FR2937738A1 - Utilisation de polypeptides isoles ayant des proprietes antigeniques vis-a-vis de mycoplasma pneumoniae, ainsi que des polynucleotides et anticorps correspondants - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide de séquences ID SEQ N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 soit pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae, soit pour induire une réponse immunitaire contre Mycoplasma pneumoniae.

Description

L'invention porte sur l'utilisation de polypeptides nouvellement sélectionnés et de polynucléotides correspondants, d'une part, dans le domaine du diagnostic sérologique des infections impliquant Mycoplasma pneumoniae - plus précisément comme outil de diagnostic sérologique de telles infections - et, d'autre part, dans le domaine de la prévention des infections par cette bactérie. Elle porte également sur l'utilisation de tels 10 polypeptides dans la génération d'anticorps adaptés à détecter des antigènes de Mycoplasma pneumoniae. Dans tous les cas, ce sont les propriétés antigéniques desdits polypeptides vis-à-vis de Mycoplasma pneumoniae qui sont exploitées, soit pour reconnaître les anticorps 15 générés par l'organisme infecté par Mycoplasma pneumoniae, soit pour faire que ledit organisme génère de tels anticorps, à des fins de protection immunitaire ou à des fins de détection des antigènes de Mycoplasma pneumoniae. Mycoplasma pneumoniae est une bactérie dépourvue de 20 paroi qui envahit les cellules de l'épithélium respiratoire. Elle est responsable d'infections respiratoires aiguës fréquemment rencontrées chez l'enfant à partir de cinq ans et chez l'adulte jeune. Il peut s'agir de pneumonies atypiques à évolution favorable, parfois 25 associées à d'autres manifestations ORL, cutanées, hématologiques, neurologiques ou plus souvent de trachéobronchites. Mycoplasma pneumoniae serait responsable de 15 à 20% des pneumopathies communautaires se manifestant à l'état endémique avec de petites poussées épidémiques 30 tous les quatre à sept ans (Bébéar C, Bébéar C.M et de Barbeyrac B. dans FreneyJ. Renaud F. Hansen W. Bullet C. Précis de bactériologie clinique, ed. ESKA. Paris. 2000) . Il existe un premier pic d'incidence chez les enfants de 5 à 15 ans, chez qui Mycoplasma pneumoniae serait responsable de près de 40% des pneumonies communautaires et de près de 20% des 35 pneumonies communautaires nécessitant une hospitalisation. Le second pic d'incidence concerne l'adulte après 50 ans, avec des chiffres s'élevant progressivement avec l'âge j usqu' à dépasser 0% (Brunner H. Mycoplasma pneumoniae infections, Isr.J Med Sci (1981),17: 516-523 ; Ghosh et al. Surveillance of Mycoplasma pneumoniae infections in Scotland 1986-1991. J Infect (1992), 25: 221-227 Waites et al. Mycoplasma pneumoniae and its vole as a human patgogen. Clin.Microbiol.Rev. (2004) 17: 697-728). Le délai important entre la primo-infection chez l'enfant et la réinfection chez l'adulte montre que l'infection chez l'enfant confère à l'individu une protection immunitaire efficace contre la réinfection. Il a été également observé une association clinique entre M. pneumoniae et asthme chez les enfants, même si la nature de la corrélation n'est pas encore clairement établie (Hansbro PM et al., Pole of atypical bacterial infection of the lung in predisposition/protection of asthme. Pharmacology et Therapeutics (2004),101:193-210). Il semblerait qu'il existe une sous-estimation fréquente des infections aiguës, voire chroniques, à M. pneumoniae chez les enfants à travers des pathologies telles que l'asthme ou les pneumopathies communautaires. Mycoplasma pneumoniae pénètre dans l'organisme par voie aérienne (inhalation de gouttelettes, contacts directs avec des sujets infectés) en adhérant aux cellules de l'épithélium respiratoire. Ce contact engendre un stress oxydatif à l'origine de l'altération du mouvement ciliaire et la formation de lésions cellulaires. Une réaction inflammatoire locale se forme. La réaction immunologique peut entraîner l'apparition d'infiltrats et parfois même d'auto-anticorps. Certains antigènes membranaires de M. pneumoniae sont en effet semblables à des antigènes retrouvés au niveau du cerveau et du pancréas (Waites KB, Talkington OF. Mycap/asmapneumoniaeand its rote as a human pathogen, Clin Microbiol Rev, 2004) . De nombreux agents infectieux, qu'ils soient viraux ou bactériens, peuvent être à l'origine d'une pneumonie, et la symptomatologie respiratoire ne permet guère de différencier les infections à M. pneumoniae de celles provoquées par d'autres agents de pneumonies atypiques. Le début de la maladie est progressif après une incubation de 15 à 20 jours. La maladie se manifeste par de la fièvre, un malaise, des céphalées, des myalgies et rachialgies et surtout une toux sèche et opiniâtre. L'état général est peu altéré et l'examen physique pauvre en symptômes, contrastant avec l'importance des images radiologiques des poumons. La maladie est généralement régressive avec le temps ; cependant la convalescence est longue et la toux persistante. M. pneumoniae peut également causer diverses complications extrapulmonaires en se dispersant au niveau d'autres organes : pleurésies, éruptions cutanées, sinusites, myocardites, péricardites, atteintes articulaires, anémie hémolytique, manifestations nerveuses, infections génitales (Waites KB, Talkington OF. Mycoplasma pneumoniae and its rote as a human pathogen, Clin Microbiol Rev, 2004) . Le traitement des infections à Mycoplasma pneumoniae repose sur un choix probabiliste en fonction de l'âge, surtout chez les enfants, et de critères cliniques et radiologiques dont aucun n'est ni très spécifique ni très sensible. Il a pu être démontré que la sévérité de la maladie est souvent liée à une antibiothérapie retardée. Une étude en 2007 a notamment rapporté le décès d'une jeune fille de 18 ans en Autriche après une infection à M. pneumoniae, l'antibiothérapie n'ayant probablement pas été administrée précocement. L'absence de paroi rend cette bactérie insensible à la pénicilline et autres bêta-lactamines habituellement prescrites en cas de pneumonie d'origine bactérienne. Ainsi les antibiotiques fréquemment utilisés dans les infections à M. pneumoniae sont les tétracyclines, les fluoroquinolones, les macrolides et apparentés. Cependant des cas de résistance aux fluoroquinolones et macrolides ont déjà pu être observés (Matsuoka, et al. Characterization and Molecular analysis of Macrolide-Résistant Mycoplasma pneumoniae clinical isolates obtained in Japan. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48,12: 4824-4630 ; Gruson D. eta/. In vitra developpement of resistance tu six and four fluoroquinolones in Mycoplasmspneumoniaeand Mycoplasmahominisrespectively. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49, 3 :1190- 1193). Ces problèmes de résistance rendent le diagnostic d'infection à M. pneumoniae essentiel pour que l'antibiothérapie soit appropriée et administrée précocement.

A l'heure actuelle, le diagnostic direct est réalisé par culture ou par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ; quant au diagnostic indirect, des tests sérologiques existent tels que les agglutinines froides, la réaction de fixation du complément, l'immunofluorescence indirecte, l'agglutination passive et les tests ELISA. Toutefois, il n'existe pas de test de diagnostic de référence pour la détection d'infections à M. pneumoniae. La culture de M. pneumoniae peut être réalisée à partir de prélèvements de gorge, d'aspirations nasopharyngées chez l'enfant et de lavages bronchoalvéolaires, mais elle est longue (2 à 3 semaines) et fastidieuse. Rarement pratiquée en routine, elle est plutôt réservée aux laboratoires de référence. Cependant, lorsqu'elle est positive, elle est spécifique à 100. La persistance de la bactérie pouvant aller jusqu'à plusieurs semaines après l'infection, des tests complémentaires, comme le dosage d'anticorps spécifiques, sont nécessaires pour confirmer le diagnostic d'une infection active.

L'amplification génique par PCR, à partir de prélèvements du tractus respiratoire, est une méthode plus rapide et plus sensible que la culture (sur 100 prélèvements positifs en PCR, seulement 60 sont positifs en culture). Différents systèmes ont été proposés, tels que l'amplification de séquences au hasard et l'amplification du gène de l'adhésine ou encore du gène codant l'ARN 16S. Cette approche est sensible (78-92%), permettant la détection de 10 à 100 cfu avec une bonne spécificité {92ù100%) ariens K, Goossens N and leven M., Molecular Diagnosis of Mycaplasma pneumaniaerespiratorytract infections, J. Clin. Microbiol., 2003). Cependant, la technique n'est pas standardisée et reste très coûteuse et trop complexe à utiliser en routine dans la plupart des laboratoires de microbiologie clinique ; aucun kit de détection n'est commercialisé.

Les sérologies sont les méthodes les plus utilisées dans le diagnostic d'infection à M. pneumoniae, notamment en cas d'absence de prélèvements comme, par exemple, des aspirations nasopharyngées ou des lavages bronchoalvéolaires. A la suite d'une infection à M. pneumoniae, le système immunitaire d'un individu non immunodéprimé répond rapidement par la production d'anticorps atteignant un pic au bout de 3 à 6 semaines pour ensuite décliner graduellement sur une période allant de quelques mois à quelques années. La production d'immunoglobulines M (IgM), spécifiques de M. pneumoniae, apparaît 7 à 10 jours après le début de l'infection. Leur mise en évidence est souvent la preuve d'une infection récente, surtout chez les jeunes enfants qui n'ont pas eu d'expositions répétées à la bactérie. Cependant, chez l'adulte ayant eu une exposition répétée, l'infection à M. pneumoniae ne provoque pas de montée rapide d'IgM et, dans ce cas, les tests sérologiques commercialisés mettant en évidence une réponse IgM peuvent être pris en défaut. De même, la réponse IgM pouvant persister pendant des mois, voire des années, le taux d'anticorps IgM ne reflète pas forcément une infection récente. Dans certains cas, la réinfection conduit à une augmentation du taux d'IgG, et c'est pourquoi il est préconisé de rechercher en parallèle une réponse IgG et IgM. Les IgA sont produits tôt au cours de l'infection mais leur niveau de production décroît plus rapidement que celui des IgG et des IgM. Ils peuvent être de bons indicateurs d'une infection récente pour toutes les classes d'âges, même après de multiples réinfections (Waites K.B., C.M. Bébéar, J.A. Robertson, D.F. Talkington, and G.E. Kenny. laboratory diagnosis of mycoplasmal infections. Cumitech of American Society for Microbiology, coardinating editor : F.S. Nolte., 2001, ASM press :1-30) . Il existe différentes techniques sérologiques, souvent complémentaires, pour diagnostiquer une infection à M. pneumoniae. Les principaux tests sont la recherche d'agglutinines froides, la réaction de fixation du complément, l'immunofluorescence indirecte, les tests d'agglutination passive et les tests ELISA.

La présence d'agglutinines froides, évocatrice à un taux >64, est parfois constatée dans les infections à M. pneumoniae mais elle n'est ni constante ni caractéristique. Cette technique autrefois utilisée n'est donc plus recommandée dans la recherche d'infection à M. pneumoniae. La réaction de fixation du complément (RFC), utilisant une préparation antigénique effectuée à partir du micro-organisme entier, a longtemps été utilisée. Le test mesure le taux d'IgM et d'IgG simultanément sans les différencier. Un titre >64, est évocateur d'une infection. La technique est lourde, peu sensible et peut donner lieu à des réactions croisées ou à des résultats ininterprétables (sérums anticomplémentaires ). La recherche d'anticorps spécifiques peut se faire par immunofluorescence indirecte. Le sérum à tester, mis au contact d'antigènes de M. pneumoniae, est révélé par des anticorps anti-IgM ou anti-IgG humaines, conjugués à un fluorochrome. Cette technique existe sous forme de kit commercialisé mais nécessite un microscope à fluorescence. La lecture des lames est longue et fastidieuse et l'interprétation des résultats reste délicate.

Des tests d'agglutination passive pour la détection d'IgM et/ou d'IgG sont commercialisés. Ils mettent en évidence une reconnaissance par des anticorps, contenus dans le sérum du patient, d'antigènes (extraits de M. pneumoniae) fixés à des particules de latex, de gélatine ou encore d'érythrocytes dans le cas du test d'hémagglutination indirecte (IHA). La technique nécessite au moins deux sérums pour mettre en évidence une augmentation du titre d'anticorps et ne présente pas d'avantages par rapport à la technique ELISA Maltes K.B., C.M. Bébéar, J.A. Robertson, O.F. Talkington, and G.E. Kenny. Laboratory diagnoses of mycoplasmal infections, Cumitech of American Society for Microbiology, coordinating editor : F.S. Nuite, 2001, ASM press :1-30) . Les techniques ELISA permettent de détecter indépendamment des IgG ou des d'IgM. Des préparations d'extraits bactériens, de protéines purifiées comme l'adhésine P1, de glycolipides ou de peptides synthétiques ont été utilisées, fixées au support solide. Le sérum des patients est incubé avec la phase solide antigénique, et des anticorps anti-IgG ou anti-IgM humaines, conjugués à un enzyme, réagit avec les anticorps liés à l'antigène. Le complexe est mis en évidence par l'hydrolyse d'un substrat de l'enzyme, aboutissant à un produit coloré. Le choix de l'ELISA (IgM et/ou IgG) dépend de l'âge du patient et du nombre de sérums pouvant être testés. La présence d'IgM est très évocatrice chez l'enfant et l'adolescent mais plus rarement observée chez l'adulte. Il est préférable de rechercher des anticorps spécifiques sur deux sérums prélevés à 10-15 jours d'intervalle, pour mettre en évidence une séroconversion (augmentation x 4 du titre d'anticorps). En résumé, les pratiques courantes ne répondent toujours pas aux attentes médicales pour établir de façon certaine le diagnostic d'infections à M. pneumoniae chez l'enfant ou l'adulte. Bien que les tests sérologiques semblent être les plus adaptés, dans de nombreux cas le diagnostic d'une infection active reste difficile à différencier de celui d'une infection passée (Waites K.B., C.M. Bébéar, J.A. Robertson, D.F. Talkington, and G.E. Kenny. Laboratory diagnosis of mycoplasmal infections. Cumitech of American Society for Microbiology, coordinating editor : F.S. Halte., 2001, ASM press :1-30, Talkington OF, Shott S, Fallon MT, Schwartz SB and Thacker WL. Analysis of eight commercial enzyme immunoassay tests for détection of antibodies to Mycop/asmapneumonissin human serum, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2004) . Le génome de M. pneumoniae a été séquencé en 1996 et réannoté en 2000 (Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li BC., Herrmann R. Complete sequence analysis of the gemme of the bacteria Mycop/asmapneumoniae. Nucleic acid research, Vol 22, No 24, 4420-4449. DandekarT., Huynen M., Doerks T., Sanchez-Pulido L., Snel B., Suyama M., Yuan YP, Hermann R., Bork P, Reannotating the Mycoplasmapneumonies genome sequence : adding value, function and reading frames. Nucleic acid research, Vol 28, No 17, 3278-3288.) Il a pu être identifié 688 phases ouvertes de lecture. A l'issue de recherches sélectives, les inventeurs de la présente invention ont identifié, à partir du génome de M. pneumoniae, de nouveaux polynucléotides et de nouveaux polypeptides dont les utilisations possibles sont décrites ci-après. Les inventeurs ont du mettre en place un crible sélectif afin d'identifier les propriétés antigéniques uniques desdits polypeptides. Les polypeptides ont été sélectionnés 8 spécifiquement pour leurs propriétés antigéniques, parmi nombre d'autres issus de M. pneumoniae, dont certains localisés à la surface de la bactérie ou intrinsèques à la membrane et qui se sont avérés non pertinents pour le diagnostic sérologique d'une telle infection. Bien que la séquence ADN de ces polypeptides ait été identifiée lors du séquençage du génome, l'état des connaissances ne permettait en aucun cas de mettre en évidence l'antigénicité desdits polypeptides.

La présente invention a comme objectifs de résoudre les déficiences des tests sérologiques actuels et de permettre le diagnostic de M. pneumoniae chez des patients enfants ou adultes, souffrant de pneumopathie ou d'asthme. Elle se propose également d'apporter des compositions pharmaceutiques pour la prévention des infections à M. pneumoniae.

Définitions Les définitions suivantes sont données afin de 20 faciliter la compréhension de certains termes utilisés dans cette description. On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non. 25 Le terme polynucléotide inclut, sans limitation, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin, un ADN qui est un mélange de régions simple brin, double brin et/ou triple brin, un 30 ARN simple brin ou double brin, un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin et les molécules hybrides comprenant un ADN et un ARN qui peuvent comprendre des régions simple brin, double brin et/ou triple brin ou un 35 mélange de régions simple brin et double brin. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brin. Les brins dans de telles régions peuvent provenir de la même molécule ou de molécules différentes. Par conséquent les ADN ou ARN, ayant des squelettes modifiés pour la stabilité ou d'autres raisons, sont inclus dans le terme polynucléotide. On entend également par polynucléotide, les ADN et ARN contenant une ou plusieurs bases modifiées. On entend par "base modifiée", par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine. Le terme polynucléotide vise également les polynucléotides de forme modifiée chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement. Les polynucléotides comprennent également les polynucléotides courts tels que les oligonucléotides. On entend par "polypeptide" un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée. Le terme polypeptide comprend les chaînes courtes, appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et les chaînes longues, appelées protéines.

Un polypeptide peut être composé d'acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits du polypeptide et n'importe où dans le polypeptide : dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou amino- terminales. Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturels ou synthétiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP- ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés, telle que l'arginylation ou 1' ubiquitination. (PRDTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.N. Freeman and Company, New York (1993) and Wald, F., Posttranslational Protein Modifications : Perspectives and Prospects, pgs 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol.182 : 826-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis : Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663 : 48-62 (1992)) .

On entend par "isolé", modifié par la main de l'homme à partir de l'état naturel, c'est-à-dire que le polynucléotide ou le polypeptide présent dans la nature a été modifié ou isolé de son environnement naturel, ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé", mais le même polynucléotide ou polypeptide séparé des matériaux coexistants dans son état naturel est "isolé". On entend par "pourcentage d'identité" entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques le pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Cette comparaison peut être réalisée grâce à un programme, par exemple le programme EMBOSS-Needle (alignement global Needleman-Wunsch) à l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10.0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 et Kruskal, J.B. (1983), An overview of sequence comparison, In O. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed), Time warps, strind edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, pp.1-44 Addison Wesley) . Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100. Un premier polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec un second polypeptide est un polypeptide comportant, au plus, 5 acides aminés modifiés sur 100 acides aminés, par rapport à la séquence dudit second polypeptide. En d'autres termes jusqu'à 5% des acides aminés dudit second polypeptide peuvent être délétés ou substitués par un autre acide aminé ou ledit premier polypeptide peut comporter jusqu'à 5% d'acides aminés en plus par rapport au nombre total d'acides aminés du second polypeptide. Ces modifications de la séquence peuvent être situées aux positions amino et/ou carboxy-terminales de la séquence d'acides aminés ou à un endroit quelconque entre ces positions terminales, en un ou plusieurs emplacements (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Gemme Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993 ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994 ; sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987) .

Par analogie, un premier polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec un second polynucléotide est donc un polynucléotide comportant, au plus, 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à la séquence dudit second polynucléotide. En d'autres termes, jusqu'à 5% des nucléotides du polynucléotide, par exemple, de séquence ID SEQ N°1 peuvent être délétés ou substitués par un autre nucléotide, ou un polynucléotide peut comporter jusqu'à 5% de nucléotides en plus par rapport au nombre total de nucléotides du polynucléotide ID SEQ N°1. Ces modifications peuvent être positionnées aux extrémités 3' et/ou 5', ou à un endroit quelconque entre ces extrémités, en un seul ou plusieurs emplacements. On entend par "fragment de polypeptide" un polypeptide comprenant au moins "n" acides aminés consécutifs issus du polypeptide ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 où, selon les séquences, n sera égal à 7 acides aminés ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50 ou plus acides aminés). De préférence, lesdits fragments comportent un épitope des séquences ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18. Ces épitopes de type B ou T peuvent être déterminés par un logiciel (par exemple, PEOPLE [Alix, 1999], PREDITOP [Pellequer et Westhof, 1993] ou TEST [Zao et al., 2001]) ou expérimentalement par des techniques classiques [par exemple, par cartographie d'épitope ou protéolyse ménagée]. On entend par "fragment de polynucléotide" un polynucléotide comprenant au moins "n" nucléotides consécutifs issus des polynucléotides ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 où, selon les séquences, n sera égal à 21 nucléotides ou plus (par exemple, 22, 23, 24, 25, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 90, 120, 150 ou plus nucléotides).

On entend par "cellule hôte" une cellule qui a été transformée ou transfectée, ou est capable de transformation ou de transfection, par une séquence polynucléotidique exogène. On entend par "amorces spécifiques" de courtes séquences nucléotidiques capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur le brin d'ADN ou sur son brin complémentaire.

On entend par "milieu de culture" le milieu dans lequel on purifie un polypeptide selon l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques bien connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification. On entend par "fonction" l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide. La fonction d'un polypeptide conforme à l'invention est celle d'un antigène de M. pneumoniae, et la fonction d'un polynucléotide conforme à l'invention est celle de coder ce polypeptide. On entend par "antigène", tout composé qui, seul ou en association avec un adjuvant ou porteur, est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique. Cette définition comprend également tout composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène. La fonction d'un antigène de M. pneumoniae est donc de permettre d'établir le diagnostic d'une infection à M. pneumoniae, mais peut-être aussi de réaliser des suivis thérapeutiques ou de préciser s'il s'agit d'une infection active ou aiguë, par exemple, par l'utilisation de la détection de différents isotypes d'anticorps. La fonction d'un antigène de M. pneumoniae peut également être d'induire une réponse immunitaire chez un patient auquel il aura été administré à des fins de prévention d'une infection ultérieure à M. pneumoniae.

On entend par "analogie structurale" une analogie aussi bien de la structure primaire (séquence) que de la structure secondaire (éléments structuraux), de la structure tertiaire (structure tridimensionnelle) ou de la structure quaternaire (association de plusieurs polypeptides dans un même complexe) (BIDCHEMISTRY, 4ème Ed, L. Stryer, New Ynrk,1995).

On entend par "variant" d'un polynucléotide dit initial ou d'un polypeptide dit initial, respectivement, un polynucléotide ou un polypeptide qui en diffère par au moins un nucléotide ou un acide aminé, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est-à-dire la même fonction. Une différence dans la séquence polynucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide initial. Néanmoins, par définition, ces variants doivent conférer la même fonction que la séquence polynucléotidique initiale, par exemple, coder un polypeptide ayant une fonction antigénique. Le polynucléotide ou le polypeptide variant diffère généralement du polynucléotide initial ou du polypeptide initial par une substitution, addition, délétion, fusion ou troncation ou plusieurs de ces modifications, prises en combinaison. Un variant non-naturel d'un polynucléotide initial ou d'un polypeptide initial peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe. On définit comme "séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique" un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence polynucléotidique dans des conditions stringentes.

On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes" les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences polynucléotidiques ont une identité d'au moins 80%. Ces conditions peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. On entend par "anticorps" les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés, ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines.

Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par administration à un animal d'un polypeptide donné, suivie d'une récupération des anticorps produits par ledit animal par extraction depuis ses fluides corporels. On peut également administrer à l'animal un variant dudit polypeptide, ou des cellules hôtes exprimant ce polypeptide.

Le terme "immunospécifique" appliqué au terme anticorps, vis-à-vis d'un polypeptide donné, signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour ce polypeptide que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur.

Par "affinité" on entend à la fois une complémentarité structurale et une complémentarité des liaisons de faible énergie entre deux molécules au sens d'une définition communément admise (voir, par exemple, Klotz 1M. Ligand-protein binding affinities. In Protein Function, a Practical Approach (T.E. Creighton, Ed). 1989 ; 25-35. IRL Press, Oxford, ou encore Ajay, Murcko MA. 15 Computational methods to predict binding free energy in ligand-receptor complexes. J. Med Cham. 1995; 38:4953- 67). L'affinité peut être mesurée par les techniques classiques de la biochimie (ELISA, compétition, fluorescence,...) bien connues de la personne du métier. Par sérum "positif" on entend un sérum contenant des 20 anticorps, produits à la suite d'une infection à M. pneumoniae, identifiés par leur liaison avec le polypeptide (antigène) de l'invention. On entend par "sensibilité" la proportion de malades infectés, diagnostiqués selon l'art antérieur et donnés 25 positifs par le diagnostic selon l'invention. On entend par "spécificité" la proportion de donneurs de sang, testés comme témoins, soumis au diagnostic selon l'invention et donnés négatifs par le diagnostic selon l'invention. 30 On entend par "kit de diagnostic" un ensemble contenant au moins l'un des produits selon l'invention (polypeptide, polynucléotide, anticorps) et un diluant convenable, rassemblés dans un contenant approprié fait dans un matériau adapté. Ce contenant peut rassembler les 35 différents moyens complémentaires nécessaires au test sérologique (par exemple, des réactifs marqués, des tampons, des solutions qui contiennent des ions adaptés, etc...) ainsi que les instructions requises pour réaliser le test. La présente invention répond aux objectifs qu'elle s'est fixés plus haut en apportant un nouveau polynucléotide et un nouveau polypeptide pour le diagnostic sérologique d'infections à M. pneumoniae ainsi qu'une composition pour la prévention de telles infections. Plus précisément, l'invention a pour objet l'utilisation, in vitro, de l'un au moins des polypeptides de séquence ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, ou 18, d'une partie ou de variants de ces polypeptides, de cellules hôtes comprenant des vecteurs incluant un polynucléotide codant pour l'un au moins desdits polypeptides ou un variant desdits polypeptides, dans la production d'anticorps et le domaine du diagnostic in vitro de L. pneumoniae. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic et une composition pharmaceutique.

Utilisation de polypeptides L'identification des polypeptides selon l'invention est le résultat d'un crible et d'études approfondies que les séquences issues des programmes de génomique de M. pneumoniae ne laissaient pas envisager. Le laboratoire de la Déposante connaît, par ailleurs, des polypeptides issus de M. pneumoniae qui ne permettent pas de diagnostiquer une infection à cette bactérie. La Déposante a cependant identifié, de façon tout à fait inattendue, qu'un tel diagnostic était possible en utilisant d'autres polypeptides et, même, des fragments de polypeptides issus de M. pneumoniae, qu'elle a spécifiquement identifiés. Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation : . soit pour détecter, in vitro, dans des échantillons 35 biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae, . soit pour induire une réponse immunitaire contre Mycoplasma pneumoniae a) d'un polypeptide isolé de séquence d'acides aminés ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 ; ou b) d'un polypeptide isolé constitué d'un fragment d'une séquence d'acides aminés ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 ayant la même fonction que ledit polypeptide de séquence ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 ; ou c) d'un polypeptide isolé constitué d'une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18 ou avec un fragment de séquence identifié sous b), et ayant la même fonction que ledit polypeptide de séquence ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18, étant entendu que par "même fonction que ledit polypeptide", on entend une fonction antigénique de Mycoplasma pneumoniae. Plus précisément, - la séquence d'acides aminés ID SEQ N°2 (appelée 20 protéine 10B2) est codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N°1 - la séquence d'acides aminés ID SEQ N°4 (appelée protéine 10A2) est codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N°3 25 - la séquence d'acides aminés ID SEQ N°6 (appelée protéine 1OA1) est codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N°5 - la séquence d'acides aminés ID SEQ N°8 (appelée protéine 14G5) est codée par la séquence polynucléotidique 30 ID SEQ N°7 - la séquence d'acides aminés ID SEQ N°10 (appelée protéine 15C6) est codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N°9 - la séquence d'acides aminés ID SEQ N°12 (appelée 35 protéine 15E6) est codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N°11 ; - la séquence d'acides aminés ID SEQ N°14 (appelée protéine 14E5) est codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N°13 ; - la séquence d'acides aminés ID SEQ N°16 (appelée 5 protéine 15D6) est codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N°15 ; et - la séquence d'acides aminés ID SEQ N°18 (appelée protéine 7D4) est codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N°17. 10 Ainsi, des polypeptides conformes à l'invention peuvent comprendre des séquences d'acides aminés ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou des variants ou fragments desdites séquences d'acides aminés. 15 La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, dans lequel une cellule hôte définie précédemment est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture. 20 Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide 25 trichloroacétique, ou de moyens tels que l'extraction à l'acide, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie sur phosphocellulose, la chromatographie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographie sur hydroxylapatite ou les 30 chromatographies d'exclusion.

Utilisation de polynucléotides La présente invention a également pour objet l'utilisation : . soit pour détecter, in vitro, dans des échantillons 5 biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae, . soit pour induire une réponse immunitaire contre Mycoplasma pneumoniae a) d'un polynucléotide isolé de séquence de 10 nucléotides ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,ou 17 ; ou b) d'un polynucléotide isolé constitué d'un fragment d'une séquence de nucléotides ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 ou 17 et ayant la même fonction que ledit polynucléotide de séquence ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 15,ou 17 ; ou c) d'un polynucléotide isolé ayant au moins 60% d'identité avec une séquence de nucléotides ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 ou 17 ou avec un fragment de séquence tel que défini sous b), et ayant la même fonction que ledit 20 polynucléotide de séquence ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 ou 17 ; ou d) d'une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 ou 17 ou au polynucléotide selon les points b) ou c) ci-dessus, 25 étant entendu que par ayant la même fonction que ledit polynucléotide on entend une fonction de codage d'un polypeptide antigénique de M. pneumoniae de séquence ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ou 18. Ainsi, des polynucléotides conformes à l'invention 30 peuvent comprendre des séquences polynucléotidiques ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 ou des variants ou fragments desdites séquences. Les polynucléotides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes standard de synthèse d'ADN ou 35 d'ARN. Les polynucléotides conformes à l'invention peuvent également comprendre des séquences polynucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites, des séquences non-traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm.

Utilisation de vecteurs d'expression et de cellules hôtes La présente invention a aussi pour objet l'utilisation du polypeptide selon l'invention préparé par culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide conforme à l'invention. De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisomes de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus et les rétrovirus. Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence polynucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences polynucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences polynucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre.

La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant conforme à l'invention.

L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection. Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que des cellules de streptocoques, de staphylocoques, d'Escherichia coli ou de Baciilus subtilis, des cellules de champignons telles que des cellules de levure et des cellules d'Aspergillus, des cellules de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que des cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 ou encore des cellules végétales.

Utilisation des anticorps selon l'invention L'invention vise également l'utilisation d'un polypeptide selon l'invention pour la génération d'anticorps adaptés à détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'antigènes issus d'une infection par Mycoplasma pneumoniae. L'invention vise, en outre, l'utilisation de tels anticorps pour détecter, périodiquement, in vitro, les antigènes de M. pneumoniae et ainsi suivre l'évolution de la pathologie et de l'effet d'un traitement appliqué à un patient. Des anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide tel que défini selon l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polypeptide, à un mammifère, de préférence non humain, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes, la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines et la technique des hybridomes EBV. Isotypes d'anticorps Les immunoglobulines (ou anticorps) sont constituées de deux chaînes polypeptidiques différentes : deux chaînes légères (L) d'isotypes [kappa] ou [lambda], et de deux chaînes lourdes (H) d'isotypes [gamma], [alpha], [mu], [delta] ou [epsilon]. Ces quatre chaînes sont liées de façon covalente par des ponts disulfures. Les deux types de chaînes H ou L possèdent des régions qui contribuent à la fixation des antigènes et sont très variables d'une immunoglobuline à une autre. Ces régions déterminent l'affinité des anticorps pour leur ligand. Les isotypes des chaînes lourdes permettent de définir la classe de l'immunoglobuline ; il existe 5 isotypes d'anticorps (IgA, IgM, IgD, IgE et IgG). Des sous-classes, par exemple IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4 sont définies par des différences de séquence de la chaîne lourde. Les différentes classes d'immunoglobulines ont des propriétés physicochimiques propres et leur synthèse dépend directement des phases et des niveaux d'activation de la réponse immunitaire. Chez l'homme, les IgG représentent la principale classe d'immunoglobulines : leur concentration sérique chez l'adulte varie de 8 à 16 g/l. Leur demi-vie plasmatique est d'environ 3 semaines. Les IgA constituent la deuxième classe d'immunoglobulines sériques, après les IgG, en terme de concentration {2 à 4 g/1). En revanche, elles représentent la classe prépondérante des immunoglobulines dans les sécrétions (sécrétions respiratoires, salivaires, digestives..., lait, colostrum, larmes). Sur le plan structural, les IgA ont la particularité de se présenter sous plusieurs formes moléculaires : - dans le sérum, les IgA peuvent se présenter sous forme de monomères (forme prépondérante) ou sous forme de dimères associés à une chaîne J (chaîne de jonction). La chaîne J est un peptide riche en cystéine de 137 acides aminés (poids moléculaire : 15 000 Da), d'origine plasmocytaire ; la sous-classe IgAl est prépondérante dans le sérum ; - dans les sécrétions, les IgA, appelées IgA sécrétoires, sont sous forme de dimères ; elles sont donc associées à une chaîne J, mais elles comportent également un composant sécrétoire. Les IgA produites par les lymphocytes B sont captées par les cellules épithéliales, par un récepteur (polyIgR) situé au pôle basal de la cellule. C'est pendant le transfert de l'IgA à travers la cellule épithéliale, vers le pôle apical de la cellule, que le composant sécrétoire (poids moléculaire : 70 000 Da), ou pièce sécrétoire, est ajouté. Le rôle de la pièce sécrétoire est de protéger les IgA sécrétoires vis-à-vis des enzymes protéolytiques présents dans les sécrétions. Comme les IgA, les IgM peuvent se présenter sous 2 formes moléculaires distinctes : - une forme monomérique : c'est la forme sous laquelle 20 les IgM sont synthétisées et insérées dans la membrane du lymphocyte B ; - une forme pentamérique : c'est la forme sous laquelle les IgM sont sécrétées. Les 5 monomères de base sont reliés par des ponts disulfures. De plus, une chaîne J 25 relie l'extrémité de 2 monomères. Les IgD représentent moins de 1% des immunoglobulines sériques. Elles sont habituellement coexprimées avec les IgM à la surface des lymphocytes B où elles semblent jouer un rôle de récepteur pour les antigènes. 30 Les IgE ne sont présentes, chez un sujet normal, qu'à l'état de traces. Cinétique d'apparition des anticorps et affinité La cinétique d'apparition d'anticorps spécifiques et 35 d'un isotype donné est aujourd'hui encore mal comprise. D'une façon générale les cellules B, dites naïves, synthétisent différentes IgM qui constituent un large répertoire de molécules capables de fixer des antigènes (Steven A. Frank., Immunology and Evolution of Infectious Disease. (2002), Princeton University Press, Princeton, USA). Ainsi, lors de la première exposition à un antigène, celui-ci va se fixer avec une faible affinité à différentes IgM du système immunitaire. Cette interaction va néanmoins stimuler la division de la cellule B naïve correspondante. La division est d'autant plus rapide que l'affinité de l'IgM est forte ce qui permet une sélection initiale des meilleurs clones. De plus, lors de la division, les réarrangements génétiques permettent l'augmentation de l'affinité des anticorps. La région constante des immunoglobulines change également afin de produire des IgG dans le système circulatoire et des IgA à la surface des muqueuses (Steven et Frank 2002. Immunology and Evolution of Infectious Disease. Princeton University 15 Press, Princeton, USA) .

Utilisations des isotypes d'anticorps selon l'invention L'homme de l'art peut donc déduire de ce qui est explicité ci-dessus, que la présence d'une ou plusieurs 20 classes d'anticorps et l'affinité particulière des anticorps ont différentes implications d'un point de vue du diagnostic médical dans la différentiation des infections récurrentes ou non, d'une infection active, aiguë, chronique, latente, et/ou récente. 25 Sérologie Les échantillons biologiques testés peuvent être du sang, de l'urine, de la salive, du liquide de ponction de sérologie (par exemple liquide céphalo-rachidien, liquide 30 pleural ou liquide articulaire) ou l'un de leurs constituants (par exemple, le sérum).

Les vaccins La présente invention concerne également une 35 composition pharmaceutique, utilisable comme vaccin, renfermant à titre de principe actif au moins un des polypeptides, polynucléotides, vecteurs recombinants ou cellules hôtes selon l'invention, et un excipient pharmaceutiquement acceptable (par exemple, une solution stérile aqueuse ou non, pouvant contenir un antioxydant ou un tampon ou un soluté rendant la composition isotonique pour les fluides corporels).

Les kits L'invention a également pour objet des kits de diagnostic in vitro comprenant, d'une part : • au moins l'un des polypeptides conformes à l'invention, ou . au moins l'un des polynucléotides codant pour lesdits polypeptides, ou . au moins l'un des anticorps conformes à l'invention, 15 et, d'autre part, au moins un diluant (par exemple, un tampon, une solution saline...).

Partie expérimentale A l'issue d'un crible par Western blot, il a été 20 découvert que les protéines 10B2, 10A2, 10A1, 14G5, 1506, 15E6, 14E5, 15D6, 7D4 (ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18) ont une utilité dans le diagnostic des infections à M. pneumoniae. D'autres protéines, telles que la protéine GroEL appelée ici 2A9 (ID SEQ N°20), la protéine 25 DnaK nommée 6F2 (ID SEQ N°22) et la protéine ClpB appelée 10E2 (ID SEQ N°24)), qui ont également été testées, ne présentent pas les mêmes propriétés antigéniques que les polypeptides identifiés selon l'invention. Ces protéines sont codées par des gènes séquencés, dont la séquence est 30 connue de tous et accessible dans les banques de données.

A - Protocole d'obtention des antigènes

A.1) Clonage de la séquence codant pour les 35 polypeptides ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ou 24.

Les gènes codant pour les séquences des polypeptides ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ou 24 sont amplifiés par PCR à partir de l'ADN génomique de la bactérie M. pneumoniae (souche M129-B7, ATCC 29342) en utilisant, respectivement, des amorces spécifiques des séquences ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, ou 23 ; ces amorces sont choisies par l'homme de l'art de façon à encadrer la séquence d'ADN et à l'amplifier spécifiquement (par exemple ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23). Les fragments correspondants, ainsi amplifiés, sont clonés dans des vecteurs selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ces vecteurs permettent la production des protéines clonées sous contrôle d'un promoteur inductible par l'isopropyl-thiogalactoside (IPTG). Les protéines clonées correspondent aux polypeptides ID SEQ N°2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 et 24.

A.2) Expression des protéines Une souche d'Escherichia coll. est transformée par le vecteur d'expression précédemment décrit. Les bactéries sélectionnées sont mises en culture une nuit à 30°C sous agitation dans 50 ml de milieu Luria Bertani (LB, J.Miller, A short course in Bacteria Genetics , Cald Spring Harbor laboratory Press, 1992) contenant, respectivement, de l'ampicilline et du chloramphénicol à une concentration finale de 100 pg/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/50ème dans un volume final de 1 litre de milieu LB auquel on a ajouté, respectivement, de l'ampicilline et du chloramphénicol à une concentration finale de 100 pg/ml, et elle est incubée à 30°C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (en abrégé, A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par l'IPTG à une concentration finale de 0,5 mM. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (6 minutes à 5240 tours/min à 4°C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1,5.

A.3) Purification Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HC1 20 mM, pH 8, contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées avec du lysozyme (0,1 g / 50 ml) en présence de 250 mM d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA). La suspension est incubée pendant 30 minutes à 4°C puis centrifugée pendant 10 minutes à 4°C à 15500xg. Le culot est congelé à -20°C pendant au moins une nuit.

A.4) Exemple : purification de 10A1 (ID SEQ N°6) Les protocoles de purification diffèrent pour chaque protéine en fonction de sa solubilité et de ses caractères physicochimiques propres. Nous présentons, à titre d'exemple, la purification de la protéine 10A1. Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Mes 20 mM à pH 6, 0, puis soniquées 4 fois 20 secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 4°C pendant 30 minutes, le surnageant est filtré sur membrane de porosité 0,22 pm. Le filtrat est alors déposé sur une colonne échangeuse de cation (par exemple, SP-Sépharose 12 ml, Amersham Biosciences). Après lavage de la colonne, la protéine est éluée par un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl dans du tampon Mes [acide 2-(N-morpholino) éthane sulfonique] 20 mM à pH 6,0 en 20 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et les protéines sont précipitées par du sulfate d'ammonium à une concentration finale de 0,6 g/l. La solution est laissée au moins une nuit à 4°C puis centrifugée pendant 30 minutes à 20800xg. Le culot est alors repris dans un volume le plus faible possible (en général 300 pl) de tampon Na2HPO4/NaH2PO4 50 mM, pH 8, 0, contenant du NaCl 100 mM, puis déposé sur une colonne de gel filtration, par exemple SuperdexHR75-10/30, Amersham).

Les fractions éluées contenant la protéine sont rassemblées et du glycérol est ajouté à une concentration finale de 20%. Les protéines purifiées sont alors stockées à -20°C jusqu'à leur utilisation dans les tests.

Les concentrations des protéines sont déterminées spectrophotométriquement à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace CN, Vajdos F., Fee l., Grimsley G. Et Gray T., (1995), Protein Science 4, 2411-2423). La pureté des protéines est vérifiée par analyse par électrophorèse SDS-PAGE et par 10 spectrométrie de masse.

B - Test de diagnostic in vitro Pour réaliser les tests de diagnostic, des sérums provenant de patients, enfants et adultes, ayant eu une 15 infection documentée à M. pneumoniae (c'est-à-dire titres IgM et/ou IgG et/ou RFC et/ou PCR positifs et/ou culture positive ; collection du laboratoire) ont été utilisés. Les sérums témoins, correspondent à des sérums de donneurs de sang n'ayant pas eu une infection à 20 M. pneumoniae après caractérisation par test (c'est-à-dire titres IgM et IgG et IgA en ELISA négatifs et RFC négatifs ; collection du laboratoire). La fixation, sur les protéines recombinantes purifiées (obtenues comme décrit précédemment), des anticorps 25 présents dans les sérums a été évaluée soit par des tests en Western Blot soit par la technique ELISA.

B.1) Protocole de test de Western blot, pour les polypeptides tels que définis selon l'invention. 30 Après transfert sur une membrane de nitrocellulose des protéines recombinantes purifiées (obtenues comme décrit précédemment), la membrane est saturée pendant 45 minutes à l'aide d'une solution de tampon salin phosphate (PBS) contenant 3% de lait demi-écrémé. Après trois lavages par 35 du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, la membrane est mise en présence du sérum testé à la dilution adéquate (1/500) dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé pendant 45 minutes. Après trois nouveaux lavages, des anticorps anti-immunoglobulines G et A et M humaines de chèvre (par exemple 170-1042, Biorad), marqués à la phosphatase alcaline, sont ajoutés en une période de 45 minutes après avoir été dilués, selon le protocole du fournisseur, dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé. Trois nouveaux lavages sont effectués puis du phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle et du nitroblue tetrazolium sont ajoutés, selon les indications du fournisseur, jusqu'à l'obtention du résultat. Un résultat positif correspond à la fixation de l'anticorps anti-immunoglobuline humaine à un complexe composé du polypeptide selon l'invention fixé à la membrane et de l'anticorps sérique humain le reconnaissant spécifiquement, ce qui se traduit par une coloration localisée au niveau dudit complexe.

B.2 : Protocole du test ELISA, pour les polypeptides tels que définis selon l'invention.

Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4°C en présence de 0,5 pg d'antigène purifié (protéines 10B2, 10A2, 10A1, 14G5, 15C6, 15E6, 14E5, 15D6, 7D4, 2A9, 6F2, 10E2) dans du tampon salin phosphate (PBS). Après quatre lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées une heure et demie à 37°C par du PBS-Tween contenant 4% d'albumine de sérum bovin (BSA) (250 pl par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 pl de chaque sérum positif ou témoin sont ajoutés, à la dilution 1/100 dans du tampon PBS-BSA 4%, dans chaque puits. La plaque est ensuite incubée à 37°C pendant 30 minutes. Après quatre nouveaux lavages, des anticorps anti-immunoglobulines G et/ou A et/ou M humaines de chèvre marqués à la peroxydase (par exemple 31415, Pierce) sont ajoutés (simultanément et/ou indépendamment) en 30 minutes à 37°C après avoir été dilués, selon le protocole du fournisseur, dans du tampon PBS-BSA 4%. Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 pl de substrat tétrabenzimidine (TMB) (par exemple HD979505, Pierce) sont ajoutés par puits. Après incubation pendant environ 15 minutes, 100 pl d'acide sulfurique sont ajoutés dans chaque puits. L'absorbance à 450 nm de chaque puits est alors mesurée après 5 minutes. Sont considérés comme positif en ELISA, les sérums identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention.

C) Résultats et interprétations Des résultats types obtenus sont présentés dans les différents exemples ci-après. Les sérums de patients (enfants et/ou adultes) considérés comme positifs sont ceux contenant des anticorps dirigés contre M. pneumoniae identifiés, par ELISA, par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention.

Exemple 1 : Résultats obtenus par l'utilisation des polypeptides selon l'invention pour la détection d'anticorps spécifiques dans les sérums (ELISA) chez des enfants. Le panel d'échantillons testés est constitué de sérums de patients enfants dont l'infection à M. pneumoniae a été diagnostiquée par la mise en évidence d'une réponse IgM et/ou IgG positive par test ELISA, et/ou la mise en évidence d'un titre positif après test de réaction de fixation du complément et/ou par la mise en évidence du microorganisme par culture de prélèvements et/ou amplification par PCR. Le panel d'individus témoins est constitué de sérums d'enfants atteints de pneumopathie, diagnostiqués négatifs pour une infection à M. pneumoniae selon l'art antérieur. Les tableaux 1 et 2 présentent les résultats obtenus selon l'invention pour les polypeptides 10B2 (ID SEQ N° 2), 10A2 (ID SEQ N° 4), 10A1 (ID SEQ N° 6), 14G5 (ID SEQ N°8), 15C6 (ID SEQ N° 10), 15E6 (ID SEQ N° 12), 14E5 10 (ID SEQ N° 14), 15D6 (ID SEQ N° 16), 7D4 (ID SEQ N° 18), 2A9 (ID SEQ N° 20), 6F2 (ID SEQ N° 22) et 10E2 (ID SEQ N° 24) avec des anticorps secondaires reconnaissant les immunoglobulines G (tableau 1) ou M (tableau 2) présentes dans des sérums de patients malades ou de d'individus témoins.

Tableau 1 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-IgG comme anticorps secondaires Sérums d'enfants atteints Sérums d'enfants atteints de de pneumopathies pneumopathies non diagnostiquées à diagnostiquées à M. pneumoniae selon l'art antérieur, testés comme M. pneumoniae selon 1 art antérieur témoins Polypeptides Nombre Nombre de sérums Nombre de Nombre de sérums de "positifs" selon sérums "négatifs" selon testés sérums testés l'invention l'invention testés 10B2 21 12 (57.1%) 20 20 (100.0%) ID SEQ N°2 10A1 20 6 (30.0%) 20 20 (100.0%) ID SEQ N°6 6 F2 ID SEQ N°22 20 1 (5.0%) 20 20 (100.0%) 5 Tableau 2 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-IgM comme anticorps secondaires Sérums d'enfants atteints de Sérums d'enfants atteints de pneumopathies non diagnostiquées à pneumopathies diagnostiquées à M. pneumoniae selon l'art M. pneumoniae selon l'art antérieur, testés comme antérieur témoins Nombre de Nombre de sérums Nombre de sérums Polypeptides sérums "positifs" selon Nombre de "négatifs" testés testés l'invention sérums testés selon l'invention 10B2 21 10 (47.6%) 20 18 (90.0%) ID SEQ N°2 10A2 18 7 (33.3%) 18 18 (100.0%) ID SEQ N°4 14G5 21 9 (42.9%) 20 20 (100.0%) ID SEQ N°8 15C6 21 10 (47.6%) 20 19 (95.0%) ID SEQ N°10 15E6 21 11 (52.4%) 20 20 {100.0%) ID SEQ N°12 14E5 21 10 (47.6%) 20 19 (95.0%) ID SEQ N°14 15D6 21 10 (47.6%) 20 19 (95.0%) ID SEQ N°16 7D4 21 8 (38.1%) 20 19 (95.0%) ID SEQ N°18 2A9 21 2 (9.5%) 20 19 (95.0%) ID SEQ N°20 6F2 20 1 (5.0%) 20 20 (100.0%) ID SEQ N°22 10E2 20 3 (14.5%) 20 19 (95.0%) ID SEQ N°24 Des résultats similaires peuvent être obtenus par Western Blot.

Exemple 2 : Résultats obtenus par l'utilisation des polypeptides selon l'invention pour la détection d'anticorps spécifiques dans les sérums (ELISA) chez des adultes.

Le panel d'échantillons testés est constitué de sérums de patients adultes dont l'infection à M. pneumoniae a été diagnostiquée par la mise en évidence d'une réponse IgM et/ou IgG positive par test ELISA, et/ou la mise en évidence d'un titre positif après test de réaction de fixation du complément et/ou par la mise en évidence du microorganisme par culture de prélèvements et /ou amplification par PCR. Le panel d'individus témoins est constitué de sérums d'adultes donneurs de sang. Les tableaux 3 et 4 présentent les résultats obtenus selon l'invention pour les polypeptides 10B2 (ID SEQ N°2), 14G5 (ID SEQ N°8), 15C6 (ID SEQ N°10), 7D4 (ID SEQ N°18), 6F2 (ID SEQ N° 22) avec des anticorps secondaires reconnaissant les immunoglobulines G (tableau 3) ou M (tableau 4) présentes dans des sérums de patients malades ou de d'individus témoins.

Tableau 3 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-IgG comme anticorps secondaires Sérums d'adultes atteints de Sérums d'adultes donneurs pneumopathies diagnostiquées à de sang testés comme M. pneumoniae selon l'art témoins antérieur Polypeptides Nombre de Nombre de sérums Nombre Nombre de sérums testés sérums "positifs" selon de "négatifs" selon testés l'invention sérums l'invention testés 10B2 8 3 (37.5%) 30 29 (96.7%) ID SEQ N°2 6F2 ID SEQ N°22 8 0 (0.0%) 30 29 (96.7%) Tableau 4 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-IgM comme anticorps secondaires Sérums d'adultes atteints de Sérums d'adultes donneurs pneumopathies diagnostiquées à M. pneumoniae selon l'art de sang testés comme témoins antérieur Polypeptides Nombre de Nombre de sérums Nombre Nombre de sérums testés sérums "positifs" selon de "négatifs" selon testés l'invention sérums l'invention testés 14G5 ID SEQ N°8 8 3 (37.5%) 30 29 (96.7%) 15C6 8 5 (62.5%) 30 30(100.0%) ID SEQ N°10 7D4 8 4 (50.0%) 30 29 (96.7%) ID SEQ N°18 6F2 ID SEQ N°22 8 0 (0.0%) 30 29 (96.7%) 10 Des résultats similaires peuvent être obtenus par Western Blot.5 D'après les tableaux de résultats 1 à 4, on constate que, par le test ELISA, que les protéines 2A9, 6F2 et 10E2 ont de mauvaises performances (spécificité et/ou sensibilité) et ne peuvent être utilisées dans le cadre du diagnostic sérologique d'une infection à M. pneumoniae chez l'enfant ou chez l'adulte. En revanche, il est possible d'identifier in vitro et avec une spécificité de 100%, jusqu'à 57,1 % en détectant les IgG et jusqu'à 52,4% en détectant les IgM, des pneumopathies causées par M. pneumoniae chez l'enfant grâce à l'utilisation, selon l'invention, de l'un ou l'autre des polypeptides. De même, jusqu'à 37,5% et 62,5% des infections causées par M. pneumoniae peuvent être diagnostiquées chez des patients adultes en détectant respectivement les IgG et les IgM pour des spécificités de 96,7% et 100% grâce à l'un ou l'autre des polypeptides identifiés selon l'invention. Nous retrouvons donc un taux important d'anticorps dirigés contre l'un ou l'autre des polypeptides identifiés selon l'invention chez la plupart des patients enfants et adultes testés. Ces antigènes peuvent donc conférer aux individus infectés une protection immunitaire durable contre la réinfection. Ils pourraient, par suite, être utilisés en prévention des infections à M. pneumoniae.

Il est ainsi démontré, d'une part, l'existence, chez l'homme, d'une réponse anticorps significative (la probabilité associée à un test de x2 est inférieure à 0,05) vis-à-vis des polypeptides identifiés selon l'invention au cours des infections à M. pneumoniae et, d'autre part, que les protéines 10B2, 10A2, 10A1, 14G5, 1506, 15E6, 14E5, 15D6 et 7D4 sont pertinentes pour le diagnostic sérologique de ce type d'infection, à travers des pathologies telles que la pneumopathie. des séquences polynucléotidiques ID SEQ N°1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17

Claims (9)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits 5 à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae, a) d'un polypeptide isolé de séquence d'acides aminés ID SEQ N°2 ; ou b) d'un polypeptide isolé constitué d'un fragment d'une séquence d'acides aminés ID SEQ N°2, ayant la même 10 fonction que ledit polypeptide de séquence ID SEQ N°2 ; ou c) d'un polypeptide isolé constitué d'une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec la séquence ID SEQ N°2, ou avec un fragment de séquence identifié sous b), et ayant la même fonction que ledit 15 polypeptide de séquence ID SEQ N°2, étant entendu que par "même fonction que ledit polypeptide", on entend une fonction antigénique de Mycoplasma pneumoniae.
2. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée 20 en ce que ledit polypeptide est préparé par culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide et par isolement dudit polypeptide depuis ledit milieu de culture. 25
3. 3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit polynucléotide est de séquence de nucléotides ID SEQ N°1.
4. 4. Utilisation pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits 30 à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae, a) d'un polynucléotide isolé de séquence de nucléotides ID SEQ N°1 ; ou b) d'un polynucléotide isolé constitué d'un fragment d'une séquence de nucléotides ID SEQ N°1, et ayant la même 35 fonction que ledit polynucléotide de séquence ID SEQ N°1 ; ouc) d'un polynucléotide isolé ayant au moins 60% d'identité avec une séquence de nucléotides ID SEQ N°1 ou avec un fragment de séquence tel que défini sous b), et ayant la même fonction que ledit polynucléotide de séquence ID SEQ N°1 ; ou d) d'une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence ID SEQ N°1, ou au polynucléotide selon les points b) ou c) ci-dessus, étant entendu que par ayant la même fonction que ledit polynucléotide on entend une fonction de codage d'un polypeptide antigénique de M. pneumoniae de séquence ID SEQ N°2.
5. 5. Utilisation d'anticorps immunospécifiques d'un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 3 pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'antigènes issus d'une infection par Mycoplasma pneumoniae.
6. 6. Kit pour la mise en oeuvre de l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans le domaine de la détection, in vitro, dans des échantillons biologiques, de la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits polypeptides ou l'un desdits polynucléotides, tels qu'identifiés dans l'une quelconque desdites revendications 1 à 4, associé à au moins un diluant.
7. 7. Kit pour la mise en oeuvre de l'utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits anticorps associé à au moins un diluant.
8. 8. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, pour la mise en oeuvre de l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour induire une réponse immunitaire contre Mycoplasma pneumoniae, comprenant, à titre de principe actif, au moins : a) d'un polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ N°2 ; oub) d'un polypeptide constitué d'un fragment d'une séquence d'acides aminés ID SEQ N°2 ayant la même fonction que ledit polypeptide de séquence ID SEQ N°2 ; ou c) d'un polypeptide constitué d'une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec la séquence ID SEQ N°2, ou avec un fragment de séquence identifié sous b), et ayant la même fonction que ledit polypeptide de séquence ID SEQ N°2 ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable, étant entendu que par ayant la même fonction que ledit polypeptide" on entend une fonction antigénique de M. pneumoniae.
9. 9. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, pour la mise en oeuvre de l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour induire une réponse immunitaire contre Mycoplasma pneumoniae comprenant, à titre de principe actif, au moins : a) d'un polynucléotide de séquence de nucléotides ID SEQ N°1 ; ou b) d'un polynucléotide constitué d'un fragment d'une séquence de nucléotides ID SEQ N°1 et ayant la même fonction que ledit polynucléotide de séquence ID SEQ N°1 ; ou c) d'un polynucléotide ayant au moins 60% d'identité avec une séquence de nucléotides ID SEQ N°1 ou avec un fragment de séquence tel que défini sous b), et ayant la même fonction que ledit polynucléotide de séquence ID SEQ N°1 ; ou d) d'une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence ID SEQ N°1, ou au polynucléotide selon les points b) ou c) ci-dessus, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable, étant entendu que par ayant la même fonction que ledit polynucléotide on entend une fonction de codage d'un polypeptide antigénique de M. pneumoniae de séquence ID SEQ N°2.