FR2893136A1 - Procedes de diagnostic de maladies hepatiques et de criblage de molecules pour le traitement de ces maladies - Google Patents

Abstract

La présente demande a pour objet une méthode de diagnostic de maladies hépatiques comprenant la mesure de l'expression de l'apolipoprotéine A4 dans les cellules ou tissus hépatiques et dans la circulation (sang, plasma, sérum).Elle est en outre relative à un procédé de criblage de molécules pour le traitement de ces maladies mise en contact desdits composés avec un mammifère et mesure de l'expression de l'apolipoprotéine A4 dans lesdites cellules d'origine hépatique ou dans la circulation dudit mammifère.

Description

La présente demande a pour objet un procédé de diagnostic de maladies

hépatiques. Elle a en outre pour objet un procédé de criblage de molécules pour le traitement de ces maladies. L'apolipoprotéine A4 (Apo A4) est une apolipoprotéine circulante abondante.

L'expression de cette protéine a été mise en évidence chez les rongeurs dans l'hypothalamus, l'intestin grêle et le foie. La majeure partie del' Apo A4 trouvée dans le plasma chez la souris est considérée comme d'origine intestinale (Wu et al JBC 254, 7316-7322 1979). Chez l'homme la synthèse d'Apo A4 a été décrite par Elshourbagy (JBC 262 1987) comme étant limitée au petit intestin. L'Apo A4 a de multiples fonctions. Elle régule le transport des lipides et le métabolisme par l'intermédiaire de différents mécanismes tels que l'activation des flux de cholestérol à partir de tissus hépatiques et la stimulation de l'activité lipoprotéine lipase (Stan et al., Biochim Biophys acta, 1631 2003, 177-187).

L'Apo A4 est aussi connue pour être un facteur de satiété. Les maladies hépatiques constituent un problème majeur de santé publique. II est donc indispensable de diagnostiquer toutes les maladies hépatiques à un stade aussi précoce que possible, à l'aide de méthodes de dosage spécifiques et sensibles.

La demanderesse a mis en évidence de manière surprenante que l'Apo A4 est exprimée dans le foie chez l'homme et que le niveau d'expression hépatique du gène codant l'Apo A4 est augmenté de manière significative dans les maladies hépatiques. La présente invention a pour objet une méthode de détection, de diagnostic ou de pronostic d'une maladie hépatique comprenant la mesure de l'expression de l'Apo A4 dans les cellules ou tissus hépatiques ou des extraits de ces cellules et tissus, ou dans le sang et ses dérivés. Ainsi la présente invention a pour objet la mesure de l'expression de l'Apo A4 non seulement dans les cellules ou tissus hépatiques mais aussi dans le sang, dans lequel on retrouve l'Apo A4 d'origine hépatique. Une telle méthode peut comprendre les étapes de : -isolement des cellules, tissus hépatiques ou d'extraits de ces cellules et tissus, ou du sang ou de ses dérivés. et - mesure de l'expression de l'Apo A4.

De tels extraits peuvent être obtenus par lyse des cellules et tissus hépatiques. On entend par maladies hépatique toute maladie ayant une influence sur les tissus et cellules hépatiques, qu'elle soit chronique ou étiologique (alcoolique, virale, toxique, alimentaire, environnementale...). Plus particulièrement la présente invention a pour objet une méthode de détection, de diagnostic ou de pronostic des stéatohépatites, des carcinogenèses du foie, des cirrhoses, des hépatites virales, des insuffisances hépatocellulaires, des cholestases, des hypertensions portales, des stéatoses et stéatohépatites, de la maladie de la veine et l'artère hépatique, des fibroses, de l'obésité, et des syndromes métaboliques.

On entend par dérivé du sang toute fraction cellulaire ou acellulaire issue du sang par traitement physique (par exemple par centrifugation), biologique (par exemple par coagulation) ou chimique ou par tout autre traitement permettant l'obtention de tels dérivés. Préférentiellement de tels dérivés sont le plasma et le sérum.

Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de l'invention ladite méthode comprend la mesure de la quantité d'ARN messager (ARNm) transcrits à partir du ou des gènes codant l'Apo A4 dans les cellules ou tissus hépatiques d'un individu chez lequel on souhaite diagnostiquer ou pronostiquer une maladie hépatique. Les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés dudit mammifère sont prélevés et traités par des méthodes connues de l'homme du métier, afin notamment d'éviter la dégradation des ARN messager et des protéines puis la quantité d'ARN messager transcrits par le ou les gènes codant l'Apo A4 est mesurée. De manière particulièrement avantageuse la quantité d'ARN messager transcrits est mesurée par amplification suivant la méthode dite de Polymerase Chain Reaction (PCR) quantitative ou QPCR. Selon cette technique les ARN totaux sont extraits et purifiés et les ARN messager contenus dans l'extrait sont convertis dans un premier temps en ADNs complémentaires (ADNc), à l'aide d'une transcriptase inverse.

La polymérase préférentiellement utilisée dans la présente invention est la Taq polymérase, mais elle peut être toute autre enzyme présentant une activité polymérase et utilisable dans les conditions opératoires de la PCR. De part ses propriétés cet enzyme permet un doublement de la quantité d'ADN initial à chaque cycle de synthèse.

L'analyse des ADNc dérivés des ARNm contenus dans l'échantillon biologique est réalisée par PCR quantitative en temps réel. Les ADNc sont amplifiés à l'aide d'amorces et de sonde spécifiques de la séquence de l'Apo A4, selon un procédé qui comprend en substance une répétition du cycle comprenant les étapes suivantes : - séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADNc préparé à partir de l'échantillon, hybridation de la sonde et d'un couple d'amorces sens et anti-sens, et synthèse de brins d'ADN de novo par élongation avec une polymérase. Avantageusement les amorces sens et anti-sens comprennent au moins 15 nucléotides et présentent une identité d'au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et encore préférentiellement 95 % avec la séquence de l'Apo A4 humaine, correspondant à la séquence SEQ ID N 13 (Gene bank n NM 000482), ou avec sa séquence complémentaire. Au cours de la réaction d'amplification le produit de la réaction, ou amplimère, est détecté à l'aide d'une sonde, constituée d'un oligonucléotide comprenant au moins 15 nucléotides et présentant une identité d'au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et encore préférentiellement 95 % avec la séquence de l'Apo A4 humaine, correspondant à la séquence SEQ ID N 13 (Gene bank n NM 000482), ou avec sa séquence complémentaire.

Les deux amorces sont respectivement choisies sur les brins sens et antisens, et de manière à permettre l'amplification d'un fragment d'ADN. La sonde est quant à elle ciblée de manière à s'hybrider avec le fragment d'ADN résultant de l'amplification délimitée par la position des deux amorces. De manière avantageuse la sonde présente une température de fusion Tm théorique supérieure d'environ 10 C 0,5 aux Tm théoriques des amorces. Préférentiellement lesdits oligonucléotides (amorces et sonde) comprennent entre 15 et 25 nucléotides. Le procédé est mis en oeuvre durant un nombre de cycles suffisant pour permettre l'obtention d'une quantité mesurable de produit d'amplification (n=40).

Les amorces utilisées pour l'amplification du gène codant l'Apo A4 Humaine présentent préférentiellement les séquences SEQ ID N 1 : gcagctggctccctatgct et SEQ ID N 2 : ggaaggtcaggccctcaag. La sonde présente préférentiellement la séquence SEQ ID N 3 : cacgcaggagaagctcaaccacca. Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de la présente invention la sonde comporte une molécule ou un système de molécules révélateur. Ledit système révélateur est constitué de préférence par un colorant reporteur et un colorant extincteur de fluorescence, respectivement fixés aux extrémités 5' et 3' de la sonde. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux le système révélateur est constitué par la paire reporter / quencher représentée par la 6-carboxyfluorescéine (FAM) et la 6-carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) respectivement fixé en 5' et en 3' de la sonde. Pour mettre en oeuvre la PCR dans le cadre de la présente invention on peut se référer aux revues générales des techniques PCR et aux instructions des fabricants et distributeurs de réactifs et de thermocycleurs, et en particulier à la notice explicative intitulée Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection publiée par Perkin Elmer Applied Biosystems (1999) et au PCR Protocols (Academic Press New-York 1989). L'un des avantages de la méthode de détection par QPCR est que l'analyse des produits de PCR se fait directement à la fin des cycles de PCR par la lecture de la fluorescence obtenue au cours des cycles. II n'est donc pas nécessaire de travailler avec les produits de PCR qui sont à risque de contamination pour les analyses ultérieures. En outre la quantification du nombre de cibles mis au départ dans la réaction est très fiable et reproductible. La détection du produit de PCR se fait au cours des cycles PCR à l'aide d'une sonde fluorescente. Celle-ci est nécessaire pour détecter le produit de PCR et a lieu en pleine phase exponentielle de PCR et non en point final ; ce principe de détection est donc plus sensible et plus spécifique. Un autre avantage de la QPCR réside dans le fait que les amplifications non spécifiques sont évitées, grâce au principe du hot start , la PCR en temps réel étant réalisée en présence d'une ADN polymérase thermostable s'activant à la première dénaturation. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention la méthode selon la présente invention comprend la mesure de la quantité de protéine ou de fragments de la protéine Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés. De manière particulièrement avantageuse la quantité de protéine ou de fragments de la protéine Apo A4 est mesurée à l'aide d'au moins un anticorps spécifique de cette protéine. Ces anticorps peuvent être obtenus par une méthode consistant à injecter à des animaux, tels que des rongeurs, une émulsion de la protéine Apo A4 humaine purifiée ou une séquence peptidique de l'Apo A4 d'environ 20 acides aminés, éventuellement en présence d'un adjuvant tel que l'adjuvant de Freund. Les injections sont répétées et l'antisérum est récolté. La mesure de la liaison entre ces anticorps et l'Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés des individus chez lesquels on souhaite quantifier l'Apo A4 hépatique peut être effectuée par tout moyen adapté. Préférentiellement elle peut se faire par la technique ELISA (abréviation de Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) et encore plus préférentiellement par une méthode dite en Sandwich . La méthode dite en Sandwich fait appel à deux anticorps: un premier anticorps de capture est lié à un phase solide telle qu'une microplaque un deuxième anticorps de détection permet de quantifier la protéine. Selon cette technique les anticorps de détection sont couplés avec une peroxydase. Les anticorps liés à la protéine Apo A4 sont isolés des anticorps non-liés et mis en présence d'un substrat de la peroxydase, préférentiellement le dihydrochlorure de 0-phenylenediamine. La réaction colorimétrique permet de quantifier le nombre d'anticorps liés et de ce fait la quantité de protéine liée. Cette réaction colorimétrique est mesuré à l'aide d'un appareil adapté, par exemple par mesure de la densité optique. Une amplification de la réaction peut être effectuée en utilisant au moins deux anticorps, d'une part des anticorps anti-Apo A4 non couplés à la peroxydase et d'autre part des anticorps couplés à la peroxydase reconnaissant les premiers anticorps.

En outre un autre anticorps anti-Apo A4 peut être utilisé pour fixer les complexes anticorps-Apo A4 sur un support facilitant ainsi l'isolement des complexes et la séparation des anticorps non-fixés. La liaison entre ces anticorps et l'Apo A4 peut aussi être mesurée en utilisant des anticorps marqués par un isotope radioactif. Dans ce mode de mise en oeuvre les anticorps liés à la protéine Apo A4 sont isolés et la radioactivité des complexes anticorps-Apo A4 est mesurée à l'aide d'un appareil de mesure adapté à l'isotope utilisé. D'autres techniques que la technique ELISA et radioisotopique peuvent être mises en oeuvre pour le dosage de la protéine Apo A4 telle que la nephelométrie et la turbidimétrie. Pour l'obtention des anticorps et la mise en oeuvre des technique ELISA et radioisotopique notamment,on peut se reporter au manuel "Antibodies, A Laboratory Manual," (Cold Spring Harbor Press (1988)). La présente invention a en outre pour objet un procédé de criblage de composés destinés à la prévention ou au traitement de maladies hépatiques comprenant les étapes de : • mise en contact desdits composés avec un mammifère, et • mesure de l'expression de l'Apo A4 dans lesdites cellules d'origine hépatique ou dans les ou dans le sang et les dérivés du sang cellules dudit mammifère.

Le mammifère dans les cellules ou le sang duquel la mesure de l'expression de l'Apo A4 peut être effectuée est tout mammifère chez lequel l'Apo A4 est exprimée dans le foie. II peut être avantageusement un rongeur et préférentiellement une souris. Avantageusement on utilise des lignées d'animaux ayant une tendance naturelle à l'obésité. Ainsi une souris d'une lignée Balbc ByJ, DIO Balbc ByJ, DIO Balbc AnN ou DIO C57BI/6J est préférentiellement utilisée. La mesure de l'expression de l'Apo A4 peut être effectuée par la mesure de la quantité d'Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés dudit mammifère ou par la mesure de la quantité d'ARN messager transcrit par le ou les gènes codant l'Apo A4 exprimés dans les cellules ou tissus hépatiques dudit mammifère, comme indiqué ci-dessus.

La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples de mise en oeuvre qui suivent. Exemple 1 : Mesure de l'expression de l'Apo A4 chez des souris normales 5 (C57 B16) ou obèses (C57 B16iobob) par quantification des ARN messager transcrits et de la protéine Apo A4 plasmatique 1. Matériels et méthodes Protocole expérimental Le sang des souris normales (C57 B16) ou obèses (C57 B16/obob) a été prélevé 10 et centrifugé 10 mn à 10 000 rpm et le plasma a été prélevé. Un morceau de foie (75-130 mg) a été prélevé dans des tubes de 2 ml contenant 1,5 ml de RNA Later (Ambiom). Le foie et le plasma ont été conservés à -20 C pour en vue du dosage des ARNm et de la protéine Apo A4. 15 Analyse par QPCR en temps réel de l'expression de l'Apo A4 de Souris Cette technique en 2 étapes principales fait intervenir : 1. L'extraction et la purification des ARN totaux puis la conversion des ARNm contenus dans l'échantillon en ADN complémentaires (ADNc). 2. L'analyse des ADNc, réalisée par PCR quantitative en temps réel. Les 20 expressions relatives du gène sont données en % par rapport à un gène de référence interne invariant, comme la béta2-microglobuline ou l'ARN Ribosomal 18S. L'analyseur de séquence 7900HT Fast Real-Time PCR System et les réactifs pour l'amplification sont fournis par Applied Biosystems 25 Méthodes : Préparation des lysats tissulaires. 80 mg de foie de souris sont excisés et immédiatement plongés dans 2 ml de RNAlater afin de préserver au maximum l'intégrité de l'ARN avant toute manipulation. Le morceau de foie est transféré à sec dans un tube Eppendorf dans lequel sont ajoutés 2 ml de tampon de lyse (Kit d'extraction des ARNtotaux, RNeasy Midi Kit commercialisé par QIAGEN) et 2 billes en acier (diamètre, 3 mm). La lyse tissulaire est réalisée avec le Tissuelyser (commercialisé par QIAGEN) par agitation 5 min à 30HZ. A ce stade les lysats peuvent être conservés à -20 C. Extraction des ARN totaux.

Les lysats sont centrifugés 3 min à 14000xg et filtrés sur QlAshredder (commercialisé par QIAGEN) (3 x 0,7 ml). L'extraction suit le protocole du kit RNeasy Midi avec étape à la Dnase. L'étape finale est une élution de l'ARN total dans 150 pI d'eau. La concentration des ARN est obtenue par la mesure de la densité optique (DO) à 15 260 nm. Synthèse des ADN complémentaires (ADNc). A partir de 5 pg d'ARN total l'ADNc est synthétisé en utilisant le kit de réverse transcription Superscipt III (commercialisé par INVITROGEN). L'ADNc obtenu est récupéré dans 20 pI de volume final. 20 Analyse de l'expression des gènes par PCR sur le 7900HT. 5 pI d'une dilution d'ADNc sont additionnés de 15 pI de mélange réactionnel contenant en particulier : du tampon, de la polymérase nécessaires à la réaction de PCR ainsi que les amorces et sonde spécifiques du gène à quantifier. Ces derniers sont disponibles chez le fournisseur sous forme de Taqman Gene 25 Expression Assays. Le gène de la béta2-microglobuline (B2-m) ou l'ARN ribosomal 18S sont utilisés comme références internes. Les séquences des amorces et sondes utilisées pour l'amplification du gène codant l'Apo A4 et la Béta2-m humaines et de souris sont représentées dans le tableauVll (SEQ ID N 1 à SEQ ID N 12). 30 La réaction d'amplification génique est réalisée avec des cycles de température (dénaturation 95 C/15s puis hybridation et synthèse 60 C/1 min) dans des microplaques de 96 ou de 384 puits. La durée de l'analyse est de 90 min.

Les cinétiques d'amplification (signal d'amplification fonction du nombre de cycles) sont analysées dans une représentation linéaire de la phase exponentielle (logiciel: SDS Enterprise Database). Dans cette phase est défini le Ct, nombre de cycle mesuré à signal d'amplification constant, le Ct est inversement proportionnel à la quantité d'ARN messager présent dans l'échantillon d'origine. La différence de Ct (ACt) entre le gène cible (Apo A4) et la référence interne (B2-m) donne l'abondance relative à partir de la relation Q = (2)- c' (valeur données en % par rapport au gène de référence). Mesure de la quantité de Apo A4 dans le plasma chez la souris par méthode 10 ELISA sandwich Anticorps L'anticorps de capture est de l'anticorps de chèvre anti-Apo A4 commercialisé par (Santa Cruz Biotechnology, Inc.2145 Delaware Avenue Santa Cruz, California 95060 U.S.A.). 15 De l'anti serum dirigé contre l'Apo A4 de souris est obtenu à partir de lapins immunisés par un peptide correspondant à la séquence C-terminale (acide aminé 361-380) de l'Apo A4 de souris. Une émulsion de peptide couplé sur une protéine porteuse (KLH) dans de l'adjuvant de Freund's complet est injectée de manière subcutanée aux animaux. 20 Des injections ultérieures sont effectuées avec une émulsion de peptide couplé dans de l'adjuvant de Freund's incomplet. L'antisérum est récolté 10 jours après le troisième rappel et l'anticorps est purifié par chromatographie d'affinité sur le peptide couplé à un gel de chromatographie. Mise en oeuvre de la méthode ELISA sandwich 25 Dans les puits d'une plaque de 96 puits 100 pI d'anticorps de chèvre anti-Apo A4 à 4 pg/ml dans du PBS sont incubés durant 4 heures à 20 C. Après lavage par du PBS contenant 0,1 % de tween 20 les sites de liaisons non spécifiques sont bloqués avec du tampon PBS contenant 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA) durant 60 min à température ambiante. 30 100 pl d'échantillons de plasma (dilution dans du PBS contenant 0,1 % BSA de 1/3000 à 1/20000) sont ajoutés et incubés durant la nuit à 4 C. Après lavage 100 pl à 0,1 pg/ml d'anticorps polyclonaux de lapin anti-Apo A4 de souris sont ajoutés et incubés 1 h à température ambiante. Après lavage 100 pI de conjugués IgG anti lapin -péroxydase (PIERCE 1/200 dans du PBS contenant 0,1 % BSA) sont ajoutés et incubés 1 h à température ambiante. Après lavage 150 pI d'une solution contenant de l'O-phenylenediamine et du peroxyde d'hydrogène qui est le substrat de la peroxydase (Sigma) sont ajoutés.

Après 20 min 50 pI de H2SO4 3M sont ajoutés pour arrêter la réaction et la densité optique à 492 nm est mesurée. 2. Résultats : Le tableau IA montre la distribution tissulaire de l'Apo A4 chez la souris. L'Apo A4 est exprimée dans le muscle lisse, l'intestin grêle, le foie, le colon, le placenta, l'estomac, les ovaires, le rectum, les tissus adipeux

. On note une forte expression dans l'intestin grêle. Le tableau IB confirme forte expression dans l'intestin grêle et la localisation de l'Apo A4 dans les différentes régions (duodenum, jéjunum, ileum)...DTD: Le tableau li montre l'expression de l'Apo A4 dans le foie et le plasma et montre que cette expression est augmentée dans le foie et le plasma si l'on compare les souris normales et les souris obèses. Exemple 2: Mesure de l'expression de l'Apo A4 chez l'homme par quantification des ARN messager transcrits Les ADN c sont préparés à partir de foie humain et les mesures effectuées comme décrit dans l'exemple précédent pour la préparation à partir de foie de souris. Résultats de l'analyse par QPCR en temps réel de l'expression de l'Apo A4 Humaine Le tableau III montre la distribution tissulaire de l'Apo A4 chez l'homme : présence dans l'utérus fundus, l'oesophage, la rétine, le placenta, l'épididyme et les tissus adipeux. On note une forte expression dans l'intestin grêle, en accord avec les données de la littérature. Peu d'expression dans le foie total, mais celle ci semble concentrée sur la région hépatoportale.

Le tableau IV-A confirme les résultats sur la localisation de Apo A4 dans les régions de l'intestin grêle (jejunum, ileum, duodenum). Il ressort en outre que l'expression locale de l'Apo A4 dans le foie est plus liée à certaines états physiopathologiques (système porte hépatique) (tableau IV-B).

Ce résultat est confirmé dans les tableaux V-A & VI qui regroupent une analyse des Apo A4 sur différents échantillons de foies pathologiques et de foie normal. Les valeurs élevées sont corrélées pour les pathologies suivantes : cirrhose, lupus et infarctus. La spécificité de Apo A4 comme marqueur potentiel de ces affections est démontrée par l'analyse comparée de l'Apo A4 des autres classes d'apolipoproteines : Apo Al, Apo A2 et Apo A5 (tableaux IV et V-B). Exemple 3 : Mesure de la quantité de protéine Apo A4 dans le plasma chez l'homme par méthode ELISA sandwich Anticorps L'anticorps de capture est de l'anticorps de chèvre anti-Apo A4 commercialisé par (Santa Cruz Biotechnology, Inc.2145 Delaware Avenue Santa Cruz, California 95060 U.S.A.). De l'Apo A4 humaine purifiée est obtenue à partir de sérum humain comme décrit par Weinberg RB, Hopkins RA, Jones JB. (Methods Enzymol. 1996 ; 263:282-96.

Purification, isoform characterization, and quantitation of human apolipoprotein A4). De l'anti serum dirigé contre l'Apo A4 humaine est obtenu à partir de lapins. Une émulsion h-Apo A4 purifiée dans de l'adjuvant de Freund's complet est injectée de manière subcutanée aux animaux. Des injections ultérieures sont effectuées avec une émulsion d'Apo A4 purifiée dans de l'adjuvant de Freund's incomplet. L'antisérum est récolté 10 jours après le troisième rappel. Mise en oeuvre de la méthode ELISA sandwich Les puits d'une plaque de 96 puits sont incubés avec 100 pl d'anticorps de chèvre 30 anti-Apo A4 à 4 pg/ml dans du PBS durant 4 heures à 20 C.

Après lavage par du PBS contenant 0,1 % de tween 20 les sites de liaisons non spécifiques sont bloqués avec du tampon PBS contenant 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA) durant 60 min à température ambiante. 100 pI d'échantillons de plasma (dilution dans du PBS contenant 0,1 % BSA de 1/3000 à 1/20000) sont ajoutés et incubés durant la nuit à 4 C. Après lavage 100 pI d'anticorps sériques polyclonaux de lapin anti- Apo A4 humaine (dilution 1/5000 dans PBS SAB) sont ajoutés et incubés 1 h à température ambiante. Après lavage 100 pI de conjugués IgG anti lapin -péroxydase (PIERCE 1/200 dans du PBS contenant 0,1 % BSA) sont ajoutés et incubés 1 h à température ambiante.

Après lavage 150 pI d'une solution contenant de 1'0-phenylenediamine et du peroxyde d'hydrogène qui est le substrat de la peroxydase (Sigma) sont ajoutés. Après 20 min 50 pI de H2SO4 3M sont ajoutés pour arrêter la réaction et la densité optique à 492 nm est mesurée. 5 1015 TABLEAU IA : Expression de l'Apo A4 chez la souris (exprimées en % par rapport à la béta2-microglobuline) Tissus/organe apoA4 % Embryon 198 Muscle lisse 189 Intestin grêle 174 Foie 172 Colon 79 Placenta 75 Estomac 46 Ovaire 7.1 Rectum 2.1 Tissus adipeux 0.7 Cerveau 0.6 Testicules 0.3 Thymus 0.3 Rein 0.2 Rate 0.1 Vessie 0.1 Thyroide 0.1 Muscle squeletique 0.1 Moelle épinière 0.04 Ganglion lymphatique 0.03 Prostate 0.02 CE il 0.01 Poumon 0.004 Splénocytes 0.0001 Moelle osseuse 0 Coeur 0 20

TABLEAU IB : Expression de Apo A4 dans les réqions de l'intestin prêle (%/béta2-m, moyenne +/- écart type (4 animaux)) Région Apo A4 % Duodenum 213 +/- 19 Jejunum 209 +1- 101 Ileum 3 +1-1 TABLEAU II : Expression de l'ARNm de l'Apo A4 dans le foie et mesure de 15 l'Apo A4 dans le plasma de souris normales (C57 B16) ou obèses (C57 B16/obob). mRNA foie Apo A4 % expression/b2m SD Souris C57 B16 2 1 Obèses C57 B16/obob 224 68 Plasma Apo A4 (Unité arbitraires) Souris C57 B16 1 Obèses C57 B16/obob 5 10 20 10 15 20 15 Tableau III : Expression de Apo A4 humaine dans les tissus Tissus Apo A4 % Uterus fundus 1 Uterus corpus 0,03 Uterus 0 Amygdale 0,004 Esophage 1,2 Vésicule biliaire 0,01 Glande maxillaire 0 Veine 0,03 Artère 0,2 Sein 0,006 Pénis 0 Peau 0,03 Striatum cerveau 0 Larynx 0,01 Rétine 4 Gland mammaire Muscle lisse 0 Moelle épinière 0,8 Aorte 0,02 Poumon (polyA) 0,2 Placenta (polyA) 1 cerveau 0,1 Epididime (polyA) 1 Tissus adipeux (polyA) Clontech 3 Hepatoportal triad liver 4980 Foie lobe gauche 1 Foie lobe médian 0 Foie lobe droit 0 Foie 0,4 Testicules 0,2 Rectum 0,1 Artère carotique 0 Glande adrenale 0,01 Prostate 0,03 Tissus adipeux Biochain 0 Rate 0 Colon 0,02 Pancréas 0,01 Coeur 0,01 veine umbilicale 0 Estomac 0,05 Thymus 0,1 Col de l'utérus 0 Muscle squeletique 0 Trachée 0,002 Rein 0,005 Nodule lymphatique 0,2 Tumeur de l'ovaire 0 Péricarde 0,01 Ovaire 0 Vessie 0 Thyroïde 0,2 Moelle osseuse 0 Intestin grêle duodenum 0,3 Intestin grêle 100 TABLEAU IV A: Expression des apolipoprotéines dans l'intestin Tissus/organe Apo Apo A2 Apo A4 Apo A5 Al % % %/intestin 0% Intestin grêle 0,1 0,0001 100 0,0001 (nouveau) Intestin grêle 3,4 0,0004 1347 0,003 ileum Intestin grêle 3,5 0,001 1559 0,002 jejunum Intestin grêle 0,0002 0 0,05 0 duodenum Tableau IV B : Résultats regroupés pour le foie Apo Al Apo A2 Apo A4 Apo A5 Antécédents Raisons de Age % % %/intestin % médicaux la mort Système porte 2,3 3 0,2 0,5 Hypertension Infarctus 33 hépatique 12 aigu du myocarde Système porte 2 3,5 531 2 Emphysème Infarctus 69 hépatique 16 aigu du myocarde Lobe gauche 1,5 2 0,14 0,3 Hypertension Cardiomégal 71 foie 13 ie Lobe gauche 0,9 1,3 0,2 0,2 pas Infarctus 73 foie 17 d'antécédent aigu du myocarde Lobe médian 14 15 54 0,3 Attaque, Infarctus 48 foie 14 Hypertension aigu du myocarde Lobe médian 0,0005 0 0 0,0006 Hypertension Hypertrophie 61 foie 18 du ventricule gauche Lobe droit 0,0004 0 0 0,0001 Hypertension Hypertrophie 55 foie 15 du ventricule gauche Lobe droit 0,02 0,004 0 0, 002 Hypertension Syndrome 21 foie 19 de détresse respiratoire chez l'adulte Foie total 2,5 3 0,01 0,5 Tableau VA: Expression de Apo A4 humaine dans les échantillons de foie Echantillon Origine Diagnostic histologique Apo A4 % Foie Biochain normal 0,07 Lobe droit foie Biochain normal 0,2 Lobe gauche foie Biochain normal 0,8 Cirrhose du Foie Biochain Cirrhose 7,6 Lupus du foie Biochain Lupus 15,3 Foie fetal Biochain normal 0,8 Tumeur du Foie Biochain Carcinome 0,02 hépatocellulaire Intestin grêle Biochain Normal 100 Système porte hépatique Clinomics 05-22 Cirrhose 9,4 Lobe gauche foie Clinomics 05-23 Cirrhose 8,6 Lobe médian foie Clinomics 05-24 Cirrhose 12,7 Lobe droit foie Clinomics 05-25 Cirrhose 8,3 Tableau VB: Expression de Apo Al, 2 & 5 humaines dans les échantillons de foie. Echantillon Apo A1/18S % Apo A2/18s % Apo A5/18S % Foie 27 32 0,5 Lobe droit foie 15 22 0,6 Lobe gauche foie 20 34 0,8 Cirrhose du Foie 2 3 0,08 Lupus du Foie 9 11 1 Foie fétal 20 30 0,04 Tumeur du foie 0,5 22 0,1 Intestin grêle 0,5 0 0 Système porte hépatique 1 2 0,04 Lobe gauche foie 1 3 0,06 Lobe médian foie 0,8 1,5 0,05 Lobe droit foie 0,7 1,5 0,04 TableauVI : Expression de Apo A4 dans les échantillons Humains Echantillon Status Raisons de la mort Apo A4 % système porte Hypertension Infarctus aigu du 0,2 hépatique 12 myocarde Lobe gauche foie 13 Hypertension Cardiomégalie 0,14 Lobe médian foie 14 Attaque, Infarctus aigu du 54 Hypertension myocarde Lobe droit foie 15 Hypertension Hypertrophie du ventricule 0 gauche système porte Emphysème Infarctus aigu du 531 hépatique 16 myocarde Lobe gauche foie 17 Inconnu Infarctus aigu du 0,2 myocarde Lobe médian foie 18 Hypertension Hypertrophie du ventricule 0 gauche Lobe droit foie 19 Hypertension Syndrome de détresse 0 respiratoire chez l'adulte Foie total Normal 0,01-0,07 Lobe droit foie Normal 0,2 Lobe gauche foie Normal 0,2 _ Cirrhose 7,6 Foie Cirrhose Foie lupus Lupus 15 Foie fetal Normal 0, 8 tumeur du Foie Tumeur 0,02 système porte Cirrhose 9 hépatique 22 Lobe gauche foie 23 Cirrhose 9 Lobe médian foie 24 Cirrhose 13 Lobe droit foie 25 Cirrhose 8 Cerveau total Intestin grêle 1005 TABLEAU VII : Séquences des amorces et des sondes pour le dosage par PCR quantitative de la béta2-microqlobuline et de I'Apo A4 Humain et Souris. Amorce sens Amorce anti-sens Sonde 5' Fam-3' Gene bank 5'-3' 5'-3' Tamra Apo A4 humain SEQ ID N 1 SEQ ID N 2 SEQ ID N 3 NM_000482 gcagctggctcc ggaaggtcaggccctc cacgcaggagaag ctatgct aag ctcaaccacca Apo A4 souris SEQ ID N 4 SEQ ID N 5 SEQ ID N 6 NM_007468 gggtgcacaaca ccctctcagtttccttgg ccctttgtcgtacagct agctggt ctag gagtgggca Béta2-m humain SEQ ID N 7 SEQ ID N 8 SEQ ID N 9 NM_004048 gatgagtatgcct ggcatcttcaacctcca aaccatgtgactttgt gccgtgt tga cacag Béta2-m souris SEQ ID N 10 SEQ ID N 11 SEQ ID N 12 NM_009735 acgccacccacc ggcgggtggaactgtg tgggaagccgaaca gga tta tactgaactgctacg

Claims (13)

Revendications

1. Méthode de diagnostic ou de pronostic de maladie hépatique comprenant la mesure de l'expression de l'Apo A4 dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés.

2. Méthode selon la revendication 1 comprenant les étapes de : isolement du sang ou des ses dérivés et mesure de l'expression de l'Apo A4.

3. Méthode selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité d'ARN messagers transcrits parle ou les gènes codant l'Apo A4, exprimés dans les cellules ou tissus hépatiques.

4. Méthode selon la revendication 3 caractérisée en ce la quantité d'ARN messagers transcrits est mesurée par méthode PCR.

5. Méthode selon la revendication 4 caractérisée en ce la quantité d'ARN messagers transcrits est mesurée par méthode PCR quantitative.

6. Méthode selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés.

7. Méthode selon la revendication 6 caractérisée en ce que la quantité d'Apo A4 est mesurée à l'aide d'au moins un anticorps spécifique de cette protéine.

8. Méthode selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'anticorps spécifique est couplé avec une peroxydase ou est marqué par un isotope radioactif.

9. Méthode selon l'une des revendications 7 et 8 caractérisée en ce que la liaison de l'anticorps à la protéine est mesurée par la technique ELISA.

10. Procédé de criblage ou de détection de composés destinés à la prévention ou au traitement de maladies hépatiques comprenant les étapes de : - mise en contact desdits composés avec un mammifère et mesure de l'expression de l'Apo A4 dans les cellules d'origine hépatique ou dans le sang et les dérivés du sang dudit mammifère.

11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend la mesure de la quantité d'Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et les dérivés du sang dudit mammifère.

12. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend la mesure de la quantité d'ARN messagers transcrits par le ou les gènes codant21 l'Apo A4 exprimés dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et les dérivés du sang dudit mammifère.

13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12 caractérisé en ce que ledit mammifère est une souris de la lignée Balbc ByJ, DIO Balbc ByJ, DIO Balbc 5 AnN ou DIO C57BI/6J.