FR2891552A1 - New recombinant baculovirus, useful to produce glycoproteins, comprises first and second expression cassettes permitting protein expression in a host cell and comprising first and second promoters - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention est relative à des baculovirus recombinantsThe present invention relates to recombinant baculoviruses
permettant l'expression de plusieurs gènes hétérologues, et à leurs utilisations, notamment pour la production de protéines devant subir des allowing the expression of several heterologous genes, and their uses, in particular for the production of proteins to undergo
modifications post-traductionnelles (par exemple des glycoprotéines) ou la production de complexes protéiques. post-translational modifications (eg glycoproteins) or the production of protein complexes.
Parmi les systèmes d'expression eucaryotes, le système baculoviruscellules d'insectes est un des plus utilisés pour la production de protéines hétérologues. Sa mise en oeuvre est simple, rapide et peu coûteuse, et le taux de production de protéines est élevé. Among the eukaryotic expression systems, the baculoviruscellular insect system is one of the most used for the production of heterologous proteins. Its implementation is simple, fast and inexpensive, and the rate of protein production is high.
En général, les cellules d'insectes peuvent effectuer de manière satisfaisante une grande partie des modifications post-traductionnelles rencontrées dans les protéines de vertébrés. Toutefois, il existe des exceptions. A titre d'exemples, on citera la C-amidation, la ycarboxylation, et la N-glycosylation. Notamment, la N- glycosylation, qui est incomplète dans les cellules d'insectes, ne permet pas d'aboutir aux structures glycanniques de type complexe rencontrées dans un grand nombre des glycoprotéines de vertébrés (ALTMANN et al., Glycoconjugate J. 16: 109-123, 1999; MARCHAL et al., Glycobiol. 9(7) : 645-654, 1999; RESTELLI et BUTLER, Cell Engineering, vol.3: glycosylation, Kluwer Academic Publishers: 61-92, 2002). In general, insect cells can satisfactorily perform much of the post-translational modifications encountered in vertebrate proteins. However, there are exceptions. Examples include C-amidation, ycarboxylation, and N-glycosylation. In particular, N-glycosylation, which is incomplete in insect cells, does not make it possible to produce the complex type of glycan structures found in a large number of vertebrate glycoproteins (ALTMANN et al., Glycoconjugate J. 16: 109 -123, 1999; MARCHAL et al., Glycobiol., 9 (7): 645-654, 1999. RESTELLI and BUTLER, Cell Engineering, Vol.3: Glycosylation, Kluwer Academic Publishers: 61-92, 2002).
La synthèse du précurseur Glc3Man9GlcNAc2-P-PDol, le transfert en bloc sur la protéine naissante, et les premières étapes de maturation dans le réticulum endoplasmique, qui sont conservées dans toutes les cellules eucaryotes, ont lieu normalement dans les cellules d'insectes. Cependant, l'élongation des chaînes sucrées s'arrête au stade tri-mannose (Man3GlcNAc2Fuc), produisant des structures oligosaccharidiques dépourvues du galactose et de l'acide sialique habituellement présents à l'extrémité des structures glycannique de type complexe. The synthesis of the precursor Glc3Man9GlcNAc2-P-PDol, the bulk transfer on the nascent protein, and the first stages of maturation in the endoplasmic reticulum, which are conserved in all eukaryotic cells, take place normally in the insect cells. However, the elongation of the sugar chains stops at the tri-mannose stage (Man3GlcNAc2Fuc), producing oligosaccharide structures devoid of galactose and sialic acid usually present at the end of complex-type glycan structures.
Cette structure écourtée a été attribuée à l'absence ou la déficience des glycosyltransférases (galactosyltransférase, Nacétylglucosaminyltransférase et sialyltransférase) impliquées dans le greffage de ces sucres (ALTMANN et al., 1999, précité ; MARCHAL et al., 1999, précité ; RESTELLI et BUTLER, 2002, précité), ainsi qu'à l'hydrolyse de la forme GlcNAcMan3GlcNAc2Fuc par une N- acétylglucosaminidase présente dans un compartiment tardif de la voie de sécrétion chez certaines lignées de cellules d'insectes (ALTMANN et al., J. Biol. Chem. 270(29) : 17344-17349, 1995b). This shortened structure has been attributed to the absence or deficiency of the glycosyltransferases (galactosyltransferase, Nacetylglucosaminyltransferase and sialyltransferase) involved in the grafting of these sugars (ALTMANN et al., 1999, aforementioned MARCHAL et al., 1999, RESTELLI et al. BUTLER, 2002, cited above), as well as the hydrolysis of the GlcNAcMan3GlcNAc2Fuc form by N-acetylglucosaminidase present in a late compartment of the secretory pathway in certain insect cell lines (ALTMANN et al., J. Biol Chem 270 (29): 17344-17349, 1995b).
Cette N-glycosylation incomplète constitue une limitation à l'utilisation du système baculovirus-cellules d'insectes pour la production de certaines glycoprotéines, qui ne sont pleinement fonctionnelles que si elles comportent des N-glycannes de type complexe. Notamment, lorsqu'il s'agit de glycoprotéines destinées à un usage thérapeutique, l'absence de N-glycannes de type complexe risque de diminuer leur efficacité, voire d'induire des réponses immunitaires indésirables lors de leur utilisation. This incomplete N-glycosylation constitutes a limitation to the use of the baculovirus-insect cell system for the production of certain glycoproteins, which are only fully functional if they comprise N-glycans of the complex type. In particular, when it comes to glycoproteins intended for therapeutic use, the absence of complex N-glycans may reduce their effectiveness, or even induce undesirable immune responses during their use.
Pour améliorer la N-glycosylation dans les cellules d'insecte, il a été proposé d'exprimer dans celles-ci les glycosyltransférases manquantes ou déficientes. To improve N-glycosylation in insect cells, it has been proposed to express therein the missing or deficient glycosyltransferases.
Le Brevet US 6,461,863 propose ainsi différentes constructions pour transformer des cellules d'insecte afin d'améliorer la N-glycosylation de protéines d'intérêt. Le principe de ces constructions est d'exprimer les enzymes intervenant dans la N-glycosylation sous contrôle d'un promoteur précoce de baculovirus, et d'exprimer la protéine d'intérêt à glycosyler sous contrôle d'un promoteur tardif de baculovirus. US Pat. No. 6,461,863 thus proposes different constructs for transforming insect cells in order to improve the N-glycosylation of proteins of interest. The principle of these constructs is to express the enzymes involved in N-glycosylation under the control of an early baculovirus promoter, and to express the protein of interest to be glycosylated under the control of a late baculovirus promoter.
Le Brevet US 6,461,863 propose deux approches possibles pour exprimer les gènes de glycosyltransférases 30 dans les cellules transformées: l'expression transitoire: des gènes de glycosyltransférases, et notamment un gène de galactosyltransférase et un gène de sialyltransférase, placés chacun sous contrôle d'une copie du promoteur précoce de la protéine IE1, sont insérés dans un baculovirus, et exprimés lors de l'infection de la cellule hôte par celui-ci. Le gène de la protéine d'intérêt à glycosyler est placé sous contrôle du promoteur de la polyédrine ou de la protéine P10, soit dans le même baculovirus, soit dans un baculovirus différent; dans ce dernier cas, les deux baculovirus sont utilisés pour co-infecter les cellules-hôtes. US Pat. No. 6,461,863 proposes two possible approaches for expressing the glycosyltransferase genes in transformed cells: transient expression: glycosyltransferase genes, and in particular a galactosyltransferase gene and a sialyltransferase gene, each placed under control of a copy of the early promoter of the IE1 protein, are inserted into a baculovirus, and expressed during infection of the host cell with it. The gene of the protein of interest to be glycosylated is placed under the control of the polyhedrin promoter or of the P10 protein, either in the same baculovirus or in a different baculovirus; in the latter case, both baculoviruses are used to co-infect the host cells.
l'expression stable: les gènes de glycosyltransférases, placés sous contrôle de copies du promoteur d'IEl, sont insérés dans l'ADN cellulaire, pour produire des lignées de cellules d'insectes transgéniques exprimant les glycosyltransférases. Ces lignées peuvent ensuite être utilisées comme cellules-hôtes pour des baculovirus recombinants exprimant le gène de la protéine d'intérêt à glycosyler, sous contrôle du promoteur de la polyédrine ou de celui de la protéine P10. stable expression: the glycosyltransferase genes, under control of copies of the IE1 promoter, are inserted into the cellular DNA, to produce transgenic insect cell lines expressing the glycosyltransferases. These lines can then be used as host cells for recombinant baculoviruses expressing the gene of the protein of interest to be glycosylated, under the control of the polyhedrin promoter or that of the P10 protein.
Plusieurs publications décrivent des lignées de cellules d'insectes obtenues par cette deuxième approche: HOLLISTER et al.(Glycobiol. 8(5) : 473-880, 1998), et JARVIS et al. (Cur. Opin. Biotech. 9(5) : 528-533, 1998b) décrivent ainsi une lignée cellulaire dérivée de la lignée Sf9, dont le génome contient plusieurs copies d'une cassette d'expression contenant le gène de la (31.4 galactosyltransférase bovine sous contrôle du promoteur pIEl. AUMILLER et al. (Glycobiol. 13(6) . 497-507, 2003) décrivent une lignée cellulaire dérivée de Sf9, dans laquelle sont exprimées l'ensemble des enzymes nécessaires à l'obtention d'une glycoprotéine recombinante sialylée. Several publications describe insect cell lines obtained by this second approach: HOLLISTER et al (Glycobiol., 8 (5): 473-880, 1998), and JARVIS et al. (Cur., Opin. Biotech, 9 (5): 528-533, 1998b) thus describe a cell line derived from the Sf9 line, the genome of which contains several copies of an expression cassette containing the (31.4 galactosyltransferase) gene. bovine under the control of the pIE1 promoter AUMILLER et al (Glycobiol 13 (6), 497-507, 2003) describe a cell line derived from Sf9, in which are expressed all the enzymes necessary to obtain a protein. recombinant sialylated glycoprotein.
En revanche, l'utilisation de baculovirus recombinants exprimant plusieurs gènes de glycosyltransférases a rencontré moins de succès, bien que cette approche soit plus flexible, et permette de s'affranchir de la nécessité d'utiliser des cellules hôtes transgéniques. CHANG et al. (J. Biotech. 102: 61-71, 2003) décrivent un baculovirus multirecombinant exprimant trois glycosyltransférases de mammifère, à savoir la G1cNAc transférase II, la (31.4 galactosyltransferase), et l'a2,6- sialyltransferase (a26ST), et une glycoprotéine, l'al- antitrypsine. Ces quatre gènes sont exprimés dans le vecteur pAcAB4 (BELYAEV et ROY, Nucleic Acids Res. 21: 1219-1223, 1993), qui contient 2 copies du promoteur de la polyédrine et 2 copies du promoteur de la P10. Ce baculovirus multirecombinant a permis d'obtenir une N-glycosylation correcte de l'al-antitrypsine uniquement dans les cellules d'une lignée particulière, la lignée Ea4, dérivée de Estigmena acrea, qui possède intrinsèquement une capacité de glycosylation plus complète que les lignées de cellules d'insectes classiques telles que Sf9 (OGONAH et al., Bio/Technol. 14: 197-202, 1996). In contrast, the use of recombinant baculoviruses expressing several glycosyltransferase genes has been less successful, although this approach is more flexible, and avoids the need to use transgenic host cells. CHANG et al. (J. Biotech 102: 61-71, 2003) describe a multirecombinant baculovirus expressing three mammalian glycosyltransferases, namely G1cNAc transferase II, (31.4 galactosyltransferase), and α2,6-sialyltransferase (a26ST), and glycoprotein, antitrypsin. These four genes are expressed in the pAcAB4 vector (BELYAEV and ROY, Nucleic Acids Res 21: 1219-1223, 1993), which contains 2 copies of the polyhedrin promoter and 2 copies of the P10 promoter. This multirecombinant baculovirus produced a correct N-glycosylation of al-antitrypsin only in the cells of a particular line, the Ea4 line, derived from Estigmena acrea, which inherently possesses a more complete glycosylation capacity than the lines. conventional insect cells such as Sf9 (OGONAH et al., Bio / Technol 14: 197-202, 1996).
Outre la production de protéines glycosylées, il a été proposé d'utiliser des baculovirus multi-recombinants pour produire conjointement des protéines participant à un complexe protéique. On citera par exemple l'expression de protéines constitutives du virus du Bluetongue (ROY et a1, Gene. 29, 119-129, 1997) ou celle de protéines constitutives des ARN polymérases cellulaires (ACKER et al., J Biol Chem. 272, 16815-21, 1997, ou KIMURA et ISHIHAMA, Nucleic Acids Res. 28, 952-959, 2000). In addition to the production of glycosylated proteins, it has been proposed to use multi-recombinant baculoviruses to jointly produce proteins involved in a protein complex. For example, the expression of proteins constituting Bluetongue virus (ROY et al., Gene 29, 119-129, 1997) or that of proteins constituting cellular RNA polymerases (ACKER et al., J. Biol Chem. 16815-21, 1997, or KIMURA and ISHIHAMA, Nucleic Acids Res 28, 952-959, 2000).
Une des principales limitations à l'usage de baculovirus multirecombinants pour exprimer conjointement un ensemble de protéines provient du nombre relativement faible de promoteurs de baculovirus, convenant à l'expression de gènes hétérologues, qui sont disponibles. Pour y pallier, on utilise généralement plusieurs copies d'un même promoteur. Toutefois, ceci entraîne des risques d'instabilité du baculovirus multirecombinant. Diverses stratégies ont été proposées pour remédier à cette instabilité, par exemple la disposition tête-bêche des copies d'un même promoteur. Cependant ces solutions ne sont pas totalement efficaces, et paraissent même, dans certains cas, augmenter l'instabilité du baculovirus recombinant. One of the major limitations to the use of multirecombinant baculoviruses to co-express a set of proteins is the relatively low number of baculovirus promoters suitable for the expression of heterologous genes that are available. To overcome this, we generally use several copies of the same promoter. However, this entails risks of instability of multirecombinant baculovirus. Various strategies have been proposed to address this instability, such as the up-and-down arrangement of copies of the same promoter. However, these solutions are not totally effective, and even appear, in some cases, to increase the instability of the recombinant baculovirus.
Les Inventeurs ont maintenant entrepris d'obtenir des baculovirus recombinants, utilisables pour produire conjointement plusieurs protéines d'intérêt. Ils ont choisi comme modèle la production de protéines Nglycosylées, en exprimant des glycosyltransférases qui participent à la Nglycosylation. The inventors have now undertaken to obtain recombinant baculoviruses that can be used to jointly produce several proteins of interest. They chose as a model the production of Nglycosylated proteins, expressing glycosyltransferases that participate in Nglycosylation.
Pour contrôler l'expression de ces glycosyltransférases, les Inventeurs ont choisi d'utiliser, au lieu de copies d'un même promoteur de baculovirus, un promoteur différent pour chaque enzyme, qui ne soit ni un promoteur endogène du baculovirus d'origine, dans lequel sont insérées les cassettes d'expression desdites enzymes, ni un promoteur endogène de la cellule choisie comme cellule-hôte, et qui soit reconnu par l'ARN polymérase cellulaire de type II, afin que les glycosyltransférases soient exprimées sous contrôle de ces promoteurs à un stade précoce de l'infection virale. Ceci permet à ces glycosyltransférases d'être déjà présentes dans l'environnement cellulaire au moment de l'expression de la protéine à glycosyler, dont le gène est placé sous contrôle d'un promoteur tardif fort. To control the expression of these glycosyltransferases, the inventors have chosen to use, instead of copies of the same baculovirus promoter, a different promoter for each enzyme, which is neither an endogenous promoter of the baculovirus of origin, in which are inserted the expression cassettes of said enzymes, nor an endogenous promoter of the cell chosen as a host cell, and which is recognized by the type II cellular RNA polymerase, so that the glycosyltransferases are expressed under the control of these promoters to an early stage of the viral infection. This allows these glycosyltransferases to be already present in the cellular environment at the time of expression of the glycosylated protein, whose gene is placed under the control of a strong late promoter.
La présente invention a pour objet un baculovirus recombinant résultant de l'insertion dans un baculovirus d'origine de cassettes d'expression permettant l'expression de protéines dans une cellule-hôte, caractérisé en ce qu'il comprend au moins; - une première cassette d'expression, comprenant un premier promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, et reconnu par l'ARN polymérase I I de la cellule hôte; une seconde cassette d'expression, comprenant un second promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent du premier promoteur. The present invention relates to a recombinant baculovirus resulting from the insertion into baculovirus of origin of expression cassettes for the expression of proteins in a host cell, characterized in that it comprises at least; a first expression cassette, comprising a first promoter, other than an endogenous baculovirus origin promoter or an endogenous promoter of the host cell, and recognized by the host cell RNA polymerase I I; a second expression cassette, comprising a second promoter, other than a native baculovirus endogenous promoter or an endogenous promoter of the host cell, recognized by the RNA polymerase II of the host cell, and different from the first promoter.
Selon un mode de réalisation préféré d'un baculovirus recombinant conforme à l'invention, il comprend en outre: - une troisième cassette d'expression, comprenant un troisième promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, et reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent du premier et du second promoteur; Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit baculovirus recombinant comprend en outre. According to a preferred embodiment of a recombinant baculovirus according to the invention, it further comprises: a third expression cassette, comprising a third promoter, other than an endogenous origin baculovirus promoter or an endogenous promoter of the host cell, and recognized by the RNA polymerase II of the host cell, and different from the first and second promoters; According to a preferred arrangement of this embodiment, said recombinant baculovirus further comprises.
- une quatrième cassette d'expression, comprenant un quatrième promoteur, autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent du premier, du second et du troisième promoteur. a fourth expression cassette, comprising a fourth promoter, other than an endogenous origin baculovirus promoter or an endogenous promoter of the host cell, recognized by the RNA polymerase II of the host cell, and different from the first, second and third promoters.
Avantageusement, ledit baculovirus recombinant peut comprendre en outre une cinquième, voire une sixième, et le cas échéant une septième cassette d'expression, chacune d'entre elle comprenant un promoteur autre qu'un promoteur endogène du baculovirus d'origine ou un promoteur endogène de la cellule hôte, reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, et différent des promoteurs des autres cassettes d'expression. Advantageously, said recombinant baculovirus may further comprise a fifth or even a sixth, and optionally a seventh expression cassette, each of which comprises a promoter other than an endogenous promoter of the original baculovirus or an endogenous promoter. of the host cell, recognized by the RNA polymerase II of the host cell, and different from the promoters of the other expression cassettes.
La cellule-hôte peut être une cellule d'insecte, ou, le cas échéant, toute cellule animale permissive pour l'infection par un baculovirus, par exemple celles mentionnées dans l'article de revue de KOST et CONDREAY Trends in Biotechnology, 20: 173-180 (2002), ou dans la publication de CHENG et al., World J. Gastroenterol, 10: 1612-1618 (2004). The host cell may be an insect cell, or, where appropriate, any animal cell permissive for baculovirus infection, for example those mentioned in the review article of KOST and CONDREAY Trends in Biotechnology, 20: 173-180 (2002), or in CHENG et al., World J. Gastroenterol, 10: 1612-1618 (2004).
Comme indiqué ci-dessus, des promoteurs utilisables pour la construction des cassettes d'expression contenues dans les baculovirus conformes à l'invention peuvent être choisis parmi tous les promoteurs, reconnus par l'ARN polymérase II de la cellule hôte, autres que les promoteurs endogènes du baculovirus d'origine et les promoteurs endogènes de la cellule hôte. As indicated above, promoters that can be used for constructing the expression cassettes contained in the baculoviruses according to the invention can be chosen from all the promoters recognized by the host cell RNA polymerase II, other than the promoters. endogenous baculoviruses and endogenous promoters of the host cell.
Il peut s'agir en particulier de promoteurs d'autres espèces que celle dont est issue la cellule hôte, ou bien de promoteurs précoces de virus capables d'infecter la cellule-hôte, par exemple, dans le cas d'une cellule d'insecte, de promoteurs de baculovirus (d'une espèce différente de celle du baculovirus d'origine), les densovirus, les iridovirus, les polydnavirus ou les entomopoxvirus. It may be in particular promoters of other species than that from which the host cell is derived, or early promoters of viruses capable of infecting the host cell, for example, in the case of a cell of insect, baculovirus promoters (of a species different from that of the original baculovirus), densoviruses, iridoviruses, polydnaviruses or entomopoxviruses.
A titre d'exemples non-limitatifs, pour la construction de cassettes d'expression destinées à être insérées dans le baculovirus AcMNPV, pour être exprimées dans des cellules de Spodoptera frugiperda, on peut utiliser le promoteur gp67 du baculovirus d'Orgyia pseudotsugata (BLISSARD et al, Virol. 170(2) : 537-555, 1989; HILL et al, J. Gen. Virol. 75: 1811-1813, 1994), le promoteur du gène codant l'actine 3 de Bombyx mari (MOUNIER et al., Insect Biochem. 21: 293-301, 1991), le promoteur P9 du densovirus de Junonia caenia, (DUMAS et al., Virol. 191: 202-222, 1992) , le promoteur IEl de CfMNPV (baculovirus de Choristoneura fumiferana), ou de tout baculovirus autre qu'AcMNPV. By way of non-limiting examples, for the construction of expression cassettes intended to be inserted into the baculovirus AcMNPV, to be expressed in Spodoptera frugiperda cells, the gp67 promoter of the Orgyia pseudotsugata baculovirus (BLISSARD) can be used. et al., Virol, 170 (2): 537-555, 1989, HILL et al., J. Gen. Virol 75: 1811-1813, 1994), the promoter of the gene encoding actin 3 from Bombyx husband (MOUNIER et al. al., Insect Biochem 21: 293-301, 1991), the P9 promoter of Junonia caenia densovirus (DUMAS et al., Virol., 191: 202-222, 1992), the IE1 promoter of CfMNPV (Choristoneura baculovirus). fumiferana), or any baculovirus other than AcMNPV.
Avantageusement, lesdites cassettes d'expression sont dispersées dans le génome du baculovirus, chacune desdites cassettes étant positionnée dans une région différente du génome viral, au lieu d'être groupées dans une ou deux régions du génome du baculovirus, comme dans le cas des baculovirus construits dans l'art antérieur. Advantageously, said expression cassettes are dispersed in the baculovirus genome, each of said cassettes being positioned in a different region of the viral genome, instead of being grouped in one or two regions of the baculovirus genome, as in the case of baculoviruses. constructed in the prior art.
Les Inventeurs ont choisi des régions du génome viral, contenant des gènes non indispensables à la réplication du virus en culture cellulaire, de façon à cloner à leur place les gènes de chacune des glycosyltransférases. The inventors have chosen regions of the viral genome, containing non-essential genes for the replication of the virus in cell culture, so as to clone the genes of each of the glycosyltransferases in their place.
A titre d'exemples non-limitatifs de ces gènes non indispensables, on peut citer par exemple: le gène de l'EGT (Ecdysteroïde UDPglycosyltransferase) (O'REILLY et al., Science 245: 1110-1112, 1989), la région "chitinasecatepsine" (HAWTIN et al., Virol. 238: 243-253, 1997), la région codant pour la protéine pp34 (ZUIDEMA et al., Virol. 173(1) : 98-108, 1989), la région codant pour la protéine Pif 1 (GUTTIERREZ et al., J. Gen. Virol. 85: 331-341, 2004), le gène de la gp37 (JIANGUO et al., J. Gen. Virol. 70: 2449-2459, 1989), le gène He65 (MILLER, Plenum Press, New York, 1997). By way of nonlimiting examples of these non-essential genes, there may be mentioned, for example: the gene for EGT (Ecdysteroid UDPglycosyltransferase) (O'REILLY et al., Science 245: 1110-1112, 1989), the region "chitinasecatepsin" (HAWTIN et al., Virol., 238: 243-253, 1997), the region encoding the pp34 protein (ZUIDEMA et al., Virol., 173 (1): 98-108, 1989), the coding region for the Pif 1 protein (GUTTIERREZ et al., J. Gen. Virol 85: 331-341, 2004), the gp37 gene (JIANGUO et al., J. Gen. Virol 70: 2449-2459, 1989 ), the He65 gene (MILLER, Plenum Press, New York, 1997).
Si l'on souhaite exprimer, dans une même cellule-hôte, différentes protéines à des moments différents, (par exemple, si l'on souhaite exprimer des enzymes intervenant dans la glycosylation, préalablement à la protéine d'intérêt à glycosyler) on peut utiliser un baculovirus conforme à l'invention exprimant les protéines dont on souhaite obtenir l'expression précocément en association avec un autre baculovirus exprimant la ou les protéine(s) dont on souhaite obtenir l'expression plus tardivement. If it is desired to express, in the same host cell, different proteins at different times (for example, if it is desired to express enzymes involved in glycosylation, prior to the protein of interest to be glycosylated), using a baculovirus according to the invention expressing the proteins whose expression is desired to be obtained early in association with another baculovirus expressing the protein (s) whose expression is to be obtained later.
Avantageusement, on peut aussi exprimer la ou les protéine(s) dont on souhaite obtenir l'expression plus tardivement dans un baculovirus conforme à l'invention. Dans ce cas celui-ci comprend en outre, pour l'expression de la(les)dite(s) protéine(s) d'intérêt, une ou plusieurs cassettes d'expression comprenant chacune un autre promoteur tardif fort de baculovirus, lesdits promoteurs étant avantageusement différents entre eux. Advantageously, one can also express the protein (s) whose expression one wishes to obtain later in a baculovirus according to the invention. In this case, it also comprises, for the expression of the said protein (s) of interest, one or more expression cassettes each comprising another late strong baculovirus promoter, said promoters being advantageously different from each other.
Ces promoteurs tardifs forts peuvent être par exemple le promoteur de la polyédrine, le promoteur de la protéine p10, ou des promoteurs synthétiques ou recombinants, tels que, par exemple le promoteur synthétique décrit par WANG et al, (Gene 100: 131-137, 1991) ou le promoteur Syn décrit dans la Demande PCT WO/9520672. These strong late promoters may be, for example, the polyhedrin promoter, the p10 protein promoter, or synthetic or recombinant promoters, such as, for example, the synthetic promoter described by WANG et al (Gene 100: 131-137, 1991) or the Syn promoter described in PCT Application WO / 9520672.
Les baculovirus conformes à l'invention peuvent être utilisés, par exemple pour la production conjointe de protéines impliquées dans une même voie enzymatique, par exemple de protéines impliquées dans un même ensemble de modifications post-traductionnelles ou posttranscriptionnelles, ou bien pour la production conjointe de sous- unités d'un même complexe protéique. The baculoviruses according to the invention can be used, for example for the joint production of proteins involved in the same enzymatic pathway, for example proteins involved in the same set of post-translational or posttranscriptional modifications, or for the joint production of subunits of the same protein complex.
A titre d'illustration, des baculovirus recombinants conformes à l'invention, utilisables pour la production de protéines recombinantes glycosylées peuvent comprendre. By way of illustration, recombinant baculoviruses in accordance with the invention that can be used for the production of glycosylated recombinant proteins may comprise.
des cassettes d'expression de glycosyltransférases, chacune sous contrôle d'un promoteur reconnu par l'ARN polymérase II de la cellule hôte: par exemple un baculovirus conforme à l'invention peut comprendre une cassette exprimant une (31-4 galactosyltransférase, une cassette exprimant une Nacétylglucosaminyltransférase I, une cassette exprimant une N-acétylglucosaminyltransférase II; - le cas échéant une ou plusieurs cassettes d'expression de la protéine à glycosyler, chacune sous contrôle d'un promoteur tardif fort. Par exemple, si la protéine à glycosyler est un anticorps, l'une des chaînes peut être exprimée sous contrôle du promoteur de la protéine plO, et l'autre sous contrôle du promoteur de la polyédrine. expression cassettes of glycosyltransferases, each under control of a promoter recognized by the RNA polymerase II of the host cell: for example a baculovirus according to the invention may comprise a cassette expressing a (31-4 galactosyltransferase, a cassette expressing a Nacetylglucosaminyltransferase I, a cassette expressing an N-acetylglucosaminyltransferase II, where appropriate one or more expression cassettes of the glycosylated protein, each under the control of a strong late promoter, for example, if the protein to be glycosylated is an antibody, one of the chains may be expressed under the control of the p10 protein promoter, and the other under the control of the polyhedrin promoter.
La présente invention a également pour objet des cellules-hôtes, infectées par un baculovirus recombinant conforme à l'invention. The subject of the present invention is also host cells, infected with a recombinant baculovirus according to the invention.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, on peut utiliser les outils classiques de clonage et d'expression de gènes d'intérêt les baculovirus, tels que ceux décrits par exemple dans BACULOVIRUS EXPRESSION 10 VECTORS: A LABORATORY MANUAL (O'REILLY et al., Freeman and Cie, New York, 1994), ainsi que dans un grand nombre de Brevets ou Demandes de Brevets, tels que, par exemple, la Demande EP 0 651 815, la Demande EP 0 638 647 ou la Demande PCT WO 95/20672. For carrying out the present invention, the conventional tools for cloning and expressing genes of interest for baculoviruses, such as those described for example in BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (O'REILLY et al. al., Freeman and Co., New York, 1994), as well as in a large number of patents or patent applications, such as, for example, EP Application 0 651 815, EP Application 0 638 647 or PCT Application WO 95/20672.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de construction de baculovirus conformes à l'invention et d'utilisation de ces baculovirus pour l'expression de glycoprotéines fonctionnelles. The present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to non-limiting examples of baculovirus construction in accordance with the invention and of the use of these baculoviruses for the expression of functional glycoproteins. .
EXEMPLE 1: SCHEMA GENERAL DE CONSTRUCTION DES BACULOVIRUS MULTIRECOMBINANTS EXPRIMANT 3 GLYCOSYLTRANSFERASES DIFFERENTES: Materiel biologique utilisé : 25 Cellules d'insecte: La lignée cellulaire utilisée est la lignée Sf9 (ATCC CRL-1711) obtenue à partir des ovaires de larve du lépidoptère Spodoptera frugiperda. Elle est cultivée à 28 C dans du milieu TC100 (Life Technologies) complémenté de 5% 30 de sérum de veau foetal (Perbio). EXAMPLE 1: GENERAL CONSTRUCTION DIAGRAM OF MULTI-COMBINANT BACULOVIRUSES EXPRESSING 3 DIFFERENT GLYCOSYLTRANSFERASES: Biological material used: Insect cells: The cell line used is the Sf9 line (ATCC CRL-1711) obtained from the larval ova of the Lepidoptera Spodoptera frugiperda . It is cultured at 28 ° C. in TC100 medium (Life Technologies) supplemented with 5% fetal calf serum (Perbio).
Pour l'infection par les baculovirus, les cellules Sf9 en phase exponentielle de croissance sont infectées à une MOI (multiplicity of infection) de 5. Le milieu de culture est éliminé du tapis cellulaire et remplacé par l'inoculum viral. Celui-ci reste en contact avec les cellules pendant une heure, puis du milieu frais est ajouté. Les flacons sont incubés à 28 C pendant 3 à 5 jours. Pour récupérer les virus produits, la suspension cellulaire est centrifugée à 2000tr/min (Heraeus, Multifuge 3S-R) pendant 10 minutes et le surnageant viral est alors conservé à 4 C. For baculovirus infection, exponentially growing Sf9 cells are infected at a multiplicity of infection (MOI) of 5. The culture medium is removed from the cell layer and replaced with the virus inoculum. This remains in contact with the cells for one hour, then fresh medium is added. The flasks are incubated at 28 ° C. for 3 to 5 days. To recover the viruses produced, the cell suspension is centrifuged at 2000 rpm (Heraeus, Multifuge 3S-R) for 10 minutes and the viral supernatant is then stored at 4 C.
Virus.Virus.
Le baculovirus de départ choisi (dénommé Dsuf) est un baculovirus AcMNPV modifié par délétion du gène de la protéine P10 et de celui de la polyédrine (gène PH) remplacés respectivement par un site Sse8387I et un site Bsu36I. Ce baculovirus possède un phénotype OB- (ne forme pas de polyèdres dans les cellules infectées). The starting baculovirus chosen (called Dsuf) is an AcMNPV baculovirus modified by deletion of the P10 protein gene and that of the polyhedrin gene (PH gene) replaced respectively by a Sse8387I site and a Bsu36I site. This baculovirus has a phenotype OB- (does not form polyhedra in infected cells).
Les sites Sse8387I et Bsu36I permettent une linéarisation de l'ADN pour une transfection ciblée. Cette technique permet d'obtenir un taux de recombinants (c'est-à-dire ayant bien intégré le ou les gènes exogènes) supérieur à 98% en une seule étape de purification par plages de lyse. Sites Sse8387I and Bsu36I allow linearization of DNA for targeted transfection. This technique makes it possible to obtain a level of recombinants (that is to say having well integrated the exogenous gene (s)) greater than 98% in a single lysis plaque purification step.
Les régions du génome d'AcMNPV auxquelles il sera fait référence dans les exemples plus détaillés qui suivent se réfèrent à la carte du clone C6, séquencé par AYRES et al. (Virology, 202, 586-605, 1994). The regions of the AcMNPV genome to which reference will be made in the more detailed examples which follow refer to the map of clone C6, sequenced by AYRES et al. (Virology, 202, 586-605, 1994).
Principe de construction des baculovirus recombinants Des régions du génome viral non essentielles à la réplication du baculovirus en culture cellulaire (et autres que les gènes de la protéine P10 et de la polyédrine) ont été identifiées. C'est au niveau de ces régions (gènes cibles) que seront insérés les gènes des glycosyltransférases. Principle of construction of recombinant baculoviruses Regions of the viral genome not essential for baculovirus replication in cell culture (and other than the P10 protein and polyhedrin genes) have been identified. It is at these regions (target genes) that the glycosyltransferase genes will be inserted.
Les glycosyltransférases ont été insérées l'une après l'autre dans le génome du baculovirus. Glycosyltransferases were inserted one after another into the baculovirus genome.
Pour chaque glycotransférase le gène cible 30 choisi a été cloné dans un vecteur plasmidique bactérien pour obtenir un vecteur de transfert vide, destiné à recevoir une cassette d'expression, et permettant ensuite d'insérer, par recombinaison homologue, cette cassette d'expression dans le génome viral. For each glycotransferase the selected target gene was cloned into a bacterial plasmid vector to obtain an empty transfer vector, to receive an expression cassette, and then to insert, by homologous recombination, this expression cassette into the viral genome.
Dans un premier temps on insère dans le vecteur de transfert vide une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la polyédrine sous le contrôle de son promoteur endogène (cassette prPH-PH). L'intégration de cette cassette d'expression dans le génome du baculovirus Dsuf au niveau du gène cible produit un baculovirus intermédiaire possédant un phénotype OB+ facilement identifiable au microscope photonique par la présence de polyèdres dans les cellules infectées. In a first step, an expression cassette comprising the sequence coding for polyhedrin under the control of its endogenous promoter (prPH-PH cassette) is inserted into the empty transfer vector. The integration of this expression cassette into the Dsuf baculovirus genome at the target gene produces an intermediate baculovirus possessing an OB + phenotype easily identifiable by light microscopy by the presence of polyhedra in the infected cells.
Parallèlement, on construit une cassette d'expression contenant une séquence codant pour la glycosyltransférase que l'on souhaite insérer, sous contrôle du promoteur choisi. Cette cassette est ensuite insérée dans le vecteur de transfert vide. La recombinaison homologue entre le vecteur de transfert ainsi chargé et le génome du baculovirus intermédiaire entraine l'insertion de cette cassette à la place de la cassette prPH-PH. Le baculovirus recombinant ainsi obtenu a perdu le phénotype OB+ et peut ainsi être facilement identifié. In parallel, an expression cassette containing a sequence coding for the glycosyltransferase that one wishes to insert under the control of the chosen promoter is constructed. This cassette is then inserted into the empty transfer vector. Homologous recombination between the thus loaded transfer vector and the intermediate baculovirus genome results in the insertion of this cassette in place of the prPH-PH cassette. The recombinant baculovirus thus obtained has lost the OB + phenotype and can thus be easily identified.
EXEMPLE 2: CONSTRUCTION DES VECTEURS DE TRANSFERT VIDES Construction du vecteur de transfert pVT EGT. EXAMPLE 2: CONSTRUCTION OF EMPTY TRANSFER VECTORS Construction of the pVT EGT transfer vector.
L'EGT (Ecdysteroïde UDP-glycosyltransferase) est une enzyme de 60KDa qui glycosyle la 20-hydroxyecdysone (hormone de mue chez l'insecte) et la rend inactive (pour revue voir O'REILLY, Insect Biochem. Mol. Biol. 25(5) : 541-550, 1995). Le gène de l'EGT est transcrit très tôt au cours de l'infection. Une activité transférase est détectée dans les cellules infectées et le surnageant de culture dès 3 heures après infection (O'REILLY et al., J. Virol. 64(3) . 1321-1328, 1990). Il a été montré que ce gène n'est pas indispensable à la réplication du virus en culture cellulaire (O'REILLY et MILLER, Science 245: 1110-1112, 1989). Il peut donc être utilisé comme région d'insertion d'un gène étranger. EGT (Ecdysteroid UDP-glycosyltransferase) is a 60KDa enzyme that glycosylates 20-hydroxyecdysone (the moulting hormone in the insect) and renders it inactive (for review see O'REILLY, Insect Biochem, Mol Biol. 5): 541-550, 1995). The EGT gene is transcribed very early in the course of infection. Transferase activity was detected in the infected cells and the culture supernatant as early as 3 hours after infection (O'REILLY et al., J. Virol., 64 (3), 1321-1328, 1990). This gene has been shown not to be essential for virus replication in cell culture (O'REILLY and MILLER, Science 245: 1110-1112, 1989). It can therefore be used as insertion region of a foreign gene.
Le gène de l' EGT encadré des gènes lefl et Da26 est situé dans la région Pstl G d'AcMNPV. Le fragment Pstl-BamHI de 5000pb inclus dans la région Pstl G d'AcMNPV a été cloné dans un plasmide pUC19 (BIOLABS), pour donner le vecteur de transfert dénommé pVT EGT. Ce vecteur contient un site unique Xbal présent dans la séquence codante EGT. The EGT gene flanked by the lefl and Da26 genes is located in the PstI G region of AcMNPV. The 5000bp PstI-BamHI fragment included in the PstI G region of AcMNPV was cloned into a plasmid pUC19 (BIOLABS), to give the transfer vector called pVT EGT. This vector contains a unique XbaI site present in the EGT coding sequence.
Les étapes de la construction de ce vecteur sont schématisées sur la figure 1. The steps of the construction of this vector are shown schematically in FIG.
Construction du vecteur de transfert pVT KitKat Le virus AcMNPV possède dans la région charnière EcoRI E EcoRI H une ORF de 966 pb qui code pour une protéase à cystéine, la catepsine (Kat) (SLACK et al.,J. Construction of the pVT KitKat Transfer Vector The AcMNPV virus has in the EcoRI E EcoRI H hinge region a 966 bp ORF which encodes a cysteine protease, catepsin (Kat) (SLACK et al., J.
Gen. Virol. 76: 1091-1098, 1995) et une seconde de 1 654 pb qui code pour une chitinase (Kit) (HAWTIN et al., Virol. 212: 673-685, 1995) positionnée sur le brin complémentaire. Les ATG initiateurs des deux gènes sont distants de 48 nucléotides. Ces gènes ne sont pas indispensables à la réplication du virus en culture cellulaire (HAWTIN et al., Virol. 238:243-253, 1997) Le fragment BstXI-XbaI du plasmide pHC79 E+ H (plasmide contenant la région EcoRI E et H de AcMNPV) a été cloné en XbaI-EcoRV dans un plasmide (pBlue Script II SK M13(+) commercialisé par STRATAGENE), pour donner le vecteur pBS KitKat. Le site unique XbaI de pBS KitKat a été éliminé préalablement à la délétion d'un fragment EcoNI- EcoRI de 1 170 pb incluant les deux régions 5' codantes des gènes Kit et Kat. Le fragment délété a été remplacé par un oligonucléotide de synthèse (séquence du brin sens: 5'-TGAAGGCGAGTCTAGAACCTG-3' (SEQ ID NO: 1) ; séquence du brin antisens: 5'-AATTCAGGTTCTAGACTCGCCTTC-3' (SEQ ID NO: 2) contenant un site XbaI, pour donner le vecteur de transfert dénommé pVT KitKat. Gen. Virol. 76: 1091-1098, 1995) and a second of 1,654 bp that encodes a chitinase (Kit) (HAWTIN et al., Virol., 212: 673-685, 1995) positioned on the complementary strand. The ATG initiators of the two genes are 48 nucleotides apart. These genes are not essential for the replication of the virus in cell culture (HAWTIN et al., Virol 238: 243-253, 1997) The BstXI-XbaI fragment of the plasmid pHC79 E + H (plasmid containing the EcoRI E and H region). AcMNPV) was cloned into XbaI-EcoRV in a plasmid (pBlue Script II SK M13 (+) marketed by STRATAGENE), to give the vector pBS KitKat. The unique XbaI site of pBS KitKat was removed prior to the deletion of a 1,170 bp EcoRI-EcoRI fragment including the two 5 'coding regions of the Kit and Kat genes. The deleted fragment was replaced by a synthetic oligonucleotide (sense strand sequence: 5'-TGAAGGCGAGTCTAGAACCTG-3 '(SEQ ID NO: 1); antisense strand sequence: 5'-AATTCAGGTTCTAGACTCGCCTTC-3' (SEQ ID NO: 2) ) containing an XbaI site, to give the transfer vector called pVT KitKat.
Les étapes de la construction de ce vecteur sont schématisées sur la figure 2. The steps of the construction of this vector are shown schematically in FIG.
Construction du vecteur de transfert pVT 34 La région codant pour la protéine pp34 est située dans la région EcoRI H du baculovirus. Cette protéine transcrite très tardivement a été décrite comme constituant de l'enveloppe des corps d'inclusion (polyèdres). La délétion de ce gène par insertion du gène rapporteur LacZ a montré que cette protéine n'était pas nécessaire à la formation de particules virales non incluses (ZUIDEMA et al., Virol. 173(1) : 98-108, 1989). Construction of the pVT Transfer Vector 34 The coding region for the pp34 protein is located in the EcoRI H region of the baculovirus. This very late transcribed protein has been described as a constituent of the envelope of inclusion bodies (polyhedra). The deletion of this gene by insertion of the LacZ reporter gene has shown that this protein is not necessary for the formation of viral particles not included (ZUIDEMA et al., Virol., 173 (1): 98-108, 1989).
Le fragment PstI-EcoRI contenu dans la région EcoRI H du baculovirus a été cloné dans un plasmide pUCl9. Du fait de sa taille importante (8 100 pb), le clonage a été réalisé en deux étapes. Le fragment Pstl-Sural de 4103 pb puis le fragment SmaI-EcoRI de 3998pb ont été introduits dans le plasmide pUC19 pour donner le plasmide nommé pUC 34. Les sites EcoRI et Pstl situés à l'extrémité de la séquence virale étant gênants pour la suite des clonages, le fragment Pstl-BglII de 97pb ainsi que le site EcoRI ont été délétés. The PstI-EcoRI fragment contained in the EcoRI H region of the baculovirus was cloned into a plasmid pUC19. Because of its large size (8,100 bp), cloning was done in two stages. The PstI-Sural fragment of 4103 bp and the SmaI-EcoRI fragment of 3998 bp were introduced into the plasmid pUC19 to give the plasmid named pUC 34. The EcoRI and PstI sites located at the end of the viral sequence being troublesome for the rest clonings, the 97bp PstI-BglII fragment as well as the EcoRI site were deleted.
Le vecteur généré est nommé pVT 34. Il contient naturellement un site unique Xbal qui permet le clonage de la cassette promoteur-gène PH. The generated vector is named pVT 34. It naturally contains a unique XbaI site which allows the cloning of the promoter-gene PH cassette.
Les étapes de la construction de ce vecteur sont schématisées sur la figure 3. The steps of the construction of this vector are shown schematically in FIG.
EXEMPLE 3: CONSTRUCTION D'UNE CASSETTE D'EXPRESSION DE LA (31.4 GALACTOSYLTRANSFERASE (01,4GT) BOVINE, ET D'UN VECTEUR DE TRANSFERT CHARGE AVEC CETTE CASSETTE Clonage du promoteur gp67 Le promoteur de la glycoprotéine d'enveloppe gp67 du baculovirus d'Orgyia pseudotsugata a été choisi pour l'expression de la (31.4 galactosyltransférase. L'expression du gène de la gp67 est complexe, plusieurs types de transcrits sont observés, l'un de type précoce ((3) et les autres tardifs (y) (BLISSARD et ROHRMANN, Virol. 170(2) : 537-555, 1989; HILL et FAULKNER, J. Gen. Virol. 75: 1811-1813, 1994). EXAMPLE 3: CONSTRUCTION OF A BOVINE (31.4 GALACTOSYLTRANSFERASE (01.4GT) BOVINE EXPRESSION CASSETTE, AND A TRANSFER VECTOR CHARGED WITH SAID CASSETTE Cloning of the gp67 promoter The gp67 envelope glycoprotein promoter of the baculovirus Orgyia pseudotsugata was chosen for the expression of (31.4 galactosyltransferase.) The expression of the gp67 gene is complex, several types of transcripts are observed, one of the early type (3) and the other late (y). (BLISSARD and ROHRMANN, Virol, 170 (2): 537-555, 1989, HILL and FAULKNER, J. Gen. Virol 75: 1811-1813, 1994).
Ce promoteur a été reconstitué à l'aide de quatre oligonucléotides de synthèse. L'ATG initiateur de la traduction de la gp67 a été muté en ATC avec création d'un site BglII. Chacun des oligonucléotides de synthèse a été cloné séparément dans un plasmide pBS, puis les fragments ont été rassemblés dans un même plasmide pBS en Sacl-Kpnl. This promoter was reconstituted using four synthetic oligonucleotides. The ATG initiator of the gp67 translation has been transferred to ATC with the creation of a BglII site. Each of the synthetic oligonucleotides was cloned separately into a plasmid pBS, and then the fragments were pooled in the same plasmid pBS Sacl-KpnI.
Le promoteur ainsi reconstitué (SEQ ID NO: 3) est représenté sur la figure 4A. The promoter thus reconstituted (SEQ ID NO: 3) is represented in FIG. 4A.
5'-GAGCTCGCTAGCGAAGATAAGATATAAATTATCGCAAGATAAGGCGCACGTTGATTG GGTCACCCGAGTGTACGTTGATAAAGTCACGTGGGCACCCAACGCGTTGATAAGCATGGG TATATAAGGGCCTGCAGTGTTCTGGTAAATCAGTTGCACTGTGCTCTTCACAGGAACACT ACAAGACCTACAAGATCTTGAGAATTGTTGTATTTATTTTGCTTTGTGGGATCCATGCAT GCTAGC-3' Dans cette figure, les sites de restriction utilisés pour l'assemblage des fragments sont soulignés. La position de la mutation ATC-* ATG est encadrée. L'assemblage des fragments est schématisé sur la figure 4B. 5'-GAGCTCGCTAGCGAAGATAAGATATAAATTATCGCAAGATAAGGCGCACGTTGATTG GGTCACCCGAGTGTACGTTGATAAAGTCACGTGGGCACCCAACGCGTTGATAAGCATGGG TATATAAGGGCCTGCAGTGTTCTGGTAAATCAGTTGCACTGTGCTCTTCACAGGAACACT ACAAGACCTACAAGATCTTGAGAATTGTTGTATTTATTTTGCTTTGTGGGATCCATGCAT GCTAGC-3 'In this figure, the restriction sites used to assemble the fragments are underlined. The position of the ATC- * ATG mutation is framed. The assembly of the fragments is shown schematically in FIG. 4B.
La fonctionnalité du promoteur a été vérifiée en introduisant le gène de la (3-galactosidase de E. coli en aval de celui-ci. Après délétion du LacZ du plasmide pBS, le gène de la (3-galactosidase a été inséré dans ce plasmide en aval du promoteur gp67. Des expériences de transfection et de transfection-infection de cellules Sf9 en culture ont été menées. L'activité enzymatique a été visualisée dans les cellules par incubation en présence de X-Gal. Ces expériences montrent que la quantité de cellules bleues n'excède pas 5% en cas de transfection simple alors qu'elle atteint 98% lorsque la transfection est complémentée par une infection par le virus sauvage (toutes les cellules bleues présentent aussi le phénotype OB+). Ces résultats démontrent que le promoteur gp67 synthétique est fonctionnel dans un environnement viral infectieux. The functionality of the promoter was verified by introducing the E. coli β-galactosidase gene downstream thereof After deletion of LacZ from plasmid pBS, the β-galactosidase gene was inserted into this plasmid downstream of the gp67 promoter Transfection and transfection-infection experiments of Sf9 cells in culture were carried out The enzyme activity was visualized in the cells by incubation in the presence of X-Gal These experiments show that the amount of blue cells does not exceed 5% in case of simple transfection, whereas it reaches 98% when transfection is supplemented by infection with the wild-type virus (all blue cells also have the OB + phenotype). These results demonstrate that the promoter Synthetic gp67 is functional in an infectious viral environment.
Insertion de la P1.4 galactosyltransférase La p1.4 galactosyltransférase (UDP-galactose: ,Q-D-N-acétylglucosaminyl-protéine)6(1-4) transférase, EC 2.4.1.38) catalyse le transfert d'un résidu galactose à partir d'UDP-Gal sur un résidu G1cNAc. L'ADNc de la P1.4 galactosyltransférase bovine (D'AGOSTARO et al., Eur. J. Biol. 183(1) : 211-217, 1989: n d'accès X 14558)a été cloné dans un plasmide pBS en BamHI. Insertion of P1.4 galactosyltransferase The p1.4 galactosyltransferase (UDP-galactose:, QDN-acetylglucosaminyl-protein) 6 (1-4) transferase, EC 2.4.1.38) catalyzes the transfer of a galactose residue from UDP -Gal on a G1cNAc residue. The bovine P1.4 galactosyltransferase cDNA (D'AGOSTARO et al., Eur J Biol 183 (1): 211-217, 1989: Access accession X 14558) was cloned into a plasmid pBS. Bam.
Une seule modification de la séquence codant la (31.4 galactosyltransférase a été faite. Il s'agit de la délétion du site unique Bsu36I. Outre l'avantage d'une recombinaison facilitée par linéarisationdes ADN viraux et plasmidiques, la présence des sites uniques Sse8387I et Bsu36I dans le génome viral permet de marquer le virus. La délétion du site Bsu36I a été réalisée par PCR. La séquence d'origine 5'-ACCGCATGCCCTGAGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 4) contenant les sites SphI (en italique) et Bsu36I (en gras) a été remplacée par la séquence BGTfor 5'-ACCGCATGCCCTGAAGAGTC-3' (SEQ ID NO: 5) codant les mêmes acides aminés. La seconde amorce dessinée est BGTbac 5'-CCTTGTGAGGAGGCATGC- 3'(SEQ ID NO: 6). Le fragment amplifié a été cloné dans un plasmide pUC en Sphl et séquencé. Le fragment muté a été réintégré dans le plasmide d'origine pBS (31,4GT en Sphl-Ncol. A single modification of the (31.4 galactosyltransferase) coding sequence was made, which is the deletion of the unique Bsu36I site.In addition to the advantage of recombination facilitated by linearization of viral and plasmid DNAs, the presence of unique sites Sse8387I and Bsu36I in the viral genome makes it possible to mark the virus The deletion of the Bsu36I site was carried out by PCR The original sequence 5'-ACCGCATGCCCTGAGGAGTC-3 '(SEQ ID NO: 4) containing the SphI sites (in italics) and Bsu36I (in bold) has been replaced by the sequence BGTfor 5'-ACCGCATGCCCTGAAGAGTC-3 '(SEQ ID NO: 5) encoding the same amino acids The second primer drawn is BGTbac 5'-CCTTGTGAGGAGGCATGC-3' (SEQ ID NO: The amplified fragment was cloned into a SphI pUC plasmid and sequenced The mutated fragment was reintegrated into the original plasmid pBS (31.4GT in SphI-Ncol.
Construction du vecteur de transfert chargé pVT EGT-prgp67-01, 4GT Le plasmide pBS promoteur gp67 synthétique a été digéré par Nhel. Le promoteur gp67 ainsi libéré a été inséré dans le vecteur de transfert pVT EGT au site unique Xbal. Le sens d'insertion a été vérifié. Il est identique à celui du gène EGT. Le gène de la (31.4 galactosyltransférase a été cloné en aval du promoteur gp67 dans le vecteur de transfert pVT EGT en BamHI. Le sens d'insertion du gène a été contrôlé. Construction of the pVT-loaded transfer vector EGT-prgp67-01, 4GT The synthetic pPG promoter plasmid gp67 was digested with NheI. The gp67 promoter thus released was inserted into the pVT EGT transfer vector at the unique XbaI site. The direction of insertion has been verified. It is identical to that of the EGT gene. The 31.4 galactosyltransferase gene was cloned downstream of the gp67 promoter into the BamHI pVT EGT transfer vector and the direction of insertion of the gene was monitored.
EXEMPLE 4: CONSTRUCTION D'UNE CASSETTE D'EXPRESSION DE LA NACETYLGLUCOSAMINYLTRANFERASE I (GNTI) ET D'UN VECTEUR DE TRANSFERT CHARGE AVEC CETTE CASSETTE Construction du plasmide pUC Ad20. EXAMPLE 4: CONSTRUCTION OF A NACETYLGLUCOSAMINYLTRANFERASE I (GNTI) EXPRESSION CASSETTE AND A CHARGED TRANSFER VECTOR WITH THIS CASSETTE Construction of the plasmid pUC Ad20.
Ce plasmide intermédiaire permet l'insertion rapide des différents promoteurs et des gènes GNTI et II avant leur transfert dans leur vecteur respectif. This intermediate plasmid allows the rapid insertion of the different promoters and genes GNTI and II before their transfer in their respective vector.
Une séquence contenant de multiples sites de clonage a été reconstituée par oligonucléotides de synthèse chevauchants et insérée dans un plasmide pUCl9. Ce polylinker (SEQ ID NO: 7) du plasmide pUC Ad20, est représenté ci-après, et schématisé sur la figure 5 A. 5'AGCTTGTCTAGACGAAGCGCTATTAGATCTACTCTCGAGATACAATTGCTAGAATTC AAACCCGGGTACATGCATAATTCCGGATTAGTTAACATCGCTAGCCTGCAATTC-3' Identification et clonage du promoteur et du stop du gène actine 3 de Bombyx mori. A sequence containing multiple cloning sites was reconstituted with overlapping synthetic oligonucleotides and inserted into a pUC19 plasmid. This polylinker (SEQ ID NO: 7) of the plasmid pUC Ad20, is represented below, and shown schematically in FIG. 5. 5'AGCTTGTCTAGACGAAGCGCTATTAGATCTACTCTCGAGATACAATTGCTAGAATTC AAACCCGGGTACATGCATAATTCCGGATTAGTTAACATCGCTAGCCTGCAATTC-3 'Identification and cloning of the promoter and the stop of the actin 3 gene of Bombyx mori .
Le promoteur du gène codant pour l'actine 3 de Bombyx mori (MOUNIER et al. , Insect Biochem. 21: 293-301, 1991) est reconnu par la polymérase II cellulaire. The promoter of the gene encoding Bombyx mori actin 3 (Mounier et al., Insect Biochem 21: 293-301, 1991) is recognized by cellular polymerase II.
Un fragment de ce promoteur (prA3) de 1534 pb (SEQ ID NO: 8) a été cloné dans le plasmide pUC Ad20 en SmaI-EcoRI (figure 5 A). A fragment of this promoter (prA3) of 1534 bp (SEQ ID NO: 8) was cloned in plasmid pUC Ad20 into SmaI-EcoRI (FIG. 5A).
2891552 16 5'GGTAGGAGCTCTTGTGAGTCCTCGCGGGTAGGTACCACCACCCTGCCTATTTCTGCCGTGAA GCAGTAATGCGTTTCGGTTTGAAGAGTGGGGCGGCCGTGGTACTGAGACCTTAGAACTCATATCTG AAGGTGGGTGGCACATTTACGTTGTAGATGTCTATGGGCTCCAGTAACCACTTAACATCAGGTGGG CTGTGAGCTCTTACACCCATCTACGCAATAAAAAATTAAAAATAAATATGTTTGAAGTCCGTAACA2891552 16 5'GGTAGGAGCTCTTGTGAGTCCTCGCGGGTAGGTACCACCACCCTGCCTATTTCTGCCGTGAA GCAGTAATGCGTTTCGGTTTGAAGAGTGGGGCGGCCGTGGTACTGAGACCTTAGAACTCATATCTG AAGGTGGGTGGCACATTTACGTTGTAGATGTCTATGGGCTCCAGTAACCACTTAACATCAGGTGGG CTGTGAGCTCTTACACCCATCTACGCAATAAAAAATTAAAAATAAATATGTTTGAAGTCCGTAACA
TAGATTCCGTATTTTTACAGTTGTTTTTCACGTTTTTCATTTCTTCACCGACAATGGAAAATAATC ACACACAAATACACTGTATAGTAACAACGAGCAGAGCCGATTTTGGAGTTTCGATAAAGCGAGGCT ACCAAGAATGCGGCAGATAAGATTTACGTACATTCAAGAGTCGCTGATAACAACTTTTACCTCTCA AATTGCCCACAGTGCGATCACAAGAAACATAGACGAACGGATCTGTGCGCAACGAGCCGCTACGAT ATCATTATCATACAGATTTTTATCTTTTCATCTAGCTTCAGTTAGTGATGCTTTCTGATCTCTTCA TAGATTCCGTATTTTTACAGTTGTTTTTCACGTTTTTCATTTCTTCACCGACAATGGAAAATAATC ACACACAAATACACTGTATAGTAACAACGAGCAGAGCCGATTTTGGAGTTTCGATAAAGCGAGGCT ACCAAGAATGCGGCAGATAAGATTTACGTACATTCAAGAGTCGCTGATAACAACTTTTACCTCTCA AATTGCCCACAGTGCGATCACAAGAAACATAGACGAACGGATCTGTGCGCAACGAGCCGCTACGAT ATCATTATCATACAGATTTTTATCTTTTCATCTAGCTTCAGTTAGTGATGCTTTCTGATCTCTTCA
TAATTATAATTAAAAAGAATAAATTATCTAGTAATATAGTTCTACTACGGTACACGAATTTTGAGA TTAATTAACCGGATTTTCTGGGTTATGATTTACATCGGTACAGAATCTAGTGAAAGCACGTCGAGT GAAATTCTATGAAACTTCGGCGGGAGTCGGGGAGAGGTTACAAGCGACCGCGAGGTGCCGCTAACT TAATCAGTTATCAAGGCATCGCCTTATCAAAAGATGCGAGCTGATAGCGTGCGCGTTACCATATAT GGTGACAAAAACTGAGTCAGCCCGCGATTGGTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATT TAATTATAATTAAAAAGAATAAATTATCTAGTAATATAGTTCTACTACGGTACACGAATTTTGAGA TTAATTAACCGGATTTTCTGGGTTATGATTTACATCGGTACAGAATCTAGTGAAAGCACGTCGAGT GAAATTCTATGAAACTTCGGCGGGAGTCGGGGAGAGGTTACAAGCGACCGCGAGGTGCCGCTAACT TAATCAGTTATCAAGGCATCGCCTTATCAAAAGATGCGAGCTGATAGCGTGCGCGTTACCATATAT GGTGACAAAAACTGAGTCAGCCCGCGATTGGTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATT
GTGATAACGGCTCTTTTATATAGTTTATCCTCACGAGTCGGTTCTCATTTACTAAGGTGTGCTCGA ACAGTGCGCATTCGCATCTACGTACTTGTCACTTATTTAATAATACTATGTAAGTTTTAATTTTAA AATTGCGAAAGAAAAAAAAACATATTTATTTATTTGTAAAATTTGAATTTCGAAGGTTCTCCGTCC CTTTACCTTTAAGTATTACATATGTTTGAGTGTTTTTTTTTTTTAATAATACGCTAATGATAACGT GTTACGTTACATAATTGTTGCATAACTAGTGAAGTGAAATTTTTTATAAAA.AAAAACATTTTTCGG AATTTAGTGTACTGCAGATGTTAATAAACACTACTAAATAAGAAATAAGTTTATTGGACGCACATT TCAAAGTGTCCACTCGCATCGATCA.ATTCGGAAACAGAAATTGGGAACAGTGAATTATGAATCTTA TACAGTTTTCTTTAACGTCACTAAATAGATGGACGCAAATAAATTTGTCGTTTACTTAGTATAATG TATGGAATGAGAATGTAGTTTGAATTGTTTTTTTTCTTTTCTTGCAGACTAATTCAAGATTTGCGA CGAAGAAGTTGCCGCGTTGG-3' De la même manière, un stop de transcription, le stop A3 (StA3) de 459 pb (SEQ ID NO: 9) 5'GGATCCGTCGAGTAAAACGAACGGAATGTTGTTGTTGCCGTTTTTTTTTTGACAAAGATTTT TATTTATTAAAGTTACTAACCCCAAAACTTTTTAATAAAATAAATTTATATACCGGTATAATAACT GACGTTTTTCACTTGCTGTCCCCGCTCCCGACTAACAGTACGTCGTGTGCACCGAAATTACCGATT GTGATAACGGCTCTTTTATATAGTTTATCCTCACGAGTCGGTTCTCATTTACTAAGGTGTGCTCGA ACAGTGCGCATTCGCATCTACGTACTTGTCACTTATTTAATAATACTATGTAAGTTTTAATTTTAA AATTGCGAAAGAAAAAAAAACATATTTATTTATTTGTAAAATTTGAATTTCGAAGGTTCTCCGTCC CTTTACCTTTAAGTATTACATATGTTTGAGTGTTTTTTTTTTTTAATAATACGCTAATGATAACGT GTTACGTTACATAATTGTTGCATAACTAGTGAAGTGAAATTTTTTATAAAA.AAAAACATTTTTCGG AATTTAGTGTACTGCAGATGTTAATAAACACTACTAAATAAGAAATAAGTTTATTGGACGCACATT TCAAAGTGTCCACTCGCATCGATCA.ATTCGGAAACAGAAATTGGGAACAGTGAATTATGAATCTTA TACAGTTTTCTTTAACGTCACTAAATAGATGGACGCAAATAAATTTGTCGTTTACTTAGTATAATG TATGGAATGAGAATGTAGTTTGAATTGTTTTTTTTCTTTTCTTGCAGACTAATTCAAGATTTGCGA CGAAGAAGTTGCCGCGTTGG-3 'Similarly, a transcription stop, the stop A3 (STA3) 459 bp (SEQ ID NO: 9) 5'GGATCCGTCGAGTAAAACGAACGGAATGTTGTTGTTGCCGTTTTTTTTTTGACAAAGATTTT TATTTATTAAAGTTACTAACCCCAAAACTTTTTAATAAAATAAATTTATATACCGGTATAATAACT GACGTTTTTCACTTGCTGTCCCCGCTCCCGACTAACAGTACGTCGTGTGCACCGAAATTACCGATT
TCGTACACCGTTTGAGACAGTTACGCTAGGAGCACAAATCTCCCAGCTGCATACCGTTGTTTACTG CAGTCTTTAATTGGAATGCGAGTCGTTGACCGCTTAATACGAAACATTCTAAAATTCGCATCGTAA CGCCATTAAAAATGCAAAGGAAACTGGTTCTGTACTTTCTACCTTTCAAAAGATCTGATTCACCAA ATTAATTTTATGCGGACTCACTAATTCCGTAGAAATCTGTGTTCGTTAATAATGAATCAGAGGTAC C-3 TCGTACACCGTTTGAGACAGTTACGCTAGGAGCACAAATCTCCCAGCTGCATACCGTTGTTTACTG CAGTCTTTAATTGGAATGCGAGTCGTTGACCGCTTAATACGAAACATTCTAAAATTCGCATCGTAA CGCCATTAAAAATGCAAAGGAAACTGGTTCTGTACTTTCTACCTTTCAAAAGATCTGATTCACCAA ATTAATTTTATGCGGACTCACTAATTCCGTAGAAATCTGTGTTCGTTAATAATGAATCAGAGGTAC C-3
a été inséré aux sites BglII-Eco47III du plasmide pUC Ad20. was inserted at the BglII-Eco47III sites of plasmid pUC Ad20.
Le promoteur prA3 contient une région régulatrice de type silencer de 800 pb. Une digestion par Alul-EcoRI a permis de l'éliminer, pour obtenir la construction AsA3 (SEQ ID NO: 10). 5'GGTAGGAGCTCTTGTGAGTCCTCGCGGGTAGATAGCGTGCGCGTTACCATATATGGTGACAA AAACTGAGTCAGCCCGCGATTGGTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATTGTGATAAC The prA3 promoter contains a 800 bp silencer regulatory region. Alul-EcoRI digestion removed it to obtain the AsA3 construct (SEQ ID NO: 10). 5'GGTAGGAGCTCTTGTGAGTCCTCGCGGGTAGATAGCGTGCGCGTTACCATATATGGTGACAA AAACTGAGTCAGCCCGCGATTGGTGGAAAAACAAACTGGAGCCGATACTGTGTAAATTGTGATAAC
GGCTCTTTTATATAGTTTATCCTCACGAGTCGGTTCTCATTTACTAAGGTGTGCTCGAACAGTGCG CATTCGCATCTACGTACTTGTCACTTATTTAATAATACTATGTAAGTTTTAATTTTAAAATTGCGA AAGAAAAAAAAACATATTTATTTATTTGTAAAATTTGAATTTCGAAGGTTCTCCGTCCCTTTACCT TTAAGTATTACATATGTTTGAGTGTTTTTTTTTTTTAATAATACGCTAATGATAACGTGTTACGTT ACATAATTGTTGCATAACTAGTGAAGTGAAATTTTTTATAAAAAAAAACATTTTTCGGAATTTAGT GGCTCTTTTATATAGTTTATCCTCACGAGTCGGTTCTCATTTACTAAGGTGTGCTCGAACAGTGCG CATTCGCATCTACGTACTTGTCACTTATTTAATAATACTATGTAAGTTTTAATTTTAAAATTGCGA AAGAAAAAAAAACATATTTATTTATTTGTAAAATTTGAATTTCGAAGGTTCTCCGTCCCTTTACCT TTAAGTATTACATATGTTTGAGTGTTTTTTTTTTTTAATAATACGCTAATGATAACGTGTTACGTT ACATAATTGTTGCATAACTAGTGAAGTGAAATTTTTTATAAAAAAAAACATTTTTCGGAATTTAGT
GTACTGCAGATGTTAATAAACACTACTAAATAAGAAATAAGTTTATTGGACGCACATTTCAAAGTG TCCACTCGCATCGATCAATTCGGAAACAGAAATTGGGAACAGTGAATTATGAATCTTATACAGTTT TCTTTAACGTCACTAAATAGATGGACGCAAATAAATTTGTCGTTTACTTAGTATAATGTATGGAAT GAGAATGTAGTTTGAATTGTTTTTTTTCTTTTCTTGCAGACTAATTCAAGATTTGCGACGAAGAAG TTGCCGCGTTGG-3' Insertion de la GNTI L'ADNc de l'UDP-G1cNAc: a-3-Dmannoside P1,2-N-acéty1glucosaminyltransférase I humaine (GNTI; EC 2.4.1. 101; HULL et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176: 608-615, 1991; n d'accès: M61829), a été cloné dans un plasmide pGEM5Z-f contenant le gène de la GNT-I (plasmide ATCC 79003). GTACTGCAGATGTTAATAAACACTACTAAATAAGAAATAAGTTTATTGGACGCACATTTCAAAGTG TCCACTCGCATCGATCAATTCGGAAACAGAAATTGGGAACAGTGAATTATGAATCTTATACAGTTT TCTTTAACGTCACTAAATAGATGGACGCAAATAAATTTGTCGTTTACTTAGTATAATGTATGGAAT GAGAATGTAGTTTGAATTGTTTTTTTTCTTTTCTTGCAGACTAATTCAAGATTTGCGACGAAGAAG TTGCCGCGTTGG-3 'Insertion of GNTI cDNA UDP-G1cNAc: a-3-Dmannoside P1,2-N-acéty1glucosaminyltransférase human I (GNTI; EC 2.4.1 101; HULL et al.. Biochem Biophys Res Commun 176: 608-615, 1991, access number: M61829), was cloned into plasmid pGEM5Z-f containing the GNT-I gene (plasmid ATCC 79003).
Du fait de l'absence de sites de clonage appropriés de part et d'autre de la séquence, les régions 5' et 3' codantes ont été modifiées par PCR avec des amorces 25 contenant les sites de restriction permettant un clonage rapide dans un plasmide pUC, puis dans le vecteur de transfert approprié. En outre, le codon stop UAG a été changé en UAA, le codon UAG n'étant pas toujours reconnu comme codon stop en cellule de lépidoptère. Due to the lack of appropriate cloning sites on either side of the sequence, the coding 5 'and 3' regions were modified by PCR with restriction site-containing primers allowing rapid plasmid cloning. pUC, then in the appropriate transfer vector. In addition, the stop codon UAG was changed to UAA, the UAG codon not always being recognized as stop codon in lepidopteran cell.
L'amorce sens GI1: 5'-CGATGAATTCCAATTGATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGCTTG-3' (SEQ ID NO: 11) et l'amorce anti-sens GI2: 5'CTGAGGATCCTCTTGGGCCAGGCGAATCACTTC-3' (SEQ ID NO: 12) permettent l'amplification de la région 5' codante du gène GNTI et le clonage de ce fragment dans un pUC19 en EcoRI-BamHI. The forward primer GI1: 5'-CGATGAATTCCAATTGATGCTGAAGAAGCAGTCTGCAGGGCTTG-3 '(SEQ ID NO: 11) and the antisense primer GI2: 5'CTGAGGATCCTCTTGGGCCAGGCGAATCACTTC-3' (SEQ ID NO: 12) allow amplification of the region encoding the GNTI gene and cloning this fragment into pUC19 into EcoRI-BamHI.
L'amorce sens GI3. 35The primer GI3 sense. 35
5'-CGATGGATCCCTGAGATCTCAAGAACGATGACC-3' (SEQ ID NO: 13); et l'amorce antisens GI4: 5'-GTCAAAGCTTCTCGAGCAGGTGTTAATTCCAGCTAGGATC-3'(SEQ ID NO: 14) permettent l'amplification d'un fragment correspondant à la région 3' codante du gène GNTI et son clonage aux sites BamHI-HindIII dans le plasmide pUC19 chargé de la séquence 5'-GNTI. Le plasmide obtenu a été vérifié par séquençage (Eurogentec, Belgique). Le fragment SmaI-Bg1II de GNTI partie centrale du gène est ensuite extrait du plasmide d'origine pGEM52f-GNTI, purifié par électrophorèse puis réintroduit dans le plasmide pUC19 contenant les fragments 5' et 3' codants. Le gène GNTI reconstitué a une taille de 1342 pb. 5'-CGATGGATCCCTGAGATCTCAAGAACGATGACC-3 '(SEQ ID NO: 13); and the antisense primer GI4: 5'-GTCAAAGCTTCTCGAGCAGGTGTTAATTCCAGCTAGGATC-3 '(SEQ ID NO: 14) allow the amplification of a fragment corresponding to the 3' coding region of the GNTI gene and its cloning at the BamHI-HindIII sites in the plasmid pUC19 loaded with the 5'-GNTI sequence. The plasmid obtained was verified by sequencing (Eurogentec, Belgium). The SmaI-BglII fragment of GNTI central part of the gene is then extracted from the original plasmid pGEM52f-GNTI, purified by electrophoresis and then reintroduced into plasmid pUC19 containing the 5 'and 3' coding fragments. The reconstituted GNTI gene has a size of 1342 bp.
Le gène de la N-acétylglucosaminyltransférase I a été cloné entre le promoteur A3 et le stop A3 dans le plasmide pUC Ad20 aux sites Munl-XhoI, pour donner le plasmide pUC Ad20 GNTI. The N-acetylglucosaminyltransferase I gene was cloned between the A3 promoter and the A3 stop in the pUC Ad20 plasmid at the MunI-XhoI sites, to give the plasmid pUC Ad20 GNTI.
Les différentes étapes de cette construction sont schématisées sur la Figure 5. The different stages of this construction are shown schematically in Figure 5.
Construction du vecteur de transfert chargé pVT KitKat-GNTI La cassette de 2482 pb (680+460+1342) constituée du promoteur AsA3 suivi du gène GNTI et du stop A3 a été introduite dans le vecteur de transfert pVT KitKat au site unique XbaI. Construction of the pKT loaded Transfer Vector Kit Kat-GNTI The 2482 bp cassette (680 + 460 + 1342) consisting of the AsA3 promoter followed by the GNTI gene and the A3 stop was introduced into the pVT KitKat transfer vector at the unique XbaI site.
EXEMPLE 5: CONSTRUCTION D'UNE CASSETTE D'EXPRESSION DE LA NACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE II (GNTII) ET D'UN VECTEUR DE TRANSFERT CHARGE AVEC CETTE CASSETTE Identification et clonage du promoteur P9 Le promoteur P9, issu du densovirus de Junonia caenia, permet la transcription des protéines de capside du densovirus (DUMAS et al., Virol. 191: 202-222, 1992). Il est reconnu par l'ARN polymérase II cellulaire. Le fragment BstEII-PvuII a été isolé du plasmide pBRJAS (GIRAUD, Thèse de doctorat, Université des Sciences de Marseille, 1991), et cloné dans un plasmide pUC en HinclI. EXAMPLE 5: CONSTRUCTION OF A NACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE II EXPRESSION CASSETTE (GNTII) AND A TRANSFER VECTOR CHARGED WITH THIS CASSETTE Identification and cloning of the P9 promoter The P9 promoter, derived from the Junonia caenia densovirus, allows the transcription of capsid proteins of the densovirus (DUMAS et al., Virol., 191: 202-222, 1992). It is recognized by cellular RNA polymerase II. The BstEII-PvuII fragment was isolated from plasmid pBRJAS (GIRAUD, Ph.D. Thesis, Marseille University of Sciences, 1991), and cloned into a plasmid pUC in HinclI.
Ce fragment (SEQ ID NO: 15) 5'GGTGACCTTGACCTTTGACCTTCTATATGACCTTGACCTACTTCTGTGACCTTCTGGTCTACT GACCTTTGACCTTCTGAGCTGATGTCTACTGACCTGATGATGGAGAGGATCCGAAGACCTTGGAGCThis fragment (SEQ ID NO: 15) 5'GGTGACCTTGACCTTTGACCTTCTATATGACCTTGACCTACTTCTGTGACCTTCTGGTCTACT GACCTTTGACCTTCTGAGCTGATGTCTACTGACCTGATGATGGAGAGGATCCGAAGACCTTGGAGC
TGAAGGTGGAACACAGGACCTGATGTTAGTGAAGGACAGCAATAGTGTGCGAGTGAGATAGCACTA TAGCAACTGTTAGAGCGAGATAGCAATATGAGTAAAAGAGATAGCATGCAAACAAACCTTGAGATA ATTTATGCGCATTTTATTATCTTGTTATTGTGACCTCGTTTGACCGGCAAACTCGCGTCGAGGCTG GGCCGTGTGCAAAACAGGATGTGGCTGGCCAGCGGACCATTGACTATATAAAGGCTGACGTGTTCT TGAAGGTGGAACACAGGACCTGATGTTAGTGAAGGACAGCAATAGTGTGCGAGTGAGATAGCACTA TAGCAACTGTTAGAGCGAGATAGCAATATGAGTAAAAGAGATAGCATGCAAACAAACCTTGAGATA ATTTATGCGCATTTTATTATCTTGTTATTGTGACCTCGTTTGACCGGCAAACTCGCGTCGAGGCTG GGCCGTGTGCAAAACAGGATGTGGCTGGCCAGCGGACCATTGACTATATAAAGGCTGACGTGTTCT
ATTTTTAGTCAGTATGTCTTTCTACACGGCCGGGTTAATACATCGTGCGCGAC-3' est représenté sur la figure 6A. Dans le but de muter l'ATG initiateur, le fragment BalIPstI a été échangé par un fragment reconstitué à partir d'oligonucléotides de synthèse. ATTTTTAGTCAGTATGTCTTTCTACACGGCCGGGTTAATACATCGTGCGCGAC-3 'is shown in Figure 6A. In order to mutate the initiator ATG, the BalIPstI fragment was exchanged with a fragment reconstituted from synthetic oligonucleotides.
Ce fragment (SEQ ID NO: 16): 5'CCAGCGGACCATTGACTATATAAAGGCTGACGTGTTCTATTTTTAGTCAGTACTTCTTTCTAC ACGGCCGGGTTAATACATCGTGCGCGACCTGCA-3' est représenté sur la Figure 6B, qui schématise les différentes étapes de la construction du vecteur pUCprP9 15 ATG*, contenant ce promoteur.This fragment (SEQ ID NO: 16): 5'CCAGCGGACCATTGACTATATAAAGGCTGACGTGTTCTATTTTTAGTCAGTACTTCTTTCTAC ACGGCCGGGTTAATACATCGTGCGCGACCTGCA-3 'is shown in FIG. 6B, which schematizes the various steps of the construction of the pUCprP9 ATG * vector, containing this promoter.
Analyse fonctionnelle du promoteur Comme décrit précédemment, le gène LacZ a été introduit sous contrôle du promoteur P9 pour vérifier la fonctionnalité du promoteur. Des expériences de transfection de cellules Sf9 avec le plasmide pUCprP9-0Gal montre que le promoteur est reconnu par la polymérase cellulaire puisque plus de 50% de cellules présentent une coloration bleue après trois jours de transfection. Ces résultats montrent que le promoteur P9 est fonctionnel. Functional Analysis of the Promoter As previously described, the LacZ gene was introduced under control of the P9 promoter to verify the functionality of the promoter. Transfection experiments of Sf9 cells with the plasmid pUCprP9-0Gal show that the promoter is recognized by the cellular polymerase since more than 50% of cells show a blue coloration after three days of transfection. These results show that the P9 promoter is functional.
Insertion de la GNTII Le gène humain de la Nacétylglucosaminyltransférase II (GNTII; EC 2.4.1.143; TAN, Eur. J. Biochem. 231(2) : 317-328, 1995; n d'accession NM_ 002408) est cloné dans un plasmide pGEM52-f. Insertion of GNTII The human gene for Nacetylglucosaminyltransferase II (GNTII, EC 2.4.1.143, TAN, Eur J Biochem 231 (2): 317-328, 1995, Accession No. NM-002408) is cloned into a plasmid pGEM52-f.
Pour les mêmes raisons que pour GNTI, le gène a été resynthétisé par PCR avec les amorces suivantes: GII1; 5'CAGCGAATTCTCCGGAATGAGGTTCCGCATCTACAAACGGAAGGTGC-3' (SEQ ID NO: 17) GII2 5'-CTGAGGATCCGTTCAGCTGGTACACCAGGGAC-3' (SEQ ID NO: 18). For the same reasons as for GNTI, the gene was resynthesized by PCR with the following primers: GII1; 5'CAGCGAATTCTCCGGAATGAGGTTCCGCATCTACAAACGGAAGGTGC-3 '(SEQ ID NO: 17) GII2 5'-CTGAGGATCCGTTCAGCTGGTACACCAGGGAC-3' (SEQ ID NO: 18).
Le fragment obtenu, correspondant à la région 5' du gène, a été cloné aux sites EcoRI-BamHI du plasmide pUC. Les amorces GII3: 5'CTGAGGATCCCCTCAAATTCCTAGGATCTTTCATGC-3' (SEQ ID NO: 19); 5 et GII4 5'GTCCAAGCTTGGTTAACCTGTGACTTTCACTGCAGCCTTCTGTAAC-3' (SEQ ID NO: 20) ont permis l'amplification d'un fragment correspondant à la région 3' du gène. Il a été cloné aux sites BamHI-HindIII du plasmide pUC contenant déjà le fragment 5'-GNTII. The resulting fragment, corresponding to the 5 'region of the gene, was cloned at the EcoRI-BamHI sites of the plasmid pUC. Primers GII3: 5'CTGAGGATCCCCTCAAATTCCTAGGATCTTTCATGC-3 '(SEQ ID NO: 19); And GII4 5'GTCCAAGCTTGGTTAACCTGTGACTTTCACTGCAGCCTTCTGTAAC-3 '(SEQ ID NO: 20) allowed the amplification of a fragment corresponding to the 3' region of the gene. It was cloned at BamHI-HindIII sites of plasmid pUC already containing the 5'-GNTII fragment.
Le fragment KpnI-AvrII de GNTII, correspondant partie centrale du gène a ensuite été extrait du plasmide d'origine pGEM52f-GNTII pour être réintroduit dans le plasmide pUC contenant les fragments 5' et 3' du gène. Le plasmide pUC GNTII ainsi obtenu contient le gène complet de la GNTII (1352 pb). The KpnI-AvrII fragment of GNTII, corresponding central part of the gene was then extracted from the original plasmid pGEM52f-GNTII to be reintroduced into the plasmid pUC containing the 5 'and 3' fragments of the gene. The plasmid pUC GNTII thus obtained contains the complete gene of GNTII (1352 bp).
Une autre modification apportée au gène de la GNTII, est la mutation du site Bsu36I présent dans le 20 fragment BclI-SalI (169 pb) par PCR. Another modification to the GNTII gene is the mutation of the Bsu36I site present in the BclI-SalI fragment (169 bp) by PCR.
La séquence d'origine: 5'-GTCAAGCTTGATCAGACCCTGAGGAATGTAG-3' (SEQ ID NO: 21) contenant les sites Hindlll (souligné), BclI (encadré) et Bsu36I (en gras) a été remplacée par la séquence ForBsGII: 5'GTCAAGCTTGATCAGACCCTGCGTAATGTAG-3' (SEQ ID NO: 22) Cette dernière séquence a été utilisée comme amorce sens pour la PCR avec l'amorce anti- sens BacBsGII: 5'-GGCGATCAGCTGATTGATCTC-3' (SEQ ID NO: 23) Le fragment amplifié a été cloné dans un plasmide pUC en Hindlll-Sall et séquencé. Le fragment muté a été réintégré dans le plasmide d'origine pUC GNTII en Bcll-Sall. The original sequence: 5'-GTCAAGCTTGATCAGACCCTGAGGAATGTAG-3 '(SEQ ID NO: 21) containing the sites HindIII (underlined), BclI (box) and Bsu36I (in bold) has been replaced by the sequence ForBsGII: 5'GTCAAGCTTGATCAGACCCTGCGTAATGTAG- 3 '(SEQ ID NO: 22) This last sequence was used as sense primer for PCR with BacBsGII antisense primer: 5'-GGCGATCAGCTGATTGATCTC-3' (SEQ ID NO: 23) The amplified fragment was cloned in a Hindlll-SalI pUC plasmid and sequenced. The mutated fragment was reintegrated into the plasmid of pUC GNTII origin in BclI-SalI.
Enfin, le gène de la N- acétylglucosaminyltransférase II a été cloné en aval du promoteur P9 dans le pUC Ad20GNT-I aux sites AccIII-HpaI. Les étapes de cette construction sont schématisées sur la Figure 7. Finally, the N-acetylglucosaminyltransferase II gene was cloned downstream of the P9 promoter in the Ad20GNT-I pUC at the AccIII-HpaI sites. The steps of this construction are shown schematically in Figure 7.
Construction du vecteur de transfert chargé pVT34 GNTII Le fragment XbaINheI de 1 800pb de pUC Ad20 contenant le promoteur P9 et le gène de la GNTII a été inséré au site unique XbaI dans le pVT34 pour obtenir le vecteur pVT34-GNTII. Construction of the loaded transfer vector pVT34 GNTII The 1,800-bp XbaINheI fragment of pUC Ad20 containing the P9 promoter and the GNTII gene was inserted at the unique XbaI site into pVT34 to obtain the pVT34-GNTII vector.
EXEMPLE 6: CONSTRUCTION DE BACULOVIRUS RECOMBINANT EXPRIMANT DE 1 A 3 GLYCOSYLTRANSFERASES. EXAMPLE 6 CONSTRUCTION OF RECOMBINANT BACULOVIRUS EXPRESSING FROM 1 TO 3 GLYCOSYLTRANSFERASES
Construction du baculovirus recombinant intermédiaire AcEGT-PH Une cassette PrPH-PH (séquence codant pour la polyédrine sous le contrôle de son promoteur endogène) a été insérée directement au site unique XbaI du vecteur pVT EGT, pour donner le vecteur pVT EGT-PH. La co-transfection de cellules Sf9 avec le vecteur pVT EGT-PH et l'ADN du virus Dsuf permet d'obtenir le virus recombinant AcEGT-PH de phénotype OB+. Construction of the AcEGT-PH Intermediate Recombinant Baculovirus A PrPH-PH cassette (sequence coding for polyhedrin under the control of its endogenous promoter) was inserted directly into the unique XbaI site of the pVT EGT vector, to give the pVT EGT-PH vector. The co-transfection of Sf9 cells with the pVT EGT-PH vector and the Dsuf virus DNA makes it possible to obtain the recombinant AcEGT-PH virus of OB + phenotype.
Obtention du baculovirus recombinant AcEGT-01,4GT Le virus recombinant possédant le gène de la (31, 4GT a été obtenu par cotransfection de cellules Sf9 avec l'ADN du virus AcEGT-PH et le vecteur de transfert chargé pVT EGT-prgp67-P1,4GT. Le virus recombinant obtenu a perdu le phénotype OB+. Ce virus est dénommé A cEGT-(3l,4GT. Obtaining the recombinant baculovirus AcEGT-01,4GT The recombinant virus possessing the (31,4GT) gene was obtained by cotransfection of Sf9 cells with AcEGT-PH virus DNA and the loaded transfer vector pVT EGT-prgp67-P1 The recombinant virus obtained has lost the OB + phenotype.This virus is called A cEGT- (31, 4GT.
Construction du baculovirus recombinant intermédiaire AcEGT-(31,4GTKitKat-PH Une cassette PrPH-PH a été insérée directement au site unique XbaI du vecteur pVT KitKat, pour donner le vecteur de transfert pVT KitKat-PH. Construction of the AcEGT- (31.4GTKitKat-PH) Intermediate Recombinant Baculovirus A PrPH-PH cassette was inserted directly into the unique XbaI site of the pVT KitKat vector, to give the pVT KitKat-PH transfer vector.
La co-transfection de cellules Sf9 avec le vecteur pVT KitKat-PH et l'ADN du virus recombinant AcEGT- (31,4GT permet d'obtenir le virus intermédiaire AcEGT-(31,4GTKitKat-PH, de phénotype OB+. The co-transfection of Sf9 cells with the pVT KitKat-PH vector and the DNA of the recombinant AcEGT- (31.4GT) virus makes it possible to obtain the intermediate AcEGT- (31.4GTKitKat-PH) virus, of OB + phenotype.
Obtention du baculovirus recombinant AcEGT-01,4GT-KitKat-GNTI Ce virus recombinant est obtenu par 35 cotransfection de cellules Sf9 avec le vecteur de transfert chargé pVT KitKat-GNTI et l'ADN du virus AcEGT-(31, 4GT- KitKat-PH. Le virus recombinant obtenu, de phénotype OB-est dénommé AcEGT-(314GT-KitKat-GNTI. Obtaining the recombinant baculovirus AcEGT-01, 4GT-KitKat-GNTI This recombinant virus is obtained by cotransfection of Sf9 cells with the loaded transfer vector pVT KitKat-GNTI and the DNA of the virus AcEGT- (31, 4GT-KitKat-PH The resulting recombinant virus, OB-phenotype is called AcEGT- (314GT-KitKat-GNTI.
Construction du baculovirus recombinant intermédiaire AcEGTJ31,4GT-KitKatGNTI-pp34-PH Une cassette PrPH-PH a été insérée directement au site unique XbaI du vecteur pVT 34, pour donner le vecteur de transfert pVT 34- PH. La co-transfection de cellules Sf9 avec le vecteur pVT 34-PH et l'ADN du virus recombinant AcEGT-1314GT-KitKat-GNTI permet d'obtenir le 10 virus intermédiaire AcEGT-(31,4GT-KitKat-GNTI-pp34-PH, de phénotype OB+. Construction of the Intermediate Recombinant Baculovirus AcEGTJ31,4GT-KitKatGNTI-pp34-PH A PrPH-PH cassette was inserted directly into the unique XbaI site of the pVT vector 34, to give the pVT 34-PH transfer vector. The co-transfection of Sf9 cells with the pVT 34-PH vector and the recombinant AcEGT-1314GT-KitKat-GNTI DNA DNA makes it possible to obtain the intermediate virus AcEGT- (31,4GT-KitKat-GNTI-pp34-PH OB + phenotype.
Construction du baculovirus recombinant final DsuG Des cellules Sf9 ont été transfectées avec le vecteur de transfert chargé pVT34-GNTII et l'ADN viral AcEGT-(31,4GT-KitKat-GNTI-pp34-PH. Le virus recombinant obtenu, de phénotype OB-, a été nommé DsuG. Construction of the final recombinant baculovirus DsuG Sf9 cells were transfected with the loaded transfer vector pVT34-GNTII and the viral DNA AcEGT- (31,4GT-KitKat-GNTI-pp34-PH) The recombinant virus obtained, of OB-phenotype , was named DsuG.
Deux clones du virus DsuG, dénommés 8563 et 8567 ont été retenus pour la suite des expérimentations. Two clones of the DsuG virus, designated 8563 and 8567 were retained for the rest of the experiments.
L'insertion des gènes des glycosyltransférases dans le génome viral a été vérifiée par digestion de l'ADN viral par les enzymes de restriction EcoRI, BamHI, Hindlll et PstI, et comparaison du profil électrophorétique obtenu avec celui du virus d'origine DsuF, ainsi que par détection de la présence des trois gènes à l'aide de sondes froides marquées à la digoxygénine. The insertion of the glycosyltransferase genes into the viral genome was verified by digestion of the viral DNA with restriction enzymes EcoRI, BamHI, HindIII and PstI, and comparison of the electrophoretic profile obtained with that of the original DsuF virus, and only by detection of the presence of the three genes using cold probes labeled with digoxigenin.
EXEMPLE 7: PRODUCTION ET GLYCOSYLATION D'UN ANTICORPS RECOMBINANT. EXAMPLE 7 PRODUCTION AND GLYCOSYLATION OF A RECOMBINANT ANTIBODY
L'anticorps choisi pour tester la glycosylation est un anticorps humain anti-(32 microglobuline (anti-(3MG). The antibody selected for testing glycosylation is a human anti-32 microglobulin antibody (anti- (3MG).
Un baculovirus exprimant cet anticorps a été construit par recombinaison entre le baculovirus DsuG et des vecteurs de transfert chargés avec les chaînes lourdes et légères de l'anticorps anti-13MG. A baculovirus expressing this antibody was recombinantly constructed between the baculovirus DsuG and transfer vectors loaded with the heavy and light chains of the anti-13MG antibody.
La séquence codant pour la chaîne légère a été clonée en aval du promoteur PH dans le vecteur de transfert pGMAc116T. Le vecteur pGMAc116T résulte de l'insertion du fragment EcoRI I de 5073 pb d'AcMNPV dans un plasmide pUC, suivie de la délétion partielle de la séquence codant pour la polyédrine. Ce vecteur contient un site unique BglII et un site unique Kpnl permettant le clonage sous contrôle transcriptionnel du promoteur PH. The sequence encoding the light chain was cloned downstream of the PH promoter in the pGMAc116T transfer vector. The pGMAc116T vector results from the insertion of the 5073 bp EcoRI I fragment of AcMNPV into a pUC plasmid, followed by the partial deletion of the polyhedrin coding sequence. This vector contains a unique BglII site and a unique KpnI site for cloning under transcriptional control of the PH promoter.
Quant à la séquence codant pour la chaîne lourde, elle a été clonée en aval du promoteur P10 dans le vecteur de transfert p119. Le vecteur p119 résulte de l'insertion dans un plasmide pUC d'un fragment HindIII-EcoRI de 3430pb situé dans les régions EcoRI S, X et P d'AcMNPV, suivie de la délétion partielle de la séquence codant pour la protéine P10. Ce vecteur contient un site unique BglII et un site unique HindIII permettant le clonage sous contrôle transcriptionnel du promoteur P10. As for the sequence encoding the heavy chain, it was cloned downstream of the P10 promoter in the p119 transfer vector. The p119 vector results from the insertion into a pUC plasmid of a HindIII-EcoRI fragment of 3430bp located in the EcoRI S, X and P regions of AcMNPV, followed by the partial deletion of the coding sequence for the P10 protein. This vector contains a unique BglII site and a unique HindIII site for cloning under transcriptional control of the P10 promoter.
Des cellules Sf9 ont été cotransfectées avec de l'ADN du virus DsuG, ou de l'ADN du virus DsuF, utilisé à titre de témoin, et les vecteurs de transfert pGmAcll6T et p119 chargés respectivement avec la séquence codant pour la chaîne légère et la séquence codant pour la chaîne lourde de l'anticorps anti-(3MG. Sf9 cells were cotransfected with DsuG virus DNA, or DsuF virus DNA, used as a control, and the pGmAcl16T and p119 transfer vectors loaded respectively with the light chain and sequence coding for the heavy chain of the anti- (3MG.
Les baculovirus recombinants résultants expriment la chaîne lourde de l'anticorps anti-PMG sous contrôle du promoteur plO, et la chaîne légère sous contrôle du promoteur PH. The resulting recombinant baculoviruses express the heavy chain of the anti-PMG antibody under the control of the p10 promoter, and the light chain under the control of the PH promoter.
I - Cinétique d'expression des gènes codant pour les glycosyltransférases et les chaînes de l'anticorps anti-(3MG. I - kinetics of expression of the genes encoding the glycosyltransferases and chains of the anti- (3MG.
Afin de vérifier la présence de transcrits spécifiques des différentes glycosyltransférases, et de suivre le profil d'expression temporelle des différents promoteurs utilisés, l'analyse de l'apparition des transcrits des différentes enzymes dans des cellules Sf9 infectées par les baculovirus recombinants a été effectuée par RT-PCR. In order to verify the presence of specific transcripts of the different glycosyltransferases, and to follow the temporal expression profile of the different promoters used, the analysis of the appearance of the transcripts of the various enzymes in Sf9 cells infected with the recombinant baculoviruses was carried out by RT-PCR.
Les cellules infectées sont collectées par centrifugation à basse vitesse (2000 rpm, 10min), à différents temps après infection. Chaque point de la cinétique a été réalisé en double. Le temps 0 correspond à l'addition du milieu de culture frais sur le tapis cellulaire après une heure d'adsorption de l'inoculum viral. Infected cells are collected by low speed centrifugation (2000 rpm, 10min), at different times after infection. Each point of the kinetics was performed in duplicate. Time 0 corresponds to the addition of the fresh culture medium to the cell layer after one hour of adsorption of the viral inoculum.
Après extraction des ARN totaux par le Trizol (Life Technologie) à partir des culots cellulaires (1 ml de Trizol pour un culot de 107 cellules Sf9 infectées), et quantification à 260 nm (spectrophotomètre Beckmann DU530), une quantité correspondant à 2 pg d'ARN total a été soumise à la transcriptase inverse. Les amorces utilisées pour la synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) correspondant au messager recherché, sont l'amorce GI4 pour le gène GNTI et l'amorce GII4 pour le gène GNTII, celles-ci ayant servi pour l'amplification de la région 3' des gènes. Pour la synthèse de l'ADNc (31,4GT, on utilise l'amorce B14B de séquence 5'CATTGGGATGAGGTCCACAT-3'(SEQ ID NO: 24). After extraction of the total RNA by Trizol (Life Technology) from the cell pellets (1 ml of Trizol for a pellet of 107 infected Sf9 cells), and quantification at 260 nm (Beckmann spectrophotometer DU530), an amount corresponding to 2 μg of Total RNA was subjected to reverse transcriptase. The primers used for the synthesis of the complementary DNA (cDNA) corresponding to the desired messenger are the GI4 primer for the GNTI gene and the GII4 primer for the GNTII gene, these having served for the amplification of the region. 3 'genes. For the synthesis of the cDNA (31.4GT, the primer B14B of sequence 5'CATTGGGATGAGGTCCACAT-3 '(SEQ ID NO: 24) is used.
Les échantillons ont été incubés 5 min à 93 C (inactivation de la transcriptase inverse) puis soumis à une PCR. Les amorces utilisées sont: (i) pour GNTI, GI3 et GI4, (ii) pour GNTII, GI13 et GII4 et (iii) pour (31,4GT, les amorces B14B et BGTfor. The samples were incubated for 5 min at 93 ° C. (inactivation of the reverse transcriptase) and then subjected to PCR. The primers used are: (i) for GNTI, GI3 and GI4, (ii) for GNTII, GI13 and GII4 and (iii) for (31.4GT, primers B14B and BGTfor.
L'analyse sur gel d'agarose de 25 pl de produit PCR révèle la présence de fragments d'amplification aux tailles attendues. Pour chaque expérience, les fragments d'ADN amplifiés ont été révélés avec une sonde spécifique marquée à la digoxygénine. Ces sondes ont été préparées à partir des plasmides d'origine (pUC GLATI, pUC GNTII ou pBS (31,4GT respectivement). La matrice utilisée pour la réalisation du témoin positif (T+) correspond à l'ADN du plasmide contenant le gène à caractériser. Les témoins négatifs (T-) ont été obtenus à partir d'ARN totaux préparés 48 heures post-infection mais non soumis à la transcription inverse. D'autres témoins ont été insérés dans chaque expérience. Il s'agit d'ARN totaux issus de cellules Sf9 non infectées (S) ou infectées avec le virus sauvage DsuF pendant 8 heures (F8) et 48 heures (F48) et traités avec les amorces utilisées pour l'expérience. Agarose gel analysis of 25 μl of PCR product revealed the presence of amplification fragments at the expected sizes. For each experiment, the amplified DNA fragments were revealed with a specific probe labeled with digoxygenin. These probes were prepared from the original plasmids (pUC GLATI, pUC GNTII or pBS (31.4GT respectively) .The matrix used for producing the positive control (T +) corresponds to the plasmid DNA containing the Negative controls (T-) were obtained from total RNA prepared 48 hours post-infection but not reverse-transcribed, and other controls were inserted into each experiment. totals from Sf9 cells uninfected (S) or infected with wild-type virus DsuF for 8 hours (F8) and 48 hours (F48) and treated with the primers used for the experiment.
Expression des glycosyltransférases: Les Figures 8A, 8B et 8C illustrent respectivement l'activité transcriptionnelle des gènes GNTI, GNTII, et (31,4GT au cours du temps. Expression of glycosyltransferases: FIGS. 8A, 8B and 8C respectively illustrate the transcriptional activity of the genes GNTI, GNTII, and (31,4GT over time.
Les échantillons 2 à 72 correspondent aux cellules Sf9 infectées avec le virus DsuG B3003 entre 2 et 72 heures p.i. Les échantillons F8 et F48 sont des témoins négatifs. Ils correspondent aux cellules Sf9 infectées avec le virus DsuF après 8 heures (F8) et 48 heures (F48) p.i. L'échantillon S correspond à un témoin cellules non infectées. SL est le marqueur ADN de taille (Smart Ladder, Eurogentec) Expression de GNTI Des fragments d'amplification de 430 pb révélés avec la sonde marquée à la digoxygénine pUC GNTI sont observés dès 2 heures après infection et jusqu'à 48 heures (le point 72 heures n'a pas été effectué dans cette expérience) alors qu'aucun produit d'amplification n'est obtenu dans les témoins négatifs F8 et F48. Le marquage du témoin positif T+ confirme que ces produits correspondent à l'amplification de la région 3' du gène GNTI. Le témoin négatif T- permet de confirmer que les échantillons ne présentent aucune trace d'ADN contaminant. Samples 2 to 72 correspond to Sf9 cells infected with DsuG B3003 virus between 2 and 72 hours p.i. Samples F8 and F48 are negative controls. They correspond to Sf9 cells infected with DsuF virus after 8 hours (F8) and 48 hours (F48) p.i. Sample S corresponds to a control uninfected cells. SL is the size DNA marker (Smart Ladder, Eurogentec) GNTI Expression 430 bp amplification fragments revealed with the digoxygenin-labeled probe pUC GNTI are observed from 2 hours after infection and up to 48 hours (the point 72 hours was not performed in this experiment) while no amplification product is obtained in the negative controls F8 and F48. The labeling of the positive control T + confirms that these products correspond to the amplification of the 3 'region of the GNTI gene. The negative control T- confirms that the samples show no trace of contaminating DNA.
Expression de GNTII On observe l'amplification par RT PCR d'un fragment de 255 pb à partir d'ARN totaux extraits après 2 heures d'infection et jusqu'à 72 heures. La révélation avec une sonde pUC GNTII confirme que ces produits d'amplification sont bien issus d'ARN GNTII. Expression of GNTII The amplification by RT PCR of a fragment of 255 bp is observed from total RNA extracted after 2 hours of infection and up to 72 hours. The revelation with a pUC GNTII probe confirms that these amplification products are indeed derived from GNTII RNA.
Expression de 01, 4GT Le même type de résultat est obtenu avec la sonde. Des produits d'amplification de 380 pb révélant la présence de transcrit (31,4GT sont observés dès 2 heures post-infection et jusqu'à 72 heures. L'hybridation avec la sonde pBS (31,4GT permet de confirmer que ces produits d'amplification sont issus d'ARN de (31,4GT Que ce soit pour l'étude des transcrits (31,4GT, GNTI ou GNTII, la présence de transcrits est décelée très tôt dans l'infection. Ces résultats confirment que les promoteurs A3, P9 et gp67 sont bien fonctionnels en cellules Sf9 infectées par un baculovirus, et notamment qu'ils sont actifs à des stades précoces de l'infection. Expression of 01, 4GT The same type of result is obtained with the probe. 380 bp amplification products revealing the presence of transcript (31.4GT are observed as early as 2 hours post-infection and up to 72 hours.) Hybridization with the pBS probe (31.4GT confirms that these products amplification are derived from (31,4GT) RNA Whether for the study of transcripts (31,4GT, GNTI or GNTII, the presence of transcripts is detected very early in the infection.These results confirm that A3 promoters , P9 and gp67 are well functional in baculovirus-infected Sf9 cells, and in particular that they are active at early stages of infection.
Expression des chaînes légère et lourde de l'anticorps D'après la littérature, les promoteurs très tardifs PH et P10 sont activés entre 12 à 18 heures post-infection (ROHEL et FAULKNER, J. Gen. Virol. 50: 739-747, 1984). Afin de vérifier que les transcrits GNTI, GNTII et P1,4GT apparaissaient bien avant les chaînes y et K des anticorps, de nouvelles RT PCR ont été réalisées sur les mêmes préparations d'ARN totaux avec des amorces spécifiques Bac 116TCK: 5'-CAGATTTCAACTGCTCATCAGATG-3' (SEQ ID NO: 25) et For 116TVL: 5'-CCGGATTATTCATACCGTC-3' (SEQ ID NO: 26) pour l'amplification de la séquence insérée dans la région PH et les amorces Bac 119CG1: 5'-GAGGTGCTCTTGGAGGAG-3' (SEQ ID NO: 27) et For 119VH: 5'CAGCTTTTGGACGGTTTGC-3' (SEQ ID NO: 28) pour l'amplification de la séquence insérée dans la région P10. Les résultats sont présentés dans la figure 9. Expression of light and heavy chains of the antibody According to the literature, the very late promoters PH and P10 are activated between 12 and 18 hours post-infection (ROHEL and FAULKNER, J. Gen. Virol 50: 739-747, 1984). In order to verify that the GNTI, GNTII and P1,4GT transcripts appeared well before the y and K chains of the antibodies, new RT PCRs were performed on the same total RNA preparations with specific primers. 116TCK Bac: 5'-CAGATTTCAACTGCTCATCAGATG -3 '(SEQ ID NO: 25) and For 116TVL: 5'-CCGGATTATTCATACCGTC-3' (SEQ ID NO: 26) for the amplification of the inserted sequence in the PH region and the primers Bac 119CG1: 5'-GAGGTGCTCTTGGAGGAG -3 '(SEQ ID NO: 27) and For 119VH: 5'CAGCTTTTGGACGGTTTGC-3' (SEQ ID NO: 28) for the amplification of the inserted sequence in the P10 region. The results are shown in Figure 9.
Les échantillons 2 à 72 correspondent aux cellules Sf9 infectées avec le virus DsuG B3003 entre 2 et 72 heures p.i. Les échantillons F8 et F48 sont des témoins négatifs. Ils correspondent aux cellules Sf9 infectées avec le virus DsuF après 8 heures (F8) et 48 heures (F48) p.i. L'échantillon S correspond à un témoin cellules non infectées. SL est le marqueur ADN de taille (Smart Ladder, Eurogentec) Ces résultats montrent que les premiers transcrits chaînes légères et chaînes lourdes n'apparaissent qu'à partir de 12 heures p.i et 4 heures p.i respectivement. Samples 2 to 72 correspond to Sf9 cells infected with DsuG B3003 virus between 2 and 72 hours p.i. Samples F8 and F48 are negative controls. They correspond to Sf9 cells infected with DsuF virus after 8 hours (F8) and 48 hours (F48) p.i. Sample S corresponds to a control uninfected cells. SL is the size DNA marker (Smart Ladder, Eurogentec) These results show that the first transcribed light chains and heavy chains appear only from 12 hours p.i and 4 hours p.i respectively.
II- Production et caractérisation des anticorps recombinants Des cellules Sf9 (densité de 500 000 cellules/ml) ont été infectées en bouteille roulante par le virus DsuF ou le virus DsuG à une MOI de 2 PFU/cellule (2 X 400 ml) dans du milieu sans sérum. Après 5 jours d'infection, les surnageants de culture ont été collectés et les anticorps purifiés sur protéine A Sépharose (Amersham). II-Production and Characterization of the Recombinant Antibodies Sf9 cells (density of 500,000 cells / ml) were infected in a roller bottle with the DsuF virus or the DsuG virus at a MOI of 2 PFU / cell (2 × 400 ml) in medium without serum. After 5 days of infection, the culture supernatants were collected and the antibodies purified on Protein A Sepharose (Amersham).
Deux lots d'anticorps ont été purifiés (i) l'un correspondant à un clone viral obtenu après recombinaison avec de l'ADN du virus DsuF: clone B1601 (anticorps mannosylé ) et (ii) l'autre correspondant à un clone issu de la recombinaison avec de l'ADN de virus DsuG: clone B3003 (anticorps galactosylé ). Two batches of antibodies were purified (i) one corresponding to a viral clone obtained after recombination with DNA of the DsuF virus: clone B1601 (mannosylated antibody) and (ii) the other corresponding to a clone derived from recombination with DsuG virus DNA: clone B3003 (galactosylated antibody).
Caractérisation des anticorps Analyse de la glycosylation de la chaîne lourde de l'anticorps Les chaînes yl et K des anticorps B1601, B3003 et d'une IgGl de référence (Sigma) sont séparées sur gel SDS PAGE 10% en conditions dénaturantes. Characterization of the antibodies Analysis of the glycosylation of the heavy chain of the antibody The yl and K chains of the B1601, B3003 and a reference IgG1 (Sigma) antibodies are separated on SDS PAGE 10% gel under denaturing conditions.
Après transfert sur membrane de nitrocellulose, on effectue un marquage soit avec la lectine ConA (Canavalia ensiformis Agglutinin), spécifique des résidus mannosyl, soit avec la lectine RCAl20 (Riccinus communis Agglutinin), spécifique des résidus galactosyl. After transfer on a nitrocellulose membrane, labeling is carried out either with the ConA lectin (Canavalia ensiformis Agglutinin), specific for the mannosyl residues, or with the lectin RCAl20 (Riccinus communis Agglutinin), specific for the galactosyl residues.
Ce marquage est effectué selon le protocole suivant: la membrane est saturée dans un bain de Polyvinylpyrolidone K30 (Aldrich) à 2% dans le tampon TBS (Tris-HC1 50mM, NaCl 0,15M, pH 7,5) pendant 2 heures. Deux lavages de 5 minutes dans le tampon TBS suivi d'un lavage dans le tampon 1 (TBS + 1mM MgC12, 1mM MnC12, 1mM CaC12, pH 7,5) sont effectués avant une incubation d'une heure de la lectine couplée à la digoxygénine et diluée dans le tampon 1 à lpg/ml (RCAl20, ConA, SNA (Roche) cf tableau cidessous pour leur spécificité). Après trois lavages de 5 minutes, un nouveau blocage des sites non spécifiques est entrepris avec une solution de Blocking Reagent (Roche) à 0,5% dans le TBS. Une incubation d'une heure en présence du fragment Fab anti-digoxygénine couplé à la phosphatase alcaline (Roche) est effectuée suivie d'une série de trois lavages et d'une pré-incubation de 5 minutes dans le tampon 2 (Tris-HC1 0, 1M; MgC12 50mM; NaCl 0,1M, pH 9,5). La révélation s'effectue sous agitation, par action d'une solution de 50pl de NBT (75 mg 4-Nitro blue Tretrazolium chloride/ml diméthylformamide) et de 37,5 pl de X-phosphate (50 mg de 5-bromo-4-chloro-3indolyl-phosphate/ml diméthylformamide) dans 10ml de tampon 2. This labeling is carried out according to the following protocol: the membrane is saturated in a bath of polyvinylpyrrolidone K30 (Aldrich) at 2% in TBS buffer (50 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.5) for 2 hours. Two washes of 5 minutes in TBS buffer followed by washing in buffer 1 (TBS + 1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 1mM CaCl2, pH 7.5) are performed before a one-hour incubation of the lectin coupled to the digoxygenin and diluted in buffer 1 to 1 μg / ml (RCAl20, ConA, SNA (Roche) cf table below for their specificity). After three washes of 5 minutes, a new block of non-specific sites is undertaken with a solution of Blocking Reagent (Roche) at 0.5% in TBS. A one-hour incubation in the presence of the anti-digoxigenin Fab fragment coupled with alkaline phosphatase (Roche) is performed followed by a series of three washes and a 5-minute preincubation in buffer 2 (Tris-HCl). 0.1M, 50mM MgCl 2, 0.1M NaCl, pH 9.5). The revelation is carried out with stirring, by the action of a solution of 50 μl of NBT (75 mg 4-nitro blue tretrazolium chloride / ml dimethylformamide) and 37.5 μl of X-phosphate (50 mg of 5-bromo-4 3-chloroindolyl phosphate / ml dimethylformamide) in 10 ml of buffer 2.
Les résultats sont illustrés par la figure 10: (1) : IgGl de référence; (2) anticorps B1601 (3) anticorps B3003; A: Marquage à la RCAl20 des résidus terminaux (3 galactosyl greffés sur l'Asp297 de la région Fc des IgGl. B: Marquage à la ConA des résidus manosyl greffés sur l'Asp297 de la région Fc des IgGl. The results are illustrated in Figure 10: (1): Reference IgG1; (2) antibody B1601 (3) antibody B3003; A: RCAl20 labeling of the end residues (3 galactosyl grafted on Asp297 of the Fc region of IgG1 B: ConA labeling of manosyl residues grafted onto Asp297 of the Fc region of IgG1.
Ces résultats montrent que le marquage à la lectine RCAl20 de la chaîne lourde de chaque anticorps permet de détecter la présence de résidus galactosyl terminaux uniquement sur l'anticorps B3003 et sur l'IgGl de référence, alors que le marquage par la lectine ConA, spécifique des résidus mannosyl, a été observé sur les trois anticorps. These results show that the RCAl20 lectin labeling of the heavy chain of each antibody makes it possible to detect the presence of galactosyl end residues solely on the B3003 antibody and on the reference IgG1, whereas the labeling by the ConA lectin, specific mannosyl residues, was observed on all three antibodies.
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