FR2935805A1 - Procede de mesures de concentration d'especes moleculaires au moyen d'un chromatogramme - Google Patents

Abstract

Un modèle d'évolution de signal d'une colonne chromatographique est formé, puis inversé en fonction de signaux mesurés, pour calculer les concentrations des solutés en exploitant tout le signal. Le modèle s'appuie sur des équations gouvernant le transport des solutés dans la colonne en fonction de divers paramètres physiques, qui peuvent être réévalués. Application à la recherche et à la mesure de composants rares, tels que des protéines dans les échantillons de liquides biologiques.

Description

1 PROCEDE DE MESURES DE CONCENTRATIONS D'ESPECES MOLECULAIRES AU MOYEN D'UN CHROMATOGRAMME

DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE On traite ici d'un procédé de détermination 5 de concentrations d'espèces moléculaires sur un chromatogramme. On recourt souvent à des techniques de séparation pour l'analyse de mélanges. Les appareils différents peuvent comprendre une colonne 10 chromatographique pouvant être couplée à un spectromètre de masse. Dans le cas particulier des fluides biologiques où on cherche à mesurer la concentration de différentes protéines, un module de digestion peut être ajouté en amont pour décomposer les 15 protéines en peptides dont l'étude est plus facile. Les colonnes chromatographiques sont fondées sur les vitesses différentes prises par les espèces chimiques d'un mélange pour la parcourir et leur séparation consécutive. Un spectrogramme mesuré est un signal à 20 deux dimensions correspondant à la sortie du spectromètre de masse. L'une des dimensions est sensible au temps de rétention des différentes espèces dans la colonne chromatographique, l'autre dimension correspond au rapport masse sur charge associé à 25 chacune des espèces. Ces données consistent en un spectre composé d'une succession de pics. En faisant la projection du spectrogramme sur la dimension temps de rétention ou en faisant une coupe à une masse donnée, on obtient un chromatogramme mesuré, à savoir une image 2 du signal de sortie de la colonne chromatographique. L'étude du spectrogramme ou du chromatogramme permet de déterminer les espèces chimiques du mélange et leurs concentrations.

Il faut toutefois admettre que des résultats précis sont difficiles à obtenir, notamment pour deux raisons. La superficie des pics, qui exprime la concentration de l'espèce chimique concernée, peut être difficile à évaluer en raison du bruit de l'appareil ou de la fluctuation des paramètres physiques de la colonne de chromatographie ; aussi, la forme et la position du pic peuvent varier d'une expérience à l'autre en raison de caractéristiques différentes des colonnes chromatographiques, de conditions de mesures différentes ou d'une simple dispersion statistique. Ces inconvénients sont d'autant plus marqués que les espèces chimiques sont nombreuses et leurs concentrations très faibles, ce qui est le cas des protéines dans les liquides biologiques, où on cherche souvent certaines protéines rares. C'est par exemple le cas des marqueurs sanguins du cancer, qu'on trouve dans le plasma à des concentrations de l'ordre de 1 à 1000 picomoles/litre, ou de 1 à 1000 femtomoles par millilitre de plasma.

Parmi les méthodes connues, la plus simple d'entre elles consiste à isoler chaque pic, à évaluer la concentration par des mesures de leur hauteur sur la durée d'élution correspondante (selon l'axe du chromatogramme) ou même par une seule mesure de hauteur, et à déterminer de quelle espèce chimique il s'agit d'après la position du pic sur le spectrogramme. 3 Les inconvénients mentionnés ci-dessus d'imprécision du résultat obtenu et même de difficulté à identifier correctement les espèces chimiques en présence de mélanges complexes sont particulièrement marqués dans ce procédé rudimentaire. Une autre méthode consiste à utiliser une décomposition numérique du spectrogramme par une analyse factorielle pour isoler les pics. Les pics des peptides d'intérêt sont obtenus à partir de calibrations d'échantillons de compositions connues. Mais les inconvénients classiques ne sont pas suffisamment éliminés, par exemple à cause des disparités entre les conditions de mesure à la calibration et à l'étude de l'échantillon, qui sont difficiles à évaluer et à corriger. L'invention est relative à un procédé amélioré de détermination de concentrations des espèces moléculaires dans une solution passée dans une colonne chromatographique et un spectromètre de masse. Elle est fondée sur l'utilisation d'un modèle spatio-temporel local théorique de transport des molécules à travers la colonne chromatographique pour exprimer des chromatogrammes modélisés associés chacun à une des espèces, plus précis qu'avec une calibration empirique.

Une opération numérique appropriée entreprise avec les points du chromatogramme d'étude et des chromatogrammes modélisés permet d'inverser le système représenté par le chromatogramme d'étude, c'est-à-dire d'y distinguer les contributions des différentes espèces chimiques qui composent l'échantillon, et enfin de déduire leurs concentrations respectives. 4 Un modèle rigoureux étant utilisé pour exprimer les chromatogrammes modélisés, on peut s'attendre à une meilleure identification des pics du chromatogramme d'étude, donc à une meilleure évaluation de la composition de l'échantillon, et à une meilleure évaluation des concentrations, d'autant plus que l'inversion du système est faite de façon simple. Le modèle de transport des molécules exprimant les chromatogrammes modélisés peut comprendre, pour chacune des espèces, une équation d'évolution de concentrations des molécules de ladite espèce, le long de la colonne chromatographique, avec le temps. Cette équation découle directement des réactions chimiques d'adsorption et de désorption des molécules sur le matériau solide de la colonne, qui obéit à des lois simples et connues. Cette équation d'évolution peut favorablement exprimer la concentration à chaque point de la colonne chromatographique en fonction de concentrations antérieures à ce point et à des points voisins, par une simple combinaison pondérée par des coefficients. Ces coefficients peuvent être déterminés analytiquement ou empiriquement. Ils sont des fonctions de paramètres comprenant notamment des paramètres de la colonne chromatographique, des paramètres des pics chromatographiques d'étalonnage et des paramètres d'ajustement. Les paramètres de la colonne chromatographique comprennent éventuellement une longueur et un paramètre fonction de sa porosité. Les paramètres des pics chromatographiques d'étalonnage comprennent éventuellement un ou plusieurs paramètres de position des pics et de forme des pics, déterminés empiriquement par une calibration. 5 Les paramètres d'ajustement peuvent comprendre des pas d'échantillonnage spatiaux, le long de la colonne chromatographique, et temporels. D'autres paramètres peuvent être ajoutés au modèle, comme une vitesse d'un solvant dans la colonne chromatographique ou des paramètres décrivant une modification de composition d'un solvant avec le temps, quand la chromatographie est faite par exemple en mode de gradient, avec une introduction progressive d'un solvant plus fort que le solvant utilisé à l'origine.

L'invention sera maintenant décrite par deux modes de réalisations principaux : un mode dit isocratique où la composition du solvant responsable du mouvement de l'échantillon à travers une colonne de chromatographie reste constante, et un mode dit de gradient où la composition du solvant change, un solvant plus fort remplaçant progressivement un solvant d'origine. L'invention sera maintenant décrite en liaison aux figures: - la figure 1 représente un appareillage, - la figure 2 un signal de chromatogramme mesuré et un signal de chromatogramme modélisé, - et la figure 3 est un logigramme du procédé.

Le dispositif d'exploitation peut être celui de la figure 1, où un échantillon sanguin à 6 étudier, par exemple, passe par un module de digestion 1 qui décompose les protéines en peptides dont la mesure et l'étude sont plus faciles, puis par la colonne de chromatographie 2 et par un spectromètre de masse 3. Le signal alors émis est un spectrogramme bidimensionnel; il est fourni à un module de traitement 4 qui met en oeuvre le procédé d'exploitation du spectre, constitutif de l'invention, pour en déduire les concentrations des peptides de l'échantillon.

L'invention peut être appliquée avec d'autres dispositifs. C'est ainsi qu'un module d'enrichissement, pouvant comprendre des étages de déplétion ou de capture par affinité, en amont du module de digestion peut être ajoutée pour faire une première sélection des protéines d'intérêt. Aussi, le module de digestion 1 est facultatif le signal arrivant au module de traitement 4 serait analogue mais représentatif de protéines plutôt que peptides, de sorte que l'invention serait appliquée sans changement pour donner les concentrations de ces protéines. Le spectromètre de masse 3 peut avoir différents modes de fonctionnement, ceci n'influençant pas les traitements du module 4. Le mode classique appelé mode MS où l'on étudie une plage de masses peut être remplacé par le mode MS-MS où l'on procède à un refractionnement des peptides de certaines masses ou encore le mode MRM où l'analyse est faite pour seulement quelques masses prédéfinies. Enfin, le spectromètre de masse 3 est lui aussi facultatif, et le signal issu du chromatographe 2 et traité par le module de traitement 4 serait un 7 spectre monodimensionnel qui serait traité de la même façon. L'invention pourrait aussi être appliquée à d'autres genres d'échantillons ou de produits à mesurer. Le module de traitement 4 travaille en accomplissant une inversion numérique du signal qu'il reçoit pour donner les concentrations des peptides, ou en général des produits mesurés par le dispositif. Il s'appuie sur une modélisation du signal en fonction des différents paramètres, dont lesdites concentrations et d'autres paramètres, connus par une calibration ou une autre mesure, ou inconnus. La figure 3 donne une représentation génnérale du procédé. Des modèles de la colonne chromatographique 2 (El), du solvant (E2) et du soluté (E3) sont élaborés pour décrire l'écoulement dans la colonne chromatographique 2, l'adsorption du soluté par ladite colonne et la loi d'alimentation en le solvant.

La synthèse de ces modèles particuliers donne un modèle général d'espace-état (E4) qui décrit complètement le signal issu de la colonne chromatographique 2 en fonction de divers paramètres, qui peuvent être évalués (E5) par des calibrations particulières, des mesures, des hypothèses, ou qui dépendent de choix arbitraires. Quand une mesure a été faite sur un fluide inconnu, donnant un chromatogramme expérimental, elle peut entrer dans l'écriture d'un système où elle correspond au modèle pondéré par les paramètres. La résolution de ce système (E6) par inversion numérique donne les concentrations des solutés (E7) du fluide inconnu. Les 8 paramètres peuvent toutefois être réajustés (E8), la résolution étant généralement itérative. Les étapes du procédé seront détaillées à peu près dans l'ordre de leur présentation. Des compléments et des généralisations seront donnés à l'occasion. Voici maintenant comment le modèle numérique du signal est créé. PARAMETRES DU MODELE 1) Un élément du modèle découle du transport progressif des solutés tels que les protéines dans la colonne chromatographique. Le transport peut être représenté par l'équation (1) ci-dessous, qui donne la concentration du soluté adsorbé q sur la phase stationnaire (résine échangeuse d'ions) de la colonne par rapport à la concentration du soluté dans la phase mobile c au même endroit (abscisse z) et au même instant (t) : c(z,t)+F(z,t)usc(z,t) Di2c(z,t) at at az z2 où F est le rapport des volumes occupés par la phase mobile et la phase stationnaire (facteur de porosité), us la vitesse de propagation du solvant, et Di un facteur représentant la dispersion qui contribue à l'étalement des pics de chromatographie (appelé facteur de diffusion). 2) Une autre caractéristique de l'état de la colonne chromatographique concerne l'adsorption du soluté sur la phase stationnaire de la colonne, c'est- à-dire l'interaction des molécules de la phase mobile 9 avec la phase stationnaire. Une modélisation peut être faite, par exemple pour un régime stationnaire, ce qu'on appelle isotherme, à l'équilibre. Un exemple d'isotherme simple est q*=k.c*, les astérisques indiquant que l'on considère les concentrations à l'équilibre, et k étant un facteur constant, dit de rendement de réaction. Un exemple d'isotherme linéaire peut être noté q(z,t)=k.c(z,t) (2). 3) Dans le cas d'un mode de gradient, il convient encore de modéliser l'évolution de la concentration des solvants. Dans les expériences typiques, le solvant faible est l'eau, et initialement prépondérant voire unique (100% de la concentration totale dans la solution) ; et le solvant fort est le méthanol ou l'acétonitrile, qui est introduit progressivement. Dans le cas le plus simple, il n'y a pas d'interaction entre le solvant et la phase stationnaire, et le front d'injection du solvant est identique (en débit et en composition) du début à la fin de la colonne à un retard de propagation près. On peut considérer une variation linéaire de la concentration cp du solvant fort (1), entre 0 à un instant t1 et une valeur maximale à un instant ultérieur t2, soit (cp (t, z=0) =(po+(3t) , et en tout point du réacteur on obtient alors : pp(t, z) = (po pour 0<t<z/u p(t,z) = (po+R( t ù ü ) pour z/u<t. 4) On considère maintenant le comportement du soluté. En mode isocratique (composition du solvant 10 constante), le facteur de rétention k introduit en 2) est défini comme k= (tR-to) /Fto, où to est le temps mort ou temps de rétention de la colonne pour sortir les composés non retenus, tR est le temps de rétention du soluté considéré, et F est le paramètre de porosité, vu en 1, de la phase stationnaire et indépendant du solvant. En mode de gradient, k est une fonction de cp et une relation telle que ln k ((p) =ln kW-S. (p , kW étant le facteur de rétention dans l'eau et S la pente du gradient, est communément utilisée. 5) Des modèles plus complexes pourraient être pris en compte ainsi que certaines colonnes chromatographiques comprenant des phases stationnaires en piliers poreux. Du liquide se trouve alors presque immobile et forme une phase stagnante. Les transferts de soluté peuvent se réaliser entre la phase mobile et la phase stationnaire, la phase stagnante et la phase stationnaire, et la phase mobile et la phase stagnante. La diffusion moléculaire comprendrait être une diffusion axiale dans la phase mobile. Des isothermes non linéaires peuvent encore être introduits pour tenir compte de la variation souvent constatée du rendement de l'échange selon les concentrations de soluté dans la phase mobile et la phase stationnaire. Enfin, par rapport à l'équation (2), un isotherme non linéaire ou encore un isotherme liant le soluté et le solvant en cas d'interaction entre le solvant et la phase stationnaire pourrait être proposé. On trouvera une description d'un isotherme non linéaire dans l'ouvrage Fundamentals of preparative and nonlinear chromatography chapitres 3 et 4 (auteurs : Guiochon 11 et al, Elsevier Academic Press - second edition), et une autre description dans l'article Maas loadability of chromatographic columns , par Poppe et Kraak, paru dans le Journal of chromatography , 255 (1983), p.395 à 414, Elsevier Scientific Publishing Company.

INFLUENCE DE LA CALIBRATION INTERNE Dans la suite du procédé on considère des protéines alourdies dans l'échantillon. Il s'agit de protéines d'étalonnage couramment utilisées dans l'art pour tenir compte de variations de résultats de la colonne chromatographique, notamment du temps de rétention des composés des échantillons. Ces protéines alourdies sont presque identiques aux protéines recherchées mais enrichies en isotopes lourds et donc bien identifiables au spectromètre de masse 3. Introduites en concentrations connues, elles permettent de calibrer la colonne chromatographique en mesurant les hauteurs et les temps de rétention de leurs pics, au bénéfice des mesures des protéines d'étude de même espèce. Il faut toutefois souligner que l'emploi de protéines alourdies n'est pas obligatoire en pratique. On appelle mi,],k(n> le chromatogramme du peptide i appartenant à une protéine d'étude k dans l'échantillon j au temps n, m*i, ,k(°) le même chromatogramme mais pour le peptide appartenant à la protéine alourdie k, mil, (n) la somme des chromatogrammes des Npep peptides appartenant à la protéine k d'étude, m*j,k(n) la même somme pour la Npep protéine k alourdie, soit mJ,k (n) ù 1 mi,J,k (n) et i=1 Npep mlk(n)= jk(n), et mi,,,k(n) et m* ,,k(n)peuvent être i=1 exprimées par: mi,J,k (n) ù ai,kNi,J,k y (n, p i,J,k (n) mi,J,k (n) ù Ni,J,k yi,k (n, p)CJ,k + i,J,k (n)

où c~,k est la concentration de la protéine k d'étude dans l'échantillon j, c*j,k la concentration de la protéine k alourdie, Ri,J,k le gain de calibration de la chaîne de mesure pour le peptide i de la protéine k (obtenu grâce à la concentration c*j,k, connue de l'opérateur et à la mesure correspondante sur le signal), ai,k est un gain de calibration (obtenu en utilisant une calibration externe pour un échantillon de protéines à la concentration c k connue), yi,k(n,p) est la réponse du chromatographe 2 pour le peptide i appartenant à la protéine k, d'après le modèle d'état indiqué ci-dessous et E ,j,k et E*i, ,,k sont des bruits, qu'il est possible de modéliser indépendamment, par exemple par des réalisations de processus aléatoires gaussiens de moyenne nulle (correspondant à un bruit blanc) et de variance déterminée. p correspond à l'ensemble des paramètres du modèle : il peut s'agir de paramètres physiques propres à la colonne ou propres aux couples (colonne - peptide), connus ou déterminés expérimentalement. p comprend également des paramètres numériques choisis pour assurer la stabilité du modèle. Ces paramètres seront définis dans la suite du texte.

Nous supposons avoir Nc expériences de calibration pour lesquelles c k et c*j,k sont connues et Np expériences d'étude pour lesquelles csont connues et c k (les concentrations à obtenir) sont inconnues.

EXPRESSION DU MODELE DE LA COLONNE Les dérivées de premier ordre et de second ordre de l'équation (1) rencontrée plus haut peuvent être données par les équations (3) et (4) . i,n 20z [c(i +1,n)ù c(i -1, n)] + o(Oz 2 ) (3) ~z [c(i _ +1,n)ù2c(i,n)+c(iù1,n)]+o(Oz2) a`c(z,t) (4) i,n z en termes de différences finies où Az est le pas d'échantillonnage en distance et o(Oz2) désigne 20 des termes insignifiants. De plus, la dérivée temporelle du premier ordre peut être approchée par l'équation (5) 1 = [c(i,n+1)ùc(i,n)]+ o (At) i, n en termes de différences finies où At est le pas 25 d'échantillonnage en temps et o(At) désigne des termes insignifiants. 14 Il est alors possible de remplacer l'équation (1) par l'équation (6) : c(i,n+1)=I(p)c(i+1, n) +J(p)c(i,n)+K(p)c(i -1,n) (6), J(p) = où I (P) _At(2Di ù uszz 2Az2(1+Fk) Az2(1+ Fk) ù 2DiAt Az 2(1+ Fk) K(p) _ At(2Di + uszz 2Az 2 (1+ Fk ) ECRITURE DEVELOPPEE DU MODELE 1) Considérons d'abord le mode isocratique.

Le modèle peut être représenté par le système à espace état . x(t + 1) = f (x(t), p, u, t) y(t) = h(x(t), p, u, t) x(0) = xo(p) où x(t) est un vecteur d'état, p représente les paramètres du système, u représente le signal d'entrée dans le système (la fonction d'injection), y(t) la sortie du système (modèle de la colonne chromatographique pour un peptide donné à estimer) et xo des conditions initiales du vecteur d'état. Dans le 20 cas d'un système discret, stationnaire et linéaire, ce système devient : x(n + 1) = A(p)x(n) + B(p)u(n) y(n) = C(p)x(n) + D(p)u(n) x(0) = xo (p) où n correspond à un échantillonnage du temps de 1 à 25 nt, A est une matrice d'état, B une matrice d'entrée, C une matrice de sortie et D une matrice de commande directe. Le système peut être développé comme suit: c(1, n) L dimension nz= ; AZ est un vecteur-colonne de J(p) 1(p) 0 0 K(p) J(p) I(p) 0 0 A(p) = K(p) J(p) I(p) . 0 0 K(p) J(p) I(p) 0 0 K(p) J(p),

est une matrice carrée de dimensions nz ; 1(p), J(p) et K(p) doivent être positifs pour que le système soit stable, ce qui implique des contraintes sur les pas d'échantillonage en temps et en espace. B(p) = 0 0 est un vecteur-colonne de dimension nz ; C(p)=(0 0 1) est un vecteur-ligne de dimension nz, avec y(n) = c(L ù,n); D (p) est ici une matrice qui peut Az être choisie à volonté, ou être nulle, ce qu'on suppose ici. 2) Voici maintenant comment le système espace-état est formé en mode de gradient. Il devient : x(n + 1) = A(n, p)x(n) + B(n, p)u(n) y(n) = C(n, p)x(n) + D(n, p)u(n) x(0) = xo (p) qui diffère du précédent en ce que les matrices A,B,C et D dépendent du temps n. L'isotherme peut alors être défini par la relation (7), et le gradient par les relations (8) et (9) ci-dessous pour les hypothèses données d'un gradient linéaire, q(z,t) = k(z,t)c(z,t) (7) ln k(z,t) = ln kW ù Sep(z,t) k(z,t) _ -sso(z,t) (8 ) ep(z, t) = ep (9) La dérivée l'équation (10) .de l'équation (7) donne -sg,(z,t) aço(z, t) e-sv(z,r)c(z, t) c(z,t) at û Skw at q(z't) = k(z,t) ac(z, t) + ,k(z,t) c(z, t) _ at û at at (Io), et l'équation &(z, t) ûSFka~(z, t) e-sp(z,t)c(z,t) + us ac(z, t) at w at az (1+ Fkwe-s z,t) a2c(z,t) z (11)

est obtenue des équations (1),(8) et (10). Exprimée sous forme de différences finies, elle devient l'équation (12) (1+Fk e-s~(i,n)(c(i,n+1)ùc(i,n))ùFSk `~(z't) W At W at e-Sgo(`,n(i,n) i,n 20z (c(i +1,n)ù c(i û 1,n)) + Di (c(i +1,n)ù 2c(i, n) + c(i -1, n)) c(i,n+1)= At(l + FkWe-s i'n>) ' Di us c(i +1,n) Oz 2 2Az + At (1 + (1+ Fk e-s'(i,n)) a~(z,t) FkWe-s~(i,n> ~ Ot + FSk at e-sg,(z,t) 2Di Oz2 i,n + At(1 + FkWe S i,n) )ù1 Di us Az 2 + 2Az c(i ù (12)

qu'il est possible d'exprimer de façon simplifiée par 10 l'équation (13) : c(i,n+1)=I(i,n,p)c(i+1,n)+J(i,n,p)c(i,n)+K(i,n,p)c(iû1,n) (13)

où les coefficients I, J et K ont une forme plus compliquée que précédemment : I (i, n, p) = At(l + FkWe-Sç0(i,n)) 1 Di u5 Oz2 2Az 15 K(i, n, p) = At(1+ Fkwe-Sç0(i,n))-1 J(i,n, p) = At(1+FkWe-S'(i'n))-1 Di us + Oz 2 20z (1+FkWe-S i'n)) aev(z,t) + FSk At W at e-s,(z,t) 2Di Oz2 i,n Le problème a alors la forme du système suivant : 5 x(n + 1) = A(n, p)x(n) + B(p)u(n) y(n) = C(p)x(n) x(0) = xo (p) où x,B,C et D sont identiques à ceux du mode isocratique et où A est exprimé de la façon suivante : 'J(1,n,p) 1(1,n,p) 0 0 K(2,n,p) J(2,n,p) 1(2,n, p) 0 0 K(i,n,p) J(i,n,p) 1(i,n,p) 18 0 -1,n,p) J(n, -1,n,p) 1(n, -1,n,p) 0 K(n,,n,p) J(n,,n,p) , 0 K 0 A(n,p)= Dans tous les cas, on en déduit y(n) pour n=1 à n=nt, nt étant l'abscisse maximum du chromatogramme (nombre de points en temps de rétention) 10 c'est-à-dire un modèle d'état du signal de sortie de la colonne chromatographique pour un peptide donné pour le mode considéré (isocratique ou gradient). Ce modèle est typiquement celui d'un pic d'élution. Il est une fonction du temps et dépend aussi des facteurs 15 physiques de l'appareillage. Il est supposé reproduire le signal qui serait effectivement mesuré à la sortie de la colonne de chromatographie 2 pour ce peptide dans les mêmes conditions de mesure. Il porte la référence 5 à la figure 2. 20 PREMIERE EVALUATION DES PARAMETRES Voici maintenant comment les paramètres physiques p sont déterminés. On peut distinguer trois catégories : certains sont des paramètres fixes qu'il est possible de déterminer par des mesures comme L, longueur de la colonne, et F, coefficient de rapport de phase, corrélé à la porosité e ( de la colonne chromatographique par la relation F= `1ùEJ. Une deuxième e

catégorie de paramètres est déterminée expérimentalement sur un chromatogramme expérimental : il s'agit de la vitesse du solvant us, en mesurant le temps de rétention to d'un marqueur sans interaction avec la phase stationnaire et en appliquant simplement

la relation : L us =- ; t0

z de même k = tR ùt° et Di = Lu6 , où tR et G2 représentent Fto 2tR2 respectivement le temps de rétention et la variance statistique (étalement du pic) du peptide dans un 15 chromatogramme.

Enfin, les paramètres At et Oz de la troisième catégorie sont des pas d'échantillonnage en temps et en longueur, choisis arbitrairement pour respecter les contraintes de stabilité de résolution du

20 système numérique.

En mode de gradient, d'autres catégories de paramètres doivent être considérées. Certains paramètres servent d'abord à modéliser la concentration du solvant fort en fonction du temps mais ils sont

25 connus puisque cette concentration dépend de l'opérateur. Les coefficients kW et S sont déterminés par des calibrations supplémentaires mettant en jeu un peptide déterminé. 20 RESOLUTION DU SYSTEME ET OBTENTION DES RESULTATS On procède maintenant à des recherches successives de minimums de fonctions d'erreurs pour inverser le système complexe exprimant le signal en fonction des paramètres de la modélisation et des inconnues. De plus, dans le cas où le système est faiblement reproductible d'une expérience à l'autre, il est possible de réajuster les paramètres trouvés auparavant pour donner de meilleurs résultats. Il est à noter que plutôt qu'un algorithme de minimisation déterministe, tel une minimisation quadratique, il est possible d'utiliser d'autres critères d'adéquation entre les mesures et le modèle tels que des algorithmes de minimisation stochastique de type bayésien. 1) Les facteurs de calibration ai,k et (3i,j,k, exprimant le gain de l'appareillage doivent maintenant être déterminés. On commence par estimer les facteurs ((3i,j,k) pour chaque expérience (expérience d'étude ou expérience de calibration)par un calcul dans lequel on ajuste à la fois les paramètres physiques p et ces facteurs de calibration Ri,j,k pour rechercher un minimum, soit min m* ùf ( c* 02+2o 2 * où mi, k j,k,p ,j,k i,j,kYi,k 1~) 7,k p ho sont les valeurs mesurées des spectrogrammes des échantillons de calibration comprenant des peptides alourdis, C*j,k les concentrations connues de ces peptides, et yi,k(p) correspond à l'écriture développée du modèle en fonction de x,A,B,C,etD ; a, est un coefficient arbitraire et p(0) est une valeur initiale, obtenue précédemment des paramètres p. Seuls les 21 paramètres p qui souffrent d'imprécision d'évaluation sont réévalués. Ce calcul ne peut toutefois pas être entrepris s'il n'y a pas de peptide d'étalonnage alors les coefficients (3, i,j,k sont supposés tous égaux à 1. 2) Une seconde étape consiste à calculer les autres coefficients de calibration ai,k sur les Nc expériences de calibration l k,j,k ù ai,kNi,j,k yi,k (p)C j,k j=1 min ,,,,k,p 2 +2 pù po 0 2 pour i=1 à Npep, (tous les peptides), les paramètres physiques p pouvant encore être réévalués. Ce calcul ne peut toutefois pas être entrepris s'il n'y a pas d'expérience de calibration ; alors les coefficients ai,k sont supposés tous égaux à 1.

15 3) La résolution finale, permettant de déterminer les concentrations C,k des protéines d'étude k dans les Np expériences d'études, consiste en une nouvelle recherche de minimum selon Npep //~~ mj,k ùljai,kNijkyik(p)Cj,k k i=1 20 tous les échantillons étudiés), m,k représentant les sommes des mi,j,k comme on l'a vu. Ces calculs sont de réalisation facile sur un ordinateur. Un exemple de résultat obtenu est à la figure 2, où un signal modélisé 5 (y (t)) est superposé 25 au signal effectivement mesuré 6 après avoir été pondéré par la concentration c et les gains de calibration trouvés par le calcul, et aussi après la réévaluation des paramètres physiques p à partir de Po, min 2 pour j =l à 22 qui a pu corriger des défauts d'évaluation de la forme (étalement) ou de la position du pic dans le modèle 5 : la concordance est excellente.

Claims (18)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de détermination de concentrations de molécules dans un soluté d'une solution, consistant à faire traverser à la solution un appareillage comprenant une colonne chromatographique (2) et à obtenir un chromatogramme de la solution, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'un modèle spatio-temporel local de transport des molécules à travers la colonne chromatographique, pour exprimer des chromatogrammes modélisés associés chacun à une des espèces, puis une opération numérique d'inversion faisant intervenir des valeurs (m) du chromatogramme de la solution et des valeurs (y) des chromatogrammes modélisés pour déterminer lesdites concentrations (c).
2. 2. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 1, caractérisé en ce que le modèle spatio-temporel de transport des molécules comprend, pour chacune des espèces, une équation d'évolution de concentration des molécules de ladite espèce et une équation d'interaction des molécules de la phase mobile avec la phase stationnaire.
3. 3. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'équation d'évolution exprime la concentration pour chaque point de la colonne chromatographique en fonction de concentrations antérieures audit point et à des points voisins, 24 lesdites concentrations antérieures étant pondérées par des coefficients.
4. 4. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 3, caractérisé en ce que les coefficients sont des expressions de paramètres comprenant des paramètres de la colonne chromatographique, des paramètres de pics chromatographiques d'étalonnage des espèces, et des paramètres d'ajustement.
5. 5. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 4, caractérisé en ce que les paramètres de la colonne chromatographique comprennent une longueur (L) et un paramètre (F) fonction de la porosité de ladite colonne.
6. 6. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 4, caractérisé en ce que les paramètres de pics chromatographiques d'étalonnage comprennent un paramètre (Di) de diffusion des molécules du soluté.
7. 7. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 4, caractérisé en ce que les paramètres comprennent encore un paramètre lié à une vitesse d'un solvant (us) dans la colonne chromatographique.
8. 8. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 4, caractérisé en ce que les paramètres d'ajustement comprennent des pas d'échantillonnage spatiaux (Oz), le long de la colonne chromatographique, et temporels (At).
9. 9. Procédé de détermination de concentration de molécules selon la revendication4, caractérisé en ce que les paramètres comprennent encore des paramètres décrivant une modification de composition d'un solvant avec le temps.
10. 10. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 2ou 3, caractérisé en ce que l'équation d'évolution est : c(z,t)+F~q(z,t)+us c(z,t)Di2c(z,t) at at az ù az2
11. 11. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 9, caractérisé en ce que le modèle de transport est x(n +1) = A(p, p)x(n) + B(p, p)u(n) exprimé par y(n) = C(p,p)x(n) + D(p,p)u(n) x(0) = xo (p) où n correspond à un échantillonnage du temps de 1 à 15 nt, A est une matrice d'état, B une matrice d'entrée, C une matrice de sortie et D une matrice de commande directe, A, B, C et D dépendant du temps, c(1, n) et . x(n) _ L nz= ù ; AZ est un vecteur-colonne de dimensionJ(p) 1(p) 0 0 K(p) J(p) I(p) 0 0 . A(p)= K(p) J(p) I(p) . 0 0 K(p) J(p) I(p) 0 0 K(p) J(p), est une matrice carrée de dimension nz 0 B(p) = 0, est un vecteur-colonne de dimension nz ;C(p)=(O ••• 0 1) est un vecteur-ligne de dimension nz, avec L y(n) = c(Qz,n) ; D (p) est choisie à volonté, et I (i) , J (n) et K(p) sont des coefficients.
12. 12. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 11, caractérisé en ce que : At(2Di û usAz) 2Az 2 (1 + Fk ) 26 I(p) _ J(p) = Az 2 (1+ Fk) ù 2Di At Az2(1+Fk) K(p) = At(2Di +uszz 2Az 2 (1+ Fk ) où F est un facteur de porosité de la colonne chromatographique, Di un facteur de diffusion chromatographique, et At et OZ des pas d'échantillonnage temporel et spatial du modèle.
13. 13. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 9, caractérisé en ce que le modèle de transports est x(n +1) = A(n, p)x(n) + B(n, p)u(n) exprimé par y(n) = C(n,p)x(n) + D(n, p)u(n) x(0) = xo (p) où n correspond à un échantillonnage du temps de 1 à nt, A est une matrice d'état, B une matrice d'entrée, C une matrice de sortie et D une matrice de commande directe, A, B, C et D dépendant du temps, c(1,n) est un vecteur-colonne de ( L dimension nz= ; J(1,n, p) I(1,n, p) 0 0 K(2,n,p) J(2,n,p) I(2,n,p) 0 0 A(p) = K (i, n, p) J (i, n, p) I (i, n, p) 0 0 K(nz-1,n,p) J(nz-1,n,p) I(nz-1,np) 0 0 K(uz,u,p) J(uz,u,p) est une matrice carrée de dimension nz AZ B(p) = 0 0, est un vecteur-colonne de dimension nz ;C(p)=(O ••• 0 1) est un vecteur-ligne de dimension nz, avecy(n) = c(L ,n) D (p) est choisie à volonté, et Az I(i,n,p),J(i,n,p)et K(i,n,p) sont des coefficients.
14. 14. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon la revendication 13, caractérisé en ce que : I (i, n, p) = At(1 + FkWe-s,0(i,n)~-~ Di us Oz2 2Az K (i, n, p) = At(1 + Fkw e -s''(i,n) ) J(i, n, p) = At(1+ FkWe-s'(i,n) )-~ Di us + Oz 2 20z (1 + FkWe-s i'n) ) + FSk aev(z, t) At w at eùs,(z,t) Oz2 i, n où F est un paramètre de porosité de la colonne chromatographique, kW un facteur de rétention, S une pente de gradient, cp une concentration, Di un facteur de diffusion chromatographique et OZ et At des pas d'échantillonnage spatial et temporel du modèle.
15. 15. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que des paramètres de gain de l'appareillage (c(,I) sont déduits par une recherche de minimum d'une fonction qui est une différence entre des signaux mesurés pour des molécules de concentration connue et des expressions où interviennent lesdits paramètres de gain, le modèle de transport des molécules et lesdites concentrations connues. 29
16. 16. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration sont obtenues par une recherche d'un minimum d'une fonction qui est une différence entre des signaux mesurés pour lesdites molécules et des expressions où interviennent lesdits paramètres de gain, le modèle de transport des molécules et lesdites concentrations.
17. 17. Procédé de détermination de concentrations de molécules selon les revendications 4 et 15, caractérisé en ce que certains des paramètres sont réévalués pendant la recherche de minimum.
18. 18. Procédé de détermination de concentration de molécules selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend l'utilisation d'au moins un algorithme de minimisation stochastique de type bayésien pour obtenir une adéquation entre les mesures et le modèle.