FR2903495A1 - METHOD OF DETECTING INTERACTIONS USING PY FLUORESCENCE RAPPORTEUR - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre (i) un peptide contenant au moins un acide aminé phosphorylé ou phosphorylable et (ii) une cible (par exemple, une enzyme telle qu'une protéine phosphatase ou une protéine kinase) susceptible d'interagir avec ce peptide, dans lequel, en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique,a) on met en présence ladite cible et le peptide contenant le marqueur de fluorescence Pya;b) on détermine le niveau de fluorescence F1 du peptide marqué en présence de ladite cible ; etc) on compare ce niveau de fluorescence F1 avec le niveau de fluorescence F0 du peptide marqué en l'absence de ladite cible, une différence significative entre F0 et F1 révélant une interaction entre la cible et le peptide.The present invention relates to a method for fluorescence detection of an interaction between (i) a peptide containing at least one phosphorylated or phosphorylatable amino acid and (ii) a target (for example, an enzyme such as a protein phosphatase or a protein kinase) capable of interacting with this peptide, in which, in the absence of cleavage of the peptide sequence, a) said target is brought into contact with the peptide containing the fluorescence marker Pya; b) the level of F1 fluorescence of the labeled peptide in the presence of said target; etc.) this level of F1 fluorescence is compared with the fluorescence level F0 of the labeled peptide in the absence of said target, a significant difference between F0 and F1 revealing an interaction between the target and the peptide.

Description

1 PROCEDE DE DETECTION D'INTERACTIONS A L'AIDE DU RAPPORTEUR DE1 METHOD FOR DETECTING INTERACTIONS USING THE RAPPORTEUR DE

FLUORESCENCE Pva La présente invention se rapporte au domaine de la détection, par fluorescence, d'interactions entre des composés peptidiques et leurs cibles. Plus précisément, la présente invention concerne un procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre (i) un composé peptidique contenant au moins un acide aminé phosphorylé ou phosphorylable et (ii) une cible (par exemple, une enzyme telle qu'une protéine phosphatase ou une protéine kinase) susceptible d'interagir avec ce composé peptidique. Selon ce procédé, la détection est réalisée grâce à la présence, dans l'enchaînement peptidique dudit composé, de l'acide aminé Pya utilisé comme rapporteur de fluorescence et ce, en l'absence de clivage dudit enchaînement peptidique. La connaissance des mécanismes intracellulaires qui permettent le contrôle du cycle cellulaire est essentielle. Les cascades de phosphorylations-déphosphorylations des protéines font partie de ces mécanismes biologiques essentiels. Selon toute vraisemblance, de nombreux noeuds de communication existent entre ces mécanismes intracellulaires et les voies de signalisation des médiateurs intercellulaires. Au plan des mécanismes, on constate que la diversité des contrôles ne s'appuie pas sur une grande variété de réactions. Pour ce qui concerne les médiateurs à récepteurs membranaires, on observe toujours l'activation d'une ou plusieurs protéines kinases suivie de la phosphorylation de diverses protéines substrats. Ces protéines substrats sont, par exemple, des enzymes, des canaux ioniques, des protéines du cytosquelette, des facteurs de transcription, des protéines de contrôle du cycle cellulaire, etc., dont la phosphorylation entraînera une modification des propriétés biologiques (activation ou désactivation). Les changements 2903495 2 de propriétés de ces protéines substrats conduisent, plus ou moins directement, à des modifications métaboliques et/ou génomiques qui, ensemble, constituent la réponse cellulaire spécifique. II est également intéressant de constater que de très nombreuses 5 étapes de transduction des signaux cellulaires consistent en la levée d'inhibitions. C'est le cas de l'activation des récepteurs membranaires tyrosines kinases et des récepteurs nucléaires aux facteurs de transcription. Dans ces deux cas, pourtant structurellement très différents l'un de l'autre, on observe que l'absence du domaine de liaison de 10 l'hormone entraîne l'activation constitutive du récepteur. Ceci indique que les domaines de liaison des hormones inhibent les activités des domaines transducteurs en l'absence du ligand. Il est donc important de rechercher les protéines dont l'interaction dépend de manière critique de la phosphorylation-déphosphorylation d'une ou plusieurs tyrosine(s). 15 Un exemple type d'une cascade de signalisations impliquant des protéines kinases (également ici appelées kinases ou PK) et protéines phosphatases (également ici dénommées phosphatases ou PP) est celui qui concerne les actions mitogéniques de l'insuline. Elles s'exercent par l'intermédiaire d'une cascade complexe d'événements. Le premier 20 substrat du récepteur de l'insuline après la liaison de celle-ci, a été nommé, de manière assez logique, substrat n 1 du récepteur de l'insuline Insulin Receptor Substrate 1 (IRS-1). Ce récepteur est une protéine de 165-180 kDa. L'activation du récepteur de l'insuline entraîne la phosphorylation de PRS-1 sur de nombreux résidus tyrosines (Tyr). Au 25 moins 8 tyrosines de IRS-1 subissent ainsi une phosphorylation par le récepteur de l'insuline. Ces phosphotyrosines (Tyr-O-PO3H2 ou pTyr) sont les points d'ancrage d'autres protéines intervenant dans les voies de signalisation de l'insuline (GRB2, PLCy, PI3 kinase, etc.). Toutes ces protéines ont en commun de posséder des domaines SH2 ( src 30 homology 2 ) responsables des interactions spécifiques avec des régions 2903495 3 portant ces phosphotyrosines. Ces protéines à SH2 reconnaissent des phosphotyrosines appartenant à des séquences différentes dans l'enchaînement d'IRS-1. Ce sont les séquences situées autour des tyrosines phosphorylées qui déterminent les spécificités de liaison des 5 différentes protéines à SH2 avec IRS-1. A titre d'exemple, le complexe IRS-1/Grb-2 interagit avec une protéine homologue du produit du gène Son of Sevenless (SoS) de la drosophile. Cette protéine SoS catalyse l'échange du GDP pour le GTP au niveau de la protéine ras (p21 ras), ce qui entraîne l'activation 10 phosphorylante de cette dernière. La protéine ras possède également une activité GTPase qui reste cependant faible et doit être stimulée (jusqu'à 10 000 fois) par une GTPase Activating Protein (GAP). L'action de GAP entraîne la désactivation de ras. La tyrosine phosphatase SHP-2, impliquée dans la transduction du 15 signal de certains facteurs de croissance (IGF-1, EGF, etc.) et de cytokines, en activant la cascade des MAP kinases après sa liaison au complexe Grb2-SoS, pourrait aussi jouer un rôle dans la régulation du signal. Dans le cas des protéines à phosphotyrosine, la spécificité de 20 reconnaissance des sites phosphorylés porte sur la phosphotyrosine elle-même et sur les 3 résidus adjacents du côté C-terminal. Néanmoins, on a récemment mis en évidence un domaine appelé TPB ( phosphotyrosine binding ), dont la spécificité de liaison porte sur les résidus du côté N-terminal par rapport à la phosphotyrosine. Ce recouvrement des sites de 25 spécificité laisse envisager une certaine compétition entre les deux types de domaine (et, donc, une balance entre les voies de signalisation concernées). Ces résidus adjacents du côté N-terminal de la phosphotyrosine sont également déterminants pour la liaison des 2903495 4 tyrosines phosphatases et, donc, pour la durée de vie de la phosphorylation de la tyrosine considérée. En effet, les mécanismes de régulation des processus cellulaires impliquent un équilibre permanent entre l'état phosphorylé d'une protéine 5 par une kinase, et son état déphosphorylé par une phosphatase. Ainsi, certaines tyrosines phosphatases membranaires, en déphosphorylant le récepteur de l'insuline, sont capables de l'inactiver. Chez la souris, l'absence de la protéine tyrosine phosphatase 1B (PTP-1 B) entraîne une augmentation de la sensibilité à l'insuline. Grâce à son domaine SH2, 10 SHIP-2 se lie à certaines phosphotyrosines d'IRS-1 et inhibe ainsi son activité. Autre phosphatase jouant un rôle probable dans la régulation du signal insulinique, la SHIP-2 (inositol 5-phosphatase à domaine SH2) catalyse normalement la conversion de PIP3 en PIP2. Chez la souris, l'invalidation hétérozygote du gène de SHIP-2 augmente 15 l'insulinosensibilité. Ainsi apparaît-il que de nombreux mécanismes peuvent moduler la cascade de réactions faisant suite à la liaison des messagers extracellulaires (insuline dans les exemples précédents) à leurs récepteurs. En outre, les diverses voies d'activation impliquées présentent 20 entre elles des interactions, rendant ainsi particulièrement difficile la compréhension du rôle précis de chaque molécule. C'est la raison de l'intérêt porté aux phosphatases et kinases ainsi qu'à leur(s) cible(s). D'un point de vue pratique, il existe à ce jour de nombreuses méthodes pour étudier les kinases et phosphatases. Quelques-unes des 25 méthodes les plus courantes sont décrites ci-après à titre de présentation non-exhaustive de l'arrière-plan technologique de l'invention. La déphosphorylation de la tyrosine dans un peptide peut être suivie par la mesure de l'accroissement de fluorescence de cet acide aminé au cours de l'hydrolyse du groupe O-P03H2 (Zhang et al., 1993). 2903495 5 Toutefois, cette variation est très faible, de l'ordre de 130 à 150 unités, ce qui représente à peine un doublement de la fluorescence de base du substrat. Elle est en outre facilement altérée par la présence d'autres amino-acides, en particulier Tyr ou Trp. 5 Plusieurs dosages utilisant la fluorescence ont été rapportés tant pour mesurer l'activité kinase que l'activité phosphatase. Ces dosages sont basés sur le changement de conformation attendu lorsqu'une protéine ou un peptide gagne ou perd le groupe P03H2 sur un acide aminé phosphorylable. Pour être efficaces, ces méthodes exigent l'introduction 10 d'un groupe fluorescent, tel que 6-acryloyl-2-diméthylaminonaphtalène (acrylodan), BODIPY, IANBD amide, IAEDANS, etc., sur la chaîne latérale d'une cystéine nécessairement adjacente à l'acide aminé phosphorylable ou phosphorylé (revue dans Brennan J.D., 1999 ; Past et al., 1994 ; Higaschi et al., 1997 ; Noble J. et al., 2003). L'avantage de ces essais est 15 de pouvoir être conduits de manière homogène (en solution et de manière continue). Ils possèdent toutefois plusieurs inconvénients. En particulier, l'obligation de vicinité entre la cystéine et le reste phosphorylable peut représenter une gêne à la liaison avec la kinase ou la phosphatase et ce, d'autant plus que ce reste Cys va comporter un fluorophore très 20 encombrant. En outre, la contrainte de vicinité limite la construction (et la diversité) de librairies de substrats. Enfin, la sensibilité reste assez faible, ce qui rend nécessaire des quantités d'enzymes importantes et un temps de mesure long. Ceci est un facteur défavorable pour le tri à haut débit d'inhibiteurs (Noble J., 2003). 25 Deux méthodes proches des techniques précédentes et s'appuyant sur la fluorescence ont été rapportées. Elles consistent à introduire un fluorophore, tel que la rhodamine, à l'extrémité d'un peptide phosphorylable, puis à placer ce peptide en présence d'un complexe soluble ou non du fer. La phosphorylation de l'acide aminé (Tyr, Ser, Thr) 30 par une kinase conduit à la liaison du groupe O-P03H2 avec le complexe 2903495 6 du fer et à un rapprochement du fluorophore. Ceci entraîne une diminution de la fluorescence qui peut donc être utilisée pour doser l'activité de l'enzyme, son inhibition, etc. Inversement, dans le cas d'une phosphatase, la fluorescence du phosphopeptide, éteinte au début du fait de l'interaction 5 du peptide avec le complexe du fer, va augmenter au fur et à mesure de la déphosphorylation. Là encore, cette technique possède plusieurs inconvénients : i) elle nécessite un apport extérieur de complexe métallique qui peut interagir avec du phosphate inorganique présent dans la préparation utilisée (homogénats) ou avec un groupe de ce type dans 10 un inhibiteur à tester ; ii) elle présuppose que la conformation du peptide est suffisamment flexible pour se modifier et venir à très grande proximité du complexe du fer, ce qui dépend bien évidemment de la séquence du peptide. Cette technique est actuellement commercialisée sous différents noms (QTL biosystems, IQTM technology). Une variante plus compliquée 15 exige une révélation par polarisation de fluorescence (Molecular Devices). Elle se base sur le changement (réduction) dans la vitesse de rotation-déplacement du peptide phosphorylé lorsqu'il est lié au complexe du fer par son groupe phosphate, et inversement (augmentation) lorsque le phosphate est éliminé par l'action d'une phosphatase. Outre la 20 sophistication d'appareillage que cette technique exige, la sensibilité reste faible. Une autre méthode est décrite dans la demande de brevet internationale WO 2005/012329. Cette méthode s'effectue en deux temps et exige la construction de peptides phosphorylables possédant un site de 25 clivage spécifique pour une enzyme donnée. Le peptide contient en N-terminal un groupe fluorescent et en C-terminal un reste capable d'éteindre la fluorescence émise par le fluorophore ( quencher ). Le quenching s'effectue par transfert d'énergie de fluorescence (FRET). La phosphorylation d'un tel peptide n'affecte pas le FRET mais le 30 quenching disparaît lorsque l'enzyme ajoutée coupe le peptide et 2903495 libère le fluorophore contenu dans un des deux métabolites. II s'agit d'un dosage non homogène (deux étapes) qui présente de nombreuses limitations, parmi lesquelles la mise en oeuvre d'une peptidase dont l'activité est modulée par la présence ou l'absence du reste phosphorylé, 5 ce qui limite le caractère universel de la méthode. D'autres méthodes d'étude de l'activité des protéines kinases basées sur le transfert d'énergie de fluorescence FRET ont été rapportées. Elles diffèrent par la nature du couple donneur-accepteur (Sato et al., 2002 ; Ting et al., 2001 ; Zhang et al., 2001). Cependant, 10 toutes exigent l'introduction d'un couple de fluorophores, ce qui rend plus difficile, notamment, la construction de librairies de peptides substrats. Des substrats fluorescents sensibles à l'activité des protéines kinases ont été décrits récemment (Wang et al., 2006). Afin de mettre en évidence la phosphorylation de résidus Tyr, les auteurs ont fixé le 15 fluorophore pyrène à l'extrémité de la chaîne latérale de l'acide L-2,3-diaminopropionique (Dap) ou de l'acide L-2,4-diaminobutanoîque (Dab). Les résidus Dap ou Dab ainsi modifiés sont ensuite introduits dans des chaînes peptidiques comprenant 10 acides aminés, dont la tyrosine, afin de constituer des librairies de substrats potentiels. La fluorescence du 20 reste pyrényl est augmentée lors de la phosphorylation de la tyrosine par des tyrosines kinases. Cependant, les auteurs ont constaté que ces substrats n'étaient pas universels. En effet, un certain nombre de tyrosines kinases ne les reconnaissent pas. Plusieurs explications peuvent être avancées. D'une part, le reste pyrényl, parce qu'il est introduit à 25 l'extrémité de la chaîne latérale du Dap ou du Dab, est mobile et, donc, d'autant plus susceptible d'entraver l'accès de l'enzyme à sa cible et, par conséquent, de nuire à leur interaction. D'autre part, Wang et al. introduisent le reste pyrène dans les substrats à la fin de la synthèse peptidique en phase solide, après l'étape de déprotection des restes Dab 30 et Dap jusque-là protégés sous forme de 4-méthyltrityl. Ceci limite 2903495 considérablement les possibilités de diversification des acides aminés utilisables pour construire la librairie de substrats. En l'occurrence, compte tenu des possibilités de réaction de l'acide 1-pyrène acétique avec les chaînes latérales, seuls 4 acides aminés différents (G, A, E et I) sont 5 utilisés dans la formule générale. Les acides aminés G, A et I sont par constitution dépourvus de groupement réactif dans leur chaîne latérale ; le carboxylate en y de l'acide glutamique E est protégé par un reste t-Bu. Dans ces conditions, comme le soulignent les auteurs, la reconnaissance des substrats par un grand nombre de kinases différentes est de facto 10 limitée, du fait de la faible variabilité de séquence des substrats présents dans la librairie. Du reste, le changement de fluorescence (ici, une augmentation) lors de la phosphorylation du résidu Tyr n'est observé que lorsque la chaîne latérale portant le reste pyrène se trouve en position +3 ou -2 par rapport à la tyrosine. II en résulte donc que cette méthode ne 15 peut permettre l'étude que d'un nombre restreint de tyrosines kinases. II existe ainsi diverses méthodes pour étudier les molécules d'intérêt qui présentent une activité biologique, notamment enzymatique, telles que les kinases et phosphatases. Pourtant, toutes les méthodes disponibles à ce jour imposent des contraintes de faisabilité et de 20 réalisation et/ou présentent des inconvénients techniques, qui en limitent de manière notable l'utilité, la facilité d'usage, la mise en oeuvre à grande échelle (ou à haut débit : pour du high-throughput screening û HTS ) et la généralité d'application. II existe donc un besoin pour une méthode et des moyens qui seraient à la fois (i) simples de réalisation et d'utilisation ; 25 (ii) efficaces ; (iii) sensibles et (iv) applicables de manière beaucoup plus générale que les méthodes et moyens connus. La présente invention représente précisément la première réponse technique satisfaisante apportée dans le domaine. La Demanderesse propose ici pour la première fois d'utiliser un 30 rapporteur de fluorescence unique, à la fois universel et puissant, de l'état 2903495 9 phosphorylé ou non de résidus tyrosines, à savoir le reste Pya (L-pyrénylalanine). Et, dans le cadre de la présente invention, la Demanderesse propose d'introduire Pya dans de courtes séquences peptidiques 5 contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylables ou phosphorylées, et de l'utiliser comme rapporteur des réactions de phosphorylation et/ou déphosphorylation de cet acide aminé par des kinases ou phosphatases, respectivement. Les séquences comprenant le ou les résidus Tyr et Pya peuvent avantageusement être immobilisées sur un support (e.g., bille, 10 colonne ou plaque). Brièvement, les Inventeurs se sont aperçus que les états phosphorylés ou non de séquences peptidiques, issues de substrats connus de phosphatases ou de kinases, ou bien provenant d'une librairie restreinte, conduisent à un changement intense (diminution jusqu'à 15 l'extinction, ou augmentation) de la fluorescence du rapporteur Pya, sous l'effet d'un phénomène de modulation de ce paramètre par collision ( collisional quenching ). La présente invention montre que ces changements de fluorescence peuvent être avantageusement utilisés pour mesurer l'activité d'une phosphatase ou d'une kinase et, ainsi, rechercher 20 des inhibiteurs ou activateurs de ces enzymes et quantifier la puissance de ces molécules dans un test homogène à haut débit. La Demanderesse propose donc ici des méthodes qui facilitent la caractérisation et le dosage de tyrosines phosphatases et tyrosines kinases, ainsi que la caractérisation et le dosage de leurs inhibiteurs ou 25 activateurs spécifiques. Sont également proposées des méthodes qui facilitent l'identification de nouvelles phosphatases ou kinases, ainsi que la recherche de substrats des phosphatases ou des kinases. La Demanderesse propose en outre des moyens de sélectionner le substrat optimisé pour une phosphatase/kinase connue ou inconnue, et de 2903495 10 l'utiliser pour mesurer le pouvoir inhibiteur ou activateur d'une substance donnée. La Demanderesse propose également une méthode sensible permettant de mettre en évidence et de caractériser des complexes entre 5 peptides ou protéines phosphorylés et leurs cibles protéiques réceptrices en milieu homogène ou sur cellules ou tissus. Comme indiqué ci-dessus, la présente invention tire profit des propriétés singulières, mises en évidence ici pour la première fois, du reste fluorescent Pya, lorsqu'il est placé dans une séquence 10 d'aminoacides dont l'un au moins correspond à une tyrosine ou une tyrosine phosphorylée. Cet acide aminé Pya peut être produit en grande quantité sous forme L (Soleilhac et al., 1996) et s'introduit facilement par synthèse en phase solide dans une séquence peptidique, ce qui minimise 15 considérablement les problèmes d'encombrement stérique associés, dans les techniques connues, à l'introduction de divers groupes fluorescents à l'extrémité de chaînes latérales d'acides aminés (cystéine, lysine, Dap/Dab). Un intérêt majeur du reste Pya tient à la fluorescence très intense 20 du pyrène qui possède deux maxima d'émission à 377 nm et 405 nm, c'est-à-dire situés dans des régions qui ne sont pas affectées par l'émission des tyrosines et tryptophanes éventuellement présents dans la protéine à étudier ou dans le milieu cellulaire. De plus, le pyrène possède un excellent rendement quantique de fluorescence (0,32) ainsi qu'un long 25 temps de vie de fluorescence (100 ns) (Berlman ID (ed.), 1971). La fluorescence émise par Pya est sensible à un environnement très polaire, la proximité de ce dernier conduisant à une extinction de fluorescence par collision (Yaron et al. 1979). Cette sensibilité à un 2903495 11 environnement polaire a d'ailleurs déjà été mise à profit dans le passé pour mesurer, par exemple, la dégradation de l'endothéline par l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE) (Luciani et al., 2001 ; brevet FR 2 807 523), celle des substrats des toxines botuliques B (Anne et al., 5 2001 ; brevet FR 2 809 733) et A (demande de brevet FR 2 869 908). . Dans ces exemples, un reste très polaire, la p-nitrophénylalanine (pNF), a été introduit dans les substrats pour servir de quencher . Le clivage du substrat entre les deux chromophores libère deux métabolites et une intense fluorescence du reste Pya est observée, puisque celui-ci ne subit 10 plus l'influence du groupe quencher . Or, dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont trouvé de manière tout à fait inattendue que la fluorescence du reste Pya était fortement affectée par l'état de phosphorylation d'une tyrosine cible d'une kinase ou d'une phosphatase. En outre, de manière tout aussi 15 surprenante, ils ont trouvé que la phosphorylation par une kinase de cet acide aminé et, donc, son changement de polarité, produisait non pas une diminution mais une augmentation de la fluorescence de Pya. Réciproquement, l'action d'une phosphatase telle que la PTP1B produit l'effet inverse, c'est-à-dire une diminution très importante de la 20 fluorescence de Pya. Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre : - un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou phosphorylables et un marqueur Pya ; et 25 - une cible susceptible d'interagir avec ce peptide, ledit procédé comprenant au moins, en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique : 2903495 12 a) la mise en présence du peptide contenant le marqueur Pya, avec ladite cible ; b) la détermination du niveau de fluorescence F1 dudit peptide marqué en présence de ladite cible ; et 5 c) la comparaison du niveau de fluorescence F1 obtenu à l'étape b) avec le niveau de fluorescence FO dudit peptide marqué en l'absence de ladite cible, une différence significative entre FO et F1 révélant une interaction entre la cible et le peptide. Au sens de l'invention, une interaction peut être directe ou 10 indirecte. Une interaction directe entre deux partenaires au moins ne fait intervenir aucun intermédiaire ou relais. Soit les partenaires sont en contact physique immédiat les uns avec les autres (interaction que l'on pourrait qualifier de structurelle), soit les partenaires interagissent à distance . A l'opposé, dans une interaction indirecte entre au moins 15 deux partenaires, un ou plusieurs partenaires additionnels servent de relais. Ce(s) relais est(sont) donc, lui(eux), en interaction directe avec les partenaires en question. Dans tous les cas, quel que soit le type d'interaction, elle a pour conséquence de produire un effet sur la fonction biologique de l'un des partenaires au moins (interaction fonctionnelle). 20 Les termes et expressions activité , fonction , activité biologique et fonction biologique sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. Une telle activité peut être notamment de nature enzymatique. Un enchaînement peptidique est une séquence de restes ou 25 résidus , qui peuvent être des acides aminés naturels, de série L, ou des acides aminés modifiés tels que des acides aminés naturels phosphorylés, la phénylalanine modifiée Phe-(p-CH2PO3H2) ou p-CH2-Phe, le marqueur Pya. Les termes enchaînement (peptidique) , chaîne (peptidique) séquence (peptidique) et peptide sont 30 équivalents et désignent une suite d'acides aminés, incluant le marqueur Pya, dont la longueur peut aller de 2 à 30 résidus, de préférence de 2 à 20 2903495 13 résidus, de préférence encore de 2 à 15 résidus, de manière encore préférée de 5 à 11 résidus. Comme il ressort de ce qui précède, les termes reste et résidu sont synonymes et désignent ici une unité dans la chaîne peptidique, en particulier un acide aminé, modifié ou non, 5 phosphorylé ou non, et Pya. De préférence, les séquences peptidiques mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention comprennent au moins un résidu tyrosine, phosphorylé ou non. L'expression en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique signifie que l'on exclut toute rupture d'une ou plusieurs 10 liaisons peptidiques dans la séquence en cause. Cette caractéristique de l'invention reflète la capacité du reste Pya à servir de marqueur autonome de fluorescence, permettant à lui seul de détecter un signal d'interaction. Bien évidemment, on distingue ici clairement le clivage tel que décrit ci-dessus de l'hydrolyse, catalysée par une phosphatase, d'un 15 groupe -O-PO3H2 en groupe -OH. Comme cela ressort sans ambiguïté du présent texte, les termes et expressions marqueur Pya , marqueur de fluorescence Pya , rapporteur de fluorescence Pya , rapporteur Pya , reste Pya , résidu Pya sont synonymes. 20 Le peptide est dit marqué lorsque l'enchaînement peptidique contient le marqueur Pya. Le terme cible est ici utilisé pour désigner n'importe quel type de composé de nature biologique, qu'il soit d'origine naturelle, recombinant ou synthétique. Il peut notamment s'agir de protéines, 25 d'acides gras, d'acides nucléiques, d'anticorps, de polysaccharides, etc. De préférence, la cible selon l'invention est une protéine et, plus particulièrement, une enzyme. En ce cas, l'enzyme est, de préférence, apte à modifier la structure et/ou la fonction du peptide tel que sus-défini. Par exemple, il peut s'agir d'une phosphatase ou d'une kinase. Ainsi, dans 30 le cas où l'enzyme est une phosphatase (respectivement, une kinase), le peptide peut être, par interaction directe ou indirecte avec cette enzyme, 2903495 14 modifié structurellement par déphosphorylation (respectivement, par phosphorylation), entraînant ainsi une modification de sa fonction. Cette modification peut se traduire par une activation ou une inhibition, partielle ou totale, ou un changement d'activité. 5 Selon un mode de réalisation, l'enzyme est une phosphatase et le peptide comprend au moins un résidu Tyr phosphorylé. Alternativement, l'enzyme est une kinase et le peptide comprend au moins un résidu Tyr phosphorylable. De manière préférée, l'enzyme selon l'invention est une 10 phosphatase et, en ce cas, la molécule comprend, ou est, de préférence au moins un résidu Tyr phosphorylé. En pratique, préalablement à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, Pya peut être incorporé dans l'enchaînement peptidique via une liaison covalente, c'est-à-dire une liaison de nature peptidique. Le 15 marqueur Pya est alors de préférence incorporé dans la séquence peptidique de manière à être séparé du ou d'un résidu Tyr ou pTyr par au maximum 3, de préférence 2, acides aminés. Lors des étapes b) et c), la détermination des niveaux de fluorescence FO et F1 du peptide marqué est réalisée par des méthodes 20 conventionnelles, bien connues de l'homme du métier. Cette détermination peut être purement qualitative (on détecte alors l'apparition ou la disparition, ou bien l'augmentation ou la diminution d'intensité, de la fluorescence). Alternativement ou bien additionnellement, la détermination peut être une mesure quantitative de la fluorescence (on effectue alors 25 des mesures de fluorescence qui permettent d'accéder aux constantes cinétiques, aux constantes de dissociation, de déterminer un pouvoir inhibiteur ou activateur, etc.). La détermination quantitative de la fluorescence selon le procédé objet de la présente invention est avantageusement adaptée au tri systématique, à haut débit (HTS) (Pour 30 une revue récente des techniques actuellement disponibles, voir la demande US 2005/0026234 au nom de Violin et al.) 2903495 Selon un mode de réalisation, la différence entre les niveaux de fluorescence FO et F1 observée à l'étape c) correspond à une augmentationde la fluorescence. Ceci est, par exemple, le cas lorsque la cible est une protéine tyrosine kinase et le peptide contient une tyrosine. 5 Selon un autre mode de réalisation, la différence entre les niveaux de fluorescence FO et F1 observée à l'étape c) correspond à une diminution de la fluorescence. On citera à titre d'exemple de ce mode de réalisation, le cas où la cible est une tyrosine phosphatase et le peptide contient une pTyr. 10 Un deuxième aspect de la présente invention vise l'application du procédé décrit ci-dessus à la détection, l'identification et la sélection d'une cible ayant une activité biologique, de préférence une enzyme. Un mode de réalisation correspond, par exemple, à un procédé de criblage pour identifier une enzyme, dans lequel on met en oeuvre le 15 procédé de détection par fluorescence conforme à l'invention, en utilisant, en tant que substrat de l'enzyme, le peptide contenant le marqueur de fluorescence Pya. En ce cas, la cible est alors l'enzyme à identifier. La détection, l'identification et la sélection de l'enzyme se feront d'après l'activité susceptible d'être mise en évidence en présence du substrat. 20 Selon un troisième aspect, la présente invention s'intéresse à l'application du procédé de détection par fluorescence tel que précédemment décrit, au dosage de l'activité biologique d'une cible, de préférence une enzyme. Selon un mode de réalisation, l'on met en oeuvre un procédé de 25 dosage de l'activité d'une enzyme, notamment d'une kinase (activité de phosphorylation) ou d'une phosphatase (activité de déphosphorylation). A cette fin, on utilise le procédé de détection par fluorescence décrit ci-dessus, dans lequel le peptide contenant Pya est le substrat de l'enzyme, et les niveaux de fluorescence, déterminés quantitativement, sont corrélés 30 aux niveaux d'activité enzymatique. 2903495 16 Un quatrième aspect de la présente invention a trait à l'application du procédé de détection par fluorescence ci-dessus, à la détection, l'identification et la sélection d'un peptide capable d'agir comme substrat d'une enzyme. 5 Un mode de réalisation particulier correspond à un procédé de criblage d'un peptide contenant le marqueur Pya et susceptible d'agir comme substrat d'une enzyme, lequel procédé comprend au moins la mise en oeuvre des étapes a) à c) du procédé de détection par fluorescence précédemment décrit, de telle sorte qu'à l'issue de l'étape c), 10 si FO et F1 sont significativement différents, on sélectionne le peptide pour sa capacité à agir comme substrat de l'enzyme. Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne l'application du procédé de détection par fluorescence décrit ci-dessus, à la détection, l'identification et la sélection d'un composé capable de 15 perturber l'interaction entre un peptide contenant Pya agissant comme substrat et une cible. Le terme perturber peut ici être synonyme de promouvoir/augmenter/activer ou, à l'opposé, de altérer/réduire/inhiber/supprimer . 20 Selon un mode de réalisation, cette application correspond à un procédé de criblage d'un composé susceptible de perturber l'interaction entre une cible et un peptide contenant Pya et agissant comme substrat, ledit procédé comprenant au moins la mise en oeuvre des étapes a) à c) du procédé de détection selon l'invention puis, si FO et F1 sont 25 significativement différents, la sélection du composé capable de perturber l'interaction entre le peptide et la cible. De préférence, la cible est une enzyme, notamment une phosphatase ou une kinase. Lors de l'étape de sélection, si FO est significativement supérieur à 30 F1, le composé est capable d'inhiber l'interaction entre le peptide et la cible (le composé est donc un inhibiteur). En revanche, si F1 est 2903495 significativement supérieur à F0, ledit composé est capable de promouvoir l'interaction entre le peptide et la cible (le composé est alors un activateur). Un sixième aspect de la présente invention concerne l'application 5 du procédé de détection par fluorescence tel que décrit plus haut, à la détermination des caractéristiques cinétiques de l'interaction entre : - un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou phosphorylables et un marqueur Pya ; et - une enzyme présentant une activité kinase ou phosphatase. 10 Selon un mode réalisation particulier, cette application du procédé de détection par fluorescence conforme à l'invention comprend en outre la détermination quantitative du pouvoir d'un composé à inhiber ou activer ladite interaction et, facultativement, le calcul des constantes thermodynamiques de cette inhibition ou activation. 15 Un septième aspect de la présente invention concerne un substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation, comprenant un marqueur Pya, de formule générale choisie parmi les formules (I) et (II) suivantes : 20 Z-(XI )I-X2-(X' 1)m-Pya-(X" I )n-N H2 (1) Z-(X, )I-Pya-(X', )m-X2-(X"I )n-NH2 (II) dans lesquelles : Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ; 25 XI, X'1 et X"l représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L, phosphorylé ou non, ou p-CH2-Phe ; I+m+n est inférieur ou égal à 9 ; X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe. 2903495 18 Selon un mode de réalisation particulier, un substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation a pour formule, une formule choisie parmi : 5 Z-(XI)3-X2-(X'1 )2-Pya-E-NH2 (III) Z-(XI)3-Pya-(X'l)2-X2-E-NH2 (IV) dans lesquelles : - Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ; 10 X, et X'1 représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L choisi parmi A, E, D, L ; X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe. Avantageusement, une ou plusieurs librairies (ou banques) de 15 substrats répondant à l'une ou l'autre de ces formules (I) à (IV) seront constituées et pourront notamment être utilisées à des fins de criblage, de substrats (en particulier, de substrats de phosphatases ou de kinases) et/ou d'enzymes (en particulier, de phosphatases ou de kinases) susceptibles d'agir sur ces substrats. 20 Selon un huitième aspect, la présente invention vise l'utilisation d'un tel substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation, dans un procédé de détection par fluorescence conforme à la description précédente, ou dans l'une des applications susmentionnées. II en est ainsi de la fixation sur un support (plaque, 25 résine, billes magnétiques, etc.) par l'intermédiaire du reste hexanoyl ou biotinyl d'un substrat phosphorylé correspondant à une séquence phosphorylée d'une kinase. L'introduction de l'aminoacide p-CH2-Phe à la place de pTyr empêche l'hydrolyse non spécifique ou par une phosphatase, et permet d'isoler la(les) cible(s) potentielle(s) de la kinase. 30 On peut à cet égard citer l'exemple typique de la séquence phosphorylée du récepteur aux facteurs de croissance ou aux facteurs angiogéniques 2903495 19 qui possèdent une activité tyrosine kinase intracellulaire. Le peptide phosphorylé, résistant aux phosphatases et immobilisé, permet d'isoler une cible, par exemple SoS pour le récepteur à l'EGF, par la variation de fluorescence du reste p-CH2-Phe, lors de l'interaction avec sa (ses) 5 cible(s) spécifique(s), celle(s)-ci pouvant être des phosphatases. Les figures suivantes illustrent la présente invention, sans en limiter ni l'objet ni la portée. - Fiqure 1 : Comparaison des spectres d'émission de fluorescence des peptides 9 (phosphorylé) et 8 (non phosphorylé). 10 Conditions : Tampon utilisé : Hepes 50 mM pH 6:9, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 2 mM. Mesure à l'aide d'un spectrophotomètre Perkin-Elmer à Xex=343 nm; f ex = 15 ; f em = 2.5. -Figure 2 : Cinétique de la déphosphorylation du peptide 9 (10 pM) par la PTP1B (10 ng/mL). 15 Conditions :Tampon utilisé : Hepes 50mM pH 6.9, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 2 mM. La PTP1B a été utilisée à une concentration de 10 ng/mL. La cinétique a été suivie à l'aide d'un fluorimètre Berthold (2^,ex=340 nm; ? em= 405 nm; Lamp energy = 10 000) à 30 C. Paramètres cinétiques de la réaction : Km = 1.30 0.20 pM, kcat = 46.0 20 2.0 s-1, kcat/Km = 3.20 0.10 107 M-1.s-1 - Fiqure 3 : Inhibition de l'activité phosphatase de la PTP1B sur le substrat 9 par un inhibiteur compétitif et réversible : le PTP inhibitor IV. Conditions : Tampon utilisé : Hepes 50mM pH 6.9, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 2 mM. La PTP1B a été utilisée à une concentration de 20 25 ng/mL, le substrat 9 à une concentration de 10 pM. Les tests d'activité ont été réalisés après une incubation de 15 min à 30 C. (Lecture sur plaques 96 puits, à l'aide d'un fluorimètre Berthold à Xex=340 nm; 2çem= 405 nm; Lamp energy = 10 000). - Figure 4 : Cinétique de phosphorylation du peptide 12 (20 pM) par la 30 kinase p60s-src. 2903495 20 Conditions : Tampon utilisé : Tris 50mM pH 7.5, DTT 2mM, MgCl2 5mM, MnCl2 1 mM, BSA 0,01 mg/mL, ATP 1 mM. La p60c-src (famille des tyrosines kinase) (humaine, SIGMA, ref : S5439, lot n 014K2706) a été utilisée à une concentration finale de 10 nM, le substrat 12 a été utilisé à 5 une concentration de 20 pM. (Lecture sur plaques 96 puits, à l'aide d'un fluorimètre Berthold à Xex=340 nm; hem= 405 nm; Lamp energy = 10 000). Paramètres cinétiques de la réaction : Km = 20.16 pM, kcat = 1.53 s-1, kcat/Km = 7.59 104 M-1 .s-1. 10 D'autres propriétés, modes de réalisation et avantages de la présente invention pourront ressortir à la lecture des exemples suivants, donnés ici à titre purement illustratif. EXEMPLES I-Préparation de séquences peptidiques marquées, utilisables comme substrats potentiels de kinases ou phosphatases : Le reste Pya peut être introduit : - dans des séquences peptidiques connues, susceptibles de servir 20 de substrats à des phosphatases et des kinases, - dans des librairies de séquences peptidiques lorsque les substrats des enzymes sont inconnus. 15 2903495 21 I-1- Introduction du reste Pya dans une séquence peptidique connue, susceptible de servir de substrat à des phosphatases et des kinases A titre d'exemple et de manière non limitative, on peut citer : 5 a) la mise au point d'un substrat de la phosphatase PTP1B. Le domaine d'activation du récepteur à l'insuline, le fragment 1157-1168 (I-pY-E-T-D-pY-pY-R-K-G-G-K) est déphosphorylé très rapidement, sur les deux pY adjacentes, par la PTP1B. Le peptide 9 Ac-I-Pya-E-T-D-pY-pY-R-K-NH2, dans lequel Pya 10 remplace une tyrosine, a été synthétisé et s'est révélé être un excellent substrat de PTPIB, avec déphosphorylation simultanée des deux pY restantes (voir exemples ci-dessous). L'analogue non phosphorylé 8 (Ac-I-Pya-E-T-D-Y-Y-R-K-NH2) est un substrat de kinase et, plus particulièrement, du domaine PTK du 15 récepteur à l'insuline. b) la mise au point d'un substrat de la kinase p60c-src. A partir du substrat commercial Ac-I-Y-G-E-F-NH2 (Nair et al., 1995), le peptide 11 et son analogue phosphorylé 10 ont été synthétisés (Ac-I-Y-G-E-Pya-NH2 et Ac-l-pY-G-E-Pya-NH2). 20 c) la mise au point d'un substrat de la kinase Hck. A partir du substrat décrit dans la littérature (Porter et al., 2000), on a procédé à la synthèse du composé 12 (Ac-E-E-Pya-I-Y-G-E-I-E-A-NH2) et de son analogue phosphorylé 13 (Ac-E-E-Pya-l-pY-G-E-I-E-A-NH2). 25 2903495 22 I-2- Librairie de séquences peptidiques : Les librairies de peptides substrats revendiquées ici peuvent avantageusement être obtenues par synthèse en phase solide tel que décrit dans la littérature (D. Conis et al., 1998). 5 L'accès chimique à ces librairies est simplifié, soit par l'utilisation de la méthode split-mix qui conduit à des peptides possédant en une seule position un mélange de n aminoacides (Furka A. et al., 1991), soit en utilisant la méthode Ala scan inverse (Vetter S.W. et al., 2000) qui consiste à partir d'un peptide ne contenant que des alanines et à 10 changer successivement chaque Ala par divers aminoacides. a) Librairies construites par la méthode split and mix : Ces librairies développées par la Demanderesse correspondent aux formules générales : 15 Ac-S-K-G-Pya-(X)n-Y (ou pY) ùG-G-K-NH2 (V) et Ac-S-K-G-Y (ou pY) -(X)n-Pya-G-G-K-NH2 (VI) dans lesquelles n=1, 2 ou 3 et X est un mélange d'a-aminoacides choisis parmi les aminoacides suivants : G, V, L, M, F, W,  The present invention relates to the field of fluorescence detection of interactions between peptide compounds and their targets.  More specifically, the present invention relates to a method of fluorescence detection of an interaction between (i) a peptide compound containing at least one phosphorylated or phosphorylatable amino acid and (ii) a target (for example, an enzyme such as a protein phosphatase or a protein kinase) capable of interacting with this peptide compound.  According to this method, the detection is carried out thanks to the presence, in the peptide sequence of said compound, of the amino acid Pya used as a fluorescence reporter and this, in the absence of cleavage of said peptide sequence.  Knowledge of the intracellular mechanisms that enable cell cycle control is essential.  The phosphorylation-dephosphorylation cascades of proteins are part of these essential biological mechanisms.  In all likelihood, many communication nodes exist between these intracellular mechanisms and the signaling pathways of intercellular mediators.  In terms of mechanisms, we find that the diversity of controls does not rely on a wide variety of reactions.  With regard to membrane receptor mediators, the activation of one or more protein kinases is still observed followed by the phosphorylation of various substrate proteins.  These substrate proteins are, for example, enzymes, ion channels, cytoskeleton proteins, transcription factors, cell cycle control proteins, and the like. , whose phosphorylation will cause a change in biological properties (activation or deactivation).  The changes in properties of these substrate proteins lead, more or less directly, to metabolic and / or genomic changes which together constitute the specific cellular response.  It is also interesting to note that a very large number of cell signal transduction steps consist in the removal of inhibitions.  This is the case of the activation of membrane receptors tyrosine kinases and nuclear transcription factor receptors.  In these two cases, yet structurally very different from each other, it is observed that the absence of the binding domain of the hormone causes constitutive activation of the receptor.  This indicates that the hormone binding domains inhibit the activities of the transducer domains in the absence of the ligand.  It is therefore important to look for proteins whose interaction depends critically on the phosphorylation-dephosphorylation of one or more tyrosine (s).  A typical example of a signaling cascade involving protein kinases (also referred to herein as kinases or PKs) and protein phosphatases (also herein referred to as phosphatases or PPs) is that which relates to the mitogenic actions of insulin.  They are exercised through a complex cascade of events.  The first substrate of the insulin receptor after binding thereof, has been quite logically named Insulin Receptor Substrate 1 Insulin Receptor Substrate 1 (IRS-1).  This receptor is a 165-180 kDa protein.  Activation of the insulin receptor causes phosphorylation of PRS-1 on many tyrosine residues (Tyr).  At least 8 tyrosines of IRS-1 thus undergo phosphorylation by the insulin receptor.  These phosphotyrosines (Tyr-O-PO3H2 or pTyr) are the anchor points of other proteins involved in insulin signaling pathways (GRB2, PLCy, PI3 kinase, etc.). ).  All of these proteins have in common that they possess SH2 (src homology 2) domains responsible for specific interactions with these phosphotyrosine bearing regions.  These SH2 proteins recognize phosphotyrosines belonging to different sequences in the sequence of IRS-1.  It is the sequences around the phosphorylated tyrosines that determine the binding specificities of the different SH2 proteins with IRS-1.  By way of example, the IRS-1 / Grb-2 complex interacts with a homologous protein of the Son of Sevenless (SoS) gene product of Drosophila.  This SoS protein catalyzes the exchange of GDP for GTP at the ras (p21 ras) level, which results in the phosphorylating activation of the latter.  The ras protein also has a GTPase activity which remains weak, however, and must be stimulated (up to 10,000 times) by a GTPase Activating Protein (GAP).  The action of GAP causes the disabling of ras.  Tyrosine phosphatase SHP-2, involved in signal transduction of certain growth factors (IGF-1, EGF, etc.). ) and cytokines, by activating the MAP kinase cascade after binding to the Grb2-SoS complex, could also play a role in signal regulation.  In the case of phosphotyrosine proteins, the phosphorylated site recognition specificity relates to phosphotyrosine itself and to the 3 adjacent residues on the C-terminal side.  Nevertheless, a domain called TPB (phosphotyrosine binding) has recently been identified, whose binding specificity relates to residues on the N-terminal side with respect to phosphotyrosine.  This overlap of specificity sites suggests some competition between the two types of domain (and, therefore, a balance between the signaling pathways involved).  These adjacent residues on the N-terminal side of phosphotyrosine are also critical for the binding of tyrosine phosphatases and therefore for the lifetime of tyrosine phosphorylation.  Indeed, the mechanisms of regulation of cellular processes involve a permanent equilibrium between the phosphorylated state of a protein by a kinase, and its state dephosphorylated by a phosphatase.  Thus, some membrane tyrosine phosphatases, by dephosphorylating the insulin receptor, are able to inactivate it.  In mice, the absence of protein tyrosine phosphatase 1B (PTP-1 B) leads to an increase in insulin sensitivity.  Thanks to its SH2 domain, SHIP-2 binds to certain phosphotyrosines of IRS-1 and thus inhibits its activity.  As another phosphatase likely plays a role in the regulation of the insulin signal, SHIP-2 (SH2-domain inositol 5-phosphatase) normally catalyzes the conversion of PIP3 to PIP2.  In mice, heterozygous invalidation of the SHIP-2 gene increases insulin sensitivity.  Thus it appears that many mechanisms can modulate the cascade of reactions following the binding of extracellular messengers (insulin in the previous examples) to their receptors.  In addition, the various activation pathways involved interact with one another, thus making it particularly difficult to understand the precise role of each molecule.  This is the reason for the interest in phosphatases and kinases and their target (s).  From a practical point of view, there are to date many methods for studying kinases and phosphatases.  Some of the 25 most common methods are described below as a non-exhaustive presentation of the technological background of the invention.  The dephosphorylation of tyrosine in a peptide can be followed by the measurement of the fluorescence increase of this amino acid during the hydrolysis of the O-PO 3 H 2 group (Zhang et al. , 1993).  However, this variation is very small, of the order of 130 to 150 units, which represents hardly a doubling of the basic fluorescence of the substrate.  It is also easily altered by the presence of other amino acids, in particular Tyr or Trp.  Several assays using fluorescence have been reported both for measuring kinase activity and phosphatase activity.  These assays are based on the expected conformational change when a protein or peptide gains or loses the P03H2 group on a phosphorylatable amino acid.  To be effective, these methods require the introduction of a fluorescent group, such as 6-acryloyl-2-dimethylaminonaphthalene (acrylodan), BODIPY, IANBD amide, IAEDANS, etc. , on the side chain of a cysteine necessarily adjacent to the phosphorylatable or phosphorylated amino acid (reviewed in Brennan J. D. , 1999; Past et al. , 1994; Higaschi et al. , 1997 ; Noble J.  et al. , 2003).  The advantage of these tests is that they can be conducted in a homogeneous manner (in solution and in a continuous manner).  However, they have several disadvantages.  In particular, the requirement of vicinity between the cysteine and the phosphorylatable residue may represent an inconvenience to binding with the kinase or the phosphatase, and all the more so since this Cys residue will contain a very cumbersome fluorophore.  In addition, the vicinity constraint limits the construction (and diversity) of substrate libraries.  Finally, the sensitivity remains quite low, which necessitates large amounts of enzymes and a long measurement time.  This is an unfavorable factor for high throughput sorting of inhibitors (Noble J. , 2003).  Two methods similar to the preceding techniques and based on fluorescence have been reported.  They consist in introducing a fluorophore, such as rhodamine, at the end of a phosphorylable peptide, and then placing this peptide in the presence of a soluble or non-iron complex.  Phosphorylation of the amino acid (Tyr, Ser, Thr) by a kinase leads to the binding of the O-PO 3 H 2 group to the iron complex and to approximation of the fluorophore.  This results in a decrease in the fluorescence which can therefore be used to measure the activity of the enzyme, its inhibition, etc.  Conversely, in the case of a phosphatase, the fluorescence of the phosphopeptide, extinguished at the beginning because of the interaction of the peptide with the iron complex, will increase as the dephosphorylation progresses.  Again, this technique has several disadvantages: i) it requires an external supply of metal complex which can interact with inorganic phosphate present in the preparation used (homogenates) or with such a group in an inhibitor to be tested; ii) it presupposes that the conformation of the peptide is sufficiently flexible to change and come very close to the iron complex, which obviously depends on the peptide sequence.  This technique is currently marketed under different names (QTL biosystems, IQTM technology).  A more complicated variant requires fluorescence polarization revelation (Molecular Devices).  It is based on the change (reduction) in the rotation-displacement rate of the phosphorylated peptide when it is bound to the iron complex by its phosphate group, and conversely (increase) when the phosphate is removed by the action of a phosphorylated peptide. phosphatase.  In addition to the apparatus sophistication that this technique requires, the sensitivity remains low.  Another method is described in the international patent application WO 2005/012329.  This method is carried out in two stages and requires the construction of phosphorylatable peptides having a specific cleavage site for a given enzyme.  The peptide contains an N-terminal fluorescent group and C-terminal a rest capable of extinguishing the fluorescence emitted by the fluorophore (quencher).  Quenching is done by fluorescence energy transfer (FRET).  Phosphorylation of such a peptide does not affect FRET but quenching disappears when the added enzyme cuts the peptide and liberates the fluorophore contained in one of the two metabolites.  This is a non-homogeneous assay (two steps) which has numerous limitations, among which the implementation of a peptidase whose activity is modulated by the presence or absence of the phosphorylated residue, which limits the universal character of the method.  Other methods of studying protein kinase activity based on FRET fluorescence energy transfer have been reported.  They differ in the nature of the donor-acceptor pair (Sato et al. , 2002; Ting et al. , 2001; Zhang et al. , 2001).  However, all require the introduction of a pair of fluorophores, which makes it more difficult, in particular, to construct libraries of peptide substrates.  Fluorescent substrates sensitive to the activity of protein kinases have recently been described (Wang et al. , 2006).  In order to demonstrate the phosphorylation of Tyr residues, the authors fixed the fluorophore pyrene at the end of the side chain of L-2,3-diaminopropionic acid (Dap) or L-2 acid, 4-diaminobutanoic acid (Dab).  Dap or Dab residues thus modified are then introduced into peptide chains comprising 10 amino acids, including tyrosine, to form libraries of potential substrates.  The fluorescence of the pyrenyl residue is increased upon tyrosine phosphorylation by tyrosine kinases.  However, the authors found that these substrates were not universal.  Indeed, a number of tyrosine kinases do not recognize them.  Several explanations can be advanced.  On the one hand, the pyrenyl residue, because it is introduced at the end of the Dap or Dab side chain, is mobile and therefore more likely to hinder the access of the enzyme to its target and, therefore, to impair their interaction.  On the other hand, Wang et al.  the pyrene residue is introduced into the substrates at the end of the solid phase peptide synthesis, after the step of deprotection of the Dab 30 and Dap residues hitherto protected in the form of 4-methyltrityl.  This considerably limits the possibilities of diversification of the amino acids that can be used to build the substrate library.  In this case, taking into account the possibilities of reacting 1-pyrene acetic acid with the side chains, only 4 different amino acids (G, A, E and I) are used in the general formula.  Amino acids G, A and I are constitutionally devoid of reactive group in their side chain; the carboxylate in y glutamic acid E is protected by a t-Bu residue.  Under these conditions, as pointed out by the authors, the recognition of substrates by a large number of different kinases is de facto limited, because of the low sequence variability of the substrates present in the library.  Moreover, the change in fluorescence (here, an increase) during the phosphorylation of the Tyr residue is observed only when the side chain carrying the pyrene residue is in position +3 or -2 relative to tyrosine.  It follows therefore that this method can only allow the study of a small number of tyrosine kinases.  There are thus various methods for studying the molecules of interest which exhibit a biological activity, in particular an enzymatic activity, such as kinases and phosphatases.  However, all the methods available to date impose constraints of feasibility and of realization and / or have technical drawbacks, which significantly limit the utility, the ease of use, the implementation on a large scale ( or broadband: for high-throughput screening (HTS) and general application.  There is therefore a need for a method and means that are both (i) simple to implement and use; (Ii) effective; (iii) sensitive and (iv) applicable in a much more general way than known methods and means.  The present invention represents precisely the first satisfactory technical answer provided in the field.  The Applicant proposes here for the first time to use a single fluorescence reporter, both universal and powerful, of the phosphorylated or non-phosphorylated state of tyrosine residues, namely the Pya (L-pyrenylalanine) residue.  And, in the context of the present invention, the Applicant proposes to introduce Pya into short peptide sequences containing one or more phosphorylated or phosphorylated tyrosines, and to use it as a reporter for the phosphorylation and / or dephosphorylation reactions of this acid. aminated by kinases or phosphatases, respectively.  The sequences comprising the residue (s) Tyr and Pya can advantageously be immobilized on a support (e. boy Wut. ball, column or plate).  Briefly, the inventors have found that the phosphorylated or non-phosphorylated states of peptide sequences, derived from known substrates of phosphatases or kinases, or from a restricted library, lead to an intense change (decrease to extinction). , or increase) of the fluorescence of the protractor Pya, under the effect of a phenomenon of modulation of this parameter by collision (collisional quenching).  The present invention shows that these fluorescence changes can be advantageously used to measure the activity of a phosphatase or kinase and, thus, look for inhibitors or activators of these enzymes and quantify the potency of these molecules in a test. homogeneous high speed.  The Applicant therefore proposes methods that facilitate the characterization and the determination of tyrosine phosphatases and tyrosine kinases, as well as the characterization and the determination of their specific inhibitors or activators.  Also provided are methods that facilitate the identification of new phosphatases or kinases, as well as the search for substrates for phosphatases or kinases.  The Applicant further proposes means for selecting the substrate optimized for a known or unknown phosphatase / kinase, and for using it to measure the inhibitory or activating power of a given substance.  The Applicant also proposes a sensitive method making it possible to demonstrate and characterize complexes between 5 peptides or phosphorylated proteins and their receptor protein targets in a homogeneous medium or on cells or tissues.  As indicated above, the present invention takes advantage of the singular properties, demonstrated here for the first time, of the Pya fluorescent residue, when placed in an amino acid sequence of which at least one is an amino acid sequence. tyrosine or a phosphorylated tyrosine.  This amino acid Pya can be produced in large quantities in L form (Soleilhac et al. 1996) and is easily introduced by solid phase synthesis into a peptide sequence, which greatly minimizes the steric hindrance problems associated, in known techniques, with the introduction of various fluorescent groups at the chain end. Lateral amino acids (cysteine, lysine, Dap / Dab).  A major interest of the remainder Pya is the very intense fluorescence of pyrene which has two emission maxima at 377 nm and 405 nm, i.e. located in regions which are not affected by the emission of tyrosines and tryptophans possibly present in the protein to be studied or in the cell medium.  In addition, pyrene has excellent fluorescence quantum yield (0.32) as well as a long fluorescence lifetime (100 ns) (Berman ID (ed. ), 1971).  The fluorescence emitted by Pya is sensitive to a very polar environment, the proximity of the latter leading to fluorescence quenching by collision (Yaron et al.  1979).  This sensitivity to a polar environment has, moreover, already been used in the past to measure, for example, endothelin degradation by the endothelin converting enzyme (ECE) (Luciani et al. , 2001; patent FR 2 807 523), that of botulinum toxin B substrates (Anne et al. 2001; patent FR 2 809 733) and A (patent application FR 2 869 908).  .  In these examples, a very polar residue, p-nitrophenylalanine (pNF), was introduced into the substrates to serve as quencher.  The cleavage of the substrate between the two chromophores releases two metabolites and an intense fluorescence of the remainder Pya is observed, since it is no longer influenced by the quencher group.  However, in the context of the present invention, the inventors have found quite unexpectedly that the fluorescence of the Pya residue was strongly affected by the phosphorylation state of a target tyrosine of a kinase or a phosphatase.  In addition, surprisingly, they found that kinase phosphorylation of this amino acid and, therefore, its polarity change, produced not a decrease but an increase in the fluorescence of Pya.  Conversely, the action of a phosphatase such as PTP1B produces the opposite effect, i.e. a very significant decrease in the fluorescence of Pya.  According to a first aspect, the present invention relates to a method for fluorescence detection of an interaction between: a peptide containing one or more phosphorylated or phosphorylatable tyrosines and a Pya marker; and a target capable of interacting with this peptide, said method comprising at least, in the absence of cleavage of the peptide sequence: a) bringing the peptide containing the Pya marker into contact with said target; b) determining the level of F1 fluorescence of said labeled peptide in the presence of said target; and c) comparing the level of F1 fluorescence obtained in step b) with the fluorescence level FO of said labeled peptide in the absence of said target, a significant difference between FO and F1 revealing an interaction between the target and the target. peptide.  Within the meaning of the invention, an interaction can be direct or indirect.  Direct interaction between at least two partners does not involve any intermediaries or relays.  Either the partners are in immediate physical contact with each other (interaction that could be described as structural), or the partners interact remotely.  In contrast, in an indirect interaction between at least two partners, one or more additional partners serve as relays.  This relay (s) is (are) therefore, him (them), in direct interaction with the partners in question.  In any case, whatever the type of interaction, it has the effect of having an effect on the biological function of at least one of the partners (functional interaction).  The terms and expressions activity, function, biological activity and biological function are equivalent and correspond to the usual meaning in the technical field of the invention.  Such an activity can be in particular of enzymatic nature.  Peptide linkage is a sequence of residues or residues, which may be naturally occurring L-series amino acids, or modified amino acids such as phosphorylated natural amino acids, modified phenylalanine Phe- (p-CH2PO3H2) or p- CH2-Phe, the marker Pya.  The terms (peptide) chain, (peptide) chain (peptide) and peptide chain are equivalent and denote a sequence of amino acids, including the Pya marker, the length of which can range from 2 to 30 residues, preferably from 2 to 30 residues. 13 residues, more preferably from 2 to 15 residues, more preferably from 5 to 11 residues.  As can be seen from the foregoing, the terms residue and residue are synonymous and denote here a unit in the peptide chain, in particular an amino acid, whether or not modified, phosphorylated or not, and Pya.  Preferably, the peptide sequences used in the context of the present invention comprise at least one tyrosine residue, phosphorylated or otherwise.  Expression in the absence of cleavage of the peptide sequence means that any rupturing of one or more peptide bonds in the sequence in question is excluded.  This feature of the invention reflects the ability of the Pya remainder to serve as an autonomous fluorescence marker, allowing it alone to detect an interaction signal.  Of course, the cleavage as described above of the phosphatase-catalyzed hydrolysis of a -O-PO3H2 group in the -OH group is clearly distinguished here.  As is clear from the present text, the terms and expressions Pya marker, Pya fluorescence marker, Pya fluorescence reporter, Pya reporter, remain Pya, Pya residue are synonymous.  The peptide is said to be labeled when the peptide sequence contains the Pya marker.  The term target is used here to designate any type of compound of biological nature, whether natural, recombinant or synthetic.  It may especially be proteins, fatty acids, nucleic acids, antibodies, polysaccharides, etc.  Preferably, the target according to the invention is a protein and, more particularly, an enzyme.  In this case, the enzyme is preferably capable of modifying the structure and / or the function of the peptide as above-defined.  For example, it may be a phosphatase or a kinase.  Thus, in the case where the enzyme is a phosphatase (respectively, a kinase), the peptide may be, by direct or indirect interaction with this enzyme, structurally modified by dephosphorylation (respectively, by phosphorylation), thereby causing a modification of its function.  This change may result in activation or inhibition, partial or total, or a change of activity.  According to one embodiment, the enzyme is a phosphatase and the peptide comprises at least one phosphorylated Tyr residue.  Alternatively, the enzyme is a kinase and the peptide comprises at least one phosphorylatable Tyr residue.  Preferably, the enzyme according to the invention is a phosphatase and in this case the molecule comprises, or is preferably, at least one phosphorylated Tyr residue.  In practice, prior to the implementation of the method according to the invention, Pya can be incorporated into the peptide sequence via a covalent bond, that is to say a peptide-type bond.  The Pya tag is then preferably incorporated into the peptide sequence so as to be separated from the Tyr or pTyr residue or residue by up to 3, preferably 2, amino acids.  In steps b) and c), determination of the fluorescence levels FO and F1 of the labeled peptide is carried out by conventional methods well known to those skilled in the art.  This determination may be purely qualitative (the appearance or disappearance, or the increase or decrease in intensity, of the fluorescence is then detected).  Alternatively or additionally, the determination may be a quantitative measurement of the fluorescence (fluorescence measurements are then made which allow access to kinetic constants, dissociation constants, determine inhibitory or activating power, etc. ).  The quantitative determination of the fluorescence according to the method which is the subject of the present invention is advantageously suited to systematic, high throughput sorting (HTS) (For a recent review of the techniques currently available, see the application US 2005/0026234 in the name of Violin and al. According to one embodiment, the difference between the fluorescence levels FO and F1 observed in step c) corresponds to an increase in the fluorescence.  This is, for example, the case when the target is a protein tyrosine kinase and the peptide contains a tyrosine.  According to another embodiment, the difference between the fluorescence levels FO and F1 observed in step c) corresponds to a decrease in the fluorescence.  By way of example of this embodiment, the case where the target is a tyrosine phosphatase and the peptide contains a pTyr is exemplified.  A second aspect of the present invention is the application of the method described above to the detection, identification and selection of a target having biological activity, preferably an enzyme.  One embodiment corresponds, for example, to a screening method for identifying an enzyme, in which the fluorescence detection method according to the invention is carried out using, as substrate of the enzyme, the peptide containing the fluorescence marker Pya.  In this case, the target is then the enzyme to be identified.  The detection, identification and selection of the enzyme will be based on the activity that can be demonstrated in the presence of the substrate.  According to a third aspect, the present invention is concerned with the application of the fluorescence detection method as described above, to the assay of the biological activity of a target, preferably an enzyme.  According to one embodiment, a method is used to assay the activity of an enzyme, in particular a kinase (phosphorylation activity) or a phosphatase (dephosphorylation activity).  For this purpose, the fluorescence detection method described above, in which the peptide containing Pya is the substrate of the enzyme, is used, and the fluorescence levels, quantitatively determined, are correlated with levels of enzymatic activity.  A fourth aspect of the present invention relates to the application of the above fluorescence detection method to the detection, identification and selection of a peptide capable of acting as a substrate for an enzyme.  A particular embodiment corresponds to a method for screening a peptide containing the Pya marker and capable of acting as a substrate for an enzyme, which process comprises at least the implementation of steps a) to c) of the process The fluorescence detection method described above is such that, after step c), if FO and F1 are significantly different, the peptide is selected for its ability to act as a substrate for the enzyme.  In a fifth aspect, the present invention relates to the application of the fluorescence detection method described above, to the detection, identification and selection of a compound capable of disrupting the interaction between a peptide containing Pya acting as a substrate and a target.  The term disrupt can be synonymous here to promote / increase / activate or, conversely, to alter / reduce / inhibit / delete.  According to one embodiment, this application corresponds to a method for screening a compound capable of disturbing the interaction between a target and a peptide containing Pya and acting as a substrate, said method comprising at least the implementation of the steps a ) to c) of the detection method according to the invention and, if FO and F1 are significantly different, the selection of the compound capable of disrupting the interaction between the peptide and the target.  Preferably, the target is an enzyme, in particular a phosphatase or a kinase.  In the selection step, if FO is significantly greater than F1, the compound is able to inhibit the interaction between the peptide and the target (the compound is therefore an inhibitor).  On the other hand, if F1 is significantly higher than F0, said compound is able to promote the interaction between the peptide and the target (the compound is then an activator).  A sixth aspect of the present invention relates to the application of the fluorescence detection method as described above, to the determination of the kinetic characteristics of the interaction between: a peptide containing one or more phosphorylated or phosphorylated tyrosines and a marker Pya; and an enzyme exhibiting kinase or phosphatase activity.  According to a particular embodiment, this application of the fluorescence detection method according to the invention further comprises the quantitative determination of the power of a compound to inhibit or activate said interaction and, optionally, the calculation of the thermodynamic constants of this inhibition. or activation.  A seventh aspect of the present invention relates to a self-reporter peptide substrate of its phosphorylation state, comprising a Pya tag, of the general formula selected from the following formulas (I) and (II): Z- (XI) I- X 2 - (X '1) m -Pya- (X "I) nNH 2 (1) Z- (X 1) I-Pya- (X') m -X 2 - (X" I) n -NH 2 (II) in which: Z is acetyl, biotinyl or 6-aminohexanoyl; XI, X'1 and X "1 represent independently of each other a natural L-amino acid, phosphorylated or non-phosphorylated, or p-CH2-Phe; I + m + n is less than or equal to 9; X2 is selected among Tyr, pTyr and p-CH2-Phe.  According to a particular embodiment, a self-reporter peptide substrate of its phosphorylation state has the formula: ## STR2 ## NH2 (III) Z- (XI) 3-Pya- (X'1) 2-X2-E-NH2 (IV) wherein: - Z is acetyl, biotinyl or 6-aminohexanoyl; X, and X'1 independently of one another are a naturally occurring L-series amino acid selected from A, E, D, L; X2 is selected from Tyr, pTyr and p-CH2-Phe.  Advantageously, one or more libraries (or libraries) of substrates corresponding to one or other of these formulas (I) to (IV) will be constituted and may in particular be used for screening purposes, substrates (in particular , phosphatase substrates or kinases) and / or enzymes (in particular, phosphatases or kinases) capable of acting on these substrates.  According to an eighth aspect, the present invention is directed to the use of such a self-reporter peptide substrate of its phosphorylation state, in a fluorescence detection method as described above, or in one of the aforementioned applications.  This is the case of fixation on a support (plate, resin, magnetic beads, etc.). ) via the hexanoyl or biotinyl residue of a phosphorylated substrate corresponding to a phosphorylated sequence of a kinase.  The introduction of the p-CH2-Phe amino acid in place of pTyr prevents nonspecific or phosphatase hydrolysis, and allows the potential target (s) of the kinase to be isolated.  Typical examples of the phosphorylated sequence of the growth factor receptor or angiogenic factors which possess intracellular tyrosine kinase activity can be cited.  The phosphorylated, phosphatase-resistant and immobilized peptide makes it possible to isolate a target, for example SoS for the EGF receptor, by the fluorescence variation of the remainder p-CH2-Phe, during the interaction with its Specific target (s), that (s) may be phosphatases.  The following figures illustrate the present invention without limiting either the object or the scope thereof.  - Figure 1: Comparison of the fluorescence emission spectra of peptides 9 (phosphorylated) and 8 (non-phosphorylated).  Conditions: Buffer used: 50 mM Hepes pH 6: 9, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT.  Measurement using a Perkin-Elmer spectrophotometer at Xex = 343 nm; f ex = 15; f em = 2. 5.  FIG. 2: Kinetics of the dephosphorylation of peptide 9 (10 μM) by PTP1B (10 ng / mL).  Conditions: Buffer used: 50mM Hepes pH 6. 9, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT.  PTP1B was used at a concentration of 10 ng / mL.  The kinetics were monitored using a Berthold fluorometer (2%, ex = 340 nm, em = 405 nm, Lamp energy = 10,000) at 30 ° C.  Kinetic parameters of the reaction: Km = 1. 30 0. 20 μM, kcat = 46. 0 20 2. 0 s-1, kcat / Km = 3. 20 0. 10,107 M-1. 3: Inhibition of the phosphatase activity of PTP1B on substrate 9 by a competitive and reversible inhibitor: the PTP inhibitor IV.  Conditions: Buffer used: Hepes 50mM pH 6. 9, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT.  PTP1B was used at a concentration of 25 ng / mL, substrate 9 at a concentration of 10 μM.  Activity tests were performed after a 15 min incubation at 30 C.  (Reading on 96-well plates, using a Berthold fluorimeter at Xex = 340 nm, 2eem = 405 nm, Lamp energy = 10,000).  Figure 4: Phosphorylation kinetics of peptide 12 (20 μM) by p60s-src kinase.  Conditions: Buffer used: Tris 50mM pH 7. 5, 2mM DTT, 5mM MgCl 2, 1mM MnCl 2, 0.01mg / mL BSA, 1mM ATP.  P60c-src (tyrosine kinase family) (human, SIGMA, ref: S5439, lot # 014K2706) was used at a final concentration of 10 nM, substrate 12 was used at a concentration of 20 μM.  (Reading on 96-well plates, using a Berthold fluorometer at Xex = 340 nm, hem = 405 nm, Lamp energy = 10,000).  Kinetic parameters of the reaction: Km = 20. 16 μM, kcat = 1. 53 s-1, kcat / Km = 7. 59 104 M-1. s-1.  Other properties, embodiments and advantages of the present invention will be apparent from the following examples, given here for illustrative purposes only.  EXAMPLES I-Preparation of Marked Peptide Sequences, Usable as Potential Substrates of Kinases or Phosphatases: The Pya residue can be introduced: into known peptide sequences, which can serve as substrates for phosphatases and kinases, in libraries of Peptide sequences when enzyme substrates are unknown.  Introduction of the Pya residue in a known peptide sequence, which can serve as a substrate for phosphatases and kinases By way of example and in a nonlimiting manner, mention may be made of: a) the development of a PTP1B phosphatase substrate.  The insulin receptor activation domain, fragment 1157-1168 (I-pY-E-T-D-pY-pY-R-K-G-G-K) is dephosphorylated very rapidly, on both adjacent pY, by PTP1B.  Peptide 9 Ac-I-Pya-ETD-pY-pY-RK-NH2, in which Pya replaces a tyrosine, was synthesized and found to be an excellent PTPIB substrate, with simultaneous dephosphorylation of the two remaining pYs ( see examples below).  The non-phosphorylated analog (Ac-I-Pya-E-T-D-Y-Y-R-K-NH 2) is a kinase substrate and, more particularly, the PTK domain of the insulin receptor.  b) the development of a p60c-src kinase substrate.  From the commercial substrate Ac-I-Y-G-E-F-NH 2 (Nair et al. 1995), peptide 11 and its phosphorylated analog were synthesized (Ac-1-Y-G-E-Pya-NH2 and Ac-1-pY-G-E-Pya-NH2).  C) the development of a Hck kinase substrate.  From the substrate described in the literature (Porter et al. , 2000), compound 12 (Ac-E-E-Pya-I-Y-G-E-I-E-A-NH 2) and its phosphorylated analog (Ac-E-E-Pya-1-pY-G-E-I-E-A-NH 2) were synthesized.  I-2- Peptide Sequence Library: The library of substrate peptides claimed herein may advantageously be obtained by solid phase synthesis as described in the literature (D.  Conis et al. , 1998).  The chemical access to these libraries is simplified, either by the use of the split-mix method which leads to peptides having in one position a mixture of n amino acids (Furka A.  et al. , 1991), or using the Ala reverse scan method (Vetter S. W.  et al. , 2000) which consists of a peptide containing only alanines and to successively change each Ala by various amino acids.  a) Libraries built by the split and mix method: These libraries developed by the Applicant correspond to the general formulas: Ac-SKG-Pya- (X) nY (or pY) -G-GK-NH2 (V) and Ac-SKGY ( or pY) - (X) n-Pya-GGK-NH 2 (VI) wherein n = 1, 2 or 3 and X is a mixture of α-amino acids selected from the following amino acids: G, V, L, M, F, W,

P, S, T, C, Y, N, Q, E, D, H, K, R, pY, pCH2Phe. b) Librairies construites par la méthode Ala scan inverse : A partir de la séquence suivante, comportant des restes alanines (formule VII ci-dessous). Z-(A)m-X2-(A)n-N H2 (VII) 20 2903495 Où: Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl (lors de la synthèse effectuée en phase solide, le groupe Z est un acétyl) ; m et n sont chacun inférieurs ou égaux à 4 ; 5 X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe. Une seule alanine est remplacée dans chaque peptide par un résidu Pya, conduisant ainsi à 8 peptides différents si chacun des m et n vaut 4. Puis, dans chacun de ces peptides, chaque alanine restante est 10 successivement remplacée par un mélange des 18 acides aminés naturels (sauf Ala), auxquels on ajoute les acides aminés modifiés Tyr- OPO3H2 (pTyr) et Phe-CH2-PO3H2 (pCH2-Phe). II- Exemples de substrats de phosphatases et de kinases marqués 15 selon l'invention : Afin d'illustrer les méthodes proposées dans la partie I précédente, les peptides suivants ont été synthétisés selon la procédure susmentionnée. Chaque peptide a été synthétisé sous forme phosphorylée ou non sur la(les) tyrosine(s) contenue(s) dans leur 20 séquence.  P, S, T, C, Y, N, Q, E, D, H, K, R, pY, pCH2Phe. b) Libraries built by the Ala reverse-scan method: From the following sequence, containing alanine residues (formula VII below). Where: Z is acetyl, biotinyl or 6-aminohexanoyl (in the solid phase synthesis, Z is acetyl); Z- (A) m-X2- (A) n-NH2 (VII); m and n are each less than or equal to 4; X2 is selected from Tyr, pTyr and p-CH2-Phe. A single alanine is replaced in each peptide by a Pya residue, thus leading to 8 different peptides if each of m and n is 4. Then, in each of these peptides, each remaining alanine is successively replaced by a mixture of 18 amino acids. natural (except Ala), to which are added the modified amino acids Tyr-OPO3H2 (pTyr) and Phe-CH2-PO3H2 (pCH2-Phe). II-Examples of phosphatase substrates and labeled kinases according to the invention: In order to illustrate the methods proposed in the foregoing part I, the following peptides were synthesized according to the procedure mentioned above. Each peptide was synthesized in phosphorylated form or not on the tyrosine (s) contained in their sequence.

1 AcSKGPyaAKpYGG-K-NH2 2 Ac S K G Pya A K Y G G-K- NH2 3 AcELEFpYMDPyaENH2 4 AcELEF Y MDPyaENH2 25 5 AcEpYpYMDPyaENH2 6 AcE Y Y MDPyaENH2 23 2903495 7 AcIPyaETDpYYRKNH2 8 AcIPya ETD YY RKNH2 9 AcIPyaETDpYpYRKNH2 10 Ac I pY G E Pya NH2 5 1 1 Acl Y GEPyaNH2 12 AcEEPyaIYGEIEANH2 13 AcEEPyaIpYGEIEANH2 La figure 1 illustre la différence de fluorescence du reste Pya dans un peptide contenant une tyrosine phosphorylée 9 ou non phosphorylée 8 à 10 la même concentration (1 micromolaire). La figure 2 représente la cinétique de déphosphorylation du peptide 9 en présence de la phosphatase PTP1 B. La figure 3 représente la courbe d'inhibition de l'activité de la PTP1 B sur le substrat 9 par action d'un inhibiteur compétitif.1 AcSKGPyaAKpYGG-K-NH2 2 Ac SKG Pya AKYG GK-NH2 3 AcELEFpYMDPyaENH2 4 AcELEF Y MDPyaENH2 25 5 AcEpYpYMDPyaENH2 6 AcE YY MDPyaENH2 23 2903495 7 AcIPyaETDpYYRKNH2 8 AcIPya ETD YY RKNH2 9 AcIPyaETDpYpYRKNH2 10 Ac I pY GE Pya NH2 5 1 1 Acl Y GEPyaNH2 12 AcEEPyaIYGEIEANH2 13 AcEEPyaIpYGEIEANH2 Figure 1 illustrates the fluorescence difference of the Pya residue in a peptide containing a phosphorylated or non-phosphorylated tyrosine 8 at the same concentration (1 micromolar). Figure 2 shows the dephosphorylation kinetics of peptide 9 in the presence of PTP1 B phosphatase. Figure 3 shows the inhibition curve of PTP1 B activity on substrate 9 by the action of a competitive inhibitor.

15 La figure 4 représente la cinétique de phosphorylation du substrat 12 par la kinase p60 ' III- Dosage de l'activité enzymatique et identification d'inhibiteurs ou d'activateurs : 20 Lorsque la meilleure séquence peptidique substrat a été déterminée pour une enzyme (protéine phosphatase (PP) ou protéine kinase (PK)), elle peut être avantageusement utilisée comme substrat afin de déterminer les caractéristiques cinétiques de la réaction enzymatique selon les méthodes conventionnelles (voir la légende des figures 2 et 4).FIG. 4 shows kinase phosphorylation of substrate 12 by p60 kinase III. Assay for Enzymatic Activity and Identification of Inhibitors or Activators: When the Best Substrate Peptide Sequence Was Determined for an Enzyme (Protein phosphatase (PP) or protein kinase (PK)), it can be advantageously used as a substrate in order to determine the kinetic characteristics of the enzymatic reaction according to conventional methods (see the legend of FIGS. 2 and 4).

25 On recherche en particulier le meilleur rapport Km/kcat pour une variation de fluorescence maximale (par exemple, pour PTP1 B).In particular, the best Km / kcat ratio is sought for maximum fluorescence variation (e.g., for PTP1 B).

2903495 25 La détermination du pouvoir inhibiteur d'un composé candidat peut ensuite s'effectuer selon les méthodes classiques (voir figure 3), notamment par (i) pré-incubation de doses croissantes du composé potentiellement inhibiteur avec l'enzyme utilisée à une concentration 5 voisine de son Km et pendant un temps tel que l'on reste en-dessous d'un seuil fixé à 15% de l'activité maximale (définie comme étant l'activité conduisant à une déphosphorylation ou un phosphorylation totale), suivie d'une (ii) mise en contact de l'enzyme ainsi préincubée avec le peptide substrat sélectionné au préalable. On recherche alors une diminution de 10 l'activité enzymatique en présence du substrat et de l'inhibiteur potentiel, par rapport au niveau d'activité de référence de l'enzyme en présence du seul substrat. L'identification d'un activateur peut s'effectuer de manière analogue, mais en recherchant, à l'inverse, une augmentation de l'activité 15 enzymatique en présence du substrat et de l'activateur potentiel, par rapport au niveau d'activité de référence de l'enzyme en présence du seul substrat. IV- Recherche, caractérisation et inhibition/activation des complexes 20 formés par des peptides ou protéines phosphorylés et un domaine protéique récepteur : Plusieurs méthodes ont été décrites pour mettre en évidence des complexes formés entre un peptide ou une protéine phosphorylé(e) et un domaine protéique récepteur. Ces techniques sont le plus souvent basées 25 sur l'utilisation d'un fragment de la protéine contenant la séquence phosphorylée (Liu et al., 1999). Toutefois, en l'absence de rapporteur, la variation de fluorescence du reste Tyr-PO3H2 lors de l'interaction avec son substrat est très faible (Cussac et al., 1994).The determination of the inhibitory potency of a candidate compound can then be carried out according to conventional methods (see FIG. 3), in particular by (i) pre-incubation of increasing doses of the potentially inhibitory compound with the enzyme used at a concentration. Close to a threshold set at 15% of the maximum activity (defined as the activity leading to dephosphorylation or total phosphorylation), followed by (ii) bringing the thus preincubated enzyme into contact with the previously selected substrate peptide. A decrease in enzymatic activity is then sought in the presence of the substrate and the potential inhibitor, relative to the reference activity level of the enzyme in the presence of the single substrate. The identification of an activator can be carried out in a similar manner, but by seeking, conversely, an increase in the enzymatic activity in the presence of the substrate and the potential activator, relative to the level of activity. reference of the enzyme in the presence of the single substrate. IV- Investigation, characterization and inhibition / activation of complexes formed by phosphorylated peptides or proteins and a receptor protein domain: Several methods have been described to demonstrate complexes formed between a phosphorylated peptide or protein and a domain. protein receptor. These techniques are most often based on the use of a fragment of the protein containing the phosphorylated sequence (Liu et al., 1999). However, in the absence of a reporter, the fluorescence variation of the Tyr-PO3H2 residue during the interaction with its substrate is very low (Cussac et al., 1994).

2903495 Or, un autre avantage propre à l'invention tient à la variation importante et inattendue de la fluorescence du reste Pya dans une des séquences peptidiques d'une librairie conforme à ce qui précède, lorsque cette séquence reconnaît un effecteur de la tyrosine phosphatase ou 5 kinase spécifique. Ce (ou ces) effecteur(s) correspond(ent) à une protéine, un ensemble de protéines, un peptide, un acide nucléique libre ou complexé qui est ou sont impliqués de manière plus ou moins critique dans la signalisation cellulaire régulée par l'action des phosphatases et kinases.Another advantage of the invention lies in the large and unexpected variation of the fluorescence of the Pya residue in one of the peptide sequences of a library according to the above, when this sequence recognizes an effector of tyrosine phosphatase or 5 specific kinase. This (or these) effector (s) corresponds (e) to a protein, a set of proteins, a peptide, a free or complexed nucleic acid which is or is involved in a more or less critical manner in the cellular signaling regulated by the action of phosphatases and kinases.

10 Lorsque la séquence peptidique contenant le reste Pya doit être phosphorylée sur une tyrosine, on peut avantageusement remplacer cet aminoacide par un reste PheûCH2-PO3H2 (Marseigne et Roques, 1988), qui n'est pas hydrolysable et se prête donc plus facilement à des mesures, en milieu homogène ou non (homogénats cellulaires, cellules, tissus), 15 sans risque de clivage alors que ce pourrait être le cas avec le reste OPO3H2. La variation de la fluorescence de Pya observée lors de la liaison entre la séquence phosphorylée contenant le fluorophore et un effecteur est utilisée pour caractériser des inhibiteurs (ou activateurs) de cette interaction. Cette réaction qui s'effectue dans un milieu homogène en une 20 seule étape se prête facilement, et avantageusement du fait de sa sensibilité, à un tri systématique à haut débit de molécules inhibitrices ou activatrices (criblage de type HTS). V- Mise en évidence de phosphatases ou de kinases jusque-là 25 inconnues : La caractérisation des phosphates et kinases et leur mise en évidence lorsqu'elles sont inconnues devrait en principe pouvoir s'appuyer sur l'existence de séquences préférentielles pour les deux types d'enzymes.When the peptide sequence containing the Pya residue must be phosphorylated on a tyrosine, this amino acid may advantageously be replaced by a PheuCH 2 -PO 3 H 2 residue (Marseigne and Roques, 1988), which is not hydrolysable and therefore is more readily amenable to measurements, in a homogeneous or non-homogeneous medium (cell homogenates, cells, tissues), without any risk of cleavage, whereas this could be the case with the remainder OPO3H2. The variation of the fluorescence of Pya observed during the binding between the phosphorylated sequence containing the fluorophore and an effector is used to characterize inhibitors (or activators) of this interaction. This reaction, which is carried out in a homogeneous medium in a single step, is easily and advantageously amenable to high throughput screening of inhibitory or activating molecules (HTS screening). V - Detection of phosphatases or kinases hitherto unknown: The characterization of phosphates and kinases and their detection when they are unknown should in principle be able to rely on the existence of preferential sequences for both types. enzymes.

2903495 27 II est intéressant de noter que, même si la séquence globale est évidemment identique pour un système kinase/phosphatase donné, la séquence particulière permettant une reconnaissance spécifique optimisée de l'une ou l'autre enzyme n'est pas identique, la kinase 5 nécessitant généralement un enchaînement d'acides aminés plus long autour de l'amino-acide Tyr phosphorylable. Conformément à la présente invention, dans une première étape, les peptides marqués présents dans une librairie sont criblés afin d'isoler la séquence peptidique la plus affine pour une enzyme potentielle par 10 variation de fluorescence. Dans une seconde étape, le peptide le plus affin est utilisé pour isoler l'enzyme. Pour ce faire, on remplace le reste tyrosine (respectivement pTyr) par son analogue non hydrolysable pCH2-Phe. La séquence peptidique peut être immobilisée, par exemple, par l'intermédiaire d'un reste biotinyle en N-terminal qui va interagir avec une 15 avidine, ou bien par fixation covalente directe grâce à l'acide aminohexanoïque N-terminal. Les exemples ci-dessus s'intéressent plus particulièrement aux protéines kinases et protéines phosphatases comme cibles biologiques d'intérêt. Bien entendu, les moyens et méthodes proposés dans le cadre 20 de la présente invention sont d'application générale (universels). Par conséquent, grâce à la description détaillée de l'invention qui précède et à la lumière de ses connaissances générales dans le domaine, l'homme du métier est tout à fait capable de transposer - et, si nécessaire, d'adapter par des mises au point de routine - avec succès et sans efforts, les 25 exemples donnés ci-dessus.It is interesting to note that, although the overall sequence is obviously identical for a given kinase / phosphatase system, the particular sequence allowing optimized specific recognition of one or the other enzyme is not identical, the kinase Generally requiring a longer amino acid sequence around the phosphorylable Tyr amino acid. In accordance with the present invention, in a first step, tagged peptides present in a library are screened to isolate the most affine peptide sequence for a potential enzyme by fluorescence variation. In a second step, the most refined peptide is used to isolate the enzyme. To do this, the tyrosine residue (respectively pTyr) is replaced by its nonhydrolyzable analogue pCH2-Phe. The peptide sequence may be immobilized, for example, via an N-terminal biotinyl residue that will interact with an avidin, or by direct covalent attachment with N-terminal aminohexanoic acid. The above examples are more particularly concerned with protein kinases and protein phosphatases as biological targets of interest. Of course, the means and methods proposed in the context of the present invention are of general application (universal). Therefore, thanks to the detailed description of the foregoing invention and in the light of his general knowledge in the field, the skilled person is quite capable of transposing - and, if necessary, adapting by means of at the point of routine - with success and without effort, the 25 examples given above.

2903495 28 REFERENCES Zhang et al., Anal. Biochem. 1993, 211, 7-15 Brennan J.D., J. Fluorescence, 1999, 9, 295-312 5 Past et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 12880-12887 Higaschi et al., FEBS Letters, 1997, 414, 55-60 Noble J. et al., Anal. Biochem, 2003, 75, 2042-2047 Sato et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20, 287-294 Ting et al., PNAS, 2001, 98, 15003-15008 10 Zhang et al., PNAS, 2001, 98, 14997-15002 Wang et al., JACS, 2006, 128,1808-1809 Soleilhac et al., Anal. Biochem. 1996, 241,120-127 Yaron et al. Anal. Biochem.1979,95,228-235 Luciani et al., 2001, Biochem. J., 356, 813-819 15 Anne et al., Anal. Biochem. 2001, 291, 253-261 Kennely P.J. et Krebs E.G., J. Biol. Chem., 1991, 256, 15555-15558 Shelson S.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 1992, 89, 2027-2031 Garcia P. et al., J. Biol. Chem., 1993, 25, 25146-25151 Salmeen A. et al., Molecular Cell, 2000, 6, 1401-1412 20 Conis D. et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol., 1998, 31, 1345 Furka A. et al., General Method for the rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures, Int. J. Pept. Prot. Res., 1991, 37, 487-493 Sakai et al., J. Cell Biol., 1997, 139, 1465-1476 Root et al., PNAS, 1997, 94, 5685-5690 25 Xu et al., PNAS, 1999, 96, 151-156 Marseigne et Roques, J. Org. Chem., 1988, 53, 3621-3624 Berlman ID (ed.), 1971. Handbook of fluorescence spectra of aromatic molecules. Acad. Press N.Y. Nair et al., J. Med. Chem., 1995, 38, 4276 30 Porter et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 2721 Cussac et al., EMBO J., 1994, 17, 4011 2903495 29 Vetter S.W. et al., J. Biol. Cham., 2000, 275, 2265-2268 Liu et al., J.Med.Chem., 1999, 42, 3737-3741REFERENCES Zhang et al., Anal. Biochem. 1993, 211, 7-15 Brennan J.D., J. Fluorescence, 1999, 9, 295-312 Past et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 12880-12887 Higaschi et al., FEBS Letters, 1997, 414, 55-60 Noble J. et al., Anal. Biochem, 2003, 75, 2042-2047 Sato et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20, 287-294 Ting et al., PNAS, 2001, 98, 15003-15008 Zhang et al., PNAS, 2001, 98, 14997-15002 Wang et al., JACS, 2006, 128, 1808-1809 Soleilhac et al., Anal. Biochem. 1996, 241, 120-127 Yaron et al. Anal. Biochem. 1979. 95,228-235 Luciani et al., 2001, Biochem. J., 356, 813-819 Anne et al., Anal. Biochem. 2001, 291, 253-261 Kennely P.J. and Krebs E.G., J. Biol. Chem., 1991, 256, 15555-15558 Shelson S.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 1992, 89, 2027-2031 Garcia P. et al., J. Biol. Chem., 1993, 25, 25146-25151 Salmeen A. et al., Molecular Cell, 2000, 6, 1401-1412 Conis, D. et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol., 1998, 31, 1345 Furka A. et al., General Method for the rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures, Int. J. Pept. Prot. Res., 1991, 37, 487-493 Sakai et al., J. Cell Biol., 1997, 139, 1465-1476 Root et al., PNAS, 1997, 94, 5685-5690, Xu et al., PNAS, 1999, 96, 151-156 Marseigne and Roques, J. Org. Chem., 1988, 53, 3621-3624 Berlman ID (ed.), 1971. Handbook of fluorescence spectra of aromatic molecules. Acad. Press N.Y. Nair et al., J. Med. Chem., 1995, 38, 4276 Porter et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 2721 Cussac et al., EMBO J., 1994, 17, 4011, and Vetter S.W. et al., J. Biol. Cham., 2000, 275, 2265-2268 Liu et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3737-3741.

Claims (18)

REVENDICATIONS 1 Procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre : - un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou 5 phosphorylables et un marqueur Pya ; et - une cible susceptible d'interagir avec ce peptide, ledit procédé comprenant au moins, en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique : a) la mise en présence du peptide contenant le marqueur Pya, avec ladite 10 cible ; b) la détermination du niveau de fluorescence FI dudit peptide marqué en présence de ladite cible ; et c) la comparaison du niveau de fluorescence FI obtenu à l'étape b) avec le niveau de fluorescence FO dudit peptide marqué en l'absence de ladite 15 cible, une différence significative entre FO et FI révélant une interaction entre la cible et le peptide.  A method of fluorescently detecting an interaction between: a peptide containing one or more phosphorylated or phosphorylatable tyrosines and a Pya marker; and a target capable of interacting with this peptide, said method comprising at least, in the absence of cleavage of the peptide sequence: a) bringing the peptide containing the Pya marker into contact with said target; b) determining the FI fluorescence level of said labeled peptide in the presence of said target; and c) comparing the fluorescence level F1 obtained in step b) with the fluorescence level FO of said labeled peptide in the absence of said target, a significant difference between FO and FI revealing an interaction between the target and the target. peptide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite interaction est directe.  2. Method according to claim 1, characterized in that said interaction is direct. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite interaction est indirecte.  3. Method according to claim 1, characterized in that said interaction is indirect. 4. Procédé selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que ladite 25 cible est une enzyme.  4. Process according to claim 1 to 3, characterized in that said target is an enzyme. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite enzyme est une phosphatase ou une protéine kinase. 20 2903495 31  5. Method according to claim 4, characterized in that said enzyme is a phosphatase or a protein kinase. 20 2903495 31 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite enzyme est une phosphatase et ledit peptide comprend au moins un résidu Tyr phosphorylé.  6. Method according to claim 5, characterized in that said enzyme is a phosphatase and said peptide comprises at least one phosphorylated Tyr residue. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la détermination des niveaux de fluorescence FO et FI de ladite molécule marquée est quantitative.  7. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the determination of the fluorescence levels FO and FI of said labeled molecule is quantitative. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 10 caractérisé en ce que la différence entre les niveaux de fluorescence FO et FI correspond à une augmentation de la fluorescence.  8. Method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the difference between the fluorescence levels FO and FI corresponds to an increase in fluorescence. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la différence entre les niveaux de fluorescence FO et 15 F1 correspond à une diminution de la fluorescence.  9. Method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the difference between the fluorescence levels FO and F1 corresponds to a decrease in fluorescence. 10. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 à la détection, l'identification et la sélection d'une cible ayant une activité biologique, de préférence une enzyme.  10. Application of the method according to any one of claims 1 to 9 to the detection, identification and selection of a target having a biological activity, preferably an enzyme. 11. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 au dosage de l'activité biologique d'une cible, de préférence une enzyme. 25  11. Application of the method according to any one of claims 1 to 9 to the assay of the biological activity of a target, preferably an enzyme. 25 12. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 à la détection, l'identification et la sélection d'un peptide capable d'agir comme substrat d'une enzyme.  12. Application of the method according to any one of claims 1 to 9 to the detection, identification and selection of a peptide capable of acting as a substrate of an enzyme. 13. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 30 1 à 9 à la détection, l'identification et la sélection d'un composé capable 20 2903495 32 de perturber l'interaction entre un peptide et une cible, de préférence une enzyme.  13. Application of the method according to any one of claims 1 to 9 to the detection, identification and selection of a compound capable of disrupting the interaction between a peptide and a target, preferably an enzyme. . 14. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 5 1 à 9 à la détermination des caractéristiques cinétiques de l'interaction entre : - un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou phosphorylables et un marqueur Pya ; et - une enzyme présentant une activité kinase ou phosphatase.  14. Application of the method according to any one of claims 1 to 9 to the determination of the kinetic characteristics of the interaction between: a peptide containing one or more phosphorylated or phosphorylated tyrosines and a Pya marker; and an enzyme exhibiting kinase or phosphatase activity. 15. Application selon la revendication 14, comprenant en outre la détermination quantitative du pouvoir d'un composé à inhiber ou activer ladite interaction et, facultativement, le calcul des constantes thermodynamiques de cette inhibition ou activation.  The use of claim 14, further comprising quantitatively determining the ability of a compound to inhibit or activate said interaction and, optionally, calculating the thermodynamic constants of such inhibition or activation. 16. Substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation comprenant un marqueur Pya et susceptible d'être utilisé dans un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou dans une application selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, de formule générale choisie parmi les formules (I) et (Il) suivantes : Z-(XI )I-X2-(X'1)m-Pya-(X"I )n-NH2 (1) Z-(X1)I-Pya-(X'1)m-X2-(X"1)n-NH2 (II) dans lesquelles : Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ; XI, X'l et X"1 représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L, phosphorylé ou non, ou p-CH2-Phe ; I+m+n est inférieur ou égal à 9 ; - X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe. • 2903495 33  16. The self-reporter peptide substrate of its phosphorylation state comprising a Pya marker and capable of being used in a process according to any one of claims 1 to 9 or in an application according to any one of claims 10 to 15, of general formula selected from the following formulas (I) and (II): Z- (XI) I-X2- (X'1) m-Pya- (X "I) n -NH2 (1) Z- (X1) I-Pya- (X'1) m-X2- (X-1) n -NH2 (II) wherein: Z is acetyl, biotinyl or 6-aminohexanoyl; XI, X'l and X "1 represent, independently of each other, a natural L-amino acid, phosphorylated or non-phosphorylated, or p-CH 2 -Phe; I + m + n is less than or equal to 9; from Tyr, pTyr and p-CH2-Phe • 2903495 33 17. Substrat peptidique selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il a pour formule, une formule choisie parmi les formules (III) et (IV) suivantes : 5 Z-(X1)3-X2-(X'1)2-Pya-E-N H2 (III) Z-(X1)3-Pya-(X'1)2-X2-E-NH2 (IV) dans lesquelles : - Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ; 10 X1 et X'1 représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L choisi parmi A, E, D, L ; X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe.  17. Peptide substrate according to claim 16, characterized in that it has the formula, a formula chosen from the following formulas (III) and (IV): Z- (X1) 3-X2- (X'1) 2 -Pya-EN H2 (III) Z- (X1) 3-Pya- (X'1) 2-X2-E-NH2 (IV) wherein: - Z is acetyl, biotinyl or 6-aminohexanoyl; X1 and X'1 independently of one another are a naturally occurring L-series amino acid selected from A, E, D, L; X2 is selected from Tyr, pTyr and p-CH2-Phe. 18. Utilisation d'un substrat selon la revendication 16 ou 17 dans un 15 procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou dans une application selon l'une quelconque des revendications 10 à 15.  18. Use of a substrate according to claim 16 or 17 in a process according to any one of claims 1 to 9 or in an application according to any one of claims 10 to 15.