FR2895896A1 - Procede de reconstruction d'image par lumiere retrodiffusee et dispositif pour la mise en oeuvre d'un tel procede - Google Patents

Abstract

Le procédé permet de reconstruire une image de tomographie optique par fluorescence pour examiner un objet comportant des fluorophores el ayant une première face et une seconde face opposée. Le procédlé comporte une première étape d'éclairement (F1) de la première face de l'objet avec une lumière d'excitation des fluorophores. Une première image est acquise (F2) par détection d'une lumière émise par la seconde face de l'objet et une seconde image est acquise (F3) par détection d'une lumière émise par la première face de l'objet. La reconstruction (F4) de la répartition des fluorophores dans l'objet est effectuée par l'intermédiaire de la première et de la seconde image. Le procédé peut, de plus, comporter une seconde étape d'éclairement de la seconde face de l'objet avec une lumière d'excitation des fluorophores et l'acquisition de deux images correspondantes.

Description

Procédé de reconstruction d'image par lumière rétrodiffusée et dispositif

pour la mise en oeuvre d'un tel procédé 5 Domaine technique de l'invention L'invention concerne un procédé de reconstruction d'une image de tomographie optique par fluorescence pour examiner un objet comportent des fluorophores et ayant une première face et une seconde face opposée, 10 procédé comportant : une première étape d'éclairement de la première face de l'objet avec une lumière d'excitation des fluorophores et l'acquisition d'une première image par détection d'une lumière émise par la seconde face de l'objet. 15 État de la technique La tomographie optique de fluorescence consiste à déterminer la répartition 20 tridimensionnelle de fluorophores dans un objet comportant un milieu homogène diffusant. Les fluorophores peuvent être fonctionnalisés pour cibler des cellules tumorales et, ainsi, marquer des cellules cancéreuses. Un a face avant de l'objet est éclairée par une lumière d'excitation dont le spectre correspond au fluorophore. Généralement une lumière d'excitation est déplacée 25 point par point sur la surface de l'objet et une caméra prélève l'image de la lumière de fluorescence qui est émise par la face arrière de l'objet, dans le cas d'une géométrie de transmission où l'objet présente, par exemple, la forme d'une tranche ou d'une plaque (géométrie de type slab en anglais). Ainsi, la face avant et la face arrière opposée constituent deux plans parallèles. Cette 30 géométrie est fréquemment utilisée en mammographie et imagerie du petit animal.

Comme représenté sur la figure 1, l'objet 1 est éclairé par un jeu de sources lumineuses S d'une longueur d'onde d'excitation k ex placées vis-à-vis d'une 35 première face 2 de l'objet 1. La lumière transmise à la longueur d'onde d'excitation Xex et la lumière émise par les fluorophores 4 avec une longueur d'onde d'émission ) em sont détectées par un jeu de détecteurs D disposé vis-à-vis d'une seconde face 3 de l'objet 1, opposée à la première face 2. En pratique, le jeu de sources peut être remplacé par un laser dont le faisceau se déplace sur la première face 2 de l'objet 1.

Les longueurs d'onde d'excitation Xex et d'émission ~,ern sont détectées séparément par l'intermédiaire de filtres optiques. Ainsi, on distingue les signaux Uex(s,d) détectés à la longueur d'onde d'excitation Xex et les signaux Uem(s,d) détectés à la longueur d'onde d'émission Xem, s et d étant les indices identifiant respectivement la source S et le détecteur D correspondant au signal U(s,d), c'est-à-dire la source S et le détecteur D activés pour l'acquisition du signal U(s,d).

Le traitement des signaux Uex(s,d) et Uem(s,d) permet de reconstruire la répartition des fluorophores 4 dans l'objet 1. Les algorithmes pour résoadre ce problème sont bien connus et décrits, par exemple, dans l'article Optical tomography in medical imaging de S. R.Arridge (Inverse Problems 15, R41-R93, 1999). Le problème est notamment résolu à partir de l'équaion de diffusion, établie à partir de l'équation de transfert radiatif. Chaque source S génère dans le milieu une onde diffusive ayant la longueur d'onde ?.ex. L'onde diffusive se propage dans le milieu et une partie de l'énergie de l'onde diffusive excite les fluorophores 4 qui peuvent être considérés comme des :.ources secondaires réémettant un rayonnement à la longueur d'onde d'émission lem.

L'équation de diffusion est résolue par l'intermédiaire de fonctions de Green dans une géométrie de plans parallèles, ce qui permet d'obtenir une expression analytique pour la propagation de l'onde diffusive dans le milieu.

En ce qui conceme le signal de fluorescence, on considère que chaque fluorophore 4 présente un paramètre de conversion de photons correspondant à la fraction de l'énergie incidente qui est réémise avec la longueur d'onde d'émission Xem. De manière plus générale, on peut associer à chaque élément de volume M (voxel) de l'objet 1 un paramètre de conversion X(m), où m est l'indice de maillage identifiant les voxels M qui sont définis selon un maillage quelconque du volume de l'objet 1. On note G(m,d) la fonction de Green correspondant à la propagation de lumière entre un voxel M et un détecteur D. De plus, on note G(s,m) la fonction de Green correspondant à la propagation de lumière entre une source S et un voxel M. Le flux incident dans le voxel M et correspondant à la source S est proportionnel à Q(s)G(s,m), où Q(s) est le flux émis par la source S. Le flux réémis par le voxel M avec la longueur d'onde d'émission ? em est donné par Q(s)G(s,m)X(m). La contribution du voxel M excité par la source S, au signal détecté par le détecteur D est donc proportionnelle à Q(s)G(s,m)X(m)G(m,d). En considérant l'ensemble du volume de l'objet, le signal Uem(s,d) est proportionnel à la somme des io contributions de tous les voxels M, c'est-à-dire à l'expression Q(s)Em(G(s,m)X(m)G(m,d)). Lorsque les flux Q(s) émis par les sources S sont constants et égaux pour toutes les différentes sources, on peut incorporer les différentes constantes dans les paramètres de conversion X(m) et on obtient : 15 Uems,d = Gs,mXmGm,d (1). m On obtient ainsi un système linéaire d'équations reliant les mesures des détecteurs aux paramètres de conversion X(m) inconnus et recherchés.

L'acquisition d'un nombre suffisant de mesures permet ainsi de reconstruire la 20 répartition des fluorophores 4 dans l'objet 1. La reconstruction proprement dite est, par exemple, effectuée au moyen d'un algorithme itératif de type ART (Algebraic Reconstruction Technique) qui minimise l'erreur entre les mesures expérimentales et le résultat analytique calculé.

25 L'algoritme ART minimise l'erreur 2 Uemsd ~jGs,mXmGm,d m Uer s,d Uex s,d = IIYmes ù m il2 (2), avec W=G(s,m)G(m,d)/Uex(s,d).

30 La lumière d'excitation de la fluorescence et la lumière de fluorescence sont habituellement situées dans la bande spectrale du proche infrarouge, puisque le pouvoir de pénétration de cette lumière est relativement important dans des tissus biologiques. Le coefficient d'extinction étant par exemple de 2,5cm-1, l'intensité de lumière est réduite par un facteur 12 pour iliaque centimètre pénétré, ce qui exclut l'étude dans une profondeur supérieure à 10 cm.

Etant donné que l'objet présente une certaine épaisseur, les fluorophores ne sont pas tous à la même distance ni de la source de lumière, ni des détecteurs, ce qui entraîne une perte de précision dans la reconstruction de l'image. En effet, les zones de l'objet situées près du plan des sources de lumière sont imagées avec une qualité moindre que celles qui sont près du plan des détecteurs, comme indiqué dans l'article Effects of sampling and limited data in optical tomography de V.A.Markel et al. (Applied Physics Letters Vol. 81, No.7, 2002).

L'article Dual-projection optical diffusion tomography de V.A.Markel et al. (Optics letters Vol. 29, No.17, 2004) propose d'utiliser deux projections orthogonales pour améliorer la résolution en profondeur par rapport à la résolution transverse, ce qui ne permet pas d'examiner des objets sous forme de tranche dont l'épaisseur est de l'ordre du centimètre et dont la largeur et la hauteur sont nettement supérieures au centimètre. L'article SingulEr-value analysis and optimization of experimental parameters in fluorescence molecular tomography de E.E.Graves et al. (J. Opt. Soc. Am. Vol. 21, No.2, 2004) étudie les distributions optimales de sources de lumière et de détecteurs pour la géométrie en plans parallèles.

De plus, dans le cas où l'ensemble de détecteurs est constitué par une caméra, le nombre de points éclairés individuellement est souvent plus petit que le nombre de pixels de la caméra. Cette différence de résolution de part et d'autre de l'objet mène à un résultat peu précis.

Par ailleurs, l'article Comparison of imaging geometries for diffuse optical tomography of tissue de B.W.Pogue et al. (Optics Express Vol.4, No.8, 1999) compare différentes géométries de tomographie optique diffusive (DOT), sans cependant, aborder la fluorescence.

Objet de l'invention L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients et, en particulier, 5 d'améliorer la résolution de la reconstruction de la répartition de fluorophores dans un milieu diffusant ayant la forme d'une plaque. Selon l'invention, ce but est atteint par le fait que le procédé comporte également : 10 l'acquisition d'une seconde image par détection d'une lumière émise par la première face de l'objet et la reconstruction de la répartition des fluorophores clans l'objet par l'intermédiaire de la première et de la seconde image. 15 Selon un développement de l'invention, le procédé comporte en outre : une seconde étape d'éclairement de la seconde face de l'objet avec une lumière d'excitation des fluorophores, l'acquisition d'une troisième image par détection d'une lumière émise par la première face de l'objet, 20 l'acquisition d'une quatrième image par détection d'une lumière émise par la seconde face de l'objet, la reconstruction de la répartition des fluorophores dans l'objet par l'intermédiaire des quatre images.

25 Avantageusement, la lumière émise par la première face et/ou la lumière émise par la seconde face sont filtrées afin de supprimer la lumière d'excitation.

Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, la reconstruction de la répartition des fluorophores dans l'objet est effectuée en établissant, pour 30 chaque acquisition d'image, un système linéaire d'équations à partir d'une matrice de fonctions de Green correspondant.

Les systèmes linéaires d'équations peuvent notamment être combiné:3 pour être résolus. 35 L'invention a également pour but un disposif pour la mise en oeuvre du procédé de reconstruction, ce dispositif comportant : des moyens pour l'éclairement de la première face de l'objet avec une lumière d'excitation des fluorophores et des moyens pour l'acquisition d'image par détection d'une lumière émise par la seconde face de l'objet, des moyens pour l'acquisition d'image par détection d'une lumière émise par la première face de l'objet et des moyens pour la reconstruction de la répartition des fluorophores dans l'objet par l'intermédiaire de la première et de la seconde irnage. Avantageusement, les moyens pour l'acquisition d'image sont munis d'un filtre pour supprimer la lumière d'excitation.

Le dispositif peut comporter des moyens pour l'éclairement de la seconde face de l'objet avec une lumière d'excitation des fluorophores. Description sommaire des dessins D'autres avantages et caractéristiques ressortiront plus clairement de la description qui va suivre de modes particuliers de réalisation de l'invention donnés à titre d'exemples non limitatifs et représentés aux dessins annexés, dans lesquels : 25 La figure 1 illustre un procédé de reconstruction selon l'art antérieur. La figure 2 montre schématiquement différentes étapes d'un procédé de reconstruction selon l'invention. La figure 3 illustre la propagation du rayonnement de fluorescence dans u i objet 30 présentant une épaisseur L. La figure 4 montre schématiquement différentes étapes d'un mode de réalisation particulier du procédé de reconstruction selon l'invention. La figure 5 représente un mode de réalisation particulier d'un dispositif selon l'invention. 35 Description de modes particuliers de réalisation L'invention concerne une géométrie en plans parallèles, l'objet 1 ayant, typiquement, une épaisseur comprise entre 10 et 15mm. Un jeu de sources S de lumière est, de préférence, constitué par une source laser que l'on déplace selon deux directions orthogonales pour quadriller l'objet 1. Typiquerient, le laser décrit une grille de 11 par 15 positions avec un pas de 3mm. Selon la précision à obtenir, le pas peut être réduit et selon la taille de la zone à io observer, le nombre de points peut être augmenté (par exemple de l'crdre de 30 points ou plus dans les deux directions).

L'ensemble de détecteurs D est, de préférence, constitué par une caméra CCD couplée à une lentille permettant d'imager l'objet dans un plan parallèle à 15 la surface de l'objet 1. La caméra acquiert ainsi une image pour chaque position de la source laser.

La résolution dans un plan parallèle aux faces 2 et 3 est naturellement meilleure que la résolution perpendiculaire à ce plan, car les détecteurs sont disposés 20 dans un plan parallèle aux faces 2 et 3 de l'objet, notamment lorsqu'une caméra de type CCD est dirigée sur l'une des première et seconde faces de l'objet. II est, ainsi, difficile de localiser un fluorophore 4 selon la pro.'ondeur perpendiculaire aux faces 2 et 3. En effet, l'intensité du signal détecté, par exemple, ne dépend pas seulement de la distance entre le fluorophore 4 et les 25 détecteurs mais également du rendement de conversion du fluorophore 4.

Comme indiqué à la figure 2, une première étape d'éclairement F1 consiste à éclairer la première face 2 de l'objet 1 avec une lumière d'excitation des fluorophores 4 ayant une longueur d'onde d'excitation Une première image 30 est acquise (F2) par détection d'une lumière émise par la seconde face 3 de l'objet 1. Le rayonnement détecté correspondant à la première image est alors le rayonnement transmis par l'objet 1, et comporte la longueur d'onde d'excitation Xex et la longueur d'onde d'émission Xem.

35 On entend par la lumière émise par une face de l'objet, toute la lumière sortant de l'objet par cette face et, ainsi, les rayons incidents sur un détecteur disposé en regard de cette face. On ne détecte donc pas seulement des photons émis par les fluorophores 4 directement en direction du détecteur mais également la lumière d'excitation transmise en direction du détecteur.

De plus, une seconde image (F3) est acquise par détection d'une lumière émise par la première face 2 de l'objet 1. Le rayonnement détecté correspondant à la seconde image est alors le rayonnement rétrodiffusé par l'objet 1, et comporte la longueur d'onde d'excitation Xex et la longueur d'onde d'émission Xem.

Le rayonnement rétrodiffusé et le rayonnement transmis sont alimentés lors de la première étape d'éclairement (F1) par l'énergie provenant de la source S. Les première et seconde images correspondent à l'excitation des fluorophores 4 par la première étape d'éclairement F1 et sont acquises pendant ou directement après la première étape d'éclairement F1. La reconstructioi de la répartition des fluorophores 4 dans l'objet 1 est effectuée par l'intermédiaire de la première et de la seconde image (F4).

Il peut être avantageux d'acquérir l'une des deux images (F2, F3) ou les deux images (F2, F3) à partir de la seule lumière de fluorescence. Pour cela, les détecteurs sont équipés de filtres qui suppriment la lumière d'excitation (longueur d'onde d'excitation Xex) et laissent passer la lumière de fluorescence (longueur d'onde d'émission Xem).

Ainsi, afin de reconstruire la répartition des fluorophores 4 dans l'objet 1, on mesure le rayonnement transmis aussi bien que le rayonnement rétrodiffusé. Ceci permet d'obtenir une meilleure résolution en profondeur, c'est-à-dire perpendiculairement aux première (2) et seconde (3) faces de l'objet 1.

En effet, le signal transmis et le signal rétrodiffusé, en particulier les signaux de fluorescence, sont de natures très différentes, notamment en relation avec la résolution en profondeur, ce qui peut être mieux compris à l'aide de la figure 3. Le signal incident 5, en provenance de la source S, traverse l'objet 1 sur une longueur z et est, ainsi (en première approximation), proportionnel à un facteur Pi=exp(-az)/z dû à l'amortissement dans le matériau et à l'étalement spatial de l'onde. La variable z correspond à la profondeur de l'emplacement d'un fluorophore 4 dans l'objet 1 ayant une épaisseur L. s Le signal transmis 6, en direction du détecteur Dt de la lumière transmise, traverse l'objet 1 sur une longueur L-z et est, ainsi (en première approximation), proportionnel à un facteur Pt=exp(-a(L-z))/(L-z). Le signal transmis 6 étant, de plus, proportionnel au signal incident 5 qui l'alimente, le signal 6 est donc proportionnel à un facteur Pi.Pt=exp(-aL)/(zL-z2).

Le signal rétrodiffusé 7, en direction du détecteur Dr de la lumière rétrodiffusée, traverse l'objet 1 sur une longueur z et est, ainsi, proportionnel à un facteur Pr=exp(-az)/z. Le signal rétrodiffusé 7 étant, de plus, proportionnel au signal incident 5 qui l'alimente, le signal rétrodiffusé 7 est donc proportionnel à un facteur Pi.Pr= exp(-2az)/z2.

On constate ainsi, que le signal transmis 6, proportionnel à Pi. Pt=exp(-o L)/(zL- z2), ne dépend pas de manière exponentielle de z, tandis que le signal rétrodiffusé 7, proportionnel à Pi.Pr= exp(-2az)/z2, dépend de [-lanière exponentielle de z, ce qui permet d'obtenir une meilleure précision du signal rétrodiffusé 7 en fonction de la profondeur exprimée par la variable z.

Comme le signal rétrodiffusé 7 s'atténue fortement avec la profondeur, les fluorophores 4 positionnés loin de la première face 2 disposée en regard de la source S d'éclairement, seront difficilement perceptibles par le détecteur de rétrodiffusion Dr. Le rapport de signal sur bruit et la résolution en profondeur diminuent alors pour des profondeurs importantes. Il est possible de pallier à cet inconvénient en utilisant un deuxième ensemble de mesures, pour lesquelles la seconde face 3 est éclairée avec une lumière d'excitation des fluorophores 4 ayant une longueur d'onde d'excitation Xex. Pour ce deuxième ensemble de mesures, le rayonnement transmis est détecté en regard de la première face 2 et le rayonnement rétrodiffusé est détecté en regard de la seconde face 3 de l'objet 1.

Ainsi, comme représenté à la figure 4, une seconde étape d"éclairement (F5) consiste à éclairer la seconde face 3 de l'objet 1 avec une lumière d'excitation des fluorophores 4 ayant une longueur d'onde Xex. Une troisième image est acquise (F6) par détection d'une lumière émise par la première face 2 de l'objet 1, c'est-à-dire un rayonnement transmis par l'objet (a.em et Xex). Une quatrième image est acquise (F7) par détection d'une lumière émise par la seconde face 2 de l'objet 1, c'est-à-dire un rayonnement rétrodiffusé (~,em et k ex). La répartition des fluorophores 4 dans l'objet 1 est ensuite reconstruite (F8) par l'intermédiaire des quatre images. La troisième image et la quatrième image font suite à l'excitation des fluorophores 4 provoquée par la seconde étape d'éclairement F5 et sont acquises pendant la seconde étape d'éclairement F5.

10 Avantageusement, l'une ou les deux images de transmission (première image et/ou troisième image) peuvent être réalisées grâce à la seule lumière de fluorescence (? em) transmise, la lumière d'excitation étant filtrée en amont de la détection. Pour cela, les détecteurs sont équipés de filtres qui suppriment la lumière d'excitation (longueur d'onde d'excitation k ex) et laissent passer la 15 lumière de fluorescence (longueur d'onde d'émission Xem).

De même, l'une ou les deux images de rétrodiffusion (seconde image et/ou quatrième image) peuvent aussi être filtrées pour ne conserver que la lumière de fluorescence. Et enfin, il peut être intéressant de filtrer les quatre imager. 20 Les étapes d'éclairement (F1, F5) peuvent être effectuées avec une même source de lumière S. Dans un premier mode de réalisation particulier, la source de lumière S et l'objet 1 sont déplacés relativement entre les première F1) et seconde (F5) étapes d'éclairement. Par exemple, la source de lumière S est 25 déplacée, tandis que l'objet 1 reste immobile. On peut également envisager de retourner l'objet 1. Dans un second mode de réalisation particulier, la IJmière d'excitation peut être dirigée sur les première (2) et seconde (3) faces de l'objet 1 par l'intermédiaire d'un ou de plusieurs miroirs et/ou lames semiréfléchissantes. 30 Les quatrième (F7) et troisième (F6) acquisitions d'image peuvent être effectuées, respectivement, avec les détecteurs Dl et D2 associés aux première et seconde étapes d'acquisition d'image (F2, F4).

35 Dans le mode de réalisation particulier représenté à la figure 5, le dispositif pour la mise en oeuvre du procédé de reconstruction comporte une première source S1 disposée en regard de la première face 2 de l'objet 1. La première source5 S1 émet une lumière d'excitation des fluorophores 4, c'est-à-dire une lumière ayant la longueur d'onde Un premier détecteur Dl pour l'acquisition d'image permet de détecter une lumière émise par la première face 2 de l'objet. Le détecteur peut comporter, si nécessaire, un filtre laissant passer la longueur d'onde d'émission Xem et atténuant la longueur d'onde d'excitation tex. Le dispositif peut comporter une seconde source S2 pour l'éclairement de la seconde face 3 de l'objet 1 avec une lumière d'excitation (Xex) des fluorophores 4.

Un second détecteur D2 pour l'acquisition d'image permet de détecter une lumière émise par la seconde face 2 de l'objet. Ce détecteur également, peut comporter, si nécessaire, un filtre laissant passer la longueur d'onde d'émission ? em et atténuant la longueur d'onde d'excitation Xex. Une unité de contrôle 7 permet de gérer les sources S1 et S2 et les détecteurs Dl et D2. L'unité de contrôle 7 permet également de traiter les signaux reçus par les détecteurs Dl et D2 et de reconstruire la répartition des fluorophores 4 dans l'objet 1 par l'intermédiaire des images acquises.

Grâce au retournement de la mesure, les différentes zones de l'objet 1 sont 20 imagées avec une haute résolution dans au moins une des étapes d'acquisition d'image et la résolution n'est donc plus limitée du fait de l'épaisseur de l'objet 1.

Afin de reconstruire l'image de l'objet 1 par l'intermédiaire de la première image et de la seconde image, on complète le système linéaire précédemment décrit 25 en utilisant deux jeux de matrices des fonctions de Green correspondant respectivement à la première et la seconde acquisition d'image. A chaque itération de l'algorithme de type ART, au lieu de ne considérer qu'un système linéaire unique, on considère l'ensemble d'équations formé par les deux systèmes. 30 Le premier et le second système linéaire d'équations, respectivement associés à la première et à la seconde acquisition d'image (F2 et F3) peuvent 'écrire comme l'équation 1 ci-dessus. On peut définir un super indice i=i(s,d) de mesure qui englobe les indices s et d des sources de lumière et des 35 détecteurs, par exemple conformément à la relation i=Nd.s+d, où Nd est le nombre des détecteurs. Avec W(i,m)=G(s,m)G(m,d), chaque système s'écrit alors : Uem i = Gs,mX mGm,d m qui peut s'écrire de façon matricielle U = WX . On combine les deux systèmes correspondant respectivement aux deux acquisition d'image.

Dans le cas de quatre acquisitions d'image (F2, F3, F6, F7), quatre systèmes correspondant respectivement aux quatre images sont combinés en écri vant : [X] ou sous forme symbolique U = WX (4), où U est une matrice à une colonne et 4n lignes, W est une matrice à m

colonnes et 4n lignes et X est une matrice à une colonne et m lignes, avec n=Nd.Ns (Ns est le nombre de sources). Comme défini d-dessus, m est l'indice de maillage. Les matrices U1 à U4 et W1 à W4 correspondent respectivement aux première, seconde, troisième et quatrième images. On peut considérer les équations des quatre systèmes séquentiellement ou les

réarranger aléatoirement. Le traitement des quatre images permet d'obtenir un résultat amélioré par rapport à l'art antérieur, même si les images sont traitées indépendamment. En effet, une zone près de l'une des surfaces 2 ou 3 de l'objet 1 est ainsi toujours

bien résolue grâce à celle ou celles des images pour laquelle le détecteur D (Dr ou Dt) est disposé près de la zone considérée. On peut davantage améliorer la résolution du procédé de reconstruction par l'intermédiaire du traitement combiné des images, ce qui a été prouvé par l'intermédiaire de simulatiois. U1 U2 U3 U4 W, W2 W3 W425

Claims (9)

Revendications

1. Procédé de reconstruction d'une image de tomographie optique par fluorescence pour examiner un objet (1) comportant des fluorophores (4) et ayant une première face (2) et une seconde face (3) opposée, procédé comportant : une première étape d'éclairement (F1) de la première face (2) de l'objet (1) avec une lumière d'excitation (?,ex) des fluorophores (4) et l'acquisition d'une première image (F2) par détection d'une lumière ()\,em, tex) émise par la seconde face (3) de l'objet (1), procédé caractérisé en ce qu'il comporte : l'acquisition d'une seconde image (F3) par détection d'une lumière (?em, Xex) émise par la première face (2) de l'objet (1) et la reconstruction (F4) de la répartition des fluorophores (4) dans l'objet (1) 15 par l'intermédiaire de la première et de la seconde image.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il corn porte : une seconde étape d'éclairement (F5) de la seconde face (3) de l'objet (1) avec une lumière d'excitation (Xex) des fluorophores (4), 20 l'acquisition d'une troisième image (F6) par détection d'une lumière (Xem, Xex) émise par la première face (2) de l'objet (1), l'acquisition d'une quatrième image (F7) par détection d'une lumière (?.em, a,ex) émise par la seconde face (2) de l'objet (1) et la reconstruction (F8) de la répartition des fluorophores (4) dans l'o jet (1) 25 par l'intermédiaire des quatre images.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la reconstruction (F5, F8) de la répartition des fluorophores (4) dans l'objet (1) est effectuée en établissant, pour chaque acquisition d'image, un système linéaire 30 d'équations à partir d'une matrice de fonctions de Green correspondant.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les systèmes linéaires d'équations sont combinés pour être résolus. 13

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'au moins l'une des première (F2) et troisième (F6) images est obterue ave filtrage de la lumière d'excitation (Xex).

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'au moins l'une des seconde (F3) et quatrième (F7) images est cbtenue avec filtrage de la lumière d'excitation (Xex).

7. Disposif pour la mise en oeuvre du procédé de reconstruction selon l'une 10 quelconque des revendications 1 à 6, comportant : des moyens pour l'éclairement (Si) de la première face (2) de l'objet (1) avec une lumière d'excitation (Xex) des fluorophores (4) et des moyens pour l'acquisition d'image (Dt, D2) par détection d'une lumière (? em) émise par la seconde face (3) de l'objet (1), 15 dispositif caractérisé en ce qu'il comporte : des moyens pour l'acquisition d'image (Dr, D1) par détection d'une lumière (Xem) émise par la première face (2) de l'objet (1) et des moyens pour la reconstruction (5) de la répartition des fluorophores (4) dans l'objet (1) par l'intermédiaire de la première et de la seconde in-age. 20

8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour l'éclairement (S2) de la seconde face (3) de l'objet (1) avec une lumière d'excitation (X.ex) des fluorophores (4). 25

9. Dispositif selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens de filtrage pour supprimer la lumière d'excitation (?.ex), disposés en amont des moyens pour l'acquisition d'image (Dr, Dl). 30