les fibroblastes et cellules souches de la peau. Fillers that can be evaluated according to the invention will especially be chosen from modified or unmodified hyaluronic acid, collagen, elastin, polylactic acid, biopolymers, synthetic polymers and autologous or allogeneic cells or transplants. their mixtures The cells will be chosen in particular from fibroblasts and stem cells of the skin.
L'acide hyaluronique est formé par la répétition d'une unité disaccharidique hydrophile, dans laquelle le D-glucuronate de sodium est relié à la N-acétyl-glucosamine par des liaisons R1-4 glycosidique. Sa structure chimique est simple, linéaire et uniforme, sans spécificité d'espèce. En condition physiologique, le polysaccharide se trouve non sous forme acide mais sous la forme d'un sel sodique, l'hyaluronate de sodium, molécule polyanionique. Par convention, on parle d'hyaluronane. Dans les tissus sains, son poids moléculaire varie de 4 à 10 millions de daltons (400D par unité), ce qui donne un produit final pouvant atteindre 1011m. Seule la longueur et la concentration d'hyaluronane varie dans la nature. La masse moléculaire de l' hyaluronane dermique est en moyenne de 2,5 millions de daltons. Son contenu varie en fonction de l'âge . Hyaluronic acid is formed by the repetition of a hydrophilic disaccharide unit, wherein the sodium D-glucuronate is linked to N-acetyl glucosamine by glycosidic R1-4 linkages. Its chemical structure is simple, linear and uniform, without species specificity. In physiological condition, the polysaccharide is not in acid form but in the form of a sodium salt, sodium hyaluronate, polyanionic molecule. By convention, we speak of hyaluronan. In healthy tissues, its molecular weight varies from 4 to 10 million daltons (400D per unit), which gives a final product of up to 1011m. Only the length and concentration of hyaluronan varies in nature. The molecular weight of dermal hyaluronan averages 2.5 million daltons. Its content varies according to age.
Par acide hyaluronique (AH) on entend dans la présente description l'acide hyaluronique ou l'un de ses sels, en particulier ses sels de sodium, potassium, manganèse, magnésium , et calcium. Son poids moléculaire peut varier, et est généralement supérieur à 106 daltons. Au sens de l'invention, on entend également désigner par acide hyaluronique un mélange de molécules de différentes masses moléculaires, correspondant à des répétitions plus ou moins nombreuses de l'unité disaccharidique de base. By hyaluronic acid (HA) is meant in the present description hyaluronic acid or a salt thereof, in particular its sodium salts, potassium, manganese, magnesium, and calcium. Its molecular weight may vary, and is generally greater than 106 daltons. For the purposes of the invention, the term "hyaluronic acid" is also intended to denote a mixture of molecules of different molecular masses, corresponding to more or less numerous repeats of the basic disaccharide unit.
Au niveau industriel, l'acide hyaluronique peut être obtenu par extraction des tissus (par exemple de crêtes de coq) ou par fermentation bactérienne (tel que Streptococcus equi) L'acide hyaluronique est soluble dans l'eau, sa vitesse de dissolution étant masse moléculaire dépendante (plus la masse moléculaire est élevée, plus lentement il sera soluble), le processus peut être accéléré par agitation. At the industrial level, hyaluronic acid can be obtained by extraction of tissues (for example from rooster crests) or by bacterial fermentation (such as Streptococcus equi) Hyaluronic acid is soluble in water, its dissolution rate being mass dependent molecular (the higher the molecular mass, the more slowly it will be soluble), the process can be accelerated by stirring.
Du fait de sa courte demi vie, pour son utilisation dans le cadre du traitement des rides par comblement, le produit doit généralement subir une réticulation. La réticulation se fait, essentiellement, en milieu alcalin, utilisant les sites carboxyliques et hydroxyles de la molécule. Mais cette réticulation peut être réalisée en milieu acide, bien que les liaisons créées dans ce milieu soient nettement moins résistantes qu'en milieu alcalin. Le procédé de réticulation ne change pas le caractère polyanionique du polysaccharide, mais diminue sensiblement la miscibilité à l'eau du gel obtenu. Because of its short half life, for use in the treatment of wrinkles by filling, the product must generally undergo crosslinking. Crosslinking is essentially in an alkaline medium, using the carboxylic and hydroxyl sites of the molecule. But this crosslinking can be carried out in acidic medium, although the bonds created in this medium are significantly less resistant than in alkaline medium. The crosslinking process does not change the polyanionic character of the polysaccharide, but substantially reduces the miscibility with water of the gel obtained.
Dans les procédés de réticulation, l'acide hyaluronique utilisé est de qualité pharmaceutique. La technique de réticulation classique comporte 3 étapes. Une étape de préparation d'une acide hyaluronique de qualité pharmaceutique, suivi d'un séchage , laissant l'hyaluronane sous forme de fibres. L'écheveau de fibre d'hyaluronane obtenu est remis en solution dans une solution tampon . Par exemple, l'acide hyaluronique de faible masse moléculaire est mélangé à un acide de forte masse moléculaire. A ce stade le réticulant est ajouté, en milieu alcalin pour donner une masse gélifiée. Les différents réticulants utilisés pour réaliser les gels disponibles en chirurgie esthétique sont : - divinyl sulfone, - 1,2,7,8 diépoxyoctane - 1,4 butanediol diglycidyl éther (BDDE) , pour un grand nombre de produits actuellement sur le marché Dans certains cas une 4ème étape soit par addition d'acide hyaluronique soit par une seconde étape de réticulation en milieu acide. In crosslinking processes, the hyaluronic acid used is of pharmaceutical grade. The conventional crosslinking technique comprises 3 steps. A step of preparation of a pharmaceutical grade hyaluronic acid, followed by drying, leaving the hyaluronan in the form of fibers. The skein of hyaluronan fiber obtained is redissolved in a buffer solution. For example, hyaluronic acid of low molecular weight is mixed with a high molecular weight acid. At this stage, the crosslinking agent is added in an alkaline medium to give a gelled mass. The different crosslinking agents used to produce the gels available in cosmetic surgery are: - divinyl sulfone, - 1,2,7,8-diepoxyoctane - 1,4 butanediol diglycidyl ether (BDDE), for a large number of products currently on the market In some case a 4th step is by addition of hyaluronic acid or by a second step of crosslinking in acidic medium.
Au sens de l'invention, on entend par dérivés de l'acide hyaluronique notamment les dérivés modifiés chimiquement et/ou réticulés (présentant des ponts intra ou inter chaînes). De préférence, le dérivé réticulé est choisi parmi les dérivés réticulés de poids moléculaire supérieur ou égal à 106 daltons et notamment supérieur ou égal à 2 millions de daltons. Toutefois, ce poids moléculaire est généralement inférieur ou égal à 15. 106 daltons. For the purposes of the invention, the term "hyaluronic acid derivatives" is intended to mean chemically modified and / or crosslinked derivatives (having intra- or inter-chain bridges). Preferably, the crosslinked derivative is chosen from crosslinked derivatives of molecular weight greater than or equal to 106 daltons and especially greater than or equal to 2 million daltons. However, this molecular weight is generally less than or equal to 15. 106 daltons.
Le collagène peut être de diverses origines, par exemple : humain, bovin ou porcin. Le collagène peut-être libre ou réticulé et est utilisé de préférence à une concentration élevée à 35mg/ml. La réticulation conduisant éventuellement à des pontages entre les chaines de collagène, après réaction avec une fonction aldéhyde, peut-être réalisée de façon aléatoire (ex avec le réticulant Glutaraldéhyde ou sucre réducteur) ou de façon précise et spécifique. La réaction de réticulation est appelée réaction de glycation. Cette réaction si elle se fait de façon aléatoire peut conduire à des produits néfastes pour la biologie de la peau. Le collagène peut-être réticulé et/ou modifié de façon spécifique conduisant à la formation de produits de glycation bénéfiques pour la peau. Collagen can be of various origins, for example: human, bovine or porcine. The collagen may be free or crosslinked and is preferably used at a high concentration of 35 mg / ml. The crosslinking optionally leading to cross-linking between the collagen chains, after reaction with an aldehyde function, may be carried out randomly (eg with the crosslinking agent Glutaraldehyde or reducing sugar) or in a precise and specific manner. The crosslinking reaction is called a glycation reaction. This reaction if it is done randomly can lead to products harmful to the biology of the skin. The collagen may be crosslinked and / or specifically modified leading to the formation of beneficial glycation products for the skin.
Le procédé d'évaluation selon l'invention comprendra notamment les étapes suivantes: a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire avec au moins des fibroblastes et au moins un produit de comblement à évaluer; b) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et le produit de comblement, qui constitue l'équivalent de derme; c) on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de derme. The evaluation method according to the invention will comprise in particular the following steps: a) mixing constituents of the extracellular matrix equivalent with at least fibroblasts and at least one filling product to be evaluated; b) the mixture is left in contact for a time sufficient to allow the fibroblasts to contract to obtain a gel of extracellular matrix constituents in which the fibroblasts are distributed and the filler, which constitutes the dermis equivalent; c) measuring at least one physical, chemical or biological parameter of the dermis equivalent.
Selon l'un des modes de réalisation de l'invention, le procédé d'évaluation d'au moins un produit de comblement peut ainsi comprendre les étapes suivantes: a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire avec au moins des fibroblastes et au moins un produit de comblement à évaluer; b) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et le produit de comblement, qui constitue l'équivalent de derme; c) on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme au dessus de l'équivalent de derme; d) on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de peau comprenant l'équivalent de derme et d'épiderme obtenu à l'issue de l'étape c). According to one of the embodiments of the invention, the method for evaluating at least one filling product may thus comprise the following steps: a) mixing constituents of the extracellular matrix equivalent with at least fibroblasts and at least one filler to be evaluated; b) the mixture is left in contact for a time sufficient to allow the fibroblasts to contract to obtain a gel of extracellular matrix constituents in which the fibroblasts are distributed and the filler, which constitutes the dermis equivalent; c) the surface of the dermis equivalent is seeded with keratinocytes and the culture is continued under conditions which make it possible to obtain an equivalent of epidermis above the dermis equivalent; d) measuring at least one physical, chemical or biological parameter of the skin equivalent comprising the equivalent of dermis and epidermis obtained at the end of step c).
Le temps de contact de l'étape b peut varier de 3 à 6 jours, par exemple être d'environ 4 jours. The contact time of step b may vary from 3 to 6 days, for example, be about 4 days.
Avantageusement, à l'étape c, on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme. De telles conditions sont connues de l'homme du métier. En particulier, après ensemencement des kératinocytes sur le support, la culture peut être maintenue immergée dans un milieu nutritif qui peut être par exemple le milieu décrit par Rheinwald et Green, 1975, (Cell, 6, (3), 317-330) milieu qui permet la prolifération des kératinocytes (nommé par ailleurs dans le texte milieu 3F) . Advantageously, in step c, the surface of the dermis equivalent is seeded with keratinocytes and the culture is continued under conditions allowing the production of an epidermis equivalent. Such conditions are known to those skilled in the art. In particular, after inoculation of the keratinocytes on the support, the culture can be kept immersed in a nutrient medium which can be for example the medium described by Rheinwald and Green, 1975, (Cell, 6, (3), 317-330). which allows the proliferation of keratinocytes (named elsewhere in the text middle 3F).
Après un temps d'incubation de 3 à 15 jours, préférentiellement de 7 à 9 jours, l'équivalent de peau est maintenu à l'interface air/liquide par exemple par dépôt sur une grille métallique. Le liquide est alors préférentiellement constitué du même milieu nutritif que le précédent. After an incubation period of 3 to 15 days, preferably 7 to 9 days, the skin equivalent is maintained at the air / liquid interface, for example by deposition on a metal grid. The liquid is then preferably composed of the same nutrient medium as the previous one.
L'incubation se poursuit ensuite jusqu'à obtention d'un équivalent de peau présentant les caractéristiques d'une peau, à savoir le support sur lequel se trouve un équivalent d'épiderme présentant les quatre types de couches cellulaires classiques, à savoir les couches basale, suprabasale, granuleuse et cornée. Ainsi, l'incubation se poursuit pendant une durée comprise entre 5 et 30 jours préférentiellement entre 7 et 10 jours. The incubation then continues until obtaining a skin equivalent having the characteristics of a skin, namely the support on which there is an epidermis equivalent having the four types of conventional cell layers, namely the layers basal, suprabasal, granular and cornea. Thus, the incubation is continued for a period of between 5 and 30 days, preferably between 7 and 10 days.
L'équivalent de derme ou de peau obtenu par ce mode de réalisation se rapproche d'une injection finale de type nappage, à savoir dans la pratique réelle en médecine esthétique sur un patient répartition homogène et globale par injections multiples du produit dans la peau du visage. En effet, la répartition du produit de comblement dans l'équivalent de derme est homogène et la concentration du produit de comblemnt est sensiblement constante dans tout le volume de l'équivalent de derme. Avec un produit réticulé, on se situera dans le comblement des rides profondes ou la redéfinition des contours du visage avec des injections linéaires multiples et/ou croisées. Avec de l'acide hyaluronique non réticulé, on se situera plutôt dans un axe mésothérapie avec des injections multiples mais de petites tailles. The equivalent of dermis or skin obtained by this embodiment is similar to a final injection type topping, namely in actual practice in aesthetic medicine on a patient homogeneous and global distribution by multiple injections of the product in the skin of the skin. face. Indeed, the distribution of the filler in the dermis equivalent is homogeneous and the concentration of the filler is substantially constant throughout the volume of the dermis equivalent. With a crosslinked product, one will be in the filling of deep wrinkles or the redefinition of facial contours with multiple linear injections and / or crossed. With uncrosslinked hyaluronic acid, we will rather be in a mesotherapy axis with multiple injections but small sizes.
Selon l'une des variantes du procédé, à l'étape d, on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent de derme. Selon une autre variante, à l'étape d, on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique de l'équivalent d'épiderme. La mesure peut être qualitative, quantitative ou semi-quantitative. Par mesure d'un paramètre biologique, on entend notamment la mesure (ou le dosage) du taux de protéines exprimées par l'équivalent de derme ou d'épiderme comprenant le produit de comblement, notamment des protéines exprimées par les différents types cellulaires présents en particulier par les fibroblastes et/ou les kératinocytes. Cette mesure peut s'effectuer au sein de l'équivalent de derme ou d'épiderme, notamment en mesurant la concentration de protéines de la matrice extracellulaire; elle peut aussi concerner le dosage des protéines libérées par l'équivalent de derme ou de peau dans le surnageant de culture obtenu à l'issue de l'étape b. According to one of the variants of the method, in step d, at least one physical, chemical or biological parameter of the dermis equivalent is measured. According to another variant, in step d, at least one physical, chemical or biological parameter of the epidermis equivalent is measured. The measurement can be qualitative, quantitative or semi-quantitative. By measurement of a biological parameter, the measurement (or the dosage) of the level of proteins expressed by the equivalent of dermis or epidermis comprising the filling product, in particular proteins expressed by the various cell types present in particularly by fibroblasts and / or keratinocytes. This measurement can be carried out within the equivalent of dermis or epidermis, in particular by measuring the concentration of proteins of the extracellular matrix; it may also relate to the determination of the proteins released by the equivalent of dermis or skin in the culture supernatant obtained at the end of step b.
Le paramètre biologique mesuré peut aussi comprendre l'évaluation du taux de prolifération des cellules constitutives de l'équivalent de derme ou de peau contenant le produit de comblement, en particulier des fibroblastes ou des kératinocytes. L'évaluation peut comprendre la visualisation de l'expression de protéines par immunofluorescence (solubles ou non, membranaires ou non comme par exemple le récepteur CD44), la morphologie des fibroblastes dans le collagène observée par un marquage immunofluorescent des filaments du cytosquelette tels que la vimentine. The measured biological parameter may also comprise the evaluation of the proliferation rate of the cells constituting the equivalent of dermis or skin containing the filling product, in particular fibroblasts or keratinocytes. The evaluation may comprise the visualization of the expression of proteins by immunofluorescence (soluble or non-soluble, membrane-bound or otherwise, for example the CD44 receptor), fibroblast morphology in the collagen observed by immunofluorescent staining of the cytoskeleton filaments such as the vimentin.
L'équivalent de peau utile dans le procédé selon l'invention peut aussi contenir des cellules endothéliales, des mélanocytes, des cellules de papilles dermiques, des cellules du système immunitaire, telles que des lymphocytes, des cellules dendritiques, des macrophages des monocytes ou des cellules de Langerhans, des adipocytes, des cellules nerveuses, et leurs mélanges; en particulier, l'équivalent de peau tel que défini précédemment comprend en outre des cellules choisies parmi les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les adipocytes. Le modèle permet ainsi d'étudier l'effet biologique d'un produit de comblement sur la signalisation inflammatoire et de donner des informations sur l'éventuelle composante inflammatoire d'un produit. The skin equivalent useful in the process according to the invention may also contain endothelial cells, melanocytes, dermal papilla cells, cells of the immune system, such as lymphocytes, dendritic cells, monocyte macrophages or Langerhans cells, adipocytes, nerve cells, and mixtures thereof; in particular, the skin equivalent as defined above further comprises cells selected from melanocytes, Langerhans cells and adipocytes. The model thus makes it possible to study the biological effect of a filler on inflammatory signaling and to provide information on the possible inflammatory component of a product.
La présence d'une structure et d'une composition de derme reproduisant la structure de la peau humaine est nécessaire pour évaluer l'ensemble des effets pouvant être induits par l'injection de produits de comblement. En particulier, il a été montré chez l'animal que l'injection d'acide hyaluronique réticulé stimule la production de collagène (Wang et al. arch. Dermatol. 2007; 143:155-163). Il est donc important de pouvoir évaluer ce type d'activité biologique, ce qui est possible avec le modèle selon l'invention. The presence of a structure and a dermis composition reproducing the structure of the human skin is necessary to evaluate all the effects that can be induced by the injection of fillers. In particular, it has been shown in animals that injection of cross-linked hyaluronic acid stimulates collagen production (Wang et al., Dermatol 2007, 143: 155-163). It is therefore important to be able to evaluate this type of biological activity, which is possible with the model according to the invention.
Les produits de comblement sont destinés, selon les indications du fabricant et leur composition, à être injectés soit dans la partie superficielle de la peau (derme papillaire) soit dans la partie moyenne à profonde de la peau (derme réticulaire). Les propriétés biologiques étant différentes entre les fibroblastes de la partie papillaire et ceux de la partie réticulaire, les effets d'un actif ou d'un produit peuvent donc être différents selon les cellules qui sont mises en contact. La mise en oeuvre d'équivalent de derme à teneur contrôlée en fibroblastes papillaires et/ou réticulaires selon la présente invention permet donc de tester spécifiquement l'effet du produit selon la profondeur à laquelle il est destiné ou inversement, permet de déterminer à quelle profondeur le produit aura l'effet le plus bénéfique.35 Le procédé et l'équivalent de peau selon l'invention permettent d'évaluer les effets biologiques, biophysiques, biomécaniques, physiques, modifications d'apparence visuelle, morphologie, relief, couleur induits par l'injection d'un produit de comblement. La mesure des paramètres physiques, chimiques ou biologiques représentatifs de ces effets, peut être qualitative, quantitative ou semi-quantitative, et sera effectuée par des méthodes connues de l'homme du métier. The filling products are intended, according to the manufacturer's indications and their composition, to be injected either into the superficial part of the skin (papillary dermis) or into the middle to deep part of the skin (reticular dermis). The biological properties being different between the fibroblasts of the papillary part and those of the reticular part, the effects of an active or a product can therefore be different according to the cells that are put in contact. The use of dermis equivalent with a controlled content of papillary and / or reticular fibroblasts according to the present invention thus makes it possible to specifically test the effect of the product according to the depth to which it is intended or vice versa, makes it possible to determine to what depth the product will have the most beneficial effect. The method and the skin equivalent according to the invention make it possible to evaluate the biological, biophysical, biomechanical, physical effects, visual appearance modifications, morphology, relief, color induced by the injection of a filling product. The measurement of physical, chemical or biological parameters representative of these effects may be qualitative, quantitative or semi-quantitative, and will be performed by methods known to those skilled in the art.
En particulier, l'évaluation pourra comprendre une étape au cours de laquelle on mesure au moins un paramètre physique, chimique ou biologique tel que défini précédemment d'un équivalent de derme ou de peau contenant le produit de comblement, et on le compare à celle mesurée dans un équivalent de peau préparé dans les mêmes conditions mais ne contenant pas de produit de comblement. Selon un mode de réalisation de l'invention, on mesure la quantité de protéines de la matrice extracellulaire et/ou la quantité d'ARNm de la matrice extracellulaire produite par l'équivalent de derme contenant le produit de comblement, et on la compare à celle mesurée d'un équivalent de derme préparé dans les mêmes conditions mais ne contenant pas de produit de comblement. Comme indiqué précédemment, cette mesure pourra être effectuée dans l'équivalent de derme ou dans le surnageant de culture de l'équivalent de derme. In particular, the evaluation may comprise a step during which at least one physical, chemical or biological parameter as defined above is measured for a dermis or skin equivalent containing the filling product, and is compared to that measured in a skin equivalent prepared under the same conditions but not containing a filling product. According to one embodiment of the invention, the amount of extracellular matrix proteins and / or the amount of mRNA of the extracellular matrix produced by the dermis equivalent containing the filling product is measured, and is compared with that measured of a dermis equivalent prepared under the same conditions but not containing a filling product. As indicated above, this measurement may be performed in the dermis equivalent or in the culture supernatant of the dermis equivalent.
Des protéines utiles à mesurer dans les différents modes de réalisation du procédé selon l'invention sont notamment les métalloprotéinases, telles que la MMP-1, les inhibiteurs de MMPs tels que TIMP-1, et les facteurs de croissance tels que KGF. Useful proteins to be measured in the different embodiments of the process according to the invention are in particular metalloproteinases, such as MMP-1, MMP inhibitors such as TIMP-1, and growth factors such as KGF.
Le procédé d'évaluation pourra également être utile pour comparer plusieurs produits de comblement et par exemple les classer selon leur structure et établir une corrélation avec leurs effets biologiques. The evaluation procedure may also be useful for comparing several fillers and for example classifying them according to their structure and correlating with their biological effects.
L'invention a encore pour objet un équivalent de peau susceptible d'être obtenu comme produit intermédiaire dans le procédé d'évaluation défini dans ce qui précède, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un équivalent de derme comprenant au moins (i) des constituants de matrice extracellulaire et des fibroblastes et (ii) un produit de comblement. The subject of the invention is also a skin equivalent which can be obtained as an intermediate product in the evaluation method defined in the foregoing, characterized in that it comprises at least one dermis equivalent comprising at least (i) extracellular matrix components and fibroblasts; and (ii) a filler.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un tel équivalent de peau pour l'évaluation d'un produit de comblement. The invention also relates to the use of such a skin equivalent for the evaluation of a filler.
L'invention concerne enfin un procédé de préparation d'un tel équivalent de peau, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) on mélange des constituants de l'équivalent de matrice extracellulaire avec au moins des fibroblastes et au moins un produit de comblement à évaluer; b) on laisse le mélange en contact pendant un temps suffisant pour permettre aux fibroblastes de se contracter pour obtenir un gel de constituants de matrice extra-cellulaire dans lequel sont répartis les fibroblastes et le produit de comblement, qui constitue l'équivalent de derme; c) on ensemence la surface de l'équivalent de derme par des kératinocytes et on poursuit la culture dans des conditions permettant l'obtention d'un équivalent d'épiderme au dessus de l'équivalent de derme; d) on récupère l'équivalent de peau comprenant l'équivalent de derme et l'équivalent d'épiderme obtenus à l'issue de l'étape c. The invention finally relates to a method for preparing such a skin equivalent, characterized in that it comprises the following steps: a) mixing constituents of the extracellular matrix equivalent with at least one fibroblast and at least one filling product to be evaluated; b) the mixture is left in contact for a time sufficient to allow the fibroblasts to contract to obtain a gel of extracellular matrix constituents in which the fibroblasts are distributed and the filler, which constitutes the dermis equivalent; c) the surface of the dermis equivalent is seeded with keratinocytes and the culture is continued under conditions which make it possible to obtain an equivalent of epidermis above the dermis equivalent; d) recovering the skin equivalent comprising the dermis equivalent and the epidermis equivalent obtained at the end of step c.
L'invention sera illustrée plus en détail par les exemples qui suivent Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes: Figure 1: coupe schématique d'un modèle de type nappage Figure 2: expression des protéines MMP-1 dans le surnageant dans des modèles préparés avec des acide hyaluronique (HA) de différents degrés de réticulation. Figure 3: évaluation de la prolifération épidermique dans des modèles préparés avec des acide hyaluronique (HA) de différents degrés de réticulation. The invention will be further illustrated by the following examples. In these examples, reference is made to the following figures: Figure 1: Schematic section of a layering model Figure 2: Expression of the MMP-1 proteins in the supernatant in models prepared with hyaluronic acid (HA) of different degrees of crosslinking. Figure 3: evaluation of epidermal proliferation in models prepared with hyaluronic acid (HA) of different degrees of crosslinking.
Exemple 1: préparation d'un équivalent de peau: Les milieux et tampons utilisés sont décrits dans Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984 (Br J Derm, 111, 219-222) et Asselineau et al, 1987 (Models Derm, vol III, ed. Lowe et Maibach, 1/7). Example 1: Preparation of a Skin Equivalent: The media and buffers used are described in Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau and Prunieras, 1984 (Br J Derm, 111, 219-222 and Asselineau et al., 1987 (Models Derm, Vol III, Lowe and Maibach, 1/7).
Stérilement, on prépare la `solution intermédiaire lattis' dans un tube Falcon. Pour la réalisation d'une lattis, on mélange 4,6m1 de MEM 1,76X, 0,9m1 de sérum de veau foetal (SVF), 0,5m1 de NaOH à 0,1 N, 0,28m1 de MEM Hépès à 10%SVF. Mélanger 100pl de solution de produit de comblement avec la solution intermédiaire lattis (10m1 -100pl du produit) de façon homogène. Sterilization, the 'intermediate solution lattis' is prepared in a Falcon tube. For the production of a lattice, 4.6 ml of MEM 1.76 X, 0.9 ml of fetal calf serum (FCS), 0.5 ml of 0.1 N NaOH, 0.28 ml of MEM Hepes 10 % FCS. Mix 100 μl of filling solution with the intermediate solution (10 μl-100 μl of the product) in a homogeneous way.
A cette solution, ajouter 1,42 millions de fibroblastes à partir de la solution initiale de fibroblastes concentrés à 2 millions par ml dans du MEM Hépès à 10% SVF, soit 0,71 ml. To this solution, add 1.42 million fibroblasts from the initial solution of concentrated fibroblasts to 2 million per ml in 10% FCS Hepes Ce, or 0.71 ml.
Les fibroblastes issus de plastie mammaires ont été préalablement isolés et amplifiés selon la méthode décrite par Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau et Prunieras, 1984 (Br J Derm, 111, 219-222) et Asselineau et al, 1987 (Models Derm, vol III, ed. Lowe et Maibach, 1/7). Fibroblasts derived from mammoplasty were previously isolated and amplified according to the method described by Bell et al, 1979 (PNAS USA, 76, 1274-1278), Asselineau and Prunieras, 1984 (Br J Derm, 111, 219-222) and Asselineau et al., 1987 (Models Derm, vol III, ed Lowe and Maibach, 1/7).
A cette solution, ajouter 3ml de solution de collagène bovin (Ci=Smg/ml soluble dans 0.017N d'acide acétique), on dénommera le mélange ainsi crée solution finale lattis. La solution finale lattis avec produit ainsi obtenue est déposée dans une boîte de pétri 60mm de diamètre. NB : L'incorporation du produit de comblement ainsi est répartie dans la matrice dermique. To this solution, add 3ml of bovine collagen solution (Ci = Smg / ml soluble in 0.017N of acetic acid), the so-called mixture will be created final solution lattis. The final solution lattis with product thus obtained is deposited in a petri dish 60mm in diameter. NB: The incorporation of the filling product thus is distributed in the dermal matrix.
Après contraction de 4 jours, le derme équivalent est ensemencé en kératinocytes pour 7 jours de culture et l'épiderme est différencié avec l'interface air pendant 7/11 jours. After 4 days contraction, the equivalent dermis is seeded into keratinocytes for 7 days of culture and the epidermis is differentiated with the air interface for 7/11 days.
La figure 1 représente une coupe schématique du modèle ainsi obtenu : FIG. 1 represents a schematic section of the model thus obtained:
Exemple2 : Caractérisation des HA réticulés en fonction de leur réticulation et du volume incorporé dans le derme EXAMPLE 2 Characterization of the Crosslinked HAs as a Function of Their Crosslinking and of the Volume Incorporated in the Dermis
Les milieux de cultures des dermes équivalents ont été prélevés et un dosage ELISA a été effectuée (MMP-1 ELISA, Amersham Biosciences, Réf RPN2610) pour détecter la protéine MMP-1 (métalloprotéinase extracellulaire de type 1) exprimée par les fibroblastes contenus dans ce derme suite à la contraction de la matrice. La figure 2 représente les différences liées à la réticulation et en fonction du volume: The equivalent dermal culture media were removed and an ELISA assay was performed (MMP-1 ELISA, Amersham Biosciences, Ref RPN2610) to detect the MMP-1 protein (extracellular metalloproteinase type 1) expressed by the fibroblasts contained in this invention. dermis following the contraction of the matrix. Figure 2 shows the cross-linking and volume-related differences:
Légende : HA du moins réticulé au plus réticulé : HA+, HA++, HA+++. On observe une augmentation de l'expression de la protéine MMP-1, dans le surnageant 30 de culture des dermes équivalents après contraction, avec les HA réticulés, cette augmentation est fonction de la réticulation et la quantité injectée. Legend: HA at least cross-linked to most reticulated: HA +, HA ++, HA +++. An increase in the expression of the MMP-1 protein in the culture supernatant of equivalent dermes after contraction is observed with the crosslinked HAs, this increase is a function of the crosslinking and the quantity injected.
Exemple 3 : Stimulation de la prolifération épidermique en présence de HA réticulés EXAMPLE 3 Stimulation of Epidermal Proliferation in the Presence of Crosslinked HA
35 Des coupes de tissus paraffines d'une peau reconstruite témoin (aucun produit/pas d'inclusion) et d'une peau reconstruite `inclusion' préparée comme décrit à l'exemple 1 25 (produit acide hyaluronique réticulé avec BDDE, 20mg/ml) sont réalisées pour une épaisseur de 5pm. Ces coupes sont déparaffinées suivant le protocole ci-après : xylène 2 fois 5 min, alcool absolu 3 min, alcool 70% 3 min, alcool 50% 3 min, eau distillée 10 minutes, PBS 5 min. Paraffin tissue sections of a control reconstructed skin (no product / no inclusion) and an 'inclusion' reconstructed skin prepared as described in Example 1 (BDDE-crosslinked hyaluronic acid product, 20mg / ml ) are made for a thickness of 5pm. These sections are deparaffinized according to the following protocol: xylene 2 times 5 min, absolute alcohol 3 min, alcohol 70% 3 min, alcohol 50% 3 min, distilled water 10 minutes, PBS 5 min.
Les coupes sont plongées dans une solution de citrate pH9 chaude à 95°C pendant 25 min et laissée à refroidir dans cette solution hors du bain-marie pendant 25 min. Ces coupes, rincées au PBS, subissent les étapes de blocage, suivantes : H2O2 (10 min), avidine (20min), biotine (20min), sérum de cheval (30 min). The sections are immersed in a solution of hot pH9 citrate at 95 ° C. for 25 minutes and allowed to cool in this solution out of the water bath for 25 minutes. These sections, rinsed with PBS, undergo the following blocking steps: H2O2 (10 min), avidin (20 min), biotin (20 min), horse serum (30 min).
Ces coupes, rincées au PBS, sont incubées à 4°C pendant la nuit avec un anticorps primaire souris anti-Ki67 humain qui reconnait les cellules en prolifération (Novocastra, réf 25120). Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec un anticorps secondaire cheval anti-souris (couplé à une biotine) qui reconnait l'anticorps primaire (Vector, réf BA-1400) à TA pendant 30 min. These sections, rinsed with PBS, are incubated at 4 ° C. overnight with a human anti-Ki67 mouse primary antibody that recognizes the proliferating cells (Novocastra, ref 25120). The sections are rinsed with PBS and then incubated with a secondary anti-mouse horse antibody (coupled with a biotin) which recognizes the primary antibody (Vector, ref BA-1400) at RT for 30 min.
Les coupes sont rincées au PBS puis incubées avec une solution d'amplification ABCHRP reagent (complexe biotine-avidine couplé à une enzyme peroxydase, Dako, réf S2001) pendant 30min à TA. Les coupes sont rincées au PBS puis incubées 10 min avec le chromogène AEC puis rincées à nouveau en PBS. Une coloration des noyaux est effectuée avec l'hématoxyline pendant 5 sec. Les coupes rincées à nouveau sont montées dans du milieu de montage sous lamelle. L'observation est réalisée au microscope conventionnel (modèle DMDR, Leica Microsystems). The sections are rinsed with PBS and then incubated with an ABCHRP reagent amplification solution (biotin-avidin complex coupled to a peroxidase enzyme, Dako, ref S2001) for 30 min at RT. The sections are rinsed with PBS and then incubated for 10 min with the AEC chromogen and rinsed again with PBS. Staining of the nuclei is performed with hematoxylin for 5 sec. The rinsed cups are mounted in underlayer mounting medium. The observation is carried out under a conventional microscope (DMDR model, Leica Microsystems).
La figure 3 représente la stimulation de la prolifération épidermique en présence de HA réticulés : Légende : HA du moins réticulé au plus réticulé : +, ++, +++. On observe une stimulation de la prolifération épidermique en présence des HA réticulés indépendamment de la réticulation de l'HA. 30 FIG. 3 represents the stimulation of epidermal proliferation in the presence of crosslinked HA: Legend: HA at least cross-linked to most cross-linked: +, ++, +++. Epidermal proliferation stimulation is observed in the presence of the crosslinked HAs independently of the crosslinking of the HA. 30
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