FR2894963A1 - Nouveaux composes interagissant avec pea-15 - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à de nouveaux composés pseudo-peptidiques de formule définie, aptes à interagir avec la protéine PEA-15 et leur utilisation dans des procédés de criblage et un procédé de diagnostic d'états pathologiques susceptibles d'impliquer PEA-15.

Description

La presente invention a pour objet des composes susceptibles d'interagir

avec la proteine PEA-15 (Phosphoproteine Enrichie dans les Astrocytes, d'un poids moleculaire de 15 kDa), leurs derives fluorescents, ainsi que la mise en oeuvre de ces composes dans des procadas de criblage et de diagnostic, et des compositions pharmaceutiques.

PEA-15 est une petite proteine cytoplasmique de 130 acides amines abondamment exprimee dans le cerveau, en particulier dans les astrocytes, et, plus faiblement, de maniere ubiquitaire dans de nombreux autres tissus. La structure de cette proteine, tres conservae parmi les vertebras, comprend a 1'extramita N-terminale un domaine effecteur de mort (Death Effector Domain, DED) de 80 acides amines, et un domaine NES (Nuclear Export Signal), et une extremity C-terminale de structure peu organisae contenant des sites de phosphorylation par la proteine kinase C (PKC), et par la proteine kinase calcium/calmoduline-dependante de type II. La sequence ganomique de PEA-15 est composae de quatre exons et s'etend sur environ 10,2 kb d'ADN ganomique (Wolfard et at., 2000, Gene, 241:143).

PEA-15 est presente in vivo sous diffarentes formes : non phosphorylee, mono- et bi-phosphorylee, presentant chacune une activity biologique diffarente. PEA-15 est une proteine multifonctionnelle susceptible d'interagir avec de nombreux partenaires au moyen de ses diffarents domaines fonctionnels, et selon son degra de phosphorylation (Renault et al., Biochem. Pharmacol, 2003, 66:1581). A ce jour, sept partenaires de PEA-15 ont eta identifies, intervenant dans les multiples fonctions remplies par cette proteine, a savoir FADD, caspase 8, Omi/HtraA2, ERK1/2, Akt, Rsk2, et la phospholipase Dl. Par ces multiples interactions, PEA-15 parait jouer un role central dans de nombreux processus cellulaires physiologiques et/ou pathologiques. I1 a eta montra que cette proteine possede, notamment, les propriatas d'inhiber 1'apoptose, d'inhiber 1'entree des cellules dans le cycle cellulaire, d'etre impliquae dans le retablissement de la signalisation des integrines inhibae par 1'expression de l'oncogene H-Ras, d'inhiber la proliferation cellulaire, et d'etre impliquae dans le transport du glucose et la secretion d'insuline (Renault et at., Biochem. Pharmacol., 2003, 66 :1581). Par exemple, it a eta observe que la suppression de 1'expression de PEA-15 dans les astrocytes se traduit par une augmentation de la sensibility de ces derniers a 1'apoptose induite par le TNF alpha (Kitsberg et al., J. Neurosci., 1999, 19:8244) et que la reduction de 1'expression de cette proteine entraine une augmentation de la proliferation de differentes lignees cellulaires telles que les astrocytes, les lymphocytes et les hepatocytes (Formstecher et al., Dev. Cell., 2001, 1:239). Il a egalement ete observe que 1'expression de la protein inhibe egalement la migration cellulaire. Par ailleurs, cette proteine pourrait egalement etre impliquee dans la genese et/ou le developpement des tumeurs primitives cerebrales, ainsi que dans les processus metastatiques. Par exemple, une augmentation de 1'expression de PEA-15 a ete observee dans differentes tumeurs telles que les gliomes, le cancer de l'ovaire, le cancer du rein, le cancer du sein, dans les carcinomes hepatocellulaires, les lymphomes ou les melanomes (Hwang et at., Genomics, 1997, 42 :540 ; Bera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91 :9789). De meme, la surexpression de cette proteine dans des souris transgeniques augmente leur sensibilite aux cancers de la peau induits chimiquement (Formisano et at., Oncogene, 2005, 24:7012). Par contre, 1'expression de PEA-15 dans un tissu induit une inhibition de la permissivite de ce dernier vis-a-vis de l'invasion par des cellules tumorales. I1 a egalement ete montre que des cellules du cancer du sein pouvaient etre sensibilisees A. la chimiotherapie par diminution de 1'expression de PEA-15 (Stassi et at., Cancer Res., 2005, 65:6668). En outre, une surexpression de PEA-15 a ete observee dans les fibroblastes, les muscles sties et le tissu adipeux de patients affectes par le diabete de type II (Condorelli et at., EMBO. J., 1997, 17 :3858), et it a ete montre que la suppression de 1'expression de cette proteine permettait de restaurer la secretion d'insuline en reponse au glucose. Une surexpression de cette proteine est egalement observee dans certains processus inflammatoire.

Par consequent, it apparait que PEA-15 pourrait servir de cible therapeutique dans de nombreux etats pathologiques. Or, A. ce jour, on ne dispose pas de composes aisement accessibles susceptibles de moduler l'activite de cette proteine. Par ailleurs, on ne dispose pas non plus d'outils susceptibles de permettre de cribler aisement de tels composes.

Par consequent, it existe un besoin d'acceder facilement a des composes susceptibles d'interagir avec PEA-15 et de moduler son activite.

I1 existe egalement un besoin de disposer d'outils de criblage de composes susceptibles de moduler 1'activit& biologique de PEA-15. I1 existe egalement un besoin de disposer de nouveaux composes pour le traitement d'etat pathologique tel que le cancer et le diabete de type II.

I1 existe egalement un besoin de disposer d'outils pour le diagnostic et/ou le pronostic d'etats pathologiques impliquant PEA-15, et notamment une alteration de son expression voire de son activite biologique, tels que le diabete de type II, le cancer, notamment les gliomes, les carcinomes, ou des &tats pathologiques impliquant un exces ou un d&faut d'apoptose ou de proliferation cellulaire, par exemple.

La presente invention a pour but de donner satisfaction en ces termes. De maniere inattendue, les inventeurs ont observe que des composes de formule generale (I) suivante : R 0 O NH N H Rz 0 0 (I) duns laquelle n, p, r, R1, R2, R3, R4 et A sont tels que d&finis par la suite, sont susceptibles 15 d'interagir avec PEA-15 et d'en moduler 1'activit&. Ainsi, les inventeurs ont observe qu'un compose conforme a 1'invention, comme par exemple le compose fluorescent 6D6-1, detaill& par la suite, est capable d'interagir de maniere sp&cifique avec une proteine de PEA-15 et de moduler son activite biologique. 20 Par ailleurs, les inventeurs ont egalement observe qu'il &tait possible d'utiliser un compose de 1'invention notamment fluorescent en combinaison avec une proteine de fusion fluorescente GFP-PEA-15 (Green Fluorescent Protein) pour developper des proc&d&s mettant en oeuvre un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence (FRET) permettant, par exemple, le criblage d'agents susceptibles d'interagir avec PEA-15 ainsi 25 que le diagnostic et/ou le pronostic d'&tats pathologiques impliquant PEA-15. I1 est egalement possible d'utiliser un tel compose notamment fluorescent en combinaison avec une proteine de fusion GST-PEA 15 pour mettre en oeuvre un proc&d& H N A H N n de criblage par competition permettant d'identifier des agents suceptibles d'interagir avec PEA15. Ainsi, selon un de ses premiers aspects, la presente invention se rapporte a un compose de formule (I) suivante : H N N p H O H N A 0 NH O R4 dans laquelle : - n peut &tre &gala 0 ou 1, - p peut representer un nombre entier variant de 1 a 6, et en particulier variant de 10 2 A. 4, - r peut representer un nombre entier variant de 1 a 12, et en particulier variant de 2 a 6, et en particulier est &gal a 4, R1 peut representer un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 a C20, sature ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 a C1o, sature ou insature, un 15 radical aryle en C6 a C105 optionnellement substitu& par un ou plusieurs atomes d'halogene, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 a C65 ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 a C105 - R2 peut representer une chaine laterale d'acide amine ou d'un derive d'acide amine, 20 - -COR3 peut representer un radical acyle porteur d'une entit& basique R3, notamment choisie parmi les radicaux de formules suivantes : R7 HN - dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, Y peut representer N ou N+R7, et R6 et R7 peuvent representer, independamment 1' un de 1'autre, un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 A. C20, satur& ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 A. Cm, satur& ou insature, un radical aryle en C6 A. C10, optionnellement substitue par un ou plusieurs atomes d'halogene, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 A. C65 ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 A. Cio, - R4 peut representer un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 A. C1o, satur& ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 A. C10, satur& ou insature, un radical aryle en C6 A. C10, optionnellement substitue par un ou plusieurs atomes d'halogene, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 A. C65 ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 A. Cio, - A peut representer un radical derive d'un reste xanthene, notamment un reste 15 phenyl-9 xanthene, d'un reste acridine, notamment un reste phenyl-9 acridine, ou d'un reste 4-bora-3a,4a-diaza indacene, - et ses derives. Avantageusement, A peut representer un marqueur fluorescent. Selon un autre de ses aspects, la presente invention se rapporte a un proc&d& de 20 criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une proteine PEA-15, ou un de ses analogues, comprenant au moins les &tapes consistant a : a- mettre en presence, au moins une proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un compose notamment fluorescent conforme a l'invention, dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, 25 A et D &cant tels qu'ils d&finissent un couple accepteur-donneur d'&nergie de fluorescence, convenant A. la mise en oeuvre d'un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence, b- mesurer un premier signal S1, caracteristique de l'ensemble obtenu a 1'&tape a) par irradiation A. une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'&nergie de fluorescence, c- mettre 1'ensemble obtenu a 1'etape a) en presence d'un milieu presume contenir au moires un agent a cribler dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, d- mesurer un second signal S2, de meme nature que Si, caracteristique de 5 1'ensemble obtenu are-tape c) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'energie de fluorescence, e- comparer les premier et second signaux Si et S2 afin d'en tirer une conclusion relative a une eventuelle interaction de ladite proteine PEA-15 avec 1'agent a cribler. 10 Au sens de la presente invention, on entend designer par << analogue de proteine PEA-15 un compose de type peptidique, presentant une homologie de sequences avec PEA-15 et une activite biologique similaire, ainsi que des variants susceptibles de resulter de 1'epissage alternatif de l'ARNm codant pour cette proteine, comme par exemple celui decrit par Underhill et al. (Mamm. Genome, 2001, 12:172), ainsi que des fragments de 15 cette proteine ou de ces composes de type peptidique presentant la capacite de her un compose de formule conforme a 1'invention. Par activite biologique >>, on entend designer les proprietes biologiques de la proteine PEA-15, notamment telles qu'indiquees precedemment. Par homologie de sequences >>, on entend designer une identite de sequence 20 d'au moires 85 %, en particulier d'au moires 90 % et plus particulierement d'au moires 95 % de 1'analogue avec la proteine PEA-15, et en particulier les sequences caracteristiques de PEA-15 (Renault et al., Biochem. Pharmacol. 2003, 66 :1581), a savoir he domaine DED, et notamment la sequence conservee RxDLF, he domaine NES (Nuclear Export Signal), les sequences peptidiques impliquees dans 1'interaction de la proteine PEA-15 avec ses 25 differents partenaires proteiques (par exemple ERK1/2, Akt, FADD, caspase 8) et les sequences peptidiques comprenant les sites de phosphorylation par la proteine kinase C (PKC) ou la proteine kinase calcium/camoduline-dependante de type II, a savoir respectivement les motifs LTRIPSAKK (S104) et DIRQPSEEIIK (S116) (S : serine phosphorylee). 30 La nature des modifications susceptibles d'etre introduites dans une proteine pour obtenir des analogues tels que definis ci-dessus et les procedes pour les mettre en oeuvre relevent des connaissances et de la pratique de routine de 1'homme de fart.

Selon un autre de ses aspects, la presente invention a pour objet un procede de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une proteine PEA-15, ou un de ses analogues, comprenant au moins les &tapes consistant a : a- mettre en presence au moins une proteine PEA-15 li&e a un support avec 5 un compose conforme a 1'invention, dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, b- mesurer un premier signal S 1 caract&ristique de 1'ensemble obtenu a 1'&tape a), c-mettre en presence 1'ensemble obtenu a 1'&tape a) avec un agent a cribler 10 dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, d- mesurer un second signal S2, de meme nature que S1, caract&ristique de 1'ensemble obtenu are-tape c), e- comparer S i et S2 afin d'en tirer une conclusion relative a une eventuelle interaction de ladite proteine PEA-15 avec 1'agent a cribler. 15 Selon encore un autre de ses aspects, la presente invention se rapporte a un procede de diagnostic et/ou de pronostic d'un &tat pathologique susceptible d'impliquer PEA-15 par detection et, eventuellement, par quantification de PEA-15 dans un &chantillon biologique pr&lev& chez un individu comprenant au moins les &tapes consistant a : a- mettre en presence au moins une proteine PEA-15 portant un marqueur 20 fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un compose, notamment fluorescent, conforme a 1'invention dans des conditions propices a une interaction avec ladite protein, A et D &cant tels qu'ils d&finissent un couple accepteur-donneur d'&nergie de fluorescence, convenant a la mise en oeuvre d'un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence, b-mesurer un premier signal S1 caract&ristique de 1'ensemble obtenu a 1'&tape 25 a) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'&nergie de fluorescence, c- mettre 1'ensemble obtenu a 1'&tape a) en presence d'un &chantillon biologique pr&sum& comprendre au moins une proteine PEA-15 dans des conditions propices a 1'interaction de ladite proteine PEA-15 de 1'&chantillon biologique avec ledit 30 compose selon l'invention, d-mesurer un second signal S2, de meme nature que Si, caracteristique de 1'ensemble obtenu a 1'&tape c) par irradiation A. une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'&nergie de fluorescence, e- comparer Si et S2 afin d'en tirer une conclusion relative A. une eventuelle 5 presence de la proteine PEA-15 dans ledit &chantillon biologique, et eventuellement une conclusion relative A. la quantit& de ladite proteine. Selon encore un autre de ses aspects, la presente invention se rapporte egalement a un complexe isole comprenant au moires une proteine PEA-15 et au moires un compose de formule conforme a 1'invention. 10 Selon encore un autre de ses aspects, la presente invention concerne egalement une trousse pour criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une proteine PEA-15, ou run de ses analogues, comprenant : - au moires une proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D ou un marqueur de purification, et 15 - au moires un compose conforme a 1'invention, le cas &ch&ant, A et D &cant tels qu'ils d&finissent un couple accepteur-donneur d'&nergie de fluorescence, convenant A. la mise en oeuvre d'un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence.

20 COMPOSES Les composes de 1'invention sont de formule generale (I) suivante : 0 A H N H N N p H O (I) NH O R4 dans laquelle : 25 - n peut etre &gala 0 ou 1, - p peut representer un nombre entier variant de 1 A. 6, et en particulier variant de 2 A. 4, - r peut representer un nombre entier variant de 1 A. 12, et en particulier variant de 2 A. 6, et en particulier &gal A. 4, - RI peut representer un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 A. C20, sature ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 A. Cio, sature ou insature, un radical aryle en C6 A. Cio substitue par un ou plusieurs atome(s) d'halogene, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en Ci A. C65 ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 A. Cio, - R2 peut representer une chaine laterale d'acide amine ou d'un derive d'acide amine, - -COR3 peut representer un radical acyle porteur d'une entit& basique, 10 notamment choisie parmi les radicaux de formules suivantes : R7 R7 ^,,,,,,N Cl HN 15 - dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, Y peut representer N ou N+ - R7, et R6 et R7 peuvent representer, independamment run de 1'autre, un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 A. Czo, sature ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 A. Cio, sature ou insature, un radical aryle en C6 A. Cio, optionnellement substitue par un ou plusieurs atomes d'halogene, un ou plusieurs 20 radical(aux) alkoxy en C1 A. C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 A. Cio, - R4 peut representer un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 A. Cio, sature ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 A. Cio, sature ou insature, un radical aryle en C6 A. Cio, optionnellement substitue par un ou plusieurs atomes d'halogene, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 a C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 a Clo, - A peut representer un radical derive d'un reste xanthene, notamment d'un reste phenyl-9 xanthene, d'un reste acridine, notamment d'un reste phenyl-9 acridine, ou d'un reste 4-bora-3a,4a-diaza indacene, - et ses derives. Selon un mode de realisation, A peut representer un marqueur fluorescent. Au sens de la presente invention, on entend designer par << derive >>, des formes tautomeres, des formes stereoisomeres, des formes polymorphes, des sels pharmaceutiquement acceptables et des solvates pharmaceutiquement acceptables. Au sens de la presente invention, on entend designer par forme tautomere >>, run des isomeres dont les structures different par la position d'un atome, en general d'hydrogene, et d'une ou de plusieurs liaisons multiples et qui sont capables de se transformer facilement et reversiblement run dans 1'autre.

Au sens de la presente invention, on entend designer par forme stereoisomere des isomeres de molecules de constitution identique, et qui ne different que par un ou des arrangement(s) differents de leurs atomes dans 1'espace. Au sens de la presente invention, on entend designer par sels pharmaceutiquement acceptables des composes obtenus par reaction d'un compose de 20 formule generale (I) avec une base ou un acide. A titre d'exemple de base convenant a 1'invention on peut mentionner 1'hydroxyde de sodium, le methoxyde de sodium, 1'hydrure de sodium, le t-butoxyde de potassium, 1'hydroxyde de calcium, 1'hydroxyde de magnesium, et analogues, et leurs melanges, dans des solvants tels que le THE (tetrahydrofurane), le methanol, le t-butanol, 25 le dioxane, l'isopropanol, 1ethanol, leurs analogues, et leurs melanges. Les bases organiques comme la lysine, 1'arginine, la diethanolamine, la choline, la tromethamine, la guanidine et leurs derives peuvent egalement etre utilises. A titre d'exemple de sels d'addition d'acide convenant a 1'invention, on peut citer ceux susceptibles d'etre prepares par reaction d'un compose de formule generale (I) 30 avec un acide tel que 1' acide chlorhydrique, 1' acide bromhydrique, 1' acide nitrique, 1' acide sulfurique, 1acide phosphorique, 1acide p-toluenesulfonique, 1acide methanesulfonique, 1' acide acetique, 1' acide citrique, 1' acide maleique, 1' acide salycilique, 1' acide hydroxynapthoique, 1'acide ascorbique, 1'acide palmitique, 1'acide succinique, 1'acide benzoique, 1'acide benzenesulfonique, l'acide tartrique, et analogues, et leurs melanges, dans les solvants tels que l'ac&tate d'ethyle, Tether, des solvants alcooliques, race-tone, le THF, le dioxane, leurs analogues et leurs melanges.

On entend designer par forme polymorphe >>, des composes obtenus par cristallisation d'un compose de formule generale (I) dans differentes conditions, telles que par exemple l'utilisation de differents solvants, generalement utilises pour la cristallisation. La cristallisation a differentes temperatures impliquent, par exemple, differents modes de refroidissement, par exemple des refroidissements tres rapides a tres lents impliquant des &tapes de chauffage ou fusion de composes suivi par un refroidissement graduel ou rapide. La presence de formes polymorphes peut &tre determine au moyen d'analyses par spectroscopie RMN, par spectroscopie IR (infrarouge), par DSC (Differential Scaning Calorimetry), par diffraction de rayons X ou d'autres techniques analogues.

Au sens de la presente invention, on entend designer par radical alkyle >>, un radical hydrocarbon& lineaire, ou ramifi&, satur& ou insatur&, de 1 A. 20 atomes de carbone, en particulier de 2 A. 18 atomes de carbone, en particulier de 3 A. 16 atomes de carbone, en particulier de 4 A. 12 atomes et plus particulierement de 6 A. 10 atomes de carbone, susceptible d'etre substitu& par des radicaux tels que d&finis ci-apres.

A titre d' exemple, sont inclus dans cette definition des radicaux tels que methyle, ethyle, isopropyle, n-butyle, t-butyle, t-butylm&thyle, n-propyle, pentyle, nhexyle, 2-ethylbutyle, heptyle, octyle, nonyle, ou decyle. Au sens de la presente invention, on entend par radical cycloalkyle >>, un cycle alkylene, optionnellement ramifi&, satur& ou insatur&, de 3 A. 10 atomes de carbone, en particulier en C4 A. C8 et plus particulierement en C6, tel que le cyclopropyle, le cyclopentyle, le cyclohexyle, le cyclohexylmethyle, le cycloheptyle. Au sens de la presente invention, on entend par radical aryle >>, un cycle aromatique comprenant de 1 A. 3 noyaux aromatiques, eventuellement fusionn&s, de 6 A. 20 atomes de carbone, notamment de 10 A. 14 atomes de carbone, comprenant optionnellement un plusieurs heteroatomes choisis parmi 0, N et S, et le cas &ch&ant &cant substitues par des radicaux tels que d&finis ci-dessus et ci-apres.

A titre d'exemple de radicaux aryle convenant A. la mise en oeuvre de l'invention it est possible de mentionner le radical phenyle, le radical benzyle, le radical phenetyle, le radical naphtyle, le radical anthryle, et tour les cycles aromatiques comprenant un plusieurs heteroatomes choisis parmi 0, N et S, tel que par exemple la pyridine, le thioph&ne, le pyrrole, le furanne, la quinoleine, 1'acridine, le xanth&ne, le 4-bora-3a,4a diaza indac&ne. Au sens de la presente invention, on entend par radical alkoxy >>, un radical - OR dans lequel le reste alkyle est un radical hydrocarbon& lineaire, ramifie ou cyclique, condense ou non, satur& ou insatur& de 1 A. 20 atomes de carbone, en particulier de 2 A. 18 atomes de carbone, en particulier de 3 A. 16 atomes de carbone, en particulier de 4 A. 12 atomes et plus particuli&rement de 6 A. 10 atomes de carbone. On peut citer, A. titre d'exemple, les groupes methoxy, &thoxy, propoxy, butoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, n-pentoxy, isopentoxy, sec-pentoxy, t-pentoxy, hexyloxy, methoxyethoxy, methoxypropoxy, &thoxy&thoxy, &thoxypropoxy et analogues. Au sens de la presente invention, on entend par radical acyle >>, un radical hydrocarbon& lineaire, ramifie ou cyclique, condense ou non, satur& ou insatur&, comprenant une fonction C=0 et ayant de 1 A. 10 atomes de carbone, en particulier de 2 A. 8 atomes de carbone et de preference de 3 A. 6 atomes de carbone et plus particuli&rement de 4 atomes de carbone par exemple, un radical formyle, un radical acetyle, un radical succinyle, un radical benzoyle, un radical 1-naphtoyle ou 2-naphtoyle.

La chaine hydrocarbon&e des radicaux pr&cit&s peut &tre, le cas &ch&ant, interrompue par un ou plusieurs heteroatomes choisis, par exemple, parmi 0, N et S, pour former, par exemple, un radical heteroalkyle comme un radical alkylether, un radical alkylester ou un heterocycle.

Au sens de la presente invention, on entend par radical heterocyclique >>, par exemple, et de mani&re non limitative, un radical furanyle, un radical thioph&nyle, un radical pyrrolyle, un radical oxazolyle, un radical isoxazolyle, un radical thiazolyle, un radical isothiazolyle, un radical imidazolyle, un radical pyrazolyle, un radical furazanyle, un radical pyranyle, un radical pyridinyle, un radical pyridadinyle, un radical pyrimidinyle ou un radical pyradinyle, un radical furannyle, un radical quinoleinyle. Les radicaux d&finis ci-dessus peuvent le cas &ch&ant &tre substitues par un ou plusieurs atomes d'halog&ne.

Au sens de la presente invention, on entend par << atome d'halogene >>, un atome de F, Cl, Br ou I. Les atomes d'halogene avantageusement mis en oeuvre dans la presente invention sont le fluor et le chlore. En particulier, les radicaux alkylhalogenes peuvent etre des radicaux 5 perfluoroalkyles de formule generale CäF2ä+1 dans laquelle n peut varier de 1 a 10, en particulier de 2 a 8 et plus particulierement de 3 a 6.

Selon un mode de realisation, R1 peut representer notamment un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1-C18, un radical alkyle en C2-C16, par exemple un 10 radical aryle en C6 a C1o, par exemple optionnellement substitues par un ou plusieurs atomes d'halogene. En particulier, R1 peut representer notamment un atome d'hydrogene, un radical methyle, un radical ethyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un radical phenetyle, ou un radical perfluoroalkyle de formule CäF2ä+1 dans 15 laquelle n peut varier de 1 a 10, en particulier de 2 a 8 et plus particulierement de 3 a 6. En particulier, R1 peut etre un radical methyle ou un radical benzyle.

Selon un mode de realisation, R2 peut representer une chaine laterale d'un acide amine ou derive d'acide amine choisi, par exemple, parmi 1'alanine, la glutamine, la 20 leucine, la glycine, le tryptophane, la 13-alanine, la phenylalanine, la 4-chlorophenylalanine, 1'acide isonipecotinique, 1'acide 4-aminomethylbenzoique, 1'acide 3-tetrahydroisoquinoleinique et 1'histidine libre ou benzylee. L'acide amine ou derive d'acide amine peut, par exemple, etre choisi parmi : HO NH 2 acide 4-amino-methylbenzoique acide 3-tetrahydroisoquinoleinique glycine 0 0 0 HO N acide isonipecotinique Cl 4-chloro-phenylalanine HO ù NH2 H2N glutamine HO H 0 -NH2 0 phenylalanine B-alanine HO histidine benzylee 0 HO û NH2 \N

,N histidine H 0 HO ù NH2 leucine 0 HO ~i NH2 alanine \,N\ ,N tryptophane H 0 HO ù NH2 Selon un mode de realisation, R2 peut etre de formule (VI) suivante : R 5 dans laquelle - * symbolise une liaison covalente avec le reste d'un compose conforme a 1'invention, et - R5 peut representer un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 a C20, sature ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 a C1o, sature ou insature, un radical aryle en C6 a C1o, optionnellement substitue par un ou plusieurs atome(s) d'halogene. Selon un mode de realisation, les radicaux alkyle ou cycloalkyle susceptibles de figurer le radical R5 peuvent etre egalement substituer par les radicaux tels que definis precedemment ou voir leurs chaines hydrocarbonees interrompues par un ou plusieurs heteroatomes tels que definis precedemment. En particulier, R5 peut representer un atome d'hydrogene, un radical alkyle en CI-C18, un radical alkyle en C2-C 165 un radical aryle en C6 a C 10, optionnellement substitues 15 par un ou plusieurs atome(s) d'halogene. En particulier, R5 peut representer un atome d'hydrogene, un radical methyle, un radical ethyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un radical phenetyle, un radical perfluoroalkyle de formule CäF2ä+1 dans laquelle n peut varier de 1 a 10, en particulier de 2 a 8 et plus particulierement de 3 a 6. 20 En particulier, R5 peut etre un radical methyle ou un radical benzyle. R2 peut notamment etre une histidine ou un derive d'histidine tel qu'une histidine benzylee.

Selon un mode de realisation, -COR3 peut etre un radical acyle, notamment un 25 radical acetyle, substitue par une des entites basiques telles que defines precedemment. En particulier, cette entite basique peut etre un radical de formule (VII) suivante :15 dans laquelle : - * symbolise uneliaison avec le radical acyle -COR3, - Y peut representer N ou N+R7, et -R6 et R7 peuvent representer, independamment run de 1'autre, un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1-C18, un radical alkyle en C2-C16, un radical aryle en C6 A. C1o, optionnellement substitues par un ou plusieurs atome(s) d'halogene.

En particulier, R6 et R7 peuvent representer, independamment Pun de 1'autre un atome d'hydrogene, un radical methyle, un radical ethyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un radical phenetyle, un radical perfluoroalkyle de formule CäF2i+1 dans laquelle n peut varier de 1 A. 10, en particulier de 2 A. 8 et plus particulierement de3a6. En particulier, R6 et R7 peuvent etre independamment Pun de 1'autre un radical 15 methyle ou un radical benzyle

Selon un mode de realisation, le radical A peut representer un radical de formule generale (Va) : 20 dans laquelle : * symbolise une liaison covalente avec le reste du compose de formule (I), - Z=OouN, R6 (VII) - R8 = R9 = N(R')2 avec R' pouvant representer un radical alkyle en C1 a C6, en particulier un radical alkyle en C2-C4 ou R8 = OH et R9 = 0, - Rio = Rl1 = H ou X, avec X = F, Cl, Br, en particulier X = F - ou d'une part R8 et Rio et/ou d'autre part R9 et R11 peuvent respectivement former un heterocycle a 5 ou 6 chainons condense avec le reste acridine ou xanthene, le cas echeant substitue par un, deux, trois, voire plus de groupements methyle et dont 1'heteroatome est place en a du reste acridine ou xanthene et est choisi parmi N ou 0, - R12 = *-NHSO2- ou *ûNHCO-, avec * symbolisant une liaison covalente avec le reste du compose de formule (I) - R13 = H, HSO3-ou COOH. En particulier, le radical de formule (Va) peut etre tel que R8 = R9 = NMe2 ou NEt2, En particulier, le radical A de formule (Va) peut etre tel que R12 peut etre en position ortho, meta ou para. En particulier, lorsque R12 = *-NHSO2-, it peut etre avantageusement en position ortho.

Selon un mode de realisation, A peut representer un radical de formule generale (Vb) : dans laquelle : - * symbolise une liaison covalente avec le reste du compose de formule (I), - R14 peut representer un reste acyle en C2 a C45 - R15 peut representer un radical heterocyclique en C5 a C75 et notamment un radical thiophenyl, et - R16 = R17 = X, avec X = F, Cl ou Br, et notamment F.

Selon un mode de realisation, les radicaux de formule (Va) et (Vb) peuvent etre des radicaux de marqueurs fluorescents. A titre d'exemples de marqueurs fluorescents susceptibles de convenir a la mise en oeuvre de la presente invention, it est possible de mentionner la rhodamine et ses derives tels que la tetramethylrhodamine, la rhodamine Red-X (lissamine), le Bodipy et ses derives, le Texas Red et ses derives, la fluoresceine et ses derives, 1'Alexa et ses derives ainsi que 1' Oregon Green et ses derives. Selon un mode de realisation, le radical A peut representer un marqueur fluorescent choisi parmi des marqueurs fluorescents de formule(s) suivante(s) : Sulfonylrhodamine (lissamine) 0 Fluoresceine 0 Oregon Green Tetramethylrhodamine Me2N Alexa 532 0 Bodipy dans laquelle * symbolise une liaison covalente avec le reste du compose de formule (I) selon l'invention. Selon un mode de realisation, le marqueur fluorescent A peut &tre choisi parmi des marqueurs fluorescents derives de la rhodamine, comme par exemple un derive de la 5 sulfonylrhodamine B. En particulier, le reste du compose de formule generale (I) peut &tre lie en position ortho au derive de la sulfonylrhodamine (lissamine). Notamment, le radical derive de lissamine peut &tre represent& par le radical de formule suivante : 40 10 Lissamine dans laquelle * symbolise une liaison covalente avec le reste du compose de formule (I) selon l'invention.

Selon un mode de realisation, un compose conforme a 1'invention peut &tre de 15 formule generale (I) dans laquelle n peut &tre &gal a 0. Selon un mode de realisation, un compose conforme a 1'invention peut &tre repr&sent&, par exemple, par la formule generale (II) suivante : R 0 3 O H NH N R2 0 N ùA p H 20 dans laquelle : - RI, R2, R3, R4, A et p peuvent &tre, par exemple, tels que d&finis pr&c&demment.

Selon un mode de realisation, un compose conforme a 1'invention peut &tre de formule generale (I) dans laquelle n peut &tre &gal a 0, p peut &tre &gal a 4, RI peut representer un radical methyle, R2 peut representer un radical de formule suivante : dans laquelle * et R5 peuvent &tre tels que d&finis pr&c&demment, et -COR3 peut representer un radical acyle, notamment acetyle, substitu& par une entit& basique, de formule suivante : Y dans laquelle * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, et Y et R6 peuvent 10 &tre tels que d&finis pr&c&demment, et R4 peut &tre un atome d'hydrogene.

Selon un mode de realisation, un compose conforme a 1'invention peut &tre de formule generale (III) suivante : NûA H dans laquelle A, R5 , Y et R6 peuvent &tre tel que d&fini pr&c&demment.

15 Selon un mode de realisation, un compose conforme a 1'invention peut &tre un compose de formule generale (III) telle que define pr&c&demment dans laquelle le marqueur fluorescent A peut &tre, par exemple, un radical sulfonylrhodamine tel que d&fini R6 0 H N NH 0 precedemment, et notamment tel que le reste du compose de formule (III) soit en ortho du radical sulfonylrhodamine, R5 peut &tre un radical benzyle, Y peut &tre N et R6 peut &tre un radical methyle. Avantageusement, un compose conforme a 1'invention n'est pas un compose de formule generale (I) telle que define precedemment dans laquelle le marqueur fluorescent A est un radical sulfonylrhodamine (lissamine) tel que le reste du compose de formule (I) soit en para du radical sulfonylrhodamine. Avantageusement, un compose conforme a 1'invention n'est pas un compose de formule generale (III) telle que define precedemment dans laquelle le marqueur fluorescent A est un radical sulfonylrhodamine (lissamine) tel que le reste du compose de formule (III) soit en para du radical sulfonylrhodamine, et R5 est un radical benzyle, Y est N et R6 est un radical methyle. Selon une variante de realisation, un compose conforme a 1'invention peut &tre represent& par la formule (IV) suivante : PROCEDE DE SYNTHESE Des composes conformes a l'invention peuvent &tre obtenus soit sous forme d'une bibliotheque de composes de formules varies, soit sous forme de composes isoles 20 sous une forme pure ou en melange de stereoisom&res. Le proc&d& de synthese peut &tre effectue sur une r&sine de polystyrene de type REM (REgenerated Michael), constitu& d'une r&sine hydroxymethylpoylstyrene fonctionnalis&e par un ester acrylique accepteur de Michael.15 La resine de type REM convient particulierement A. la synthese de bibliotheque d'amines tertiaires, via une addition initiale de type Michael d'une amine afin de fixer cette derriere au support suivie de la synthese de la molecule sur support et enfin sa coupure du support selon un processus de quaternisation de famine puis une elimination de type HOFMANN. Apres fixation d'une amine secondaire sur le support solide, les autres residus peuvent &tre introduits au moyen de methodes de couplage de peptides classiques, utilisant 1' activation DIC/HOBt (1,3-diisopropylcarbodiimide/1-hydro xybenzotriazole). Un radical A, par exemple, de type sulforhodamine (lissamine, par exemple), peut &tre greff& directement sur une fonction amine, par exemple du radical E-NH2 d'une lysine ou sur un espaceur greff& sur le radical E-NH2 de la lysine, tel qu'un espaceur diamino-butane, au moyen d'une liaison urethane. La liberation du ou des composes de la resine peut &tre effectu&e apres alkylation de 1'amine secondaire en presence par exemple d'un halogenure d'alkyle tel qu'un iodure de methyle, ou un bromure de benzyle, suivi d'un traitement en presence d'une resine basique &changeuse d'ions de type Amberlite IRA-95. Selon un mode de realisation, un tel procede de synthese conforme a 1'invention peut &tre realise en parallele sur des plaques, par exemple des plaques de 96 puits, en utilisant un &quipement FLEXCHEM (Robbins Scientific).

Selon un mode de realisation, un compose selon l'invention peut &tre obtenu selon un procede de preparation sur support solide comprenant au moins les &tapes consistant a : a û coupler sur un support solide de formule 0 un compose de formule : R4 HN NH boc

pour obtenir un compose de formule (1) suivante : 23 R4 / N / NH boc O

R4 peut etre tel que defini ci-dessus.

b - deproteger le compose de formule (1), puis de coupler ledit compose deprotege avec le compose de formule : 0 NHBoc HO R2

pour obtenir un compose de formule (2) suivante : NHBoc O R2 pouvant etre tel que defini ci-dessus, c û deproteger le compose de formule (2), puis coupler ledit compose deprotege 10 avec le compose de formule suivante: NHFmoc HO NHBoc O pour obtenir un compose de formule (3) suivante : NHBoc O p pouvant etre tel que defini ci-dessus, 15 d û deproteger du groupe Fmoc le compose de formule (3), puis coupler ledit compose deprotege avec un compose R3COOH pour obtenir un compose de formule (4) suivante : NH Boc O COR3 pouvant etre tel que defini ci-dessus, e û deproteger le compose de formule (4), pour obtenir un compose de formule (5) suivante : NH2 10 15 O f û optionnellement, faire reagir le compose de formule (5) avec le pnitrophenylchloroformate puis avec une diamine de formule H2N J r NH2 pour obtenir un compose de formule (6) suivante : r pouvant etre tel que defini ci-dessus, g û faire reagir le compose de formule (5) ou le compose de formule (6) avec un traceur electrophile, notamment avec A-Cl, pour obtenir un compose de formule (7) suivante : R, R2, R3, A, n, p et r etant tels que definis precedemment. NH2 O O O H N A H - rN n h û diver le compose de formule (7) avec un compose de formule RIX, R1 pouvant &tre tel que d&fini ci-dessus, et X pouvant representer un atome d'halogene, notamment I ou Br, pour obtenir un compose de formule (I) tel que defini pr&c&demment.

PROCEDE DE CRIBLAGE ET DE DIAGNOSTIC La presente invention a &galement pour objet un proc&d& de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une proteine PEA-15 ou un de ses analogues, comprenant au moins les &tapes consistant a : a- mettre en presence, au moins une proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un compose fluorescent, conforme a l'invention, dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, A et D &cant tels qu'ils definissent un couple accepteur-donneur d'&nergie de fluorescence, convenant a la mise en oeuvre d'un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence, b- mesurer un premier signal S 1 caract&ristique de 1'ensemble obtenu a 1'&tape a) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'&nergie de fluorescence, c- mettre 1'ensemble obtenu a 1'&tape a) en presence d'un milieu presume contenir au moins un agent a cribler dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, d-mesurer un second signal S2, de meme nature que S1, caracteristique de 1'ensemble obtenu a 1'&tape c) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'&nergie de fluorescence, e- comparer le premier et second signal S 1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative a une eventuelle interaction de ladite proteine PEA-15 avec 1'agent a cribler. Au sens de la presente invention, on entend designer par 1' expression A et D &cant tels qu'ils definissent un couple accepteur-donneur d'&nergie de fluorescence, convenant a la mise en oeuvre d'un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence >>, un couple de marqueurs fluorescents dont le spectre d'&mission de run (donneur d'&nergie de fluorescence) recouvre tout ou partie du spectre d'excitation de 1'autre (accepteur d'&nergie de fluorescence). En particulier, le spectre d'excitation du donneur ne recouvre pas, ou qu'en tres faible partie, le spectre d'excitation de 1'accepteur, evitant ou reduisant ainsi 1'apparition de faux positifs. Selon un mode de realisation, les premier et second signaux peuvent etre des signaux fluorescents de 1'accepteur et/ou du donneur d'energie.

En presence d'un compose portant un accepteur d'energie de fluorescence susceptible d'interagir avec un compose portant un donneur d'energie de fluorescence, 1'irradiation de 1'ensemble a une longueur du spectre d'excitation du donneur d'energie de fluorescence peut produire un transfert d'energie par resonance de fluorescence (FRET). Au sens de l'invention, on entend designer par transfert d'energie de fluorescence >>, un processus physique, dependant de la distance, par lequel de 1'energie est transmise, de maniere non radiative, d'un chromophore excite, le donneur d'energie de fluorescence, A. un autre chromophore, 1'accepteur d'energie de fluorescence, par interaction dipole-dipole. La manifestation d'un tel transfert peut se detecter par une modulation du signal fluorescent du donneur et/ou du signal fluorescent de 1'accepteur, comme par exemple la diminution d'amplitude du signal fluorescent du donneur de fluorescence et/ou par une augmentation d' amplitude du signal fluorescent de 1' accepteur. Les variations d'amplitude du signal fluorescent du donneur peuvent etre concomitantes avec les variations d'amplitude du signal fluorescent de 1'accepteur.

Alternativement, un des signaux fluorescents peut varier sans qu'une variation de 1'autre signal fluorescent puisse etre detectee. Les conditions et les parametres a ajuster pour effectuer un transfert d'energie de fluorescence relevent de la pratique de 1'homme du metier qui peut se referer par exemple a Sekar and Periasamy (J. Cell. Biol., 2003, 160:629).

Selon un mode de realisation, la comparaison des premier et second signaux peut permettre de detecter une modulation d'amplitude d'un signal fluorescent. Au sens de la presente invention, on entend designer par modulation d' amplitude d'un signal fluorescent >>, duns le contexte du transfert d' energie par resonance de fluorescence, toute modulation de 1amplitude du signal de fluorescence du donneur, de 1'amplitude du spectre d'excitation ou damplitude du signal d'emission du donneur tel que defini precedemment.

Une modulation de ces signaux de fluorescence peut traduire une eventuelle interaction de 1'agent a cribler avec une protein PEA-15 portant un marqueur fluorescent D. Une telle interaction etant susceptible d'entrainer la dissociation d'un complexe protein PEA-15 portant un marqueur fluorescent D/compose selon l'invention.

Selon un mode de realisation, un procede de criblage selon l'invention peut comprendre, en outre, une etape consistant a preparer au moins un echantillon controle dans lequel ledit milieu ajoute a 1'etape c), du procede selon l'invention define precedemment, est depourvu d'agent a cribler. Le ou les echantillons controles peuvent are prepares, selon un procede 10 conforme a 1'invention, simultanement ou independamment de la mise en oeuvre d'un tel procede pour le criblage d'un agent susceptible d'interagir avec PEA-15.

Un procede selon l'invention peut comprendre une etape consistant a comparer un signal S3 mesure a partir d'un echantillon controle avec les signaux S1 et S2 tels que 15 definis precedemment pour en tirer une information sur ledit agent a cribler. Une difference entre les signaux ainsi compares peut titre informatif de la presence, de la quantite, et/ou d'une interaction avec PEA-15, d'un agent a cribler dans un echantillon. Selon un mode de realisation, le marqueur fluorescent D porte par la protein 20 PEA-15 peut are choisi, de maniere non limitative, parmi une protein, telle qu'une protein fluorescente, un marqueur fluorescent, par exemple choisi parmi un derive de la fluoresceine, un derive de la rhodamine, un derive de 1'Alexa 532 , un derive du Bodipy ou un derive de 1'Oregon Green , sous reserve que D et A soient tels que definis ci-dessus. Selon un mode de realisation, la proteine fluorescente peut titre choisie, de 25 maniere non exhaustive, parmi la Green Fluorescent Protein, ou un de ses variants fluorescents, tels que la Yellow Fluorescent Protein (YFP), la Cyan Fluorescent Protein (GFP) ou la Red Fluorescent Protein (RFP) ou le DS Red ou un de ses variants. Selon un mode de realisation, la proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent peut titre notamment une proteine de fusion, par exemple GFP-PEA-15. Une 30 telle proteine peut are obtenue par toute technique de biologie moleculaire connue de 1'homme du metier, et notamment celles decrites dans Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, Laboratory Cold Spring Harbor , NY, 1989, 2d Ed.

La construction et 1'obtention de vecteur d'expression contenant une proteine de fusion, telle que par exemple GFP-PEA-15 releve des connaissances et de la pratique habituelles de 1'homme du metier. Les sequences codant pour ces proteines sont par exemple disponibles dans des banques de donn&es, sur le site www.ncbi.nlm.nih.gov ou sur le site ca.expasy.org, et &galement commercialement. Des vecteurs d'expression, contenant une sequence d'acides nucl&iques codant pour la GFP (ou un de ses variants) ou le DS Red peuvent &tre disponible commercialement, notamment aupres de soci&t&s telles que Invitrogen ou Clontech. L'expression de tels vecteurs peut se faire dans toute cellule hote adaptee, et la recuperation de la proteine de fusion ou le cas &ch&ant de 1'acide nucl&ique codant par une telle proteine, comme 1'ARNm ou 1'ADNc, peut se faire par tout moyen adapt& connu de 1' homme de 1' art. Par exemple, une proteine de fusion GFP-PEA-15 a et& decrite par KITSBERG et at. (J. Neurosci., 1999,19:8244).

Selon un mode de realisation, un proc&d& de criblage conforme a 1'invention peut &tre mis en oeuvre, par exemple, en utilisant un compose conforme a 1'invention de formule (IV). Selon un mode de realisation, la proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D peut &tre une proteine de fusion GFP-PEA-15.

Selon un mode de realisation, un proc&d& de criblage conforme a 1'invention peut &tre effectu& ex vivo ou in vitro. Par exemple, un proc&d& conforme a 1'invention mis en oeuvre peut &tre effectu& ex vivo A. partir d'un tissu pr&lev& a partir d'un animal de laboratoire modifi& genetiquement pour que ses cellules expriment, de maniere tissu specifique ou non, une proteine de fusion GFP-PEA-15. Un proc&d& conforme a 1'invention realise peut &tre effectu& in vitro notamment in cellulo a partir de cellules intactes, ou ex cellulo, par exemple dans un lysat de cellules ou apres separation des elements d'int&rets, comme la proteine de fusion GFPPEA-15.

Un proc&d& de criblage conforme a 1'invention peut &tre effectu& in cellulo dans des cellules exprimant la proteine de fusion selon 1'invention, soit apres transfection de cellules, primaires ou en lignees, au moyen d'un vecteur d'expression tel que defini precedemment, soit par mise en culture de cellules pr&lev&es chez un animal de laboratoire modifi& genetiquement de maniere a exprimer une construction comme defini ci-dessus, soit par perfusion de cellules primaires ou en lignees, par exemple au moyen d'une micropipette ou de tout autre moyen connu de 1'homme de fart, d'une protein de fusion selon l'invention, ou d'une sequence d'acide nucl&ique codant pour cette proteine de fusion.

Selon un autre de ses aspects, la presente invention se rapporte a un proc&d& de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une proteine PEA-15, ou un de ses 10 analogues, comprenant au moins les &tapes consistant a : a- mettre en presence au moins une proteine PEA-15 li&e a un support avec un compose conforme a 1'invention, dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, b- mesurer un premier signal S 1 caract&ristique de 1'ensemble obtenu a 15 1'&tape a), c- mettre en presence 1'ensemble obtenu a 1'&tape a) avec un agent A. cribler dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, d- mesurer un second signal S2, de meme nature que S1, caracteristique de 1'ensemble obtenu a 1'&tape c), 20 e- comparer S i et S2 afin d'en tirer une conclusion relative A. une eventuelle interaction de ladite proteine PEA-15 avec 1'agent a cribler. Selon un mode de realisation, la proteine PEA-15 peut &tre li&e a un support au moyen d'un marqueur dit marqueur de purification >>. Au sens de la presente invention, on entend designer par marqueur de 25 purification >>, toute structure susceptible d' etre utilisee A. des fins de liaison entre la proteine PEA-15 et un support. Un marqueur de purification peut &tre, par exemple et de maniere non limitative, une etiquette FLAG, une etiquette polyHistidine, ou une proteine GST(Glutathion S Transferase). 30 Une proteine PEA-15 li&e a un marqueur de purification tel que defini precedemment peut &tre une proteine de fusion obtenue par toutes methodes de biologie moleculaire connues de 1'homme de fart, notamment comme indiqu& ci-dessus.

Par exemple une proteine de fusion GST-PEA-15 peut etre ete obtenue selon le protocole decrit par Kitsberg et al. (J. Neurosci, 1999, 19 : 8244). Selon le marqueur de purification consideree, un support convenant a la mise de 1'invention peut etre, par exemple et de maniere non exhaustive, une surface d'une bille de Sepharose ou d'une plaque pour culture de cellules recouverte de glutathion tel que des plaques 96 puits commercialisees par SIGMA (ref. P3233), une colonne de nickel, un anticorps anti-FLAG lie a une colonne de proteine G ou de proteine A, ou a la surface d'une bille de Sepharose ou au fond d'un puits d'une plaque de culture de cellules. Par ailleurs pour une mise en oeuvre d'un procede selon, la proteine PEA-15 peut etre liee a la surface d'une sensor ship, pour une mise en oeuvre dans un procede de detection d'un signal par resonance plasmonique de surface, selon des moyens connus de 1' homme de 1' art. Selon un mode de realisation, le compose selon 1'invention peut etre fluorescent et le premier signal S1 et le second signal S2 peuvent etre des signaux de fluorescence. La mesure de ces signaux peut etre obtenue par toutes methodes de spectrofluorimetrie ou d'imagerie par fluorescence, connues de 1'homme de fart. Les conditions d' excitation et d'enregistrement de remission de fluorescence sont a adapter selon differents facteurs connus de 1'homme de fart, tels que, par exemple et de maniere non exhaustive, la nature du marqueur fluorescent A, le support sur lequel est la proteine PEA-15. Une eventuelle interaction de la proteine PEA-15 avec un agent a cribler entrainant le deplacement du compose selon 1'invention prealablement lie peut etre detectee par une difference d'intensite de fluorescence entre les deux signaux S1 et S2.

Selon un autre mode de realisation, le premier signal S1 et le second signal S2 peuvent etre des signaux obtenus par resonance plasmonique de surface, par exemple au moyen d'un appareil de type Biacore , selon des protocoles connus de 1'homme de fart. Ces signaux sont independants de la nature fluorescente ou non d'un compose selon 1'invention.

Ainsi dans cette mise en oeuvre du procede precedemment decrit, le compose conforme a 1'invention peut ne pas etre fluorescent.

La proteine PEA-15 peut &tre fixee sur une sensor ship comme decrit pr&c&demment. Un compose selon 1'invention peut &tre mis en contact avec ladite proteine fixee au sensor ship. Les interactions entre le compose et la proteine peuvent &tre detect&es par resonance plasmonique de surface. Une eventuelle interaction de la proteine PEA-15 avec un agent a cribler entrainant le d&placement du compose selon 1'invention prealablement lie peut &tre detect&e par resonance plasmonique de surface.

Selon un autre mode de realisation, la presente invention a pour objet un proc&d& de diagnostic et/ou de pronostic d'un &tat pathologique susceptible d'impliquer PEA-15 par detection et, eventuellement, quantification de la proteine PEA-15 dans au moins un &chantillon biologique pr&sum& comprendre ladite proteine comprenant au moins les &tapes consistant a : a) mettre en presence au moins une proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un compose fluorescent conforme a 1'invention dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, A et D &cant tels qu'ils d&finissent un couple accepteur-donneur d'&nergie de fluorescence, convenant a la mise en oeuvre d'un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence, b) mesurer un premier signal S 1 caract&ristique de 1'ensemble obtenu a 1'&tape a) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'&nergie de fluorescence, c) mettre 1'ensemble obtenu a 1'&tape a) en presence d'un &chantillon biologique pr&sum& comprendre au moins une proteine PEA-15 dans des conditions propices a 1'interaction de ladite proteine PEA-15 de 1'&chantillon biologique avec ledit compose selon l'invention, d) mesurer un second signal S2, de meme nature que S1, caract&ristique de 1'ensemble obtenu a 1'&tape c) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'&nergie de fluorescence, e) comparer S i et S2 afin d'en tirer une conclusion relative a une eventuelle 30 presence de la proteine PEA-15 dans ledit &chantillon biologique, et &ventuellement une conclusion relative a la quantit& de ladite proteine.

Une comparaison du premier et du second signal peut permettre une detection d'une modulation d'amplitude d'un signal fluorescent. Une telle modulation peut &tre informatif de la presence, et eventuellement, de la quantit& de proteine PEA-15 eventuellement presente dans 1'&chantillon.

La determination de la presence et eventuellement de la quantite de la proteine PEA-15, eventuellement compare a des valeurs de references obtenues, soit a partir d'un echantillon controle comprenant une quantite connue de cette proteine, soit a partir d'un echantillon biologique sain, eventuellement en parallele avec la mesure pr&c&dente, peut &tre informatif d'un &tat pathologique impliquant notamment PEA-15 et/ou une evolution d'un tel &tat. A titre d'exemple d'&tat pathologique susceptible d'etre diagnostiqu& et/ou pronostiqu& par un proc&d& selon 1'invention, on peut mentionner le cancer, et notamment les gliomes, les cancers des ovaires, les cancers du sein, les cancers du rein, les melanomes, et &galement le diabete de type II.

Un echantillon biologique peut &tre obtenu a partir d'un tissu biologique ou d'un fluide corporel. Un proc&d& selon l'invention peut comprendre une &tape consistant a comparer un signal S3 mesur& a partir d'un echantillon controle avec les signaux Si et S2 tels que d&finis pr&c&demment pour en tirer une information la presence et, eventuellement, la quantite de PEA-15 dans un echantillon biologique. Selon un mode de realisation, le premier et le second signal peuvent &tre compare a un ou plusieurs signaux fluorescents detectes a partir d'un ou plusieurs &chantillon(s) controle(s). De tels &chantillons controles peuvent &tre obtenus en mettant en oeuvre un proc&d& selon 1'invention et en remplacant a 1'&tape c) 1'&chantillon biologique par un ou des &chantillon(s) comprenant une quantite connue de proteine PEA-15. Le ou les &chantillons controles peuvent &tre pr&pares selon un proc&d& conforme a 1'invention simultanement ou independamment de la mise en oeuvre d'un proc&d& selon l'invention pour la detection et, eventuellement, la quantification de la proteine PEA-15 dans un echantillon biologique.

Selon un mode de realisation, it est possible de faire varier les quantit&s connues de PEA-15 du ou des &chantillon(s) controle(s) ou la quantit& de proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D et ou de compose fluorescent conforme a l'invention de fawn au pouvoir obtenir une gamme &talon. Une correlation d'un signal de fluorescence a rune des quantites variables pr&c&demment defines peut &tre ainsi realisee.

Ainsi, une correlation d'un signal de FRET peut &tre &tablie avec des quantites connues de proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D, de compose fluorescent conforme a 1'invention de proteine PEA-15. Selon un mode de realisation, la proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D peut, notamment, &tre telle que define pr&c&demment.

Selon un mode de realisation, une proteine PEA-15 portant un marqueurfluorescent D peut &tre une proteine de fusion de type GFP-PEA-15. Selon un mode de realisation, le compose conforme a 1'invention peut &tre tel que d&fini pr&c&demment, et notamment peut &tre de formule (IV) tel que pr&cis& cidessus.

De nombreuses variations d'un proc&d& de diagnostic selon l'invention peuvent &tre envisages et le cas &ch&ant combines a des caract&ristiques d'un proc&d& de criblage selon 1'invention. Ainsi, selon un mode de realisation, l'invention concerne un proc&d& de diagnostic et/ou de pronostic d'un &tat pathologique susceptible d'impliquer PEA-15 mis en oeuvre selon les principes indiques ci-dessus pour le proc&d& de criblage, par exemple, mettant en oeuvre une detection par resonance plasmonique de surface, dans lequel, 1'agent a cribler et remplacer par 1'&chantillon biologique. La PEA-15 eventuellement presente dans un tel echantillon pourra se li&e au compose conforme a 1'invention et modifier ainsi le signal enregistr&.

TROUSSE POUR CRIBLAGE OU DIAGNOSTIC La presente invention a &galement pour objet une trousse pour criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une proteine PEA-15, ou d'un de ses analogues ou pour le diagnostic et/ou le pronostic d'un &tat pathologique susceptible d'impliquer PEA-15 comprenant : - au moins une proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D ou un marqueur de purification, et - au moins un compose conforme a 1'invention, le cas &ch&ant, A et D &cant tels qu'ils peuvent d&finir un couple accepteur-donneur d'&nergie de fluorescence, convenant a la mise en oeuvre d'un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence.

Selon un mode de realisation, la proteine PEA-15 portant un marqueur de fluorescence D ou un marqueur de purification peut &tre telle que define pr&c&demment. Selon un mode de realisation, lorsque la trousse selon 1'invention est plus particulierement mise en oeuvre pour le diagnostic et/ou pronostic d'un &tat pathologique, elle peut comprendre en outre au moins une proteine PEA-15 non marquee.

Selon un mode de realisation, la proteine de fusion form&e d'une proteine PEA-15 avec une proteine fluorescente ou la proteine PEA- 15 non marquee peuvent &tre presentes dans une trousse conforme a 1'invention sous la forme d'une sequence d'acides nucl&iques codant pour lesdites proteines, telle qu'un ADNc, un ARNm, ou un vecteur d' expression.

COMPOSITION PHARMACEUTIQUE Selon un mode de realisation, la presente invention a &galement pour objet un compose conforme a 1'invention pour une utilisation a titre d'agent actif dans une composition pharmaceutique.

Au sens de la presente invention, on entend designer par composition pharmaceutique >>, une composition ou une substance presentee comme possedant des propri&t&s curatives ou preventives a 1' &gard de maladies humaines ou animales, ainsi qu'une substance ou composition destine a &tre utilise afin d'etablir un diagnostic et/ou de pronostic d'un &tat pathologique ou non, ou de restaurer, corriger ou modifier les fonctions organiques d'un individu. La methode de diagnostic et/ou de pronostic susceptible d'etre mise en oeuvre par une composition pharmaceutique selon 1'invention peut &tre effectu&e in vitro ou ex vivo. Une composition pharmaceutique conforme a 1'invention peut comprendre un compose conforme a 1'invention de formule generale (I), ou un de ses derives tels qu'une forme tautomere, une forme stereoisom&re, une forme polymorphe, un sel pharmaceutiquement acceptable, ou un solvate pharmaceutiquement acceptable, en combinaison avec des vehicules, des diluants, ou des excipients usuellement utilises en pharmacie. Une composition pharmaceutique conforme a 1'invention peut etre presentee sous une forme galenique usuellement utilisee dans le domaine, telle que des comprimes, des gelules, une poudre, un sirop, une solution, une suspension. Une composition pharmaceutique conforme a 1'invention peut etre presentee sous une forme galenique convenant a 1' administration par d'autres voies, telles que la voie orale, la voie nasale, la voie sublinguale, la voie topique, la voie ophtalmique, la voie rectale, etc.

Une composition cosmetique conforme a 1'invention peut egalement etre presentee sous une forme sterile convenant a une administration par voie parenterale, telle que la voie sous-cutanee, transdermique, intramusculaire, intraveineuse, intra-arterielle, intra-cardiaque, etc. Une composition pharmaceutique conforme a 1'invention peut egalement etre 15 presentee sous une forme lyophilisee, combinee au moment de son utilisation avec une solution aqueuse sterile ou non. En particulier, la solution aqueuse peut etre sterile si la composition conforme a 1'invention est destinee a une administration parenterale. La quantite de compose conforme a 1'invention presente dans une composition 20 pharmaceutique est a ajuster, par exemple, selon la voie d'administration, le type d'individu a traiter, la nature de la pathologie a traiter. L'ajustement des quantites et des posologies en fonction de ces parametres est connu de 1' ho mme de 1' art. Une composition conforme a 1'invention comprend generalement une quantite 25 suffisante d'un compose conforme a 1'invention. On entend designer par quantite suffisante >>, la quantite necessaire a 1'obtention d'un effet recherche. Au sens de la presente invention, un tel effet peut etre par exemple la reduction ou le traitement des symptomes presentes par un individu presume atteint d'une pathologie telle qu'un cancer ou un diabete de type II. 30 Le cancer peut etre par exemple un gliome, un cancer du rein, un cancer du sein, ou un melanome.

Selon encore un autre de ses objets, la presente invention a pour objet 1'utilisation d'un compose conforme a 1'invention pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destine au traitement d'un &tat pathologique susceptible d'impliquer PEA-15.

La proteine PEA-15 peut &tre impliqu&e soit par une alteration de son expression, A. savoir par exemple une surexpression ou un manque d'expression, soit par une alteration de son activit& biologique, se traduisant, par exemple, par une augmentation de son activit& ou une diminution de son activit&, et pouvant &tre le resultat soit d'une mutation (par exemple substitution, insertion ou deletion) dans la sequence de la proteine PEA-15, soit resultant d'une alteration des signaux cellulaires modulant 1'activit& biologique et/ou l'expression de la proteine PEA-15. En relation avec un &tat pathologique susceptible d'impliquer PEA-15, le terme traitement vise A. designer la reduction de la severite d'une maladie, telle que par exemple la reduction des symptomes ou la prevention de ces symptomes.

Ainsi, et dans ce dernier cas, un compose conforme a 1'invention peut &tre administr& avant le developpement de 1'&tat pathologique. Les &tats pathologiques vises par la presente invention peuvent &tre notamment ceux d&finis pr&c&demment, tels que le cancer, et notamment les gliomes, les cancers du rein, les cancers du sein, les cancers de l'ovaire, les melanomes, et &galement le diabete de type II. On entend designer par << individu au sens de la presente invention 1'homme, des primates non humains, ainsi que des animaux de laboratoire tels que les rongeurs (par exemple souris, rat, cochon d'inde ou hamster), des animaux de ferme, en particulier des animaux &conomiquement interessants tels que la volaille,les bovins, les ovins, les pores, les chevres et les poissons, et particulierement ceux produisant des produits convenant A. la consommation humaine tels que la viande, les oeufs et le lait. Ce terme vise &galement a designer les animaux domestiques tels que les chats et les chiens. La presente invention a &galement pour objet une composition pharmaceutique telle que define pr&c&demment.

Selon un mode de realisation, la presente invention a &galement pour objet un complexe isole comprenant au moires une proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D ou un marqueur de purification et au moires un compose de formule conforme a 1invention, A et D etant tels qu'ils peuvent definir un couple accepteurdonneur d'energie de fluorescence, convenant a la mise en oeuvre d'un transfert d'energie par resonance de fluorescence. Selon une variante de realisation, un complexe selon 1invention peut comprendre a titre de proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D, une proteine de fusion GFP-PEA-15 et a titre de compose de formule conforme a 1invention, un compose de formule (IV), tel que defini precedemment.

De nombreuses modifications de l'invention telle qu'exposee ci-dessus peuvent 10 etre envisagees par 1'homme de Part sans s'ecarter de la portee de celle-ci. De telles modifications sont couvertes par la presente demande. L'invention est illustree par les exemples suivants, qui ne doivent pas etre interpretes comme limitant la portee de la presente invention.

15 LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : represente des images obtenues par imagerie confocale de la localisation du compose intracellulaire des proteines ERK et PEA-15 avant et apres traitement avec 50 M 6D6-1. Le traitement des cellules avec le compose 6D6-1 se traduit par une relocalisation de la proteine ERK dans le noyau alors que la proteine PEA-15 reste 20 cytoplasmique. La bane d'echelle correspond a 40 m.

Figure 2 : represente 1'intensite moyenne de la fluorescence de bille de Sepharose recouverte de glutathion, portant une proteine de fusion GST-PEA-15, incubees 25 en presence de 1 et 5 M de 6D6-1.

EXEMPLES EXEMPLE 1 : Synthese du compose 6D6-1 30 Synthese de (1-Methyl-piperidin-4-yl)-carbamic acid tent-butyl ester N NHBoc Dans un reacteur, la resine REM (REgenerated Michael, resin de polystyrene) (5 g, 4 mmol, 0,8 mmol.g .mol-' de charge theorique) est gonflee dans une qualit& minimale de dimethyleformamide (DMF). Une solution de tertiobutyloxycarbonylaminopiperidine (8 g, 40 mmol) dans le DMF (50 ml) est port&& A. 80 C puis ajout&e A. la resine en suspension. Le melange est agit& pendant 16 heures A. 80 C, puis filtre, et lave trois fois selon la sequence DMF, CH2C12 MeOH. Dans une seringue Supelco, la resine (2.3g, 1.5 mmol) est expanse dans 20 mL de DMF et l'iodure de methyle (3.81 mL, 61 mmol) est ajoute. Le melange est agit& par rotation pendant 24 h, la resine est filtree, lavee avec 3 sequences de DMF/ DCM. Dans les memes conditions une deuxieme &tape d'alkylation par 1'iodure de methyle est repetee. Le clivage de la piperidine de sur la resine est realise dans un ballon avec 40 mL de DCM et en presence de la resine IRA-95 (3.16 g, 1.5 mmol). Apres 24 h d'agitation par un barreau aimante, la resine est filtree, lavee DCM/MeOH. Le filtrat est collect& et amen& A. sec sous pression reduite. Une purification par flash chromatographie sur gel de silice (DCM/ MeOH : 9/1) conduit au (1-Methyl-piperidin-4-yl)-carbamic acid tert-butyl ester sous forme d'une poudre blanche. Rdt = 100 % ; 'H NMR (CDC13, 200 MHz): 4.43 (m, 1H), 2.77 (m, 2H), 2.26 (s, 3H), 2.13-1.87 (m, 4H), 1.53-1.46 (m, 2H), 1.42 (s, 9H). 13C NMR (CDC13, 50 MHz) 155.60, 110.00, 54.86, 46.47, 32.90, 28.80.

Synthese de la 1-methyl-piperidin-4- His(Bzl)-NHBoc o N N N NHBoc A temperature ambiante et sous agitation magn&tique, la (1-Methyl-piperidin4-yl)-carbamic acid tert-butyl ester (0.07 g, 0.34 mmol) est trait&e par une solution de TFA/DCM (lmL /lmL) pendant 1H30. La solution est ensuite &vapor&e A. sec sous pression reduite et le produit obtenu est sech& sous vide pendant 18 h. La N-methyl pip&ridine d&protegee est dissout dans 1 mL de DMF et sont successivement additionnes la Boc-His(Bzl)-OH (0.12 g, 0.32 mmol), le benzotriazol-1-yl- oxytrispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate [PyBop] (0.17 g, 0.32 mmol) et la diisopropylethylamine [DIEA] (0.27 mL, 1.6mmol). Apres une agitation magnetique de 3h A. temperature ambiante, la reaction est evaporee A. sec puis purifie par HPLC et conduit apres lyophilisation a une huile translucide. Rdt= 100 % ; tr = 15.74 min ; X = 220 nm ; gradient t = 0 min : 0 %solvant B 5 a t = 5 min : 0 % solvant B a t = 35 min : 100 % solvant B. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calcule pour [C24H35N503 +H ] 442 trouve 442.

Synthese de la Fmoc-Lys(o-Lissamine)-OH ,N, O_ Nom/ OH O 10 A temperature ambiante et sous agitation magnetique, la Fmoc-lys(Boc)-OH (0.57 g, 1.23 mmol) est traitee par une solution de TFA/DCM (5mL /5mL) pendant 2H. La solution est ensuite evaporee A. sec sous pression reduite et le produit obtenu est seche sous vide pendant 18 h. La Fmoc-lys-OH est ensuite mis en solution dans 17 mL de DCM puis de la triethylamine [TEA] (1.38 mL, 9.84 mmol) est additionne pour ajuste le pH au 15 environ de 8-9, on observe alors la formation d'un gel qui disparait lors de 1'addition en une demi-heure a 0 C de la lissamine (0.78 g, 1.35 mmol). Ramene A. temperature ambiante, la reaction est laissee sous agitation magnetique pendant 5 H. Le melange reactionnel est ensuite dilue avec 50 mL de DCM, lave deux fois avec HC1 10% (10 mL), puis la phase organique est sechee sur sulfate de soduim, evaporee A. sec. La purification et 20 la separation des deux isomeres de position est obtenue sur gel de silice (dichloromethane/methanol/acide acetique : 94/5/1) et conduit A. deux poudres violettes. Rdt : isomere para 40 % et isomere ortho 5 %. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calcule pour [C48H52N4010S2+H] 909, trouve 909. 25 Synthese de la 1-methyl-piperidin-4- His(Bzl)- Lys(o-Lissamine)-NHFmoc O A temperature ambiante et sous agitation magnetique, la 1-methyl-piperidin-4- His(Bzl)-NHBoc (0.03 g, 0.08 mmol) est trait& par une solution de TFA/DCM (lmL /lmL) pendant 1H30. La solution est ensuite &vapor&e A. sec sous pression reduite et le produit est sech& sous vide pendant 18 h. L'amine ainsi obtenue est dissout dans 0.5 mL de DMF et sont successivement additionnes la Fmoc-Lys(o-Lissamine)-OH (0.06 g, 0.07 mmol), le PyBop (0.03 g, 0.07 mmol) et la TEA (0.01 mL, 0.07 mmol). Apres une agitation magnetique de 4h A. temperature ambiante, la reaction est &vapor&e A. sec puis purifie par HPLC et conduit apres lyophilisation a une poudre violette. Rdt = 15 %; tr = 18.97 min ; X = 220 nm ; gradient t = 0 min : 5 % solvant B a t = 30 min : 100 % solvant B. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calcule pour [C67H77N9010S2+H] 1232, trouv& 1232. 20 Synthese de la 1-methyl-piperidin-4-His(Bzl)-Lys(o-Lissamine)- 1-methyl-1 H-imidazol-4-yl)-acetamide N 0 H H O H N W- N Dans une premiere &tape la 1-methyl-piperidin-4- His(Bzl)-Lys(o-Lissamine)- NHFmoc (0.01mg, 0.01 mmol) est trait& par 0.12 mL de pip&ridine dans 0.5 mL de DMF pendant 1 H a temperature ambiante. La solution est ensuite directement inject&e sur HPLC semi-preparative et conduit au produit d&protege sur 1'amine terminale avec un rendement de 40 %. L'amine (0 .004 g, 0.004 mmol) ainsi obtenue est engage dans une derriere &tape de couplage avec la 1-methyl-4-imidazoleacetic acid hydrochloride (0.001 g, 0.007 mmol) en presence de PyBop (0.003 g, 0.007 mmol) et de DIEA ( 0.005 mL, 0.033 mmol) dans 0.3 mL de DMSO. Apres 1H30 d'agitation A. temperature ambiante, la solution est directement inject& sur HPLC semi-preparative et conduit apres lyophilisation a une poudre violette. Rdt 30 % tr = 17.70 min ; X=220nm;gradient t=0min:5%solvant Bat= 15 35 min : 100 % solvant B. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calcule pour [C58H73N1109S+H ] 1132, trouv& 1132.

EXEMPLE 2 Detection par FRET de l'interaction du compose 6D6-1 avec la PEA-I5-GFP 20 La lign&e cellulaire 3T3 exprimant la GFP-PEA-15 (cellule 3T3-GFP-PEA-15) a et& obtenue comme decrit par FORMSTECHER et at. (Dev. Cell., 2001, 1: 239) par transfection des cellules NIH3T3 avec un plasmide pEGFP-PEA-15 obtenu comme decrit par KITSBERG et at. (J. Neurosci., 1999, 19:8244). O I I Des clones resistants a la neomycine (G418) ont et& selectionnes et cultives dans un milieu DMEM (Roche) complete avec 10 % de serum de veau foetal, 2mM de glutamine, de la penicilline (5 IU/ml) et de la str&ptomycine (5 g/ml). L'expression de la protein GFP-PEA-15 a et& verifiee par mesure de la fluorescence des cellules vivantes et une analyse par transfert WESTERN avec un anticorps anti-GFP (Roche, cat n 1 814 460 melange de deux anticorps monoclonaux faits chez la souris (clone 7.1 et clone 13.1)) et un anti-PEA-15 (anticorps polyclonal de lapin, Sharif et at., Neuroscience, 2004). Les cellules 3T3-GFP-PEA-15 sont ensuite cultivees jusqu'a confluence dans un milieu HAM-F12 comprenant de la penicilline (10 000 U/ml)/str&ptomycine (10 000 g/ml), 7 % de serum de veau foetal (BIOWHITTAKER) avant les experiences de transfert d'&nergie par resonance de fluorescence (FRET). Une solution stock du compose 6D6-1, dissous dans du DMSO a une concentration d'environ 20 mM est diluee avant utilisation dans du PBS a une 15 concentration de 10 fois la concentration finale. Le compose 6D6-1 est test& a 10-4 M et 10-5 M. Apres addition du compose 6D6-1, les cellules sont agitees doucement (100 rpm) pendant 60 minutes avant la lecture de la fluorescence afin de permettre aux composes de diffuser et de rentrer dans les cellules. 20 Les cellules sont irradi&es a une longueur d'excitation a 465 nm. La proteine GFP excitee a 465 nm &met un signal de fluorescence a 535 nm. La liaison du compose 6D6-1 a la proteine GFP-PEA-15, permet un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence (FRET) se traduisant par remission d'un signal de fluorescence a 590 nm. 25 EXEMPLE 3 Effet du compose 6D6-1 sur la localisation de ERK Des cultures primaires d'astrocytes ont et& pr&par&es a partir de cortex et de striatum d'embryons de souris (jour 16) comme decrit par ARAUJO et at. (J. Biol. Chem., 30 1993, 268:5911).

Les cultures primaires d'astrocytes ont ete maintenues pendant 24 heures en absence de serum, une condition connue pour induire une localisation principalement cytoplasmique d'ERK. Les cellules ont ensuite ete traitees ou non par 50 M du compose 6D6-1 5 pendant 2 heures 15. La localisation sub-cellulaire d'ERK et de PEA-15 a ete observee par microscopie confocale apres marquage des cellules par des anticorps fluorescents. Les cellules ont ete lavees deux fois avec du PBS (tampon salin phosphate de Dulbecco, sans CaC12 ni MgC12, Sigma), et fixees avec du paraformaldehyde A. 4 % dans du 10 PBS (pH 7,5), pendant 15 minutes, puis lavees deux fois avec du PBS comprenant 0,1 M de glycine, A. temperature ambiante. Ensuite, les cellules ont ete incubees pendant 5 minutes dans du PBS contenant 0,2 % de triton X-100. Les sites non specifiques ont ete bloques avec du PBS contenant 10 % de 15 serum de chevre normal (NGS) pendant une heure a temperature ambiante. Puis les cellules ont ete incubees sur la nuit A. 4 C avec des anticorps specifiques de PEA-15 (anticorps polyclonal de lapin, Sharif et al, Neuroscience, 2004) ou de ERK (anticorps polyclonal de lapin, Santa Cruz K-23 (ref sc-94)), dilues dans du PBS contenant 1,5 % de NGS. 20 Apres trois lavages dans du PBS, les cellules sont incubees pendant une heure a temperature ambiante avec un anticorps anti-lapin marque par Alexa-488 (Molecular Probes). Les noyaux cellulaires ont ete marques avec de 1'iodure de TOPRO2 selon les specifications du fabricant (HOECHST). 25 Les lamelles ont ete montees sur des lames de verre dans un milieu FLUOROMOUNT (Southern Biotechnology) et examinees par microscopie confocale (TCS SP2, LEICA) avec les filtres appropries. Pour 1'analyse confocale, les longueurs d'ondes d'excitation etaient 488 nm pour Alexa 488 et 633 nm pour TOPRO, les longueurs d'ondes d'emission etaient 510-525 30 nm pour Alexa-488 et 647 nm pour TOPRO. Le traitement des astrocytes par 50 M du compose 6D6-1 conduit a la relocalisation d'ERK dans le noyau, alors que PEA-15 reste cytoplasmique (Figure 1).

EXEMPLE 4 Interaction 6D6-1/proteine PEA-15 La proteine de fusion GST-PEA-15 a ete obtenue selon le protocole decrit par Kitsberg et at. (J. Neurosci, 1999, 19 : 8244).

Les proteines de fusion GST-PEA-15 ont ete recuperees apres lyse des bacteries et incubees en presence de bille de Sepharose recouverte de gluthation. Les billes ainsi obtenues sont incubees en presence de 1 ou 5 M de 6D6-1, dans un tampon Tris-HC1 20 mM pH7,4 ; NaCl 100 mM ; MgC12 1 mM ; Triton X-100 1 %).

Apres une serie de trois lavages, les billes sont seches sur une membrane de cellulose et la fluorescence est quantifiee au moyen d'un phospholmager (Biorad), en mesurant la fluorescence de la lissamine par excitation a 543 nm et mesure de remission a 590 nm. Les resultats sont la moyenne de trois experiences independantes.

Les resultats indiquent que 1'intensite moyenne de fluorescence depend de la concentration du compose et suggerent ainsi une interaction specifique entre le compose 6D6-1 et la proteine PEA-15.

Claims (31)

REVENDICATIONS

1. Compose de formule generale (I) suivante : dans laquelle : - n est egal a 0 ou 1, - p represente un nombre entier variant de 1 A. 6, et en particulier variant de 2 a 4, r represente un nombre entier variant de 1 A. 12, et en particulier variant de 2 a 6, et en particulier est egal a 4, - R1 represente un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 a C20, sature ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 A. C10, sature ou insature, un radical aryle, optionnellement substitue par un ou plusieurs atomes d'halogene, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en C1 A. C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en C1 O. Clo, R2 represente une chaine laterale d'acide amine ou d'un derive d'acide amine, -COR3 represente un radical acyle porteur d'une entite basique, notamment choisie parmi les radicaux de formules suivantes :- dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, Y represente N ou N+ùR7 et R6 et R7 representent independamment Fun de 1'autre, un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 a C20, sature ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 a C10, sature ou insature, un radical aryle en C6 a C10, optionnellement substitue par un ou plusieurs atomes d'halogene, un ou plusieurs radicaux alkoxy en C1 a C6, ou un ou plusieurs radicaux alkyle en C1 a Clo. R4 peut representer un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1 a Clo, sature ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3 a Clo, sature ou insature, un radical aryle en C6 a C10, optionnellement substitue par un ou plusieurs atomes d'halogene, un ou plusieurs radicaux alkoxy en C1 a C6, ou un ou plusieurs radicaux alkyle en C1 a Clo, A represente un radical derive d'un reste xanthene, d'un reste acridine ou d'un reste 4-bora-3a,4a-diaza indacene, et ses derives.

2. Compose selon la revendication 1, dans lequel A represente un marqueur 15 fluorescent.

3. Compose selon la revendication 1 ou 2, dans lequel R1 represente un atome d'hydrogene, un radical alkyle en C1-C18, un radical alkyle en C2-C16, un radical aryle en C6 a C10, optionnellement substitues par un ou plusieurs atomes d'halogene.

4. Compose selon 1'une quelconque des revendications 1 a 3, dans lequel R1 20 represente un radical methyle, un radical ethyle, un radical isopropyle, un radical npropyle, un radical benzyle, un radical phenetyle ou un radical perfluoroalkyle de formule Cä F2ä+1 dans laquelle n peut varier de 1 a 10.

5. Compose selon 1'une quelconque des revendications 1 a 4, dans lequel R2 represente une chain laterale d'un acide amine ou derive d'acide amine choisi parmi 25 1'alanine, la glutamine, la leucine, la glycine, le tryptophane, la (3-alanine, la phenylalanine, la 4-chloro-phenylalanine, 1acide isonipecotinique, 1acide 4-aminomethylbenzoique, dacide 3-tetrahydroisoquinoleinique et 1'histidine libre ou benzylee.

6. Compose selon rune quelconque des revendications 1 a 4, dans lequel R2 est de formule (VI) suivante :dans laquelle - * symbolise une liaison covalente avec le reste d'un compose de formule generale (I), et - R5 represente un radical alkyle en C1-C20 sature ou insature, lineaire ou ramifie, un radical cycloalkyle en C3-C10, sature ou insature, un radical aryle en C6 A. Clo, optionnellement substitues par un ou plusieurs atomes d'halogene.

7. Compose selon la revendication precedente, dans lequel R5 represente un radical methyle, un radical ethyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un radical phenetyle, un radical perfluoroalkyle de formule C,,F2ä+1 dans laquelle n peut varier de 1 a 10.

8. Compose selon rune quelconque des revendications precedentes, dans lequel ùCOR3 est un radical acyle substitue par une entite basique de formule (VII) suivante : dans laquelle : * symbolise une liaison avec le radical acyle ùCOR3, Y peut representer N ou N+R7, et R6 et R7 representent, independamment Pun de 1'autre un atome 20 d'hydrogene, un radical alkyle en C1-C18, un radical alkyle en C2-C16, un radical aryle en C6 a C10, optionnellement substitues par un ou plusieurs atomes d'halogene.

9. Composition selon la revendication precedente, dans lequel R6 et R7 representent, independamment Fun de ratite, un atome d'hydrogene, un radical methyle, un radical ethyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical benzyle, un Y 47 R5 radical phenethyle, un radical perfluoroalkyle de formule CnF2ä+I dans laquelle n peut varier de 1 a

10. 10. Compose selon rune quelconque des revendications precedentes, dans lequel A represente un radical de formule generale (Va) : Bans laquelle : * symbolise une liaison covalente avec le reste du compose de formule (I), Z=OouN, R8 = R9 = N(R')2 avec R' representant un radical alkyle en CI a C6, Cl a C6 10 ouR8=OH et R9=O, Rlo = Rl1 = H ou X, avec X = F, Cl, Br, ou, d'une part R8 et Rio et/ou d'autre part R9 et R11 forment respectivement un heterocycle a 5 ou 6 chainons, condense avec le reste acridine ou xanthene, le cas echeant substitue par un, deux, trois groupements methyle et dont 15 1'heteroatome est place en a du reste acridine ou xanthene et est choisi parmi N ou 0, - R12 = *-NHS02- ou *ùNHCO-, avec * symbolisant une liaison covalente avec le reste du compose de formule (I) - R13 = H, HS03- ou COOH, 20 ou un radical de formule generale (Vb) :5dans laquelle : * symbolise une liaison covalente avec le reste du compose de formule (I), R14 peut representer un reste acyle en C2 a C4, R15 peut representer un radical heterocyclique en C5 a C7, et R16 = R17 = X, avec X = F, Cl ou Br.

11. Compose selon la revendication precedente, dans lequel R12 est en position ortho.

12. Compose selon 1'une quelconque des revendications 2 a 11, dans lequel le radical A represente un marqueur fluorescent choisi parmi le Bodipy et ses derives, la rhodamine et ses derives, le Texas Red et ses derives, la fluoresceine et ses derives, l'Alexa et ses derives et 1'Oregon Green et ses derives.

13. Compose selon la revendication precedente, dans lequel le marqueur fluorescent A est choisi parmi les marqueurs fluorescents de formules suivantes : O j N Et2 10 H Sulfonylrhodamine (lissamine) 0 Fluoresceine 0 Oregon Green Tetramethylrhodamine Me2N Alexa 532 e215Bodipy dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le reste du compose de formule generale (I).

14. Compose selon Tune quelconque des revendications precedentes, dans 5 lequel n est egal a 0.

15. Compose selon la revendication precedente, represents par la formule generale (II) suivante : 50 NùA pH R4 dans laquelle : 10 - RI, R2, R3, R4, A et p sont tels que definis selon rune des revendications 1 a 13.

16. Compose selon la revendication 9, represents par la formule generale (III) suivante : R6 N~ ZY OI 0 0 NH ùN N Iù~--N \ H N--A H NùZ/ R5 dans laquelle A, R5 et R6, sont tels que definis selon l'une quelconque des revendications 15 1,2et6a13.

17. Compose selon la revendication pr&c&dente, represents par la formule (IV) suivante :

18. Procede de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une proteine PEA-15 ou un de ses analogues, comprenant au moins les &tapes consistant a : a) mettre en presence au moins une protein PEA-15 nee a un support avec un compose tel que defini selon rune quelconque des revendications 1 a 17, dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, b) mesurer un premier signal S 1 caracteristique de 1'ensemble obtenu a 10 1'etape a), c) mettre en presence 1'ensemble obtenu a 1'&tape a) avec un agent a cribler dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, d) mesurer un second signal S2, de meme nature que S1, caracteristique de 1'ensemble obtenu a 1'&tape c), 15 e) comparer S l et S2 afin d'en tirer une conclusion relative a une eventuelle interaction de ladite proteine PEA- 15 avec 1'agent a cribler.

19. Procede de criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une proteine PEA-15 ou un de ses analogues, comprenant au moins les &tapes consistant a : a- mettre en presence, au moins une proteine PEA-15 portant un marqueur 20 fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un compose tel que defini selon rune quelconque des revendications 2 a 17, dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, A et D &cant tels qu'ils definissent un couple accepteur-donneur d'energie de fluorescence, convenant a la mise en oeuvre d'un transfert d'&nergie par resonance de fluorescence,b- mesurer un premier signal S 1 caracteristique de 1'ensemble obtenu a 1'etape a) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'energie de fluorescence, c- mettre 1'ensemble obtenu a 1'etape a) en presence d'un milieu presume 5 contenir au moins un agent a cribler dans des conditions propices a une interaction avec ladite proteine, d- mesurer un second signal S2, de meme nature que S1, caracteristique de 1'ensemble obtenu a 1'etape c) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'energie de fluorescence, 10 e- comparer les premier et second signaux S 1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative a une eventuelle interaction de ladite pro-Leine PEA-15 avec 1'agent a cribler.

20. Procede selon la revendication precedente, dans lequel le marqueur fluorescent D est choisi parmi une proteine, telle qu'une proteine fluorescente, un 15 marqueur fluorescent choisi parmi un derive de la fluoresceine, un derive de la rhodamine, un derive de 1'Alexa 532 , un derive du Bodipy ou un derive de 1'Oregon Green .

21. Procede selon la revendication precedente, dans lequel la pro-Leine fluorescente est choisie parmi la Green Fluorescent Protein, ou un de ses variants fluorescents tels que la Yellow Fluorescent Protein (YFP), la Cyan Fluorescent Protein 20 (GFP) ou la Red Fluorescent Protein (RFP) ou le DS Red ou un de ses variants.

22. Procede selon la revendication 20 ou 21, dans lequel la pro-Leine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D est une pro-Leine de fusion GFP-PEA-15.

23. Procede selon rune quelconque des revendications 19 A. 22, caracterisee en ce qu'il est effectue in cellulo. 25

24. Procede selon la revendication precedente, caracterise en ce qu'il est effectue dans des cellules exprimant une pro-Leine de fusion GFP-PEA-15.

25. Procede de diagnostic et/ou de pronostic d'un etat pathologique susceptible d'impliquer PEA-15 par detection et, eventuellement, de quantification de la proteine PEA-15 dans au moins un echantillon biologique presume comprendre ladite 30 proteine comprenant au moins les etapes consistant a : a) mettre en presence au moins une protein PEA-15 portant un marqueur fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un compose, notamment fluorescent, conforme a 1' invention dans des conditions propices a une interaction avec ladite protein, A et D etant tels qu'ils definissent un couple accepteur-donneur d'energie de fluorescence, convenant a la mise en oeuvre d'un transfert d'energie par resonance de fluorescence, b) mesurer un premier signal S 1 caracteristique de 1'ensemble obtenu a 1'etape a) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur d'energie de fluorescence, c) mettre 1'ensemble obtenu a 1'etape a) en presence d'un echantillon biologique presume comprendre au moins une protein PEA-15 dans des conditions propices a 1'interaction de ladite protein PEA-15 de 1'echantillon biologique avec ledit compose selon l'invention, d) mesurer un second signal S2, de meme nature que S1, caracteristique de 1'ensemble obtenu a 1'etape c) par irradiation a une longueur d'onde permettant d'exciter le 15 donneur d'energie de fluorescence, e) comparer S 1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative a une eventuelle presence de la protein PEA-15 dans ledit echantillon biologique, et eventuellement une conclusion relative a la quantite de ladite proteine.

26. Procede selon la revendication precedente, dans lequel la proteine PEA-15 20 portant un marqueur fluorescent D est telle que define selon rune quelconque des revendications 20 a 22.

27. Complexe isole comprenant au moins une proteine PEA-15 et au moins un compose de formule telle que definie selon rune quelconque des revendications 1 a 17.

28. Trousse pour criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une proteine 25 PEA-15, ou d'un de ses analogues, ou pour le diagnostic et/ou pronostic d'un etat pathologique susceptible d'impliquer PEA-15, comprenant : au moins une proteine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D ou un marqueur de purification, et au moins un compose de formule telle que definie selon 1'une quelconque des 30 revendications 1 a 17,le cas echeant, A et D etant tels qu'ils definissent un couple accepteur-donneur d'energie de fluorescence, convenant a la mise en oeuvre d'un transfert d'energie par resonance de fluorescence.

29. Compose selon rune quelconque des revendications 1 a 17 pour une 5 utilisation a titre d'agent actif dans une composition pharmaceutique.

30. Composition pharmaceutique comprenant au moins un compose tel que defini selon dune quelconque des revendications 1 a 17.

31. Utilisation d'un compose tel que defini selon dune quelconque des revendications 1 a 17 pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destine au 10 traitement d'un etat pathologique impliquant PEA-15.