FR2890743A1 - METHOD OF ASSAYING PRIMARY AMINES WITH VERY LOW CONCENTRATION - Google Patents
METHOD OF ASSAYING PRIMARY AMINES WITH VERY LOW CONCENTRATION Download PDFInfo
- Publication number
- FR2890743A1 FR2890743A1 FR0509209A FR0509209A FR2890743A1 FR 2890743 A1 FR2890743 A1 FR 2890743A1 FR 0509209 A FR0509209 A FR 0509209A FR 0509209 A FR0509209 A FR 0509209A FR 2890743 A1 FR2890743 A1 FR 2890743A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- reagent
- labeling
- primary amines
- marking
- primary
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 108
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 62
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 52
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 48
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 7
- ZIPLKLQPLOWLTM-UHFFFAOYSA-N naphthalene-2,3-dicarbaldehyde Chemical compound C1=CC=C2C=C(C=O)C(C=O)=CC2=C1 ZIPLKLQPLOWLTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 48
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 29
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 23
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 12
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 8
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- SESSRFZDDUZRQV-UHFFFAOYSA-N anthracene-1,2-dicarbaldehyde Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=C(C=O)C(C=O)=CC=C3C=C21 SESSRFZDDUZRQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 claims description 4
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 claims description 3
- -1 SO4H Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical group NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000003335 secondary amines Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims description 3
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002518 isoindoles Chemical class 0.000 claims 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 24
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 5
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 26
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N thiohydroxylamine Chemical compound SN RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 13
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 108010042237 Methionine Enkephalin Proteins 0.000 description 12
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 12
- YFGBQHOOROIVKG-BHDDXSALSA-N (2R)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[(2S)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 YFGBQHOOROIVKG-BHDDXSALSA-N 0.000 description 11
- 102400000988 Met-enkephalin Human genes 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 9
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 9
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 9
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 9
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 9
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 9
- 108010022337 Leucine Enkephalin Proteins 0.000 description 8
- URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N leu-enkephalin Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1CC(N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 125000005365 aminothiol group Chemical group 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001437 electrospray ionisation time-of-flight quadrupole detection Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102100031680 Beta-catenin-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 3
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000993469 Homo sapiens Beta-catenin-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 3
- 125000004431 deuterium atom Chemical group 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- 108010092674 Enkephalins Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 125000000904 isoindolyl group Chemical class C=1(NC=C2C=CC=CC12)* 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- GDTSJMKGXGJFGQ-UHFFFAOYSA-N 3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 GDTSJMKGXGJFGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 1
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- YFGBQHOOROIVKG-FKBYEOEOSA-N Met-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 YFGBQHOOROIVKG-FKBYEOEOSA-N 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 102400001103 Neurotensin Human genes 0.000 description 1
- 101800001814 Neurotensin Proteins 0.000 description 1
- 208000003028 Stuttering Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000002045 capillary electrochromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003981 capillary liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5 Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)OC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=CC=C1 CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 1
- 238000000175 multiple-ion monitoring Methods 0.000 description 1
- 238000010844 nanoflow liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- WMPJPAMWRAOQSU-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1,2-dicarbaldehyde Chemical compound C1=CC=CC2=C(C=O)C(C=O)=CC=C21 WMPJPAMWRAOQSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N neurotensin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002553 single reaction monitoring Methods 0.000 description 1
- 238000001877 single-ion monitoring Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004354 sulfur functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6812—Assays for specific amino acids
- G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
L'invention se rapporte à un procédé de marquage d'entités portant une fonction amine primaire consistant essentiellement à faire réagir en une étape lesdites amines primaires avec : - un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec lesdites amines primaires, et - un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé.L'amine primaire à analyser, le réactif colorant (F) et le réactif de substitution (S) réagissent en une étape, avec un rendement réactionnel proche de 100%. Les composés obtenus sont fluorescents et donnent par ionisation une fragmentation préférentielle facilement identifiable en spectrométrie de masse.L'invention permet aussi bien le dosage quantitatif que la détermination structurale des molécules aminées présentes en faible concentration dans les fluides biologiques, en particulier des protéines et des peptides. Elle permet également de comparer directement les profils protéiques ou peptidiques des deux milieux par le dosage simultané des amines primaires présentes dans ces deux milieux, en une seule série de mesures sur un échantillon unique.Sont également revendiqués un kit de marquage et un procédé d'analyse des amines primaires.The invention relates to a method for labeling entities carrying a primary amine function essentially consisting in reacting in one step said primary amines with: a reagent (F) capable of forming a fluorescent compound with said primary amines, and a reagent (S) capable of substituting the reagent (F) with an ionizable group and forming a major ion by fragmentation of said compound. The primary amine to be analyzed, the dye reagent (F) and the substitution reagent (S) react in one step, with a reaction yield close to 100%. The compounds obtained are fluorescent and give by ionization a preferential fragmentation easily identifiable by mass spectrometry. The invention makes it possible both for the quantitative determination and the structural determination of the amine molecules present in low concentration in biological fluids, in particular proteins and proteins. peptides. It also makes it possible to directly compare the protein or peptide profiles of the two media by the simultaneous determination of the primary amines present in these two media, in a single series of measurements on a single sample. A marking kit and a method for producing the same are also claimed. analysis of primary amines.
Description
MÉTHODE DE DOSAGE DES AMINES PRIMAIRESMETHOD OF ASSAYING PRIMARY AMINES
À TRÈS FAIBLE CONCENTRATION La présente invention appartient au domaine de l'analyse chimique de haute sensibilité des molécules aminées présentes dans les fluides biologiques, en particulier des protéines et des peptides. The present invention belongs to the field of high sensitivity chemical analysis of amino molecules present in biological fluids, in particular proteins and peptides.
Plus précisément l'invention se rapporte à un kit et une méthode de marquage des amines primaires dans des échantillons complexes tels que des échantillons issus de milieux biologiques. L'invention permet d'identifier et de doser des amines à des concentrations très faibles dans des échantillons de très petite taille. L'invention permet aussi de détecter et de quantifier les amines primaires de façon simple, rapide et précise. Grâce à l'excellente sélectivité de la méthode sur laquelle elle repose, l'invention permet notamment de distinguer les différentes amines primaires d'un même échantillon, mais aussi d'identifier les amines primaires identiques présentes dans des échantillons différents. More specifically, the invention relates to a kit and a method for labeling primary amines in complex samples such as samples from biological media. The invention makes it possible to identify and assay amines at very low concentrations in very small samples. The invention also makes it possible to detect and quantify primary amines simply, quickly and accurately. Thanks to the excellent selectivity of the method on which it is based, the invention makes it possible in particular to distinguish the different primary amines of the same sample, but also to identify the identical primary amines present in different samples.
L'étude des fluides biologiques rend indispensable la séparation et la détection de molécules en très faible concentration, c'est-à-dire à des concentrations micromolaires, nanomolaires voire picomolaires. Les méthodes de séparation de ces molécules sont maintenant bien établies. Elles reposent toutes sur les techniques de chromatographie liquide (ou LC) telles que la chromatographie HPLC, la chromatographie liquide capillaire, la nano-LC, ou sur les techniques d'électrophorèse (électrophorèse capillaire de zone, chromatographie micellaire électrocinétique, électrochromatographie capillaire, l'électrophorèse sur veine liquide). Par contre, les méthodes de détection et de dosage à ces très faibles concentrations sont beaucoup moins développées, ce qui constitue un limite importante à la progression des connaissances et à la mise au point de nouvelles méthodes thérapeutiques. The study of biological fluids makes the separation and the detection of molecules in very low concentration, that is to say at micromolar, nanomolar or even picomolar concentrations indispensable. The methods of separating these molecules are now well established. They are all based on liquid chromatography (LC) techniques such as HPLC, capillary liquid chromatography, nano-LC, or on electrophoresis techniques (capillary electrophoresis zone, electrokinetic micellar chromatography, capillary electrochromatography, electrophoresis). electrophoresis on liquid vein). On the other hand, the methods of detection and dosing at these very low concentrations are much less developed, which constitutes an important limit to the progression of knowledge and to the development of new therapeutic methods.
On sait que la protéomique étudie l'ensemble des protéines présentes dans un organisme. Elle peut avoir par exemple pour objet d'étudier l'expression génique en se fondant sur le profil protéique d'une cellule ou plus largement d'un système biologique. On peut aussi chercher à établir une comparaison entre cellules normales et de cellules anormales, afin de connaître quelles sont les protéines dont les proportions varient entre un organisme sain et un organisme malade. Une telle comparaison permet d'identifier certaines protéines comme cibles thérapeutiques et d'élaborer de nouveaux médicaments. Proteomics is known to study all the proteins present in an organism. It may for example be designed to study gene expression based on the protein profile of a cell or more broadly a biological system. One can also seek to establish a comparison between normal cells and abnormal cells, to find out which proteins vary in proportions between a healthy organism and a sick organism. Such a comparison makes it possible to identify certain proteins as therapeutic targets and to develop new drugs.
Pour ce faire, des méthodes de séparation telles que l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel haute résolution sont employées. Puis, un travail d'identification des protéines est nécessaire ainsi qu'une étude quantitative des protéines identifiées (c'est ce qu'on appelle la protéomique quantitative). A l'heure actuelle on utilise communément deux méthodes d'analyse, à savoir la spectrométrie de masse (MS), et l'électrophorèse sur gel, avec la méthode appelée DIGE pour DIfferential Gel Electrophoresis (Somiari R.I., Somiari S., Russell S., Shriver C.D., J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2005; 815, pp. 21525.), associée à la fluorimétrie classique ou la fluorimétrie induite par laser (LIF). To do this, separation methods such as two-dimensional gel electrophoresis on high resolution gel are employed. Then, a work of identification of the proteins is necessary as well as a quantitative study of the identified proteins (this is called quantitative proteomics). At the present time two methods of analysis are commonly used, namely mass spectrometry (MS), and gel electrophoresis, with the method called DIGE for DIfferential Gel Electrophoresis (Somiari RI, Somiari S., Russell S , Shriver, CD, J. Chromatogr, B. Analyt, Technol, Biomed, Life Sci., 2005, 815, pp. 21525.), associated with conventional fluorimetry or laser-induced fluorimetry (LIF).
La peptidomique est quant à elle une discipline encore balbutiante, mais qui connaît un succès grandissant en marge de la protéomique (Svensson M., Skold K., Svenningsson P., Andren P.E., J. Proteome Res., 2003, 2, pp. 213-9). Elle a pour objet de doser de manière relative et absolue les peptides contenus dans un milieu. Une de ses applications est, par exemple, en neurochimie, la mesure dans des microdialysats de cerveaux de rats, de la variation en fonction du temps de la concentration de différents neuropeptides (substance P, neurotensine, angiotensine, ...). Il s'agit là d'analyser un grand nombre d'échantillons de faible volume (de l'ordre du pl) contenant des peptides, connus ou inconnus, ainsi que d'autres amines telles que des acides aminés et des catécholamines, ces molécules étant présentes à des concentrations nanomolaires. Il faut donc avoir recours à des méthodes de séparation et de détection qualitatives et quantitatives performantes en terme de sélectivité et de sensibilité. Les microtechniques de séparation telles que la HPLC, la nanoLC, l'électrophorèse capillaire, sont adaptées à ces petits volumes d'échantillons et sont en principe susceptibles d'être associées à la spectrométrie de masse et à la fluorimétrie. Peptidomic is still a stammering discipline, but one that is enjoying growing success on the fringes of proteomics (Svensson M., Skold K., Svenningsson P., Andren PE, J. Proteome Res., 2003, 2, pp. 213-9). Its purpose is to dose relative and absolute peptides contained in a medium. One of its applications is, for example, in neurochemistry, the measurement in microdialysates of rat brains, of the variation as a function of time of the concentration of different neuropeptides (substance P, neurotensin, angiotensin, etc.). This is to analyze a large number of low-volume samples (of the order of the pl) containing peptides, known or unknown, as well as other amines such as amino acids and catecholamines, these molecules being present at nanomolar concentrations. It is therefore necessary to use qualitative and quantitative separation and detection methods that are efficient in terms of selectivity and sensitivity. Separation microtechniques such as HPLC, nanoLC, capillary electrophoresis, are adapted to these small sample volumes and are in principle likely to be associated with mass spectrometry and fluorimetry.
Qu'ils soient dédiés à la protéomique ou à la peptidomique, les dosages quantitatifs peuvent être réalisés soit par fluorimétrie soit par spectrométrie de masse tandis que la détermination de la structure des molécules est réalisée par spectrométrie de masse. Ces deux techniques d'analyse sont donc complémentaires et doivent être réalisées de concert pour disposer de données complètes. Dans les deux cas, les molécules à étudier doivent être marquées avant de pouvoir être détectées. Whether dedicated to proteomics or peptidomics, quantitative assays can be performed either by fluorimetry or mass spectrometry, while the determination of the structure of the molecules is carried out by mass spectrometry. These two analysis techniques are therefore complementary and must be performed in concert to have complete data. In both cases, the molecules to be studied must be labeled before they can be detected.
Dans la technique de DIGE/fluorescence, on utilise des marqueurs caractérisés par leurs propriétés de fluorescence tels que des cyanines, les marqueurs pouvant être excitées respectivement à 532 nm et à 633 nm (par exemple les marqueurs Cy3 et Cy5 commercialisés par Pharmacia). Pour comparer des protéines issues d'organismes différents (par exemple l'un sain et l'autre malade), on utilise une paire de marqueurs fluorescents excitables (et donc émettant) à des longueurs d'onde distinctes, communément les colorants Cy3 et Cy5. La comparaison des intensités des signaux de fluorescence donne la concentration relative pour la même protéine entre l'organisme sain et l'organisme anormal. La fluorimétrie et la fluorimétrie induite par laser (LIF) sont maintenant bien maîtrisées pour permettre la détection de molécules fluorescentes à très faibles concentrations (Somiari, id.). In the DIGE / fluorescence technique, markers characterized by their fluorescence properties such as cyanines are used, the markers being able to be excited respectively at 532 nm and at 633 nm (for example the markers Cy3 and Cy5 marketed by Pharmacia). To compare proteins from different organisms (for example, one healthy and the other sick), a pair of fluorescent (and thus emitting) fluorescent markers are used at different wavelengths, commonly Cy3 and Cy5 dyes. . The comparison of the intensities of the fluorescence signals gives the relative concentration for the same protein between the healthy organism and the abnormal organism. Fluorometry and laser-induced fluorimetry (LIF) are now well controlled to allow the detection of fluorescent molecules at very low concentrations (Somiari, id.).
Dans les techniques de spectrométrie de masse, on utilise des marqueurs isotopiques non radioactifs, c'est à dire des marqueurs différant uniquement par leur masse, leur formule chimique restant identique. Dans un des deux marqueurs, n atomes de deutérium ont pris la place de n atomes d'hydrogène, la différence de masse entre les deux marqueurs étant donc égale à n. Le même principe peut être réalisé en remplaçant des atomes de carbone C12 avec du carbone lourd C13. In the mass spectrometry techniques, non-radioactive isotopic markers are used, that is to say markers differing only in their mass, their chemical formula remaining identical. In one of the two markers, n deuterium atoms have taken the place of n hydrogen atoms, the difference in mass between the two markers therefore being equal to n. The same principle can be achieved by replacing C12 carbon atoms with C13 heavy carbon.
Par exemple pour étudier deux populations différentes de protéines en spectrométrie de masse, on associe chaque population à un des marqueurs. Dans le spectre de masse, la fragmentation des molécules aboutit à la formation de certains ions caractéristiques des marqueurs et des molécules étudiées. Les pics correspondant à des ions qui différent de n unités de masse sont repérés et leur intensité relative représente la proportion d'une protéine donnée dans chaque population. On peut ainsi effectuer des comparaisons relatives entre les populations protéiques de cellules ou d'organes sains et anormaux. Les données de spectrométrie de masse permettent ainsi de reconstituer la structure des molécules. For example, to study two different populations of proteins in mass spectrometry, each population is associated with one of the markers. In the mass spectrum, the fragmentation of the molecules leads to the formation of certain ions characteristic of the markers and molecules studied. Peaks corresponding to ions that differ from n mass units are identified and their relative intensity represents the proportion of a given protein in each population. Relative comparisons can be made between protein populations of healthy and abnormal cells or organs. The mass spectrometry data thus make it possible to reconstitute the structure of the molecules.
On peut aussi utiliser la spectrométrie de masse pour la réalisation des dosages quantitatifs, à condition de disposer d'un étalon interne isotopique, c'est-à-dire de la même molécule que celle qui est étudiée, mais marquée isotopiquement avec plusieurs atomes de deutérium ou de C13. De la sorte, d'une part la molécule à doser et son étalon isotopique interne peuvent être obtenus dans les mêmes conditions par les techniques de séparation chimique (par co-migration en chromatographie liquide ou par les techniques électrophorétiques), et d'autre part, en revanche ils peuvent être identifiés et distingués sur le spectre de masse, grâce à leur différence de masse moléculaire. Mass spectrometry can also be used for carrying out quantitative assays, provided that an isotopic internal standard is available, that is to say of the same molecule as that studied, but isotopically labeled with several atoms. deuterium or C13. In this way, on the one hand the molecule to be assayed and its internal isotopic standard can be obtained under the same conditions by chemical separation techniques (by co-migration in liquid chromatography or by electrophoretic techniques), and secondly on the other hand, they can be identified and distinguished on the mass spectrum, thanks to their difference in molecular weight.
Aujourd'hui la méthode de spectrométrie de masse faisant appel à un étalon interne la plus utilisée pour la protéomique quantitative est la méthode dite ICAT pour "Isotope-Coded Affinity Tag" (Gygi S.P., Rist B., Griffin T.J., Eng J., Aebersold R., J. Proteome Res. 2002, 1, pp. 47-54). Cependant, cette méthode présente un certain nombre d'inconvénients. D'une part, la réaction d'association avec le marqueur ICAT n'est jamais totale, ce qui est un problème en soit, mais aussi implique une étape de purification de l'échantillon avant le passage en MS pour éliminer les molécules non marquées. Par ailleurs, du fait de la faible réactivité chimique des marqueurs ICATs, elle ne permet pas de doser les molécules à faible concentration (nanomolaire). En outre, ce type de marqueurs ne réagit que sur les groupements thiols des cystéines. Today, the mass spectrometry method using an internal standard most used for quantitative proteomics is the so-called ICAT method for "Isotope-Coded Affinity Tag" (SP Gygi, Rist B., Griffin TJ, Eng J., Aebersold R., J. Proteome Res., 2002, 1, pp. 47-54). However, this method has a number of disadvantages. On the one hand, the association reaction with the ICAT marker is never complete, which is a problem in itself, but also involves a step of purifying the sample before switching to MS to remove unmarked molecules . Moreover, because of the low chemical reactivity of ICATs markers, it does not allow the determination of molecules at low concentration (nanomolar). In addition, this type of marker reacts only on the thiol groups of the cysteines.
Plus généralement, une autre limitation importante des méthodes de dosage par spectrométrie de masse est qu'en pratique, il n'est pas toujours possible de disposer d'un étalon isotopique interne car cela nécessite de réaliser une synthèse avec des isotopes lourds des composés à doser. Aussi une méthode a-t-elle été proposée, consistant à dériver les composés avec un groupement contenant lui-même des isotopes lourds. Par exemple la demande de brevet US 2003 0054570 propose de modifier les cystéines par des composés contenant un groupement arginine et pouvant se lier à la fonction thiol des cystéines grâce à une chaîne carbonée contenant des isotopes légers ou lourds. Dans la demande US 2003 0087322, le marqueur peut contenir différents isotopes lourds et possède une fonction ayant une affinité biologique donnée permettant d'isoler sélectivement les molécules dérivées sur colonne d'affinité. More generally, another important limitation of mass spectrometry assay methods is that in practice it is not always possible to have an internal isotopic standard since this requires a synthesis with heavy isotopes of the compounds to be made. assayed. Also a method has been proposed, consisting in deriving the compounds with a group containing itself isotopes heavy. For example, patent application US 2003 0054570 proposes to modify the cysteines by compounds containing an arginine group and capable of binding to the thiol function of cysteines by means of a carbon chain containing light or heavy isotopes. In the application US 2003 0087322, the marker may contain different heavy isotopes and has a function having a given biological affinity for selectively isolating the molecules derived on an affinity column.
Néanmoins, ces marqueurs isotopiques souffrent tous d'un déficit de réactivité et ne permettent pas de doser des molécules en très faible concentration. Ils demandent un protocole de préparation long et délicat. D'autres marqueurs isotopiques ont été décrits dans la littérature, mais tous sont limités quant à la sensibilité à atteindre. De telles méthodes ne s'adressent au demeurant qu'à certaines familles chimiques et fournissent donc des résultats partiels sur le protéome ou le peptidome étudié. Nevertheless, these isotopic markers all suffer from a lack of reactivity and do not allow the determination of molecules in very low concentration. They ask for a long and delicate preparation protocol. Other isotopic markers have been described in the literature, but all are limited as to the sensitivity to be achieved. Such methods are only intended for certain chemical families and therefore provide partial results on the proteome or peptidome studied.
Comme déjà indiqué, les dosages quantitatifs sont réalisés soit par fluorimétrie soit par spectroscopie de masse, tandis que la détermination de la structure des molécules est réalisée par spectroscopie de masse, ces deux techniques d'analyse complémentaires devant être réalisées ensemble pour disposer de données utiles complètes. Or, outre les inconvénients précédemment exposés, elles sont longues et complexes à mettre en oeuvre et rien n'existe pour mener ce travail en régime de routine. En particulier, l'emploi de marqueurs spécifiques, chacun étant susceptible d'être détecté par une technique, augmente encore la lourdeur du travail préparatoire des analyses. As already indicated, the quantitative assays are carried out either by fluorimetry or by mass spectroscopy, whereas the determination of the structure of the molecules is carried out by mass spectroscopy, these two complementary analysis techniques having to be carried out together in order to have useful data complete. However, in addition to the previously mentioned disadvantages, they are long and complex to implement and nothing exists to carry out this work in routine mode. In particular, the use of specific markers, each of which is likely to be detected by a technique, further increases the cumbersome preparatory work of the analyzes.
Pour éviter ce problème, il a été proposé de réaliser un marquage à l'aide d'un colorant de fluorescence lui-même dérivé par un groupement fonctionnel détectable après fragmentation en spectrométrie de masse. Le marqueur fluorogène utilisé est le naphthalène 2,3 dialdéhyde (NDA), marqueur bien connu pour réagir avec les amines primaires en donnant des composés fluorescents. Celui-ci est dérivé, selon la méthode retenue, soit par un ion cyanure, soit par un groupement 13-mercaptoéthanol. To avoid this problem, it has been proposed to carry out a labeling using a fluorescence dye itself derived by a detectable functional group after fragmentation in mass spectrometry. The fluorogenic marker used is 2,3-naphthalene dialdehyde (NDA), a well-known marker for reacting with primary amines to give fluorescent compounds. This is derived, depending on the method chosen, either by a cyanide ion, or by a 13-mercaptoethanol group.
Cependant, sur les peptides, la réaction de marquage utilisant le NDA et le cyanure n'est pas totale. Le cyanure réagit lentement et incomplètement avec le NDA. Ceci conduit à un taux de substitution médiocre et à des résultats d'analyse biaisés: l'analyse quantitative est difficile, et en outre des espèces en faible concentration peuvent tout simplement ne pas être identifiées. However, on the peptides, the labeling reaction using NDA and cyanide is not complete. Cyanide reacts slowly and incompletely with NDA. This leads to poor substitution rates and biased analytical results: quantitative analysis is difficult, and low concentration species may simply not be identified.
Le groupe CN présente au demeurant des risques liés à sa toxicité lors des manipulations, et il est de toutes façons d'un intérêt très limité. D'une part il ne peut pas fournir un marqueur isotopique car un seul atome de carbone pourrait être remplacé, ce qui est insuffisant pour obtenir des résultats interprétables en spectrométrie de masse. D'autre part, contrairement aux marqueurs de la présente invention, on ne peut pas modifier sa structure par dérivation pour avoir deux marqueurs différents utilisables dans la même analyse, l'un pouvant par exemple servir à fournir un étalon interne. The CN group also has risks related to its toxicity during handling, and is in any case of very limited interest. On the one hand it can not provide an isotopic label because only one carbon atom could be replaced, which is insufficient to obtain interpretable results in mass spectrometry. On the other hand, unlike the markers of the present invention, one can not change its structure by derivation to have two different markers usable in the same analysis, one may for example be used to provide an internal standard.
En ce qui concerne le 13-mercaptoéthanol, les possibilités de substitutions isotopiques sont encore extrêmement réduites, tout comme les possibilités de dérivation. De plus, le rendement d'ionisation de l'espèce marquée avec le 13-mercaptoéthanol est faible. On évite de au demeurant autant que possible son emploi du fait de sa forte et désagréable odeur. Ainsi, à l'heure actuelle, ces méthodes n'ont pas donné de résultats probants, ni apporté d'amélioration notable en spectrométrie de masse. With regard to 13-mercaptoethanol, the possibilities for isotopic substitution are still extremely limited, as are the possibilities of derivation. In addition, the ionization efficiency of the labeled species with 13-mercaptoethanol is low. It avoids as much as possible its use because of its strong and unpleasant odor. Thus, at present, these methods have not given convincing results, nor brought significant improvement in mass spectrometry.
La présente invention a pour but de remédier à ces inconvénients. Plus précisément, un objectif de la présente invention est de disposer de moyens de marquage moléculaire permettant aussi bien le dosage quantitatif que la détermination structurale des entités étudiées. Un second objectif de la présente invention est de disposer d'un marqueur de haute réactivité chimique autorisant l'analyse de substances biologiques en concentration micromolaire ou moindre encore. Un autre objectif de la présente invention est de disposer d'une méthode de grandes sélectivité et sensibilité vis-à-vis des molécules cibles. Un objectif de l'invention est aussi de permettre le dosage de la plus grande partie des molécules représentatives du profil protéique ou peptidique d'un milieu étudié, à savoir celles portant une fonction amine primaire. Encore un autre objectif de l'invention est de pouvoir réaliser le dosage simultané des amines primaires présentes dans deux milieux d'origine différente, par une seule série de mesures réalisée sur un échantillon unique, pour comparer directement les profils protéiques ou peptidiques des deux milieux. The present invention aims to overcome these disadvantages. More specifically, an object of the present invention is to provide molecular marking means for both the quantitative determination and the structural determination of the entities studied. A second objective of the present invention is to have a high chemical reactivity label allowing the analysis of biological substances in micromolar concentration or less. Another object of the present invention is to have a method of high selectivity and sensitivity vis-à-vis the target molecules. An objective of the invention is also to allow the assay of most of the molecules representative of the protein or peptide profile of a medium studied, namely those carrying a primary amine function. Yet another object of the invention is to be able to perform the simultaneous determination of the primary amines present in two media of different origin, by a single series of measurements carried out on a single sample, to directly compare the protein or peptide profiles of the two media. .
Ce but est atteint d'une part grâce à un procédé et à un kit de marquage des amines primaires et d'autre part grâce à un procédé d'analyse des amines primaires, objets de l'invention. This object is achieved firstly by a method and a marking kit for primary amines and secondly by a method for analyzing primary amines, objects of the invention.
Plus précisément l'invention se rapporte à un procédé de marquage d'entités portant une fonction amine primaire (N) en vue de leur analyse quantitative et structurale consistant essentiellement à faire réagir en une étape lesdites amines primaires avec: - un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec lesdites amines primaires, et - un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. More specifically, the invention relates to a method for labeling entities bearing a primary amine function (N) for quantitative and structural analysis consisting essentially of reacting in one step said primary amines with: - a reagent (F) capable of forming a fluorescent compound with said primary amines, and - a reagent (S) capable of substituting the reagent (F) with an ionizable group and forming a major ion by fragmentation of said compound.
Un autre objet de l'invention est un kit comprenant au moins: - un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec les amines primaires (N), - un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. Another subject of the invention is a kit comprising at least: a reagent (F) capable of forming a fluorescent compound with the primary amines (N), a reagent (S) capable of substituting the reagent (F) with a ionizable group and forming a major ion by fragmentation of said compound.
Les trois composants, à savoir l'amine primaire à analyser, le réactif colorant (F) et le réactif de substitution (S) réagissent en une étape, avec un rendement réactionnel proche de 100%. Les composés obtenus sont fluorescents. Ils donnent par ionisation une fragmentation préférentielle résultant en la perte de la chaîne latérale apportée par le réactif de substitution (S) facilement identifiable en spectrométrie de masse. Cette fragmentation très spécifique permet par exemple de réaliser des expériences de suivi dans le temps de la fragmentation unique ou multiple ("single réaction monitoring" ou "multiple réaction monitoring") très efficaces, sélectives et sensibles. The three components, namely the primary amine to be analyzed, the dye reagent (F) and the substitution reagent (S) react in one step, with a reaction yield close to 100%. The compounds obtained are fluorescent. They give by ionization a preferential fragmentation resulting in the loss of the side chain provided by the substitution reagent (S) easily identifiable in mass spectrometry. This very specific fragmentation makes it possible, for example, to carry out monitoring experiments in the time of single or multiple fragmentation ("single reaction monitoring" or "multiple reaction monitoring") that are very efficient, selective and sensitive.
Il a pu être développé également sur la base du procédé de marquage et du kit selon l'invention, un procédé d'analyse des amines primaires, de haute sensibilité, fiable, rapide et facile à mettre en oeuvre, destiné à l'étude des peptides et des protéines ou encore des acides aminés, contenus dans de très faibles volumes et/ou à très faibles concentrations, à la fois en termes quantitatifs (dosage) et en termes de structure (identification). It has also been possible to develop, on the basis of the marking method and of the kit according to the invention, a method for the analysis of primary amines, of high sensitivity, which is reliable, fast and easy to implement, intended for the study of peptides and proteins or even amino acids, contained in very small volumes and / or at very low concentrations, both quantitatively (dosage) and in terms of structure (identification).
Certains des colorants de fluorimétrie utilisables en tant que marqueurs des amines primaires dans la présente invention sont déjà connus. Cependant, ces marqueurs de fluorescence n'ont été utilisés jusqu'à présent que pour une détermination quantitative de molécules connues (par comparaison à un étalon), l'émission à la longueur d'onde de fluorescence étant proportionnelle à la concentration dans l'échantillon. L'utilisation de ce type de réactifs est proposée ici pour l'étude à la fois quantitative et structurale des amines primaires, en vue d'une identification complète de molécules d'intérêt. Ce résultat particulièrement intéressant est obtenu notamment grâce à la dérivation de ces molécules fluorogènes par des groupements ionisables, rendant ainsi ces marqueurs utilisables pour le dosage en spectrométrie de masse des très faibles concentrations d'amines primaires. On obtient alors un marqueur binaire associé à la molécule cible, les produits de réaction étant détectables tels quels par deux méthodes d'analyse distinctes, même à des concentrations micromolaires, voire nanomolaires. Some of the fluorimetric dyes usable as markers of primary amines in the present invention are already known. However, these fluorescence markers have been used until now only for a quantitative determination of known molecules (as compared to a standard), the emission at the fluorescence wavelength being proportional to the concentration in the sample. The use of this type of reagent is proposed here for the quantitative and structural study of primary amines, for a complete identification of molecules of interest. This particularly interesting result is obtained in particular by virtue of the derivation of these fluorogenic molecules by ionizable groups, thus making these markers usable for mass spectrometric determination of the very low concentrations of primary amines. A binary marker associated with the target molecule is then obtained, the reaction products being detectable as such by two distinct methods of analysis, even at micromolar or even nanomolar concentrations.
En effet, de manière inattendue, la réaction des amines primaires avec le marqueur binaire selon l'invention présente un rendement et une spécificité excellents, la totalité des amines primaires et elles seules réagissant avec les réactifs de marquage. Les techniques d'analyse employées montrent également une sensibilité exceptionnelle vis-à-vis des amines marquées selon l'invention, ce qui permet d'atteindre le résultat souhaité. Sans chercher à fournir une théorie explicative à l'effet synergique observé, l'hypothèse peut être formulée que la présence d'un réactif apportant un groupement ionisable favorise l'association des trois composants amine primaire-réactif fluorogène-réactif de substitution. Il semble même que la présence de l'amine soit décisive pour la fixation du réactif de substitution ionisable sur le réactif fluorogène. Indeed, unexpectedly, the reaction of the primary amines with the binary marker according to the invention has excellent yield and specificity, all of the primary amines and they alone reacting with the labeling reagents. The analytical techniques employed also show exceptional sensitivity to labeled amines according to the invention, which makes it possible to achieve the desired result. Without seeking to provide an explanatory theory for the observed synergistic effect, the hypothesis can be formulated that the presence of a reagent providing an ionizable group promotes the combination of the three components primary amine-fluorogenic reactant-substitution reagent. It even seems that the presence of the amine is decisive for the fixation of the ionizable substitution reagent on the fluorogenic reagent.
Dans la description qui va suivre et sauf indication contraire explicite, l'invention s'étendra à toute entité portant une fonction amine primaire, c'est-à-dire aussi bien aux protéines, aux peptides et aux acides aminés, qu'à d'autres molécules portant une telle fonction pouvant exister dans un milieu, biologique ou non, à étudier. La fonction amine primaire est une des fonctions les plus répandues parmi les molécules biologiques. Cette prévalence est mise à profit par la présente invention, qui a ainsi pour objet un procédé de dosage des amines primaires, destiné à l'étude des entités aminées. In the following description and unless explicitly stated otherwise, the invention will extend to any entity carrying a primary amine function, that is to say as well to proteins, peptides and amino acids, as to other molecules bearing such a function can exist in a medium, biological or not, to study. The primary amine function is one of the most common functions among biological molecules. This prevalence is exploited by the present invention, which thus relates to a method for determining primary amines, intended for the study of amino species.
Dans le procédé et le kit selon l'invention, le réactif (F) correspond à une molécule capable de former un composé fluorescent avec les amines primaires. In the method and the kit according to the invention, the reagent (F) corresponds to a molecule capable of forming a fluorescent compound with the primary amines.
Le réactif (F) est de préférence un dialdéhyde aromatique fluorogène, qui peut être choisi avantageusement parmi les alpha-dialdéhydes aromatiques donnant des dérivés fluorescents de la famille des isoindoles. De façon non limitative, il est choisi parmi les réactifs suivants naphthalène2, 3dialdéhyde (NDA), orthophthal-dialdéhyde (OPA), anthracène dialdéhyde (APA), et leurs dérivés substitués. The reagent (F) is preferably a fluorogenic aromatic dialdehyde, which may be advantageously chosen from aromatic alpha-dialdehydes giving fluorescent derivatives of the family of isoindoles. In a nonlimiting manner, it is chosen from the following reagents: naphthalene2, 3dialdehyde (NDA), orthophthal-dialdehyde (OPA), anthracene dialdehyde (APA), and their substituted derivatives.
O naphthalène2,3dialdéhyde (NDA) orthophthal-dialdéhyde (OPA) O anthracène dialdéhyde (APA) Ces réactifs dorment avec les amines primaires des dérivés ayant de bons rendements de fluorescence. La stabilité des composés formés a été vérifiée par des études de spectrométrie de masse: elle est suffisante pour conduire les analyses dans de bonnes conditions (Manica D.P., Lapos J.A., Jones A.D., Ewing A.G. , Anal. Biochem., 2003, 322, pp.68-78). O naphthalene2,3dialdehyde (NDA) orthophthal-dialdehyde (OPA) O anthracene dialdehyde (APA) These reagents sleep with the primary amines of derivatives with good fluorescence yields. The stability of the compounds formed has been verified by mass spectrometry studies: it is sufficient to conduct the analyzes under good conditions (Manica DP, Lapos JA, Jones AD, Ewing AG, Anal Biochem., 2003, 322, pp. .68-78).
Dans le procédé et le kit selon l'invention, le réactif (S) correspond à une molécule capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. La faculté d'ionisation du groupement apporté par le réactif (S) est considérée avant fixation sur le réactif (F). Dans la présente invention, un groupement ionisable est défini comme un groupe dont le pKa est compris entre 2 et 12. Les expressions "groupement ionisable", "thiol ionisable", ... feront quant à elles référence à la faculté d'ionisation dudit groupement avant ou après sa fixation au réactif (F). In the process and the kit according to the invention, the reagent (S) corresponds to a molecule capable of substituting the reagent (F) with an ionizable group and of forming a major ion by fragmentation of said compound. The faculty of ionization of the group provided by the reagent (S) is considered before fixing on the reagent (F). In the present invention, an ionizable group is defined as a group whose pKa is between 2 and 12. The expressions "ionizable group", "ionizable thiol", ... will refer to the faculty of ionization of said grouping before or after its attachment to the reagent (F).
Le réactif (S) est de préférence capable de substituer le réactif (F) en alpha de l'amine primaire (N). C'est avantageusement un thiol ionisable, qui peut être choisi parmi les composés de formule R SH, où R est une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée portant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une amine primaire. De tels thiols de formule générale R SH sont en effet facilement ionisables. Utilisés en combinaison avec le dialdéhyde aromatique ils forment, après réaction avec l'amine à étudier, des composés fluorescents dérivés par un groupement soufré. The reagent (S) is preferably capable of substituting the reagent (F) alpha for the primary amine (N). It is advantageously an ionizable thiol, which may be chosen from compounds of formula R SH, where R is a linear or branched carbon chain carrying a functional group of acidic or basic character other than a primary amine. Such thiols of general formula R SH are indeed easily ionizable. Used in combination with the aromatic dialdehyde they form, after reaction with the amine to be studied, fluorescent compounds derived by a sulfur group.
La perte spécifique de la chaîne thiol lors de la fragmentation du composé marqué aboutit à la formation d'un ion caractéristique majoritaire, bien identifiable en spectrométrie de masse, ce qui explique la haute sélectivité de la méthode. Il est recommandé, pour éviter les confusions avec les amines à étudier, de ne pas utiliser un composé de formule R SH où R porterait un groupement fonctionnel amine primaire. The specific loss of the thiol chain during the fragmentation of the labeled compound results in the formation of a majority characteristic ion, well identifiable in mass spectrometry, which explains the high selectivity of the method. It is recommended, in order to avoid confusion with the amines to be studied, not to use a compound of formula R SH where R would carry a primary amine functional group.
De manière préférée, le réactif (S) est un composé de formule R SH, où R est une chaîne carbonée du type (CH2)x A, avec x 2, et A est un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'un groupe amine primaire. Selon un mode de réalisation préféré non limitatif de l'invention, le groupement fonctionnel A est choisi parmi les groupes amine secondaire, amine tertiaire, amine quaternaire ou du type guanidinium, ou parmi les groupes acides COOH, SO4H, SO3H, BO3H. La présence d'un tel groupement fonctionnel sur le thiol accroît la polarité du thiol, ce qui d'une part augmente sa réactivité vis-à-vis du réactif (F) et d'autre part favorise la formation d'un ion caractéristique majoritaire jouant excellemment son rôle de marqueur en spectrométrie de masse. Les aminothiols et les carboxythiols sont particulièrement préférés. Preferably, the reagent (S) is a compound of formula R SH, where R is a carbon chain of the (CH 2) x A type, with x 2, and A is a functional group of acidic or basic character other than primary amine group. According to a preferred non-limiting embodiment of the invention, the functional group A is chosen from secondary amine, tertiary amine, quaternary amine or guanidinium type groups, or from the acidic groups COOH, SO4H, SO3H, BO3H. The presence of such a functional group on the thiol increases the polarity of the thiol, which on the one hand increases its reactivity with respect to the reagent (F) and on the other hand promotes the formation of a majority characteristic ion excellently playing the role of marker in mass spectrometry. Aminothiols and carboxythiols are particularly preferred.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit de marquage est utilisé pour le marquage d'amines dans des échantillons différents, souvent en vue de réaliser une comparaison entre les milieux desquels proviennent ces échantillons, qui peuvent par exemple être prélevés sur deux organismes différents à comparer du point de vue de leur profil protéique ou peptidique. Cette paire d'échantillons peut aussi être constituée d'un échantillon provenant d'un milieu à étudier et d'un échantillon étalon. According to one particular embodiment of the invention, the labeling kit is used for the labeling of amines in different samples, often with a view to making a comparison between the media from which these samples originate, which can for example be taken from two different organisms to compare from the point of view of their protein or peptide profile. This pair of samples may also consist of a sample from a medium to be studied and a standard sample.
Les réactifs de substitutions (S) du type R SH sont facilement synthétisés et il est facile d'obtenir un réactif (S) marqué isotopiquement soit par des atomes de deutérium soit par des atomes de C 13 (réactif lourd) et gardant les mêmes qualités chromatographiques que le réactif léger. C'est le cas en particulier des aminothiols (par exemple aminothiols linéaires de formule BIB2N (CH2)x SH, où BI et B2 ne sont pas l'hydrogène en même temps) et des carboxythiols (par exemple carboxythiols linéaires de formule HOOC (CH2)x SH) qui permettent d'obtenir des étalons isotopiques bons marchés, pouvant être utilisés en fluorimétrie, en fluorimétrie induite par laser et en spectrométrie de masse. Il est également aisé de synthétiser des réactifs (S) du type A (CH2)x SH dont le groupement A (CH2)x est différent: on peut par exemple faire varier la valeur de x pour avoir des chaînes (CH2)x plus ou moins longues, ou bien faire varier B I et B2 portés par l'amine dans les aminothiols. The substitution reagents (S) of the R SH type are easily synthesized and it is easy to obtain a reagent (S) labeled isotopically either by deuterium atoms or by C 13 atoms (heavy reagent) and keeping the same qualities. chromatographic as the light reagent. This is particularly the case for aminothiols (for example linear aminothiols of formula BIB2N (CH2) x SH, where BI and B2 are not hydrogen at the same time) and carboxythiols (for example linear carboxythiols of formula HOOC (CH2 ) x SH), which makes it possible to obtain cheap isotopic standards which can be used in fluorimetry, laser-induced fluorimetry and mass spectrometry. It is also easy to synthesize reagents (S) of the type A (CH2) x SH whose group A (CH2) x is different: one can for example vary the value of x to have chains (CH2) x more or less long, or vary BI and B2 carried by the amine in aminothiols.
Ainsi, dans le procédé de marquage selon l'invention, un au moins des atomes du réactif (S) peut être remplacé par un isotope stable. Le kit de marquage correspondant comprend alors i) un premier réactif (S) et ii) un second réactif (S') de même formule que le premier réactif (S) dont au moins un atome est remplacé par un isotope lourd stable. De préférence, en spectrométrie de masse, quatre atomes au moins sont substitués par leur isotope lourd. Thus, in the labeling method according to the invention, at least one of the reagent (S) atoms can be replaced by a stable isotope. The corresponding labeling kit then comprises i) a first reagent (S) and ii) a second reagent (S ') of the same formula as the first reagent (S) of which at least one atom is replaced by a stable heavy isotope. Preferably, in mass spectrometry, at least four atoms are substituted by their heavy isotope.
De manière alternative ou simultanée, dans le procédé de marquage selon l'invention, un au moins des atomes du réactif (F) peut également être remplacé par un isotope stable. Dans ce cas, le kit de marquage correspondant comprend i) un premier réactif (F) et ii) un second réactif (F') de même formule que le premier réactif (F) dont au moins un atome est remplacé par un isotope stable. Alternatively or simultaneously, in the labeling method according to the invention, at least one of the reagent (F) atoms can also be replaced by a stable isotope. In this case, the corresponding labeling kit comprises i) a first reagent (F) and ii) a second reagent (F ') of the same formula as the first reagent (F) of which at least one atom is replaced by a stable isotope.
Lorsque l'on utilise deux versions (S) et (S') du réactif de substitution ou deux versions (F) et (F') du réactif colorant, on appelle "réactif léger" celui qui ne contient pas d'isotope et "réactif lourd" celui qui contient au moins un isotope lourd stable d'un de ses atomes. Par extension, on appellera "composé léger" le composé marqué avec le réactif léger et "composé lourd" celui qui est marqué avec le réactif lourd. When two (S) and (S ') versions of the substitution reagent or two (F) and (F') versions of the dye reagent are used, the term "light reagent" is used to denote the one which does not contain isotope and " heavy reagent "one that contains at least one stable heavy isotope of one of its atoms. By extension, the "light compound" will be termed the compound labeled with the light reagent and "heavy compound" that which is labeled with the heavy reagent.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le kit de marquage d'entités portant une fonction amine primaire présentes dans deux échantillons comprend un premier réactif (Si) et un second réactif (S2) de formules respectives RI SH et R2 SH, dans lesquels RI et R2 sont des chaînes carbonées linéaires ou ramifiées portant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une amine primaire, et où RI et R2 ont des masses différentes. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux car il évite d'avoir recours à la synthèse d'un composé lourd servant d'étalon interne en spectrométrie de masse. According to another embodiment of the invention, the tagging kit of entities carrying a primary amine function present in two samples comprises a first reagent (Si) and a second reagent (S2) of the respective formulas RI SH and R2 SH, wherein R1 and R2 are linear or branched carbon chains bearing a functional group of acidic or basic character other than a primary amine, and wherein R1 and R2 have different masses. This embodiment is particularly advantageous because it avoids resorting to the synthesis of a heavy compound used as an internal standard in mass spectrometry.
Lorsque l'on utilise deux versions (Si) et (S2) du réactif de substitution, on appelle "réactif léger" celui qui a la chaîne carbonée la plus courte, et "réactif lourd" celui qui a la chaîne carbonée la plus longue. Par extension on appelle "composé léger" le composé marqué avec le réactif léger et "composé lourd" celui qui est marqué avec le réactif lourd. When two (Si) and (S2) versions of the substitution reagent are used, the one with the shortest carbon chain is called "light reagent" and the one with the longest carbon chain is called "heavy reagent". By extension the so-called "light compound" is the compound labeled with the light reagent and "heavy compound" that which is labeled with the heavy reagent.
Selon un autre mode particulier de réalisation du procédé et du kit de marquage selon l'invention, le réactif (S) comprend au moins un carbone asymétrique et il est optiquement pur. On peut de la sorte facilement séparer les couples d'énantiomères d'une amine primaire optiquement active. En effet, ce réactif forme avec une amine primaire ayant un carbone asymétrique un couple de diastéréoisomères dont certaines propriétés physiques sont différentes, notamment leur hydrophobie. Les diastéréoisomères, élués à des vitesses différentes, pourront donc être séparés et analysés individuellement. According to another particular embodiment of the method and the marking kit according to the invention, the reagent (S) comprises at least one asymmetric carbon and is optically pure. In this way, the enantiomeric pairs of an optically active primary amine can be easily separated. Indeed, this reagent forms with a primary amine having an asymmetric carbon a pair of diastereoisomers with certain physical properties are different, including their hydrophobicity. The diastereoisomers, eluted at different speeds, can therefore be separated and analyzed individually.
Selon une caractéristique intéressante du procédé de marquage selon l'invention, les réactifs (F) et (S) peuvent être introduits dans un échantillon biologique pour marquer les entités portant une fonction amine primaire dudit échantillon biologique. En effet, comme déjà indiqué, dans le procédé selon l'invention, les deux réactifs sont capables de réagir sélectivement avec les amines primaires, en une étape, pour donner des composés détectables tels quels, par fluorimétrie et par spectroscopie de masse. Cette réaction présente le grand avantage de conserver un bon rendement et une grande sélectivité vis-à-vis des amines primaires même dans un milieu complexe tel qu'un milieu biologique. Les entités marquées, formées avec l'ensemble des amines primaires présentes dans ledit milieu, peuvent ensuite être séparées, identifiées et quantifiées grâce au procédé d'analyse selon l'invention qui sera décrit plus loin. According to an interesting feature of the labeling method according to the invention, the reagents (F) and (S) can be introduced into a biological sample to mark the entities carrying a primary amine function of said biological sample. Indeed, as already indicated, in the process according to the invention, the two reagents are capable of reacting selectively with the primary amines, in one step, to give detectable compounds as such, by fluorimetry and by mass spectroscopy. This reaction has the great advantage of maintaining a good yield and a high selectivity towards primary amines even in a complex medium such as a biological medium. The labeled entities, formed with all of the primary amines present in said medium, can then be separated, identified and quantified by means of the analysis method according to the invention which will be described below.
Le procédé de marquage et le kit conformes à l'invention ci-dessus décrite peuvent être appliquées au marquage des amines primaires provenant de toutes sortes de milieux biologiques, par exemple humain, animal, végétal, microbiologique, viral et de tout type d'environnement et de prélèvements,d'organismes sains, malades ou présentant une quelconque anomalie. Ils sont particulièrement adaptés au marquage des amines primaires dans un échantillon biologique. The labeling method and the kit according to the invention described above can be applied to the labeling of primary amines from all kinds of biological media, for example human, animal, plant, microbiological, viral and any type of environment. and samples, healthy organisms, sick or with any abnormality. They are particularly suitable for labeling primary amines in a biological sample.
Enfin, un autre objet de l'invention est un procédé d'analyse des amines primaires présentes dans un échantillon, mettant en oeuvre le procédé de marquage précédemment décrit. Ce procédé d'analyse comprend essentiellement les étapes consistant à : a) marquer les amines primaires par le procédé de marquage tel que décrit ci-dessus, b) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir des fractions, c) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes: fluorimétrie, spectrométrie de masse. Finally, another subject of the invention is a method for analyzing primary amines present in a sample, implementing the marking method described above. This method of analysis essentially comprises the steps of: a) labeling the primary amines by the labeling method as described above, b) treating the sample with at least one separation technique to obtain fractions, c) subjecting fractions obtained in at least one of the following analytical techniques: fluorimetry, mass spectrometry.
Le kit de marquage selon l'invention peut bien entendu être avantageusement utilisé pour la mise en oeuvre du procédé d'analyse cidessus. The marking kit according to the invention can of course be advantageously used for the implementation of the above analysis method.
Le procédé d'analyse selon l'invention permet aussi l'analyse des amines primaires présentes dans deux échantillons, en ayant recours à deux réactifs de substitutions ou à deux réactifs colorants formant les couples "léger-lourd" décrits précédemment notés [(F),(S)] à savoir un couple S-S', S1-S2, ou F-F'. Ce procédé comprend essentiellement les étapes suivantes: a) marquer les amines primaires des deux échantillons par un procédé de marquage tel que décrit précédemment, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F),(S)] différent, b) traiter les échantillons par au moins une technique séparative pour obtenir deux séries de fractions distinctes, c) soumettre les deux séries de fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes: fluorimétrie, spectrométrie de masse. The analysis method according to the invention also allows the analysis of the primary amines present in two samples, using two substitution reagents or two coloring reagents forming the "light-heavy" pairs described previously noted [(F)). , (S)] namely a pair S-S ', S1-S2, or F-F'. This process essentially comprises the following steps: a) labeling the primary amines of the two samples by a labeling method as described above, each using a pair of labeling reagents [(F), (S)] different (b) treat the samples by at least one separation technique to obtain two sets of distinct fractions; (c) subject the two series of fractions obtained to at least one of the following analytical techniques: fluorimetry, mass spectrometry.
Bien entendu, le procédé d'analyse peut être réalisé à l'aide du kit de marquage des amines primaires décrit précédemment en utilisant différents couples de réactifs. Of course, the analysis method can be carried out using the primary amine labeling kit described previously using different pairs of reagents.
De manière particulièrement avantageuse, le procédé d'analyse selon l'invention permet de réaliser l'analyse des amines primaires présentes dans deux milieux distincts, en une seule série de mesures sur un échantillon unique obtenu par réunion des deux milieux. Le procédé comprend alors essentiellement les étapes suivantes: a) marquer les amines primaires des deux milieux par un procédé de marquage tel que décrit précédemment, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F),(S)] différent, b) réunir les deux milieux en un échantillon unique, c) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir une série unique de fractions, d) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes: fluorimétrie, spectrométrie de masse. In a particularly advantageous manner, the analysis method according to the invention makes it possible to carry out the analysis of the primary amines present in two distinct media, in a single series of measurements on a single sample obtained by combining the two media. The process then essentially comprises the following steps: a) labeling the primary amines of the two media by a labeling method as described above, each using a pair of labeling reagents [(F), (S)] (b) combine the two media into a single sample; (c) treat the sample with at least one separation technique to obtain a single series of fractions; (d) subject the fractions obtained to at least one of the following analytical techniques: fluorimetry, mass spectrometry.
On appellera "milieu" une solution contenant des substances connues ou indéterminées en plus ou moins grand nombre, pouvant provenir par exemple d'un prélèvement biologique, ou encore préparée pour les besoins expérimentaux, et on appellera "échantillon" la fraction prélevée sur un milieu en vue de la soumettre à l'analyse. A noter que dans le cas général, un échantillon donné est prélevé à partir d'un milieu donné et les deux termes pourront être synonymes. The term "medium" is used to refer to a solution containing known or unknown substances in greater or lesser number, which may come for example from a biological sample, or prepared for experimental purposes, and the sample taken from a medium will be called "sample". for submission to analysis. Note that in the general case, a given sample is taken from a given medium and the two terms can be synonymous.
On forme ainsi après marquage, un échantillon unique à partir de deux prélèvements sur des milieux distincts, pour obtenir par une seule série de mesures des informations qualitatives et quantitatives sur les deux milieux, qu'il est alors possible de comparer de manière directe. Ce mode d'analyse est de ce fait extrêmement puissant et constitue un résultat particulièrement important de la présente invention. Thus, after labeling, a single sample is formed from two samples on separate media, to obtain by a single series of measurements qualitative and quantitative information on the two media, which can then be compared directly. This mode of analysis is therefore extremely powerful and is a particularly important result of the present invention.
Le procédé d'analyse selon l'invention peut être mis en oeuvre selon divers protocoles présentant différents avantages, ce que permet parfaitement la méthode de marquage des amines primaires revendiquée. The analysis method according to the invention can be implemented according to various protocols having different advantages, which is perfectly possible by the method for labeling primary amines claimed.
Selon un mode de réalisation intéressant, dans le procédé d'analyse selon l'invention le second échantillon comprend au moins une amine primaire connue à une concentration connue. Il peut ainsi constituer un étalon interne vis-à-vis du premier échantillon, permettant un dosage quantitatif. According to an interesting embodiment, in the analysis method according to the invention the second sample comprises at least one known primary amine at a known concentration. It can thus constitute an internal standard vis-à-vis the first sample, allowing a quantitative determination.
Selon un autre mode de réalisation intéressant, dans le procédé d'analyse selon l'invention, les étapes de marquage sont réalisées après l'étape de séparation. According to another interesting embodiment, in the analysis method according to the invention, the marking steps are carried out after the separation step.
Selon encore un autre mode de réalisation intéressant du procédé de l'invention, seules les fractions fluorescentes sont analysées par spectrométrie de masse. Ceci permet de n'enregistrer que les résultats utiles provenant des fractions contenant une molécule d'intérêt et d'optimiser le travail de traitement des données en aval. According to yet another interesting embodiment of the process of the invention, only the fluorescent fractions are analyzed by mass spectrometry. This makes it possible to record only the useful results from fractions containing a molecule of interest and to optimize the downstream data processing work.
Le procédé d'analyse selon l'invention s'applique particulièrement à l'analyse quantitative et structurale des amines primaires présentes dans des échantillons biologiques. L'échantillon peut provenir de différentes origines. Il peut être par exemple humain, animal, végétal, microbiologique, viral. Il peut provenir de tout type d'environnement et de prélèvements, d'organismes sains, malades ou présentant une quelconque anomalie. The analysis method according to the invention is particularly applicable to the quantitative and structural analysis of primary amines present in biological samples. The sample can come from different origins. It can be for example human, animal, plant, microbiological, viral. It can come from any type of environment and samples, healthy organisms, sick or with any abnormality.
L'intérêt de disposer d'un marqueur unique de haute réactivité chimique pour les études en spectrométrie de masse et fluorimétrie classique ou induite par laser est multiple, du fait des potentialités offertes par le double marquage permettant un puissant couplage de ces techniques, notamment: - distinguer et identifier des molécules ayant les mêmes temps de migration en techniques séparatives: elles donnent des pics identiques en fluorimétrie, alors que la spectrométrie de masse permettra leur séparation et leur quantification grâce à la mesure de l'abondance des ions de ratios m/z différents. The interest of having a single marker of high chemical reactivity for studies in mass spectrometry and conventional or laser-induced fluorimetry is multiple, because of the potentialities offered by the double marking allowing a powerful coupling of these techniques, in particular: - distinguish and identify molecules with the same migration times in separation techniques: they give identical peaks in fluorimetry, whereas mass spectrometry will allow their separation and quantification by measuring the abundance of ions of ratios m / z different.
- avoir deux méthodes de détection totalement différentes permettant de confirmer l'exactitude et la précision du résultat obtenu par une des méthodes et ainsi diminuer le risque d'erreur. - signaler à l'expérimentateur que des molécules en très faible concentration, détectées par fluorimétrie induite par laser, ne pourront pas l'être en spectrométrie de masse (dont les seuils de détections des concentrations sont supérieurs). - have two completely different detection methods to confirm the accuracy and precision of the result obtained by one of the methods and thus reduce the risk of error. - signaling to the experimenter that molecules in very low concentration, detected by laser-induced fluorimetry, can not be in mass spectrometry (whose concentration detection thresholds are higher).
- lorsque le détecteur de fluorescence est installé entre l'étape de séparation et la source d'ionisation ou la plaque de dépôt (MALDI), on pourra effectuer des acquisitions de données en spectrométrie de masse uniquement pour les molécules marquées: les molécules fluorescentes peuvent être détectées et orientées rapidement vers la source d'ionisation ou la plaque de dépôt. - when the fluorescence detector is installed between the separation step and the ionization source or the deposit plate (MALDI), mass spectrometry data acquisition can be performed only for the labeled molecules: the fluorescent molecules can be detected and oriented quickly to the ionization source or deposit plate.
- pouvoir identifier plus facilement des molécules autres que les amines primaires (et donc non marquées) à partir d'un même spectre de masse, par analyse d'abord des données se rapportant aux amines primaires puis des données restantes. - to be able to more easily identify molecules other than primary amines (and therefore not marked) from the same mass spectrum, by first analyzing data relating to primary amines and then remaining data.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples suivants qui illustrent des modes de réalisations possibles de la présente invention sans toutefois la limiter à ceux-ci. La puissance et l'universalité de la méthode de marquage et d'analyse des amines primaires seront particulièrement mis en relief. Other advantages and features of the invention will become apparent in the following examples which illustrate possible embodiments of the present invention without, however, limiting thereto. The power and universality of the method of marking and analysis of primary amines will be particularly emphasized.
Exemple 1Example 1
Marquage, séparation et analyse d'un échantillon Dans cet exemple, un protocole type est décrit, avec les indications nécessaires à son adaptation à différents types de milieux à étudier. Le réactif fluorogène est le NDA. Le réactif de substitution est le N,Ndiméthylaminoéthylthiol de formule HS-CH2--CH2-N(Me)2. Marking, separation and analysis of a sample In this example, a standard protocol is described, with the indications necessary for its adaptation to different types of media to be studied. The fluorogenic reagent is NDA. The substitution reagent is N, N-dimethylaminoethylthiol of formula HS-CH2-CH2-N (Me) 2.
Le marquage d'un échantillon d'un volume de 1 l contenant des peptides ou des protéines à des concentrations de l'ordre de la nM, est réalisé en une étape, à température ambiante. On ajoute 5 l d'une solution de NDA à 5 pmol/l dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7, avec 5 l d'une solution d'aminothiol à 15 'amolli dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. On mélange au vortex pendant une minute, on laisse réagir au moins 10 minutes. The labeling of a sample of a volume of 1 l containing peptides or proteins at concentrations of the order of nM, is carried out in one step, at room temperature. 5 L of a solution of NDA at 5 pmol / l in sodium tetraborate buffer at pH = 8.7 were added with 5 l of a solution of aminothiol softened in pH sodium tetraborate buffer. = 8.7. Vortexed for one minute, allowed to react for at least 10 minutes.
Pour une bonne fiabilité des résultats, on considère que la quantité de NDA doit être au moins 3 à 10 fois plus importante que la quantité totale des amines primaires. La concentration en aminothiol doit être de préférence au moins 2 à 3 fois plus importante que celle du NDA. Pour un échantillon particulièrement concentré en protéines, peptides et acides aminés, on peut augmenter les volumes des solutions de NDA et de thiol afin que toutes les molécules contenant des fonctions amines primaires soient marquées, le reste des manipulations restant identique. For a good reliability of results, it is considered that the amount of NDA must be at least 3 to 10 times greater than the total amount of primary amines. The concentration of aminothiol should preferably be at least 2 to 3 times greater than that of NDA. For a particularly concentrated sample of proteins, peptides and amino acids, the volumes of the NDA and thiol solutions can be increased so that all the molecules containing primary amine functions are labeled, the rest of the manipulations remaining identical.
Dans un second temps, l'échantillon marqué est soumis aux techniques séparatives connues avant analyse. Par exemple, 1 l d'échantillon marqué est injecté en HPLC phase inverse (colonne C18, 3 pm, 3 mm de diamètre interne, 15 cm de longueur) à un débit de 5 l/mn. On utilise un solvant tel que acétonitrile/eau acidifiée avec 0,1% de TFA (acide trifluoroacétique) selon un gradient du type suivant: Temps (min) % H2O; 0,1% TFA; pH = 2 % AcN 0 64 36 9 64 36 30 70 Un autre solvant, par exemple un solvant méthanol / eau avec un gradient adapté en fonction des différentes molécules à analyser peut aussi être utilisé pour faire migrer les différentes molécules. Tout type de colonne chromatographique peut être employé, les colonnes de phase inverse étant très habituellement choisies pour ce sujet, mais des colonnes échangeuses d'ions peuvent aussi être utilisées sans difficulté avec des conditions d'élution adaptées. La séparation peut également être réalisée par électrophorèse capillaire (CE). In a second step, the marked sample is subjected to the known separation techniques before analysis. For example, 1 l of labeled sample is injected in reverse phase HPLC (C18 column, 3 μm, 3 mm internal diameter, 15 cm length) at a flow rate of 5 l / min. A solvent such as acetonitrile / water acidified with 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) is used according to a gradient of the following type: Time (min)% H2O; 0.1% TFA; pH = 2% AcN 0 64 36 9 64 36 30 70 Another solvent, for example a methanol / water solvent with a gradient adapted according to the different molecules to be analyzed can also be used to migrate the different molecules. Any type of chromatographic column may be employed, the reverse phase columns being very commonly chosen for this subject, but ion exchange columns may also be used without difficulty with suitable elution conditions. The separation can also be performed by capillary electrophoresis (CE).
Dans un troisième temps, l'échantillon est analysé par fluorimétrie etlou par spectrométrie de masse. In a third step, the sample is analyzed by fluorimetry and / or by mass spectrometry.
Un détecteur de fluorescence induite par laser (ZETALIF 2000TM, modèle 410 ou 442, Picometrics, Ramonville, France) est connecté en sortie de colonne chromatographique pour recevoir les fractions obtenues. L'excitation de l'échantillon est réalisée à une longueur d'onde de 442 nm ou de 410 nm qui sont les deux longueurs d'onde proches des maxima d'absorption dans le visible des composés isoindoles. L'émission fluorescente est détectée au dessus de 460 nm ou de 430 nm. A laser-induced fluorescence detector (ZETALIF 2000TM, model 410 or 442, Picometrics, Ramonville, France) is connected at the output of the chromatographic column to receive the fractions obtained. The excitation of the sample is carried out at a wavelength of 442 nm or 410 nm which are the two wavelengths close to the maximum absorption in the visible of the isoindole compounds. The fluorescent emission is detected above 460 nm or 430 nm.
A la sortie du fluorimètre, est connectée la source ESI d'un spectromètre de masse (ESIQtof, UltimaTM, Micromass Waters), ou un "spotter" (déposeur automatique d'échantillons) pour l'ionisation MALDI. At the output of the fluorometer, is connected the ESI source of a mass spectrometer (ESIQtof, UltimaTM, Micromass Waters), or a "spotter" (automatic depositor of samples) for the MALDI ionization.
Exemple 2Example 2
Étude quantitative sans standard isotopique par analyse en infusion directe en spectrométrie de masse (MS) ionisation electrospray (ESI). Quantitative study without isotopic standard by direct infusion analysis in mass spectrometry (MS) ionization electrospray (ESI).
Le but est de déterminer la masse d'un acide aminé ou d'un peptide donné contenu dans un échantillon, sans séparation préalable. The purpose is to determine the mass of a given amino acid or peptide contained in a sample, without prior separation.
Principe On utilise un marqueur de fluorescence (F) et deux marqueurs de substitution (S 1 et S2). Dans cet exemple le marqueur (F) est le NDA. Les marqueurs S1 et S2 sont des aminothiols portant des substituants différents, à savoir le marqueur léger N,Ndiméthyl-aminoéthylthiol (Sigma) , noté G1, et le marqueur lourd N,N diéthylaminoéthylthiol (Sigma), noté G2. Lors de la fragmentation, chacun des ions moléculaires perd la chaîne aminothiol. Ainsi, le premier perd une chaîne de masse 105, le second perd une chaîne de masse 133, donnant chacun le même fragment à m/z = 704, 6. Principle A fluorescence marker (F) and two substitution markers (S 1 and S 2) are used. In this example the marker (F) is the NDA. Markers S1 and S2 are aminothiols bearing different substituents, namely the light N, Ndimethylaminoethylthiol (Sigma) marker, denoted G1, and the heavy N, N diethylaminoethylthiol (Sigma) marker, denoted G2. During fragmentation, each of the molecular ions loses the aminothiol chain. Thus, the first loses a mass chain 105, the second loses a mass chain 133, each giving the same fragment at m / z = 704, 6.
Réalisation d'un courbe étalon Une gamme de concentration du peptide à doser est réalisée à partir d'une préparation standard du commerce. Le marquage du peptide est réalisé avec NDA+G2 comme décrit à l'exemple 1. Le peptide marqué avec G1, à une concentration fixe, est aussi présent dans chaque solution. Les différentes solutions sont analysées. Lors de la fragmentation, chacun des ions moléculaires perd la chaîne aminothiol. Ainsi, le premier perd une chaîne de masse 105, le second perd une chaîne de masse 133, donnant chacun le même fragment à m/z = 704,6. A partir du spectre de masse, on repère les pics et on calcule le rapport de la hauteur des pics correspondant au peptide marqué avec NDA+G1, et avec NDA+ G2. En faisant varier la concentration du peptide marqué avec NDA+G2 et en gardant constante la concentration du peptide marqué avec NDA+G1, on obtient une droite d'étalonnage: le rapport des teneurs mesurées expérimentalement (peptide marqué NDA+G2 / peptide marqué NDA+G1) est porté en ordonnée. Le rapport calculé à partir des valeurs de la gamme utilisée est porté en abscisse. Realization of a Standard Curve A concentration range of the peptide to be assayed is made from a standard commercial preparation. The labeling of the peptide is carried out with NDA + G2 as described in Example 1. The peptide labeled with G1, at a fixed concentration, is also present in each solution. The different solutions are analyzed. During fragmentation, each of the molecular ions loses the aminothiol chain. Thus, the first loses a mass chain 105, the second loses a mass chain 133, each giving the same fragment at m / z = 704.6. From the mass spectrum, the peaks are identified and the ratio of the height of the peaks corresponding to the peptide labeled with NDA + G1 and with NDA + G2 is calculated. By varying the concentration of the NDA + G2-labeled peptide and keeping the concentration of the NDA + G1-labeled peptide constant, a calibration line is obtained: the ratio of the levels measured experimentally (NDA + G2 labeled peptide / NDA-labeled peptide). + G1) is plotted on the ordinate. The ratio calculated from the values of the range used is plotted on the abscissa.
Dosage du peptide dans un échantillon Pour déterminer la concentration du peptide dans un échantillon quelconque, il suffit de faire réagir les marqueurs NDA+G1 (de rapport m/z = 809,7) avec les amines primaires dudit échantillon, d'y ajouter une quantité connue du peptide marqué avec NDA+ G2 (de rapport m/z = 837,8) puis de déterminer le rapport (peptide marqué NDA+G2 / peptide marqué NDA+G1) expérimental à partir des valeurs obtenues sur le spectre de masse. On lit alors le rapport théorique correspondant d'où on tire la concentration du peptide dans l'échantillon étudié. Assaying the peptide in a sample To determine the concentration of the peptide in any sample, it is sufficient to react the NDA + G1 markers (ratio m / z = 809.7) with the primary amines of said sample, to add a known amount of peptide labeled with NDA + G2 (ratio m / z = 837.8) and then to determine the ratio (labeled peptide NDA + G2 / peptide labeled NDA + G1) experimental from the values obtained on the mass spectrum. The corresponding theoretical ratio is then read from which the concentration of the peptide in the sample studied is drawn.
Illustration: dosage de la leucine-enképhaline Le dosage a été réalisé sur un échantillon test de composition connue, afin de valider la méthode. Illustration: leucine-enkephalin assay The assay was performed on a test sample of known composition, in order to validate the method.
É Protocole de marquage - Solution 1: 10 pl de marqueur G1 à 2 mmol/1(diluée dans H2O), 10 pl de NDA (Sigma) à 0,2 mmol/l, 2 pl de NEt3 à 1.00 mmol/l (Sigma) et 80 l de leucine-enképhaline standard (Sigma) à 10 molli dans l'eau. Tagging protocol - Solution 1: 10 μl of G1 marker at 2 mmol / l (diluted in H2O), 10 μl of NDA (Sigma) at 0.2 mmol / l, 2 μl of NEt3 at 1.00 mmol / l (Sigma) ) and 80 l of leucine-enkephalin standard (Sigma) 10 mol in water.
- Gamme de solutions 2:10 l de marqueur G2 à 2 mmol/l (diluée dans H2O), 10 gl de NDA (Sigma) à 0,2 mmol/l, 2 l de NEt3 à 100 mmol/l (Sigma) et 80 l de leucine-enképhaline standard (Sigma) aux concentrations de 0,5 mmol/l à 50 mol/l dans l'eau. É Protocole de dilution -10 l de solution 1 et 10 l de solution 2 sont introduits dans 980 l de solution acétonitrile/eau (1:1) avec 0.1% de HCOOH. La solution diluée est introduite par infusion dans la source ESI du spectromètre de masse ESIQtof (Ultima, Micromass Waters), grâce à une pompe à seringue. La concentration en leucine-enképhaline marquée G2 des différentes solutions diluées se situe donc entre 5 nmoll et 500 nmol/1 et la concentration en leucine-enképhaline marquée G1 est de 100 nmol/1 dans toutes les solutions diluées. - Range of solutions: 2:10 l of G2 marker at 2 mmol / l (diluted in H2O), 10 g of NDA (Sigma) at 0.2 mmol / l, 2 l of NEt3 at 100 mmol / l (Sigma) and 80 l of leucine-enkephalin standard (Sigma) at concentrations of 0.5 mmol / l to 50 mol / l in water. Dilution protocol - 10 l of solution 1 and 10 l of solution 2 are introduced into 980 l of acetonitrile / water solution (1: 1) with 0.1% of HCOOH. The diluted solution is introduced by infusion into the ESI source of the ESIQtof mass spectrometer (Ultima, Micromass Waters), using a syringe pump. The leucine-enkephalin G2 concentration of the various diluted solutions is thus between 5 nmol and 500 nmol / l and the leucine-enkephalin concentration labeled G1 is 100 nmol / l in all the diluted solutions.
É La courbe étalon obtenue est présentée Figure 1. É The obtained standard curve is shown in Figure 1.
C'est une droite d'équation y = 0,982 x 0,061, avec un coefficient de régression linéaire R2 = 0,996. La pente est très proche de 1 et l'ordonnée à l'origine est proche de zéro. Ce résultat montre d'une part que la méthode de dosage est linéaire sur une échelle de concentration de deux décades, la limite de quantification en spectrométrie de masse simple étant inférieure à 5 nmole/1 niveau inégalé à ce jour , et d'autre part que la dérivation des marqueurs n'affecte pas les propriétés d'ionisation du peptide marqué. Cette propriété très importante permet d'atteindre des seuils de sensibilité inédits, et qui n'ont pas pu être atteints en utilisant comme co-réactif le KCN (voir les études menées de façon comparable, par exemple K. Linnemayr et al., J. Mass Spectrom., 1999, 34, pp. 427-434). It is a line of equation y = 0.982 x 0.061, with a linear regression coefficient R2 = 0.996. The slope is very close to 1 and the y-intercept is close to zero. This result shows, on the one hand, that the assay method is linear on a concentration scale of two decades, the limit of quantification in simple mass spectrometry being less than 5 nmole / l level unequaled to date, and secondly that the derivation of the markers does not affect the ionization properties of the labeled peptide. This very important property makes it possible to reach unprecedented sensitivity thresholds, which could not be reached by using KCN as a co-reactant (see the studies carried out in a comparable manner, for example K. Linnemayr et al., J. Mass Spectrom., 1999, 34, pp. 427-434).
Le spectre de masse présenté Figure 2 à titre d'exemple, illustre le type de graphe que l'on obtient. Il s'agit ici du spectre de la leucineenképhaline à 10-6 molli, marquée avec NDA+G 1 et NDA+G2 dans la proportion de 1:2. The mass spectrum shown in Figure 2 by way of example, illustrates the type of graph that is obtained. This is the spectrum of leucineencephalin at 10-6 mol, labeled with NDA + G 1 and NDA + G2 in the ratio of 1: 2.
- Le pic de rapport m/z = 837,8 est celui de l'ion moléculaire monochargé (M+H)+ correspondant à la leucine-enképhaline marquée avec NDA+G2. The peak of ratio m / z = 837.8 is that of the monocharged molecular ion (M + H) + corresponding to leucine-enkephalin labeled with NDA + G2.
- Le pic de rapport m/z = 809,7 est celui de l'ion moléculaire monochargé (M+H)+ correspondant à la leucine-enképhaline marquée avec NDA+G1. - The peak ratio m / z = 809.7 is that of the monocharged molecular ion (M + H) + corresponding to leucine-enkephalin labeled with NDA + G1.
- Le pic de rapport m/z = 704,6 est celui du fils des deux ions moléculaires précédents; il représente le total de la leucine-enképhaline marquée avec NDA+G 1 et NDA+G2, et ayant perdu le co-réactif aminothiol (G1 ou G2). The peak of ratio m / z = 704.6 is that of the son of the two preceding molecular ions; it represents the total leucine-enkephalin labeled with NDA + G 1 and NDA + G2, and having lost the co-reactive aminothiol (G1 or G2).
- On constate que le pic de rapport m/z = 809,7 est environ deux fois supérieur au pic de rapport m/z = 837,8, ce qui correspond bien au rapport des concentrations injectées de G1 et G2. - It is found that the peak ratio m / z = 809.7 is about twice the peak m / z ratio = 837.8, which corresponds well to the ratio of the injected concentrations of G1 and G2.
Le fait que la fragmentation donne une perte abondante du marqueur aminothiol permet de caractériser avec certitude le peptide marqué et non pas un autre ion isobare, ayant le même rapport m/z, mais non marqué (des molécules ne portant pas de fonction amine primaire). Par exemple, pour un marqueur aminothiol donnant un ion de masse 133, il est facile de repérer un couple de pics distants de 133 unités, correspondant à l'ion moléculaire d'un peptide et à son marqueur. La fragmentation des peptides marqués selon l'invention au niveau de l'aminothiol étant particulièrement importante, la perte du groupe marqueur est bien visible et facilement identifiable, ce qui confère une sélectivité quasi totale à la méthode. The fact that the fragmentation gives an abundant loss of the aminothiol marker makes it possible to characterize with certainty the labeled peptide and not another isobaric ion having the same m / z ratio, but not labeled (molecules not carrying a primary amine function) . For example, for an aminothiol marker giving a mass ion 133, it is easy to identify a pair of peaks at a distance of 133 units, corresponding to the molecular ion of a peptide and its marker. The fragmentation of the peptides labeled according to the invention at the aminothiol level being particularly important, the loss of the marker group is clearly visible and easily identifiable, which confers almost total selectivity to the method.
Le fait de pouvoir distinguer avec certitude les amines primaires des autres molécules apporte un avantage très appréciable pour l'étude des milieux complexes. The fact of being able to distinguish with certainty the primary amines from the other molecules brings a very appreciable advantage for the study of complex media.
Enfin, cet exemple montre bien la relation linéaire, établie par la droite étalon, entre le rapport des hauteurs de pic et le rapport des concentrations, même lorsque les deux co-réactifs (G1 et G2) sont différents. Finally, this example clearly shows the linear relationship, established by the straight line, between the ratio of peak heights and the concentration ratio, even when the two co-reactants (G1 and G2) are different.
Dans cet exemple, G1 et G2 peuvent être aussi une molécule de même structure chimique, avec G2 contenant 6 atomes de deutérium, ou de C13. Sur les mêmes échantillons, en reportant le rapport d'intensité des deux pics des composés lourds sur les deux pics des composés légers en fonction de la concentration de l'enképhaline marquée avec la chaîne lourde, on obtient une courbe d'étalonnage qui est une droite. Le dosage de l'enképhaline peut aussi être fait en CE/LIF, en HPLC/fluorescence, ou en HPLC/fluorescence. In this example, G1 and G2 can also be a molecule of the same chemical structure, with G2 containing 6 deuterium atoms, or C13. On the same samples, by plotting the intensity ratio of the two peaks of the heavy compounds on the two peaks of the light compounds as a function of the concentration of the enkephalin labeled with the heavy chain, we obtain a calibration curve which is a right. The enkephalin assay can also be done in CE / LIF, HPLC / fluorescence, or HPLC / fluorescence.
Exemple 3Example 3
Étude quantitative sans standard isotopique interne, par analyse par fluorimétrie laser (LIF) et spectrométrie de masse par ionisation electrospray (ESI-MS), avec marquage précolonne. Quantitative study without internal isotopic standard, by laser fluorimetry analysis (LIF) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), with precolumn marking.
Le marquage est réalisé avant la séparation par chromatographie. On peut faire appel aussi bien à la chromatographie liquide (LC) qu'à la technique d'électrophorèse capillaire (CE). Le détecteur LIF est connecté à la sortie de la colonne chromatographique (ou sur le capillaire). A la sortie du fluorimètre, est connectée la source d'un spectromètre de masse Le but est de déterminer la quantité d'un acide aminé ou d'un peptide donné contenu dans un échantillon, avec séparation préalable. L'espèce à doser doit être identifiée avec certitude avant analyse quantitative. Plusieurs espèces peuvent être étudiées dans un même échantillon. The labeling is carried out before separation by chromatography. Both liquid chromatography (LC) and capillary electrophoresis (CE) can be used. The LIF detector is connected to the output of the chromatographic column (or on the capillary). At the output of the fluorometer is connected the source of a mass spectrometer The purpose is to determine the amount of a given amino acid or peptide contained in a sample, with prior separation. The species to be assayed must be identified with certainty before quantitative analysis. Several species can be studied in the same sample.
Selon la méthode proposée, la MS permet d'identifier les espèces amines primaires préalablement séparées, et notamment de nouveaux peptides, protéines ou acides aminés marqués. Ces peptides ou protéines ou acides aminés marqués, sont aisément identifiables par la perte de neutre du marqueur ionisable (S) (dans le présent exemple, un aminoacylthiol). La détection LIF permet de quantifier les amines primaires correspondantes grâce à la surface des pics. La MS permet en outre la détermination structurale des nouvelles molécules détectées. According to the proposed method, the MS makes it possible to identify the previously separated primary amine species, and in particular new peptides, proteins or labeled amino acids. These peptides or proteins or labeled amino acids are easily identifiable by the neutral loss of the ionizable label (S) (in this example an aminoacylthiol). The LIF detection makes it possible to quantify the corresponding primary amines by virtue of the peak area. The MS also allows the structural determination of the new molecules detected.
Le mode opératoire suivi est illustré dans le présent exemple par le dosage d'une solution modèle d'arginine. The procedure followed is illustrated in the present example by the assay of a model solution of arginine.
Préparation des échantillons L'arginine (Sigma) est marquée par le NDA et l'aminothiol G1 (N,N diméthyl2aminoéthylthiol) selon le principe décrit à l'exemple 1. On prend 1 l d'échantillon d'arginine à diverses concentrations (de 50 nmol/1 à 1000 nmol/1), puis on ajoute 5 l de solution de NDA à la concentration de 5 pmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7, avec 5 l d'aminothiol G1 à 15 mol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. Preparation of samples Arginine (Sigma) is labeled with NDA and aminothiol G1 (N, N-dimethyl-2-aminoethylthiol) according to the principle described in Example 1. 1 l of arginine sample is taken at various concentrations (from 50 nmol / l at 1000 nmol / l), then 5 l of NDA solution at a concentration of 5 pmol / l in sodium tetraborate buffer at pH = 8.7, with 5 l of aminothiol G1 to 15 mol / 1 in sodium tetraborate buffer at pH = 8.7.
Séparation et analyse La séparation a lieu en chromatographie liquide (Chromatographe HPLC Alliance Waters) sur une colonne de 3,5 m, 2,1x150 mm (Waters X-Terra RP-182E), avec un débit de 400 l/mn et un solvant préparé à partir du tampon A = (eau, 1% d'acide trifluoroacétique, pH=2) et de 1acétonitrile. Le gradient d' élution est de 64% de tampon A / 36% d'acétonitrile pour le To en conditions isocratiques pendant 9 minutes, puis gradient linéaire jusqu'à 30% de tampon A / 70% d'acétonitrile, en 21 minutes. D'autres gradients de migration peuvent être choisis sans difficulté par l'homme de l'art. Separation and analysis The separation is carried out in liquid chromatography (Alliance Waters HPLC Chromatograph) on a 3.5 m column, 2.1x150 mm (Waters X-Terra RP-182E), with a flow rate of 400 l / min and a solvent prepared from buffer A = (water, 1% trifluoroacetic acid, pH = 2) and acetonitrile. The elution gradient is 64% A / 36% acetonitrile buffer for the To under isocratic conditions for 9 minutes, then linear gradient up to 30% buffer A / 70% acetonitrile, in 21 minutes. Other migration gradients can be chosen without difficulty by those skilled in the art.
Le volume d'injection est de 5 l (ou plus petit). A la sortie de la colonne est connecté un capillaire sur lequel est fixé le détecteur LIF (ZETALIF 2000, Picometrics, 410 nm). Le capillaire est connecté à la source ESI d'un spectromètre de masse ESIqTOF. Sur le spectre de masse, on repère l'ion moléculaire (M+H)+, on note le rapport masse/charge (m/z). Cet ion est obtenu par la perte importante et sélective par l'arginine marquée par le NDA+GI d'un groupe (M+H-105) correspondant à l'aminothiol G1. La perte est sélective de l'ion parent (M+H)+. On répète l'analyse avec les échantillons à différentes concentrations en arginine et on établit la courbe étalon mettant en relation la concentration en arginine (exprimée en nmol/1) et la surface du pic chromatographique. La courbe étalon (non représentée) est une droite d'équation y = 6.710-4 [arginine] + 0.089. The injection volume is 5 l (or smaller). At the outlet of the column is connected a capillary on which is fixed the detector LIF (ZETALIF 2000, Picometrics, 410 nm). The capillary is connected to the ESI source of an ESIqTOF mass spectrometer. On the mass spectrum, we find the molecular ion (M + H) +, we note the mass / charge ratio (m / z). This ion is obtained by the significant and selective loss by arginine labeled with NDA + GI of a group (M + H-105) corresponding to aminothiol G1. The loss is selective from the parent ion (M + H) +. The analysis is repeated with the samples at different concentrations of arginine and the standard curve relating the concentration of arginine (expressed in nmol / l) and the surface of the chromatographic peak is established. The standard curve (not shown) is a line of equation y = 6.710-4 [arginine] + 0.089.
Pour un échantillon à étudier, la MS permet d'abord d'identifier l'arginine sans ambiguïté grâce à l'ion de masse (M+H-105) associé à l'ion moléculaire, tandis que la fluorescence détectée par le détecteur LIF permet de doser l'acide aminé identifié grâce à la courbe étalon. Le spectre MS apporte aussi des données quantitatives, permettant la confirmation du dosage par fluorimétrie. For a sample to be studied, the MS first makes it possible to identify arginine unambiguously thanks to the mass ion (M + H-105) associated with the molecular ion, whereas the fluorescence detected by the detector LIF allows the determination of the amino acid identified by the standard curve. The MS spectrum also provides quantitative data, allowing fluorimetric assay confirmation.
Exemple 4Example 4
Étude quantitative avec standard isotopique interne, par analyse par fluorimétrie (LIF) et spectrométrie de masse par ionisation electrospray (ESI-MS), avec marquage précolonne. Quantitative study with internal isotopic standard, by fluorimetry analysis (LIF) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), with precolumn marking.
Principe Le principe et le but du dosage sont les mêmes qu'à l'exemple 3, le dispositif d'analyse est identique (colonne de séparation, fluorimètre, MS). Par contre, on travaille ici avec un étalon interne (donc sans recourir à une courbe étalon). Principle The principle and purpose of the assay are the same as in Example 3, the analysis device is identical (separation column, fluorimeter, MS). On the other hand, one works here with an internal standard (thus without resorting to a standard curve).
Le composé à doser étant connu (l'arginine dans le présent exemple), on effectue la réaction de marquage avec un couple de marqueurs (F)+(S léger) dans le milieu à étudier, et on prépare une solution contenant ledit composé à une concentration définie, celui-ci étant marqué avec un couple de marqueurs (F)+(S lourd). Les deux solutions sont réunies en un échantillon unique qui est analysé. The compound to be assayed being known (arginine in the present example), the labeling reaction is carried out with a pair of markers (F) + (S light) in the medium to be studied, and a solution containing said compound is prepared. a defined concentration, which is marked with a pair of markers (F) + (heavy S). Both solutions are combined into a single sample that is analyzed.
Préparation des échantillons L'arginine à doser est marquée par le NDA et l'aminothiol léger Gl (N,N diméthyl2aminoéthylthiol) selon le principe décrit à l'exemple 1. On prépare en parallèle une solution d'arginine standard à 100 nmol/l, qu'on marque avec le NDA et l'aminothiol lourd G2 (N,N diéthyl2aminoéthylthiol). Preparation of the samples The arginine to be assayed is labeled with NDA and light aminothiol Gl (N, N dimethylaminoethylthiol) according to the principle described in Example 1. A standard arginine solution at 100 nmol / l is prepared in parallel. , which is labeled with NDA and heavy aminothiol G2 (N, N diethylaminoethylthiol).
- NDA: 5 pl de solution à 5 mol/l dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7; - aminothiol: 5 l à 15!amolli dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. NDA: 5 μl of 5 mol / l solution in sodium tetraborate buffer at pH = 8.7; - Aminothiol: 5 to 15 ml softened in sodium tetraborate buffer at pH = 8.7.
Puis les deux solutions sont mélangées volume à volume pour former un échantillon unique qui est soumis à analyse comme décrit à l'exemple précédent. Les composés marqués sont élués à des vitesses différentes selon le marqueur associé, et donnent deux signaux fluorescents distincts proportionnels à leur concentration. Le spectre de masse permet de vérifier la nature du composé dosé par la masse des deux ions moléculaires associés un ion fils unique, le rapport des hauteurs des pics donnant le rapport des concentrations en arginine "lourde" (étalon interne) et "légère" (à doser). On peut ainsi faire un dosage quantitatif de l'arginine dans un milieu quelconque. Then the two solutions are mixed volume to volume to form a single sample which is subjected to analysis as described in the previous example. The labeled compounds are eluted at different rates depending on the associated label, and give two distinct fluorescent signals proportional to their concentration. The mass spectrum makes it possible to verify the nature of the compound dosed by the mass of the two molecular ions associated with a single son ion, the ratio of the peak heights giving the ratio of the concentrations of arginine "heavy" (internal standard) and "light" ( to be dosed). It is thus possible to make a quantitative determination of arginine in any medium.
Exemple 5Example 5
Analyse comparative d'échantillons provenant de deux milieux différents par spectrométrie de masse ESI-MS et détection LIF, avec marquage précolonne. Comparative analysis of samples from two different media by ESI-MS mass spectrometry and LIF detection, with precolumn labeling.
Le marquage est réalisé avant la séparation par chromatographie liquide (LC) ou électrophorèse capillaire (CE). Comme dans l'exemple 3 le détecteur LIF est connecté en sortie de colonne LC ou sur le capillaire de CE, puis le capillaire entre dans la source du spectromètre de masse. Le but est de fournir un outil permettant de comparer des milieux complexes, tels que des milieux biologiques, par exemple des microdialysats, l'un issu d'un organisme sain et l'autre d'un organisme présentant une anomalie (maladie ou autre). Ils contiennent un mélange de peptides dont on souhaite connaître la proportion relative dans chaque milieu. The labeling is carried out before separation by liquid chromatography (LC) or capillary electrophoresis (CE). As in Example 3, the detector LIF is connected at the output of the LC column or on the CE capillary, then the capillary enters the source of the mass spectrometer. The goal is to provide a tool for comparing complex media, such as biological media, such as microdialysates, one from a healthy organism and one from an abnormal organism (disease or other) . They contain a mixture of peptides which one wants to know the relative proportion in each medium.
Les différences relevées entre les deux milieux permettront de sélectionner certains peptides pour les étudier quantitativement et qualitativement en vue par exemple de mieux connaître les mécanismes de la maladie et la traiter, ou de disposer d'une molécule indicatrice de son évolution. Un fois ce ou ces peptides sélectionnés, on pourra appliquer les méthodes décrites dans les exemples précédents, ou des variantes de celles-ci adaptées au type d'information recherchée, pour approfondir leur étude spécifique. The differences between the two media will make it possible to select certain peptides to study them quantitatively and qualitatively, for example to better understand the mechanisms of the disease and to treat it, or to have a molecule indicating its evolution. Once this or these peptides selected, we can apply the methods described in the previous examples, or variants thereof adapted to the type of information sought, to further their specific study.
Principe On utilise ici un marqueur de fluorescence (F) et deux marqueurs de substitution (S) et (S'). Les marqueurs (S) et (S') seront chimiquement identiques, mais dans (S'), certains atomes d'hydrogène ou de carbone ont été remplacés par un isotope lourd stable. Selon la méthode proposée, le premier milieu (Ml) est traité avec le couple de marqueurs (F)+(S) (léger), le deuxième milieu (M2) est traité avec le couple de marqueurs (F)+(S') (lourd). Tous les composés portant une fonction amine primaire présents dans les milieux vont être marqués par l'un ou l'autre couple de marqueurs. Après marquage, les milieux sont mélangés pour former un échantillon mixte, qui est analysé. 10 Principle A fluorescence marker (F) and two substitution markers (S) and (S ') are used here. Markers (S) and (S ') will be chemically identical, but in (S'), some hydrogen or carbon atoms have been replaced by a stable heavy isotope. According to the proposed method, the first medium (Ml) is treated with the pair of markers (F) + (S) (light), the second medium (M2) is treated with the pair of markers (F) + (S ') (heavy). All the compounds carrying a primary amine function present in the media will be labeled with one or the other couple of markers. After labeling, the media are mixed to form a mixed sample, which is analyzed. 10
Le spectre de masse permet d'identifier les pics correspondants aux composés lourds et légers associés à un même peptide présent dans les deux milieux, et de calculer le ratio lourd/léger pour faire un dosage relatif, en se fondant sur la différence d'intensité des ions dont le rapport m/z diffère du nombre d'atomes de deutérium ou de C13 introduits dans le marqueur de substitution (S'). En effet, comme précédemment expliqué, chacun des composés marqués est identifié grâce à sa perte spécifique à haut rendement du marqueur de substitution. La détection LIF permet quant à elle de quantifier de façon absolue la concentration totale des composés marqués (F)+(S) et (F)+(S') (lourd + léger) qui co- migrent. The mass spectrum makes it possible to identify the peaks corresponding to the heavy and light compounds associated with the same peptide present in the two media, and to calculate the heavy / light ratio to make a relative assay, based on the difference in intensity. ions whose ratio m / z differs from the number of deuterium or C13 atoms introduced into the substitution marker (S '). Indeed, as previously explained, each of the labeled compounds is identified by virtue of its specific high yield loss of the substitution marker. The LIF detection makes it possible to quantify in absolute terms the total concentration of the labeled compounds (F) + (S) and (F) + (S ') (heavy + light) which co-migrate.
Illustration: analyse de deux solutions contenant de la met-enképhaline Le mode opératoire suivi est illustré dans le présent exemple par l'analyse de deux solutions modèles de met-enképhaline. Dans cet exemple le marqueur (F) sera le NDA. Le marqueur (S) sera l'aminothiol G1 (HS-CH2CH2-N(CH3)2) et (S') sera l'hexadeutérodiméthyl2 aminoéthylthiol (HS-CH2CH2-N(CD3)2), noté G1D. Ces deux marqueurs ont une différence de masse = 6. Illustration: Analysis of two solutions containing met-enkephalin The procedure followed is illustrated in the present example by the analysis of two model solutions of met-enkephalin. In this example the marker (F) will be the NDA. The marker (S) will be aminothiol G1 (HS-CH2CH2-N (CH3) 2) and (S ') will be hexadeuterodimethyl2 aminoethylthiol (HS-CH2CH2-N (CD3) 2), denoted G1D. These two markers have a mass difference = 6.
É Analyse qualitative Préparation des échantillons On prépare les deux solutions modèles de met-enképhaline représentant les milieux M1 et M2 de concentrations Cl et C2 inconnues (ici de 500 nmol/1 et 100 nmol/1, respectivement), qui devront être déterminées. E Qualitative analysis Preparation of samples The two model solutions of met-enkephalin representing media M1 and M2 of unknown concentrations C1 and C2 (here of 500 nmol / 1 and 100 nmol / l, respectively), respectively, have to be determined.
On prend 1pl de milieu M1, on ajoute 5 pl de solution de NDA à 5 pmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7 avec 5 pl d'aminothiol léger G1 à 15 gmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. On répète l'opération avec le milieu M2, le NDA et l'aminothiol G1D. Puis les deux solutions sont mélangées volume à volume. 1 μl of medium M1 is added, 5 μl of NDA solution at 5 pmol / l in sodium tetraborate buffer at pH = 8.7 with 5 μl of light aminothiol G1 at 15 gmol / l in tetraborate buffer. sodium at pH = 8.7. The operation is repeated with the M2 medium, the NDA and the aminothiol G1D. Then both solutions are mixed volume to volume.
Séparation et analyse La séparation est effectuée en chromatographie liquide (Chromatographe HPLC Alliance Waters) sur une colonne de 3,5 m, 2,1 x150 mm (Waters X-Terra RP-18k), avec un débit de 400 gl/mn et un solvant préparé à partir du tampon A = (eau, 1% d'acide trifluoroacétique, pH=2) et de lacétonitrile. Le gradient d'élution est de 64% de tampon A / 36% d'acétonitrile pour le To en conditions isocratiques pendant 9 minutes, puis gradient linéaire jusqu'à 30% de tampon A / 70% d'acétonitrile, en 21 minutes. D'autres gradients de migration peuvent 10 15 être définis sans difficulté par l'homme de l'art. Le volume d'injection est de 5 pl (ou plus petit). A la sortie de la Separation and analysis The separation is carried out in liquid chromatography (HPLC Alliance Waters Chromatograph) on a 3.5 m column, 2.1 x 150 mm (Waters X-Terra RP-18k), with a flow rate of 400 gl / min and a solvent prepared from buffer A = (water, 1% trifluoroacetic acid, pH = 2) and lacetonitrile. The elution gradient is 64% A / 36% acetonitrile buffer for the To under isocratic conditions for 9 minutes, then linear gradient up to 30% buffer A / 70% acetonitrile, in 21 minutes. Other migration gradients can be readily defined by those skilled in the art. The injection volume is 5 pl (or smaller). At the exit of
colonne est connecté un capillaire sur lequel est fixé le détecteur LIF (ZETALIF 2000, Picometrics, 410 nm). Le capillaire est aussi connecté à la source ESI d'un spectromètre de masse ESIqTOF. column is connected a capillary on which is fixed the detector LIF (ZETALIF 2000, Picometrics, 410 nm). The capillary is also connected to the ESI source of an ESIqTOF mass spectrometer.
Le spectre de masse obtenu (non représenté) montre des ions (M+H)+ (pic m/z = 827,6) et (M+H+6)+ (pic m/z = 833,6) correspondant au composé marqué avec l'un ou l'autre des couples de marqueurs. A ces ions on peut associer un ion fils unique obtenu après la perte d'une part de la molécule marquée de NDA + Gl (à M+H-105 pour la perte de l'aminothiol léger G1) et d'autre part de la molécule marquée NDA + G1D (à M+H-6-105 pour la perte de daminothiol lourd G1D). Insistons encore une fois sur le fait que la perte est massive et est sélective de l'ion parent (M+H)+ ou (M+6+H)+. The mass spectrum obtained (not shown) shows ions (M + H) + (peak m / z = 827.6) and (M + H + 6) + (peak m / z = 833.6) corresponding to the compound marked with one or the other pair of markers. To these ions we can associate a single son ion obtained after the loss on the one hand of the NDA + Gl labeled molecule (at M + H-105 for the loss of the G1 light aminothiol) and on the other hand the NDA + G1D labeled molecule (at M + H-6-105 for G1D heavy daminothiol loss). Again, let us stress that the loss is massive and is selective of the parent ion (M + H) + or (M + 6 + H) +.
Le repérage de couples de pics présentant une différence de rapport m/z = 105 ou 105+6, permet d'affirmer que le composé détecté a bien été soumis au marquage et est donc bien une amine primaire. La masse de cet ion fils est de 827,7 ce permet d'identifier la méthionine enképhaline avec certitude. Le rapport des hauteurs des deux pics (M+H)+ / (M+H+6)+ mesuré sur le spectre est de 5. The identification of pairs of peaks having a difference in ratio m / z = 105 or 105 + 6 makes it possible to affirm that the detected compound has been well labeled and is therefore a primary amine. The mass of this ion son is 827.7 this allows to identify methionine enkephalin with certainty. The ratio of the heights of the two peaks (M + H) + / (M + H + 6) + measured on the spectrum is 5.
On conclut donc que le rapport des concentrations de la met-enképhaline dans le deux milieux étudiés est de 5. It is therefore concluded that the ratio of the concentrations of met-enkephalin in the two media studied is 5.
É Analyse quantitative Réalisation d'une courbe étalon Le composé étudié étant identifié, on peut maintenant préparer des solutions de différentes concentrations avec un produit du commerce pour établir une courbe étalon. Le protocole de dosage de la met-enképhaline marquée par NDA+G1 est le suivant. Quantitative Analysis Realization of a Standard Curve Since the test compound is identified, solutions of different concentrations can now be prepared with a commercial product to establish a standard curve. The assay protocol for NDE + G1 labeled met-enkephalin is as follows.
On mélange 111l de solution de met-enképhaline (Sigma) à diverses concentrations (de 50 nmol/1 à 1000 nmol/l), avec 5 pl de solution de NDA à 5 p.mol/l dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7, 5 l d'aminothiol G1 à 15 mol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. 111 μl of met-enkephalin solution (Sigma) at various concentrations (from 50 nmol / l to 1000 nmol / l) are mixed with 5 μl of NDA solution at 5 μmol / l in pH sodium tetraborate buffer. = 8.7, 5 l of aminothiol G1 at 15 mol / l in a sodium tetraborate buffer at pH = 8.7.
Les différentes solutions sont analysées en HPLC-LIF selon le même mode opératoire que ci-dessus. La fluorescence détectée par le détecteur LIF au niveau du pic du chromatogramme correspondant au composé étudié est fonction de la concentration en met-enképhaline. La courbe étalon obtenue est une droite d'équation (avec la concentration exprimée en nmol/l) : y = 310-4 [met-enképhaline] + 0,170. The different solutions are analyzed in HPLC-LIF according to the same procedure as above. The fluorescence detected by the detector LIF at the peak of the chromatogram corresponding to the test compound is a function of the concentration of met-enkephalin. The standard curve obtained is a line of equation (with the concentration expressed in nmol / l): y = 310-4 [met-enkephalin] + 0.170.
Dosage dans l'échantillon mixte Les couples de marqueurs utilisés pour préparer l'échantillon mixte de cet exemple étant chimiquement identiques, les molécules de met-enképhaline marquées comigrent et forment un pic unique en chromatographie, dont la fluorescence est proportionnelle à la concentration de met-enképhaline. La valeur de la fluorescence mesurée est de 0,350 RFU (Relative Fluorescence Unit). Il suffit de reporter l'intensité de la fluorescence mesurée au niveau du pic chromatographique sur la courbe étalon pour obtenir la valeur absolue de la concentration totale en met-enképhaline de l'échantillon mixte. Elle est égale à 600 nmol/l en tenant compte de la dilution. Assay in the mixed sample The pairs of markers used to prepare the mixed sample of this example being chemically identical, the labeled met-enkephalin molecules comigrate and form a single peak in chromatography, whose fluorescence is proportional to the concentration of met enkephalin. The measured fluorescence value is 0.350 RFU (Relative Fluorescence Unit). It is sufficient to report the intensity of the fluorescence measured at the level of the chromatographic peak on the standard curve to obtain the absolute value of the total met-enkephalin concentration of the mixed sample. It is equal to 600 nmol / l taking into account the dilution.
La concentration respective dans chaque milieu est calculée à partir du rapport 1:5 précédemment obtenu. Le résultat du calcul indique que le milieu M1 contient 500 nmol/l, tandis que le milieu M2 contient 100 nmol/l, ce qui est conforme aux concentrations fixées pour les solutions modèles de cet exemple. The respective concentration in each medium is calculated from the previously obtained 1: 5 ratio. The result of the calculation indicates that the medium M1 contains 500 nmol / l, while the medium M2 contains 100 nmol / l, which is in accordance with the concentrations fixed for the model solutions of this example.
Ainsi, le dosage relatif en MS et absolu en fluorescence permet de déterminer la concentration absolue du peptide léger dans le mélange lourd plus léger. La MS permet de le doser et de l'identifier sans ambiguïté grâce à la masse des ions (M+H-105), et M+H-111). Thus, the relative determination of DM and absolute fluorescence makes it possible to determine the absolute concentration of the light peptide in the lighter heavy mixture. The MS allows to dose and identify it unambiguously thanks to the mass of ions (M + H-105), and M + H-111).
Remarque Pour améliorer la sensibilité de détection on peut doser la molécule en MS/MS par la méthode dite "père recherche fils" (single ion monitoring ou multiple ion monitoring) ou encore "fils recherche père", bien connues de l'homme du métier. Ceci permet de disposer d'une valeur obtenue par une technique distincte à partir d'un même échantillon. Note To improve the detection sensitivity, the molecule can be assayed in MS / MS by the so-called "father research son" method (single ion monitoring or multiple ion monitoring) or "father research son", well known to those skilled in the art. . This makes it possible to have a value obtained by a different technique from the same sample.
Exemple 6Example 6
Marquage post colonne Les molécules portant une fonction amine primaire peuvent être marquées après la séparation chromatographique. Dans ce cas, le flux de liquide est soumis à la réaction de marquage en sortie de colonne chromatographique, puis dosé par détection LIF, et enfin entre dans la source ESI-MS. Cette méthode évite à l'expérimentateur d'effectuer la réaction de marquage précolonne. Post-column labeling Molecules carrying a primary amine function can be labeled after chromatographic separation. In this case, the liquid flow is subjected to the labeling reaction at the output of the chromatographic column, then assayed by LIF detection, and finally enters the source ESI-MS. This method prevents the experimenter from performing the precolumn labeling reaction.
Cette technique est illustrée par le marquage avec le marqueur de fluorescence (F)=aminothiol Gl et marqueur de substitution (S)=NDA. La séparation se fait en milieu pH=8,7 dans une micro-colonne C18 de 0,3 mm de diamètre avec un débit de 5 l/mn. A la sortie de la colonne est disposée une puce de réaction (Upchurch) à deux entrées-une sortie comportant une chambre de mélange. Le flux de liquide provenant de la colonne chromatographique entre dans l'entrée 1, un mélange NDA (4,3!mol) et d'aminothiol G1 (12,9 pmol/l) entre dans l'entrée 2 avec un débit de 5 pl/mn. La réaction de marquage se fait dans la puce de réaction. La sortie de la puce de réaction est raccordée au détecteur de fluorescence ou au détecteur LIF puis au spectromètre de masse, pour réaliser l'analyse comme précédemment décrit. This technique is illustrated by labeling with the fluorescence marker (F) = aminothiol Gl and substitution marker (S) = NDA. The separation is carried out in pH = 8.7 medium in a C18 microcolumn of 0.3 mm in diameter with a flow rate of 5 l / min. At the outlet of the column is disposed a reaction chip (Upchurch) with two inputs-an output having a mixing chamber. The flow of liquid from the chromatographic column enters the inlet 1, a mixture NDA (4.3 mol) and aminothiol G1 (12.9 pmol / l) enters the inlet 2 with a flow rate of 5 pl / min. The labeling reaction is in the reaction chip. The output of the reaction chip is connected to the fluorescence detector or to the detector LIF and then to the mass spectrometer, to carry out the analysis as previously described.
Exemple 7Example 7
Marquage par des couples de réactifs [(F),(S)] différents, de même hydrophobie. Marking by different pairs of reagents [(F), (S)] of the same hydrophobicity.
L'objectif ici est de mimer la technique d'électrophorèse DIGE (Dlfferencial Gel Electrophoresis) c'est-à-dire de d'utiliser deux agents fluorogènes excitables à deux longueurs d'onde différentes, mais ayant la même hydrophobie (Marouga R., David S., Hawkins E., Anal. Bioanal. Chem., 2005, 382, pp. 669-78). Par la technique DIGE on peut distinguer par fluorimétrie des composés ayant été co-élués. Cependant, une fois la fraction intéressante identifiée sur le gel, sa récupération en vue d'analyse complémentaire est problématique. L'intérêt de la méthode d'analyse selon l'invention est d'obtenir des composés marqués co-élués en sortie de chromatographe, pouvant être analysés par fluorimétrie et par MS sans traitement intermédiaire. The objective here is to mimic the technique of electrophoresis DIGE (Dlfferencial Gel Electrophoresis) that is to say to use two fluorogenic agents excitable at two different wavelengths, but having the same hydrophobicity (Marouga R. David S., E. Hawkins, Bioanal Anal, Chem., 2005, 382, pp. 669-78). By the DIGE technique it is possible to distinguish by fluorimetry compounds which have been co-eluted. However, once the interesting fraction identified on the gel, its recovery for further analysis is problematic. The advantage of the analysis method according to the invention is to obtain labeled compounds co-eluted at the chromatograph outlet, which can be analyzed by fluorimetry and by MS without intermediate treatment.
On utilise pour cela deux couples de marqueurs [(F1),(SI)] et [(F2),(S2)]. Two pairs of markers [(F1), (SI)] and [(F2), (S2)] are used for this purpose.
- [(F1),(S1)] : anthracène dialdéhyde (ADA) et aminothiol à chaîne carbonée courte par exemple HSCH2N(CH3)2 - [(F2),(S2)] : naphtalène dialdéhyde (NDA) et aminothiol à chaîne carbonée plus longue par exemple HSCH2N(CH2CH3)2. - [(F1), (S1)]: anthracene dialdehyde (ADA) and short chain aminothiol eg HSCH2N (CH3) 2 - [(F2), (S2)]: naphthalene dialdehyde (NDA) and carbon chain aminothiol longer eg HSCH2N (CH2CH3) 2.
L'hydrophobie du groupement fluorescent peut être modulée en utilisant des colorants portant des chaînes carbonées plus ou moins ramifiées. The hydrophobicity of the fluorescent group can be modulated by using dyes carrying more or less branched carbon chains.
Après marquage, on obtient les adduits qui, ayant la même hydrophobie en HPLC en phase inverse, ont le même temps d'élution. La sortie de la colonne HPLC est connectée au détecteur LIF, puis le capillaire entre dans la source du spectromètre de masse. Le protocole opératoire est similaire à celui qui est présenté dans l'exemple 4. After labeling, adducts are obtained which, having the same hydrophobicity in reverse phase HPLC, have the same elution time. The output of the HPLC column is connected to the LIF detector, then the capillary enters the source of the mass spectrometer. The operating protocol is similar to that presented in Example 4.
Les composés co-élués ont des propriétés de fluorescence différentes, des propriétés d'ionisation en MS proches, mais des masses différentes. Ainsi, par fluorescence et MS associées, ces composés sont différentiables et identifiables (analyse qualitative). Il sont dosables quantitativement si on dispose des amines primaires étalon interne. The co-eluted compounds have different fluorescence properties, ionization properties in close MS, but different masses. Thus, by fluorescence and associated MS, these compounds are differentiable and identifiable (qualitative analysis). They are quantitatively measurable if internal standard primary amines are available.
15 20 25 3015 20 25 30
Claims (35)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0509209A FR2890743B1 (en) | 2005-09-09 | 2005-09-09 | METHOD OF ASSAYING PRIMARY AMINES WITH VERY LOW CONCENTRATION |
| PCT/FR2006/002070 WO2007028906A2 (en) | 2005-09-09 | 2006-09-08 | Method for assaying primary amines in very low concentration |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0509209A FR2890743B1 (en) | 2005-09-09 | 2005-09-09 | METHOD OF ASSAYING PRIMARY AMINES WITH VERY LOW CONCENTRATION |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2890743A1 true FR2890743A1 (en) | 2007-03-16 |
| FR2890743B1 FR2890743B1 (en) | 2007-12-07 |
Family
ID=36579693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0509209A Expired - Fee Related FR2890743B1 (en) | 2005-09-09 | 2005-09-09 | METHOD OF ASSAYING PRIMARY AMINES WITH VERY LOW CONCENTRATION |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2890743B1 (en) |
| WO (1) | WO2007028906A2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE602008001609D1 (en) | 2007-03-19 | 2010-08-05 | Brains Online Holding B V | METHOD FOR DETERMINING AN ANALYTE WITH A PRIMARY AMINO GROUP AND KIT FOR LABELING THIS ANALYSIS |
| GB0819405D0 (en) | 2008-10-22 | 2008-11-26 | Oxtox Ltd | Assay method |
| CN115386056B (en) * | 2022-06-20 | 2024-07-26 | 中国人民解放军96901部队25分队 | Electrochromic conjugated organic polymer material and preparation method thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6265220B1 (en) * | 1998-06-29 | 2001-07-24 | Edwin F. Ullman | Assay for homocysteine |
-
2005
- 2005-09-09 FR FR0509209A patent/FR2890743B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-09-08 WO PCT/FR2006/002070 patent/WO2007028906A2/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6265220B1 (en) * | 1998-06-29 | 2001-07-24 | Edwin F. Ullman | Assay for homocysteine |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| METZ, ET AL.,: "Off-line Liquid Chromatographic-Mass Spectrometric Studies of Fluorescent betaaminothiol-o-phthalaldehyde Derivatives", J. CHROMATOGR., vol. 330, no. 2, 1985, pages 307 - 313, XP002386044 * |
| SIMONS, JR., ET AL.: "Structure and Properties of a Stable Isoindole. The Dimethyl Acetylenedicarboxylate-1-(Ethylthio)-2-eta-propylisoindole Substitution Product", J. ORG. CHEM., vol. 46, no. 23, 1981, pages 4739 - 4744, XP002386045 * |
| SIMPSON, ET AL.: "Off-line Liquid Chromatographic-Mass Spectrometric Studies of o-phthaladehyde-Primary Amine Derivatives", J. CHROMATOGR., vol. 261, no. 3, 1983, pages 407 - 414, XP002386043 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007028906A3 (en) | 2007-06-07 |
| WO2007028906A2 (en) | 2007-03-15 |
| FR2890743B1 (en) | 2007-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pu | Simultaneous determination of concentration and enantiomeric composition in fluorescent sensing | |
| Ta et al. | Twenty years of amino acid determination using capillary electrophoresis: A review | |
| Qu et al. | Validated quantitation of underivatized amino acids in human blood samples by volatile ion-pair reversed-phase liquid chromatography coupled to isotope dilution tandem mass spectrometry | |
| Wang et al. | Quantification of glutathione in plasma samples by HPLC using 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan as a fluorescent labeling reagent | |
| Xu et al. | Analytical methods for amino acid determination in organisms | |
| EP2336763A1 (en) | Method for analysis of compounds with amino group and analytical reagent thereof | |
| Poinsot et al. | Recent advances in amino acid analysis by CE | |
| Prior et al. | Chiral capillary electrophoresis with UV-excited fluorescence detection for the enantioselective analysis of 9-fluorenylmethoxycarbonyl-derivatized amino acids | |
| Attia et al. | A novel method for tyrosine assessment in vitro by using fluorescence enhancement of the ion-pair tyrosine-neutral red dye photo probe | |
| CN107014787B (en) | Application of glutathione template gold nanocluster in detection of cysteine and lysine | |
| Pelosi et al. | From radioactive ligands to biosensors: binding methods with olfactory proteins | |
| Li et al. | Highly sensitive trivalent copper chelate-luminol chemiluminescence system for capillary electrophoresis detection of epinephrine in the urine of smoker | |
| Gałęzowska et al. | Determination of amino acids in human biological fluids by high-performance liquid chromatography: Critical review | |
| Poinsot et al. | Recent advances in amino acid analysis by capillary electrophoresis | |
| Zhu et al. | Post-column derivatization for fluorescence and chemiluminescence detection in capillary electrophoresis | |
| Wuethrich et al. | Derivatisation for separation and detection in capillary electrophoresis (2012–2015) | |
| Hartung et al. | Performance of capillary electrophoresis instruments–state of the art and outlook | |
| Piechocka et al. | Chromatographic strategies for the determination of aminothiols in human saliva | |
| Naghashian-Haghighi et al. | Determination of enantiomeric excess of some amino acids by second-order calibration of kinetic-fluorescence data | |
| Prior et al. | Enantioselective micellar electrokinetic chromatography of dl‐amino acids using (+)‐1‐(9‐fluorenyl)‐ethyl chloroformate derivatization and UV‐induced fluorescence detection | |
| Chao et al. | A fluorescent sensor recognized by the FA1 site for highly sensitive detection of HSA | |
| FR2890743A1 (en) | METHOD OF ASSAYING PRIMARY AMINES WITH VERY LOW CONCENTRATION | |
| De Silva et al. | Direct detection of inorganic ions and underivatized amino acids in seconds using high-speed capillary electrophoresis coupled with back-scatter interferometry | |
| Wagner et al. | Enhancement of the fluorescence and stability of o-phthalaldehyde-derived isoindoles of amino acids using hydroxypropyl-β-cyclodextrin | |
| JPH0154668B2 (en) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 11 |
|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20170531 |