FR2936252A1 - Dispositif pour l'analyse microbiologique. - Google Patents

Dispositif pour l'analyse microbiologique. Download PDF

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Abstract

Le dispositif pour l'analyse microbiologique d'un support adapté à contenir des micro-organismes marqués par un agent fluorophore, ledit agent étant adapté à absorber de l'énergie lumineuse selon un spectre d'absorption (53) présentant un sommet (53') à une longueur d'onde d'absorption prédéterminée (λ ) et à restituer cette énergie en émettant de la lumière selon un spectre d'émission (54) présentant un sommet (54') à une longueur d'onde d'émission prédéterminée (λ ) distincte de ladite longueur d'onde d'absorption , comporte des moyens d'éclairage ; le spectre (55) de la lumière d'excitation provenant des moyens d'éclairage présentant un sommet (55') à une longueur d'onde d'excitation prédéterminée (λ ) avec un écart prédéterminé entre les longueurs d'onde d'excitation (λ ) et d'absorption (λ ) grâce à quoi il est rendu aisé de discriminer la lumière émise par ledit agent fluorophore de celle provenant des moyens d'éclairage.

Description

La présente invention concerne un dispositif pour l'analyse microbiologique de supports susceptibles de contenir des micro-organismes afin de détecter la présence ou l'absence de ces micro-organismes. Une façon d'analyser de tels supports consiste à détecter la présence des micro-organismes par analyse de la fluorescence émise par ces micro-organismes après qu'ils aient été marqués par des marqueurs dits fluorogéniques ou fluorophores. Ces marqueurs ont la particularité d'émettre en fluorescence uniquement lorsqu'ils ont été préalablement activés par une enzyme contenue 10 dans les micro-organismes. Ces marqueurs comprennent généralement un groupement fluorophore ainsi qu'un autre groupement capable de masquer ou d'empêcher la fluorescence du groupement fluorophore de se manifester. L'enzyme des micro-organismes lorsqu'ils sont présents a pour effet de modifier ce second 15 groupement afin que la fluorescence du premier groupement puisse être détectée. Ainsi, et comme illustrés par les spectres 53 et 54 en figure 7, lorsque les micro-organismes ainsi marqués sont soumis à une lumière d'excitation adaptée, le groupement fluorophore est capable d'absorber de 20 l'énergie lumineuse selon un spectre d'absorption 53 dont le sommet 53' est à une longueur d'onde À2 et de restituer cette énergie sous la forme d'un spectre d'émission en fluorescence caractéristique 54 dont le sommet 54' est à une longueur d'onde À3, distincte de À2. On connaît déjà, afin d'observer la fluorescence émise par les micro- 25 organismes en présence de tels marqueurs, et comme illustré en figure 9, des dispositifs (intégrés à des microscopes) pour l'analyse microbiologique comportant des moyens d'éclairage pour émettre la lumière d'excitation et dont le spectre 50 en forme de gaussienne présente un sommet 50' à une longueur d'onde À1 choisie égale à la longueur d'onde À2 pour exciter le fluorophore avec 30 une énergie suffisante afin qu'il émette, en présence de micro-organismes, de la lumière selon son spectre d'émission 54.
Un tel dispositif est pourvu d'un filtre d'entrée, disposé entre les moyens d'éclairage et le support à éclairer, tel que par exemple un filtre passe-bande dont le spectre 51 est illustré sur la figure 9, ce filtre ayant une bande passante très étroite et centrée sur la longueur d'onde À1 de façon à ne sélectionner, étant donnée la largeur spectrale importante des moyens d'éclairage correspondant au spectre 50, que la longueur d'onde utile pour exciter le fluorophore convenablement au niveau d'énergie souhaitée. Ce dispositif comporte également un filtre disposé entre le support à analyser et la zone de visualisation de la lumière provenant du support, ce filtre étant illustré par le spectre 52 sur la figure 9 (ici un filtre passe-bande étroite centrée sur la longueur d'onde À2), afin de ne laisser passer que la lumière qui est émise par le fluorophore en réponse à la lumière d'excitation, filtrée de toutes les autres longueurs d'onde parasites. Des dispositifs présentant un tel agencement sont par exemple décrits dans le brevet américain US 7,397,602. L'invention vise à fournir un dispositif pour réaliser, comme pour le dispositif de l'art antérieur, une détection en fluorescence mais à la fois plus économique, plus simple et tout aussi performant. Elle propose à cet effet, un dispositif pour l'analyse microbiologique d'un support adapté à contenir des micro-organismes marqués par un agent fluorophore, ledit agent étant adapté, au contact desdits micro-organismes, à absorber de l'énergie lumineuse selon un spectre d'absorption présentant un sommet à une longueur d'onde d'absorption prédéterminée (À2) et à restituer cette énergie en émettant de la lumière selon un spectre d'émission en fluorescence présentant un sommet à une longueur d'onde d'émission prédéterminée (À3) distincte de ladite longueur d'onde d'absorption (À2), ledit dispositif comportant des moyens d'éclairage adaptés à éclairer ledit support afin que lesdits micro-organismes marqués émettent, en réponse à la lumière d'excitation émise par ces moyens d'éclairage, de la lumière selon ledit spectre d'émission ; caractérisé en ce que le spectre de la lumière d'excitation provenant des moyens d'éclairage présente un sommet à une longueur d'onde d'excitation prédéterminée (À1) distincte desdites longueurs d'onde d'absorption (À2) et d'émission (À3) dudit agent fluorophore, de sorte que ladite longueur d'onde d'absorption (À2) est située entre lesdites longueurs d'onde d'excitation (À1) et d'émission (À3) avec un écart prédéterminé entre les longueurs d'onde d'excitation (À1) et d'absorption (À2), grâce à quoi il est rendu aisé de discriminer la lumière émise par ledit agent fluorophore de celle provenant des moyens d'éclairage. Le décalage spectral entre les sommets des spectres d'excitation et d'absorption avec la longueur d'onde d'absorption À2 qui est ainsi située entre les longueurs d'onde d'excitation À1 et d'émission À3 permet de disposer avantageusement entre ces longueurs d'onde d'absorption et d'émission la portion du spectre de la lumière d'excitation située au-delà de À1 afin d'obtenir, d'une part, une lumière qui présente une assez grande d'énergie à la longueur d'onde À2 pour exciter le fluorophore de façon à ce qu'il émette de la lumière par fluorescence et pour, d'autre part, avoir un faible recouvrement du spectre d'excitation avec le spectre d'émission à la longueur d'onde À3 (et aux longueurs d'onde voisines) afin que la lumière qui provient des moyens d'éclairage et qui est réfléchie sur le support à analyser ne parasite pas de façon conséquente la lumière émise par l'agent fluorophore en présences des micro-organismes de sorte qu'il est rendu aisé de discriminer la lumière émise par l'agent fluorophore de celle provenant des moyens d'éclairage. En effet, le recouvrement entre le spectre d'excitation et le spectre d'émission étant ainsi faible grâce au décalage spectral du dispositif selon l'invention, le sommet du spectre d'émission du fluorophore est plus détaché du sommet du spectre de la lumière d'excitation et le ratio entre l'énergie parasite à la longueur d'onde d'émission du fluorophore (provenant de la lumière émise par les moyens d'éclairage à cette longueur d'onde) et l'énergie provenant effectivement de la fluorescence des micro-organismes marqués se trouve considérablement amélioré. Il est ainsi possible de détecter aisément sur le support les points 30 lumineux correspondant aux micro-organismes marqués avec un contraste suffisant pour qu'ils soient nettement observables et en particulier à l'oeil nu.
Ce décalage spectral permet ainsi, même pour des moyens d'éclairage présentant une dispersion spectrale non négligeable (dispersion telle que celle illustrée par les spectres 50 et 55 sur les figures 7 et 9) de s'affranchir du filtre d'entrée des dispositifs de l'art antérieur sans qu'il ne soit pour autant nécessaire de remplacer de tels moyens d'éclairage par d'autres moyens d'éclairage dont la dispersion spectrale est plus faible (telle qu'un laser par exemple, extrêmement coûteux en général). Ceci permet ainsi de réduire significativement le coût de fabrication d'un tel dispositif tout en minimisant les pertes en énergie lumineuse, puisque la présence d'un filtre d'entrée, en particulier d'un filtre à bande passante étroite entraîne nécessairement une chute importante du rendement énergétique (et donc de la quantité de lumière parvenant jusqu'au support à éclairer) pour un tel dispositif. L'énergie lumineuse perdue étant moins importante dans le dispositif selon l'invention il est ainsi possible, pour une même puissance électrique consommée, d'éclairer des plus grandes surfaces de support à analyser (comme par exemple les surfaces de membranes de filtration microporeuses) que dans l'application à la microscopie du dispositif de l'art antérieur. Selon des caractéristiques préférées, pour des raisons de simplicité et de commodité tant à la fabrication qu'à l'utilisation : - ladite longueur d'onde d'excitation (Ài) est inférieure à ladite longueur d'onde d'absorption (À2), elle-même inférieure à ladite longueur d'onde d'émission (À3) ; - ledit spectre de la lumière d'excitation présente un pic d'intensité lumineuse maximale centré sur ladite longueur d'onde d'excitation (Ài) ; - l'écart entre lesdites longueurs d'onde d'excitation (Ài) et d'absorption (À2) est inférieur à l'écart entre lesdites longueurs d'ondes d'absorption (À2) et d'émission (À3) dudit agent fluorophore ; - ledit dispositif comporte également une fenêtre de visualisation de la lumière émise par ledit agent fluorophore munie d'un filtre adapté à laisser passer les plus grandes longueurs d'onde et dont la longueur d'onde de coupure est située entre ladite longueur d'onde d'absorption (À2) et ladite longueur d'onde d'émission (À3) ; - lesdits moyens d'éclairage comporte au moins une embase sur laquelle est montée au moins un groupe de sources lumineuses, avec lesdites sources de ce groupe qui sont régulièrement espacées les unes des autres pour former une matrice d'éclairage dudit support ; - lesdits moyens d'éclairage comportent deux dites embases inclinées l'une vers l'autre en direction d'un emplacement prédéterminé de réception dudit support dans le dispositif ; - chaque dite embase est inclinée d'un angle compris entre 40° et 50° par rapport audit emplacement prédéterminé de réception dudit support ; - lesdites sources lumineuses sont des diodes électroluminescentes ; et/ou - lesdits moyens d'éclairage comportent une lampe adaptée à émettre une lumière polychromatique et un filtre adapté à laisser passer les plus petites longueurs d'onde et dont la longueur d'onde de coupure est située entre ladite longueur d'onde d'absorption (À2) et ladite longueur d'onde d'émission (À3). Les caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la 20 description qui suit, donnée à titre d'exemple préféré, mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 est une représentation schématique d'un dispositif selon l'invention ; - la figure 2 est une vue en perspective de ce dispositif à côté 25 duquel est représentée une unité de filtration à analyser dans ce dispositif ; - les figures 3 et 4 sont respectivement une vue en perspective prise de dessous et une vue en élévation-coupe prise selon un plan médian de symétrie de ce dispositif ; - la figure 5 est une vue en perspective d'une des deux plaques de 30 circuits imprimés que comporte ce dispositif sur laquelle sont fixés deux groupes de diodes électroluminescentes, chacun émettant de la lumière à une longueur d'onde prédéterminée ; - la figure 6 est une vue en perspective d'un autre mode de réalisation du dispositif selon l'invention ; - la figure 7 illustre, avec une échelle de longueurs d'onde commune portée en abscisse et une échelle d'intensité lumineuse relative commune portée en ordonnée, les diagrammes spectraux de différents éléments optiques d'un dispositif selon l'invention ainsi que le diagramme spectral de l'agent fluorophore utilisé avec ce dispositif pour marquer les micro-organismes ; - La figure 8 est une représentation schématique d'une partie d'encore un autre mode de réalisation du dispositif selon l'invention ; et - la figure 9 illustre des diagrammes spectraux similaires à ceux de la figure 7 mais pour un dispositif selon l'art antérieur décrit précédemment. On va maintenant décrire un mode de réalisation préféré du dispositif selon l'invention à l'aide des figures 1 à 5 avant de détailler son mode de fonctionnement à l'aide des diagrammes spectraux illustrés en figure 7. Le dispositif 1 illustré sur les figures 1 à 5 comporte une enceinte 2, des moyens d'éclairage 3 formés de deux éléments d'éclairage 4, un tiroir coulissant 5 et une fenêtre de visualisation 7. L'enceinte est de forme générale parallélépipédique et présente une paroi supérieure 10 et quatre parois latérales 11 à 14, une portion de la paroi 14 étant volontairement non représentée afin de visualiser l'intérieur du dispositif. La fenêtre de visualisation 7 est ici constituée d'un filtre passe-bas 6 (c'est-à-dire qu'il laisse passer les plus basses fréquences et donc les plus grandes longueurs d'onde), une ouverture 9 étant ménagée dans la paroi supérieure 10 de l'enceinte 2 pour y recevoir ce filtre 6. L'intérieur de cette enceinte 2, délimitée par les parois 10 à 14 et 30 forme, comme on le verra ci-après, une chambre d'analyse isolée de la lumière ambiante et dans laquelle est reçu le support à analyser. Le support à analyser est ici une membrane microporeuse 41 appartenant à une unité de filtration 40, ici une unité commercialisée par Millipore sous la marque Milliflex . Cette membrane 41 présente un diamètre de 55 mm et est entourée par un corps 42 que comporte l'unité de filtration.
La membrane 41 utilisée ici est en ester de cellulose et présente une porosité adaptée à retenir les micro-organismes dont on souhaite détectée la présence, le plus souvent comprise entre 0,10 et 100 microns. Le tiroir 5 présente un corps 30, une collerette 31 et un ergot de saisie 32. Dans le corps 30 est ménagée une cavité cylindrique 33 prévue pour recevoir une unité de filtration 40. On va maintenant décrire les moyens d'éclairage 3 à l'aide des figures 3 à 5.
Ces moyens 3 comporte deux éléments d'éclairage 4 séparés. Chaque élément 4 comporte un socle 20 à section trapézoïdale, une plaque de circuit imprimé 21 sur laquelle sont disposées deux groupes 27 et 28 de diodes 22 et 23, un diffuseur 24 recouvrant ces diodes et deux masques noirs 26 entre les bords de la plaque 21 et ceux du diffuseur 24.
Les socles 20 sont fixés à l'intérieur de l'enceinte 2 sur la paroi 10 de cette enceinte, tandis que les plaques 21 sont fixées aux socles 20 sur leurs faces inclinées, opposées à celles disposées contre la paroi 10 de sorte que ces plaques sont inclinées l'une vers l'autre en direction de la zone de réception 33 du support 41.
Chaque socle 20 est ainsi prévu pour que chaque plaque 21 présente une inclinaison A (figure 1) de 45° par rapport à la paroi 10 et à l'emplacement prédéterminé qu'occupe la membrane 41, lorsque l'unité 40 est dans le logement 33 du dispositif (figure 1). Les bords supérieurs 25 des plaques 21 sont à une distance l'un de 25 l'autre égale à 100 mm tandis que ces bords 25 sont à une distance de 23 mm de la paroi 10. Les sommets de diodes électroluminescentes 22 et 23 sont eux situés à une distance de 15 mm des diffuseurs 24. Ces diffuseurs 24 sont ici réalisés à partir d'une plaque de verre sur 30 laquelle une des faces est sablée (la face qui est tournée vers les diodes).
Sur chaque plaque de circuit imprimé, et comme illustré en figure 5, est disposé un premier groupe 27 de diodes constitué de seize diodes 22 ainsi qu'un deuxième groupe 28 de diodes constitué de quatre diodes 23. Les diodes 22 sont régulièrement espacées les une des autres et disposées en quatre rangée de quatre diodes équidistantes, de sorte que chaque diode 22 est située à une distance de 16 mm des diodes 22 qui lui sont directement voisines. Ce groupe 27 forme ainsi une matrice de diodes permettant d'éclairer de façon uniforme la membrane 41 lorsqu'elle disposée dans l'enceinte 2 à son emplacement prédéterminé, le centre 29 de cette matrice étant situé à une hauteur H de 54,75 mm de cet emplacement prédéterminé (figure 1). Les diodes 23 sont réparties aux quatre coins d'un carré entrelacé au centre de la matrice de diodes 22, chaque diode 23 étant située à une distance de 32 mm des deux diodes 23 qui lui sont voisines et au centre d'un carré aux coins duquel sont situés quatre diodes 22 (figure 5). Le centre de cette matrice est confondu avec le centre 29 de la matrice constitué des diodes 22. Les diodes 22 sont des diodes de la société LUMILED commercialisées sous la référence LXHL-PB01 et dont le spectre d'émission 55 est illustré sur la figure 7, ce spectre en gaussienne présentant un sommet 55' à la longueur d'onde À1 de 470 nm, émettant ainsi dans le bleu. Les diodes 23 sont des diodes de la même société commercialisées sous la référence LXHL-PDO1, dont le spectre d'émission, non illustré sur les figures, est en gaussienne également et présente un sommet à la longueur d'onde de 625 nm, émettant ainsi dans le rouge.
Ces diodes ont un angle solide d'émission de 140° pour une valeur d'intensité relative de 25% et un angle solide d'émission de 90° pour une valeur d'intensité relative de 60%. Les diodes 23 ont une puissance d'émission sensiblement quatre fois plus importante que celle des diodes 22 de sorte qu'elles sont quatre fois 30 moins nombreuses que les diodes 22. Les matrices de diodes 22 et 23 sont entrelacées (c'est-à-dire imbriquées l'une dans l'autre) de façon à obtenir la lumière la plus homogène possible au niveau de l'unité de filtration à éclairer, qu'elle provienne des diodes 22 ou des diodes 23. Chaque groupe de diodes produit un spectre lumineux centré sur une longueur d'onde prédéterminée de façon à pouvoir exciter différents types 5 de fluorophores prédéterminés. Les pistes conductrices de chaque plaque 21 sont reliées électriquement à une unité de contrôle et de commande de ce dispositif (non représentée). On va maintenant décrire brièvement la préparation d'un échantillon 10 à analyser. Préalablement à l'étape de détection proprement dite, l'opérateur recueille par filtration au travers d'une membrane 41 d'une unité 40 un échantillon à analyser (susceptible de contenir des micro-organismes). Une fois les micro-organismes filtrés et retenus sur la membrane, 15 une étape facultative de culture des micro-organismes au contact d'un milieu de culture approprié peut être incluse. Ce milieu de culture est préférentiellement un milieu gélosé sur lequel on dépose la membrane après filtration. Cette étape, qui est facultative, permet d'obtenir des colonies de chacun des micro-organismes initialement filtrés, ce qui augmente le nombre de cellules à 20 détecter. La membrane et les micro-organismes qu'elle contient sont ensuite mis en contact d'une composition de perméabilisation des parois des micro-organismes et les marqueurs fluorophores sont ensuite incorporés à la composition de perméabilisation afin de pénétrer à l'intérieur des micro- 25 organismes à détecter. On va maintenant décrire la mise en oeuvre de la détermination de la présence ou non de micro-organismes sur un échantillon ainsi préparé à partir du dispositif selon l'invention. Dans un premier temps, le tiroir 5 est tiré et l'opérateur vient placer 30 une unité de filtration 40 (éventuellement recouvert d'un couvercle transparent non illustré pour protéger la membrane des contaminations extérieures) dans la cavité 33 de ce tiroir. Le tiroir 5 est ensuite poussé jusqu'à ce que la collerette 31 vienne en butée contre la paroi 13 de façon à ce que la membrane 41 soit disposée à son emplacement prédéterminé dans l'enceinte 2 pour être éclairée. En fonction du fluorophore qui a été utilisé pour réaliser le marquage des micro-organismes, l'opérateur sélectionne ensuite (par exemple par l'intermédiaire d'un commutateur non illustré sur les figures) les diodes correspondantes 22 ou 23 à allumer (les diodes 22 dans l'exemple illustré) de façon à éclairer de manière uniforme l'ensemble de la surface de la membrane 41 et à exciter à la bonne longueur d'onde le fluorophore ayant servi au marquage.
Les diffuseurs 24 ainsi que la distribution spatiale des diodes sur les plaques 21 permettent d'avoir un éclairage particulièrement homogène de toute la surface de la membrane 41, quelque soit le groupe de diodes utilisé. Les plaques 21 étant disposées de part et d'autre de l'ouverture 9 recevant le filtre 6, la lumière provenant de l'unité de filtration 40 qui est émise en réponse à la lumière d'excitation des diodes traverse ce filtre comme illustré sur la figure 1 de sorte qu'il est possible d'observer la réponse lumineuse de la membrane 41 au travers du filtre 6, à l'oeil nu ou bien par l'intermédiaire d'une caméra. On va maintenant détailler la réponse lumineuse obtenue en 20 présence de micro-organismes à l'aide des différents diagrammes spectraux illustrés sur la figure 7. Sur cette figure 7, le spectre 55 est de forme gaussienne et correspond au spectre de la lumière d'excitation (ici le spectre produit par les diodes 22) et qui présente un pic dont le sommet 55' correspondant à la valeur 25 d'intensité lumineuse maximale est à la longueur d'onde À1 égale à 470 nm. Les spectres 53 et 54 correspondent respectivement au spectre d'absorption et au spectre d'émission du fluorophore ici choisi pour marquer les micro-organismes présents sur la membrane. Ce fluorophore représenté ici est la 5-6 CFDA (Carboxy- 30 Fluoresceine-Di-Acétate).
Le spectre d'absorption 53 présente un sommet 53' à la longueur d'onde À2 supérieure à À1 et le spectre d'émission 54 présente un sommet 54' à la longueur d'onde À3 supérieure à À2. Dans l'exemple illustré À2 est égal à 492 nm et À3 à 517 nm, l'écart entre À1 et À2 étant ici plus faible que l'écart entre À2 et À3. La longueur d'onde d'excitation À1 est choisie volontairement inférieure à À2 de façon à ce que le sommet 55' du spectre 55 soit décalé par rapport au sommet 53' du spectre 53, du côté opposé au spectre 54. Ce décalage est choisi pour que la lumière provenant des moyens d'éclairage présente une énergie suffisante pour exciter le fluorophore sans que cette lumière ne parasite significativement celle émise par le fluorophore en réponse à cette lumière d'excitation. Le spectre 56 est celui du filtre 6 de la fenêtre de visualisation, sa fréquence de coupure étant choisie (ici de l'ordre de 550 nm) pour laisser passer essentiellement la lumière émise par le fluorophore (spectre 54) et pour retenir la lumière à des longueurs d'onde plus faible, en particulier celle provenant des diodes 22 après réflexion sur l'unité 40. Ce filtre de sortie (un filtre coloré) est faiblement sélectif pour laisser revenir aux yeux de l'utilisateur une quantité suffisante de lumière donnant une scène globalement lumineuse et donc confortable à observer tout en garantissant un niveau de contraste qui est adapté pour une observation à l'oeil nu. Lorsque la lumière d'excitation provenant des moyens d'éclairage 3 éclaire la membrane 41 de l'unité de filtration 40, chaque endroit de cette membrane présentant des micro-organismes marqués par le fluorophore est rendu visible sous la forme d'un spot lumineux de faibles dimensions (quelques centaines de microns) directement observable à l'oeil nu en sortie du filtre 6. Les valeurs de l'angle A et de la hauteur H assurent un rendu optimal pour la lecture des spots lumineux sur la membrane 41, que ce soit à l'oeil ou par l'intermédiaire d'une caméra. Ces valeurs ont été déterminées en appliquant sur une membrane témoin une marque noire et une marque jaune fluorescente et en recherchant, pour différentes valeurs de cet angle A et de cette hauteur H, les configurations A, H où la luminosité de la bande fluorescente est maximale tout en minimisant la luminosité parasite sur la marque noire. Il s'est ainsi avéré de façon surprenante que la plage [40°-50°] pour l'angle A présentait à la fois une intensité lumineuse maximale pour la marque fluorescente et une quasi absence de lumière parasite pour la marque noire, ce qui correspond donc à un optimum en termes de confort de lecture. De façon à avoir une certaine marge de sécurité par rapport au jeu de montage du dispositif c'est la valeur moyenne de 45° qui a donc ici été retenue. La valeur de hauteur H est quant à elle fonction de la dimension de l'objet à éclairer, les différentes configurations testées ont montré que pour une membrane d'un diamètre de 55 mm et pour une plage de valeur d'angle A comprise entre 40° et 50°, les meilleurs résultats étaient obtenus pour une plage de hauteur comprise entre 39,75 et 69,75 mm. De même ici, c'est la valeur moyenne de 54,75 mm qui a dans cet exemple été retenue. Le dispositif est également adapté, en jouant sur la hauteur H à éclairer d'autres types d'échantillons que des membranes, et de façon générale tout support adapté à contenir des micro-organismes (en surface ou en volume) et dont on souhaite détecter la présence par fluorescence. Un autre mode de réalisation de ce dispositif est représenté en figure 6. D'une manière générale, on a employé pour les éléments similaires les mêmes références, mais additionnées du nombre 100.
Le dispositif 101 présente les mêmes caractéristiques que le dispositif 1 si ce n'est qu'il est dépourvu du tiroir 5 (l'unité de filtration 40 étant ici posée directement sur une table par exemple) et que la fenêtre de visualisation 107 est ici formée d'un coulisseau 108 de forme rectangulaire disposé contre la paroi 110 de l'enceinte 102 et de quatre filtres 106 à 106-, chacun des filtres étant logé dans une ouverture correspondante du coulisseau 108.
Chaque filtre optique est un filtre passe-bas, laissant donc passer les plus basses fréquences (les plus grandes longueurs d'ondes) et dont la fréquence de coupure est distincte des autres fréquences de coupure. Le coulisseau 108 est engagé dans un rail de guidage (non illustré) que comporte ce dispositif de façon à pouvoir disposer au choix l'un des quatre filtres 106 à 106û en face de l'ouverture 109 de la paroi 110. Il est ainsi possible en fonction du fluorophore choisi et des diodes qui sont allumées de sélectionner parmi les quatre filtres disponibles celui qui présente la fréquence de coupure la plus adaptée (pour obtenir le meilleur contraste par exemple). Dans un mode de réalisation non illustré, le filtre 6 n'est pas un filtre passe-bas mais un filtre passe bande centré sur la longueur d'onde À2. Dans encore un autre mode de réalisation illustré schématiquement en figure 8, le sommet du spectre des moyens d'éclairage peut ne pas nécessairement être ponctuel et s'étend alors sur une plage plus importante de longueurs d'ondes en utilisant par exemple comme moyens d'éclairage 203, à la place des diodes, une lampe 204 en lumière polychromatique associée à un filtre passe-haut 234 adapté à laisser passer les plus hautes fréquences, c'est-à-dire les plus basses longueurs d'onde, moins coûteux que le filtre passe- bande de l'art antérieur et dont la longueur d'onde de coupure Àc est située entre la longueur d'onde d'absorption À2 et la longueur d'onde d'émission À3 (figure 8). On notera enfin qu'un tel système d'éclairage peut également être décliné pour bien d'autres applications telles que par exemple l'analyse par microscope, le scannage de biopuces, la lecture de plaques en fluorescence, la cytométrie, les trans-illuminateurs, la lecture en temps réel PCR, la configuration géométrique du dispositif pour chacune de ces applications étant alors déclinée de façon spécifique à l'application en question. L'armature du dispositif à laquelle sont fixées les embases 21 n'est ainsi pas nécessairement une enceinte comme l'enceinte 2 illustrée, il peut s'agir, par exemple, d'un arceau entourant l'optique d'un microscope.
La présente invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits et représentés, mais englobe toute variante d'exécution.

Claims (10)

  1. REVENDICATIONS1. Dispositif pour l'analyse microbiologique d'un support (41) adapté à contenir des micro-organismes marqués par un agent fluorophore, ledit agent étant adapté, au contact desdits micro-organismes, à absorber de l'énergie lumineuse selon un spectre d'absorption (53) présentant un sommet (53') à une longueur d'onde d'absorption prédéterminée (À2) et à restituer cette énergie en émettant de la lumière selon un spectre d'émission en fluorescence (54) présentant un sommet (54') à une longueur d'onde d'émission prédéterminée (À3) distincte de ladite longueur d'onde d'absorption (À2), ledit dispositif comportant des moyens d'éclairage (3 ; 203) adaptés à éclairer ledit support (41) afin que lesdits micro-organismes marqués émettent, en réponse à la lumière d'excitation émise par ces moyens d'éclairage (3 ; 203), de la lumière selon ledit spectre d'émission (54) ; caractérisé en ce que le spectre (55) de la lumière d'excitation provenant des moyens d'éclairage (3 ; 203) présente un sommet (55') à une longueur d'onde d'excitation prédéterminée (À1) distincte desdites longueurs d'onde d'absorption (À2) et d'émission (À3) dudit agent fluorophore, de sorte que ladite longueur d'onde d'absorption (À2) est située entre lesdites longueurs d'onde d'excitation (À1) et d'émission (À3) avec un écart prédéterminé entre les longueurs d'onde d'excitation (À1) et d'absorption (À2), grâce à quoi il est rendu aisé de discriminer la lumière émise par ledit agent fluorophore de celle provenant des moyens d'éclairage (3 ; 203).
  2. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite longueur d'onde d'excitation (À1) est inférieure à ladite longueur d'onde d'absorption (À2), elle-même inférieure à ladite longueur d'onde d'émission (À3).
  3. 3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit spectre (55) de la lumière d'excitation présente un pic d'intensité lumineuse maximale (55') centré sur ladite longueur d'onde d'excitation (À1).
  4. 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'écart entre lesdites longueurs d'onde d'excitation (À1) et d'absorption (À2) est inférieur à l'écart entre lesdites longueurs d'ondes d'absorption (À2) et d'émission (À3) dudit agent fluorophore.
  5. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte également une fenêtre de visualisation (7 ; 107) de la lumière émise par ledit agent fluorophore munie d'un filtre (6 ; 106) adapté à laisser passer les plus grandes longueurs d'onde et dont la longueur d'onde de coupure est située entre ladite longueur d'onde d'absorption (À2) et ladite longueur d'onde d'émission (À3).
  6. 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdits moyens d'éclairage (3) comporte au moins une embase (21) sur laquelle est montée au moins un groupe (27) de sources lumineuses (22), avec lesdites sources (22) de ce groupe (27) qui sont régulièrement espacées les unes des autres pour former une matrice d'éclairage dudit support (41).
  7. 7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdits moyens d'éclairage (3) comportent deux dites embases (21) inclinées l'une vers l'autre en direction d'un emplacement prédéterminé de réception dudit support (41) dans le dispositif.
  8. 8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que chaque dite embase (21) est inclinée d'un angle (A) compris entre 40° et 50° par rapport audit emplacement prédéterminé de réception dudit support (41).
  9. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que lesdites sources lumineuses sont des diodes électroluminescentes (22).
  10. 10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que lesdits moyens d'éclairage (203) comportent une lampe (204) adaptée à émettre une lumière polychromatique et un filtre (234) adapté à laisser passer les plus petites longueurs d'onde et dont la longueur d'onde de coupure (À) est située entre ladite longueur d'onde d'absorption (À2) et ladite longueur d'onde d'émission (À3).
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