FR2916367A1

FR2916367A1 - Immobilizing proteins on a microarray of electrodes comprises electrodepositing a conductive hydrophobic polymer on the electrodes and immobilizing the proteins by hydrophobic interaction

Info

Publication number: FR2916367A1
Application number: FR0703722A
Authority: FR
Inventors: Cavalier Frederic Revol; Marc Block; Herve Guillou
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Joseph Fourier Grenoble 1; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2007-05-25
Filing date: 2007-05-25
Publication date: 2008-11-28
Anticipated expiration: 2027-05-25
Also published as: WO2009004142A3; FR2916367B1; WO2009004142A2; WO2009004142A8

Abstract

Immobilizing protein molecules on a microsystem comprising an array of electrodes on a substrate comprises contacting the electrodes with an electrolyte containing a monomer so that a layer of electronically conductive hydrophobic polymer is electrodeposited on the electrodes, and contacting the polymer layer with a protein-containing medium so that the protein molecules are immobilized on the array by hydrophobic interaction. An independent claim is also included for a protein microarray comprising an array of electrodes that cover a substrate and are overlaid with a hydrophobic conductive polymer layer on which protein molecules are adsorbed by hydrophobic interaction.

Description

PROCEDE DE FIXATION SUR UN MICROSYSTEME DE COMPOSES A LIAISONSMETHOD FOR FIXING ON A MICROSYSTEM OF BONDED COMPOUNDS

PEPTIDIQUES, TELS QUE DES PROTEINES, ET MICROSYSTEME INCORPORANT CES COMPOSES. PEPTIDIQUES, SUCH AS PROTEINS, AND MICROSYSTEM INCORPORATING THESE COMPOUNDS.

La présente invention concerne un procédé de fixation d'un ou plusieurs composé(s) à liaisons peptidiques, tels que des protéines, sur un microsystème de type comportant un réseau d'électrodes recouvrant un substrat, et un tel microsystème incorporant ces composés. L'invention s'applique notamment à la fabrication de biopuces à réseaux micrométriques de protéines multiples. The present invention relates to a method for binding one or more peptide-bonded compound (s), such as proteins, to a microsystem of a type comprising an array of electrodes covering a substrate, and such a microsystem incorporating these compounds. The invention is particularly applicable to the fabrication of microarray micrometric networks of multiple proteins.

De manière connue, les microsystèmes à réseaux de protéines adsorbées à leur surface, parfois appelés puces à protéines lorsqu'ils atteignent une miniaturisation submillimétrique, sont à la base de nombreux tests de détection de composés biochimiques divers à l'aide d'anticorps, avec un vaste champ d'application comme par exemple les dosages enzymatiques dans le domaine du diagnostic médical et, plus récemment, du suivi alimentaire. On a ainsi réalisé la structuration de protéines sur des substrats solides, pour développer à leur surface des motifs composés d'une alternance de protéines et de zones dépourvues de protéines. Pour ces tests en phase solide, la miniaturisation a permis des économies d'échelle importantes et une diminution sensible des temps de mise en oeuvre. Ces réseaux de protéines peuvent être par exemple utilisés en recherche fondamentale dans l'analyse haut débit des interactions protéines/protéines. Ces dernières années, la réalisation de réseaux micrométriques de protéines (i.e. à l'échelle cellulaire et subcellulaire) a permis de réaliser des zones adhésives et antiadhésives pour les cellules biologiques qui imposent des contraintes mécaniques modifiant considérablement la physiologie de ces dernières (voir en particulier l'article de Didier Falconnet et al., Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays, Biomaterials 27 (2006) 3044-3063). Des résultats pionniers dans ce domaine ont été obtenus principalement par les groupes de recherche de Donald lngber et Georges Whitesides, montrant que la géométrie contrôle par exemple la surface ou la mort cellulaire programmée, ainsi que la prolifération cellulaire. Encore plus récemment, des travaux ont montré que la géométrie imposée par le substrat contrôlait l'orientation de la division cellulaire (voir en particulier l'article de Manuel Thery et al., the extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis, Nature Cell Biology, vol. 7, n 10, octobre 2005) ainsi que l'extension de lamellipodes, suggérant un rôle majeur des tensions mécaniques dans le contrôle de la migration cellulaire orientée. In a known manner, microsystems with networks of proteins adsorbed on their surface, sometimes called protein chips when they reach submillimetric miniaturization, are at the basis of numerous tests for the detection of various biochemical compounds using antibodies, with a wide field of application such as enzymatic assays in the field of medical diagnosis and, more recently, food monitoring. Thus structuring of proteins on solid substrates has been carried out to develop on their surface motifs composed of an alternation of proteins and zones devoid of proteins. For these solid phase tests, miniaturization has led to significant economies of scale and a significant reduction in implementation time. These protein networks can be used for example in basic research in high-throughput analysis of protein / protein interactions. In recent years, the realization of micrometric networks of proteins (ie at the cellular and subcellular level) has made it possible to produce adhesive and non-stick areas for biological cells that impose mechanical constraints that considerably modify the physiology of the latter (see in particular the article by Didier Falconnet et al., Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays, Biomaterials 27 (2006) 3044-3063). Pioneering results in this field have been obtained mainly by the Donald lngber and Georges Whitesides research groups, showing that geometry controls, for example, surface or programmed cell death, as well as cell proliferation. Even more recently, studies have shown that the geometry imposed by the substrate controls the orientation of cell division (see in particular the article by Manuel Thery et al., The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis, Nature Cell Biology, vol 7, n 10, October 2005) as well as the extension of lamellipodia, suggesting a major role of mechanical strains in the control of directed cell migration.

La réalisation de surfaces microstructurées fait principalement appel à deux techniques qui sont basées toutes deux sur la photolithographie, et qui comprennent la photolithographie dure et la photolithographie molle. The realization of microstructured surfaces mainly involves two techniques which are both based on photolithography, and which include hard photolithography and soft photolithography.

Dans la photolithographie dure, la structuration de la surface est réalisée par irradiation ultraviolette d'une couche de résine photosensible, mise en oeuvre à travers un masque qui reproduit le ou les motifs désirés. Cette irradiation altère chimiquement la résine, qui peut alors être sélectivement solubilisée par des solutions alcalines. Un inconvénient majeur de cette méthode est que les réactifs standards utilisés sont généralement toxiques et dénaturent ainsi les biomolécules. Dans la photolithographie molle, le groupe de recherche de Georges Whitesides a utilisé des surfaces microstructurées à base de PDMS (polydiméthylsiloxane), pour générer la structuration de molécules organiques adsorbées sur un substrat solide. On réalise dans ce cas des transferts de contact, des molécules d'intérêt du tampon de PDMS vers la surface, uniquement sur les surfaces en contact. Cette technique de micro-impression est bien adaptée à la structuration de biomolécules et permet de structurer des surfaces non planes. Les tampons de PDMS peuvent être gravés pour former des micro-canaux permettant d'amener des fluides sur des zones définies du substrat (voir l'article de Daniel T. Chiu et al., Patterned deposition of cells and proteins onto surfaces by using three-dimensional microfluidic systems, PNAS, 14 mars 2000, vol. 97, n 6, 2408-2413). Cette technique permet de réaliser sur le substrat des pistes formées de différentes protéines. In hard photolithography, the structuring of the surface is carried out by ultraviolet irradiation of a layer of photosensitive resin, implemented through a mask that reproduces the desired pattern or patterns. This irradiation chemically impairs the resin, which can then be selectively solubilized by alkaline solutions. A major disadvantage of this method is that the standard reagents used are generally toxic and thus denature biomolecules. In soft photolithography, Georges Whitesides' research group used microstructured surfaces based on PDMS (polydimethylsiloxane), to generate the structuring of organic molecules adsorbed on a solid substrate. In this case, contact transfers, molecules of interest of the PDMS buffer to the surface are made only on the surfaces in contact. This micro-printing technique is well suited to the structuring of biomolecules and makes it possible to structure non-planar surfaces. PDMS buffers can be etched to form micro-channels for delivering fluids to defined areas of the substrate (see the article by Daniel T. Chiu et al., Patterned deposition of cells and proteins on surfaces by using three -dimensional microfluidic systems, PNAS, March 14, 2000, vol 97, No. 6, 2408-2413). This technique makes it possible to produce on the substrate tracks formed of different proteins.

La fixation d'espèces biologiques via des polymères conducteurs électroniques ( PCE en abrégé en anglais) est une technique utilisée depuis plusieurs années. Par exemple, la fixation d'ADN sur les électrodes d'une biopuce peut être obtenue par la polymérisation électrochimique d'un monomère de pyrrole modifié. L'intérêt d'utiliser un polymère conducteurä tel que le polypyrrole, un polymère du ferrocène ou la polyaniline, est de pouvoir le déposer facilement par application d'un potentiel électrique sur une électrode métallique. Cette méthode permet de choisir une ou plusieurs électrodes de fixation parmi toutes les électrodes présentes sur le substrat de la biopuce (voir le document WO-A-94/22889, qui décrit la chimie du pyrrole permettant la fixation covalente d'un brin d'ADN sur le pyrrole). Avec cette rnéthode, il est nécessaire d'assurer la liaison chimique du composé biologique avec le monomère conducteur, avant polymérisation. Le document FR-A-2 784 466 décrit un autre procédé de fixation via un polymère conducteur d'une sonde chimique ou biologique, telle qu'un brin d'ADN, sur un microsystème de type à micro-cuvettes pourvues d'électrodes. Ce procédé consiste essentiellement à : -synthétiser un premier composé organique comprenant une première fonction d'accrochage avec ces électrodes qui est constituée d'un monomère conducteur, tel que du pyrrole, et une seconde fonction d'accrochage avec un second composé organique, - synthétiser ce second composé comprenant une fonction d'accrochage couplée à celle du premier composé et incluant un réactif, puis - fixer sur ces électrodes le premier composé via sa première fonction d'accrochage et placer le second composé dans chaque micro-cuvette pour y obtenir les sondes précitées fixées aux électrodes par le couplage précité de ces fonctions d'accrochage. The fixation of biological species via electronic conductive polymers (abbreviated PCE) has been used for several years. For example, the attachment of DNA to the electrodes of a biochip can be achieved by the electrochemical polymerization of a modified pyrrole monomer. The advantage of using a conductive polymer such as polypyrrole, a ferrocene polymer or polyaniline, is to be able to easily deposit it by application of an electric potential on a metal electrode. This method makes it possible to choose one or more fixation electrodes among all the electrodes present on the substrate of the biochip (see the document WO-A-94/22889, which describes the chemistry of pyrrole allowing the covalent attachment of a strand of DNA on pyrrole). With this method, it is necessary to ensure the chemical bond of the biological compound with the conductive monomer, before polymerization. FR-A-2 784 466 discloses another method of attachment via a conductive polymer of a chemical or biological probe, such as a DNA strand, to a micro-cup type microsystem provided with electrodes. This method essentially consists of: synthesizing a first organic compound comprising a first attachment function with these electrodes which consists of a conductive monomer, such as pyrrole, and a second attachment function with a second organic compound; synthesizing this second compound comprising an attachment function coupled to that of the first compound and including a reagent, then - fix on these electrodes the first compound via its first attachment function and place the second compound in each microcuvette to obtain there the aforementioned probes fixed to the electrodes by the aforementioned coupling of these hooking functions.

On notera que ces méthodes utilisent des composés que l'on vient modifier chimiquement pour leur associer un monomère conducteur avant la polymérisation, ce qui permet de fixer par des liaisons covalentes les composés sur le polymère conducteur et ainsi d'assurer une quantification satisfaisante des composés fixés sur une surface donnée. Un inconvénient majeur de ces procédés de fixation connus via des polymères conducteurs est que la synthèse chimique utilisée pour assurer la liaison directe ou indirecte entre un composé biologique et le monomère est longue, difficile et coûteuse. Dès lors que l'on veut déposer plusieurs espèces biologiques différentes sur une biopuce, le coût de ces étapes de préparation devient ainsi très important. De plus, cette technique est utilisable pour des brins d'ADN chimiquement stables et supportant les diverses étapes de la synthèse chimique, mais d'autres composés biologiques beaucoup plus fragiles comme les protéines présentent une stabilité souvent peu compatible avec les étapes chimiques nécessaires à leur fixation sur des monomères conducteurs. It will be noted that these methods use compounds that are chemically modified to associate them with a conductive monomer before the polymerization, which makes it possible to bind the compounds to the conductive polymer by covalent bonds and thus to ensure a satisfactory quantification of the compounds fixed on a given surface. A major disadvantage of these known attachment methods via conductive polymers is that the chemical synthesis used to provide the direct or indirect bond between a biological compound and the monomer is long, difficult and expensive. Since we want to deposit several different biological species on a biochip, the cost of these preparation steps becomes very important. In addition, this technique can be used for chemically stable DNA strands supporting the various stages of chemical synthesis, but other much more fragile biological compounds such as proteins have stability that is often not very compatible with the chemical steps required for their preparation. fixation on conductive monomers.

Lorsque l'on veut s'affranchir de ces étapes de synthèse chimique, on peut utiliser de façon connue un robot muni de têtes piézoelectriques, qui délivre des microgouttes de solutions protéiques à des emplacements précis du microsystème (voir l'article précité de Daniel T. Chiu et al.). On utilise par exemple un polymère tel que la polylysine qui adsorbe efficacement les composés biologiques par des liaisons électrostatiques, ou bien un silane bifonctionnel ou hydrophobe reliant la protéine à fixer au substrat. Les spots ou plots déposés présentent en général une dimension caractéristique allant de 30 à 50 pm. La méthode séquentielle du dépôt de microgouttes ne permet pas de réaliser rapidement des structurations sur des surfaces étendues. L'utilisation des tampons de PDMS dans la technique de lithographie molle décrite ci-dessus permet d'obtenir des plots de petites dimensions. Néanmoins, un inconvénient de cette technique est que si l'on veut déposer plusieurs composés biologiques différents à la surface du substrat, on doit utiliser différents tampons à aligner les uns par rapport aux autres. Bien que la maîtrise précise de cet alignement dépende essentiellement de la taille des plots et de leur espacement, il apparaît que les repositionnements de tampons inférieurs à une vingtaine de microns sont difficilement maîtrisables lors des transferts de contact avec cette technique de lithographie molle. En effet, la précision de l'alignement de ces tampons est insuffisante pour assurer un motif précis sur des surfaces macroscopiques de dimensions millimétriques, surfaces compatibles avec l'analyse à haut débit d'un grand nombre échantillons, ce qui constitue un obstacle technologique important pour la multi-structuration ou multipatterning des protéines en réseaux. Dans l'autre utilisation précitée des tampons de PDMS pour créer des micro-canaux pour les solutions protéiques, il apparaît que la taille des motifs excède largement celle des cellules. When it is desired to overcome these chemical synthesis steps, it is possible to use, in a known manner, a robot equipped with piezoelectric heads, which delivers microdroplets of protein solutions at precise locations of the microsystem (see the aforementioned article by Daniel T Chiu et al.). For example, a polymer such as polylysine is used which effectively adsorbs biological compounds by electrostatic bonds, or a bifunctional or hydrophobic silane linking the protein to be fixed to the substrate. The deposited spots or spots generally have a characteristic dimension ranging from 30 to 50 μm. The sequential method of deposition of microdroplets does not allow for rapid structuring on large surfaces. The use of PDMS buffers in the soft lithography technique described above makes it possible to obtain small pads. Nevertheless, a disadvantage of this technique is that if one wants to deposit several different biological compounds on the surface of the substrate, one must use different buffers to align with each other. Although the precise control of this alignment depends essentially on the size of the pads and their spacing, it appears that the repositioning of buffers less than twenty microns are difficult to control during contact transfers with this soft lithography technique. Indeed, the accuracy of the alignment of these buffers is insufficient to ensure a precise pattern on macroscopic surfaces of millimeter dimensions, surfaces compatible with the high-speed analysis of a large number of samples, which constitutes a significant technological obstacle for multi-structuring or multipatterning proteins in networks. In the aforementioned other use of PDMS buffers for creating micro-channels for protein solutions, it appears that the size of the patterns greatly exceeds that of the cells.

Quant à la lithographie dure, elle présente la précision requise mais, comme on l'a indiqué ci-dessus, cette technique fait appel à une réaction chimique indésirable lors de la solubilisation des zones de résine photo-activée qui est incompatible avec les fonctions biologiques des protéines préalablement déposées sur le substrat. As for hard lithography, it has the required precision but, as indicated above, this technique uses an undesirable chemical reaction during the solubilization of the photoactivated resin zones which is incompatible with the biological functions. proteins previously deposited on the substrate.

Un but de la présente invention est de proposer un procédé de fixation d'un ou plusieurs composé(s) à liaisons peptidiques, tels que des protéines, sur un microsystème comportant un réseau d'électrodes recouvrant un substrat, qui permette de remédier aux inconvénients précités. An object of the present invention is to propose a process for fixing one or more peptide-bonded compound (s), such as proteins, on a microsystem comprising an array of electrodes covering a substrate, which makes it possible to remedy the disadvantages supra.

A cet effet, le procédé de fixation selon l'invention comprend la séquence d'étapes suivantes: a) un dépôt électrolytique sur l'une au moins de ces électrodes d'une couche polymérique à base d'au moins un polymère conducteur électronique de type hydrophobe, via une mise en contact de la ou des électrode(s) avec un électrolyte comprenant un monomère à polymériser, puis b) une mise en contact de la couche polymérique ainsi obtenue avec un milieu peptidique contenant le(s) composé(s) à fixer, pour immobiliser ce(s) dernier(s) sur le réseau essentiellement par des liaisons hydrophobes. For this purpose, the fixing method according to the invention comprises the following sequence of steps: a) electrolytic deposition on at least one of these electrodes of a polymer layer based on at least one electronically conductive polymer of hydrophobic type, by bringing the electrode (s) into contact with an electrolyte comprising a monomer to be polymerized, and then (b) contacting the polymeric layer thus obtained with a peptide medium containing the compound (s) ) to fix, to immobilize the latter (s) on the network essentially by hydrophobic bonds.

On notera que ce procédé de fixation selon l'invention est caractérisé par la fixation directe desdits composés à au moins un polymère conducteur, sans étape de réaction chimique de ces composés avec le monomère conducteur à polymériser, contrairement à l'état de l'art précité, et que la mise en oeuvre successive de plusieurs séquences de ces deux étapes a) et b) permet d'assurer la réalisation du réseau à l'échelle micrométrique. Avantageusement, on répète cette séquence d'étapes a) et b) autant de fois qu'il y a de composés différents à fixer sur les électrodes du réseau, tels que des protéines multiples. It will be noted that this fixing method according to the invention is characterized by the direct attachment of said compounds to at least one conductive polymer, without a step of chemical reaction of these compounds with the conductive monomer to be polymerized, contrary to the state of the art. above, and that the successive implementation of several sequences of these two steps a) and b) ensures the realization of the network at the micrometer scale. Advantageously, this sequence of steps a) and b) is repeated as many times as there are different compounds to be fixed on the electrodes of the network, such as multiple proteins.

A titre de polymère conducteur hydrophobe utilisable dans cette étape a), on peut citer tout homopolymère ou copolymère obtenu par polymérisation électrochimique d'un monomère conducteur hydrophobe ou de plusieurs comonomères dont l'un au moins est conducteur et hydrophobe, respectivement. On peut par exemple citer le monomère 1-n-octylpyrrole, le 3- 2 0 heptylpyrrole ou le 3-méthylpyrrole. En variante, on peut utiliser un monomère autre que le pyrrole, tel que le thiophène ou l'aniline. De préférence, le (co)monomère conducteur hydrophobe est constitué d'un pyrrole et, à titre encore plus préférentiel, ledit polymère conducteur est constitué d'un polypyrrole. 25 Selon une autre caractéristique de l'invention, l'on immobilise le(s)dit(s) composé(s) à l'étape b) par adsorption non spécifique, en immergeant la ou les électrode(s) recouverte(s) de ladite couche polymérique hydrophobe dans ledit milieu, tel qu'une solution protéinique, pour former un film à base de ce(s) composé(s) qui recouvre ladite couche. 30 On notera que, malgré l'énergie moindre qui caractérise les liaisons hydrophobes entre les composés physio-adsorbés par le procédé de l'invention et lesdites couches polymériques en comparaison des liaisons covalentes mises en jeu dans l'art antérieur, la fixation des composés par ces liaisons non covalentes implique un coût d'industrialisation du microsystème obtenu qui est nettement inférieur au coût souvent rédhibitoire lié à la fixation de ces composés par des liaisons covalentes du fait de la synthèse et/ou des modifications chimiques requises. Grâce au procédé selon l'invention, on peut étudier des systèmes biologiques complexes tels que des cellules, en réalisant des réseaux micrométriques contenant un arrangement de protéines multiples à l'échelle subcellulaire. En effet, la structuration à l'échelle micrométrique de réseaux à plusieurs protéines permet d'introduire au sein d'une même cellule une asymétrie au niveau des structures adhésives et la ségrégation spatiale de récepteurs engagés sur le substrat. Cette ségrégation permet d'analyser les propriétés des différents récepteurs de l'adhérence cellulaire. On notera également qu'une telle résolution n'est pas obtenue 15 avec les procédés de fixation connus de protéines sur des microsystèmes. As a hydrophobic conductive polymer that may be used in this step a), mention may be made of any homopolymer or copolymer obtained by electrochemical polymerization of a hydrophobic conductive monomer or of several comonomers, at least one of which is conductive and hydrophobic, respectively. For example, the monomer 1-n-octylpyrrole, 3-heptylpyrrole or 3-methylpyrrole may be mentioned. Alternatively, a monomer other than pyrrole, such as thiophene or aniline, may be used. Preferably, the hydrophobic conductive (co) monomer consists of a pyrrole and, even more preferably, said conductive polymer consists of a polypyrrole. According to another characteristic of the invention, the said compound (s) in step b) is immobilized by non-specific adsorption, by immersing the coated electrode (s). said hydrophobic polymeric layer in said medium, such as a protein solution, for forming a film based on said compound (s) which overlies said layer. It will be noted that, despite the lower energy which characterizes the hydrophobic bonds between the compounds physio-adsorbed by the process of the invention and said polymer layers in comparison with the covalent bonds used in the prior art, the binding of the compounds by these non-covalent bonds implies a cost of industrialization of the microsystem obtained which is significantly lower than the often prohibitive cost related to the fixation of these compounds by covalent bonds due to the synthesis and / or chemical modifications required. Thanks to the method according to the invention, one can study complex biological systems such as cells, realizing micrometric networks containing a multiple protein arrangement at the subcellular scale. In fact, the structuring at the micrometric scale of networks with several proteins makes it possible to introduce within the same cell an asymmetry in the adhesive structures and the spatial segregation of receptors engaged on the substrate. This segregation makes it possible to analyze the properties of the different receptors of cell adhesion. It will also be appreciated that such resolution is not achieved with known protein binding methods on microsystems.

Selon un autre aspect de l'invention, les plots ou spots incluant lesdits composés sont fabriqués collectivement par les techniques de la micro-fabrication, en une seule étape de lithographie, aucun désalignement 20 n'étant possible entre les différents plots du microsystème et seule la résolution technologique permettant de définir la taille et l'espacement entre les plots du réseau. On notera en outre que les réseaux à protéines multiples qui peuvent être obtenus par le procédé de l'invention (la séparation spatiale des 25 protéines étant réalisée à l'étape du dépôt électrochimique) constituent un outil de choix pour étudier la signalisation croisée entre récepteurs, notamment. Celle-ci peut être générée par des interactions latérales directes des récepteurs au sein de superstructures moléculaires, ou bien sur des récepteurs spatialement distants. En outre, la répartition asymétrique des 30 récepteurs est un mécanisme majeur par lequel la cellule va se polariser, i.e. adopter une morphologie et une architecture interne elles-mêmes asymétriques. Cette polarisation est le plus souvent le préalable à la différenciation cellulaire, qui peut être contrôlée par la symétrie du substrat en ingénierie tissulaire. According to another aspect of the invention, the pads or spots including said compounds are manufactured collectively by micro-fabrication techniques, in a single lithography step, no misalignment being possible between the different pads of the microsystem and alone. the technological resolution to define the size and spacing between the network nodes. It should further be noted that the multiprotein networks that can be obtained by the method of the invention (the spatial separation of the proteins being performed at the electrochemical deposition step) are a tool of choice for studying cross-signaling between receptors. , especially. This can be generated by direct lateral interactions of receptors within molecular superstructures, or on spatially distant receptors. In addition, the asymmetric distribution of the receptors is a major mechanism by which the cell will polarize, i.e. adopt a morphology and internal architecture themselves asymmetrical. This polarization is most often the prerequisite for cell differentiation, which can be controlled by the symmetry of the substrate in tissue engineering.

A titre de substrat utilisable pour fabriquer le microsystème selon l'invention, on peut citer tout substrat minéral ou organique, biocompatible et pouvant être de type actif ou passif (i.e. avec ou sans système électronique intégré, respectivement). Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention concernant plus particulièrement la fixation de protéines à titre de composés à liaisons peptidiques, la surface utile des plots du réseau, i.e. des électrodes recevant ces protéines, présente une dimension caractéristique inférieure à 10 pm, le réseau ainsi obtenu étant compatible avec une fixation de cellules biologiques entre les surfaces utiles des électrodes recevant ces protéines. Selon une autre caractéristique de l'invention, le procédé de fixation peut comprendre en outre, antérieurement à l'étape a) précitée, un dépôt d'une couche isolante de passivation entre les électrodes du réseau et en recouvrement partiel sur ces dernières, la couche de passivation étant ouverte sur chaque électrode de sorte à définir la surface utile de celle-ci. De préférence, ladite couche de passivation est à base d'un polymère photosensible, tel qu'un polyimide, ou bien à base d'un nitrure de silicium ou d'un oxyde de silicium (tout matériau électriquement isolant et usinable à l'échelle du micromètre peut être utilisé). As a substrate that can be used to manufacture the microsystem according to the invention, mention may be made of any mineral or organic substrate that is biocompatible and can be of the active or passive type (i.e. with or without an integrated electronic system, respectively). According to another advantageous characteristic of the invention relating more particularly to the attachment of proteins as peptide-bonded compounds, the useful surface of the lattice pads, ie the electrodes receiving these proteins, has a characteristic dimension of less than 10 μm, the lattice thus obtained being compatible with binding of biological cells between the useful surfaces of the electrodes receiving these proteins. According to another characteristic of the invention, the fixing method may further comprise, prior to step a), a deposition of an insulating layer of passivation between the electrodes of the network and partial recovery on the latter, the passivation layer being open on each electrode so as to define the useful surface thereof. Preferably, said passivation layer is based on a photosensitive polymer, such as a polyimide, or based on a silicon nitride or a silicon oxide (any electrically insulating and machinable material on a scale micrometer can be used).

Selon une autre caractéristique de l'invention, l'on met en oeuvre l'étape a) précitée du procédé de fixation en appliquant un potentiel électrique adapté à la ou aux électrode(s) se trouvant à l'état immergé dans un bain à base dudit électrolyte en solution, pour l'obtention de ladite couche polymérique hydrophobe. Avantageusement, ledit bain peut comprendre en outre au moins un sel électrolytique pour assurer le transport ionique dans ladite solution en cours de dépôt dudit polymère. Pour cet électrolyte en solution, on peut utiliser tout solvant permettant, d'une part, la solubilisation du monomère conducteur hydrophobe et, d'autre part, ne perturbant pas les composés déposés à la surface du microsystème. On peut par exemple utiliser à titre de solvant de l'eau, de l'éthanol ou bien un mélange des deux. A titre de sels électrolytiques, on peut citer les sels classiquement utilisés en électrochimie comme par exemple ceux de formule KCI, LiCIO4, NaCI et NaSO4, de concentration avantageusement comprise entre 10-3 M et 10-1 M. Selon une autre caractéristique de l'invention, l'on peut mettre en oeuvre l'étape a) précitée en connectant cette ou ces électrode(s) immergée(s) à une électrode de travail d'un potentiostat, lequel est en outre pourvu d'une électrode de référence et d'une contre-électrode qui sont toutes deux également immergées dans ledit bain, via au moins une prise de contact électrique émergeant dudit bain et préalablement formée sur ledit substrat, qui relie la ou les électrode(s) immergée(s) à l'électrode de travail du potentiostat. According to another characteristic of the invention, the aforementioned step a) of the fixing method is carried out by applying an electric potential adapted to the electrode (s) in the submerged state in a bath. base of said electrolyte in solution, for obtaining said hydrophobic polymeric layer. Advantageously, said bath may further comprise at least one electrolytic salt for carrying out the ionic transport in said solution during the deposition of said polymer. For this electrolyte in solution, it is possible to use any solvent allowing, on the one hand, the solubilization of the hydrophobic conductive monomer and, on the other hand, not disturbing the compounds deposited on the surface of the microsystem. For example, water, ethanol or a mixture of both may be used as the solvent. As electrolytic salts, mention may be made of the salts conventionally used in electrochemistry, for example those of formula KCl, LiClO.sub.4, NaCl and NaSO.sub.4, with a concentration of advantageously between 10.sup.-3 M and 10.sup.-1 M. According to another characteristic of the invention, the invention, it is possible to implement the above-mentioned step a) by connecting this or these submerged electrode (s) to a working electrode of a potentiostat, which is further provided with a reference electrode and a counter-electrode which are both also immersed in said bath, via at least one electrical contact emerging from said bath and previously formed on said substrate, which connects the electrode (s) immersed (s) to the working electrode of the potentiostat.

Selon un premier mode de réalisation de l'invention, l'on immerge dans ledit bain ladite électrode de référence et ladite contre-électrode de part et d'autre dudit microsystème. Selon un second mode de réalisation de l'invention, l'on intègre ladite électrode de référence et ladite contre-électrode au substrat du microsystème, préalablement à l'étape a) précitée, ce qui permet d'intégrer directement la cellule électrolytique au microsystème et également de minimiser la quantité d'électrolyte nécessaire à la polymérisation (il suffit en effet que le bain électrolytique recouvre la zone du substrat où sont situées les électrodes à revêtir de la couche polymérique). According to a first embodiment of the invention, said reference electrode and said counter electrode are immersed in said bath on either side of said microsystem. According to a second embodiment of the invention, said reference electrode and said counter-electrode are integrated with the substrate of the microsystem, prior to step a), which makes it possible to directly integrate the electrolytic cell with the microsystem. and also to minimize the amount of electrolyte necessary for the polymerization (it is sufficient for the electrolytic bath to cover the area of the substrate where the electrodes to be coated with the polymeric layer are located).

On notera que l'application d'un potentiel électrique sur une ou plusieurs électrode(s) du substrat permet de choisir le ou les plot(s) sur le(s)quel(s) le polymère conducteur sera déposé et les composés adsorbés. On notera également qu'aucun masquage des plots de fixation n'est nécessaire, puisque c'est l'application d'un potentiel électrique sur les électrodes choisies du microsystème qui va permettre le dépôt localisé dudit polymère conducteur. Note that the application of an electrical potential on one or more electrode (s) of the substrate allows to choose the pad (s) on which (s) the conductive polymer will be deposited and the compounds adsorbed. It will also be noted that no masking of the fixing studs is necessary, since it is the application of an electrical potential on the chosen electrodes of the microsystem which will allow the localized deposition of said conductive polymer.

Selon un exemple particulièrement avantageux de réalisation de l'invention, l'on met en oeuvre cette étape a) simultanément sur un ou plusieurs groupe(s) d'électrodes dudit réseau. Selon cet exemple de l'invention, lors de l'étape de fabrication préalable dudit microsystème, on peut relier ledit ou chaque groupe d'électrodes à une ligne commune de remontée du courant qui est connectée électriquement à ladite ou à chaque prise de contact électrique, en vue de fixer simultanément ladite couche polymérique sur les électrodes du ou de chaque groupe puis lesdits composés sur le réseau, selon un arrangement qui est prédéterminé par la structure du microsystème. En variante selon cet exemple de l'invention, lors de l'étape a), on peut relier les prises de contact électrique, qui sont respectivement connectées aux électrodes immergées du ou de chaque groupe, à une ligne commune de sortie électrique qui est elle-même connectée à l'électrode de travail du potentiostat, en vue de fixer simultanément ladite couche polymérique sur les électrodes du ou de chaque groupe puis lesdits composés sur le réseau, selon un arrangement variable qui est alors indépendant de la structure du microsystème. On notera que cette variante permet de choisir parmi l'ensemble des électrodes présentes sur le substrat, celles correspondant aux plots de composés à fixer, et donc de réaliser par exemple différents réseaux de protéines avec une même biopuce de départ. Toujours en référence audit exemple de l'invention, l'on peut incorporer au substrat du microsystème un circuit microélectronique de multiplexage conçu pour déterminer le(s) groupe(s) d'électrodes destiné(s) à recevoir le potentiel électrique adapté, pour l'obtention de ladite couche polymérique hydrophobe sur chaque électrode dudit ou de chaque groupe. Dans ce cas, l'on peut obtenir simultanément suite à l'étape b) précitée plusieurs arrangements correspondant respectivement à différents composés fixés sur lesdits groupes d'électrodes et formant par exemple autant de biopuces à protéines multiples. 2916367 Il On notera que l'utilisation d'un substrat en silicium permet de réaliser ledit circuit microélectronique de multiplexage, et que l'avantage de ce circuit devient prépondérant dès lors que l'on a plusieurs dizaines de plots (i.e. d'électrodes) à relier ensemble pour l'étape de polymérisation 5 électrochimique. On notera également que le procédé de l'invention permet de réaliser plusieurs réseaux de composés différents en même temps. Comme les techniques de micro-fabrication collectives permettent de réaliser plusieurs puces identiques sur un même substrat, la présente invention permet de 10 déposer le(s) polymère(s) conducteur(s) sur toutes les puces d'un même substrat, dès lors que l'on utilise un substrat en silicium muni d'un multiplexeur. Par la connexion de toutes les électrodes et des puces sur lesquelles on désire déposer ce(s) polymère(s) conducteur(s), on peut ainsi fabriquer simultanément plusieurs centaines de biopuces à protéines. 15 Un rnicrosystème selon l'invention est de type à réseau micrométrique de composés à liaisons peptidiques, tel qu'une biopuce à réseau de protéines multiples, ce microsystème comportant un réseau d'électrodes qui recouvrent un substrat et qui sont au moins en partie 20 surmontées d'une couche polymérique conductrice hydrophobe à laquelle sont fixés lesdits composés. Selon la présente invention, lesdits composés, tels que des protéines, sont fixés par adsorption à la surface de ladite couche essentiellement via des liaisons hydrophobes, et cette fixation est susceptible 25 d'être obtenue par le procédé précité selon l'invention. Parmi les protéines utilisables, on peut notamment citer : - les protéines de la matrice extracellulaire telles que le fibronectine, la vitronectine, les collagènes, les laminines, ainsi que les fragments des protéines précitées ; et 30 - les anticorps monoclonaux (tous les anticorps testés à ce jour ayant gardé leur fonctionnalité). According to a particularly advantageous embodiment of the invention, this step a) is implemented simultaneously on one or more group (s) of electrodes of said network. According to this example of the invention, during the step of prior manufacture of said microsystem, said or each group of electrodes can be connected to a common line of upstream current which is electrically connected to said or each electrical contact , in order to simultaneously fix said polymeric layer on the electrodes of the or each group and then said compounds on the network, in an arrangement that is predetermined by the structure of the microsystem. In a variant according to this example of the invention, during step a), the electrical contact points, which are respectively connected to the submerged electrodes of the or of each group, can be connected to a common electrical output line which is - Even connected to the working electrode of the potentiostat, in order to simultaneously fix said polymer layer on the electrodes of the or each group and then said compounds on the network, in a variable arrangement which is then independent of the structure of the microsystem. It will be noted that this variant makes it possible to choose from among all the electrodes present on the substrate, those corresponding to the pads of compounds to be fixed, and thus to make, for example, different protein networks with the same starting biochip. Still in reference to said example of the invention, a microelectronic multiplexing circuit designed to determine the group (s) of electrodes intended to receive the adapted electrical potential for the purpose of determining the appropriate electrical potential can be incorporated into the microsystem substrate. obtaining said hydrophobic polymeric layer on each electrode of said or each group. In this case, it is possible to obtain simultaneously, following the above-mentioned step b), several arrangements respectively corresponding to different compounds fixed on said electrode groups and forming, for example, as many multi-protein biochips. It will be noted that the use of a silicon substrate makes it possible to carry out said microelectronic multiplexing circuit, and that the advantage of this circuit becomes preponderant since there are several tens of pads (ie electrodes). to be bonded together for the electrochemical polymerization step. It will also be noted that the method of the invention makes it possible to produce several networks of different compounds at the same time. Since collective micro-fabrication techniques make it possible to produce several identical chips on the same substrate, the present invention makes it possible to deposit the polymer (s) conducting on all the chips of the same substrate, since that a silicon substrate with a multiplexer is used. By connecting all the electrodes and chips on which it is desired to deposit the polymer (s) conductor (s), it is thus possible to simultaneously produce several hundred protein biochips. A microsystem according to the invention is of the micrometric array type of peptide bonded compounds, such as a multi-protein array biochip, which microsystem has an array of electrodes which overlie a substrate and which are at least partially surmounted by a hydrophobic conductive polymeric layer to which said compounds are attached. According to the present invention, said compounds, such as proteins, are adsorbed on the surface of said layer essentially via hydrophobic bonds, and this attachment is obtainable by the above method according to the invention. Among the proteins that can be used, mention may be made in particular of: extracellular matrix proteins such as fibronectin, vitronectin, collagens, laminins, as well as the fragments of the abovementioned proteins; and monoclonal antibodies (all antibodies tested to date have retained their functionality).

On notera que la solution utilisée pour ledit milieu peptidique, tel qu'un milieu protéinique, doit être aqueuse et est incompatible avec la présence de détergents. Afin de faciliter le mouillage de la couche polymérique hydrophobe, on peut ajouter 10 % d'éthanol si nécessaire. On utilise de préférence à titre de tampon le PBS ( Phosphate Saline Buffer ou tampon phosphate salé), et les concentrations protéiques utilisées pour le recouvrement de la couche polymérique hydrophobe peuvent varier de 1 pg/ml à 20 pg/ml. Concernant les épaisseurs pouvant être obtenues selon l'invention pour la couche hydrophobe et pour le film protéinique le recouvrant, on notera que les cellules ne ressentent pas le relief du support sur des épaisseurs inférieures ou égales à 50 nm. Les électrodes étant avantageusement constituées de cavités formées dans ladite couche de passivation, le polymère hydrophobe comblera au plus ces cavités. Quant à l'épaisseur du film protéinique déposé, elle peut varier de 5 nm à 10 nm. Les caractéristiques précitées de la présente invention, ainsi que d'autres, seront mieux comprises à la lecture de la description suivante de plusieurs exemples de réalisation de l'invention, donnés à titre illustratif et non limitatif, ladite description étant réalisée en relation avec les dessins joints, parmi lesquels : la figure 1 est une vue schématique de dessus illustrant un microsystème de départ fabriqué par une technique de micro-fabrication et sur les électrodes duquel on se propose de mettre en oeuvre le procédé de fixation selon l'invention, la figure 2 est une vue schématique en coupe de ce microsystème de départ selon le plan II-ll de la figure 1, la figure 3 est une vue schématique en coupe d'un détail de la figure 2, la figure 4 est une vue schématique de côté d'un dispositif 30 pour la mise en oeuvre de la première étape du procédé de fixation selon l'invention, ce dispositif étant appliqué au microsystème de la figure 1, la figure 5 est une vue schématique de dessus du microsystème obtenu à l'issue de cette première étape au moyen du dispositif de la figure 4, la figure 6 est une vue schématique de dessus illustrant la 5 seconde étape du procédé de fixation selon l'invention appliquée au microsystème de la figure 5, la figure 7 est une vue schématique de dessus d'un microsystème obtenu à l'issue de cette seconde étape et pourvu d'un plot de composés fixés au-dessus d'une électrode, 10 la figure 8 est une vue schématique de dessus d'un microsystème obtenu à l'issue d'une pluralité de séquences successives appliquées au microsystème de la figure 1, incluant chacune la mise en oeuvre de ces première et seconde étapes illustrées aux figures 4 et 6, la figure 9 est une vue schématique de dessus d'un premier 15 mode de réalisation selon l'invention pour appliquer simultanément la première étape de la figure 4 à un groupe d'électrodes prédéterminé, et la figure 10 est une vue schématique de dessus d'un second mode de réalisation selon l'invention pour appliquer simultanément la première étape de la figure 4 à un groupe d'électrodes déterminé a posteriori. 20 Comme illustré à la figure 1, on utilise un microsystème de départ 1 qui est destiné à former une biopuce à réseau de protéines multiples et qui comporte initialement, au terme d'une étape préalable de micro-fabrication, un réseau d'électrodes métalliques 2a, 2b sur un substrat ou 25 support 3 (voir figure 2, un nombre réduit d'électrodes 2a, 2b étant représenté pour des raisons de clarté, étant entendu que le microsystème 1 peut en comprendre une multitude). On réalise ces électrodes 2 de manière connue, par exemple via une photolithographie et gravure du métal. On notera que la taille des électrodes 2 et leur espacement sur le substrat 3 ne dépend que de 30 la résolution des techniques de fabrication et peut atteindre avantageusement quelques dixièmes de microns. Les électrodes 2 sont respectivement reliées à des prises de contact électrique 4 par des lignes 5 de remontée du courant. It will be noted that the solution used for said peptide medium, such as a protein medium, must be aqueous and is incompatible with the presence of detergents. In order to facilitate the wetting of the hydrophobic polymeric layer, 10% ethanol may be added if necessary. PBS (Phosphate Saline Buffer or Saline Phosphate Buffer) is preferably used as a buffer, and the protein concentrations used to coat the hydrophobic polymeric layer may range from 1 μg / ml to 20 μg / ml. As regards the thicknesses that can be obtained according to the invention for the hydrophobic layer and for the protein film covering it, it should be noted that the cells do not feel the relief of the support at thicknesses less than or equal to 50 nm. Since the electrodes advantageously consist of cavities formed in said passivation layer, the hydrophobic polymer will fill at most these cavities. As for the thickness of the deposited protein film, it can vary from 5 nm to 10 nm. The aforementioned characteristics of the present invention, as well as others, will be better understood on reading the following description of several exemplary embodiments of the invention, given by way of illustration and not limitation, said description being made in relation to the attached drawings, among which: Figure 1 is a schematic top view illustrating a starting microsystem manufactured by a micro-manufacturing technique and on the electrodes of which it is proposed to implement the fixing method according to the invention, the FIG. 2 is a diagrammatic sectional view of this starting microsystem according to the plane II-II of FIG. 1, FIG. 3 is a schematic sectional view of a detail of FIG. 2, FIG. 4 is a schematic view of FIG. side of a device 30 for carrying out the first step of the fixing method according to the invention, this device being applied to the microsystem of FIG. 1, FIG. 1 is a schematic top view of the microsystem obtained at the end of this first step by means of the device of FIG. 4; FIG. 6 is a diagrammatic view from above illustrating the second step of the fixing method according to the invention applied to the FIG. 7 is a diagrammatic view from above of a microsystem obtained at the end of this second step and provided with a pad of compounds fixed above an electrode, FIG. a schematic view from above of a microsystem obtained at the end of a plurality of successive sequences applied to the microsystem of FIG. 1, each including the implementation of these first and second steps illustrated in FIGS. 4 and 6, FIG. 9 is a schematic top view of a first embodiment according to the invention for simultaneously applying the first step of FIG. 4 to a predetermined electrode group, and FIG. 10 is a schematic view. FIG. 1 is a top view of a second embodiment according to the invention for simultaneously applying the first step of FIG. 4 to a group of electrodes determined a posteriori. As illustrated in FIG. 1, a starting microsystem 1 is used which is intended to form a multi-protein array biochip and which initially comprises, at the end of a prior micro-fabrication step, a network of metal electrodes. 2a, 2b on a substrate or support 3 (see FIG. 2, a reduced number of electrodes 2a, 2b being shown for the sake of clarity, it being understood that the microsystem 1 can include a multitude thereof). These electrodes 2 are produced in a known manner, for example by photolithography and etching of the metal. It should be noted that the size of the electrodes 2 and their spacing on the substrate 3 depends only on the resolution of the manufacturing techniques and can advantageously reach a few tenths of a micron. The electrodes 2 are respectively connected to electrical contact points 4 by lines 5 of current rise.

De plus, comme illustré aux figures 1 à 3, on dépose sur ce réseau d'électrodes 2 une couche de passivation isolante 6 que l'on grave partiellement en vue de la première étape du procédé selon l'invention consistant à déposer un polymère conducteur électronique uniquement sur ces électrodes 2a, 2b. Ce dépôt de la couche de passivation 6 permet d'éviter le dépôt de ce polymère conducteur sur la totalité de la connectique métallique incluant notamment les prises 4 et les lignes 5, il permet de définir la surface utile de chaque électrode 2a, 2b destinée à recevoir le polymère conducteur (l'ouverture de la couche de passivation 6 sur chaque électrode 2a, 2b déterminant cette surface utile). Cette couche de passivation 6 peut être réalisée en un polymère photosensible, commepar exemple un polyimide, ou bien en un nitrure de silicium ou un oxyde de silicium. Pour mettre en oeuvre cette première étape selon l'invention, on procède, comme illustré à la figure 4, à un trempage du microsystème 1 de la figure 3 dans une solution électrolytique 7 contenant le monomère conducteur hydrophobe à polymériser, tel que du pyrrole ou un de ses dérivés, et en outre un sel électrolytique (par exemple du perchlorate de lithium) prévu pour assurer le transport ionique dans la solution 7 en cours de dépôt du polymère. On utilise à cet effet un dispositif de dépôt électrochimique 10 constitué d'un potentiostat 11 qui est pourvu d'une borne ou électrode de travail 12 destinée à être connectée à la ou à chaque prise de contact électrique 4 de l'électrode 2a, 2b correspondante du microsystème 1, lorsque cette dernière est immergée dans la solution électrolytique 7. Ce potentiostat 11 est également pourvu, de manière usuelle, d'une électrode de référence 13 et d'une contre-électrode 14 toutes deux destinées à être immergées dans la solution 7 (l'électrode de référence 13 et la contre-électrode 14 sont connectées aux deux autres bornes 13a et 14a du potentiostat 11). Comme cela est visible à la figure 4, le trempage du microsystème 1 dans le bain constitué de la solution 7 est tel que les prises de contact 4 émergent de ce bain pour l'application d'un potentiel électrique déterminé (de 0,8 V à 1,5 V par rapport à la référence, pendant un temps de 1 seconde à 10 secondes) sur l'électrode immergée 2a via l'électrode de travail 12 du potentiostat 11, et que l'électrode de référence 13 et la contre-électrode 14 sont partiellement immergées à proximité immédiate du microsystème 1, pour polymériser par électrolyse le monomère conducteur sur l'électrode 2a. In addition, as illustrated in FIGS. 1 to 3, an insulating passivation layer 6 is deposited on this electrode array 2, which is partially etched for the first step of the method according to the invention of depositing a conductive polymer. electronic only on these electrodes 2a, 2b. This deposition of the passivation layer 6 makes it possible to avoid the deposition of this conductive polymer on the totality of the metallic connectors including in particular the sockets 4 and the lines 5, it makes it possible to define the useful surface of each electrode 2a, 2b intended to receiving the conductive polymer (the opening of the passivation layer 6 on each electrode 2a, 2b determining this useful area). This passivation layer 6 may be made of a photosensitive polymer, for example a polyimide, or of a silicon nitride or a silicon oxide. To carry out this first step according to the invention, the microsystem 1 of FIG. 3 is dipped in an electrolytic solution 7 containing the hydrophobic conductive monomer to be polymerized, such as pyrrole or one of its derivatives, and furthermore an electrolytic salt (for example lithium perchlorate) intended to ensure the ionic transport in the solution 7 during the deposition of the polymer. For this purpose, an electrochemical deposition device 10 consisting of a potentiostat 11 is provided which is provided with a terminal or working electrode 12 intended to be connected to the or each electrical contact 4 of the electrode 2a, 2b. corresponding to the microsystem 1, when the latter is immersed in the electrolytic solution 7. This potentiostat 11 is also provided, in the usual way, a reference electrode 13 and a counter electrode 14 both intended to be immersed in the solution 7 (the reference electrode 13 and the counter-electrode 14 are connected to the two other terminals 13a and 14a of the potentiostat 11). As can be seen in FIG. 4, the soaking of the microsystem 1 in the bath constituted by the solution 7 is such that the contact points 4 emerge from this bath for the application of a determined electrical potential (0.8 V 1.5V relative to the reference, for a time of 1 second to 10 seconds) on the submerged electrode 2a via the working electrode 12 of the potentiostat 11, and that the reference electrode 13 and the counter electrode 14 are partially immersed in the immediate vicinity of the microsystem 1, to electrolytically polymerize the conductive monomer on the electrode 2a.

Comrne illustré à la figure 5, on obtient ainsi, après avoir retiré le microsystème 1 du bain électrolytique puis l'avoir rincé, un dépôt d'une couche polymérique hydrophobe 15 (d'épaisseur comprise entre 100 nm et 1 pm) sur l'électrode 2a ainsi connectée au potentiostat 11. Pour mettre en oeuvre la seconde étape du procédé de fixation selon l'invention, on procède ensuite, comme illustré à la figure 6, à une immersion du microsystème 1 obtenu à la figure 5 dans une solution 16 contenant la protéine que l'on se propose de déposer sur la surface utile ou plot de l'électrode 2a préalablement recouverte de la couche polymérique hydrophobe 15. As illustrated in FIG. 5, after removing the microsystem 1 from the electrolytic bath and then rinsing it, a deposit of a hydrophobic polymeric layer 15 (of thickness between 100 nm and 1 μm) is obtained on the 2a electrode and connected to the potentiostat 11. To implement the second step of the fixing method according to the invention, is then carried out, as illustrated in Figure 6, an immersion of the microsystem 1 obtained in Figure 5 in a solution 16 containing the protein that is proposed to deposit on the useful surface or pad of the electrode 2a previously coated with the hydrophobic polymeric layer 15.

Après rinçage, on obtient le film protéinique 17 illustré à la figure 7 qui recouvre le plot de l'électrode 2a en surmontant la couche polymérique hydrophobe 15 et dans lequel les molécules de la protéine déposée sont fixées par adsorption au polymère conducteur par des liaisons hydrophobes. After rinsing, the protein film 17 illustrated in FIG. 7, which covers the pad of the electrode 2a, is obtained by overcoming the hydrophobic polymeric layer and in which the molecules of the deposited protein are fixed by adsorption to the conductive polymer by hydrophobic bonds. .

En répétant cette séquence d'étapes respectivement destinées à former la couche polymérique 15 et le film protéinique 17, il est possible de déposer autant de protéines différentes qu'on le souhaite sur les plots sélectionnés sur le microsystème 1, comme illustré à la figure 8 où sont représentés à titre d'exemple quatre films 17a-17d de protéines différentes surmontant respectivement quatre électrodes 2a-2d du microsystème 1, formant ainsi une biopuce incorporant différentes protéines. By repeating this sequence of steps respectively intended to form the polymeric layer 15 and the protein film 17, it is possible to deposit as many different proteins as desired on the selected pads on the microsystem 1, as illustrated in FIG. where are shown by way of example four 17a-17d films of different proteins respectively surmounting four electrodes 2a-2d of the microsystem 1, thus forming a biochip incorporating different proteins.

Pour réaliser un réseau de protéines multiples, on peut choisir de déposer la couche polymérique hydrophobe 15 sur plusieurs électrodes 30 2a-2c en même temps. A cet effet, comme illustré à la figure 9, on peut relier lors de l'étape préalable de micro-fabrication ces électrodes 2a- 2c entre elles et à une ligne commune 18 de remontée du courant électrique vers une prise de contact 4, de sorte à appliquer simultanément un même potentiel électrique à ces électrodes 2a-2c via l'électrode de travail 12 du potentiostat 11. En variante, comme illustré à la figure 10, on peut relier les prises de contact 4 respectives des électrodes 2a-2c entre elles par une ligne commune 19 de sortie électrique au moment de procéder à la première étape de dépôt électrolytique, toujours en vue d'appliquer un même potentiel à ces électrodes 2a-2c. Cette variante permet notamment de choisir l'emplacement des plots de protéines à fixer parmi l'ensemble des électrodes présentes sur le substrat 3, et donc de réaliser différents réseaux protéiques avec une même biopuce de départ. To make a network of multiple proteins, one can choose to deposit the hydrophobic polymeric layer 15 on several electrodes 2a-2c at the same time. For this purpose, as illustrated in FIG. 9, it is possible to connect these electrodes 2a-2c to each other at the micro-fabrication stage and to a common line 18 for raising the electrical current to a contact point 4, so as to simultaneously apply the same electrical potential to these electrodes 2a-2c via the working electrode 12 of the potentiostat 11. In a variant, as illustrated in FIG. 10, it is possible to connect the respective contact sockets 4 of the electrodes 2a-2c between they by a common line 19 of electrical output at the time of proceeding to the first electrolytic deposition step, always with a view to applying the same potential to these electrodes 2a-2c. This variant makes it possible in particular to choose the location of the protein pads to be fixed among the set of electrodes present on the substrate 3, and thus to make different protein networks with the same starting biochip.

Exemple de protocole de réalisation d'une biopuce à réseau de protéines multiples : Le protocole de fabrication ci-après d'une biopuce selon l'invention est donné à titre d'exemple. La succession des étapes décrites permet d'obtenir une fixation ( patterning ) de différentes protéines sur la surface de la biopuce. On va décrire les étapes successives aboutissant à la fixation de deux protéines sur la puce. Bien évidemment, si l'on poursuivait les étapes décrites ci-après, il serait possible de fixer plus de deux protéines. La fabrication de la biopuce ayant été décrite ci-dessus en relation avec le microsystème selon l'invention, on a fait figurer dans le tableau 1 ci-après les étapes biologiques utilisées lors de la fonctionnalisation de la puce. Example of a protocol for producing a biochip with a multiple protein network: The following fabrication protocol of a biochip according to the invention is given by way of example. The succession of the steps described makes it possible to obtain a patterning of different proteins on the surface of the biochip. The successive steps leading to the attachment of two proteins on the chip will be described. Of course, if one continued the steps described below, it would be possible to fix more than two proteins. Since the fabrication of the biochip has been described above in relation to the microsystem according to the invention, the biological steps used during the functionalization of the chip are shown in Table 1 below.

Tableau 1 : N ETAPE Produit utilisé Protocole d'utilisation 1 BSA ( Bovin Concentration 2 mg/ml. serum albumine ou Immersion de la puce pendant une Sérum Albumine heure à 37 C. Bovine en français) 2 lavage PBS Concentrations : Na2HPO4 8mM, (tampon phosphate KH2PO4 1,5mM, NaCl 137 mM, KCI 3 salé) mM, pH 7,2 3 Rinçage eau déionisée Jusqu'à résistivité supérieure à 10 MS2 4 Dépôt d'un polypyrrole Concentrations : 20 mM dans 1 (octadécylpyrrole) Perchlorate de lithium aqueux 0,1 M. Dépôt électrochimique potentiostatique 1,2 V / SCE (électrode au calomel saturé) pendant 5 secondes Fixation protéine N 1 1 heure à 37 C PBS solution contenant 10 % d'éthanol. Table 1: N STEP Product used Protocol of use 1 BSA (Bovine Concentration 2 mg / ml, Serum albumin or Immersion of the flea during a Serum Albumin hour at 37 C. Bovine in French) 2 wash PBS Concentrations: Na2HPO4 8mM, ( 1.5mM KH2PO4 phosphate buffer, 137mM NaCl, saline KCl3) mM, pH 7.2 3 Deionized water rinsing To resistivity greater than 10 MS2 4 Polypyrrole deposition Concentrations: 20 mM in 1 (octadecylpyrrole) Perchlorate 0.1 M aqueous lithium. Potentiostech electrostatic 1,2 V / SCE (saturated calomel electrode) for 5 seconds Protein N fixation 1 hour at 37 ° C. PBS solution containing 10% ethanol.

6 3 Lavages PBS 5 minutes 7 BSA (Sérum 1 heure à 37 C Albumine Bovine) 8 Pluronic F127 Solution aqueuse à 4 % (m/v) durée 1 heure et température 37 C 9 3 lavages PBS 5 minutes Rinçage eau déionisée Jusqu'à résistivité supérieure à 10 un 11 Dépôt d'un polypyrrole Concentration : 20 mM dans (octadécylpyrrole) Perchlorate de lithium aqueux 0,1 M. Dépôt électrochimique potentiostatique 1,2 V / SCE pendant 5 secondes 12 Fixation protéine N 2 1 heure à 37 C PBS solution contenant 10 % d'éthanol. 13 3 lavages PBS 5 minutes 14 BSA (Sérum 1 heure à 37 C Albumine Bovine) Pluronic F127 Solution aqueuse à 4 % (m/v) durée 1 heure et température 37 C 16 3 Lavages PBS 5 minutes 17 Rinçage eau déionisée Jusqu'à résistivité supérieure à 10 M. j Dans ce tableau 1, les étapes 4 à 10 et les étapes 11 à 17 5 représentent respectivement une première et une seconde fixation de protéines. 176 3 Washings PBS 5 minutes 7 BSA (Serum 1 hour at 37 C Bovine Albumin) 8 Pluronic F127 4% aqueous solution (m / v) time 1 hour and temperature 37 C 9 3 washes PBS 5 minutes Rinse deionized water resistivity greater than 10 microliters 11 Polypyrrole deposition Concentration: 20 mM in (octadecylpyrrole) 0.1 M aqueous lithium chlaurate 1.2 V electrostatic electrostatic charge / SCE for 5 seconds 12 N 2 protein fixation 1 hour at 37 ° C PBS solution containing 10% ethanol. 13 3 washes PBS 5 minutes 14 BSA (Serum 1 hour at 37 C Bovine Albumin) Pluronic F127 4% aqueous solution (m / v) 1 hour duration and temperature 37 C 16 3 PBS washings 5 minutes 17 Deionized water rinsing resistivity greater than 10 M. In this Table 1, steps 4 to 10 and steps 11 to 17 represent first and second protein binding, respectively. 17

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de fixation d'un ou plusieurs composé(s) à liaisons peptidiques, tels que des protéines, sur un microsystème (1) comportant un réseau d'électrodes (2a-2d) recouvrant un substrat (3), caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'étapes suivantes: a) un dépôt électrolytique sur l'une au moins de ces électrodes d'une couche polymérique (15) à base d'au moins un polymère conducteur électronique de type hydrophobe, via une mise en contact de la ou des électrode(s) avec un électrolyte (7) comprenant un monomère à polymériser, puis b) une mise en contact de la couche polymérique hydrophobe ainsi obtenue avec un milieu peptidique (16) contenant le(s)dit(s) composé(s) à fixer, pour immobiliser ce(s) dernier(s) sur ledit réseau essentiellement par des liaisons hydrophobes. A method of binding one or more peptide-bonded compounds, such as proteins, to a microsystem (1) having an electrode array (2a-2d) overlying a substrate (3), characterized in that it comprises the following sequence of steps: a) an electrolytic deposition on at least one of these electrodes of a polymeric layer (15) based on at least one hydrophobic-type electronically conductive polymer, via a setting in contact with the electrode (s) with an electrolyte (7) comprising a monomer to be polymerized, then b) bringing the hydrophobic polymeric layer thus obtained into contact with a peptide medium (16) containing the said (s) ( s) compound (s) to fix, to immobilize this (s) last (s) on said network essentially by hydrophobic bonds.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on immobilise le(s)dit(s) composé(s) à l'étape b) par adsorption non spécifique, en immergeant la ou les électrode(s) (2a-2d) recouverte(s) de ladite couche polymérique hydrophobe (15) dans ledit milieu (16), tel qu'une solution protéinique, pour former un film (17, 17a-17d) à base de ce(s) composé(s) qui recouvre ladite couche. 2. Method according to claim 1, characterized in that the said compound (s) is immobilized in step b) by non-specific adsorption, by immersing the electrode (s) (2a). -2d) coated with said hydrophobic polymeric layer (15) in said medium (16), such as a protein solution, to form a film (17, 17a-17d) based on this compound (s) ) which covers said layer.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit microsystème (1) forme un réseau de type micrométrique présentant un arrangement de protéines multiples. 3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that said microsystem (1) forms a micrometric type network having a multiple protein arrangement.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la surface utile des électrodes (2a-2d) recevant lesdites protéines présente une dimension caractéristique inférieure à 10 pm, ledit réseau étant compatible avec une fixation de cellules biologiques entre les surfaces utiles des électrodes recevant ces différentes protéines. 4. Method according to claim 3, characterized in that the effective surface of the electrodes (2a-2d) receiving said proteins has a characteristic dimension of less than 10 pm, said network being compatible with a fixation of biological cells between the useful surfaces of the electrodes receiving these different proteins.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, antérieurement à l'étape a), un dépôt d'une couche isolante de passivation (6) entre lesdites électrodes (2a-2d) et enrecouvrement partiel sur ces dernières, la couche de passivation étant ouverte sur chaque électrode de sorte à définir la surface utile de celle-ci. 5. Method according to claim 4, characterized in that it further comprises, prior to step a), a deposition of an insulating passivation layer (6) between said electrodes (2a-2d) and partial overlap on the latter, the passivation layer being open on each electrode so as to define the useful surface thereof.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite couche de passivation (6) est à base d'un polymère photosensible, tel qu'un polyimide, ou bien à base d'un nitrure de silicium ou d'un oxyde de silicium. 6. Method according to claim 5, characterized in that said passivation layer (6) is based on a photosensitive polymer, such as a polyimide, or based on a silicon nitride or an oxide of silicon.

7. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre l'étape a) en appliquant un potentiel électrique adapté à la ou aux électrode(s) (2a-2d) se trouvant à l'état immergé dans un bain à base dudit électrolyte (7) en solution, pour l'obtention de ladite couche polymérique hydrophobe (15). 7. Method according to one of the preceding claims, characterized in that it implements step a) by applying an electrical potential adapted to the electrode (s) (2a-2d) in the submerged state in a bath based on said electrolyte (7) in solution, for obtaining said hydrophobic polymeric layer (15).

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit bain comprend en outre au moins un sel électrolytique pour assurer le transport ionique dans ladite solution en cours de dépôt dudit polymère. 8. The method of claim 7, characterized in that said bath further comprises at least one electrolytic salt for ion transport in said solution during deposition of said polymer.

9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'on met en oeuvre l'étape a) en connectant cette ou ces électrode(s) (2a-2d) immergée(s) à une électrode de travail (12) d'un potentiostat (11), lequel est en outre pourvu d'une électrode de référence (13) et d'une contre-électrode (14) qui sont toutes deux également immergées dans ledit bain (7), via au moins une prise de contact électrique (4) émergeant dudit bain et préalablement formée sur ledit substrat (3) qui relie la ou les électrode(s) immergée(s) à ladite électrode de travail. 9. The method of claim 7 or 8, characterized in that it implements step a) by connecting this or these electrode (s) (2a-2d) immersed (s) to a working electrode (12). ) of a potentiostat (11), which is further provided with a reference electrode (13) and a counterelectrode (14) both of which are also immersed in said bath (7) via at least one electrical contact (4) emerging from said bath and previously formed on said substrate (3) which connects the electrode (s) immersed (s) to said working electrode.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on immerge dans ledit bain (7) ladite électrode de référence (13) et ladite 25 contre-électrode (14) de part et d'autre dudit microsystème (1). 10. Process according to claim 9, characterized in that said reference electrode (13) and said counterelectrode (14) are immersed in said bath (7) on either side of said microsystem (1).

11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on intègre ladite électrode de référence (13) et ladite contre-électrode (14) au substrat (3) dudit microsystème (1), préalablement à l'étape a). 11. The method of claim 9, characterized in that integrates said reference electrode (13) and said counter electrode (14) to the substrate (3) of said microsystem (1), prior to step a).

12. Procédé selon une des revendications précédentes, 30 caractérisé en ce que l'on met en oeuvre l'étape a) simultanément sur un ou plusieurs groupe(s) d'électrodes (2a-2d) dudit réseau. 12. Method according to one of the preceding claims, characterized in that it implements step a) simultaneously on one or more group (s) of electrodes (2a-2d) of said network.

13. Procédé selon les revendications 9 et 12, caractérisé en ce que, lors de l'étape de fabrication préalable dudit microsystème (1), on relie ledit ou chaque groupe d'électrodes (2a-2d) à une ligne commune de remontée du courant (18) qui est connectée électriquement à ladite ou à chaque prise de contact électrique (4), en vue de fixer simultanément ladite couche polymérique (15) sur les électrodes du ou de chaque groupe puis lesdits composés sur ledit réseau, selon un arrangement qui est prédéterminé par la structure du microsystème. 13. Method according to claims 9 and 12, characterized in that, during the step of prior manufacture of said microsystem (1), is connected said or each group of electrodes (2a-2d) to a common line of recovery of a current (18) which is electrically connected to said or each electrical contact (4), for simultaneously fixing said polymeric layer (15) on the electrodes of the or each group and said compounds on said array, in accordance with an arrangement which is predetermined by the structure of the microsystem.

14. Procédé selon les revendications 9 et 12, caractérisé en ce que, lors de l'étape a), on relie lesdites prises de contact électrique (4), qui sont respectivement connectées aux électrodes (2a-2d) immergées dudit ou de chaque groupe, à une ligne commune de sortie électrique (19) qui est elle-même connectée à l'électrode de travail (12) dudit potentiostat (11), en vue de fixer simultanément ladite couche polymérique (15) sur les électrodes du ou de chaque groupe puis lesdits composés sur ledit réseau selon un arrangement variable qui est indépendant de la structure du microsystème (1). 14. Process according to claims 9 and 12, characterized in that, during step a), said electrical contact plugs (4), which are respectively connected to the submerged electrodes (2a-2d) of said or of each group, to a common electrical output line (19) which is itself connected to the working electrode (12) of said potentiostat (11), in order to simultaneously fix said polymer layer (15) on the electrodes of the each group then said compounds on said network in a variable arrangement which is independent of the structure of the microsystem (1).

15. Procédé selon la revendication 7 et une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'on incorpore au substrat (3) dudit microsystème (1) un circuit microélectronique de multiplexage conçu pour déterminer le(s) groupe(s) d'électrodes (2a-2d) destiné(s) à recevoir ledit potentiel électrique adapté, pour l'obtention de ladite couche polymérique hydrophobe (15) sur chaque électrode dudit ou de chaque groupe. 15. The method of claim 7 and one of claims 12 to 14, characterized in that is incorporated in the substrate (3) of said microsystem (1) a microelectronic multiplexing circuit designed to determine the group (s) of electrodes (2a-2d) for receiving said adapted electrical potential, for obtaining said hydrophobic polymeric layer (15) on each electrode of said or each group.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'on obtient simultanément suite à l'étape b) plusieurs arrangements correspondant respectivement à différents composés fixés sur lesdits groupes d'électrodes (2a-2d) et formant par exemple autant de biopuces à protéines multiples. 16. The method of claim 15, characterized in that is obtained simultaneously following step b) several arrangements respectively corresponding to different compounds attached to said electrode groups (2a-2d) and forming for example as many microarrays with multiple proteins.

17. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on répète la séquence d'étapes a) et b) autant de fois qu'il y a de composés différents à fixer sur les électrodes (2a-2d) dudit réseau. 17. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the sequence of steps a) and b) is repeated as many times as there are different compounds to be fixed on the electrodes (2a-2d) of said network. .

18. Microsystème (1) à réseau micrométrique de composés à liaisons peptidiques, tel qu'une biopuce à réseau de protéines multiples, leditmicrosystème comportant un réseau d'électrodes (2a-2d) qui recouvrent un substrat (3) et qui sont au moins en partie surmontées d'une couche polymérique conductrice hydrophobe (15) à laquelle sont fixés lesdits composés, caractérisé en ce que lesdits composés sont fixés par adsorption à la surface de ladite couche essentiellement via des liaisons hydrophobes. 18. Microsystem (1) with a micrometric network of peptide-bonded compounds, such as a multi-protein array biochip, said micro-system comprising an array of electrodes (2a-2d) which cover a substrate (3) and which are at least partially surmounted by a hydrophobic conductive polymeric layer (15) to which said compounds are attached, characterized in that said compounds are adsorbed on the surface of said layer essentially via hydrophobic bonds.