FR2877673A1 - Animaux modeles comprenant au moins une mutation ou un ki et un ko conditionnel - Google Patents
Animaux modeles comprenant au moins une mutation ou un ki et un ko conditionnel Download PDFInfo
- Publication number
- FR2877673A1 FR2877673A1 FR0411871A FR0411871A FR2877673A1 FR 2877673 A1 FR2877673 A1 FR 2877673A1 FR 0411871 A FR0411871 A FR 0411871A FR 0411871 A FR0411871 A FR 0411871A FR 2877673 A1 FR2877673 A1 FR 2877673A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- sequence
- nucleic acid
- recombinase
- cells
- combination
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 21
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 claims description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 102000006255 nuclear receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012301 transgenic model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
La présente invention concerne une combinaison de séquences d'ADN permettant de développer des animaux modèles comprenant d'une part une modification de son génome afin d'introduire soit un nouveau gène pour être exprimé (KI ou Knock In) soit une mutation dans un gène cible et d'autre part un KO (Knock Out), constitutif ou conditionnel, dans un gène cible.
Description
Animaux modèles comprenant au moins une mutation ou un M et un KO
conditionnel La présente invention concerne une combinaison de séquences d'ADN permettant de développer des animaux modèles comprenant d'une part une modification de son génome afin d'introduire soit un nouveau gène pour être exprimé (KI ou Knock In) soit une mutation dans un gène cible et d'autre part un KO (Knock Out), constitutif ou conditionnel, dans un gène cible.
La combinaison de séquences ADN selon l'invention permet de réaliser sur le même modèle animal plusieurs opérations nécessitant autrefois le développement et l'usage de plusieurs modèles distincts. Il permet par exemple, d'étudier avec le même modèle le phénotype obtenu par l'introduction d'une mutation dans la séquence du gène endogène ou de disposer d'un modèle transgénique par exemple exprimant le gène humain en lieu et place du gène endogène, puis après excision de l'ensemble effectuer un KO dans le gène d'insertion, permettant d'étudier le phénotype pour le modèle KO, ce KO pouvant être tissu spécifique ou ubiquitaire.
La combinaison de séquences d'ADN selon l'invention comprend une première séquence (S 1) et une deuxième séquence (S2) destinées à être insérés dans l'ADN génomique d'une cellule eucaryote d'un organisme hôte.
Par séquence d'ADN on entend selon l'invention une molécule d'ADN constituée par une séquence d'acides désoxyribonucléiques liés de manière covalente.
Pour la combinaison selon l'invention, les première et deuxième séquences S1 et S2 sont supportées soit sur deux vecteurs, soit sur un même vecteur, soit encore dans le génome d'au moins une cellule eucaryote d'un organisme hôte.
Par cellule eucaryote, on entend plus particulièrement selon l'invention toutes cellules d'origine animale, préférentiellement à l'exception de l'homme, en particulier les cellules de mammifères, préférentiellement de mammifères rongeurs, plus préférentiellement de rat ou de souris.
De manière préférentielle, la première et deuxième séquences sont intégrées dans l'ADN génomique d'une cellule eucaryote au sein d'un même gène cible, la première séquence S1 étant préférentiellement destinée à être intégré en aval du promoteur du gène cible.
De manière préférentielle la deuxième séquence S2 est destinée à être intégrée en aval du site d'intégration de la première séquence Si de préférence en aval d'exons important pour la fonction ou la fonctionnalité du gène cible La première séquence S1 de la combinaison selon l'invention comprend, dans le 5 sens 5'-3', les éléments suivants - Un premier site SR1 de reconnaissance d'une première recombinase R1, et - Un acide nucléique hétérologue, La deuxième séquence S2 de la combinaison selon l'invention comprend, dans le sens 5'-3', les éléments suivants Un premier site SR2 de reconnaissance d'une recombinase R2, Une séquence d'acide nucléique d'un gène codant pour un marqueur de sélection fonctionnel dans la cellule eucaryote dans le génome de laquelle il sera intégré Un second site SR2 de reconnaissance de la recombinase R2, et Le cas échéant, un second site SRI de reconnaissance de la recombinase R1.
Selon un premier mode particulier de réalisation de l'invention, l'acide nucléique hétérologue de la première séquence S1 est un acide nucléique codant pour un exon du gène cible, comprenant au moins une mutation. La séquence S1 est avantageusement intégrée dans le génome de la cellule cible de manière que l'exon muté de la séquence S1 vienne remplacer l'exon non muté du gène cible.
Parmi les gènes cibles, on peut citer les gènes associés aux récepteurs nucléaires, aux récepteurs membranaires, aux facteurs de transcription, etc. L'insertion de la combinaison de séquences dans le génome de l'organisme hôte peut conduire, après excision, à une délétion affectant un ou plusieurs gènes, par exemple lorsque le locus d'insertion porte plusieurs gènes ou parties de gènes, ou encore lorsque l'on laisse un grand fragment d'ADN génomique entre les deux séquences S1 et S2 selon l'invention.
Selon un deuxième mode particulier de réalisation de l'invention, l'acide nucléique hétérologue de la séquence S1 est un acide nucléique comprenant dans le sens 5'-3', les éléments suivants: Une séquence d'acide nucléique codant pour une séquence d'intérêt, et Un deuxième site SR1 de reconnaissance de la troisième recombinase R1, le site SR1 localisé en 3' de la séquence S2 n'est pas présent..
De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique codant pour une séquence d'intérêt dans la séquence S1 comprend, liés de manière fonctionnelle, des éléments fonctionnels nécessaires à l'arrêt de la transcription et de manière préférentielle des éléments fonctionnels nécessaires à l'initiation de la transcription.
Parmi les éléments nécessaires à l'initiation de la transcription, on peut citer ceux décrits notamment dans Baker et al ((1972) J Mol Biol.; 69:89-102.) et dans Georgiev 5 GP.((1972) Curr Top Dev Biol. 7, 1-60).
Parmi les éléments nécessaires à l'arrêt de la transcription, on peut citer ceux décrits notamment dans Proudfoot et al (Cell. (1991) 64,:671-4) et dans Beaudoing et al. (Genome Res. (2001) 11, 520-526).
La séquence d'intérêt de la séquence S1 selon l'invention est de préférence choisie 10 parmi les séquences suivantes: Une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide, en particulier une protéine d'intérêt, ou Une séquence d'acide nucléique codant pour un RNA, en particulier un RNA antisens ou un RNAi, miRNA, shRNA ou siRNA.
De manière avantageuse, la séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide est un ADNc, plus préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine. On citera notamment ceux décrits dans Li, et al. ((1997). J Cell Biol 139, 129-44), Schneider-Maunoury et al. ((1993). Cell 75, 1199-214) et Tajbakhsh et al. ((1996) Nature 384, 26670).
De manière avantageuse, le RNA antisens ou interférent permet d'inhiber la traduction d'ARNm cibles, préférentiellement choisis parmi les gènes suivants: GPCR, récepteurs nucléaires, récepteurs membranaires, cytokines, canaux ionique, etc. De manière avantageuse, les sites de reconnaissance de recombinases SR1 et SR2 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les sites Lox P, Lox P modifiés et FRT.
Les combinaisons préférées sont représentées sur le tableau ci-dessous.
SR1 SR2 Lox P Lox P modifié
FRT FRT
Lox P muté FRT FRT Lox P muté En fonction des sites de reconnaissance choisis, les recombinases R1 ou R2 sont choisies, indépendamment l'une de l'autre, parmi les recombinases suivantes: Cre ou FLP.
Les sites de reconnaissance Lox P, Lox P modifié, FRT et les recombinases Cre et FLP correspondantes sont bien connus de l'homme du métier, notamment décrits dans Kilby, et al. ((1993). Trends Genet 9, 413-21), Sauer, et Henderson ((1988). Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5166-70), Gu et al. ((1994). Science 265, 103-6), Cohen-Tannoudjiet Babinet ((1998). Mol Hum Reprod 4, 929-38), Shibata, et al. ((1997). Science 278, 120-3), Schlake et Bode ((1994). Biochemistry 33, 12746-51).
La présente invention concerne également un procédé de transformation de cellules eucaryotes pour intégrer dans son génome la combinaison de vecteurs selon l'invention.
Les méthodes d'intégration de séquences dans le génome de cellules eucaryotes sont bien connues de l'homme du métier, notamment décrites dans Smithies et al. ((1985). Nature 317, 230-4) et Wong et al. ((1986). Somat Cell Mol Genet 12, 63-72).
De manière préférentielle, les cellules sont des cellules animales transformées par les méthodes telles que décrites dans Vasquez et al ((2001) PNAS 98, 8403-8410) et Yanez et al ((1999), somatic cell and molecular genetics 25, 27-31).
La présente invention concerne aussi les cellules eucaryotes dans le génome desquelles est intégré la combinaison de vecteurs selon l'invention, plus préférentiellement les cellules animales telles que définies précédemment, en particulier souris ou rat.
Ces cellules selon l'invention peuvent être des cellules obtenues par intégration de la combinaison de séquences par le procédé selon l'invention. Elles peuvent également comprendre des cellules obtenues par prélèvement sur des animaux obtenus à partir desdites cellules obtenues par le procédé selon l'invention.
L'invention concerne également des embryons d'animaux obtenus à partir des cellules selon l'invention, ainsi que les animaux obtenus à partir de ces embryons et la descendance desdits animaux ayant conservé le vecteur selon l'invention. Les animaux selon l'invention sont définis précédemment à l'exception de l'homme, préférentiellement des mammifères, plus préférentiellement des mammifères rongeurs, encore plus préférentiellement des rats ou des souris.
Les animaux modèles ainsi obtenus peuvent être employés de la manière décrite ci-dessous.
Les méthodes de préparation d'animaux modèles sont bien connues de l'homme du métier, et notamment décrites pour le mouton (Wilmut et al. Nature 385, 810-813, 1997; WO 97 07669), la souris (Wakayama et al. Nature 394, 369-374, 1998; WO 99 37143), les bovins (Wells et al. Biol. Reprod. 60, 996-1005, 1999), la chèvre (Baguisi et al. Nature Biotechnol. 17, 456-461, 1999; WO 00 25578), le porc (Polejaeva et al. Nature 407, 86- 90, 2000), le lapin (Chesne et al. Nature Biotechnol. 20, 366-369, 2002) et le rat (Zhou & al., Science, 25 septembre 2003; PCT/FR04/001275). Les méthodes de transfert nucléaire sont notamment décrites par Campbell & al. (Nuclear transfer in practice, School of Biosciences, University of Nottingham, Leicestershire, United Kingdom).
La première application concerne le développement d'un modèle porteur d'une mutation dans un exon porteur d'un domaine fonctionnel (S 1). Ce modèle permet d'étudier le phénotype créé par cette mutation.
Dans un second temps, il est possible de le comparer au phénotype obtenu par une inactivation complète de la fonction du gène (KO) en croisant cet animal avec un animal exprimant une recombinase (Cre ou Flp selon les sites SR utilisés) de façon ubiquitaire. Cette comparaison de phénotype peut être par la suite raffinée en inactivant le gène de façon tissue spécifique en utilisant des animaux exprimant la recombinase de façon tissue spécifique ou en délivrant la recombinase de façon ectopique (virus, ...).
La seconde application concerne le développement d'un modèle dans lequel a été substitué le gène humain au gène de souris (S 1). Ce modèle humanisé fournit un outil d'étude in vivo de molécules et de drogues qui est plus relevant que l'animal de départ. Plus l'écart entre la protéine Humaine et la protéine de souris est importante et plus ce modèle est pertinent.
Dans un second temps, il est possible de disposer d'un modèle KO pour cette forme humaine en croisant cet animal humanisé avec un animal exprimant une recombinase (Cre ou Flp suivant les sites SR utilisés) de façon ubiquitaire. Ce nouveau modèle est particulièrement adapté pour étudier la toxicité et les effets non spécifiques des molécules testées. Cette étude peut être par la suite raffinée en inactivant le gène de façon tissue spécifique en utilisant des animaux exprimant la recombinase de façon tissue spécifique ou en délivrant la recombinase de façon ectopique (virus, ...).
Exemple 1: Souris KO exempte d'expression du gène Prpf31 La stratégie employée permet de générer un modèle de souris KO exempt d'expression du gène Prpf31 par la génération d'un modèle qui a à la fois un point de mutation Kin qui mime la mutation A216P chez l'homme et une délétion conditionnelle du domaine NOP.
Ce modèle sera obtenu en introduisant un point de mutation dans l'exon 7 en introduisant deux sites LoxP aux deux extrémités de l'exon 7. La stratégie de développement du modèle est exposée sur la figure 2. Sur cette figure, les triangles rouges représentent les sites LoxP, les doubles triangles jaunes représentent les sites FRT, la boîte pourpre représente la cassette de résistance Neo, la boîte orange représente la cassette de sélection négative DTA, les boîtes noires représentent les exons et l'astérisque au dessus de l'exon 7 schématise la mutation qui y est introduit.
L'injection des cellules cibles ES 2 dans les blastocystes va permettre de générer le point de mutation Kin du modèle. L'accouplement de la lignée cellulaire Kin avec une souris exprimant Cre de manière tissus spécifique va permettre la génération de souris modèles KO du domaine NOP tissus spécifique.
La stratégie choisie comprend les étapes suivantes: clonage et séquençage de la région ciblée du gène murin 129Sv Prpf3l construction d'un vecteur de ciblage permettant à la fois de générer un point de mutation et un KO conditionnel du domaine NOP Electroporation du vecteur de ciblage dans les cellules ES et sélection des événements de recombinaison homologue Excision in vitro via Flip de la cassette de sélection Injection des cellules ES dans les blastocystes Génération de souris chimères et génotypage pour la caractérisation des mutants hétérozygotes.
Exemple 2: Souris KO exempte d'expression du gène C3Ra La stratégie employée permet de générer un modèle de souris KO exempt d'expression du gène murin C3Ra par la génération d'un modèle qui a à la fois un Kin de la forme Humaine et une délétion conditionnelle du gène humain.
La stratégie de développement du mofèle est exposée sur la figure 1. Sur cette figure, les triangles bleus représentent les sites LoxP, les doubles triangles rouges représentent les sites FRT, la boîte blanche représente la cassette de résistance Neo. L'action de la recombinase Flip permet d'obtenir un modèle humanisé propre. L'action de la recombinase Cre tissue specifique ou ubiquitaire permet d'obtenir un KO tissue specifique ou ubiquitaire.
Claims (10)
1. Combinaison de séquences d'ADN comprenant une première séquence Si et une deuxième séquence S2 destinées à être insérés dans un gène cible d'une cellule eucaryote, 5 caractérisée en ce que la première séquence S1 comprend, dans le sens 5'-3', les éléments suivants Un premier site SR1 de reconnaissance d'une première recombinase R1, et - Un acide nucléique hétérologue, et la deuxième séquence S2 comprend, dans le sens 5'-3', les éléments suivants Un premier site SR2 de reconnaissance d'une recombinase R2, Une séquence d'acide nucléique d'un gène codant pour un marqueur de sélection fonctionnel dans la cellule eucaryote dans le génome de laquelle il sera intégré Un second site SR2 de reconnaissance de la recombinase R2, et - Le cas échéant, un second site SR1 de reconnaissance de la recombinase R1.
2. Combinaison selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'acide nucléique hétérologue de la séquence S1 est un acide nucléique codant pour un exon du gène cible, comprenant au moins une mutation, destiné à être dans le génome de la cellule cible de manière que l'exon muté de la séquence S1 vienne remplacer l'exon non muté du gène cible.
3. Combinaison selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique dans la séquence S1 est une séquence d'acide nucléique comprenant, liés de manière fonctionnelle, des éléments fonctionnels nécessaires à l'initiation de la transcription et/ou des éléments fonctionnels nécessaires à l'arrêt de la transcription.
4. Combinaison selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'acide nucléique hétérologue de la séquence S1 comprend une séquence d'intérêt choisie parmi les séquences suivantes: Une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide, en particulier une protéine d'intérêt, ou Une séquence d'acide nucléique codant pour un RNA, en particulier un RNA antisens ou un RNAi, miRNA, shRNA ou siRNA.
5. Combinaison selon la revendication 4, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide est un ADNc, plus préférentiellement un ADNc codant pour un polypeptide d'origine humaine.
6. Combinaison selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les sites de reconnaissance de recombinases SR1 et SR2 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, parmi les sites Lox P, Lox P modifiés et FRT.
7. Cellules eucaryotes dans le génome desquelles est intégré la combinaison de 5 séquences selon l'une des revendications 1 à 6.
8. Cellules selon la revendication 7, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les cellules de mammifères, à l'exception de l'homme, préférentiellement de mammifères rongeurs, de préférence rat ou souris.
9. Embryons d'animaux, à l'exception de l'homme, obtenus à partir des cellules selon 10 l'une des revendications 7 ou 8.
10. Animaux obtenus à partir des embryons selon la revendication 9, comprenant des cellules selon l'une des revendications 7 ou 8, à l'exception de l'homme.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0411871A FR2877673A1 (fr) | 2004-11-08 | 2004-11-08 | Animaux modeles comprenant au moins une mutation ou un ki et un ko conditionnel |
| PCT/EP2005/055826 WO2006048465A2 (fr) | 2004-11-08 | 2005-11-08 | Animaux modèles comprenant au moins une mutation ou un ki et un ko conditionnel |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0411871A FR2877673A1 (fr) | 2004-11-08 | 2004-11-08 | Animaux modeles comprenant au moins une mutation ou un ki et un ko conditionnel |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2877673A1 true FR2877673A1 (fr) | 2006-05-12 |
Family
ID=34952520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0411871A Withdrawn FR2877673A1 (fr) | 2004-11-08 | 2004-11-08 | Animaux modeles comprenant au moins une mutation ou un ki et un ko conditionnel |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2877673A1 (fr) |
| WO (1) | WO2006048465A2 (fr) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010149765A1 (fr) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Modèles animaux non humains de l'augmentation de la perméabilité vasculaire rétinienne |
| US20120311728A1 (en) | 2009-11-06 | 2012-12-06 | Ziad Mallat | Methods and pharmaceutical composition for the treatment of atherosclerosis |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030165497A1 (en) * | 2000-07-19 | 2003-09-04 | Lioubin Mario N. | RRP sequences and knockout mice and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1116790A1 (fr) * | 2000-01-14 | 2001-07-18 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Modele murin caracterise par la mutation conditionelle du gene smn - utilisation pour l'etude de l'atrophie musculaire spinale et d'autres maladies neurodégénératives et myopathies musculaires |
| CA2428972A1 (fr) * | 2003-05-30 | 2004-11-30 | Wyeth | Methode d'inactivation conditionnelle a l'aide d'un silenceur inductible pour le piegeage et le ciblage de genes |
| EP1483962A3 (fr) * | 2003-06-06 | 2005-01-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Modèle animal transgénique de la fonction de Glyt1 |
-
2004
- 2004-11-08 FR FR0411871A patent/FR2877673A1/fr not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-11-08 WO PCT/EP2005/055826 patent/WO2006048465A2/fr active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030165497A1 (en) * | 2000-07-19 | 2003-09-04 | Lioubin Mario N. | RRP sequences and knockout mice and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CASANOVA EMILIO ET AL: "Construction of a conditional allele of RSK-B/MSK2 in the mouse", GENESIS THE JOURNAL OF GENETICS AND DEVELOPMENT, vol. 32, no. 2, February 2002 (2002-02-01), pages 158 - 160, XP009048883, ISSN: 1526-954X * |
| REN SHU-YUE ET AL: "A Hoxa2 mutant conditional allele generated by Flp- and Cre-mediated recombination", GENESIS THE JOURNAL OF GENETICS AND DEVELOPMENT, vol. 32, no. 2, February 2002 (2002-02-01), pages 105 - 108, XP009048884, ISSN: 1526-954X * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2006048465A3 (fr) | 2006-07-13 |
| WO2006048465A2 (fr) | 2006-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2017268458B2 (en) | Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide RNAS | |
| Yoshimi et al. | ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes | |
| Remy et al. | Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation | |
| Seibler et al. | Rapid generation of inducible mouse mutants | |
| Ruan et al. | Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs | |
| Lipkin et al. | Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice | |
| Miura et al. | CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA | |
| AU2014253942B2 (en) | Targeted modification of rat genome | |
| Yang et al. | Identification and characterization of rabbit ROSA26 for gene knock-in and stable reporter gene expression | |
| EP3546575B1 (fr) | Procédé d'édition du génome | |
| US20110107445A1 (en) | Efficient Insertion of DNA Into Embryonic Stem Cells | |
| Sakurai et al. | A non-inheritable maternal Cas9-based multiple-gene editing system in mice | |
| Kanatsu-Shinohara et al. | Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells | |
| Murakami et al. | CRISPR/Cas9 nickase‐mediated efficient and seamless knock‐in of lethal genes in the medaka fish Oryzias latipes | |
| Liu et al. | A modified TALEN-based strategy for rapidly and efficiently generating knockout mice for kidney development studies | |
| JP2023544987A (ja) | 編集効率が向上したプライム編集ベースの遺伝子編集用組成物およびその用途 | |
| CN115279900A (zh) | 用于切割靶序列的经优化方法 | |
| WO2006048465A2 (fr) | Animaux modèles comprenant au moins une mutation ou un ki et un ko conditionnel | |
| EP1814998B1 (fr) | Animaux modeles comprenant au moins un ko et un ki conditionnel | |
| Pramod et al. | Intratesticular injection followed by electroporation allows gene transfer in caprine spermatogenic cells | |
| Park et al. | Suppressing mosaicism by Au nanowire injector-driven direct delivery of plasmids into mouse embryos | |
| EP4230738A1 (fr) | Composition d'édition de gènes basée sur l'édition primaire avec une efficacité d'édition améliorée et son utilisation | |
| Petrezselyova et al. | Homology arms of targeting vectors for gene insertions and CRISPR/Cas9 technology: size does not matter; quality control of targeted clones does | |
| Mangerich et al. | A caveat in mouse genetic engineering: ectopic gene targeting in ES cells by bidirectional extension of the homology arms of a gene replacement vector carrying human PARP-1 | |
| FR2822161A1 (fr) | Cellule et animal transgenique modelisant les reponses humaines allergiques mediees par les ige, et leurs utilisations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |
Effective date: 20100730 |