FR2920310A1 - Procede pour la preparation d'un extrait vegetal de passiflora alata et utilisation dudit extrait dans des compositions cosmetiques et pharmaceutiques - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'extraits végétaux de Passiflora alata comme agent anti-inflammatoire dans des compositions cosmétiques et pharmaceutiques. La présente invention concerne en outre un procédé pour obtenir un extrait végétal Passiflora alata comprenant les étapes de soumettre les feuilles de la plante Passiflora alata à une extraction à l'eau pour obtenir un extrait aqueux et de soumettre l'extrait aqueux ainsi obtenu à au moins une élution avec une solution aqueuse d'éthanol dans une colonne spécifique et ensuite de sécher ledit extrait par séchage par pulvérisation.

Description

"PROCEDE POUR LA PREPARATION D'UN EXTRAIT VEGETAL DE PASSIFLORA ALATA ET UTILISATION DUDIT EXTRAIT DANS DES COMPOSITIONS COSMETIQUES ET PHARMACEUTIQUES " Domaine de l'Invention La présente invention concerne l'utilisation d'extraits végétaux Passiflora alata comme ingrédient actif anti-inflammatoire et analgésique dans des compositions cosmétiques et pharmaceutiques. Arrière-plan de l'Invention 1 o Les espèces végétales du genre Passiflora (Passifloraceae) sont natives des régions tropicales et leurs composés majeurs sont les flavonoïdes. Ces espèces végétales sont connues dans la médicine traditionnelle en tant que drogues végétales ayant une action anti-inflammatoire. Certains documents de l'art antérieur concernant la 15 préparation d'extraits de Passiflora et leur utilisation dans des compositions cosmétiques et pharmaceutiques sont présentés ci-dessous. Le document WO2005/097153 décrit une méthode spécifique pour la préparation d'extraits de fruit de la passion (Passiflora) et l'utilisation de tels extraits en tant qu'agents hépato-protecteurs, antioxydants et agents anti- 20 inflammatoires chez les mammifères. Toutefois, ce document ne se réfère pas à des espèces particulières de Passiflora ni à des caractéristiques améliorées dédites espèces. Le document EP 1 537 789 décrit des compositions pour application topique comprenant des caroténoïdes, des tocophérols and des extraits de 25 de fruit de la passion ayant une activité anti-inflammatoire. Le document JP 200200336 décrit un produit cosmétique comprenant un extrait de cymbidium et un extrait de plante qui inhibe la production de mélanine, tel que Passiflora, et possédant une activité anti-inflammatoire.

Le document JP 2000159657 décrit une préparation pour application externe topique sur la peau comprenant des extraits de plante du genre Passiflora ayant une activité inhibitrice sur la production de mélanine and un effet blanchissant.

Le document JP 2001122731 décrit une composition cosmétique contenant des extraits de Passiflora antioquiensis et Passiflora mollissima ayant une activité d'hydratation prolongée et une efficacité significative sur des maladies inflammatoires. Le document JP 2002332224, à son tour, décrit une composition cosmétique pour combattre le vieillissement cutané comprenant un extrait de Passiflora incam ata L. ayant une activité sur les symptômes du vieillissement et comprenant un ingrédient d'hydratation ou un activateur cellulaire. Le document JP 7233044 décrit également un produit cosmétique pour la prévention des rides avec une action d'activation cellulaire, dans lequel la composition selon ledit document comprend un mélange d'extraits choisis à partir de plusieurs plantes, dont Passiflora, Pinelliae Tuber et Mori Fructus. Le document WO 2005/077328 concerne un produit cosmétique antirides à base d'extraits végétaux. Les produits décrits dans ledit document sont des systèmes eau-dans-l'huile contenant un extrait de Passiflora et des extraits de pavot, menthe et myrte dans le but d'atteindre un effet hydratant de longue durée et une meilleure élasticité. Le document JP 2001226219 décrit une composition cosmétique contenant un extrait végétal dilué, ledit extrait végétal étant choisi parmi Passiflora caerulea L. et Passiflora edulis Sims, tandis que le document JP 7118139 décrit un produit cosmétique favorisant un effet embelliseur de la peau comprenant un extrait végétal, tel que Passiflora SSP. Le document JP 2004155664 concerne un agent améliorant les 30 fonctions de la peau à usage externe, lesdites fonctions de la peau étant améliorées grâce à l'utilisation de poudres végétales de plantes du genre Passiflora, entre autres. Le document WO 2005/053435 décrit des préparations pour administration orale et/ou topique contenant Passiflora incam ata en plus de carotène et de tocophérols. Les inventeurs démontrent dans la présente demande que des extraits préparés à partir de plantes du genre Passiflora ont une activité anti-inflammatoire et analgésique améliorée, et ils ont développé un procédé d'extraction de sorte à obtenir un extrait riche en flavonoïdes, ce qui résulte en une activité anti-inflammatoire et analgésique améliorée, en vue d'une utilisation topique et/ou interne (orale).

Brève Description des Dessins La Figure 1 contient une brève description du procédé d'extraction pour l'obtention d'un extrait sec à partir des feuilles de Passiflora alata enrichi en flavonoïdes et, spécifiquement, en vitexine-2"-O-rhamnoside (CAS 64820-99-1).

La Figure 2 présente le profil chromatographique obtenu par HPLC (Chromatographie Liquide Haute Performance) de l'extrait de Passiflora alata obtenu selon la présente invention. La Figure 3 présente le profil chromatographique obtenu par HPLC d'une fraction de l'extrait aqueux de Passiflora alata fractionné par une chromatographie préparatrice, en utilisant de la silice comme phase stationnaire. Cette fraction (FO3-23) possède la flavone glycosylée vitexine-2-0-rhaminoside comme composant majeur. Le fractionnement a été réalisé pour prouver les activités biologiques in vitro de ce composé, qui est également présent dans l'extrait aqueux d'origine.

Les Figures 4 à 14 représentent des graphes contenant des données relatives aux tests de sécurité et d'efficacité d'échantillons d'extraits de Passiflora alata selon la présente invention. Résumé de l'Invention 4 La présente invention concerne l'utilisation d'extraits végétaux de Passiflora alata comme agent anti-inflammatoire dans des compositions cosmétiques and pharmaceutiques. La présente invention concerne aussi un procédé pour l'obtention 5 d'un extrait végétale de Passiflora alata, comprenant les étapes de: a) soumettre des feuilles de la plante Passiflora alata à une extraction par l'eau pour obtenir un extrait aqueux; b) soumettre l'extrait aqueux obtenu en (a) à au moins une élution avec une solution hydro-alcoolique dans une colonne de 10 chromatographie remplie d'une résine spécifique ; c) concentrer et sécher par pulvérisation l'extrait obtenu en (b). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les présents inventeurs ont découvert que des extraits de Passiflora alata ont une activité anti-inflammatoire et analgésique améliorée et qu'ils 15 sont utiles dans des compositions cosmétiques, en particulier des compositions antirides ou anti-âge, ainsi que dans des compositions pharmaceutiques, en particulier pour une administration topique ou orale. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'extrait de plante de Passiflora alata est obtenu par un procédé comprenant les étapes de 20 a) soumettre des feuilles de la plante Passiflora alata à une extraction par l'eau pour obtenir un extrait aqueux; b) filtrer l'extrait obtenu en (a); c) soumettre l'extrait aqueux obtenu en (b) à un procédé de purification au moyen d'une résine spécifique; 25 d) éluer l'extrait avec un mélange hydro-alcoolique acidifié; e) concentrer le produit obtenu en (d); f) resuspendre le produit obtenu en (e) dans de l'éthanol chaud et ensuite le refroidir; g) filtrer la solution obtenue en (f); h) concentrer le produit obtenu en (g); i) sécher le produit obtenu en (h) à l'aide d'un entraîneur solide. Selon un autre aspect de l'invention, l'extrait de Passiflora alata est 5 obtenu par un procédé qui comprend les étapes de: a) soumettre des feuilles de plantes Passiflora alata à une extraction à l'eau dans le rapport de 1 partie de plante pour 20 parties d'eau chaude, entre 602C et 802C, de préférence à 802C, pendant 2 heures; b) filtrer l'extrait obtenu en (a); 10 c) soumettre l'extrait aqueux obtenu en (b) à un procédé de purification au moyen d'une résine spécifique, cette résine étant constituée de polymères de polyvinylpyrrolidone ou de polystyrène, de préférence de polystyrène; d) éluer l'extrait résultant avec un mélange hydro-alcoolique, de préférence 15 avec de l'éthanol à 30% dans l'eau, acidifié avec de l'acide acétique au pH 5.0; e) concentrer le produit obtenu en (d) jusqu'à 30% de matériel total solide; f) resuspendre le produit obtenu en (e) dans de l'éthanol 962GL à 60°C et ensuite refroidir à 2°C; 20 g) filtrer la solution obtenue en (f); h) concentrer le produit obtenu en (g) jusqu'à 20% de matériel total solide; i) sécher le produit obtenu en (h) en utilisant une méthode Spray Dryer (séchage par pulvérisation) avec une température de d'entrée de 180 2C et une température de sortie de 85 °C à l'aide de l'entraîneur "E 1450" (octenyl 25 succinate d'amidon sodique) à la concentration de 1 à 8%, de préférence 8%. L'extrait sec résultant du procédé ci-dessus contient des flavonoïdes C-glycosylés, principalement l'orientine, l'homoorientine, la vitexine, l'isovitexine et la vitexine-2"-O-rhamnoside; and des flavones, principalement la lutéoline. Leurs formules structurales sont décrites ci-dessous: OH O HomaonentIna Oriendn.

Vitsxins Lueaoina Rha,Glc/OH I HO~,.L70 OH O V itexl ne-2"-O-rha m nos ide II a été découvert que le flavonoïde présent en plus grande quantité dans l'extrait de Passiflora alata obtenu selon la présente invention est la vitexine-2"-O-rhamnoside (CAS 64820-99-1), ce flavonoïde n'étant trouvé que dans l'espèce Passiflora alata comparé aux autres espèces de Passiflora qui sont couramment utilisées comme agents phytothérapeutiques, étant aussi recommandée en tant que marqueur chimique pour éviter des adultérations de la drogue végétale avec d'autres espèces de Passiflora (PEREIRA, 2004). Le contenu en flavonoïdes totaux obtenu par la présente invention est de l'ordre d'environ 11,40% à environ 16,55%, selon la méthodologie de dosage des flavonoïdes totaux, telles que la vitexine, comme déterminé par la Pharmacopoeia Portugaise, 2000. Le contenu en vitexine-2"-O-rhamnoside obtenu par la présente invention est d'environ 9.70% à environ 11.90%, selon la méthodologie de dosage de cette substance par HPLC. Les conditions de cette analyse étaient: - Alliance de Chromatographie Liquide Haute Efficacité avec détecteur PDA 2996, fournisseur Waters. - Colonne X-Terra RP18 5um, 4,6 x 150 mm - Phase mobile: système gradient compose d'Acétonitryle et d'Acide Formique à 0, 2% v/v. - Flux: 0,6 mL/min - Température: 25 °C - Volume injecté: 20 uL -Longueur d'onde: 340,7 nm La présente invention concerne en outre des compositions cosmétiques et pharmaceutiques contenant un extrait de plante Passiflora alata comme agent actif anti-inflammatoire. Dans les compositions selon la présente invention, la quantité d'extrait de Passiflora alata utilisée dépend du but final prévu mais est de préférence entre 0,25 to 1,00% en poids, par rapport au poids total de la composition. Les compositions de la présente invention peuvent contenir d'autres ingrédients utilisés traditionnellement dans ces types de compositions, tels que des agents chélatants, des antioxydants, des agents épaississants, des agents d'ajustement du pH, des conservateurs, des agents hydratants, des agents conditionnants, autres émollients, agents filmogènes, agents absorbeurs d'oléosité parmi d'autres. La présente invention sera illustrée par les exemples ci-dessous.

Exemple 1 ù Obtention d'un extrait de Passiflora alata 50g de feuilles de Passiflora alata ont été placés dans 1,000 L d'eau distillée et le mélange a été chauffé à 80°C pendant 3 heures. Le mélange a ensuite été passé sur une colonne de polystyrène, puis élué avec solution d'éthanol à 30% acidifiée à pH 5,0 avec de l'acide acétique. L'extrait résultant a été filtré et séché. Exemple 2 ù Obtention d'un extrait de Passiflora alata purifié par contact avec du PVPP 100g de feuilles séchées de Passiflora alata ont été soumis à une extraction à l'eau distillée dans un rapport de 1:10 (p/v) à 80°C pendant 2 heures. Après une filtration sur Büchner, 4 aliquots de 50 ml ont été prélevés et mélangés à 2.5g de PVPP (Divergan F BASF) à 8 C. Après 90 minutes sous agitation, les échantillons ont été élués en Büchner et le PVPP a été soumis aux éluants suivants pour retirer les flavonoïdes contenus dans le mélange résultant : a) 50 ml H2O + NH4OH 10/0, 60°C, 30 min b) 50 ml H2O + HCI 1%, 60°C, 30 min c) 50 ml EtOH + NH4OH 1%, 60°C, 30 min d) 50 ml EtOH + HCI 1%, 602C, 30 min Les aliquots ont été dilués 8,33 fois puis analysés par HPLC dans les 1 o conditions d'analyse suivantes: Phase mobile (A): Acide formique à 0,2% dans l'eau Phase mobile (B): ACN Détection: 337 nm (pour les flavonoïdes) Flux: 0,8 mUmin 15 Standards: dissous dans le méthanol: orientine, isoorientine, vitexine, isovitexine, luteoline, apigenine. Concentration de 105 ppm Colonne: Phjenomenex Synergil 4 pm Fusion RP-80 150 x 4.6 mm Gradient: Temps % (A) % (B) 0 85 15 85 15 40 70 30 50 85 15 20 La valeur de l'aire de la vitexine a été considérée à des fins de comparaison puisqu'il s'agit du flavonoïde majeur. La Figure 1 contient un graphe comparatif des résultats obtenus pour plusieurs échantillons, et la Figure 2 liste des chromatogrammes de plusieurs cycles réalisés dans cette analyse dans lesquels il a été noté que le PVP est capable d'absorber les flavonoïdes glycosylés à faible température. Exemple 3 ù Obtention et identification de flavonoïdes de différents extraits de Passiflora alata Les flavonoïdes présents dans différents types d'extraits de Passiflora alata ont été obtenus par 2 méthodologies différentes. a) Voie 1 100g de feuilles séchées de Passiflora alata ont été mis en suspension dans 1000 ml d'eau dé-ionisée. Ensuite, les flavonoïdes ont été 1 o extraits pendant 2 heures dans un ballon de réaction sous agitation constante à 3 températures différentes: 60, 70 et 80°C. L'extrait a ensuite été filtré sous vide dans un entonnoir de Büchner en éliminant le restant de feuilles retenu et en complétant le volume du filtrat de nouveau à 1000 ml (pour chacune des différentes températures 15 d'extraction) A partir de ce volume, 500 ml d'extrait a été laissé reposer sur la nuit dans une chambre froide à 52C. Après 24 heures, l'extrait a été centrifugé à 5°C et 4100 rpm pendant 21 minutes, obtenant ainsi deux fractions: le précipité et le surnageant. Le précipité a été suspendu dans de l'éthanol, filtré sur un papier filtre banal et le volume d'éthanol a été 20 complété à 80 ml. b) Voie 2 Le volume de l'autre extrait de 500 ml séparé par la Voie (1) ci-dessus a été précipité dans l'éthanol deux fois, après un refroidissement préalable à température ambiante. Ensuite l'extrait a été centrifugé à 20°C 25 et 4100 rpm pendant 21 minutes, obtenant deux fractions: le précipité et le surnageant. Le précipité a été suspendu dans de l'éthanol, filtré sur un papier filtre banal et le volume d'éthanol a été complété à 80 ml. Dosage de la concentration en flavonoïdes La concentration en flavonoïdes contenus dans les extraits obtenus 3 0 par les Voies 1 et 2 a été déterminée selon Rolim et aI, 2005, et le 10 flavonoïde rutine a été utilisé comme standard. La concentration peut être vue dans la Figure 3, où elle est exprimée en pg/ml. La Figure 3 montre (de la gauche vers la droite) le précipité de la Voie 1 suspendu dans de l'éthanol à 602C (R1-60), le précipité de la Voie 1 suspendu dans de l'éthanol à 702C (R1-70), le précipité de la Voie 1 suspendu dans de l'éthanol à 802C (R1-80), le précipité de la Voie 2 suspendu dans de l'éthanol à 602C (R2-60), le précipité de la Voie 2 suspendu dans de l'éthanol à 702C (R2-70) et le précipité de la Voie 2 suspendu dans de l'éthanol à 802C (R2-80). Pour suivre les concentrations exactes des extraits, les résultats de la Figure 3 sont également présentés dans la Table ci-dessous : Table 1 û Absorbances et concentrations respectives des flavonoïdes des différents extraits de P. alata Echantillon Abs (391 nm) [ ] ug/ml R 1-60 0,1908 10,10 R 1-70 0,5093 26,78 R1-80 0,8166 42,87 R2-60 0,3397 17,90 R2-70 0,2791 14,73 R2-80 0,6023 31,65 A travers les résultats présentés dans la Figure 3, il est possible de suivre le profil de concentration en flavonoïdes de tous les précipités suspendus dans l'éthanol obtenus par les Voies 1 et 2 aux trois températures adoptées dans les procédures (60, 70 et 802C) et il est conclu que la température d'extraction de 80°C était la plus efficace.

En comparant les Voies 1 (aqueuse) et 2 (avec précipitation à l'éthanol), et il est conclu que la Voie 1 était la plus efficace, montrant que le procédé est optimisé par une extraction aqueuse avec une suspension dans l'éthanol ultérieure. Le précipité suspendu de la Voie à 80° a atteint une concentration supérieure à 40 pg/mI.

Exemple 4 ûEvaluation de la cvtotoxicité et de la phototoxicité in vitro L'objectif de cette expérience était de déterminer l'effet cytotoxique et phototoxique des échantillons d'extraits Passiflora alata selon la présente invention en utilisant des méthodologies établies par le National Institute of Health (NIH) EUA, qui sont valables de manière internationale.

Définitions: Cytotoxicité: Le test permet de déterminer la concentration cytotoxique d'un composant actif, lorsque les cellules 3T3 sont incubées avec celui-ci pendant 24 heures. La toxicité est déterminé en fonction de la viabilité cellulaire, suivie par l'incubation des cellules 3T3 avec du Rouge Neutre, un colorant vital qui est incorporé dans les cellules vivantes après 24 heures de contact avec le composant actif (Guidance Document on Using ln Vitro Data to Estimate ln Vivo Starting Doses for Acute Toxicity . NIH Publication 01-4500 (2001)). Phototoxicité: Le principe du test est de comparer la toxicité d'un composant actif en présence et en absence d'une dose non-toxique de rayons UVA. La phototoxicité est mesurée par la capture de Rouge Neutre par les cellules qui survivent à l'incubation avec le composant actif, selon le protocole de Borenfreund & Puerner (1985), qui a déjà été établi et standardisé par le NIH ("ZEBET/ECVAM/COLIPA Standard Operating Procedure. In Vitro 3T3 Phototoxicity Test. 26 Ap, 1998"). La phototoxicité/Photoirritation est définie comme la réponse toxique provoquée après la première exposition de la peau à certains produits/composés actifs avec une exposition ultérieure à la lumière solaire ou qui est induite par l'irradiation de la peau après une administration systémique d'un compose actif/produit ("Spielmann H, Liebsch M, Doring B, Moldenhauer F. First results of an EC/COLIPA validation project of in vitro phototoxicity testing methods. ALTEX. 1994;1 1(1):22-31"). Matériel: Cellules 3T3 (lignée cellulaire fibroblastique de peau de souris Balb/C). 3 0 Réactifs: 12 Milieu Eagle modifié de Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM), Serum de Veau Foetal (Fetal Bovine Serum, FBS), Rouge Neutre (SIGMA-ALDRICH), Dimethylsulfoxide (DMSO), Ethanol, Acide Acétique et PBS (Phosphate Buffer Saline ou Solution Saline Tamponée de Phosphate). Méthodes: Analyse de la solubilité and définition des concentrations de l'expérience: La solubilité des échantillons est évaluée selon des tests standardisés de manière internationale par le NIH. De manière à avoir une meilleure solubilisation des échantillons en solutions aqueuses, telles que le DMEM (dans le test de cytotoxicité) ou le PBS (dans le test de phototoxicité), l'utilisation d'une concentration maximale de 1% de DMSO ou d'Ethanol est autorisée Les concentrations utilisées dans les tests de cytotoxicité et de phototoxicité varient en fonction des résultats des tests de solubilité des échantillons. La concentration maximale testée ne devrait pas excéder 3 mg/ml. Cytotoxicité: Les cellules 3T3 sont ensemencées dans une plaque 96-puits stérile, à une densité de 1 x104 cellules/puits. Après 24 heures, les cellules sont incubées pendant 24 heures avec les échantillons dilués dans un milieu de culture avec 5% SFB. Ensuite, elles sont incubées avec du Rouge Neutre pendant 3 heures. L'excédent de colorant est lavé avec du PBS et les cristaux formés sont dissous avec de l'Ethanol: Acide Acétique: Eau (50:1:49). La lecture de l'absorbance est réalisée à 540 nm et, à partir des résultats obtenus, la concentration à laquelle 50% des cellules sont viables (C150) est calculée. Par conséquent, plus la valeur de CI50 est élevée, plus le potentiel cytotoxique de l'échantillon est faible, et vice-versa. Phototoxicité: Les cellules 3T3 sont ensemencées dans une plaque 96-puits stérile, à une densité de 1x104 cellules/puits. Deux plaques identiques sont préparées mais l'une d'elle sera irradiée aux UVA et l'autre sera conservée à l'obscurité, en tant que témoin. 24 heures après l'ensemencement, les cellules sont incubées pendant une heure à l'obscurité avec les échantillons dilués dans le PBS. Après cela, l'un d'eux est irradié avec 5 Joules/cm2 de lumière UVA pendant 50 minutes. Les plaques sont lavées avec du PBS et reçoivent un milieu de culture avec 10% de sérum de veau foetal pendant la période de rétablissement qui dure approximativement 12 heures. Le deuxième jour de l'expérience, les cellules sont incubées avec une solution de Rouge Neutre pendant 3 heures. L'excédent de colorant est lavé avec du PBS et les cristaux formés sont dissous avec de l'Ethanol: Acide Acétique: Eau (50:1:49). La lecture de l'absorbance est réalisée à 540 nm et, à partir des résultats obtenus, la concentration à laquelle 50% des 1 o cellules sont viables (CI50) est calculée pour chaque plaque. Le rapport entre les deux valeurs est le facteur de Photolrriration (FPI), qui classe l'échantillon comme phototoxique ou non. Calcul du FPI: FPI = C150 -UV 15 CI50 (+UV) Lorsque le FPI est supérieur ou égal à 5, l'échantillon est phototoxique. S'il n'est pas possible d'obtenir la valeur de CI50 avant la concentration maximale testée en absence d'UV, alors qu'en présence d'UV il est possible d'observer une action phototoxique et de calculer CI50, >FPI 20 est calculé en divisant la concentration maximale testée par la CI50 de la courbe de phototoxicité UV: >FPI = Cmax (-UV) Cl50 (+UV) Lorsque >FPI est supérieur à 1, l'échantillon est phototoxique. 25 Exemple 4.1 Les échantillons suivants d'extrait de Passiflora alata selon l'invention ont été analysés pour la cytotoxicité: Passiflora A = 16,54% flavonoïdes; 11,02% vitexine-2-o-r Passiflora B = 11,49% flavonoïdes; 0,39% vitexine-2-o-r D'abord, une solution stock de l'échantillon a été préparée dans du PBS à 30 mg/ml contenant 10% de DMSO. Dans le cas de la cytotoxicité, la solution stock a été diluée 10 fois dans du DMEM contenant 5% de SFB, obtenant la concentration maximale utilisée de 3 mg/mi contenant 1% de DMSO. Les autres dilutions testées pour la cytotoxicité ont aussi été préparées dans du DMEM contenant 5% de SFB. Dans le cas de la phototoxicité, la solution stock a été diluée 10 fois dans du PBS, obtenant la concentration maximale utilisée de 3 mg/ml contenant 1% de DMSO. Les autres dilutions testées pour la phototoxicité ont aussi été préparées dans du PBS. Les données relatives au test de cytotoxicité des échantillons décrits dans la présente demande ont été utilisées pour fabriquer les graphes des Figures 4 et 5. Les échantillons testés et leurs potentiels cytotoxiques respectifs in vitro sont indiqués dans la Table 2. L'échantillon 550 a été considéré comme cytotoxique in vitro au-dessus de 0,2 mg/ml. Table 2: Données obtenues dans le test de cytotoxicité Echantillons Registre CI50 (mg/ml) Extrait de Passif lora A NA Extrait de Passiflora B 2,0 Exemple 4.2 Les échantillons suivants d'extrait de Passiflora alata selon l'invention ont été analysés pour la phototoxicité: Passiflora A = 16,54% flavonoïdes; 11,02% vitexine-2-o-r Passiflora B == 11,49% flavonoïdes; 0,39% vitexine-2-o-r D'abord, une solution stock de l'échantillon a été préparée dans du PBS à 30 mg/ml contenant 10% de DMSO. Dans le cas de la phototoxicité, la solution stock a été diluée 10 fois dans du PBS, obtenant la concentration concentration maximale utilisée de 3 mg/ml contenant 1% de DMSO. Les autres dilutions testées pour la phototoxicité ont aussi été préparées dans du PBS. Les échantillons ont été filtrés sur des membranes de 0,22 pm. Les données relatives au test de phototoxicité des échantillons 5 décrits dans la présente demande ont été utilisées pour fabriquer les graphes des Figures 6 et 7. Les échantillons testés et leurs potentiels phototoxiques respectifs sont indiqués dans la Table 3. Les échantillons A et B ont été considérés comme non-phototoxiques in vitro. 10 Table 3: Données obtenues dans le test de phototoxicité Echantillon Registre FPI Extrait de Passiflore A NA Extrait de Passiflora B NA Exemple 5 û Evaluation du potentiel mutaqène à travers le test de mutation réverse chez Salmonella typhimurium (test Amesi Le test AMES (Maron & Ames, 1983; OECD Guidelines, 1997) a pour 15 but d'évaluer le potentiel de certains produits chimiques à induire des mutations dans le génome de souches de Salmonella typhimurium par des mutations réverses his- à his+, avec ou sans un système d'activation métabolique. Dans cette étude, il a été observé que les extraits de Passiflora alata n'ont pas de potentiel d'activité mutagène dans des 2 0 souches de Salmonella typhimurium. Exemple 5.1 Les échantillons suivants d'extrait de Passiflora alata selon la présente invention ont été utilisés: Echantillon C (contenu en flavonoïdes totaux 16,46% et contenu en 25 vitexine-2-o-r 11,87%) Echantillon F (contenu en flavonoïdes totaux 16,10% et contenu en vitexine -2-o-r 9,67%) Matériels: Souches TA97a, TA98, TA 100, TA102 and TA1535 and TA1537 Réactifs: Azide de sodium, 2-nitrofluorène; 9-aminoacridine, hydropéroxyde de cumène, 2-aminoanthracène, milieu glycosylé minimum, top agar, fraction S9 (Molecular Toxicology Incorporated, EUA), eau de-, 4-nitroquinoline-1-oxyde, mitomycine C Performance du Test 0,1 ml de bactéries ayant poussé sur la nuit et 0,l ml des échantillons testés sont ajoutés à chaque tube contenant 3 ml of top agar préalablement conditionné dans du bouillon sec à 45°C. Dans les tests avec activation métabolique, 0,5 ml/boîte de fraction S9 ayant une concentration en protéines de 39,7 mg/ml ont été ajoutés. Avant le test, les génotypes des souches ont été évalués dans le but de s'assurer des caractéristiques génétiques d'origine des bactéries. Grâce un milieu de croissance sélectif, la dépendance des souches vis-à-vis de l'histidine et de la biotine a été analysée. La présence de la délétion uvrB a été détectée par la sensibilité à la lumière ultraviolette irradiant les boîtes. La mutation da, qui augmente la perméabilité de la paroi bactérienne à l'entrée des substances à tester, a été détectée par la sensibilité au violet cristal. En testant la résistance à l'ampicilline, la présence du plasmide pKM101 a été notée, qui agit au niveau de la réparation de l'ADN, en augmentant la mutagénicité chimique et spontanée. La présence du plasmide pAQ1 a été vérifiée car elle fournit une résistance à tétracycline.

Le nombre de colonies révertantes spontanées par boîte pour chaque souche a été comparé au taux acceptable décrit dans la littérature par Maron & Ames (1983). Des témoins positifs et négatifs ont été inclus dans tous les tests. Comme témoin négatif, le solvant choisi pour la solubilisation des 3 0 échantillons (100 i/boîte d'eau dé-ionisée) a été utilisé pour le nombre de colonies révertantes spontanées par boîte, pour une comparaison ultérieure 17 avec le nombre de révertants observés en présence des échantillons. Comme témoins positifs, des substances mutagènes connues ont été utilisées pour s'assurer de la capacité de réponse de chaque souche au mutagène et de l'efficacité du système d'activation métabolique (azide de sodium, 4-nitroquinoline-1-oxyde, 9-amidoacridine, mitomycine C, 2-aminoanthracène, 2-nitrofluorène, hydropéroxyde de cumène). Un test préliminaire a été réalisé avec la souche TA100 afin de déterminer l'intervalle de concentration d'échantillon le plus approprié pour le test définitif en utilisant les concentrations de 8; 40; 200; 1000 et 5000 lug/boîte. Les concentrations utilisées dans ce test n'ont pas présenté de toxicité pour la croissance de Salmonella typhimurion. Ainsi, les concentrations pour le test définitif ont varié de 0,001 à 5 mg/boîte. Toutes les concentrations ont été testées en triple en absence et en presence d'activation métabolique. Les témoins négatifs et positifs ont été réalisés en triple. Les résultats ont été exprimés en nombre de colonies révertantes par boîte et par le rapport de mutagénicité (RM), qui correspond au rapport entre le nombre de colonies révertantes sur les boîtes tests et le nombre de colonies révertantes sur les boîtes de témoin négatif. Le nombre de 2 0 colonies révertantes spontanées a été comparé au taux normalement acceptable décrit dans la littérature (Maron & Ames, 1983). Un résultat est considéré comme positif lorsque le nombre moyen de colonies révertantes sur les boîtes tests est supérieur ou égal à deux fois celui observé sur les boîtes de témoin négatif (RM >2) pour les souches 25 TA97a, TA98, TA 100 et TA 102. Pour les souches TA1535 et TA1537, RM devrait être supérieur ou égal à trois. Les témoins positifs ont présenté un rapport de mutagénicité entre 5 et 152, montrant qu'ils sont appropriés pour valider l'expérience. Aucune augmentation significative dans le nombre de révertants n'a été observée 3 0 chez les souches après le traitement avec les échantillons C et F, à quelque concentration que ce soit en présence et en absence d'activation 18 métabolique. Les échantillons C et F ont montré un rapport de mutagénicité inférieur à 2. Exemple 6 ù Evaluation du potentiel d'irritation et de sensibilisation cutanées in vivo L'extrait de Passiflora alata a été soumis à un test de sécurité in vivo, selon Fisher, 1995: Echantillon C - (contenu en flavonoïdes totaux 16,46% et contenu en vitexine-2-o-r 11,87%) à 25% et 50% d'une solution aqueuse. L'extrait est soumis à une inspection de l'irritation primaire et de l'irritation accumulée et à un test de sensibilisation en pansement. Le test d'irritation primaire est évalué en retirant le pansement de test après 48 heures d'application, avec des mesures réalisées 30 minutes et 24 heures après qu'il soit retiré. Les tests d'irritation accumulée et de sensibilisation, quant à eux, nécessitent l'application du pansement de test de manière quotidienne sur une période de 14 jours, suivie d'une période de rétablissement de 14 jours et ensuite une ré-application du pansement de test pendant 48 heures sur une zone qui n'avait pas été utilisée précédemment pour l'irritation primaire. L'étude était une étude clinique contrôlée, aléatoire et en simple- aveugle. Cinquante-six volontaires ont complété l'étude et aucune réaction indésirable n'a été détectée (érythème, oedème, papules ou vésicules) dans les zones de l'application de l'échantillon. Exemple 7 ù Evaluation du potentiel anti-inflammatoire dans des fibroblastes humains in vitro Le but de ce test est d'évaluer le potentiel anti-inflammatoire d'extraits in vitro, en utilisant des cultures de fibroblastes de derme humain. La significativité statistique (p < 0,05) des données est vérifiée par une analyse de variance (One-Way ANOVA) suivie d'une comparaison multiple de Tukey en utilisant le logiciel SYSTAT 10. 3 0 Exemple 7.1 19 Les échantillons suivants d'extrait de Passiflora alata selon l'invention ont été utilisés: Echantillon A (contenu en flavonoïdes totaux 16,54% et contenu en vitexine-2-o-r 11,02%) Echantillon B (contenu en flavonoïdes totaux 11, 49% et contenu en vitexine-2-o-r 0,39%) Des fibroblastes humains dérivés du derme ont été incubés avec des lipopolysaccharides (LPS) d'Escherichia coli afin d'induire la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires IL-6 and IL-8 (Interleukine 6 and 8). Le potentiel anti-inflammatoire de l'échantillon a été identifié par la réduction de la sécrétion de marqueurs pro-inflammatoires. Matériel utilisé: Fibroblastes humains dérivés du derme, maintenus en culture jusqu'au dixième passage au plus. Plaques de culture stériles de 96 puits, plaques de culture non stériles de 96 puits, tubes coniques de15ml et 50 ml Réactifs: Milieu Eagle modifié de Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM), Serum de Veau Foetal (Fetal Bovine Serum, FBS), Rouge Neutre, Dimethylsulfoxide (DMSO), tampon de révélation (éthanol: acide acétique: eau, 50:1:49), PBS (Phosphate Buffer Saline), Tampon de Lavage (PBS contenant 0,05% de Tween-20), tampon de sensibilisation (0.1M carbonate de sodium), tampon de blocage (PBS contenant 5% d'albumine sérique bovine), lipopolysaccharide bactérien (LPS), dexaméthasone, hydrocortisone, kits pour le dosage de IL-6 et IL-8 par ELISA (R&D Systems ), kit de révélation au substrat TMB (BD Pharmingen ) et solution stop (2N d'acide sulfurique). Préparation de culture cellulaire Des plaques de 96 puits ont été préparées avec 2x104 cellules/puits dans 100 pl de DMEM contenant 10% de SFB. Les cellules ont été incubées sur la nuit dans une étuve à CO2. Le milieu de culture a été éliminé et les puits lavés avec 200p1 de PBS.

Stimulation des cellules avec des LPS 100 pI de DMEM contenant 1% de SFB et les stimuli appropriés ont été ajoutés. L'incubation a été réalisée dans une étuve à CO2 sur la nuit. Les traitements étaient: - Témoin (uniquement du DMEM contenant 10/0 de SFB); - LPS 10 ng/ml; -Dexaméthasone 5 uM; - LPS 10 ng/ml + Dexaméthasone 5 uM; - Extrait A 0.1 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Extrait A 0,1 mg/ml; - Extrait A 1 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Extrait A 1 mg/ml; - Extrait B 0.1 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Extrait B 0,1 mg/ml; - Extrait B 1 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Extrait B 1 mg/ml; Collecte du surnageant et analyse de la viabilité cellulaire Après la stimulation, les surnageants ont été collectés, stockés à - 202C et analysés par ELISA (décrit ci-dessous). Afin de maintenir la viabilité cellulaire après stimulation, les cellules ont été incubées avec du Rouge Neutre pendant 3 heures et après lavage avec 200 pl de PBS, 200 pI de solution de révélation ont été ajoutés et la lecture a été réalisée à 540 nm. Pour tous les traitements, la viabilité cellulaire devrait être supérieure ou égale à 80% de la viabilité témoin. Les données de viabilité cellulaire ont aussi été utilisées ensuite pour normaliser les données obtenues par ELISA. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assa y) 21 Pour le test ELISA, des plaques de 96 puits ont été utilisées. La quantification de marqueurs pro-inflammatoires a été déterminée par comparaison avec les courbes standards fabriquées spécifiquement pour IL-6 ou IL-8. Les surnageants de culture ont été utilisés selon les étapes suivantes: - Ajout de l'anticorps de capture dilué dans du PBS (1:180, 100 pl/puits); -Incubation sur la nuit à température ambiante; - Lavage des plaques 3 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits); - Blocage des sites libres de la plaque avec du tampon de blocage (200 10 pl/puits); - Incubation pendant 1 heure à température ambiante; - Lavage des plaques 3 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Préparation des dilutions du standard et des échantillons avec du tampon de blocage (1:200); 15 - Ajout des dilutions du standard, des échantillons et du témoin (100 pl /puits); - Incubation pendant 2 heures à température ambiante; - Lavage des plaques 3 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Ajout de l'anticorps de détection dilué dans du tampon de blocage (1:180 20 chacun, 100 pl/puits); -Incubation pendant 2 heures à température ambiante; - Lavage des plaques 3 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Ajout du conjugué streptavidine-péroxidase dilué dans du tampon de blocage (1:200, 100 pl/puits); 25 - Incubation pendant 20 min à température ambiante à l'obscurité ; - Lavage des plaques 3 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Ajout de la solution de substrat (100 pl/puits); 22 -Incubation de la plaque pendant 20 min à température ambiante à l'obscurité ; - Ajout de la solution stop (50 pl/puits); - Lecture de l'absorbance à 450nm.

A partir des résultats obtenus, les Tables 2 et 3 ont été préparés avec les valeurs d'inhibition de la sécrétion d'IL-6 et IL-8, respectivement. La colonne de référence indique un échantillon dont les données ont été utilisées comme base pour calculer les pourcentages d'inhibition pour les autres échantillons. Les données sont aussi représentées dans les graphes des Figures 8 and 9, respectivement. Table 2. Taux d'inhibition de la sécrétion d'IL-6. Traitement % Inhibition Référence Dexaméthasone 71 Extrait A 0,1 mg/ml 15 Extrait A 1 mg/ml 73 Témoin Extrait B 0,1 mg/ml 19 Extrait B 1 mg/ml 44 Dexaméthasone + LPS 96 Extrait A 0,1 mg/mi + 68 LPS LPS Extrait B 1 mg/mi + 96 LPS Extrait B 0,1 mg/mi + 69 LPS Extrait B 1 mg/mi + 85 LPS Table 3 Taux d'inhibition de la sécrétion d'IL-8. Traitement % Inhibition Référence Dexaméthasone 68 Témoin Extrait A 0,1 mg/ml 34 Extrait A 1 mg/ml 85 Extrait B 0,1 mg/ml 55 Extrait B 1 mg/ml 67 Dexaméthasone + LPS 53 Extrait A 0,1 mg/mi + 24 LPS LPS Extrait B 1 mg/ml + _ LPS 78 Extrait B 0,1 mg/ml + 32 LPS Extrait B 1 mg/ml + 51 LPS D'après les données analysées, les échantillons A et B présentent une activité anti-inflammatoire potentielle, avec une réduction de la sécrétion d' IL-6 et IL-8 par des fibroblastes humains in vitro (p < 0,05). Les deux extraits ont un effet semblable à la dexaméthasone utilisée dans le modèle. En général, les extraits utilisés à une concentration de 1 mg/mi ont montré un taux d'inhibition très proche ou supérieur à celui de la dexaméthasone à 5 uM. De plus, cet effet anti-inflammatoire a aussi été observe en présence de LPS, un agent réputé pour induire une réponse inflammatoire (p < 0,05).

Exemple 7.2 Les échantillons suivants d'extrait de Passiflora alata selon la présente invention ont été utilisés: Echantillon A (contenu en flavonoïdes totaux 16,54% et contenu en vitexine-2-o-r 11,02%) Fraction purifiée de vitexine-2-0-rhaminosode (Fr13-23) Des fibroblastes humains dérivés du derme ont été incubés avec des lipopolysaccharides (LPS) ou des UV pour induire la sécrétion des marqueurs pro-inflammatoires IL-6 et IL-8. Le potentiel anti-inflammatoire de l'échantillon a été identifié par la réduction de la sécrétion des marqueurs pro-inflammatoires. 24 Matériel utilisé: Fibroblastes humains dérivés du derme, maintenus en culture jusqu'au dixième passage au plus. Plaques de culture stériles de 96 puits, plaques de culture non stériles de 96 puits, tubes coniques del5ml et 50 ml, chambre d'irradiation avec lampe UVB.

Réactifs: Les mêmes réactifs indiqués pour l'Exemple 7.1 ont été utilisés. Préparation de culture cellulaire Des plaques de 96 puits ont été préparées avec 2x104 cellules/puits dans 100 pl de DMEM contenant 10% de SFB. Les cellules ont été incubées sur la nuit dans une étuve à CO2. Le milieu de culture a été Io éliminé et les puits lavés avec 2OOpl de PBS. Stimulation des cellules avec des LPS 100 pl de DMEM contenant 1% de SFB et les stimuli appropriés ont été ajoutés. L'incubation a été réalisée dans une étuve à CO2 sur la nuit. Les traitements étaient: 15 - Témoin (uniquement du DMEM contenant 1% de SFB); - LPS 10 ng/ml; - Dexaméthasone 5 uM; - LPS 10 ng/ml + Dexaméthasone 5 uM; - LPS 10 ng/ml + Echantillon A 1 mg/ml; 20 - LPS 10 ng/ml + Echantillon A 0,5 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Echantillon A 0,25 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Echantillon A 0,125 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Echantillon Fr13-23 1 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Echantillon Fr13-23 0, 5 mg/ml; 25 - LPS 10 ng/ml + Echantillon Fr13-23 0,25 mg/ml; -LPS 10 ng/ml + Echantillon Fr13-23 0,125 mg/ml. Stimulation des cellules aux UVB 25 100 pl de DMEM contenant 1% de SFB et les stimuli appropriés ont été ajoutés. L'incubation a été réalisée dans une étuve à CO2 pendant 50 min. Les traitements étaient: - Témoin (uniquement du PBS dans des cellules non irradiées); - UVB 0.23J/cm2 (uniquement du PBS avec irradiation après l'incubation); - UVB 0.23J/cm2 + Hydrocortisone 5 uM; -UVB 0.23J/cm2 + Echantillon A 1 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon A 0,5 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon A 0,25 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon A 0,125 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon Fr13-23 1 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon Fr13-23 0,5 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon Fr13-23 0,25 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon Fr13-23 0,125 mg/ml. Après la période d'irradiation des cellules (sauf pour le témoin), les volumes des puits ont été éliminés et remplacés avec le même traitement préparé dans 1000 de DMEM contenant 1% de SFB et les stimuli appropriés. Ensuite une incubation au CO2 a eu lieu sur la nuit. 2 0 Collecte du surnageant et analyse de la viabilité cellulaire Après la stimulation, les surnageants ont été collectés, stockés à - 20°C et analysés par ELISA (décrit ci-dessous). Afin de maintenir la viabilité cellulaire après stimulation, les cellules ont été incubées avec du Rouge Neutre pendant 3 heures et, après lavage avec 200 pl de PBS, 200 25 pl de solution de révélation ont été ajoutés et la lecture a été réalisée à 540 nm. Pour tous les traitements, la viabilité cellulaire devrait être supérieure ou égale à 80% de la viabilité témoin. Les données de viabilité cellulaire ont 26 aussi été utilisées ensuite pour normaliser les données obtenues par ELISA. ELISA (Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay) Pour le test ELISA, des plaques de 96 puits ont été utilisées. La quantification de marqueurs pro-inflammatoires a été déterminée par comparaison avec les courbes standards fabriquées spécifiquement pour IL-6 ou IL-8. Les surnageants de culture ont été utilisés selon les étapes suivantes: - Ajout de l'anticorps de capture dilué dans du tampon de sensibilisation 10 (1:250, 100 pl/puits); - Incubation sur la nuit à 4°C; - Lavage des plaques 3 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits); - Blocage des sites libres dans la plaque avec du tampon de blocage (200 pl/puits); 15 -Incubation pendant 1 heure à température ambiante; - Lavage des plaques 3 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Préparation des dilutions du standard et des échantillons avec du tampon de blocage (1:200); - Ajout des dilutions du standard, des échantillons et du témoin (100 pl 2 0 /puits); - Incubation pendant 2 heures à température ambiante; - Lavage des plaques 5 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Ajout de l'anticorps de détection dilué du conjugué streptavidinepéroxidase dilués dans du tampon de blocage (1 :250 chacun, 100 pl/puits); 25 - Incubation pendant 1 heure à température ambiante; - Lavage des plaques 7 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Ajout de la solution de substrat (100 pl/puits); 27 - Incubation de la plaque pendant 30 min à température ambiante à l'obscurité ; - Ajout de la solution stop (50 pl/puits); -Lecture de l'absorbance à 450nm.

A partir des résultats obtenus, les Tables 4 et 5 ont été préparées avec les valeurs d'inhibition de la sécrétion d'IL-6 et IL-8, respectivement, ainsi que les graphes représentés dans les Figures 10 et 11 pour la stimulation avec des LPS, et 12 et 13 pour la stimulation aux UVB. La colonne de référence indique un échantillon dont les données ont été utilisées comme base pour calculer les pourcentages d'inhibition pour les autres échantillons. Table 4. Taux d'inhibition de la sécrétion d'IL-6. Traitement °/0 Inhibition Référence LPS + Dexaméthasone 94 LPS + Echantillon A 1 mg/ml 91 LPS + Echantillon A 0,5 mg/mi 75 LPS LPS + Echantillon A 0,25 mg/ml 62 LPS + Echantillon A 0,125 mg/ml 38 LPS + Echantillon Fr13-23 0,125 mg/ml 84 UVB + Hydrocortisone 71 UVB + Echantillon A 1 mg/ml 85 UVB + Echantillon A 0,5mg/ml 90 UVB + Echantillon A 0,25 mg/mi 91 û UVB UVB + Echantillon A 0,125 mg/ml 84 UVB + Echantillon Fr13-23 0,125 80 mg/mi Table 5. Taux d'inhibition de la sécrétion d'IL-8. Traitement % Inhibition Référence LPS + Dexaméthasone 82 LPS + Echantillon A 1 mg/ml 90 LPS + Echantillon A 0,5 mg/ml 71 LPS + Echantillon A 0,25 mg/ml 57 LPS LPS + Echantillon A 0,125 mg/mi 28 LPS + Echantillon Fr13-23 0,125 65 mg/ml UVB + Hydrocortisone 79 UVB + Echantillon A 1 mg/mi 86 UVB + Echantillon A 0,5 mg/ml 88 UVB + Echantillon A 0,25 mg/mi 86 UVB UVB + Echantillon A 0,125 mg/mi 74 UVB + Echantillon Fr13-23 0,125 57 mg/ml D'après les données analysées, les échantillons A et Fr13-23 présentent une activité anti-inflammatoire potentielle, avec une réduction de la sécrétion d'IL6 et IL8 par des fibroblastes humains in vitro (p <0,05). L'échantillon A a montré une activité anti-inflammatoire dans les 2 modèles (stimulations avec LPS et UVB), à toutes les concentrations testées (p < 0,05). L'échantillon Fr13-23 n'était pas cytotoxique dans des fibroblastes humains à la concentration de 0.125 mg/ml. Ceci est probablement dû au fait que cet échantillon possède une forte concentration en vitexine-2-0- rhaminoside. A cette concentration et dans les 2 modèles (stimulations avec LPS et UVB), l'échantillon a présenté une activité anti-inflammatoire considérable. Exemple 8 û Evaluation de l'expression de molécules d'adhésion ICAM-1 in vitro.

Pendant le processus inflammatoire, il est connu que la libération de TNF-a par des macrophages et des fibroblastes a un rôle important dans la signalisation entre les leucocytes et les cellules endothéliales. La réponse cellulaire à la lésion comprend l'adhésion des leucocytes à l'endothélium de vénules post-capillaires, suivie de la migration des cellules adhérentes en dehors des vaisseaux, leur déplacement vers le site extravasculaire et leur accumulation subséquente à la lésion, mécanismes qui ont été décrits comme une séquence d'interactions et de signalisations complexes entre les leucocytes et les cellules endothéliales. L'augmentation de l'expression de molécules d'adhésion, telles que ICAM-1, V-CAM et E-sélectine, est un pré-requis pour une adhésion leucocyte-endothélium stable et précède nécessairement l'extravasation des leucocytes (Quinlan et al., 1999; Fuchs et al., 2001). Ainsi, leur évaluation peut être utilisée comme modèle expérimental in vitro pour évaluer le potentiel pro- ou anti-inflammatoire de nouvelles molécules. 2 0 Exemple 8.1 L'échantillon suivant d'extrait de Passiflora alata selon la présente invention a été utilisé: Echantillon A (contenu en flavonoïdes totaux 16,54% et contenu en vitexine-2-o-r 11,02%) 25 Des cellules endothéliales de veine ombilicales humaines (Human Umbilical Vein Endothelial Celis, HUVEC) ont été incubées avec du TNF-a pour induire l'expression d'ICAM-1, qui est responsable de l'infiltration des cellules dans le processus inflammatoire. Le potentiel anti-inflammatoire de l'échantillon a été identifié par la réduction de l'expression de cette 30 molécule. 30 Matériel: Cellules endothéliales de veine ombilicales humaines (HUVEC) avec un nombre total de passages de 6 Réactifs: Milieu de culture M199; Sérum de Veau Foetal; Trypsine (Gibco). TNF-a humain (Peprotech Mexico, S.A.), anticorps anti-ICAM-1 humains (BD Biosciences Pharmingen); phosphate buffer saline (PBS), albumine sérique bovine. Préparation de cultures cellulaires Des plaques de 24 puits ont été préparées avec 5x104 cellules/puits dans un milieu de culture M199 et 10% de sérum de veau foetal. Les cellules ont été incubées dans une étuve à CO2 pendant 24 heures. Après cette période, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations d'échantillon A pendant une incubation de 12 heures. Ensuite, les cellules ont été exposées à 10 ng/ml de TNF-a pendant une période de 6 heures pour stimuler l'expression d'ICAM-1, ce moment représentant le pic d'expression de la molécule par les cellules endothéliales en culture, comme décrit par Perfetto et al. (2003) et Jiang et al. (2004). De plus, la concentration de 10 ng/ml de TNF-a a été déterminée comme étant capable d'induire l'expression des molécules d'adhésion sans interférer avec la viabilité cellulaire (Piela-Smith et al., 1992).

Après l'incubation avec le TNF-a, les cellules ont été retirées de la plaque avec de la trypsine, lavées avec du milieu de culture avec du SFB pour retirer la trypsine contenue dans le milieu, centrifugées pendant 8 minutes à 300g et resuspendues dans 1 ml de paraformaldéhyde à 1% pendant 15 minutes pour les fixer. Ensuite, les cellules ont été centrifugées de nouveau pour retirer le paraformaldéhyde, resuspendues dans 100 l de PBS avec 1% de albumine sérique bovine (BSA) et incubées avec 5 l d'anticorps anti-ICAM (FITC), pendant une heure à la température de 4°C et à l'abri de la lumière. Ensuite, les cellules ont été centrifugées pendant 8 minutes à 300g et resuspendues dans du PBS pour la lecture des échantillons dans un cytomètre de flux FACS CALIBUR (BD), connecté à un ordinateur Apple (Macintosh) utilisant le logiciel Cell QuestPro . Dix mille mille (10,000) événements ont été acquis. Le marquage de l'anticorps isotypique a été utilisé comme témoin négatif pour l'anticorps. Les données générées par le cytomètre ont été analysées à l'aide du logiciel, les valeurs étant exprimées en pourcentage de cellules marquées par l'anticorps, ce qui indique le pourcentage de cellules ayant une expression d'ICAM-1 à la surface, et également l'intensité de fluorescence moyenne de chaque échantillon, qui indique quantitativement l'expression des molécules d'adhésion avant et après le traitement avec le TNF-a et l'échantillon à différentes concentrations.

Les résultats obtenus avec le traitement sont exprimés dans les graphes des Figures 14 et 15. Les cellules ayant été incubées avec la plus forte concentration de l'échantillon seulement (316 g/ml) ont présenté une augmentation de l'expression des molécules d'adhésion ICAM-1 comparé aux cellules ayant été maintenues dans du milieu de culture seulement ; toutefois, cette augmentation ne représentait pas une différence significative (p > 0,05). L'incubation avec le TNF-a a provoqué une augmentation significative (p < 0,001) de l'expression de ces molécules d'adhésion. L'incubation des cellules avec une concentration plus faible de l'échantillon (100 g/ml) était capable d'inhiber partiellement (bien que de manière significative, p < 0,001) l'effet du TNF-a sur l'expression des molécules d'adhésion ICAM-1 dans les cellules HUVEC. Exemple 9 ù Evaluation de l'action préventive et curative sur l'irritation cutanée in vivo Cette étude avait pour but d'évaluer l'extrait de Passiflora alata incorporé dans une formulation cosmétique à différentes concentrations, dans le traitement préventif et curatif de l'irritation cutanée provoquée par l'application d'une agression chimique réalisée dans la zone du pli nasolabial, en utilisant l'échelle de douleur pour l'évaluation subjective. Il est 3 0 connu que l'irritation par une agression chimique est transitoire, mais elle 32 est caractérisée par un processus micro-inflammatoire avec le début de la cascade signalisation de la douleur et de l'irritation (érythème, rougeur). Exemple 9.1 L'échantillon suivant d'extrait de Passiflora alata selon la présente invention a été utilisé: Echantillon C (contenu en flavonoïdes totaux 16,46% et contenu en vitexine-2-o-r 11,87%) Cet extrait a été incorporé dans une formulation cosmétique à des concentrations de 0,25%; 0,4%; 0, 75% et 1%. Les formulations contenant l'extrait ont été comparées les unes aux autres, ainsi qu'au placebo (formulation cosmétique sans le principe actif) et à un témoin positif (cortisone à usage dermatologique). La formulation est trouvée dans la Table 6. Table 6 ûFormulation cosmétique Composant Concentration (%) Eau déminéralisée 88,25 Acrylate d'alkyl TR-1 0,20 Ether de dicapryl 2,00 Cyclométhicone D5/D6 VS 7158 4,00 EDTA disodique 0,10 Lactate de cétyl 1,00 Stéarate de glycéryl 0,20 Stéaret-2 2,10 Stéaret-21 0,70 Triéthanolamine 0,10 Butylcarbamate iodopropynyl 0, 20 BHT 0,05 Phénoxyéthanol F 0,90 Gomme de xanthane 0,20 Deux rectangles de 1,0 x 2,0 cm, appelés les sites, ont été marqués avec un stylo chirurgical à gauche et à droite des zones de pli nasolabial15 33 des volontaires, âgés de 20 à 50 ans (moyenne 35 ans) ayant un test de piqure positif dans la zone nasolabiale. L'étude a été planifiée et menée selon les déterminations de la Résolution 196/96 du Conseil National de la Santé (National Health Council), sous les Directives et Standards régulant la Recherche impliquant des Etres Humains (Guidelines and Standards regulating Research involving Human Beings). Le protocole d'étude a été approuvé le 25 Juillet 2006 par le Comité d'Ethique de Recherche du Medical Sciences College de l'Université d'Etat de Campinas, sous l'Opinion Ecrite no. 373/2006. La significativité statistique (p < 0.05) a été vérifiée par une analyse de variance (One-Way ANOVA) suivie d'une comparaison multiple de Tukey. A l'aide d'une pipette médicale, une goutte de solution d'acide lactique à 10% a été appliquée à chaque site. L'irritation a été évaluée immédiatement après l'application d'acide lactique. Ensuite, les produits ont été appliqués de manière aléatoire. Après 5 et 10 minutes d'application, l'irritation provoquée a été évaluée. Le protocole a pour but d'évaluer l'effet curatif. Pour l'effet préventif, l'application a été réalisée pendant 3 jours consécutifs, deux fois par jour. Le quatrième jour, le produit a été appliqué et, après 30 minutes, l'agression chimique a été réalisée en utilisant une goutte d'acide lactique à 10% sur chaque site. L'irritation a été évaluée immédiatement après application de l'acide lactique, après 5 minutes, et après 10 minutes. Une échelle de quantification numérique a été utilisée pour évaluer 25 l'irritation en termes d'intensité de la douleur et de sévérité sur une échelle de 0 (absence de douleur et d'irritation) à 10 (douleur et irritation intenses). Les résultats de l'effet curatif et préventif du traitement sont exprimés dans les graphes des Figures 16 et 17, respectivement. Pour l'effet curatif, toutes les formulations cosmétiques contenant 30 l'échantillon C ont montré les mêmes performances que le corticoïde commercial à usage topique (p > 0,05). La formulation placebo était 34 significativement plus faible que le corticoïde et que toutes les formulations contenant l'extrait test (p < 0,05). Ces données montrent que les formulations cosmétiques contenant des extraits de Passiflora alata à n'importe laquelle des concentrations testées sont efficaces pour réduire la sensation d'inconfort (douleur, irritation, démangeaison). Leur action ne diffère pas de manière significative de celle présentée par le corticoïde à usage topique et est supérieure à celle de la formulation placebo. En conséquence, les principes actifs présents dans l'extrait de Passiflora alata sont responsables de la performance observées pour ces formulations cosmétiques vis-à-vis de la réduction de l'irritation et de la douleur. Pour l'effet préventif, toutes les formulations cosmétiques contenant l'échantillon C ont montré une réduction de l'intensité de la douleur de l'irritation. Ces effets étaient essentiellement identiques à ceux observés pour le corticoïde à usage topique utilisé dans l'étude.

La formulation placebo est significativement différente du corticoïde (p < 0.05), confirmant que l'efficacité dans la prévention de la douleur et de l'irritation des formulations cosmétiques contenant l'extrait de Passiflora alata est due à la présence de l'échantillon C dans celles-ci.20

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la préparation d'un extrait végétal de Passiflora alata, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de: a) soumettre des feuilles de la plante Passiflora alata à une extraction à l'eau pour obtenir un extrait aqueux; b) soumettre l'extrait aqueux obtenu en (a) à au moins une élution avec une solution hydro-alcoolique dans une colonne de chromatographie remplie d'une résine spécifique ; 1 o c) concentrer et sécher par pulvérisation l'extrait obtenu en (b).

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'entre les étapes (b) et (c) il comprend en outre l'étape de: - resuspendre le produit obtenu en (b) dans de l'éthanol chaud et ensuite refroidir. 15

3. Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend un extrait végétal de l'espèce Passiflora alata obtenu par un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 et 2.

4. Composition cosmétique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition anti-âge ou antirides. 20

5. Composition cosmétique selon la revendication 3 ou 4 caractérisée en ce que l'extrait végétal de Passiflora alata est présent en une quantité de 0,25% à 1,0%, en poids, par rapport au poids total de la composition.

6. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle 25 comprend, comme ingrédient actif anti-inflammatoire, un extrait végétal de l'espèce Passiflora alata obtenu par un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 et 2.- 36 -

7. Composition pharmaceutique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition pour administration topique.

8. Composition pharmaceutique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition pour administration orale.

9. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce l'extrait végétal de Passiflora alata est présent en une quantité de 0,25% à 1,0%, en poids, par rapport au poids total de la composition. l 0

10. Utilisation d'un extrait végétal de Passiflora alata dans des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, caractérisée en ce ledit extrait végétal de Passiflora alata est obtenu par un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 et 2.