FR2949344A1 - FLU PROTECTIVE VACCINES - Google Patents

Abstract

Méthodes pour produire des vaccins contre la grippe. Les méthodes utilisent une souche H1N1 de virus de la grippe A avec une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3. Le vaccin peut être adjuvanté avec un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau.Methods for producing influenza vaccines The methods use an H1N1 strain of influenza A virus with a hemagglutinin that is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SEQ ID NO: 3. The vaccine can be adjuvanted with an adjuvant in emulsion form. of oil in water.

Description

VACCINS DE PROTECTION CONTRE LA GRIPPE FLU PROTECTIVE VACCINES

DOMAINE TECHNIQUE Cette invention entre dans le domaine de fabrication de vaccins destinés à protéger contre l'infection due au virus de la grippe et en particulier contre la (les) souche(s) de la grippe porcine qui a (ont) fait son (leur) apparition en avril 2009. ART ANTERIEUR En avril 2009, une épidémie humaine de la grippe porcine a été confirmée dans de nombreux pays comprenant le Mexique et les États-Unis et s'est ensuite rapidement étendue à tout le globe. Une pandémie a été déclarée par l'OMS en juin 2009. La maladie est provoquée par un virus de la grippe porcine nouvellement identifié A/California/04/2009 A(H1 N1). Cette souche de la grippe porcine semble n'avoir aucune réaction immunologique croisée avec les souches humaines actuelles des vaccins contre la grippe, y compris l'antigène A(H1 N1) dans les vaccins saisonniers humains actuels. Le virus a été dénommé de diverses façons "grippe porcine", "nouvelle grippe H1 N1 d'origine porcine", "grippe porcine humaine", "nouvelle grippe A(H1 N1)" et "grippe A(H1 N1)v". Il existe un besoin de prévoir des procédés pour fabriquer un vaccin permettant d'empêcher la transmission ultérieure de l'homme à l'homme de cette grippe porcine et de variantes de celles-ci. DIVULGATION DE L'INVENTION L'invention fournit des procédés pour fabriquer des vaccins contre la grippe. Les procédés utilisent une souche H1 N1 du virus de la grippe A avec une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SED ID NO: 3. Le vaccin peut être adjuvanté avec un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau. TECHNICAL FIELD This invention falls within the field of manufacturing vaccines intended to protect against infection due to the influenza virus and in particular against the strain (s) of swine influenza which has (have) made its (their) In April 2009, a human epidemic of swine influenza was confirmed in many countries including Mexico and the United States and then spread rapidly throughout the world. A pandemic was declared by the WHO in June 2009. The disease is caused by a newly identified swine flu virus A / California / 04/2009 A (H1 N1). This strain of swine influenza appears to have no immunological cross-reaction with current human influenza vaccine strains, including A (H1 N1) antigen in current human seasonal vaccines. The virus has been referred to in various ways as "swine flu", "new influenza H1 N1 of porcine origin", "human swine flu", "new influenza A (H1 N1)" and "influenza A (H1 N1) v". There is a need to provide methods for making a vaccine to prevent subsequent human-to-human transmission of this swine influenza and variants thereof. DISCLOSURE OF THE INVENTION The invention provides methods for making influenza vaccines. The methods utilize a H1 N1 strain of influenza A virus with a hemagglutinin that is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SED ID NO: 3. The vaccine can be adjuvanted with an adjuvant in the form of oil emulsion in water.

L'hémagglutinine suscite une réponse immunitaire d'un receveur, et l'adjuvant accroît la couverture hétérovariante de cette réponse de sorte 2949344 -2- qu'une protection peut être fournie contre la souche homologue et également contre des variantes de celle-ci telles que des souches dérivées qui peuvent apparaître naturellement. L'invention a été utile pour préparer les produits vaccinaux FOCETRIATM et CELTURATM 5 Composants antigéniques L'invention utilise l'hémagglutinine du virus de la grippe A comme antigène du vaccin. L'antigène est préparé à partir de virions d'influenza. Diverses formes de vaccins contre le virus de la grippe sont 10 actuellement disponibles (par exemple, voir les chapitres 17 & 18 de la référence 1). L'antigène dans les vaccins produits selon l'invention prend la forme d'un virus inactivé. Les moyens chimiques pour inactiver un virus incluent un traitement avec une quantité efficace d'un ou plusieurs des agents suivants: détergents, formaldéhyde, formaline, 3-propiolactone, 15 ou rayons UV. Des moyens chimiques additionnels pour l'inactivation comprennent un traitement avec du bleu de méthylène, du psoralène, du carboxyfullerène (C60) ou une quelconque combinaison de ceux-ci. D'autres méthodes d'inactivation virale sont connues dans l'art, comme par exemple l'éthylamine binaire, l'acétyléthylèneimine ou l'irradiation 20 gamma. Le vaccin peut comprendre un virion entier, un virion fragmenté ou des antigènes de surface purifiés (comprenant de l'hémagglutinine et comprenant, en général, de la neuramidase). Le virion fragmenté et les antigènes de surface purifiés (c'est-à-dire des vaccins à 25 sous-unités de virion) sont particulièrement utiles pour l'invention. Les virions peuvent être récoltés à partir de fluides contenant le virus par divers procédés. Par exemple, un processus de purification peut comprend une centrifugation zonale utilisant une solution à gradient de sucrose linéaire qui comprend du détergent pour dissocier 30 les virions. Les antigènes peuvent alors être purifiés, après dilution optionnelle, par diafiltration. Les virions fragmentés sont obtenus en traitant les virions 2949344 -3- avec des détergents (par exemple, éther éthylique, polysorbate 80, désoxycholate, phosphate de tri-N-butyle, Triton X-100, Triton N101, bromure de cétyltriméthylammonium, Tergitol NP9, etc.) pour produire des préparations de sous-unités de virion, comprenant le processus de 5 fragmentation "Tween-ether". Les procédés de fragmentation de virus influenza sont bien connus dans l'art, par exemple, voir les références 2 û 7, etc. La fragmentation de virus est en général effectuée en dissociant ou en fragmentant des virus entiers, qu'ils soient infectieux ou non infectieux avec une concentration dissociante d'un agent de 10 fragmentation. La dissociation a pour résultat une solubilisation totale ou partielle des protéines du virus, altérant l'intégrité du virus. Les agents de fragmentation préférés sont des agents de surface non ioniques et ioniques (par exemple, cationiques), par exemple alkylglycosides, alkylthioglycosides, sucres acylés, sulfobetaines, betaines, 15 polyoxyéthylène alkyl éthers, N,N-dialkyl-glucamides, Hecameg, alkylphénoxy-polyéthoxyéthanols, composés d'ammonium quaternaire, sarcosyl, CTAB (bromures de cétyltriméthylammonium), phosphate de tri-N-butyle, Cetavlon, sel de myristyltrimethylammonium, lipofectine, lipofectamine, et DOT-MA, octyl- ou nonylphénoxy- polyoxyéthanols (par 20 exemple les agents de surface Triton, tels que Triton X-100 ou Triton N101), polyoxyéthylène sorbitan esters (les agents de surface Tween), éthers de polyoxyéthylène, esters de polyoxyéthylène, etc. Une procédure de fragmentation utile utilise les effets consécutifs du désoxycholate de sodium et du formaldéhyde, et la fragmentation peut 25 avoir lieu pendant la purification initiale du virion (par exemple dans une solution à gradient de sucrose linéaire). Donc un processus de fragmentation peut comprendre la clarification du matériel contenant des virions (pour éliminer le matériel qui n'est pas des virions), la concentration des virions récoltés (par exemple en recourant à un 30 procédé par adsorption tel que l'adsorption CaHPO4), la séparation de virions entiers du matériel qui n'est pas des virions, la fragmentation des virions à l'aide d'un agent de fragmentation au cours d'une étape de 2949344 -4- centrifugation à gradient de densité (par exemple, en utilisant un gradient de sucrose qui contient un agent de fragmentation tel que du désoxycholate de sodium), et puis la filtration (par exemple ultrafiltration) pour éliminer les matériels indésirables. Les virions fragmentés peuvent 5 être utilement remis en suspension dans une solution de chlorure de sodium isotonique tamponnée de phosphate de sodium. Les produits BEGRIVACTM, FLUARIXTM, FLUZONETM et FLUSHIELDTM sont des vaccins à virions fragmentés. Les vaccins à antigènes de surface purifiés comprennent 10 les antigènes de surface hémagglutinine et, typiquement, neuramidase du virus de la grippe. Les processus pour préparer ces protéines sous forme purifiée sont bien connus dans l'art. Les produits FLUVIRINTM AGRIPPALTM et INFLUVACTM sont des vaccins à sous-unités. Les antigènes d'influenza peuvent également être 15 présentés sous la forme de virosomes [8] (particules liposomales de type viral sans acide nucléique), comme dans les produits INFLEXAL VTM et INVAVACTM mais on préfère ne pas utiliser des virosomes avec la présente invention. Donc, dans certaines formes de réalisation, l'antigène d'influenza n'a pas la forme d'un virosome. 20 L'antigène hémagglutinine dans le vaccin peut provenir d'une quelconque souche appropriée. Dans certaines formes de réalisation, l'hémagglutinine est une hémagglutinine qui, quand elle est administrée à un sujet humain sous une forme non adjuvantée, peut susciter le développement d'anticorps anti-hémagglutinine qui peuvent 25 avoir une réaction croisée avec l'hémagglutinine A/California/04/2009 (SEQ ID NO: 1); dans ces formes de réalisation, un adjuvant peut améliorer la réponse immunitaire de sorte qu'un sujet humain produit un large spectre d'anticorps, ce qui peut contribuer à protéger contre des dérives de la souche A/California/04/2009. Dans d'autres formes de 30 réalisation, l'hémagglutinine provient de A/California/04/2009 (SEQ ID NO: 1). Dans d'autres formes de réalisation, l'hémagglutinine comprend une séquence d'acide aminé HA1 ayant au moins 1% d'identité de 2949344 -5- séquence avec la SEQ ID NO: 2, i étant égal à 85 ou supérieur, par exemple 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus (par exemple 100). Des souches H1 N1 avec des antigènes HA appropriés 5 comprennent A/California/04/2009 même, A/California/7/2009, A/Texas/5/2009, A/England/195/2009, et A/New York/18/2009. L'hémagglutinine est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 (A/California/04/2009) qu'à la SEQ ID NO: 3 (A/Chile/1/1983). Une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 10 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 (c'est-à-dire qui a une identité de séquence plus grande avec la SEQ ID NO: 1 qu'avec la SEQ ID NO: 3 quand on les compare en utilisant le même algorithme et les mêmes paramètres) est dénommée ci-après une hémagglutinine H1*. Les SEQ ID NO: 1 et 3 sont à 80,4% identiques. 15 Des séquences complètes utiles d'hémagglutinine H1 à utiliser avec l'invention comprennent la SEQ ID NO: 1 et la SEQ ID NO: 6, ainsi que celles comprenant une séquence d'acide aminé ayant au moins i% d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 2 comme discuté ci-dessus, ou ayant au moins i% d'identité de séquence avec la SEQ ID 20 NO: 7. Idéalement, l'hémagglutinine ne comprend une région hyper basique autour du site de clivage HA1/HA2. Les hémagglutinines préférées ont une préférence de liaison pour les oligosaccharides avec un disaccharide terminal Sia(a2,6)Gal plutôt qu'avec les oligosaccharides avec un disaccharide terminal Sia(a2,3)Gal (voir ci-dessous). 25 La SEQ ID NO: 6 (comprenant la SEQ ID NO: 7) est une hémagglutinine H1* utile. Elle diffère de la SEQ ID NO: 1 au niveau des résidus 214, 226 et 240 (c'est-à-dire une identité de 99,47%). En plus de comprendre une hémagglutinine H1 (telle que l'hémagglutinine H1*), les compositions réalisées en utilisant l'invention 30 peuvent comprendre un (des) antigène(s) provenant d'une ou de plusieurs (par exemple, 1, 2, 3, 4 ou plus) souches additionnelles du virus de la grippe, y compris le virus de la grippe A et / ou le virus de la grippe 2949344 -6- B. Donc, une composition peut comprend un antigène provenant d'une ou plusieurs souches caractéristiques d'un vaccin saisonnier normal plus au moins une hémagglutinine H1*, par exemple un vaccin à 4 valences avec deux souches H1 (une qui est une hémagglutinine H1*, une qui 5 n'est pas une hémagglutinine H1*), une souche H3N2 et une souche de la grippe B, ou un vaccin à 5 valences avec deux souches H1 (une qui est une hémagglutinine H1*, une qui n'est pas une hémagglutinine H1*), une souche H3N2 et deux souches du virus de la grippe B (une souche analogue à B/Victoria/2/87 et une souche analogue à 10 B/Yamagata/16/88). Quand un vaccin comprend plus d'une souche de grippe, les différentes souches sont typiquement cultivées séparément et sont mélangées après que les virus ont été récoltés et les antigènes préparés. Donc, un processus de l'invention peut comprendre l'étape consistant à mélanger des antigènes de plus d'une souche de grippe. 15 Le virus influenza peut être résistant à la thérapie antivirale (par exemple résistant à l'oseltamivir [9 ] et / ou au sanamivir). Dans certaines formes de réalisation, les souches utilisées avec l'invention auront donc de l'hémagglutinine avec une préférence de liaison pour des oligosaccharides avec un disaccharide terminal 20 Sia(a2,6)Gal plutôt que pour des oligosaccharides avec un disaccharide terminal Sia(a2,3)Gal. Pour déterminer si un virus à une préférence de liaison pour des oligosaccharides avec un disaccharide terminal Sia(a2,3)Gal, différents dosages peuvent être utilisés, voir par exemple les références 10 à 13. En fonction du type de dosage, il sera effectué 25 directement avec le virus même ou il peut être effectué indirectement avec l'hémagglutinine purifiée provenant du virus. Dans certaines formes de réalisation, l'hémagglutinine H1 a une glycosylation différente de celles que l'on voit dans les virus dérivés d'oeufs. Donc, la HA (et autres glycoprotéines) peut comprendre des 30 glycoformes que l'on ne voit pas dans les oeufs de poule. La HA utile comprend des glycoformes canines. En plus de comprendre l'antigène hémagglutinine, les 2949344 -7- vaccins fabriqués en utilisant l'invention comprennent typiquement aussi une protéine neuramidase, par exemple le vaccin comprendra une neuramidase virale. L'invention peut protéger contre un ou plusieurs sous-types NA du virus de la grippe A, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 5 ou N9, mais il protégera en général contre N1 (par exemple un virus H1 N1) ou N2 (par exemple un virus H1 N2). Des vaccins à virions entiers, à virions fragmentés ou à sous-unités comprennent tous et hémagglutinine et neuramidase. Quand un vaccin comprend un antigène neuramidase, la neuramidase peut avoir au moins j% d'identité de 10 séquence avec la SEQ ID NO: 4, j étant égal à 75 ou plus, par exemple 75, 80, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus (par exemple 100). De nombreuses séquences de ce genre sont disponibles. Dans certaines formes de réalisation, la neuramidase est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 4 qu'à la SEQ ID NO: 5. Les SEQ ID NO: 4 et 5 sont à 15 82% identiques. Les vaccins peuvent aussi comprendre une protéine matrice, telle que M1 et / ou M2 (ou un fragment de celle-ci), et / ou une nucléoprotéine. Un modèle porcin a montré que l'ajout de M2 à un vaccin contre le virus inactivé de la grippe porcine H1 N1 (adjuvanté avec une 20 émulsion d'huile dans de l'eau) peut améliorer l'efficacité du vaccin [14]. Le virus de la grippe peut être une souche réassortie, et peut être obtenu par des techniques de génétique inverse. Les techniques de génétique inverse [par exemple 15 ù 19] permettent à des virus de la grippe avec des segments génomiques désirés d'être 25 préparés in vitro en utilisant des plasmides ou des systèmes exempts de plasmide. De manière typique, la technique comprend l'expression (a) de molécules d'ADN qui codent des molécules d'ARN virales désirées, par exemple de promoteurs poil ou promoteurs polymérases bactériophages, et (b) de molécules d'ADN qui codent des protéines virales, par exemple 30 de promoteurs polII, de sorte que l'expression des deux types d'ADN dans une cellule conduit à l'assemblage d'un virion infectieux intact complet. L'ADN fournit de préférence la totalité de l'ARN viral et des 2949344 -8- protéines virales, mais il est également possible d'utiliser un virus auxiliaire pour fournir une partie de l'ARN et des protéines. Un virus de la grippe A utilisé avec l'invention peut comprendre un ou plusieurs segments d'ARN d'un virus A/PR/8/34 5 (typiquement 6 segments de A/PR/8/34, les segments HA et N provenant d'une souche de vaccin, c'est-à-dire d'un réassortiment 6 :2), en particulier quand on fait croître les virus dans des oeufs. Un vaccin protège typiquement contre une souche qui est capable de transmission de l'homme à l'homme, et donc le génome de la souche comprendra en 10 général au moins un segment d'ARN qui provient d'un virus grippal de mammifère (par exemple d'un être humain). Les virus utilisés comme source des antigènes peuvent être cultivés sur des oeufs ou sur une culture cellulaire. Le procédé standard actuel de culture de virus grippal a recours à des oeufs de poule 15 embryonnés exempts d'agents pathogènes spécifiques (SPF), le virus étant purifié du contenu de l'oeuf (fluide allantoïque). Plus récemment, toutefois, des virus ont été cultivés dans ces cultures cellulaires animales et, pour des raisons de rapidité et d'allergies des patients, cette méthode de culture est préférée. Si la culture virale sur des oeufs est utilisée, alors 20 un ou plusieurs acides aminés peuvent être introduits dans le fluide allantoïque de l'oeuf en même temps que le virus [7]. Quand on a recours à la culture cellulaire, le substrat de croissance virale sera typiquement une lignée cellulaire d'origine mammifère. Les cellules appropriées d'origine mammifère comprennent, 25 sans toutefois y être limitées, celles du hamster, de bovins, de primates (y compris l'homme et les singes) et de chiens. Les lignées cellulaires de mammifères préférées pour faire croître des virus de la grippe comprennent : les cellules MDCK [20 ù 23], issues d'un rein de chien (Madin Darby canine kidney), les cellules Vero [24 ù 26], issues du rein 30 du singe vert africain (Cercopithecus aethiops), ou les cellules PER.C6 [27] issues de rétinoblastes embryonnaires humains. Ces lignées cellulaires sont largement disponibles, par exemple auprès de la 2949344 -9- American Type Oeil Culture (ATCC) collection, des Coriell Oeil Repositories ou de la collection européenne de cultures cellulaires animales (ECACC). Par exemple, l'ATCC fournit divers types de cellules Vero sous les numéros de catalogue CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 et 5 CRL-1587, et elle fournit des cellules MDCK sous le numéro de catalogue CCL-34. Des cellules PER.C6 peuvent être obtenues auprès de l'ECACC sous le numéro de dépôt 96022940. Les lignées cellulaires qui ont la plus grande préférence pour cultiver des virus de la grippe sont les lignées cellulaires MDCK. La 10 lignée cellulaire MDCK originale peut être obtenue auprès de l'ATCC en tant que CCL-34, mais des dérivés de cette lignée cellulaire peuvent aussi être utilisés. Par exemple, la référence 20 divulgue une lignée cellulaire MDCK qui a été adaptée pour être cultivée dans une culture en suspension (`MDCK 33016', déposée comme DSM ACC 2219). De 15 manière similaire, la référence 28 divulgue une lignée cellulaire issue de la lignée MDCK qui grandit en suspension dans une culture sans sérum ('B-702', déposée comme FERM BP-7449). La référence 29 divulgue des cellules MDCK non tumorigènes, comprenant `MDCK-S' (ATCC PTA-6500), `MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), `MDCK-SF102' (ATCC 20 PTA-6502) et `MDCK-SF103' (PTA-6503). La référence 30 divulgue des lignées cellulaires MDCK avec une susceptibilité élevée à l'infection, comprenant des cellules `MDCK.5F1' (ATCC CRL-12042). N'importe laquelle de ces lignées cellulaires MDCK peut être utilisée. Quand un virus a été cultivé sur une lignée cellulaire de 25 mammifère, alors la composition peut avantageusement être exempte de protéines d'oeuf (par exemple ovalbumine et ovomucoïde) et de l'ADN de la poule, réduisant ainsi l'allergénicité. Quand le virus a été cultivé sur une lignée cellulaire, alors la culture de croissance, et également l'inoculum viral utilisé pour 30 démarrer la culture, seront de préférence exempts (c'est-à-dire auront été testés et auront un résultat négatif en ce qui concerne la contamination par) le virus herpes simplex, le virus syncytial respiratoire, le virus 2949344 - 10 - parainfluenza de type 3, le coronavirus SRAS, l'adénovirus, le rhinovirus, les réovirus, les polyomavirus, les birnavirus, les circovirus et / ou les parvovirus [31]. L'absence de virus herpes simplex est particulièrement préférée. 5 Pour la croissance sur une lignée cellulaire, par exemple sur des cellules MDCK, on peut faire croître le virus sur des cellules en suspension [20, 32, 33] ou dans une culture adhérente. Une lignée cellulaire MDCK appropriée pour une culture en suspension est MDCK 33016 (déposée comme DSM ACC 2219). Comme alternative, une 10 culture sur des microporteurs peut être utilisée. On fait de préférence croître les lignées cellulaires supportant une réplication du virus de la grippe dans des milieux de culture sans sérum et/ou sans protéine. Est dénommé milieu sans sérum dans le contexte de la présente invention un milieu dans lequel il n'y a 15 pas d'additifs de sérum d'origine humaine ou animale. Il est entendu que sans protéine signifie des cultures dans lesquelles la multiplication des cellules survient à l'exclusion de protéines, de facteurs de croissance, d'autres additifs de protéines et de protéines qui ne sont pas de protéines de sérum, mais qui peuvent comprendre optionnellement des protéines 20 de type trypsine ou d'autres protéases qui peuvent être nécessaires pour la croissance virale. Les cellules croissant dans de telles cultures contiennent naturellement elles-mêmes des protéines. On fait de préférence croître les lignées cellulaires supportant la réplication du virus de la grippe à moins de 37° C [34] 25 pendant la réplication virale, par exemple à 30 û 36° C, à 31 - 35° C, ou à 33+1°C. Le procédé pour propager un virus dans des cellules cultivées comprend en général les étapes consistant à inoculer aux cellules cultivées la souche à cultiver, à cultiver les cellules infectées 30 pendant une période de temps désirée pour la propagation du virus, telle que déterminée par exemple par titre viral ou expression d'antigènes (par exemple entre 24 et 168 heures après inoculation) et à collecter le virus 2949344 -11- propagé. On inocule aux cellules cultivées un virus (mesuré par PFU or TCID50) dans un rapport cellulaire de 1 : 500 à 1 : 1, de préférence de 1 : 100 à 1 : 5, mieux encore de 1 : 50 à 1:10. Le virus est ajouté à une suspension de cellules ou est appliqué à une monocouche des cellules, 5 et le virus est absorbé sur les cellules pendant au moins 60 minutes mais en général pendant moins de 300 minutes, de préférence entre 90 et 240 minutes à une température de 25° C à 40°C, de préférence de 28° C à 37° C. La culture de cellules infectées (par exemple monocouches) peut être enlevées soit par gel - dégel ou par action enzymatique pour 10 accroître le contenu viral des surnageants de culture récoltés. Les fluides récoltés sont alors soit inactivés soit stockés congelés. Les cellules cultivées peuvent être infectées avec une multiplicité d'infection ( MOI ) d'environ 0,0001 à 10, de préférence de 0,002 à 5, mieux encore de 0,001 à 2. Mieux encore, les cellules sont infectées avec une MOI 15 d'environ 0,01. Les cellules infectées peuvent être récoltées de 30 à 60 heures après infection. Les cellules sont de préférence récoltées de 34 à 48 heures après infection. Mieux encore, les cellules sont récoltées de 38 à 40 heures après infection. Des protéases (typiquement de la trypsine) sont en général ajoutées pendant la culture cellulaire pour permettre la 20 libération du virus, et les protéases peuvent être ajoutées à un quelconque stade approprié pendant la culture. L'hémagglutinine (HA) est le principal immunogène dans les vaccins inactivés contre la grippe et les doses de vaccin sont standardisées par référence à des niveaux de HA, typiquement mesurés 25 par un dosage par immunodiffusion radiale simple (SRID). Les vaccins actuels contiennent typiquement environ 15 pg de HA par souche, bien que des doses plus faibles soient également utilisées, par exemple pour les enfants ou dans des situations d'urgence. Des doses fractionnaires telles que '/2 (c'est-à-dire 7,5 pg de HA par souche), 1/4 (c'est-à-dire 3,75 30 pg par souche) et 1/8 ont été utilisées [35, 36], tout comme des doses plus fortes (par exemple des doses 3x ou 9x [37, 38]. Donc, les vaccins peuvent comprendre entre 0,1 et 150 pg de HA par souche grippale, de 2949344 - 12 - préférence entre 0,1 et 50 pg, par exemple. 0,1 - 20 pg, 0,1 - 15 pg, 0,1 - 10 pg, 0,1 - 7,5 pg, 0,5 - 5 pg, 3,75 - 15 pg etc. Des doses particulières comprennent par exemple environ 45, environ 30, environ 15, environ 10, environ 7,5, environ 5, environ 3,8, environ 3,75, environ 5 1,9, environ 1,5, etc. pg par souche. La HA utilisée avec l'invention peut être une HA naturelle telle qu'on la trouve dans un virus ou peut avoir été modifiée. Quand on a fait croître un virus sur une lignée cellulaire, alors la pratique courante est de réduire la quantité d'ADN résiduel de la 10 lignée cellulaire dans le vaccin final afin de réduire toute activité oncogénique de l'ADN. Donc, la composition contient de préférence moins de 10 ng, de préférence moins de 1 ng, et mieux encore moins de 100 pg) d'ADN résiduel de la cellule hôte par dose, bien que des quantités d'ADN de la cellule hôte sous forme de trace peuvent être 15 présentes. En général, l'ADN de la cellule hôte qu'il est souhaitable d'exclure est l'ADN qui est plus long que 100 bp. L'ADN contaminant peut être éliminé pendant la préparation du vaccin en utilisant des procédures de purification standard, par exemple la chromatographie, etc. L'élimination de l'ADN résiduel de la 20 cellule hôte peut être améliorée par traitement à la nucléase, par exemple en utilisant une DNase. Un procédé commode pour réduire la contamination par l'ADN de la cellule hôte est divulgué dans les références 39 & 40; il comprend un traitement en deux étapes, tout d'abord l'utilisation d'une DNase (par exemple Benzonase) qui peut être 25 utilisée pendant la croissance virale et puis d'un détergent cationique (par exemple CTAB) qui peut être utilisé pendant la dissociation des virions. Un traitement avec un agent alkylant, tel que de la 3-propiolactone, peut aussi être utilisé pour éliminer l'ADN de la cellule hôte et peut aussi être avantageusement utilisé pour inactiver les virions [41] tout en évitant 30 l'utilisation de formaldéhyde. 2949344 - 13 - Adjuvants sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau Des compositions réalisées en utilisant l'invention peuvent comprendre (ou être utilisées avec) un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau qui peut fonctionner pour améliorer les réponses 5 immunitaires (humorales et / ou cellulaires) obtenues chez un patient qui reçoit la composition. Diverses émulsions appropriées sont connues et elles comprennent typiquement au moins une huile et au moins un agent tensioactif, l'huile (les huiles) et l'agent tensioactif (les agents 10 tensioactifs) étant biodégradables (métabolisables) et biocompatibles. Les gouttelettes d'huile dans l'émulsion font en général moins de 5 pm de diamètre, et l'émulsion comprend avantageusement des gouttelettes d'huile de diamètre submicronique, ces petites tailles étant obtenues avec un microfluidiseur pour fournir des émulsions stables. On préfère 15 des gouttelettes ayant une taille inférieure à 220 nm étant donné qu'elles peuvent être soumises à une stérilisation par filtration. Les adjuvants spécifiques sous forme d'émulsion qui sont utiles avec l'invention incluent, sans toutefois y être limités: • Une émulsion submicronique de squalène, de Tween 80 et de Span 20 85. La composition de l'émulsion en volume peut être d'environ 5 0/0 de squalène, d'environ 0,5 % de polysorbate 80 et de 0,5 % de Span 85. En termes de poids, ces rapports deviennent 4,3 % de squalène, 0,5 % de polysorbate 80 et 0,48 % de Span 85. Cet adjuvant est connu en tant que `MF59' [42 û 44], comme décrit de manière plus 25 détaillée au chapitre 10 de la référence 45 et au chapitre 12 de la référence 46. L'émulsion de MF59 comprend avantageusement des ions de citrate, par exemple 10 mM de tampon citrate de sodium. • Une émulsion comprenant du squalène, un a-tocophérol, et du polysorbate 80. Ces émulsions peuvent avoir de 2 à 10 % de 30 squalène, de 2 à 10 % de tocophérol et de 0,3 à 3 % de Tween 80 et le rapport pondéral de squalène : tocophérol est de préférence 1 (par exemple 0,90) étant donné qu'il fournit une émulsion plus stable. 2949344 - 14 - Squalène et Tween 80 peuvent être présents selon un rapport volumique d'environ 5 : 2, ou un rapport pondéral d'environ 11 : 5. Une telle émulsion peut être réalisée en dissolvant du Tween 80 dans du PBS pour donner une solution à 2 %, puis en mélangeant 90 ml de 5 cette solution avec un mélange de (5 g de DL-a-tocopherol et 5 ml de squalène), puis en microfluidisant le mélange. L'émulsion résultante peut avoir des gouttelettes d'huile submicroniques, par exemple ayant un diamètre moyen entre 100 et 250 nm, de préférence d'environ 180 nm. 10 • Une émulsion comprenant du squalène, un solvant aqueux, un agent tensioactif non ionique hydrophile à base d'éther d'alkyle polyoxyéthyléné (par exemple un éther de cétostéaryle polyoxyéthyléné (12)) et un agent tensioactif non ionique hydrophobe (par exemple un ester de sorbitan ou un ester de mannide, tel que du 15 monoléate de sorbitan ou du `Span 80'). L'émulsion est de préférence thermoréversible et / ou a au moins 90 % de gouttelettes d'huile (en volume) ayant une taille inférieure à 200 nm [47]. L'émulsion peut aussi comprendre un ou plusieurs de: alditol (par exemple mannitol), un agent cryoprotecteur (par exemple un sucre tel que du 20 dodécylmaltoside et/ ou du sucrose), et/ ou un alkylpolyglycoside. De telles émulsions peuvent être lyophilisées. L'émulsion peut comprendre du squalène : éther de cétostéaryle polyoxyéthyléné : oléate de sorbitan : mannitol 330 : 63 : 49 : 61. Les antigènes et les adjuvants dans une composition seront 25 typiquement un ajout mélangé au moment de l'administration à un patient. Les émulsions peuvent être mélangées avec l'antigène pendant la fabrication ou de manière extemporanée au moment de l'administration. Donc, l'adjuvant et l'antigène peuvent être conservés séparément dans un vaccin emballé ou distribué, prêt pour la formulation 30 finale au moment de l'utilisation. L'antigène se présentera en général sous une forme aqueuse de sorte que le vaccin est finalement préparé en mélangeant deux liquides. Le rapport volumique des deux liquides 2949344 - 15 - pour le mélange peut varier (par exemple entre 5 : 1 et 1 : 5) mais est en général d'environ 1 : 1. Quand une composition comprend un tocophérol, on peut utiliser un quelconque des a, [3, y, 6, c ou tocophérols mais on préfère 5 les a-tocophérols. Un a-tocophérol préféré est le DL- a-tocophérol et le sel préféré de ce tocophérol est le succinate. Comme mentionné ci-dessus, les émulsions d'huile dans de l'eau comprenant du squalène sont particulièrement préférées. Dans certaines formes de réalisation, la concentration de squalène dans une 10 dose de vaccin peut être de l'ordre de 5 û 15 mg (c'est-à-dire une concentration de 10 û 30 mg / ml, pour un volume de dose de 0,5 ml). Il est néanmoins possible de réduire la concentration de squalène [48, 49], par exemple pour comprendre < 5 mg par dose, ou même < 1,1 mg par dose. Par exemple, une dose humaine peut comprendre 9,75 mg de 15 squalène par dose (comme dans le produit FLUADTM : 9,75 mg de squalène, 1,175 mg de polysorbate 80, 1,175 mg de trioléate de sorbitan dans un volume de dose de 0,5 ml), ou elle peut comprend une quantité fractionnaire de ceux-ci, par exemple 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1 /9 ou 1/10. Par exemple, une composition peut comprendre 7,31 20 mg de squalène par dose (et donc 0,88 mg et de polysorbate 80 et de trioléate de sorbitan), 4,875 mg de squalène / dose (et donc 0,588mg et de polysorbate 80 et de trioléate de sorbitan), 3,25 mg de squalène / dose, 2,438 mg / dose, 1,95 mg / dose, 0,975 mg / dose, etc. Une quelconque de ces dilutions fractionnaires de FLUADTM adjuvanté 25 au MF59 peut être utilisée avec l'invention. Comme mentionné ci-dessus, le mélange antigène / émulsion peut être effectuée de manière extemporanée, au moment de l'administration. Donc, l'invention peut être utilisée pour fabriquer des kits comprenant les composants antigène et adjuvant prêts 30 à être mélangés, gardés séparés jusqu'au moment de l'utilisation. 2949344 -16- Compositions pharmaceutiques Les compositions réalisées avec l'invention sont pharmaceutiquement acceptables. Elles comprennent en général des composants en plus de l'antigène, par exemple elles comprennent 5 typiquement un ou plusieurs support(s) et / ou excipient(s) pharmaceutiques. Une discussion approfondie de ces composants est disponible dans la référence 50. Les compositions se présenteront en général sous forme aqueuse. 10 La composition peut comprendre des agents conservateurs tels que du thiomersal (par exemple à 10 pg / ml) ou du 2-phénoxyéthanol. On préfère toutefois que le vaccin soit essentiellement exempt de (c'est-à-dire moins de 5 pmg / ml) de matériel mercuriel par exemple sans thiomersal [51]. Des vaccins sans mercure sans 15 davantage préférés. Des vaccins sans conservateur sont particulièrement préférés. Pour contrôler la tonicité, on préfère inclure un sel physiologique tel que du sel de sodium. On préfère le chlorure de sodium (NaCl) qui peut être présent à raison de 1 à 20 mg / ml. D'autres sels qui 20 peuvent être présents comprennent le chlorure de potassium, le phosphate de dihydrogène de potassium, le phosphate disodique dihydraté, le chlorure de magnésium, le chlorure de calcium, etc. Les compositions auront en général une osmolalité entre 200 mOsm / kg et 400 mOsm / kg, de préférence entre 240 - 360 25 mOsm / kg et mieux encore se situeront dans la plage de 290 - 310 mOsm / kg. Les compositions peuvent comprendre un ou plusieurs tampons. Les tampons typiques comprennent: un tampon phosphate, un tampon tris, un tampon borate, un tampon succinate, un tampon histidine 30 ou un tampon citrate. Les tampons seront typiquement compris dans la plage de 5- 20 mM. Le tampon peut être dans une phase aqueuse d'émulsion. 2949344 - 17 - Le pH d'une composition sera en général compris entre 5,0 et 8,1, plus typiquement entre 6,0 et 8,0, par exemple. 6,5 et 7,5 ou entre 7,0 et 7,8. Un procédé de l'invention peut par conséquent comprendre une étape d'ajustement du pH du vaccin en vrac avant emballage. 5 La composition est de préférence stérile. La composition est de préférence exempte de gluten. Les vaccins préférés ont une faible teneur en endotoxine, par exemple inférieure à 1 lU / ml et de préférence < 0.5 IU / ml. Le vaccin est de préférence exempt d'antibiotique (par 10 exemple néomycine, kanamycine, polymyxine B). La composition peut comprendre du matériel pour une unique immunisation ou peut comprendre du matériel pour de multiples immunisations (c'est-à-dire une composition `multidose'). Les arrangements multidoses comprennent en général un agent conservateur 15 dans le vaccin. Les vaccins contre la grippe sont en général administrés dans un volume de dosage d'environ 0,5 ml bien qu'une demi dose (c'est-à-dire environ 0,25 ml) puisse être administrée aux enfants et des doses unitaires seront choisies en conséquence par exemple une dose 20 unitaire pour donner une dose de 0,5 ml pour l'administration à un patient. Emballage de compositions ou composants en kit Les processus de l'invention peut comprendre une étape dans laquelle du vaccin est placé dans un récipient, et en particulier dans 25 un récipient de distribution à utiliser par des médecins. Des récipients appropriés pour les vaccins comprennent des files et des seringues jetables qui doivent être stériles. Quand une composition / un composant se trouve dans une fiole, la fiole est de préférence en verre ou en matière plastique. La fiole 30 est de préférence stérilisée avant que la composition y soit ajoutée. La fiole peut comprendre une unique dose de vaccin ou elle peut comprendre plus d'une dose (une fiole `multidose') par exemple 10 2949344 - 18 - doses. Les fioles préférées sont en verre incolore. Une fiole peut avoir un bouchon (par exemple un bouchon Luer Lock) adapté de telle manière qu'une seringue pré-remplie puisse être insérée dans le bouchon, que le contenu de la seringue puisse être 5 expulsé dans la fiole et que le contenu de la fiole puisse être retiré avec la seringue. Produits et kits de vaccin L'invention peut être utilisée pour faire divers vaccins différents. 10 Un vaccin fabriqué en utilisant l'invention comprend (i) une hémagglutinine H1 du virus de la grippe de sous-type A qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 et (ii) un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau. Cette composition est un vaccin monovalent inactivé à antigènes de surface. On a pu faire 15 croître les virus inactivés sur des oeufs ou en culture cellulaire (par exemple dans ces cellules MDCK). Le vaccin peut être présenté dans une seringue contenant une dose unitaire de 0,5 ml, chaque dose unitaire comprenant environ 7,5 pg de l'hémagglutinine H1. La seringue peut être en verre avec un piston plongeur en caoutchouc bromobutyle. 20 L'adjuvant comprend du squalène, du polysorbate 80 et du trioléate de sorbitan, par exemple environ 9,75 mg de squalène, environ 1,18 mg de polysorbate 80 et environ 1,18 mg de trioléate de sorbitan par 7,5 pg de HA. La composition peut comprendre un tampon citrate. La composition est idéalement exempte de mercure bien qu'une faible dose de 25 thimérosal puisse parfois être incluse. Dans certaines formes de réalisation, un vaccin adjuvanté a 3,75 pg de HA, notamment quand un volume de dosage de 0,25 ml est utilisé. Un autre vaccin fabriqué en utilisant l'invention comprend (i) une hémagglutinine H1 du virus de la grippe de sous-type A qui est plus 30 étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 et (ii) un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau. Cette composition est un vaccin monovalent inactivé à antigènes de surface. On a pu faire 2949344 - 19 - croître les virus inactivés sur des oeufs. Le vaccin peut être présenté dans une fiole contenant de multiples doses unitaires de 0,5 ml, par exemple une fiole de 10 doses comprenant du thimérosal, chaque dose unitaire comprenant environ 7,5 pg ou 15 pg ou 30 pg de 5 l'hémagglutinine H1. L'adjuvant comprend du squalène, du polysorbate 80 et du trioléate de sorbitan, par exemple environ 9.75 mg de squalène, environ 1,18 mg de polysorbate 80 et environ 1,18 mg de trioléate de sorbitan par 7.5 pg of HA. La composition peut comprendre un tampon citrate. 10 Un autre vaccin fabriqué en utilisant l'invention comprend (i) une hémagglutinine H1 du virus de la grippe de sous-type A qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 et (ii) un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau. Cette composition est un vaccin monovalent inactivé à antigènes de surface. On a fait 15 croître les virus inactivés dans des cellules MDCK. Le vaccin est présenté avec une dose unitaire contenant 3,75 pg de l'hémagglutinine H1. L'adjuvant comprend du squalène, du polysorbate 80 et du trioléate de sorbitan, par exemple environ 4,875 mg de squalène, environ 0,59 mg de polysorbate 80 et environ 0,59 mg de trioléate de sorbitan. La 20 composition peut comprendre un tampon citrate. Une dose unitaire peut avoir un volume de 0,25 ml. Le vaccin peut être distribué comme un paquet de 10 x dose de 0,25 ml. Un autre vaccin fabriqué en utilisant l'invention comprend (1) une hémagglutinine H1 du virus de la grippe de sous-type A qui est 25 plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 et (ii) un adjuvant comprenant et du phosphate d'aluminium et de l'hydroxyde d'aluminium. Dans une forme de réalisation utile, cette composition est un vaccin monovalent inactivé à virions entiers. On peut avoir fait croître les virus inactivés sur des oeufs. Le vaccin peut être 30 présenté dans une seringue contenant une dose unitaire de 0,5 ml, chaque dose unitaire comprenant environ 15 pg de l'hémagglutinine H1. L'adjuvant peut comprendre, dans un volume de 0,5 ml, environ 0,5 mg 2949344 - 20 - de AI+++ par exemple 0,45 mg de phosphate d'aluminium et 0,05 mg d'hydroxyde d'aluminium, hydraté. La composition peut comprendre 50 pg de thiomersal. Un autre vaccin fabriqué en utilisant l'invention comprend 5 (1) une hémagglutinine H1 du virus de la grippe de sous-type A qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 et (ii) un adjuvant comprenant du phosphate d'aluminium. Dans une forme de réalisation utile, cette composition est un vaccin monovalent inactivé à virions entiers (par exemple obtenu par inactivation au formaldéhyde). On 10 a pu faire croître les virus inactivés sur des oeufs. Le vaccin peut être présenté dans une ampoule contenant une dose unitaire de 0,5 ml, chaque dose unitaire contenant environ 6 pg de l'hémagglutinine H1 (par exemple d'une souche réassortie telle que X-179A). L'hémagglutinine peut être adsorbée sur l'adjuvant de phosphate d'aluminium qui peut être 15 sous forme de gel. La composition peut contenir du thiomersal. Un autre vaccin fabriqué en utilisant l'invention est un vaccin sans adjuvant comprenant une hémagglutinine H1 du virus de la grippe de sous-type A qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 (par exemple d'une souche 20 A/California/7/2009). Cette composition est un vaccin monovalent inactivé à virions entiers pour lequel on a fait croître les virus inactivés sur des cellules Vero. Le vaccin peut être présenté dans une fiole contenant de multiples doses, par exemple 10 x dose unitaire de 0,5 ml, chaque dose unitaire contenant environ 7,5 pg de l'hémagglutinine H1 25 (c'est-à-dire 75 pg par fiole multidose). La composition peut comprendre du trométamol, du chlorure de sodium et du polysorbate 80. Un autre vaccin fabriqué en utilisant l'invention est un vaccin non adjuvanté comprenant une hémagglutinine H1 du virus de la grippe de sous-type A qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID 30 NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 (par exemple d'une souche A/California/7/2009). Cette composition est un vaccin monovalent inactivé à virions fragmentés pour lequel on a fait croître les virus 2949344 - 21 - inactivés sur des oeufs. Le vaccin peut être présenté dans une fiole contenant de multiples doses (par exemple 10 x dose unitaire de 0,5 ml avec un agent conservateur thimérosal qui peut être présent à raison de 45 pg par dose unitaire de 0,5 ml) ou dans des seringues (une dose par 5 seringue). Chaque dose de vaccin peut avoir 7,5, 15 ou 30 pg de l'hémagglutinine H1. Le vaccin peut comprendre un tampon phosphate. L'invention peut aussi être utilisée pour la fabrication d'un kit comprenant (i) un premier composant de kit comprenant une hémagglutinine H1 du virus de la grippe de sous-type A sans adjuvant 10 qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3, fabriqué en utilisant l'invention, et (ii) un deuxième composant de kit comprenant un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau. Les deux composants de kit peuvent être mélangés au moment de l'utilisation pour donner un vaccin monovalent. Le premier composant de 15 kit est un vaccin monovalent inactivé à virions fragmentés. On a pu faire croître les virus inactivés sur des oeufs. Le kit peut être présenté comme une composition à deux fioles, chaque fiole comprenant un volume égal de liquide à mélanger dans un rapport volumique 1 : 1, par exemple pour mélanger 2,5 ml d'antigène avec 2,5 ml d'adjuvant. Une dose unitaire de 20 0,5 ml du vaccin monovalent adjuvanté peut comprendre 7,5 pg, 3,75 pg ou 1,9 pg de l'hémagglutinine H1. L'adjuvant comprend du squalène, du DL-a-tocophérol et du polysorbate 80, par exemple dans une dose unitaire de 0,5 ml: environ 10,7 mg de squalène, environ 11,9 mg de tocophérol et environ 4,9 mg de polysorbate 80 (ou une quantité 25 fractionnaire de ceux-ci, par exemple 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, ou 1/10 de ces quantités de squalène, tocophérol et polysorbate 80). Donc, les composants de l'adjuvant peuvent être présents dans un rapport massique (squalène : tocophérol : polysorbate 80) de 2,20 : 2,44: 1. Les composants de l'adjuvant peuvent être présents à 30 raison de 2,85 pg de squalène, 3,16 pg de tocophérol et 1,30 pg de polysorbate 80 par pg d'hémagglutinine H1. Le vaccin peut contenir l'agent conservateur thiomersa,l par exemple à raison d'environ 2949344 - 22 - 10 pg / ml, c'est-à-dire environ 5 pg dans une dose de 0,5 ml. Les composants antigène et adjuvant peuvent tous deux comprendre un tampon phosphate. Le composant antigène peut comprendre du polysorbate 80, de l'octoxynol 10, du chlorure de potassium et / ou du 5 chlorure de magnésium. Un kit peut comprendre 50 fioles d'antigène (2,5 ml de suspension dans chaque) et 50 fioles d'adjuvant (2,5 ml d'émulsion dans chaque). Les fioles d'antigène peuvent être dans un unique emballage; les fioles d'adjuvant peuvent être dans deux emballages. 10 Un autre kit comprend (i) un premier composant de kit comprenant une hémagglutinine H1 du virus de la grippe de sous-type A sans adjuvant qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3, fabriqué en utilisant l'invention, et (ii) un deuxième composant de kit comprenant un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile 15 dans de l'eau. Les deux composants de kit peuvent être mélangés au moment de l'utilisation pour donner un vaccin monovalent.. Dans une forme de réalisation utile, le premier composant de kit est un vaccin monovalent inactivé à virions fragmentés. On peut avoir fait croître les virus inactivés sur des oeufs. Le kit peut être présenté comme une 20 composition à deux fioles (par exemple verre borosilicate, optionnellement avec des bouchons en chlorobutyle), la première fiole contenant un volume unitaire d'antigène et la deuxième fiole contenant 3x ce volume unitaire d'émulsion, par exemple à mélanger pour donner 4x le volume unitaire de vaccin final. Donc, 1,5 ml d'antigène peut être 25 combine avec 4,5 ml d'émulsion pour donner 6 ml de vaccin. Une dose unitaire de 0,5 ml du vaccin monovalent non adjuvanté peut comprendre environ 3,8 pg de l'hémagglutinine H1. L'adjuvant comprend du squalène, de l'oléate de sorbitan, de l'éther de cétostéaryle polyoxyéthyléné et du mannitol, par exemple dans une dose unitaire de 30 0,5 ml: environ 12,4 mg de squalène, environ 1,9 mg d'oléate de sorbitan, environ 2,4 mg d'éther de cétostéaryle polyoxyéthyléné et environ 2,3 mg de mannitol (ou une fraction de ceux-ci, par exemple 3/4, - 23 - 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1 /9 ou 1/10). Donc, les composants de l'adjuvant peuvent être présents dans un rapport massique (squalène : oléate de sorbitan : éther de polyoxyéthylène cétostéarylique : mannitol) de 124 : 19 : 24 : 23. Le vaccin peut contenir l'agent conservateur thiomersal, par exemple à raison d'environ 11,3 pg par 0,5 ml ou à raison d'environ 3 pg de thiomersal par pg d'hémagglutinine. Les composants antigène et adjuvant peuvent tous deux comprendre un tampon phosphate. Les vaccins mentionnés dans cette section peuvent utilement contenir une hémagglutinine comprenant la SEQ ID NO: 7. Les vaccins préférés satisfont à 1, 2 ou 3 des critères d'efficacité du CPMP. Pour les adultes (18 ù 60 ans), ces critères sont : (1) 70 % de séroprotection, (2) 40 % de séroconversion, et / ou une augmentation de la MGT 2,5 fois. Chez les personnes âgées ((> 60 ans), ces critères sont : (1) 60 % de séroprotection; (2) 30 % de séroconversion et / ou (3) une augmentation de la MGT 2 fois. Ces critères sont fondés sur des essais ouverts avec au moins 50 patients. Les critères s'appliquent pour chaque souche dans un vaccin. Virus réassortis Comme mentionné ci-dessus, l'invention peut utiliser une souche de virus de la grippe réassorti. Dans un tel virus réassorti, (a) le gène viral de l'hémagglutinine code une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3 et (b) au moins un autre gène viral provient de la souche de virus de la grippe (A/Puerto Rico/8/34). Donc, le virus peut comprendre au moins un des segments NP, M, NS, PA, PB1 et / ou PB2 de A/PR/8/34. Dans un autre virus réassorti, (a) le gène viral de l'hémagglutinine code une protéine hémagglutinine qui a au moins k % d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 1, k étant égal à 85 ou plus, par exemple 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus (par exemple 100), et (b) au moins un autre gène viral provient de la souche de virus de la grippe (A/Puerto Rico/8/34). Donc, le virus peut comprendre au 2949344 - 24 - moins un des segments NP, M, NS, PA, PB1 et / ou PB2 de A/PR/8/34. Dans ces virus, le gène neuramidase viral peut coder une protéine neuramidase qui a au moins j % d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 4, j étant égal à 75 ou plus, par exemple 75, 80, 85, 88, 90, 5 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou plus (par exemple 100). Dans certaines formes de réalisation, la neuramidase est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 4 qu'à la SEQ ID NO: 5. Les huit segments du génome du virus de la grippe A codent (i) la sous-unité PA de la polymérase virale, (ii) la sous-unité PB1 10 de la polymérase virale, (iii) la sous-unité PB2 de la polymérase virale, (iv) la nucléoprotéine virale, (v) les protéines de la matrice virale, (vi) les protéines virales NS1 et NS2, (vii) l'hémagglutinine et (viii) la neuramidase. Les virus réassortis préférés sont des réassortis 6 : 2, c'est-à-dire qu'ils comprennent 6 segments d'une souche (par exemple 15 de A/PR/8/34) mais les segments HA et NA d'une souche différente (par exemple comme défini ci-dessus par référence aux SEQ ID NO 1 et 4). Dans d'autres formes de réalisation, il y a un réassorti 7 : 1 avec HA comme défini ci-dessus. Dans d'autres formes de réalisation, le virus comprend des gènes de trois origines différentes mais avec au moins un 20 segment (par exemple 1, 2, 3, 4, 5, 6) provenant de A/PR/8/34. Des segments viraux de A/PR/8/34, et leurs séquences, sont largement disponibles Ces virus sont particulièrement utiles pour préparer des vaccins et peuvent être commodément préparés par génétique inverse. 25 Des vaccins comprenant un ou plusieurs des gènes viraux de A/PR/8/34 peuvent être utilisés pour préparer des vaccins inactivés contre la grippe. Les virus réassortis peuvent être cultivés dans des cellules MDCK et l'invention utilise un procédé pour préparer un vaccin comprenant les étapes consistant à : (i) infecter une culture cellulaire 30 avec un virus comme défini ci-dessus, (ii) cultiver la culture cellulaire de l'étape (i) pour produire d'autres virus, (iii) purifier les virus obtenus à l'étape (ii), et (iv) traiter les virus purifiés à l'étape (iii) pour préparer un 2949344 - 25 - vaccin. Le vaccin peut être un vaccin en vrac. Il peut être utilisé pour produire un produit de vaccin final monovalent ou il peut être utilisé comme un composant pour fabriquer un produit de vaccin final multivalent. La culture cellulaire à l'étape (i) est de préférence une culture 5 de cellules MDCK mais d'autres cellules (idéalement des cellules de mammifères tels que des cellules PER.C6) peuvent être utilisées comme alternative. L'invention fournit également un procédé pour préparer un vaccine comprenant les étapes consistant à (i) préparer un virus de la 10 grippe réassorti en recourant à la génétique inverse, par exemple avec un gène hémagglutinine viral codant une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: qu'à la SEQ ID NO: 3; (ii) utiliser la souche réassortie pour fabriquer un vaccin. L'étape (ii) peut comprendre: la culture d'un virus (par exemple dans des oeufs ou en 15 culture cellulaire) et la préparation du vaccin à partir du virus cultivé. Le virus cultivé peut être inactivé, et le virus inactivé peut ensuite être utilisé pour préparer le vaccin (par exemple après fragmentation ou après purification des antigènes). L'invention fournit également un procédé pour préparer un 20 vaccin comprenant une étape consistant à utiliser un virus de la grippe réassorti comme défini ci-dessus, qui a été préparé en recourant à la génétique inverse. Généralités Le terme comprenant englobe contenant ainsi que 25 consistant , par exemple une composition comprenant X peut consister exclusivement en X ou peut contenir quelque chose en plus par exemple X + Y. Le mot essentiellement n'exclut pas complètement , par exemple une composition qui est essentiellement exempte de Y 30 peut être complètement exempte de Y. Quand c'est nécessaire, le mot essentiellement peut être omis de la définition de l'invention. Le terme environ se rapportant à une valeur numérique - 26 - x est optionnel et signifie, par exemple x 10 %. Sous réserve d'indication spécifique, un processus comprenant une étape consistant à mélanger deux ou plus de deux composants ne requiert pas un ordre spécifique de mélange. Donc, les composants peuvent être mélanger dans un ordre quelconque. Quand il y a trois composants, deux composants peuvent alors être combinés l'un avec l'autre et la combinaison peut ensuite être combinée avec le troisième composant, etc. Quand des matériels animaux (et notamment bovins) sont utilisés dans la culture de cellules, ils doivent être obtenus de sources qui sont exemptes d'encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) et notamment exemptes d'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB). Dans l'ensemble, on préfère des cellules de culture en l'absence totale de matériels dérivés d'animaux. The haemagglutinin elicits an immune response from a recipient, and the adjuvant increases the heterovarant coverage of that response so that protection can be provided against the homologous strain and also against variants thereof. than derived strains that can appear naturally. The invention has been useful for preparing the vaccine products FOCETRIATM and CELTURATM Antigenic Components The invention uses the influenza A hemagglutinin as the vaccine antigen. The antigen is prepared from influenza virions. Various forms of influenza vaccines are currently available (for example, see Chapters 17 & 18 of Reference 1). The antigen in the vaccines produced according to the invention takes the form of an inactivated virus. Chemical means for inactivating a virus include treatment with an effective amount of one or more of the following agents: detergents, formaldehyde, formalin, 3-propiolactone, or UV light. Additional chemical means for inactivation include treatment with methylene blue, psoralen, carboxyfullerene (C60) or any combination thereof. Other methods of viral inactivation are known in the art, such as, for example, binary ethylamine, acetylethyleneimine or gamma irradiation. The vaccine may comprise a whole virion, a fragmented virion, or purified surface antigens (including hemagglutinin and generally including neuramidase). Fragmented virion and purified surface antigens (i.e., virion subunit vaccines) are particularly useful for the invention. Virions can be harvested from fluids containing the virus by various methods. For example, a purification process may include zonal centrifugation using a linear sucrose gradient solution that includes detergent to dissociate the virions. The antigens can then be purified, after optional dilution, by diafiltration. The fragmented virions are obtained by treating the virions with detergents (e.g., ethyl ether, polysorbate 80, deoxycholate, tri-N-butyl phosphate, Triton X-100, Triton N101, cetyltrimethylammonium bromide, Tergitol NP9 , etc.) to produce virion subunit preparations, including the "Tween-ether" fragmentation process. Influenza virus fragmentation methods are well known in the art, for example, see references 2-7, etc. Virus fragmentation is generally accomplished by disrupting or fragmenting whole viruses, whether infectious or non-infectious with a dissociative concentration of a fragmenting agent. Dissociation results in total or partial solubilization of the virus proteins, altering the integrity of the virus. The preferred fragmenting agents are nonionic and ionic surfactants (eg, cationic), for example alkyl glycosides, alkylthioglycosides, acylated sugars, sulfobetaines, betaines, polyoxyethylene alkyl ethers, N, N-dialkyl glucamides, Hecameg, alkylphenoxy, and the like. polyethoxyethanols, quaternary ammonium compounds, sarcosyl, CTAB (cetyltrimethylammonium bromides), tri-N-butyl phosphate, Cetavlon, myristyltrimethylammonium salt, lipofectin, lipofectamine, and DOT-MA, octyl- or nonylphenoxypolyoxyethanols (by 20 for example, Triton surfactants, such as Triton X-100 or Triton N101), polyoxyethylene sorbitan esters (Tween surfactants), polyoxyethylene ethers, polyoxyethylene esters, and the like. A useful fragmentation procedure utilizes the consequent effects of sodium deoxycholate and formaldehyde, and fragmentation may occur during the initial purification of the virion (e.g., in a linear sucrose gradient solution). Thus, a fragmentation process may include the clarification of the virion-containing material (to remove non-virion material), the concentration of the harvested virions (for example by using an adsorption method such as CaHPO4 adsorption). ), separation of whole virions from non-virion material, fragmentation of the virions with a fragmentation agent during a density gradient centrifugation step (e.g. , using a sucrose gradient that contains a fragmentation agent such as sodium deoxycholate), and then filtration (eg ultrafiltration) to remove undesirable materials. The fragmented virions can be usefully resuspended in isotonic sodium chloride buffered sodium phosphate solution. BEGRIVACTM, FLUARIXTM, FLUZONETM and FLUSHIELDTM products are fragmented virion vaccines. Purified surface antigen vaccines include hemagglutinin surface antigens and, typically, influenza virus neuramidase. The processes for preparing these proteins in purified form are well known in the art. FLUVIRINTM AGRIPPALTM and INFLUVACTM are subunit vaccines. The influenza antigens can also be presented as virosomes [8] (viral-type viral-type liposomal particles), as in the INFLEXAL VTM and INVAVACTM products, but it is preferred not to use virosomes with the present invention. Thus, in certain embodiments, the influenza antigen is not in the form of a virosome. The haemagglutinin antigen in the vaccine may be from any suitable strain. In some embodiments, hemagglutinin is a hemagglutinin which, when administered to a human subject in a non-adjuvanted form, may elicit the development of anti-haemagglutinin antibodies that may cross-react with hemagglutinin A / California / 04/2009 (SEQ ID NO: 1); in these embodiments, an adjuvant can enhance the immune response so that a human subject produces a broad spectrum of antibodies, which can help protect against drifts of A / California / 04/2009 strain. In other embodiments, the hemagglutinin is from A / California / 04/2009 (SEQ ID NO: 1). In other embodiments, the hemagglutinin comprises an amino acid sequence HA1 having at least 1% sequence identity with SEQ ID NO: 2, i being 85 or greater, by Example 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or more (e.g., 100). H1 N1 strains with appropriate HA antigens include A / California / 04/2009, A / California / 7/2009, A / Texas / 5/2009, A / England / 195/2009, and A / New York / 18/2009. Hemagglutinin is more closely related to SEQ ID NO: 1 (A / California / 04/2009) than to SEQ ID NO: 3 (A / Chile / 1/1983). A hemagglutinin that is more closely related to SEQ ID NO: 10 1 than to SEQ ID NO: 3 (i.e., which has a greater sequence identity with SEQ ID NO: 1 than with SEQ ID NO: 3 when compared using the same algorithm and the same parameters) is hereinafter referred to as hemagglutinin H1 *. SEQ ID NO: 1 and 3 are 80.4% identical. Useful complete sequences of hemagglutinin H1 for use with the invention include SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 6, as well as those comprising an amino acid sequence having at least 1% sequence identity. with SEQ ID NO: 2 as discussed above, or having at least 1% sequence identity with SEQ ID NO: 7. Ideally, the haemagglutinin does not include a hyper basic region around the HA1 cleavage site. / HA 2. Preferred haemagglutinins have a binding preference for oligosaccharides with a terminal disaccharide Sia (a2.6) Gal rather than oligosaccharides with a terminal disaccharide Sia (a2.3) Gal (see below). SEQ ID NO: 6 (including SEQ ID NO: 7) is a useful hemagglutinin H1 *. It differs from SEQ ID NO: 1 at residues 214, 226 and 240 (i.e. 99.47% identity). In addition to comprising a hemagglutinin H1 (such as hemagglutinin H1 *), compositions made using the invention may include antigen (s) from one or more (e.g., 1, 2 , 3, 4 or more) additional strains of the influenza virus, including influenza A virus and / or influenza virus 2949344 -6- B. Thus, a composition may comprise an antigen from one or several strains characteristic of a normal seasonal vaccine plus at least one hemagglutinin H1 *, for example a 4-valence vaccine with two H1 strains (one which is a hemagglutinin H1 *, one which is not an H1 * hemagglutinin), one H3N2 and one influenza B strain, or one 5-valence vaccine with two H1 strains (one which is a hemagglutinin H1 *, one which is not an H1 * haemagglutinin), one H3N2 strain and two strains of the virus influenza B (a strain similar to B / Victoria / 2/87 and a strain similar to 10 B / Yamagata / 16/88 ). When a vaccine comprises more than one influenza strain, the different strains are typically grown separately and are mixed after the viruses have been harvested and the antigens prepared. Thus, a process of the invention may include the step of mixing antigens of more than one strain of influenza. The influenza virus may be resistant to antiviral therapy (e.g. resistant to oseltamivir [9] and / or sanamivir). In some embodiments, the strains used with the invention will therefore have hemagglutinin with binding preference for oligosaccharides with a terminal disaccharide Sia (a2.6) Gal rather than for oligosaccharides with a terminal disaccharide Sia ( a2,3) Gal. To determine whether a virus with a binding preference for oligosaccharides with a terminal disaccharide Sia (a2,3) Gal, different assays can be used, see for example references 10 to 13. Depending on the type of assay, it will be performed Directly with the virus itself or it can be performed indirectly with the purified haemagglutinin from the virus. In some embodiments, hemagglutinin H1 has a different glycosylation than that seen in egg-derived viruses. Thus, HA (and other glycoproteins) may include glycoforms that are not seen in chicken eggs. Useful HA includes canine glycoforms. In addition to the antigen hemagglutinin, vaccines made using the invention typically also include a neuramidase protein, for example the vaccine will include a viral neuramidase. The invention can protect against one or more NA subtypes of influenza A, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 or N9, but it will generally protect against N1 (e.g. virus H1 N1) or N2 (for example an H1 N2 virus). Whole virion, split virion or subunit vaccines all include hemagglutinin and neuramidase. When a vaccine comprises a neuramidase antigen, the neuramidase may have at least one sequence identity with SEQ ID NO: 4, where 75 is or greater, for example 75, 80, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or more (e.g., 100). Many sequences of this kind are available. In some embodiments, neuramidase is more closely related to SEQ ID NO: 4 than SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 4 and 5 are 82% identical. The vaccines may also comprise a template protein, such as M1 and / or M2 (or a fragment thereof), and / or a nucleoprotein. A porcine model has shown that the addition of M2 to an inactivated swine flu virus vaccine H1 N1 (adjuvanted with an oil emulsion in water) may improve the efficacy of the vaccine [14]. The influenza virus can be a reassortant strain, and can be obtained by reverse genetics techniques. Inverse genetics techniques (e.g., 15-19) allow influenza viruses with desired genomic segments to be prepared in vitro using plasmids or plasmid-free systems. Typically, the technique comprises the expression of (a) DNA molecules that encode desired viral RNA molecules, for example, bacteriophage hair promoters or polymerase promoters, and (b) DNA molecules that encode viral proteins, for example, polII promoters, so that the expression of both types of DNA in a cell leads to the assembly of a complete intact infectious virion. DNA preferably provides all of the viral RNA and viral proteins, but it is also possible to use a helper virus to provide a portion of the RNA and proteins. An influenza A virus used with the invention may comprise one or more RNA segments of A / PR / 8/34 virus (typically 6 segments of A / PR / 8/34, HA and N segments). from a vaccine strain, i.e. 6: 2 reassortment), particularly when the viruses are grown in eggs. A vaccine typically protects against a strain that is capable of transmitting from humans to humans, and thus the genome of the strain will generally comprise at least one RNA segment that is derived from a mammalian influenza virus (eg, example of a human being). The viruses used as the source of the antigens can be grown on eggs or on a cell culture. The current standard method of influenza virus culture employs specific pathogen-free embryo chicken eggs (SPF), the virus being purified from the egg contents (allantoic fluid). More recently, however, viruses have been cultured in these animal cell cultures and, for the sake of speed and allergies of patients, this culture method is preferred. If viral culture on eggs is used, then one or more amino acids can be introduced into the allantoic fluid of the egg along with the virus [7]. When cell culture is used, the viral growth substrate will typically be a mammalian cell line. Suitable cells of mammalian origin include, but are not limited to, those of the hamster, cattle, primates (including humans and monkeys) and dogs. Mammalian cell lines preferred for growing influenza viruses include: MDCK cells [20-23], derived from a dog kidney (Madin Darby canine kidney), Vero cells [24-26], derived from kidney of the African green monkey (Cercopithecus aethiops), or the PER.C6 cells [27] derived from human embryonic retinoblasts. These cell lines are widely available, for example from the American Type Eye Culture (ATCC) 2949344, Coriell Eye Repositories or the European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC). For example, the ATCC provides various types of Vero cells under catalog numbers CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 and CRL-1587, and provides MDCK cells under catalog number CCL-34. PER.C6 cells can be obtained from ECACC under accession number 96022940. The cell lines that have the greatest preference for growing influenza viruses are MDCK cell lines. The original MDCK cell line can be obtained from ATCC as CCL-34, but derivatives of this cell line can also be used. For example, reference 20 discloses an MDCK cell line that has been adapted to be grown in a suspension culture (`MDCK 33016 ', deposited as DSM ACC 2219). Similarly, reference 28 discloses a cell line derived from the MDCK line which grew in suspension in a serum-free culture ('B-702', deposited as FERM BP-7449). Reference 29 discloses non-tumorigenic MDCK cells, including `MDCK-S '(ATCC PTA-6500),` MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), `MDCK-SF102 '(ATCC 20 PTA-6502) and` MDCK -SF103 '(PTA-6503). Reference 30 discloses MDCK cell lines with high susceptibility to infection, including 'MDCK.5F1' cells (ATCC CRL-12042). Any of these MDCK cell lines can be used. When a virus has been grown on a mammalian cell line, then the composition may advantageously be free of egg proteins (eg ovalbumin and ovomucoid) and chicken DNA, thereby reducing allergenicity. When the virus has been grown on a cell line, then the growth culture, and also the viral inoculum used to start the culture, will preferably be free (i.e. will have been tested and will have a negative result). with regard to the contamination by) herpes simplex virus, respiratory syncytial virus, type 3 virus parainfluenza, SARS coronavirus, adenovirus, rhinovirus, reoviruses, polyomaviruses, birnaviruses, circovirus and / or parvovirus [31]. The absence of herpes simplex virus is particularly preferred. For growth on a cell line, for example on MDCK cells, the virus can be grown on cells in suspension [20, 32, 33] or in an adherent culture. An MDCK cell line suitable for suspension culture is MDCK 33016 (deposited as DSM ACC 2219). As an alternative, a culture on microcarriers can be used. Cell lines supporting replication of the influenza virus are preferably grown in culture media without serum and / or protein. Serum-free medium in the context of the present invention is a medium in which there are no serum additives of human or animal origin. It is understood that without protein means cultures in which the multiplication of cells occurs to the exclusion of proteins, growth factors, other protein additives and proteins that are not serum proteins, but which may include optionally, trypsin-like proteins or other proteases that may be required for viral growth. Cells growing in such cultures naturally contain proteins themselves. Cell lines supporting replication of the influenza virus are preferably grown at less than 37 ° C [34] during virus replication, for example at 30-36 ° C, at 31-35 ° C, or at 33 ° C. + 1 ° C. The method for propagating a virus in cultured cells generally comprises the steps of inoculating the cultured cells with the strain to be cultured, culturing the infected cells for a desired period of time for the propagation of the virus, as determined, for example, by viral titre or expression of antigens (for example between 24 and 168 hours after inoculation) and to collect propagated virus. Cultured cells are inoculated with a virus (measured by PFU or TCID50) in a cell ratio of 1: 500 to 1: 1, preferably 1: 100 to 1: 5, more preferably 1: 50 to 1:10. The virus is added to a cell suspension or is applied to a monolayer of the cells, and the virus is absorbed onto the cells for at least 60 minutes but generally for less than 300 minutes, preferably between 90 and 240 minutes at a time. temperature of 25 ° C to 40 ° C, preferably 28 ° C to 37 ° C. The culture of infected cells (eg monolayers) can be removed either by freeze-thaw or enzymatic action to increase the viral content of the cells. crop supernatants harvested. The fluids harvested are then either inactivated or stored frozen. The cultured cells may be infected with a multiplicity of infection (MOI) of from about 0.0001 to 10, preferably from 0.002 to 5, more preferably from 0.001 to 2. More preferably, the cells are infected with a murine MOI. about 0.01. Infected cells can be harvested 30 to 60 hours after infection. The cells are preferably harvested 34 to 48 hours after infection. Better still, the cells are harvested 38 to 40 hours after infection. Proteases (typically trypsin) are generally added during cell culture to allow release of the virus, and proteases may be added at any convenient stage during cultivation. Haemagglutinin (HA) is the major immunogen in inactivated influenza vaccines and vaccine doses are standardized by reference to levels of HA, typically measured by single radial immunodiffusion (SRID) assay. Current vaccines typically contain about 15 μg HA per strain, although lower doses are also used, for example for children or in emergency situations. Fractional doses such as 1/2 (ie, 7.5 μg HA per strain), 1/4 (that is, 3.75 μg per strain), and 1/8 have been used [35, 36], as well as higher doses (eg 3x or 9x doses [37, 38].) Thus, vaccines can range from 0.1 to 150 μg HA per influenza strain, 2949344 - 12 - preferably between 0.1 and 50 μg, for example 0.1 - 20 μg, 0.1 - 15 μg, 0.1 - 10 μg, 0.1 - 7.5 μg, 0.5 - 5 μg 3.75 - 15 μg etc. Particular doses include, for example, about 45, about 30, about 15, about 10, about 7.5, about 5, about 3.8, about 3.75, about 1.9. The HA used with the invention may be naturally occurring HA as found in a virus or may have been modified.When a virus has been grown on a cell line, about 1.5, etc. per gram. , then the common practice is to reduce the amount of residual DNA from the cell line in the final vaccine to reduce any act. oncogeneity of DNA. Thus, the composition preferably contains less than 10 ng, preferably less than 1 ng, and most preferably less than 100 μg of residual DNA of the host cell per dose, although amounts of DNA from the host cell under trace form can be present. In general, the DNA of the host cell that it is desirable to exclude is DNA that is longer than 100 bp. Contaminant DNA may be removed during vaccine preparation using standard purification procedures, eg, chromatography, etc. Removal of residual DNA from the host cell can be improved by nuclease treatment, for example using DNase. A convenient method for reducing DNA contamination of the host cell is disclosed in references 39 &40; it comprises a two-step treatment, first the use of a DNase (eg Benzonase) which can be used during virus growth and then a cationic detergent (eg CTAB) which can be used during dissociation of virions. Treatment with an alkylating agent, such as 3-propiolactone, may also be used to remove DNA from the host cell and may also be advantageously used to inactivate virions [41] while avoiding the use of formaldehyde . Adjuvants in the form of an oil emulsion in water Compositions made using the invention may comprise (or be used with) an adjuvant in the form of an oil emulsion in water which may function to improve the immune responses (humoral and / or cellular) obtained in a patient receiving the composition. Various suitable emulsions are known and typically comprise at least one oil and at least one surfactant, the oil (the oils) and the surfactant (the surfactants) being biodegradable (metabolizable) and biocompatible. The oil droplets in the emulsion are generally less than 5 μm in diameter, and the emulsion advantageously comprises oil droplets of submicron diameter, these small sizes being obtained with a microfluidizer to provide stable emulsions. Droplets smaller than 220 nm are preferred since they can be sterilized by filtration. Specific emulsion-type adjuvants which are useful with the invention include, but are not limited to: • A submicron emulsion of squalene, Tween 80 and Span 85. The composition of the bulk emulsion may be About 50% squalene, about 0.5% polysorbate 80 and 0.5% Span 85. In terms of weight, these ratios become 4.3% squalene, 0.5% polysorbate. 80 and 0.48% of Span 85. This adjuvant is known as `MF59 '[42-44], as described in more detail in Chapter 10 of Reference 45 and Chapter 12 of Reference 46. The MF59 emulsion advantageously comprises citrate ions, for example 10 mM sodium citrate buffer. An emulsion comprising squalene, an α-tocopherol, and polysorbate 80. These emulsions may have from 2 to 10% squalene, from 2 to 10% tocopherol and from 0.3 to 3% Tween 80 and squalene: tocopherol weight ratio is preferably 1 (for example 0.90) since it provides a more stable emulsion. Squalene and Tween 80 may be present in a volume ratio of about 5: 2, or a weight ratio of about 11: 5. Such an emulsion can be made by dissolving Tween 80 in PBS to give a 2% solution, then mixing 90 ml of this solution with a mixture of (5 g of DL-α-tocopherol and 5 ml of squalene) and then microfluidizing the mixture. The resulting emulsion may have submicron oil droplets, for example having a mean diameter between 100 and 250 nm, preferably about 180 nm. An emulsion comprising squalene, an aqueous solvent, a hydrophilic nonionic surfactant based on polyoxyethylenated alkyl ether (e.g. polyoxyethylene cetostearyl ether (12)) and a hydrophobic nonionic surfactant (e.g. sorbitan ester or a mannide ester, such as sorbitan monoleate or Span 80). The emulsion is preferably thermoreversible and / or has at least 90% oil droplets (by volume) having a size of less than 200 nm [47]. The emulsion may also comprise one or more of: alditol (eg mannitol), a cryoprotective agent (e.g., a sugar such as dodecylmaltoside and / or sucrose), and / or an alkylpolyglycoside. Such emulsions can be lyophilized. The emulsion may comprise squalene: polyoxyethylenetostearyl ether: sorbitan oleate: mannitol 330: 63: 49: 61. The antigens and adjuvants in a composition will typically be a mixed admixture at the time of administration to a patient. The emulsions can be mixed with the antigen during manufacture or extemporaneously at the time of administration. Thus, adjuvant and antigen may be stored separately in a packaged or dispensed vaccine, ready for final formulation at the time of use. The antigen will generally be in aqueous form so that the vaccine is finally prepared by mixing two liquids. The volume ratio of the two liquids for the mixture can vary (for example between 5: 1 and 1: 5) but is generally about 1: 1. When a composition comprises a tocopherol, any one can be used. a, [3, y, 6, c or tocopherols, but α-tocopherols are preferred. A preferred α-tocopherol is DL-α-tocopherol and the preferred salt of this tocopherol is succinate. As mentioned above, oil emulsions in water comprising squalene are particularly preferred. In some embodiments, the concentration of squalene in a vaccine dose may be in the range of 5-15 mg (i.e., a concentration of 10-30 mg / ml, for one dose volume). 0.5 ml). It is nevertheless possible to reduce the concentration of squalene [48, 49], for example to understand <5 mg per dose, or even <1.1 mg per dose. For example, a human dose may comprise 9.75 mg squalene per dose (as in the FLUAD ™ product: 9.75 mg squalene, 1.175 mg polysorbate 80, 1.175 mg sorbitan trioleate in a dose volume of 0). , 5 ml), or it may comprise a fractional amount thereof, for example 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7 , 1/8, 1/9 or 1/10. For example, a composition may comprise 7.31 mg squalene per dose (and thus 0.88 mg and polysorbate 80 and sorbitan trioleate), 4.875 mg squalene / dose (and thus 0.588 mg and polysorbate 80 and sorbitan trioleate), 3.25 mg squalene / dose, 2.388 mg / dose, 1.95 mg / dose, 0.975 mg / dose, etc. Any of these fractional dilutions of FLUADTM adjuvanted to MF59 can be used with the invention. As mentioned above, the antigen / emulsion mixture can be effected extemporaneously at the time of administration. Thus, the invention can be used to make kits comprising antigen and adjuvant components ready for mixing, kept separate until use. Pharmaceutical Compositions The compositions made with the invention are pharmaceutically acceptable. They generally comprise components in addition to the antigen, for example they typically comprise one or more carrier (s) and / or pharmaceutical excipient (s). A thorough discussion of these components is available in reference 50. The compositions will generally be in aqueous form. The composition may comprise preservatives such as thiomersal (for example at 10 μg / ml) or 2-phenoxyethanol. It is preferred, however, that the vaccine be substantially free of (i.e., less than 5 μg / ml) mercury material, for example, without thiomersal [51]. Vaccines without mercury without further preference. Vaccines without preservatives are particularly preferred. To control the tone, it is preferred to include a physiological salt such as sodium salt. Sodium chloride (NaCl), which may be present at 1 to 20 mg / ml, is preferred. Other salts which may be present include potassium chloride, potassium dihydrogen phosphate, disodium phosphate dihydrate, magnesium chloride, calcium chloride, and the like. The compositions will generally have an osmolality of between 200 mOsm / kg and 400 mOsm / kg, preferably between 240-360 mOsm / kg and more preferably will be in the range of 290-310 mOsm / kg. The compositions may comprise one or more buffers. Typical buffers include: phosphate buffer, tris buffer, borate buffer, succinate buffer, histidine buffer or citrate buffer. The buffers will typically be in the range of 5- 20 mM. The buffer may be in an aqueous emulsion phase. The pH of a composition will generally be from 5.0 to 8.1, more typically from 6.0 to 8.0, for example. 6.5 and 7.5 or between 7.0 and 7.8. A method of the invention may therefore include a step of adjusting the pH of the bulk vaccine before packaging. The composition is preferably sterile. The composition is preferably free of gluten. The preferred vaccines have a low endotoxin content, for example less than 1 IU / ml and preferably <0.5 IU / ml. The vaccine is preferably free of antibiotics (e.g., neomycin, kanamycin, polymyxin B). The composition may comprise material for a single immunization or may include material for multiple immunizations (i.e., a multi-dose composition). Multidose arrangements generally include a preservative in the vaccine. Influenza vaccines are generally administered in a dosage volume of about 0.5 ml, although half a dose (i.e., about 0.25 ml) may be administered to children and unit doses Accordingly, for example, a unit dose will be chosen to give a dose of 0.5 ml for administration to a patient. Packaging of compositions or kit components The processes of the invention may comprise a step in which vaccine is placed in a container, and in particular in a dispensing container for use by physicians. Suitable containers for the vaccines include disposable files and syringes that must be sterile. When a composition / component is in a vial, the vial is preferably glass or plastic. Vial 30 is preferably sterilized before the composition is added thereto. The vial may comprise a single dose of vaccine or it may comprise more than one dose (a multidose vial), for example, doses. Preferred vials are colorless glass. A vial may have a stopper (e.g., a Luer Lock stopper) adapted such that a pre-filled syringe can be inserted into the stopper, the contents of the syringe can be expelled into the vial and the contents of the vial can be removed with the syringe. Vaccine Products and Kits The invention can be used to make various different vaccines. A vaccine made using the invention comprises (i) an H1 hemagglutinin of subtype A influenza virus that is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SEQ ID NO: 3 and (ii) ) an adjuvant in the form of an oil emulsion in water. This composition is a monovalent inactivated surface antigen vaccine. The inactivated viruses could be grown on eggs or in cell culture (eg in these MDCK cells). The vaccine can be presented in a syringe containing a unit dose of 0.5 ml, each unit dose comprising about 7.5 μg of hemagglutinin H1. The syringe may be glass with a plunger made of bromobutyl rubber. The adjuvant comprises squalene, polysorbate 80 and sorbitan trioleate, for example about 9.75 mg squalene, about 1.18 mg polysorbate 80 and about 1.18 mg sorbitan trioleate per 7.5 μg. from HA. The composition may comprise a citrate buffer. The composition is ideally free of mercury although a low dose of thimerosal may sometimes be included. In some embodiments, an adjuvanted vaccine has 3.75 μg HA, especially when a 0.25 ml assay volume is used. Another vaccine made using the invention comprises (i) an H1 hemagglutinin of subtype A influenza virus that is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SEQ ID NO: 3 and ii) an adjuvant in the form of an oil emulsion in water. This composition is a monovalent inactivated surface antigen vaccine. It was possible to grow the inactivated viruses on eggs. The vaccine may be presented in a vial containing multiple unit doses of 0.5 ml, for example a 10 dose vial comprising thimerosal, each unit dose comprising about 7.5 μg or 15 μg or 30 μg of hemagglutinin. H1. The adjuvant comprises squalene, polysorbate 80 and sorbitan trioleate, for example about 9.75 mg squalene, about 1.18 mg polysorbate 80 and about 1.18 mg sorbitan trioleate per 7.5 μg of HA. The composition may comprise a citrate buffer. Another vaccine made using the invention comprises (i) an H1 hemagglutinin of subtype A influenza virus that is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SEQ ID NO: 3 and ii) an adjuvant in the form of an oil emulsion in water. This composition is a monovalent inactivated surface antigen vaccine. Inactivated viruses were grown in MDCK cells. The vaccine is presented with a unit dose containing 3.75 μg of hemagglutinin H1. The adjuvant comprises squalene, polysorbate 80 and sorbitan trioleate, for example about 4.875 mg of squalene, about 0.59 mg of polysorbate 80 and about 0.59 mg of sorbitan trioleate. The composition may comprise a citrate buffer. A unit dose may have a volume of 0.25 ml. The vaccine can be distributed as a pack of 10 x 0.25 ml dose. Another vaccine made using the invention comprises (1) an H1 hemagglutinin of subtype A influenza virus that is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SEQ ID NO: 3 and ii) an adjuvant comprising and aluminum phosphate and aluminum hydroxide. In one useful embodiment, this composition is an inactivated whole virion monovalent vaccine. The inactivated viruses may have grown on eggs. The vaccine can be presented in a syringe containing a unit dose of 0.5 ml, each unit dose comprising about 15 μg of hemagglutinin H1. The adjuvant may comprise, in a volume of 0.5 ml, approximately 0.5 mg of AI +++, for example 0.45 mg of aluminum phosphate and 0.05 mg of aluminum hydroxide, hydrated. . The composition may comprise 50 μg of thiomersal. Another vaccine made using the invention comprises (1) an H1 hemagglutinin of subtype A influenza virus that is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SEQ ID NO: 3 and ii) an adjuvant comprising aluminum phosphate. In a useful embodiment, this composition is an inactivated whole virion monovalent vaccine (e.g. obtained by formaldehyde inactivation). Inactivated viruses could be grown on eggs. The vaccine can be presented in a vial containing a unit dose of 0.5 ml, each unit dose containing about 6 μg of hemagglutinin H1 (eg of a reassortant strain such as X-179A). The hemagglutinin may be adsorbed on the aluminum phosphate adjuvant which may be in gel form. The composition may contain thiomersal. Another vaccine made using the invention is a non-adjuvanted vaccine comprising a subtype A influenza virus H1 hemagglutinin that is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SEQ ID NO: 3 ( for example, strain A / California / 7/2009). This composition is an inactivated whole virus inactivated vaccine for which inactivated viruses have been grown on Vero cells. The vaccine may be presented in a vial containing multiple doses, e.g., 10 x unit dose of 0.5 ml, each unit dose containing about 7.5 μg of hemagglutinin H1 (i.e. 75 μg by multidose vial). The composition may comprise trometamol, sodium chloride, and polysorbate 80. Another vaccine made using the invention is a non-adjuvanted vaccine comprising a subtype A influenza virus H1 hemagglutinin that is more closely related to SEQ ID 30 NO: 1 than SEQ ID NO: 3 (for example from strain A / California / 7/2009). This composition is a split-virion inactivated monovalent vaccine for which inactivated viruses have been grown on eggs. The vaccine may be presented in a vial containing multiple doses (e.g., 10 x unit dose of 0.5 ml with a thimerosal preservative which may be present at 45 μg per 0.5 ml unit dose) or in syringes (one dose per syringe). Each dose of vaccine may have 7.5, 15 or 30 μg of hemagglutinin H1. The vaccine may comprise a phosphate buffer. The invention may also be used for the manufacture of a kit comprising (i) a first kit component comprising an unadjuvanted subtype A flu virus H1 hemagglutinin which is more closely related to SEQ ID NO 1 as in SEQ ID NO: 3, manufactured using the invention, and (ii) a second kit component comprising an adjuvant in the form of an oil emulsion in water. Both kit components can be mixed at the time of use to give a monovalent vaccine. The first kit component is a monovalent inactivated vaccine with fragmented virions. The inactivated viruses could be grown on eggs. The kit may be presented as a two-vial composition, each vial comprising an equal volume of liquid to be mixed in a volume ratio of 1: 1, for example to mix 2.5 ml of antigen with 2.5 ml of adjuvant. A unit dose of 0.5 ml of the adjuvanted monovalent vaccine may comprise 7.5 μg, 3.75 μg or 1.9 μg of the hemagglutinin H1. The adjuvant comprises squalene, DL-α-tocopherol and polysorbate 80, for example in a unit dose of 0.5 ml: about 10.7 mg of squalene, about 11.9 mg of tocopherol and about 4.9 mg of polysorbate 80 (or a fractional amount thereof, for example 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1 1/8, 1/9, or 1/10 of these amounts of squalene, tocopherol and polysorbate 80). Thus, the components of the adjuvant may be present in a mass ratio (squalene: tocopherol: polysorbate 80) of 2.20: 2.44: 1. The components of the adjuvant may be present at 2.85 1 mg of squalene, 3.16 μg of tocopherol and 1.30 μg of polysorbate 80 per μg of haemagglutinin H1. The vaccine may contain thiomersa preservative, e.g. at about 10 μg / ml, i.e., about 5 μg in a 0.5 ml dose. Both the antigen and adjuvant components may comprise a phosphate buffer. The antigen component may comprise polysorbate 80, octoxynol 10, potassium chloride and / or magnesium chloride. One kit may comprise 50 vials of antigen (2.5 ml of suspension in each) and 50 vials of adjuvant (2.5 ml of emulsion in each). The antigen vials may be in a single package; the adjuvant flasks may be in two packages. Another kit comprises (i) a first kit component comprising an unadjuvanted subtype A influenza virus H1 hemagglutinin which is more closely related to SEQ ID NO: 1 than to SEQ ID NO: 3 manufactured using the invention, and (ii) a second kit component comprising an adjunct in the form of an oil emulsion in water. The two kit components can be mixed at the time of use to give a monovalent vaccine. In a useful embodiment, the first kit component is a split-virion inactivated monovalent vaccine. The inactivated viruses may have grown on eggs. The kit may be presented as a two-vial composition (eg borosilicate glass, optionally with chlorobutyl stoppers), the first vial containing a unit volume of antigen and the second vial containing 3x this unit volume of emulsion, per example to mix to give 4x unit volume of final vaccine. Thus, 1.5 ml of antigen can be combined with 4.5 ml of emulsion to give 6 ml of vaccine. A unit dose of 0.5 ml of the unadjuvanted monovalent vaccine may comprise about 3.8 μg of the hemagglutinin H1. The adjuvant comprises squalene, sorbitan oleate, polyoxyethylene cetostearyl ether and mannitol, for example in a unit dose of 0.5 ml: about 12.4 mg squalene, about 1.9 mg of sorbitan oleate, about 2.4 mg of polyoxyethylene cetostearyl ether and about 2.3 mg of mannitol (or a fraction thereof, for example 3/4, - 23 - 2/3, 1 / 2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9 or 1/10). Thus, the components of the adjuvant may be present in a mass ratio (squalene: sorbitan oleate: polyoxyethylene cetostearyl ether: mannitol) of 124: 19: 24: 23. The vaccine may contain the thiomersal preservative, for example at about 11.3 μg per 0.5 ml or at about 3 μg thiomersal per μg haemagglutinin. Both the antigen and adjuvant components may comprise a phosphate buffer. The vaccines mentioned in this section may usefully contain a hemagglutinin comprising SEQ ID NO: 7. The preferred vaccines satisfy 1, 2 or 3 of the CPMP efficacy criteria. For adults (18 to 60 years), these criteria are: (1) 70% seroprotection, (2) 40% seroconversion, and / or an increase in MGT 2.5 times. In the elderly (> 60 years), these criteria are: (1) 60% seroprotection, (2) 30% seroconversion and / or (3) an increase in MGT 2 times, these criteria are based on open tests with at least 50 patients The criteria apply for each strain in a vaccine Reassorting viruses As mentioned above, the invention may use a strain of reassortant influenza virus. ) the hemagglutinin viral gene encodes a hemagglutinin that is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SEQ ID NO: 3 and (b) at least one other viral gene is derived from the virus strain of Thus, the virus may comprise at least one of the NP, M, NS, PA, PB1 and / or PB2 segments of A / PR / 8/34. (a) the viral hemagglutinin gene encodes a hemagglutinin protein that has at least k% sequence identity with SEQ ID NO: 1, where k is 85 or greater for example 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or more (e.g. 100), and (b) at least one other viral gene is from the strain of influenza virus ( A / Puerto Rico / 8/34). Thus, the virus may comprise at least one of the NP, M, NS, PA, PB1 and / or PB2 segments of A / PR / 8/34. In these viruses, the viral neuramidase gene can encode a neuramidase protein that has at least one sequence identity with SEQ ID NO: 4, where 75 is or greater, for example 75, 80, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or more (e.g., 100). In some embodiments, neuramidase is more closely related to SEQ ID NO: 4 than SEQ ID NO: 5. The eight influenza A genome segments encode (i) the PA subunit of viral polymerase, (ii) the PB1 subunit of the viral polymerase, (iii) the PB2 subunit of the viral polymerase, (iv) the viral nucleoprotein, (v) the viral matrix proteins, (vi) ) NS1 and NS2 viral proteins, (vii) hemagglutinin and (viii) neuramidase. The preferred reassortant viruses are 6: 2 reassortants, i.e. they comprise 6 segments of a strain (eg A / PR / 8/34) but the HA and NA segments of a different strain (for example as defined above with reference to SEQ ID Nos. 1 and 4). In other embodiments, there is a 7: 1 reassortant with HA as defined above. In other embodiments, the virus comprises genes of three different origins but with at least one segment (eg 1, 2, 3, 4, 5, 6) from A / PR / 8/34. Viral segments of A / PR / 8/34, and their sequences, are widely available. These viruses are particularly useful for preparing vaccines and can be conveniently prepared by reverse genetics. Vaccines comprising one or more of the viral genes of A / PR / 8/34 may be used to prepare inactivated influenza vaccines. The reassortant viruses can be cultured in MDCK cells and the invention uses a method for preparing a vaccine comprising the steps of: (i) infecting a cell culture with a virus as defined above, (ii) culturing the culture cell of step (i) to produce other viruses, (iii) purify the viruses obtained in step (ii), and (iv) treat the purified viruses in step (iii) to prepare a 2949344 - 25 - vaccine. The vaccine can be a vaccine in bulk. It can be used to produce a monovalent final vaccine product or it can be used as a component to make a final multivalent vaccine product. The cell culture in step (i) is preferably an MDCK cell culture but other cells (ideally mammalian cells such as PER.C6 cells) can be used as an alternative. The invention also provides a method for preparing a vaccine comprising the steps of (i) preparing a reassortant influenza virus using reverse genetics, for example with a viral hemagglutinin gene encoding a hemagglutinin which is more closely related to SEQ ID NO: as SEQ ID NO: 3; (ii) use the reassortant strain to make a vaccine. Step (ii) may include: culturing a virus (e.g., in eggs or in cell culture) and preparing the vaccine from the cultured virus. The cultured virus can be inactivated, and the inactivated virus can then be used to prepare the vaccine (for example after fragmentation or after purification of the antigens). The invention also provides a method for preparing a vaccine comprising a step of using a reassortant influenza virus as defined above, which has been prepared using reverse genetics. General The term comprising encompasses as well as consisting of, for example a composition comprising X may consist exclusively of X or may contain something more for example X + Y. The word essentially does not completely exclude, for example a composition which is essentially free of Y may be completely free of Y. When necessary, the word essentially may be omitted from the definition of the invention. The term approximately referring to a numerical value - 26 - x is optional and means, for example x 10%. Subject to specific indication, a process comprising a step of mixing two or more components does not require a specific mix order. So the components can be mixed in any order. When there are three components, two components can then be combined with each other and the combination can then be combined with the third component, etc. Where animal (and in particular bovine) material is used in cell culture, it must be obtained from sources which are free of transmissible spongiform encephalopathies (TSE) and in particular free from bovine spongiform encephalopathy (BSE). Overall, culture cells are preferred in the complete absence of animal-derived material.

Quand un substrat cellulaire est utilisé pour des procédures de réassortiment ou de génétique inverse, il est de préférence un substrat qui a été approuvé pour une utilisation dans la production de vaccins humains, par exemple comme dans le chapitre général 5.2.3 de la Ph Eur. When a cell substrate is used for reassortment or reverse genetics procedures, it is preferably a substrate that has been approved for use in the production of human vaccines, for example as in the general chapter 5.2.3 of the Ph Eur .

Une identité entre des séquences de polypeptide est de préférence déterminée par l'algorithme de recherche d'homologie de Smith-Waterman tel qu'implémenté dans le programme MPSRCH (Oxford Molecular) en utilisant une recherche affine gap avec les paramètres gap open penalty=12 et gap extension penalty=l. An identity between polypeptide sequences is preferably determined by the Smith-Waterman homology search algorithm as implemented in the Oxford Molecular (MPSRCH) program using an affine gap search with the parameters gap open penalty = 12 and gap extension penalty = l.

MODES DE MISE EN OEUVRE DE L'INVENTION Produits FocetriaTM et CelturaTM Soit des oeufs SPF (pour FocetriaTM) soit une culture en suspension de cellules MDCK (pour CelturaTM) ont été infectés avec une souche réassortie H1 N1 du virus de la grippe A avec une hémagglutinine qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 1 qu'à la SEQ ID NO: 3. Les virus ont été cultivés en utilisant des techniques connues, puis collectés et inactivés, et des vaccins monovalents à antigènes de 2949344 - 27 - surface ont été préparés à partir des virus purifiés. Les antigènes purifiés ont été dilués et puis combinés avec une émulsion d'huile dans de l'eau comprenant des gouttelettes de squalène submicroniques (MF59TM) pour fournir le vaccin en vrac pour le produit FocetriaTM (ayant 7,5 pg 5 d'hémagglutinine par dose unitaire de 0,5 ml) et le produit CelturaTM (ayant 3,75 pg d'hémagglutinine par dose unitaire de 0,5 ml). Les produits sont introduits dans des seringues. Donc, les produits sont distribués dans des seringues pré-remplies pour injection, par exemple dans le deltoïde ou la partie antérolatérale de la cuisse. Ces deux 10 produits sont sûrs et efficaces et ont été autorisés pour un usage humain dans divers territoires. Autres produits Comme indiqué dans la référence 52, un vaccin monovalent à virions fragmentés non adjuvanté a été préparé à partir 15 d'une souche A/California/7/2009 HlN1sw dans des oeufs de poule embryonnés avec les mêmes techniques standard que celles qui sont utilisées pour la production du vaccin inactivé trivalent saisonnier CSL [53]. Deux vaccins différents ont été fabriqués : un avec une dose de 15 pg de HA (volume de 0,25 ml) et un autre avec une dose de 30 pg de HA 20 (volume de 0,5 ml). La référence 54 fournit des détails de fabrication d'un vaccin monovalent inactivé à virions entiers avec un adjuvant de phosphate d'aluminium, ayant 6 pg de HA par dose. Il est entendu que l'invention n'a été décrite qu'à titre 25 d'exemple et que des modifications peuvent être apportées tout en restant dans le cadre et l'esprit de l'invention. - 28 - REFERENCES [1] Vaccines. (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216- 9688-0. [2] WO02/28422. [3] WO02/067983. [4] WO02/074336. [5] W001/21151. [6] WO02/097072. [7] WO2005/113756. [8] Huckriede et al. (2003) Methods Enzymol 373:74-91. [9] Herlocher et al. (2004) J Infect Dis 190(9):1627-30. [10] Gambaryan & Matrosovich (1992) J Virol Methods 39(1-2):111-23. [11] Mastrosovich et al. (1999) J Virol 73: 1146-55. [12] Stevens et al. (2006) J Mol Biol 355:1143-55. [13] Couceiro & Baum (1994) Mem Inst Oswaldo Cruz 89(4):587-91. [14] Kitikoon et al. (2009) Vaccine doi:10.1016/j.vaccine.2009.09.130. [15] Hoffmann et al. (2002) Vaccine 20:3165-3170. [16] Subbarao et al. (2003) Virology 305:192-200. [17] Liu et al. (2003) Virology 314:580-590. [18] Ozaki et al. (2004) J. Virol. 78:1851-1857. [19] Webby et al. (2004) Lancet 363:1099-1103. [201] WO97/37000. [21] Brands et al. (1999) Dev Biol Stand 98:93-100. [22] Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7. [23] Tree et al. (2001) Vaccine 19:3444-50. [24] Kistner et al. (1998) Vaccine 16:960-8. [25] Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-110. [26] Bruhl et al. (2000) Vaccine 19:1149-58. [27] Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21. [28] EP-A-1260581 (WO01 /64846). [29] WO2006/071563. [30] WO2005/113758. [31] WO2006/027698. [32] WO03/023021 [33] WO03/023025 [34] WO97/37001. [35] W001/22992. [36] Hehme et al. (2004) Virus Res. 103(1-2):163-71. [37] Treanor et al. (1996) J Infect Dis 173:1467-70. [38] Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10. [39] EP-B-0870508. [40] US 5948410. [41] WO2007/052163. [42] WO90/14837. [43] Podda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203. 2949344 - 29 - MODES FOR CARRYING OUT THE INVENTION FocetriaTM and CelturaTM Products Either SPF eggs (for FocetriaTM) or a suspension culture of MDCK cells (for CelturaTM) were infected with a H1 N1 reassortant strain of influenza A virus with a hemagglutinin which is more closely related to SEQ ID NO: 1 than SEQ ID NO: 3. The viruses were cultured using known techniques, then collected and inactivated, and monovalent antigen-based vaccines. surface were prepared from purified viruses. The purified antigens were diluted and then combined with an oil-in-water emulsion comprising submicron squalene droplets (MF59TM) to provide the bulk vaccine for the Focetria ™ product (having 7.5 μg haemagglutinin per ml). unit dose of 0.5 ml) and the Celtura ™ product (having 3.75 μg haemagglutinin per unit dose of 0.5 ml). The products are introduced into syringes. Therefore, the products are distributed in pre-filled syringes for injection, for example in the deltoid or anterolateral part of the thigh. Both of these products are safe and effective and have been licensed for human use in various territories. Other products As reported in ref. 52, a non-adjuvanted fragmented viral monovalent vaccine was prepared from A / California / 7/2009 HlN1sw strain in embryonated chicken eggs using the same standard techniques as those used for the production of seasonal trivalent inactivated vaccine CSL [53]. Two different vaccines were manufactured: one with a dose of 15 μg of HA (volume of 0.25 ml) and another with a dose of 30 μg of HA (volume of 0.5 ml). Reference 54 provides details of manufacture of an inactivated whole viral monovalent vaccine with aluminum phosphate adjuvant having 6 μg HA per dose. It will be understood that the invention has been described by way of example only and that modifications may be made while remaining within the scope and spirit of the invention. - 28 - REFERENCES [1] Vaccines. (eds, Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0. [2] WO02 / 28422. [3] WO02 / 067983. [4] WO02 / 074336. [5] W001 / 21151. [6] WO02 / 097072. [7] WO2005 / 113756. [8] Huckriede et al. (2003) Methods Enzymol 373: 74-91. [9] Herlocher et al. (2004) J Infect Dis 190 (9): 1627-30. [10] Gambaryan & Matrosovich (1992) J. Virol Methods 39 (1-2): 111-23. [11] Mastrosovich et al. (1999) J Virol 73: 1146-55. [12] Stevens et al. (2006) J. Mol Biol 355: 1143-55. [13] Couceiro & Baum (1994) Inst Inst Oswaldo Cruz 89 (4): 587-91. [14] Kitikoon et al. (2009) Vaccine doi: 10.1016 / j.vaccine.2009.09.130. [15] Hoffmann et al. (2002) Vaccine 20: 3165-3170. [16] Subbarao et al. (2003) Virology 305: 192-200. [17] Liu et al. (2003) Virology 314: 580-590. [18] Ozaki et al. 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Claims (11)

REVENDICATIONS1. Procédé pour fabriquer un vaccin contre la grippe, dans lequel le vaccin est adjuvanté avec un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau, comprenant une étape consistant à préparer des antigènes vaccinaux à partir d'un virus de la grippe ayant une hémagglutinine comprenant une séquence d'acide aminé HA1 ayant au moins 95 % d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: REVENDICATIONS1. A method for making an influenza vaccine, wherein the vaccine is adjuvanted with an adjuvant in the form of an oil emulsion in water, comprising a step of preparing vaccine antigens from a flu virus having a hemagglutinin comprising an amino acid sequence HA1 having at least 95% sequence identity with SEQ ID NO: 2. 2. Procédé pour fabriquer un vaccin, dans lequel le vaccin est adjuvanté avec un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau, comprenant les étapes consistant à : (i) préparer un virus de la grippe réassorti en recourant à la génétique inverse, dans lequel le virus a une hémagglutinine comprenant une séquence d'acide aminé HA1 ayant au moins 95 % d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 2; et (ii) utiliser la souche réassortie pour fabriquer un vaccin en cultivant un virus dans des oeufs ou en culture cellulaire, et préparer le vaccin à partir du virus cultivé. 2. A method for making a vaccine, wherein the vaccine is adjuvanted with an adjuvant in the form of an oil emulsion in water, comprising the steps of: (i) preparing a reassortant influenza virus in using reverse genetics, wherein the virus has a hemagglutinin comprising an amino acid sequence HA1 having at least 95% sequence identity with SEQ ID NO: 2; and (ii) using the reassortant strain to make a vaccine by growing a virus in eggs or in cell culture, and preparing the vaccine from the cultured virus. 3. Procédé pour fabriquer un vaccin, comprenant une étape consistant à utiliser un virus de la grippe réassorti qui est préparé en recourant à la génétique inverse, dans lequel le virus réassorti a une hémagglutinine comprenant une séquence d'acide aminé HA1 ayant au moins 95 % d'identité de séquence avec la SEQ ID NO: 2, et dans lequel le vaccin est adjuvanté avec un adjuvant sous forme d'émulsion d'huile dans de l'eau. A method for making a vaccine, comprising a step of using a reassortant influenza virus which is prepared using reverse genetics, wherein the reassortant virus has a hemagglutinin comprising an amino acid sequence HA1 having at least 95 % sequence identity with SEQ ID NO: 2, and wherein the vaccine is adjuvanted with an adjuvant as an oil emulsion in water. 4. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le vaccin est préparé à partir de virions grippaux inactivés. The method of any one of the preceding claims, wherein the vaccine is prepared from inactivated influenza virions. 5. Procédé de la revendication 4, dans lequel le vaccin comprend des virions entiers, des virions fragmentés ou des antigènes de surface purifiés. The method of claim 4, wherein the vaccine comprises whole virions, fragmented virions or purified surface antigens. 6. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'hémagglutinine comprend la SEQ ID NO: The method of any one of the preceding claims, wherein the hemagglutinin comprises SEQ ID NO: 7. 7. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le virus a de la neuramidase qui est plus étroitement apparentée à la SEQ ID NO: 4 qu'à la SEQ ID NO: 5. The method of any one of the preceding claims, wherein the virus has neuramidase that is more closely related to SEQ ID NO: 4 than SEQ ID NO: 5. 8. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le virus comprend un ou plusieurs segments d'ARN d'un virus A/PR/8/34. The method of any one of the preceding claims, wherein the virus comprises one or more RNA segments of A / PR / 8/34 virus. 9. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on fait croître le virus sur des oeufs. 9. The method of any one of the preceding claims, wherein the virus is grown on eggs. 10. Procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel on fait croître le virus en culture cellulaire. The method of any one of claims 1 to 8, wherein the virus is grown in cell culture. 11. Procédé de la revendication 10, dans lequel on fait croître le virus en culture cellulaire MDCK ou en culture cellulaire Vero. The method of claim 10, wherein the virus is grown in MDCK cell culture or Vero cell culture.