FR2867388A1 - Reducing concentration of infectious prions, useful for treating animal tissue and fodder to prevent spread of spongiform encephalopathy, by incubation with bacteria that secrete hydrolytic enzymes active on prion protein - Google Patents
Reducing concentration of infectious prions, useful for treating animal tissue and fodder to prevent spread of spongiform encephalopathy, by incubation with bacteria that secrete hydrolytic enzymes active on prion protein Download PDFInfo
- Publication number
- FR2867388A1 FR2867388A1 FR0450513A FR0450513A FR2867388A1 FR 2867388 A1 FR2867388 A1 FR 2867388A1 FR 0450513 A FR0450513 A FR 0450513A FR 0450513 A FR0450513 A FR 0450513A FR 2867388 A1 FR2867388 A1 FR 2867388A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- prion protein
- process according
- bacteria
- contaminated
- infectious prion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
- A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
- A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
- A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
- A23B4/00—General methods for preserving meat, sausages, fish or fish products
- A23B4/14—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12
- A23B4/18—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12 in the form of liquids or solids
- A23B4/20—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23B4/22—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/20—Animal feeding-stuffs from material of animal origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
- A23L13/10—Meat meal or powder; Granules, agglomerates or flakes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
- A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
- A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
- A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Domaine de l'inventionField of the invention
La présente invention concerne des compositions et des méthodes pour la destruction de protéines prion infectieuses associées avec l'encéphalite spongiforme affectant les espèces animales, notamment bovines et ovines. Plus spécifiquement, l'invention concerne l'utilisation de bactéries pour la destruction de protéines prion infectieuses contenues dans les tissus animaux. The present invention relates to compositions and methods for the destruction of infectious prion proteins associated with spongiform encephalitis affecting animal species, in particular bovine and ovine species. More specifically, the invention relates to the use of bacteria for the destruction of infectious prion proteins contained in animal tissues.
Art antérieur Les protéines prion sont des protéines anormalement conformées qui sont associées à des maladies neuro- dégénératives infectieuses. Les maladies liées aux prions dans les espèces de mammifères non humaines incluent la scrapie chez le mouton, certaines encéphalopathies comme l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB), l'encéphalopathie spongiforme féline, l'encéphalopathie spongiforme simienne. PRIOR ART Prion proteins are abnormally conformed proteins that are associated with infectious neuro-degenerative diseases. Prion-related diseases in non-human mammalian species include scrapie in sheep, some encephalopathies such as bovine spongiform encephalopathy (BSE), feline spongiform encephalopathy, simian spongiform encephalopathy.
La protéine prion pathogène catalyse la transformation de la protéine normale, physiologique en une forme amyloïde insoluble. Les protéines prion des mammifères comprennent un haut degré d'homologie (85 à 97%). Ces protéines sont donc capables, après introduction dans un autre organisme, de provoquer la transformation des protéines prions normales endogènes (Prusiner 1998). L'infection des bovins a ainsi été associée à la présence, dans la nourriture de ces derniers, de farines de viandes et d'os d'animaux, désignées ci-après sous le terme générique de farines animales , provenant d'animaux contaminés par une protéine prion pathogène. The pathogenic prion protein catalyzes the transformation of the normal, physiological protein into an insoluble amyloid form. Prion proteins of mammals include a high degree of homology (85 to 97%). These proteins are therefore capable, after introduction into another organism, to cause the transformation of endogenous normal prion proteins (Prusiner 1998). The infection of cattle has thus been associated with the presence in their food of animal meat and bone meal, hereinafter referred to generically as animal meal, from animals infected with a pathogenic prion protein.
L'existence de farines animales provenant d'animaux contaminés par I'ESB, du fait de l'accumulation de la forme amyloïde insoluble de la protéine prion, présente de nombreux problèmes d'ordres économique, technique et environnemental. The existence of animal meal from animals contaminated with BSE, due to the accumulation of the insoluble amyloid form of the prion protein, presents many economic, technical and environmental problems.
En effet, la forme amyloïde insoluble de la protéine prion (PrPsc), qui est la forme infectieuse et pathogène de la protéine, est très stable. Cette protéine est riche en feuillets p, résistante à la chaleur et aux enzymes protéolytiques les plus actives, comme par exemple la protéinase K (Prusiner, 1998). Par conséquent, aujourd'hui dans beaucoup de pays, les produits d'origine animale qui pourraient servir de base comme supplément nutritionnel pour les animaux, tels que les farines animales, sont incinérés. Puis, les résidus de cendres sont détruits de manière à éviter une transmission de la protéine prion infectieuse à d'autres animaux. Indeed, the insoluble amyloid form of the prion protein (PrPsc), which is the infectious and pathogenic form of the protein, is very stable. This protein is rich in p-sheets, resistant to heat and the most active proteolytic enzymes, such as proteinase K (Prusiner, 1998). Therefore, in many countries today, animal products that could be used as a nutritional supplement for animals, such as animal meal, are incinerated. Then, the ash residues are destroyed so as to prevent transmission of the infectious prion protein to other animals.
En Europe, l'utilisation des farines animales et de leurs sous-produits en tant que nourriture a été interdite. Aux Etats-Unis, plusieurs cas d'encéphalite spongiforme bovine ont été rapportés, et les industriels ont été contraints à des réglementations plus sévères de manière à prévenir le développement des maladies liées au prion. In Europe, the use of animal meal and their by-products as food has been banned. In the United States, several cases of bovine spongiform encephalitis have been reported, and industrialists have been forced into stricter regulations to prevent the development of prion-related diseases.
Une grande variété de tests pour déterminer la présence de protéines prion infectieuses dans les tissus animaux a été développée, incluant des tests de type Western blot, des tests d'immunodétection de type sandwich, des tests ELISA, des tests fluoroimmunologiques, des tests d'électrophorèse capillaire, et des tests de liaison aux plasminogènes. Cependant peu de méthodes applicables industriellement pour détruire la protéine prion infectieuse ont été développées. A wide variety of tests to determine the presence of infectious prion proteins in animal tissues has been developed, including Western blot assays, sandwich-type immunodetection assays, ELISA assays, fluoro-immunological assays, assay tests, and assays. capillary electrophoresis, and plasminogen binding assays. However, few industrially applicable methods for destroying the infectious prion protein have been developed.
Les protéines prion infectieuses sont résistantes aux méthodes de destruction conventionnelles qui permettent de dénaturer les protéines, incluant par exemple l'autoclavage, la congélation, et l'exposition à des réactifs fortement délétères pour les bactéries, comme le formaldéhyde, l'acide carboxylique et le chloroforme. A titre illustratif, la protéine prion infectieuse résiste à des températures de l'ordre de 200 C. Actuellement seuls l'incinération ou encore le traitement avec des agents de blanchiment sont utilisés en pratique pour détruire l'isoforme pathogène de la protéine prion. Infectious prion proteins are resistant to conventional methods of destruction that can denature proteins, including, for example, autoclaving, freezing, and exposure to highly deleterious reagents for bacteria, such as formaldehyde, carboxylic acid, and the like. chloroform. By way of illustration, the infectious prion protein is resistant to temperatures of the order of 200 ° C. At present only incineration or treatment with bleaching agents are used in practice to destroy the pathogenic isoform of the prion protein.
Une autre méthode de destruction de la protéine prion est 35 décrite dans la demande de brevet WO 02/083082. Cette méthode consiste à utiliser des enzymes, notamment des kératinases provenant d'une bactérie Bacilus licheniformis pour réduire la quantité de protéine prion infectieuse. Néanmoins, cette méthode comprend des inconvénients d'ordres technique et économique. Another method of destroying the prion protein is described in patent application WO 02/083082. This method involves the use of enzymes, including keratinases from a bacterium Bacilus licheniformis to reduce the amount of infectious prion protein. Nevertheless, this method has technical and economic disadvantages.
En effet, la mise en oeuvre de cette méthode implique des étapes nombreuses telles que la culture des bactéries, l'extraction des enzymes protéolytiques ou encore le stockage de ces dernières, opérations qui peuvent s'avérer onéreuses à un niveau industriel. Indeed, the implementation of this method involves many steps such as the culture of bacteria, the extraction of proteolytic enzymes or the storage of the latter, which can be expensive on an industrial level.
Il existe donc dans l'état de la technique, un besoin pour de nouvelles compositions et de nouvelles méthodes pour détruire la protéine prion infectieuse qui sont applicables au traitement de matériaux biologiques, comme les tissus animaux, comprenant une protéine prion infectieuse. There is thus in the state of the art a need for novel compositions and methods for destroying the infectious prion protein that are applicable to the treatment of biological materials, such as animal tissues, comprising an infectious prion protein.
Ce besoin est d'autant plus important que plus de 180.000 cas d'ESB et 100 cas de maladie de Creutzfeldt-Jakob ont été rapportés en Europe depuis 1992, et les cas dans l'espèce humaine devraient augmenter de manière significative. L'expansion de ces maladies est difficile à contenir puisque de telles maladies ne bénéficient aujourd'hui d'aucun traitement thérapeutique. Notamment, la protéine prion pathogène n'est pas immunogène. Des efforts importants ont été réalisés pour étudier l'ESB, ainsi que le processus de contamination de la nourriture humaine par la protéine prion. This need is all the more important as more than 180,000 cases of BSE and 100 cases of Creutzfeldt-Jakob disease have been reported in Europe since 1992, and cases in the human species are expected to increase significantly. The expansion of these diseases is difficult to contain since such diseases do not benefit today from any therapeutic treatment. In particular, the pathogenic prion protein is not immunogenic. Significant efforts have been made to study BSE, as well as the process of contamination of human food by the prion protein.
Dans l'espèce humaine, les maladies neuro-dégénératives associées aux protéines prion incluent la maladie de Creutzfeldt-Jakob, le syndrome Gerstmann-Stràussler-Scheinker, l'insomnie fatale, le kuru, et les variants de la maladie de Creutzfeldt-Jakob. Ces pathologies humaines sont associées à la consommation d'une nourriture carnée (boeuf infecté par I'ESB, agent causal du nouveau variant de la maladie de CreutzfeldtJakob), à l'utilisation de l'hormone de croissance humaine contaminée par les prions infectieux (provoquant la maladie de Creutzfeldt-Jakob) et au cannibalisme rituel (qui entraîne la maladie de Kuru). In the human species, neurodegenerative diseases associated with prion proteins include Creutzfeldt-Jakob disease, Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, fatal insomnia, kuru, and variants of Creutzfeldt-Jakob disease. These human pathologies are associated with the consumption of meat food (beef infected with BSE, causative agent of the new variant of Creutzfeldt Jakob disease), with the use of human growth hormone contaminated with infectious prions ( causing Creutzfeldt-Jakob disease) and ritual cannibalism (which causes Kuru's disease).
La recherche de nouvelles compositions et de nouvelles méthodes pour détruire la protéine prion infectieuse est donc d'importance, tant dans le domaine agronomique que dans le domaine de la santé humaine. The search for new compositions and new methods for destroying the infectious prion protein is therefore of importance, both in the agronomic domain and in the field of human health.
Avantageusement, ces nouvelles techniques devront de préférence être moins consommatrices d'énergie, techniquement plus simples, et plus économiques que les techniques connues. De plus, ces nouvelles techniques devraient ne pas entraîner la destruction totale de la matière à décontaminer comme cela peut-être le cas avec l'incinération. Advantageously, these new techniques should preferably be less energy consuming, technically simpler, and more economical than known techniques. In addition, these new techniques should not result in the total destruction of the material to be decontaminated as may be the case with incineration.
Sommaire de l'inventionSummary of the invention
L'invention concerne un procédé de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière sous forme liquide, sous forme de particules ou sous forme de fibres, contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant: - une étape (a) consistant à mettre en contact et mélanger ladite matière contaminée avec au moins une bactérie, qui sécrète une ou plusieurs enzymes hydrolytiques, y compris protéolytiques, vis-à- vis de ladite protéine prion infectieuse et, une étape (b) d'incubation de la ou des bactéries avec ladite matière contaminée pendant une période de temps suffisante à l'obtention d'un pourcentage de réduction désiré de la concentration en protéine prion infectieuse dans ladite matière contaminée. The invention relates to a method for reducing the concentration of infectious prion protein of a material in liquid form, in particle form or in fiber form, contaminated or suspected of being contaminated with the infectious prion protein comprising: - a step (a) contacting and mixing said contaminated material with at least one bacterium which secretes one or more hydrolytic enzymes, including proteolytic enzymes, with respect to said infectious prion protein and a step (b) of incubating the bacteria or bacteria with said contaminated material for a period of time sufficient to obtain a desired percentage reduction in the concentration of infectious prion protein in said contaminated material.
L'invention concerne également des procédés tels que définis ci-dessus, pour lesquels l'étape (a) est précédée d'une étape de chauffage de la matière contaminée à une température et pendant une période de temps suffisantes pour augmenter la sensibilité de la protéine prion infectieuse à la protéolyse. The invention also relates to processes as defined above, for which step (a) is preceded by a step of heating the contaminated material to a temperature and for a period of time sufficient to increase the sensitivity of the infectious prion protein to proteolysis.
L'invention a également pour objet une composition nettoyante pour réduire la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant au moins une bactérie telle que définie dans le procédé ci-dessus. The invention also relates to a cleaning composition for reducing the concentration of infectious prion protein of a contaminated material or suspected to be contaminated with the infectious prion protein comprising at least one bacterium as defined in the above process.
Description des fiquresDescription of the fictures
Figure 1 Zymogrammes des surnageants provenant des bactéries 5 thermophiles et S290 SDS-PAGE 10%, piste 1: surnageants de souche AT1243 (incubation à 80 C), piste 2: surnageants de souche AT1222 (incubation à 80 C). piste 3: surnageants de souche S290. Figure 1 Zymograms of supernatants from thermophilic bacteria and S290 SDS-PAGE 10%, lane 1: supernatants of strain AT1243 (incubation at 80C), lane 2: supernatants of strain AT1222 (incubation at 80C). lane 3: supernatants of strain S290.
Figure 2 Hydrolyse de la protéine prion recombinante par les surnageants de bactéries thermophiles. Figure 2 Hydrolysis of the recombinant prion protein by supernatants of thermophilic bacteria.
(a) Pistes 1 à 6: protéine prion native, protéine prion hydrolysée par les surnageants des souches S290 (60 C), AT1243 (80 C), AT1222 (80 C), AT1243 (60 C), et AT1222 (60 C) 15 pendant cinq heures, respectivement. (a) lanes 1 to 6: native prion protein, prion protein hydrolysed by the supernatants of strains S290 (60 C), AT1243 (80 C), AT1222 (80 C), AT1243 (60 C), and AT1222 (60 C) For five hours, respectively.
(b) Pistes 1 à 6: protéine prion dénaturée thermiquement (PrPde") PrPden hydrolysée par les surnageants des souches S290 (60 C), AT1243 (80 C), AT1222 (80 C), AT1243 (60 C), et AT1222 (60 C) pendant cinq heures, respectivement. (b) lanes 1 to 6: thermally denatured prion protein (PrPde) PrPden hydrolyzed by supernatants of strains S290 (60C), AT1243 (80C), AT1222 (80C), AT1243 (60C), and AT1222 ( 60 C) for five hours, respectively.
(c) Pistes 1 à 6: protéine prion native en présence de Cul+ (PrPc"), PrPc" hydrolysée par les surnageants des souches S290 (60 C), AT1243 (80 C), AT1222 (80 C), AT1243 (60 C), et AT1222 (60 C) pendant cinq heures, respectivement. (c) lanes 1 to 6: native prion protein in the presence of Cul + (PrPc "), PrPc" hydrolyzed by the supernatants of strains S290 (60C), AT1243 (80C), AT1222 (80C), AT1243 (60C) ), and AT1222 (60 C) for five hours, respectively.
Figure 3 Hydrolyse de farines animales par les surnageants de bactéries thermophiles et par la protéinase K. (a)Les pistes 1 à 16 représentent respectivement: des farines de laine/poils (1), des farines de laine/poils hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 à 80 C (2), AT1222 à 80 C (3), et S290 à 60 C (4) des farines de viande (5), des farines de viande hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 (6) et AT1222 (7), et S290 (8) des farines de sang (9), des farines de sang hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 (10) et AT1222 (11), et S290 (12) des farines mixtes (13), des farines mixtes hydrolysées par les surnageants des souches AT1243 (14) et AT1222 (15) et S290 (16). Les temps d'incubation sont de 20 heures. FIG. 3 Hydrolysis of animal meal by the supernatants of thermophilic bacteria and by proteinase K. (a) Lanes 1 to 16 represent respectively: wool / hair flours (1), wool / hair flours hydrolysed by the supernatants of strains AT1243 at 80 C (2), AT1222 at 80 C (3), and S290 at 60 C (4) meat flours (5), meat flours hydrolysed by the supernatants of strains AT1243 (6) and AT1222 ( 7), and S290 (8) blood flours (9), blood flours hydrolysed by the supernatants of strains AT1243 (10) and AT1222 (11), and S290 (12) mixed flours (13), flours mixed hydrolyzed by supernatants of strains AT1243 (14) and AT1222 (15) and S290 (16). The incubation times are 20 hours.
(b)Les pistes 1 à 8 représentent respectivement: des farines de laine/poils (1), des farines de laine/poils hydrolysées par la protéinase K (1 pM, 37 C) (2), des farines de viande (3), des farines de viande hydrolysées par la protéinase K 4, des farines de sang (5), des farines de sang hydrolysées par la protéinase K (6), des farines mixtes (7), des farines mixtes hydrolysées par la protéinase K (8). Les temps d'incubation sont de 20 heures. (b) Lanes 1 to 8 represent respectively: wool / hair flours (1), wool / hair flours hydrolyzed by proteinase K (1 μM, 37 C) (2), meat flours (3) , protein-K 4 hydrolyzed meat-and-bone meal, blood meal (5), Proteinase K-hydrolyzed blood meal (6), mixed flours (7), protein-K-hydrolyzed mixed flours (8) ). The incubation times are 20 hours.
Description détaillée de l'invention Detailed description of the invention
Partant du constat que les procédés disponibles dans l'état de la technique pour détruire la protéine prion sont assez complexes et présentent des inconvénients d'ordre technique ou économique, les inventeurs se sont attaché à rechercher des bactéries capables de se multiplier sur les substrats à décontaminer et de produire simultanément in situ des enzymes protéolytiques efficaces contre le prion. On the basis of the fact that the methods available in the state of the art for destroying the prion protein are rather complex and have technical or economic disadvantages, the inventors have endeavored to look for bacteria capable of multiplying on the substrates of the invention. decontaminate and simultaneously produce in situ proteolytic enzymes effective against the prion.
En premier lieu, la résolution du problème de réduction du caractère pathogène des farines animales à l'aide de microorganismes a requis, de la part des inventeurs, l'étude préalable de l'activité de protéases sécrétées par de tels micro- organismes sur des substrats modèles. In the first place, solving the problem of reducing the pathogenicity of animal meal with the aid of microorganisms has required, on the part of the inventors, the preliminary study of the activity of proteases secreted by such microorganisms on microorganisms. model substrates.
Les kératines se sont avéré être un bon substrat modèle car elles présentent de nombreuses similarités structurelles avec la protéine prion infectieuse ce qui confère à ces enzymes une grande résistance à la protéolyse. On peut citer notamment l'insolubilité des kératines due à la présence de nombreux ponts disulfure intra et inter moléculaires, le contenu important en feuillets (3, dans le cas des F3 kératines, et leur degré important d'agrégation (Arai et al., 1996; Goddard et Michaelis, 1934). De telles protéines peuvent être détruites seulement par des protéases hautement actives, telles que les subtilisines sécrétées par les bactéries appartenant au genre Bacillus. (Atalo et Gashe, 1993; Cheng et al., 1995; Lin et al., 1992, Williams et al., 1990; Kristie et al., 2000) ou par des protéases actives en conditions dénaturantes qui déstabilisent les substrats résistant à la protéolyse (Han et Damodaran, 1997). Les inventeurs ont donc utilisé comme substrat modèle la kératine insoluble, formant des structures fibrillaires similaires à la PrPsc. Keratin has proved to be a good model substrate because it has many structural similarities with the infectious prion protein which gives these enzymes a high resistance to proteolysis. Mention may in particular be made of the insolubility of keratins due to the presence of numerous intra- and inter-molecular disulfide bridges, the important content in sheets (3, in the case of F3 keratins, and their important degree of aggregation (Arai et al., 1996, Goddard and Michaelis, 1934. Such proteins can be destroyed only by highly active proteases, such as subtilisins secreted by bacteria belonging to the genus Bacillus (Atalo and Gashe, 1993, Cheng et al., 1995; et al., 1992, Williams et al., 1990; Kristie et al., 2000) or by proteases active under denaturing conditions which destabilize the proteolysis-resistant substrates (Han and Damodaran, 1997). Substrate models insoluble keratin, forming fibrillar structures similar to PrPsc.
En second lieu, la résolution du problème de réduction du caractère pathogène des farines animales à l'aide de micro- organismes a nécessité de sélectionner des micro-organismes produisant des enzymes protéolytiques détruisant la protéine prion infectieuse qui soient capables de se multiplier sans apport nutritif exogène, sur la matière substrat à décontaminer. Secondly, the resolution of the problem of reducing the pathogenicity of animal meal with the aid of microorganisms necessitated the selection of microorganisms producing proteolytic enzymes destroying the infectious prion protein which are able to multiply without nutritive supply. exogenously, on the substrate material to be decontaminated.
Pour atteindre cet objectif, les inventeurs ont criblé des collections de micro-organismes capables de croître sur la kératine ou sur des farines animales et sécrétant des protéases capables de dégrader la PrPsc contenue dans les farines animales. Les inventeurs ont découvert, selon l'invention, grâce à cette méthode de criblage, des bactéries capables de dégrader la protéine prion infectieuse PrPsc et de croître sur un milieu composé de farines animales. To achieve this objective, the inventors have screened collections of microorganisms capable of growing on keratin or on animal meal and secreting proteases capable of degrading the PrPsc contained in animal meal. The inventors have discovered, according to the invention, thanks to this screening method, bacteria capable of degrading the PrPsc infectious prion protein and of growing on a medium composed of animal meal.
La présente invention est basée sur l'utilisation de bactéries thermophiles et de bactéries appartenant au genre Streptomyces pour la dégradation de la protéine prion infectieuse contenue dans les tissus ou encore les farines animales. The present invention is based on the use of thermophilic bacteria and bacteria belonging to the genus Streptomyces for the degradation of the infectious prion protein contained in tissues or animal meal.
Un premier objet de la présente invention concerne un procédé de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière organique sous forme liquide, sous forme de particules ou sous forme de fibres, contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant: - une étape (a) consistant à mettre en contact et mélanger ladite matière contaminée avec au moins une bactérie qui sécrète une ou plusieurs enzymes hydrolytiques, y compris protéolytiques, vis-à-vis de ladite protéine prion infectieuse et, une étape (b) d'incubation de la ou des bactéries avec ladite matière contaminée pendant une période de temps suffisante à l'obtention d'un pourcentage de réduction désiré de la concentration en protéine prion infectieuse dans ladite matière contaminée. A first object of the present invention relates to a method for reducing the concentration of infectious prion protein of an organic material in liquid form, in particle form or in fiber form, contaminated or suspected to be contaminated with the infectious prion protein. comprising: - a step (a) of contacting and mixing said contaminated material with at least one bacterium which secretes one or more hydrolytic enzymes, including proteolytic enzymes, with respect to said infectious prion protein and, one step ( b) incubating the bacteria or bacteria with said contaminated material for a period of time sufficient to obtain a desired percentage reduction in the concentration of infectious prion protein in said contaminated material.
L'efficacité du procédé de l'invention pour dégrader la protéine prion infectieuse était inattendue puisque l'exposition à des températures élevées et à des enzymes comme la protéinase K, connue pour dégrader les structures amyloïdes ne suffit pas à dégrader la protéine prion. Il est donc très surprenant que l'incubation de bactéries avec la protéine prion infectieuse parvienne à détruire cette dernière, à des températures compatibles avec la survie des bactéries. The effectiveness of the method of the invention for degrading infectious prion protein was unexpected since exposure to elevated temperatures and enzymes such as proteinase K, known to degrade amyloid structures, is not sufficient to degrade the prion protein. It is therefore very surprising that the incubation of bacteria with the infectious prion protein succeeds in destroying the latter, at temperatures compatible with the survival of the bacteria.
Par enzyme hydrolytique , on entend une enzyme habituellement désignée par le terme hydrolase , appartenant à la classe E.C.3 selon la classification internationale des enzymes. By hydrolytic enzyme is meant an enzyme usually referred to as hydrolase, belonging to class E.C.3 according to the International Classification of Enzymes.
De préférence, l'enzyme hydrolytique est une enzyme protéolytique ou protéase, appartenant à la classe E.C.3.4 selon la classification internationale des enzymes. Preferably, the hydrolytic enzyme is a proteolytic enzyme or protease, belonging to the class E.C.3.4 according to the international classification of enzymes.
Par les termes mise en contact et mélange , l'homme du métier comprendra que les bactéries sont par exemple déposées sur la matière contaminée ou susceptible d'être contaminée par la PrPsc, puis mélangées à la matière contaminée, de manière à augmenter la surface de contact entre les bactéries et la matière contaminée. By the terms contacting and mixing, the skilled person will understand that the bacteria are for example deposited on the contaminated material or likely to be contaminated by PrPsc, and then mixed with the contaminated material, so as to increase the surface of contact between the bacteria and the contaminated material.
Par le terme incubation , on doit comprendre que les bactéries sont placées dans des conditions permettant leur survie, de préférence des conditions proches de celles qui leurs sont habituelles dans leur milieu naturel. En particulier, la température à laquelle sont soumises les bactéries pendant leur incubation avec la matière contaminée ne sera pas inférieure à 20 C. By the term incubation, it should be understood that the bacteria are placed in conditions that allow their survival, preferably conditions close to those which are usual in their natural environment. In particular, the temperature at which the bacteria are subjected during their incubation with the contaminated material will not be less than 20 C.
Le terme matière organique sous forme de particules englobe les matières organiques sous forme de poudre et de farine. The term organic matter in the form of particles includes organic matter in the form of powder and flour.
Le terme matière organique contaminée englobe les tissus animaux, les farines animales, leurs dérivés, et les sols. Le pourcentage de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse non protéolysée désigne la valeur V, exprimée en %, obtenue à l'aide de la formule suivante: V=[(X-Y)/X]*100 Dans laquelle: X est une valeur représentative de la quantité de protéine prion non protéolysée dans la matière contaminée avant 15 traitement par le procédé selon l'invention et, Y est une valeur représentative de la quantité de protéine prion non protéolysée dans la matière contaminée après traitement par le procédé selon l'invention. The term contaminated organic material includes animal tissues, animal meals, their derivatives, and soils. The percentage reduction in the concentration of non-proteolyzed infectious prion protein means the value V, expressed in%, obtained using the following formula: V = [(XY) / X] * 100 In which: X is a value representative of the amount of unproteolysed prion protein in the contaminated material prior to treatment by the method according to the invention and Y is a value representative of the amount of unproteolysed prion protein in the contaminated material after treatment with the method according to invention.
De préférence, la valeur V est d'au moins 80%, avantageusement d'au moins 90%, de préférence d'au moins 95%, de manière tout à fait préférée d'au moins 98%, et idéalement de 100%. Preferably, the V value is at least 80%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, most preferably at least 98%, and most preferably 100%.
La valeur V du pourcentage de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse non protéolysée peut être mesurée aisément par l'homme du métier, par des techniques en soi communes. The value V of the percentage reduction in the concentration of non-proteolyzed infectious prion protein can be easily measured by those skilled in the art by techniques which are in themselves common.
A titre illustratif l'homme du métier utilise la technique d'électrophorèse comprenant avantageusement les étapes suivantes: (i) déposer un échantillon de matière organique traitée par le procédé de réduction décrit ci-dessus à l'extrémité d'un gel d'électrophorèse, (ii) faire migrer les protéines présentes dans le dépôt de matière organique sur le gel d'électrophorèse, (iii) après migration des protéines, déterminer la quantité Y de protéine prion infectieuse non protéolysée, et (iv) calculer la valeur V à l'aide de la valeur X de quantité de protéine prion infectieuse non protéolysée dans la matière organique avant traitement. As an illustration, those skilled in the art use the electrophoresis technique advantageously comprising the following steps: (i) depositing a sample of organic material treated by the reduction method described above at the end of an electrophoresis gel (ii) migrating proteins present in the organic matter deposition on the electrophoresis gel, (iii) after protein migration, determining the amount Y of non-proteolyzed infectious prion protein, and (iv) calculating the value V at using the X value of amount of non-proteolyzed infectious prion protein in the organic material before treatment.
La quantité de protéine prion infectieuse non protéolysée peut être déterminée par exemple en mettant en contact la surface du gel d'électrophorèse avec une solution contenant des anticorps marqués, spécifiques de cette protéine, puis en quantifiant l'intensité du marquage dans la région du gel d'électrophorèse dans laquelle migrent les protéines ayant une masse moléculaire identique ou proche de celle de la protéine prion infectieuse non hydrolysée. Des anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine prion infectieuse seront décrits ci- après plus en détails. The amount of non-proteolyzed infectious prion protein can be determined, for example, by contacting the surface of the electrophoresis gel with a solution containing labeled antibodies specific for this protein and then quantifying the intensity of the labeling in the gel region. electrophoresis in which proteins having a molecular weight identical or close to that of the unhydrolyzed infectious prion protein migrate. Antibodies specifically recognizing the infectious prion protein will be described hereinafter in more detail.
La valeur X peut être déterminée en appliquant les étapes (i) à (iii) du procédé ci-dessus à un échantillon de matière organique avant traitement par le procédé selon l'invention. The value X can be determined by applying steps (i) to (iii) of the above process to a sample of organic material before treatment by the method according to the invention.
De manière à pouvoir calculer le pourcentage de réduction de la concentration en protéine prion infectieuse, à l'issue du procédé, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire (c) consistant à mesurer la concentration en protéine prion infectieuse dans la matière contaminée, à l'issue de l'étape (b). De manière avantageuse, l'étape (c) du procédé selon l'invention comprend la réalisation d'un test choisi dans le groupe comprenant: un Western Blot, un test immunologique de type sandwich , un test fluoroimmunologique, une immunoélectrophorèse, un test de liaison au plasminogène. In order to calculate the percentage reduction in the concentration of infectious prion protein at the end of the process, the method according to the invention comprises an additional step (c) of measuring the concentration of infectious prion protein in the contaminated material. at the end of step (b). Advantageously, step (c) of the method according to the invention comprises carrying out a test selected from the group comprising: a Western Blot, a sandwich type immunoassay, a fluoroimmunological test, an immunoelectrophoresis, a test of plasminogen binding.
En particulier, l'homme du métier pourra réaliser une immunoélectrophorèse pour détecter la protéine prion infectieuse selon la méthode décrite dans le brevet US 6,514,707. L'homme du métier pourra également mettre en oeuvre les méthodes décrites ci-dessus en utilisant des anticorps dirigés contre la protéine prion infectieuse issus des hybridomes enregistrés sous les références ATCC HB-12403 et ATCC HB- 12696 décrits respectivement dans les brevets US 6,165,784 et US 6,261, 790. L'homme du métier pourra également mesurer la quantité de protéine prion infectieuse dans la matière biologique avant ou après traitement par le procédé selon l'invention grâce au kit de détection de la protéine prion décrit dans le brevet US 2003/009 2090 Avantageusement, le procédé de l'invention est mis en oeuvre au sein d'un procédé général de recyclage des matières contaminées, dans lequel ces matières sont placées dans un réservoir, avant d'être traversées par un flux de vapeur d'eau sous pression. Dans un tel cas, l'étape (a) du procédé de mise en contact et de mélange de la matière contaminée avec une bactérie, se fait lorsque la matière contaminée est placée dans le réservoir, et l'étape (b) d'incubation est réalisée lors de la mise en place du flux de vapeur sous pression. In particular, those skilled in the art can perform immunoelectrophoresis to detect the infectious prion protein according to the method described in US Pat. No. 6,514,707. Those skilled in the art may also carry out the methods described above by using antibodies directed against the infectious prion protein derived from the hybridomas registered under the references ATCC HB-12403 and ATCC HB-12696 respectively described in patents US 6,165,784 and US Pat. No. 6,261,790. Those skilled in the art will also be able to measure the amount of infectious prion protein in the biological material before or after treatment with the method according to the invention by means of the kit for detecting the prion protein described in US Pat. Advantageously, the process of the invention is carried out in a general process for recycling contaminated materials, in which these materials are placed in a tank, before being traversed by a stream of water vapor. under pressure. In such a case, step (a) of the method of contacting and mixing the contaminated material with a bacterium, is done when the contaminated material is placed in the tank, and the incubation step (b) is performed during the establishment of the steam flow under pressure.
Un tel mode de réalisation est particulièrement avantageux car il permet, grâce au recours à la vapeur d'eau, d'utiliser une plus grande variété de bactéries. Such an embodiment is particularly advantageous because it allows, through the use of water vapor, to use a wider variety of bacteria.
De préférence, les bactéries utilisées pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention ont subi un criblage au cours duquel les bactéries sont sélectionnées en fonction de leur capacité à croître sur de la kératine, comme cela est illustré dans l'exemple 3. En outre, les bactéries peuvent être soumises à une deuxième étape de criblage au cours de laquelle lesdites bactéries sont sélectionnées pour leur capacité à dégrader des oligomères dérivés du prion. Preferably, the bacteria used to carry out the process of the invention were screened during which the bacteria are selected according to their ability to grow on keratin, as illustrated in Example 3. In in addition, the bacteria may be subjected to a second screening step in which said bacteria are selected for their ability to degrade oligomers derived from the prion.
Ce double criblage permet de disposer de bactéries qui sont capables de croître sur un milieu constitué de farines animales, et qui sont aussi capables de dégrader la protéine prion, au sein de ces farines. This double screening makes it possible to have bacteria that are capable of growing on a medium consisting of animal meal, and which are also capable of degrading the prion protein, within these flours.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les bactéries utilisées pour mettre en oeuvre le procédé de l'invention, sont choisies parmi les bactéries thermophiles anaérobes, et les bactéries appartenant au genre Streptomyces. In a particular embodiment of the invention, the bacteria used to carry out the process of the invention are chosen from anaerobic thermophilic bacteria and bacteria belonging to the genus Streptomyces.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ladite bactérie est une bactérie thermophile anaérobe choisie dans le groupe comprenant la souche AT1243 appartenant à l'espèce d'archaea Thermococcus, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3140, et la souche AT1222 appartenant à l'espèce Thermosipho, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3139. In a particular embodiment of the invention, said bacterium is a thermophilic anaerobe bacterium selected from the group comprising the AT1243 strain belonging to the Archaea Thermococcus species, deposited with the National Collection of Microorganism Cultures of the Institute. Pasteur (CNCM) under the registration number CNCM 1-3140, and the strain AT1222 belonging to the species Thermosipho, registered with the National Collection of Microorganism Cultures of the Pasteur Institute (CNCM) under the registration number CNCM 1-3139.
Alternativement, la bactérie choisie est une bactérie de souche S290 appartenant au genre Thermoanaerobacter, déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (CNCM) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3177. Alternatively, the bacterium chosen is a bacterium of S290 strain belonging to the genus Thermoanaerobacter, deposited with the National Collection of Microorganism Cultures of the Pasteur Institute (CNCM) under the registration number CNCM 1-3177.
La disposition de plusieurs genres et espèces de bactéries permet d'appliquer le procédé de l'invention à des substrats de porosité, granulométrie, composition chimique variables. Par exemple, en fonction de la compacité de la matière contaminée à traiter et donc de l'importance des échanges gazeux au sein de la matière à traiter, une bactérie thermophile anaérobe ou une bactérie aérobe appartenant au genre Streptomyces sera choisie pour réaliser le procédé. L'homme du métier pourra également envisager de réaliser des mélanges entre bactéries de différentes espèces pour réaliser le procédé de l'invention. The arrangement of several kinds and species of bacteria makes it possible to apply the process of the invention to substrates of variable porosity, grain size, and chemical composition. For example, depending on the compactness of the contaminated material to be treated and therefore the importance of gas exchange within the material to be treated, a thermophilic anaerobe bacterium or an aerobic bacterium belonging to the genus Streptomyces will be chosen to carry out the method. Those skilled in the art may also consider making mixtures between bacteria of different species to carry out the process of the invention.
Néanmoins, le procédé selon l'invention ne se limite pas uniquement à l'utilisation des souches bactériennes décrites ci- dessus mais comprend aussi d'autres bactéries, possédant des caractéristiques enzymatiques similaires à celles décrites dans les exemples 1 et 2 et dans le tableau 1 pour les bactéries appartenant aux souches AT1243, AT1222 et S290. Pour comparer les caractéristiques enzymatiques de différentes bactéries, l'homme du métier aura recours à des techniques classiques comme des zymogrammes ou des tests de dégradation de peptides tel qu'illustré dans les exemples 1 et 2 et dans le tableau 1. Nevertheless, the process according to the invention is not limited solely to the use of the bacterial strains described above but also comprises other bacteria having similar enzyme characteristics to those described in Examples 1 and 2 and in the table. 1 for the bacteria belonging to strains AT1243, AT1222 and S290. To compare the enzymatic characteristics of different bacteria, those skilled in the art will use conventional techniques such as zymograms or peptide degradation assays as illustrated in Examples 1 and 2 and in Table 1.
Un premier intérêt de l'utilisation de bactéries vivantes directement sur la matière organique à traiter réside dans le fait que les bactéries (i) produisent les enzymes spécifiques de manière continue et (ii) se multiplient dans ladite matière organique, ce qui amplifie encore l'effet destructeur vis-à-vis de la protéine prion infectieuse. A primary benefit of using living bacteria directly on the organic material to be treated is that the bacteria (i) produce the specific enzymes continuously and (ii) multiply in said organic material, which further amplifies the destructive effect vis-à-vis the infectious prion protein.
Un second intérêt est que les bactéries vivantes produisent simultanément une variété d'enzymes protéolytiques de spécificité de coupure des liaisons peptidiques variée, ce qui accroît encore l'efficacité de destruction de la protéine prion infectieuse. A second advantage is that living bacteria simultaneously produce a variety of proteolytic enzymes of varying peptide bond cut-off specificity, further increasing the killing efficiency of the infectious prion protein.
Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, l'étape (a) est réalisée à une température comprise entre 20 C et 150 C. In a preferred embodiment of the invention, step (a) is carried out at a temperature between 20 C and 150 C.
Cette gamme de température permet de concilier à la fois les exigences nécessaires à la survie des bactéries, à l'activité des enzymes protéolytiques synthétisées par celles-ci, et à la sensibilité de la protéine prion aux enzymes protéolytiques. This temperature range makes it possible to reconcile at the same time the requirements necessary for the survival of bacteria, the activity of the proteolytic enzymes synthesized by them, and the sensitivity of the prion protein to proteolytic enzymes.
La gamme de température décrite ci-dessus étant assez large, les inventeurs se sont attaché à rechercher des optima de température de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, qui font l'objet de modes de réalisation particuliers, décrits ci-après: Dans un mode de réalisation particulier de l'invention l'étape (a) est réalisée en utilisant la souche AT1243 ou AT1222 à une température de 80 C. As the temperature range described above is rather wide, the inventors have endeavored to find temperature optima for carrying out the method according to the invention, which are the subject of particular embodiments, described below: In a particular embodiment of the invention step (a) is carried out using strain AT1243 or AT1222 at a temperature of 80 ° C.
Alternativement l'étape (a) est réalisée en utilisant la souche S290 à une température de 60 C. Alternatively step (a) is carried out using strain S290 at a temperature of 60 C.
Par ailleurs, les tests réalisés par les inventeurs ont permis de mesurer la durée minimale de l'étape (b) compatible avec une disparition totale de la protéine prion. Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'étape (b) d'incubation a une durée de 4 heures. Les modes de réalisation décrits ci-dessus s'appuient sur les exemples 3 et 4, montrant que des extraits enzymatiques des souches AT1243, AT1222 et S290 sont capable de croître sur des farines animales et de dégrader totalement la protéine prion native ou dénaturée après 4 à 5 heures d'incubation à une température de 60 C pour la souche S290 ou 80 C pour les souches AT1243 et AT1222. Furthermore, the tests carried out by the inventors made it possible to measure the minimum duration of step (b) compatible with complete disappearance of the prion protein. In a particular embodiment of the invention, the incubation step (b) has a duration of 4 hours. The embodiments described above are based on Examples 3 and 4, showing that enzymatic extracts of strains AT1243, AT1222 and S290 are capable of growing on animal meal and completely degrading the native or denatured prion protein after 4 hours. at 5 hours of incubation at a temperature of 60 ° C. for strain S290 or 80 ° C. for strains AT1243 and AT1222.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'étape (a) est précédée d'une étape de chauffage de la matière contaminée à une température et pendant une période de temps suffisantes pour augmenter la sensibilité de la protéine prion infectieuse à la protéolyse. La réalisation d'une étape du procédé, préalable à l'étape (a) de mise en contact et de mélange des bactéries avec la matière contaminée permet d'augmenter la sensibilité de la protéine aux enzymes protéolytiques et par conséquent d'abaisser la température nécessaire au déroulement correct de l'étape (b). Cette alternative du procédé selon l'invention présente donc un avantage dans le cas où un chauffage prolongé de la matière contaminée lors de l'étape (b) n'est pas envisageable, pour des raisons d'ordre économique ou technique par exemple. In a preferred embodiment of the invention, step (a) is preceded by a step of heating the contaminated material at a temperature and for a period of time sufficient to increase the sensitivity of the infectious prion protein to the proteolysis. Performing a step of the process prior to step (a) of contacting and mixing the bacteria with the contaminated material makes it possible to increase the sensitivity of the protein to proteolytic enzymes and consequently to lower the temperature. necessary for the correct operation of step (b). This alternative of the method according to the invention therefore has an advantage in the case where prolonged heating of the contaminated material during step (b) is not possible, for economic or technical reasons, for example.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention ladite étape de chauffage de la matière contaminée est réalisée à une température de 80 C et dans un mode de réalisation particulier du procédé décrit ci-dessus, l'étape (a) est réalisée à une température comprise entre 20 C et 80 C. In a preferred embodiment of the invention, said step of heating the contaminated material is carried out at a temperature of 80 ° C. and in a particular embodiment of the process described above, step (a) is carried out at a temperature of 80 ° C. temperature between 20 C and 80 C.
Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé décrit ci-dessus, l'étape (a) est réalisée en utilisant une bactérie appartenant au genre Streptomyces, à une température de 20 C, pendant 20 à 40 heures. In another particular embodiment of the method described above, step (a) is carried out using a bacterium belonging to the genus Streptomyces, at a temperature of 20 C, for 20 to 40 hours.
Les modes de réalisation décrits ci-dessus sont particulièrement avantageux, car il est connu de l'homme du métier que l'utilisation de la protéinase K dans les mêmes conditions aurait conduit à une dégradation partielle de la protéine prion en larges fragments de 14 kDa, ce qui n'est pas le cas avec le procédé de l'invention. The embodiments described above are particularly advantageous since it is known to those skilled in the art that the use of proteinase K under the same conditions would have led to a partial degradation of the prion protein into large fragments of 14 kDa. which is not the case with the method of the invention.
De manière à assurer une innocuité totale à la matière 35 organique traitée par le procédé de l'invention, il est possible de prévoir une étape supplémentaire consistant à chauffer la matière contaminée à une température, une pression et pendant une période de temps, suffisantes pour détruire les bactéries introduite au cours de l'étape (a). Par exemple cette température peut être de 120 C, et cette pression peut être de 1,5 at. A l'issue de cette étape de chauffage, la matière contaminée est débarrassée de la protéine prion, et les bactéries introduites pour réaliser l'étape (a) du procédé sont détruites. Dans le cas où le procédéest appliqué à des farines animales celles-ci peuvent alors être réutilisées comme complément alimentaire ou engrais par exemple, ce qui constitue une alternative intéressante économiquement à l'incinération. In order to ensure total safety of the organic material treated by the process of the invention, it is possible to provide an additional step of heating the contaminated material to a temperature, pressure and for a period of time sufficient to destroying bacteria introduced during step (a). For example this temperature can be 120 C, and this pressure can be 1.5 at. At the end of this heating step, the contaminated material is freed of the prion protein, and the bacteria introduced to carry out step (a) of the process are destroyed. In the case where the process is applied to animal meal these can then be reused as a food supplement or fertilizer for example, which is an economically attractive alternative to incineration.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, des ions cuivre sont ajoutés au cours de l'étape (a). In a particular embodiment of the process of the invention, copper ions are added during step (a).
L'addition d'ions cuivre à la matière contaminée à traiter permet d'augmenter l'efficacité de la dégradation de la protéine prion par les bactéries décrites ci-dessus. Comme l'illustre l'exemple 4, l'addition d'ions cuivre aux souches AT1243 et AT1222 permet d'augmenter l'efficacité de la dégradation de la protéine prion. The addition of copper ions to the contaminated material to be treated makes it possible to increase the efficiency of the degradation of the prion protein by the bacteria described above. As illustrated in Example 4, the addition of copper ions to strains AT1243 and AT1222 makes it possible to increase the efficiency of the degradation of the prion protein.
De préférence, la matière contaminée est choisie dans le groupe comprenant: les tissus animaux, les farines animales, et leurs dérivés Compositions nettoyantes Un autre objet de l'invention concerne des compositions nettoyantes réduisant la concentration en protéine prion infectieuse d'une matière contaminée ou suspectée d'être contaminée avec la protéine prion infectieuse comprenant au moins une bactérie telle que définie dans la description ci-dessus, en association avec un support approprié. Preferably, the contaminated material is selected from the group consisting of: animal tissues, animal meals, and derivatives thereof Cleaning compositions Another object of the invention is to provide cleaning compositions which reduce the concentration of infectious prion protein of a contaminated material or suspected to be contaminated with the infectious prion protein comprising at least one bacterium as defined in the above description, in combination with a suitable carrier.
Dans ce mode de réalisation, la composition nettoyante comprend les cellules de la ou des souche(s) de bactéries telles que définies cidessus, de préférence sous la forme de particules. In this embodiment, the cleaning composition comprises the cells of the strain (s) of bacteria as defined above, preferably in the form of particles.
La fabrication d'une composition nettoyante sous forme de particules peut se faire par exemple par lyophilisation des bactéries qui seront associées à un support. Le support dans lequel sont incorporées les bactéries peut être de diverses natures. Par exemple, ledit support peut être constitué exclusivement ou constitué essentiellement, d'amidon, y compris l'amidon de riz ou de maïs qui a été mélangé avec les cellules bactériennes avant sa transformation en particules, par exemple en granulés. The manufacture of a cleaning composition in the form of particles can be done for example by lyophilization of the bacteria that will be associated with a support. The support in which the bacteria are incorporated can be of various kinds. For example, said support may consist wholly or essentially of starch, including rice or maize starch which has been mixed with the bacterial cells before its transformation into particles, for example into granules.
Le support dans lequel sont incorporées les cellules bactériennes peut également être constitué exclusivement ou constitué essentiellement de 6cyclodextrine, la 33-cyclodextrine étant alors mélangée avec les cellules bactériennes préalablement à une étape de séchage, puis de fabrication de particules, en particulier de granulés. The support in which the bacterial cells are incorporated may also consist exclusively or consists essentially of 6-cyclodextrin, the 33-cyclodextrin then being mixed with the bacterial cells prior to a drying step, and then to manufacture particles, in particular granules.
Par exemple, pour la fabrication d'une composition nettoyante selon l'invention, l'homme du métier peut mélanger la (3-cyclodextrine avec une quantité appropriée de cellules bactériennes aérobes Streptomyces, de telle manière à obtenir une composition comprenant de 103 à 108 unités formant des colonies (cfu) de ladite ou desdites bactérie(s) par gramme de la composition finale contenant la j3-cyclodextrine, puis soumettre la composition ainsi obtenue à une étape de séchage, avant la fabrication de particules, en particulier de granulés, selon des méthodes conventionnelles. For example, for the manufacture of a cleaning composition according to the invention, one skilled in the art can mix the β-cyclodextrin with a suitable amount of Streptomyces aerobic bacterial cells, so as to obtain a composition comprising from 103 to 108 colony-forming units (cfu) of said bacterium (s) per gram of the final composition containing the β-cyclodextrin, and then subjecting the composition thus obtained to a drying step, before the production of particles, in particular granules, according to conventional methods.
Préférentiellement, le support peut être composé de carbonate de calcium, le cas échéant en combinaison avec du lactose Le support utilisé pour la fabrication d'une composition selon l'invention peut également être exclusivement constitué ou essentiellement constitué de lactose, le cas échéant en combinaison avec du silico-aluminate de sodium, combinaison à laquelle on ajoute le milieu de culture de la souche ou du mélange de souches de bactéries d'intérêt, qui a été préalablement soumis à une étape de séchage. Preferably, the support may be composed of calcium carbonate, optionally in combination with lactose. The support used for the manufacture of a composition according to the invention may also consist exclusively or essentially of lactose, where appropriate in combination with sodium silico-aluminate, to which is added the culture medium of the strain or mixture of bacterial strains of interest, which has been previously subjected to a drying step.
Selon un autre aspect, pour fabriquer une composition prophylactique alimentaire selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser des supports commerciaux, tels que le verre poreux, le Porolon , les fibres de carbone, l'alginate ou la chitine. In another aspect, to manufacture a food prophylactic composition according to the invention, one skilled in the art can use commercial supports, such as porous glass, Porolon, carbon fibers, alginate or chitin.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition nettoyante selon l'invention peut comprendre des ions cuivre. Sans vouloir être liés par une théorie, les inventeurs pensent que l'addition d'ions cuivre à une concentration de 1 mM à la composition de l'invention permet d'augmenter l'efficacité de la composition vis-à-vis de la dégradation de la protéine prion. In a preferred embodiment, the cleaning composition according to the invention may comprise copper ions. Without wishing to be bound by theory, the inventors believe that the addition of copper ions at a concentration of 1 mM to the composition of the invention makes it possible to increase the effectiveness of the composition with respect to degradation. of the prion protein.
Matériel et méthodes Les composés suivants, à savoir les sels, les milieux, la chaîne B d'insuline bovine, la gélatine bovine, le MOPS et tous les autres composés chimiques ont été obtenus auprès de Sigma Chemical Company Saint-Louis MO. Les préparations purifiées de prion ovin recombinant ont été obtenues comme décrits par Rezaei et al, 2000. La kératine de poulet a été obtenue auprès de Yu. Zuev, Kazan Centre of Science, Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia. Les poils de porc ont été obtenus auprès de la société SIFDDA, Plouvara, France. Materials and Methods The following compounds, namely salts, media, bovine insulin B-chain, bovine gelatin, MOPS and all other chemical compounds were obtained from Sigma Chemical Company St. Louis MO. Purified preparations of recombinant ovine prion were obtained as described by Rezaei et al, 2000. Chicken keratin was obtained from Yu. Zuev, Kazan Center of Science, Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia. Pig hairs were obtained from SIFDDA, Plouvara, France.
Souches bactériennes, milieux et conditions de croissance 25 Les souches bactériennes thermophiles anaérobes ont été isolées de souches collectées au site Rainbow (36 , 14' Nord, 33 , 54' Ouest, 2300 mètres de profondeur) . Les souches AT1243 et AT1222 ont été isolées d'un puits de chaleur. La souche AT1222 a été enrichie à 60 C en milieu SP (30 g/I de sel marin 2 g/I de poils de porc). La souche AT1243 a été enrichie à 80 C dans un milieu SPS (SP + 5 g/1 de sulfure). Les sous-cultures réalisées pour les dosages de protéases ont été effectuées dans les mêmes conditions. Des amplifications par PCR et un séquençage indiquent que la souche AT1222 appartient à l'espèce Thermosipho sp. (bactérie thermophile) et que la souche AT1243 est une bactérie archaïque qui appartient à l'espèce thermophile Thermococcus genus. Bacterial strains, media and growth conditions The anaerobic thermophilic bacterial strains were isolated from strains collected at the Rainbow site (36, 14 'North, 33, 54' West, 2300 meters deep). Strains AT1243 and AT1222 were isolated from a heat sink. Strain AT1222 was enriched at 60 ° C. in SP medium (30 g / l of marine salt and 2 g / l of porcine hair). The strain AT1243 was enriched at 80 ° C. in SPS medium (SP + 5 g / l of sulphide). The subcultures performed for the protease assays were carried out under the same conditions. PCR amplifications and sequencing indicate that strain AT1222 belongs to the species Thermosipho sp. (thermophilic bacterium) and that strain AT1243 is an archaic bacterium belonging to the thermophilic species Thermococcus genus.
La souche S290 a été isolée du point chaud de caldera Uzon, Kamchatka et a été identifiée comme appartenant au genre Thermoanaerobacter par des réactions avec des oligonucléotides spécifiques à savoir des oligonucléotides dirigés contre des ARNr-16S. Les souches S290 ont été cultivées à 60 C pendant 5 jours sur un milieu minéral Th (0,33 g/l de KH2PO4, 0,33 g/l de NH4CI, 0,33 g/l de MgCl2, 0,33 g/l de CaCl2, 0,33 g/1 de KCI, 0,5 g/1 de NaHCO3, et 0,5 g/l de Na2S), supplémenté avec 2 g/l de laine de porc ou par des plumes. Strain S290 was isolated from the hot spot of Uzon caldera, Kamchatka and was identified as belonging to the genus Thermoanaerobacter by reactions with specific oligonucleotides namely oligonucleotides directed against 16S-rRNA. Strains S290 were cultured at 60 ° C for 5 days on Th mineral medium (0.33 g / l KH2PO4, 0.33 g / l NH4Cl, 0.33 g / l MgCl2, 0.33 g / l 1 g of CaCl 2, 0.33 g / l of KCl, 0.5 g / l of NaHCO 3, and 0.5 g / l of Na 2 S), supplemented with 2 g / l of pig wool or feathers.
Lorsque les différentes espèces et souches de bactéries sont cultivées sur des farines animales, la kératine de tous les milieux a été remplacée par 2 g/l de farines de viande, d'os, de sang ou de farines comprenant un mélange de ces trois composants. When the different species and strains of bacteria are cultured on animal meal, the keratin of all media has been replaced by 2 g / l of meat, bone, blood or flours meal comprising a mixture of these three components .
Dosage des protéases Après culture, les bactéries et les éléments insolubles du milieu de culture ont été précipités par centrifugation durant 15 minutes à 7000 rpm. Les activités protéolytique et peptidasique ont été mesurées dans les surnageants résultants. Determination of proteases After culture, the bacteria and insoluble elements of the culture medium were precipitated by centrifugation for 15 minutes at 7000 rpm. Proteolytic and peptidase activities were measured in the resulting supernatants.
La présence de protéases dans les surnageants a été déterminée par des zymogrammes. Cette méthode permet de déterminer la présence d'enzymes protéolytiques à faible concentration et consiste à identifier des protéases après séparation de tous les composants protéiques du milieu par électrophorèse. Les protéases ont été séparées par SDS-PAGE comprenant des substrats à base de gélatine hydrolysée. Les produits de faible masse moléculaire issus de l'hydrolyse de la gélatine diffusent du gel et, après coloration, la présence des protéases a été identifiée par la présence de bandes blanches au sein d'un gel coloré. Le gel de polyacrylamide a été polymérisé en présence de 0,01% de gélatine bovine. 20 pI de tampon de lyse ont été ajoutés à 40 pI de surnageant et des gels de SDS-PAGE à 10, 12 ou 15% ont été réalisés (Laemmli, 1970). Après électrophorèse, les gels ont été rincés avec une solution de Triton X-100 à 2,5% pour éliminer le SDS, et ont été incubés dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2, NaCI 100 mM, CaCl2 2 mM à différentes températures pendant 3 à 10 heures. Les protéines sur les gels ont été colorées avec du nitrate d'argent (Nesterenko et al. 1994). The presence of proteases in the supernatants was determined by zymograms. This method makes it possible to determine the presence of proteolytic enzymes at low concentration and consists of identifying proteases after separation of all the protein components of the medium by electrophoresis. Proteases were separated by SDS-PAGE including hydrolyzed gelatin substrates. The low molecular weight products resulting from the hydrolysis of gelatin diffuse gel and, after staining, the presence of proteases has been identified by the presence of white bands in a colored gel. The polyacrylamide gel was polymerized in the presence of 0.01% bovine gelatin. 20 μl of lysis buffer was added to 40 μl of supernatant and 10, 12 or 15% SDS-PAGE gels were made (Laemmli, 1970). After electrophoresis, the gels were rinsed with 2.5% Triton X-100 solution to remove SDS, and incubated in 20 mM MOPS buffer, pH 7.2, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 different temperatures for 3 to 10 hours. The proteins on the gels were stained with silver nitrate (Nesterenko et al., 1994).
L'activité des protéases provenant des surnageants des bactéries cultivées dans la kératine hydrolysée, dans les farines animales ou avec le prion recombinant a été déterminée par électrophorèse. 50 pl de surnageants ont été ajoutés à 50 pI de kératine de plumes à 1 mg/ml, ou 2 mg/ml de kératine de poils de porc, ou 2 mg/mi de farines animales ou encore 1 mg/ml de prion recombinant dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2 et furent incubés à différentes températures pendant 20 à 40 heures. L'hydrolyse du substrat par la protéinase K [0,02 mg/ml (0,6 pM)] a été réalisée à 37 C. Le tampon de lyse a été ajouté aux fractions aliquotes provenant des différentes réactions protéolytiques. Les fractions aliquotes ont été portées à ébullition durant 10 minutes et ensuite un gel SDS-PAGE à 15% a été réalisé. Les protéines sur les gels ont été colorées au bleu de Coomassie Brilliant R-450. The activity of proteases from supernatants of bacteria grown in hydrolysed keratin, in animal meal or with recombinant prion was determined by electrophoresis. 50 μl of supernatants were added to 50 μl of feather keratin at 1 mg / ml, or 2 mg / ml of pig hair keratin, or 2 mg / ml of animal meal or 1 mg / ml of recombinant prion in 20 mM MOPS buffer, pH 7.2 and incubated at different temperatures for 20-40 hours. Hydrolysis of the substrate with proteinase K [0.02 mg / ml (0.6 μM)] was carried out at 37 ° C. The lysis buffer was added to the aliquots from different proteolytic reactions. The aliquots were boiled for 10 minutes and then a 15% SDS-PAGE gel was made. The proteins on the gels were stained with Coomassie Brilliant R-450 blue.
Spécificité des protéases L'activité peptidasique envers les acides aminés ou les peptides N-substitués par des p-nitroanilides a été déterminée en utilisant un spectrophotomètre. 900 pI de substrat à 0,1 mM ont été ajoutés à 100 pl de surnageants dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2 DMSO 10%. Le mélange réactionnel est incubé à différentes températures durant 3 et 20 heures, après lesquelles l'absorption à 410 nm a été mesurée (8410 p-nitroanilides = 8800 M-1 cm"1). Specificity of proteases The peptidase activity towards amino acids or N-substituted peptides by p-nitroanilides was determined using a spectrophotometer. 900 μl of 0.1 mM substrate was added to 100 μl of supernatants in 20 mM MOPS buffer, pH 7.2 DMSO 10%. The reaction mixture is incubated at different temperatures for 3 and 20 hours, after which the absorption at 410 nm was measured (8410 p-nitroanilides = 8800 M-1 cm -1).
La spécificité des protéases provenant des surnageants des bactéries a été déterminée en mesurant la fragmentation de la chaîne B oxydée de l'insuline bovine. 100 pl de surnageant ont été incubés avec 100 pl de chaîne B d'insuline à 2 mg/mi dans un tampon MOPS 20 mM, pH 7,2 à différentes températures pendant 10 heures. Les produits de l'hydrolyse ont été séparés par HPLC en phase inversée sur une colonne de Nucléosil 300-5 C18 avec un gradient de 0 à 60% de CH3CN, TFA 0,1%. Les fractions collectées ont été soumises à des analyses d'acides aminés selon Bidlingmeyer et al. (1984). Le contenu en acides aminés provenant des peptides séparés a été calculé en comparant les chromatogrammes obtenus avec des chromatogrammes standards provenant de dérivés PITC. La séquence en acides aminés des peptides a été établie grâce à la connaissance de la structure primaire de la chaîne B de l'insuline. The specificity of proteases from bacteria supernatants was determined by measuring the fragmentation of the oxidized B chain of bovine insulin. 100 μl of supernatant was incubated with 100 μl of insulin B-chain at 2 mg / ml in 20 mM MOPS buffer, pH 7.2 at different temperatures for 10 hours. The products of the hydrolysis were separated by reverse phase HPLC on a Nucleosil 300-5 C18 column with a gradient of 0 to 60% CH3CN, 0.1% TFA. The fractions collected were subjected to amino acid analyzes according to Bidlingmeyer et al. (1984). The amino acid content from the separated peptides was calculated by comparing the chromatograms obtained with standard chromatograms from PITC derivatives. The amino acid sequence of the peptides was established through knowledge of the primary structure of the B chain of insulin.
Résultats Exemple 1: Zymogrammes des protéases provenant des microorganismes d'intérêt Dans le but de caractériser les protéases sécrétées par les cultures de bactéries d'intérêt, des zymogrammes ont été réalisés sur les surnageants provenant de telles cultures. La caractéristique principale des protéases des bactéries d'intérêt est la stabilité de leur structure à la dénaturation. En effet, comme le montre la figure 1, pistes 1 et 2, les protéases soumises à une électrophorèse conservent leur activité protéolytique. Les zymogrammes réalisés à partir des surnageants de la souche AT1243 montrent que cette souche possède un ensemble de protéases possédant une masse moléculaire apparente de l'ordre de 45 à 100 kDa. Les zymogrammes réalisés à partir des surnageants des souches AT1222 montrent une seule bande d'activité protéolytique, correspondant à une masse moléculaire approximative de 100 kDa. Results Example 1 Zymograms of proteases from the microorganisms of interest In order to characterize the proteases secreted by the cultures of bacteria of interest, zymograms were performed on the supernatants from such cultures. The main characteristic of the proteases of the bacteria of interest is the stability of their structure to denaturation. Indeed, as shown in Figure 1, lanes 1 and 2, proteases subjected to electrophoresis retain their proteolytic activity. Zymograms made from the supernatants of strain AT1243 show that this strain has a set of proteases having an apparent molecular mass of the order of 45 to 100 kDa. Zymograms made from supernatants of AT1222 strains show a single band of proteolytic activity, corresponding to an approximate molecular mass of 100 kDa.
Enfin, les zymogrammes réalisés à partir des surnageants de la souche S290 montrent des bandes d'activité protéolytique, correspondant à des masses moléculaires approximatives de 66, 100, 200 kDa et plus (figure 1, piste 3). Finally, zymograms made from supernatants of strain S290 show bands of proteolytic activity, corresponding to approximate molecular weights of 66, 100, 200 kDa and more (Figure 1, lane 3).
Exemple 2: Spécificité des protéases La capacité des protéases sécrétées par les bactéries thermophiles AT1243, AT1222 et S290 à hydrolyser les substrats de faible masse moléculaire c'est-à-dire les p-nitroanilides de N-benzoylarginine, les dérivés N-succinyl de phénylalanine, le peptide Ala-Ala-Pro-Phe et le peptide Ala-Ala-Pro-Lys a été étudiée. Après trois heures d'incubation, l'activité des surnageants des souches S290 envers le peptide Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA a été observée (tableau 1). EXAMPLE 2 Specificity of Proteases The ability of proteases secreted by thermophilic bacteria AT1243, AT1222 and S290 to hydrolyze substrates of low molecular weight, ie the N-benzoylarginine p-nitroanilides, the N-succinyl derivatives of phenylalanine, the Ala-Ala-Pro-Phe peptide and the Ala-Ala-Pro-Lys peptide was studied. After three hours of incubation, the supernatant activity of the S290 strains against the Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA peptide was observed (Table 1).
L'hydrolyse de la chaîne B de l'insuline oxydée, un substrat standard permettant de tester l'activité des enzymes protéolytiques a été étudiée. La chaîne B de l'insuline est composée d'un grand nombre d'acides aminés hydrophobes, et inclut également un nombre important de résidus branchés chargés. La structure primaire de la chaîne B de l'insuline est la suivante: Phe'-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys*-Gly-Sers-His-Leu-Val-Glu-AlaLeu15-Tyr16-Leu-Val-Cys*-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe25-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala. The hydrolysis of the oxidized insulin B chain, a standard substrate for testing the activity of proteolytic enzymes, was studied. The insulin B chain is composed of a large number of hydrophobic amino acids, and also includes a large number of charged branched residues. The primary structure of the insulin B-chain is as follows: Phe'-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys * -Gly-Sers-His-Leu-Val-Glu-AlaLeu15-Tyr16-Leu-Val * -Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Tyr-PHE25-Thr-Pro-Lys-Ala.
(* signifie que le résidu cystéyle est oxydé). (* means that the cysteyl residue is oxidized).
Les inventeurs ont montré en utilisant l'HPLC que les produits de l'hydrolyse de la chaîne B de l'insuline s'accumulent dans les milieux réactionnels après trois heures d'incubation avec les surnageants de la souche AT1243. L'analyse des acides aminés provenant des peptides hydrolysés permet de proposer que les protéases de la souche AT1243 clivent les liaisons peptidiques suivantes: Ser9-His10, Tyr16-Leu17 et Phe25-Tyr26. Un site de clivage additionnel (Leu15-Tyr16) a été observé dans le cas de la souche AT1222. Les protéases de la souche S290 hydrolysent la chaîne B de l'insuline au niveau des liaisons peptidiques Leu15-Tyr16 et Tyr16-Leu17. Donc, la majorité des protéases produites par les microorganismes thermophiles étudiés possède une spécificité de type chymotrypsine. Certaines des bactéries montrent également une capacité inattendue à hydrolyser les liaisons peptidiques après un résidu séryle. De manière surprenante, les protéases secrétées par les microorganismes thermophiles n'attaquent pas les autres sites hydrophobes situés dans la molécule de la chaîne B de l'insuline. L'analyse du micro-environnement autour des liaisons clivables (les résidus dans les positions P2, P3, P1') ne révèle pas de régularité stricte dans l'activité des protéases envers ces sites. Néanmoins, il peut être observé qu'un résidu hydrophobe est fréquemment situé dans la position P2' de la liaison clivable, et qu'un résidu flexible de glycine ou d'alanine est en position P2 ou en position P3. Les protéases des souches sélectionnées pour l'hydrolyse des kératines reconnaissent donc des motifs structuraux particuliers dans la molécule substrat. La protéine prion contient beaucoup de résidus hydrophobes: Tyr (10), Phe (3), Trp (8), et IIe (4) et de nombreux résidus Ser (8). Par conséquent les protéases sont capables de dégrader le prion jusqu'à l'obtention de peptides relativement courts. De plus, l'accès aux sites de clivage va être augmenté pendant le chauffage à la température optimale d'hydrolyse par les protéases, parce que dans de telles conditions, la structure de la protéine sera partiellement ou complètement dénaturée. The inventors have shown using HPLC that the insulin B chain hydrolysis products accumulate in the reaction media after three hours of incubation with the supernatants of strain AT1243. Analysis of the amino acids from the hydrolysed peptides makes it possible to propose that the proteases of strain AT1243 cleave the following peptide bonds: Ser9-His10, Tyr16-Leu17 and Phe25-Tyr26. An additional cleavage site (Leu15-Tyr16) was observed in the case of strain AT1222. The proteases of strain S290 hydrolyze the B chain of insulin at the Leu15-Tyr16 and Tyr16-Leu17 peptide bonds. Thus, the majority of the proteases produced by the thermophilic microorganisms studied have a chymotrypsin specificity. Some of the bacteria also show an unexpected ability to hydrolyze peptide bonds after a seryl residue. Surprisingly, the proteases secreted by the thermophilic microorganisms do not attack the other hydrophobic sites located in the molecule of the B chain of the insulin. Analysis of the microenvironment around the cleavable bonds (the residues in the P2, P3, P1 'positions) does not reveal a strict regularity in the activity of the proteases towards these sites. Nevertheless, it can be observed that a hydrophobic residue is frequently located in the position P2 'of the cleavable bond, and that a flexible residue of glycine or alanine is in position P2 or in position P3. The proteases of the strains selected for the hydrolysis of keratins therefore recognize particular structural units in the substrate molecule. The prion protein contains many hydrophobic residues: Tyr (10), Phe (3), Trp (8), and IIe (4) and many Ser residues (8). Therefore proteases are able to degrade the prion until relatively short peptides are obtained. In addition, access to the cleavage sites will be increased during heating to the optimum temperature of protease hydrolysis, because under such conditions the protein structure will be partially or completely denatured.
Exemple 3: Croissance des microorganismes étudiés sur les milieux contenant de la kératine ou des farines animales. Example 3 Growth of microorganisms studied on media containing keratin or animal meal.
La capacité des bactéries thermophiles, souches S290, souches AT1243 et AT1222 à croître sur des milieux contenant de la kératine de poils de porc ou de plumes a été testée. Les bactéries sélectionnées sont capables d'utiliser des kératines a provenant de poils de porc ou R provenant de plumes, comme principale source de nutriment. The ability of thermophilic bacteria, strains S290, strains AT1243 and AT1222 to grow on media containing keratin pig hair or feathers was tested. The selected bacteria are able to use a keratin from pork or feather hair as the main source of nutrients.
La croissance sur kératine de laine a été la plus importante dans le cas des souches S290 et AT1222, la souche AT1243 fournissant des caractéristiques de croissance inférieures sur ce milieu. Le temps de culture de la plupart des bactéries fut de trois jours. The growth on wool keratin was greatest for strains S290 and AT1222, strain AT1243 providing lower growth characteristics on this medium. The culture time of most bacteria was three days.
Les souches de bactéries étudiées ont également prouvé qu'elles étaient capables de croître sur les farines animales. De plus, ces bactéries croissent sur les farines animales de manière plus rapide que sur la kératine. La croissance la plus faible a été obtenue lorsque le substrat utilisé était le sang, probablement à cause de la toxicité de certains composants présents. The strains of bacteria studied also proved that they were able to grow on animal meal. In addition, these bacteria grow on animal meal faster than on keratin. The lowest growth was obtained when the substrate used was blood, probably because of the toxicity of some components present.
Exemple 4: Activité des protéases produites par les bactéries thermophiles envers la protéine prion recombinante. EXAMPLE 4 Activity of Proteases Produced by Thermophilic Bacteria to the Recombinant Prion Protein
Il a été démontré que la protéine prion recombinante ovine se dénature à 80 C et forme des structures amyloïdes. Cette protéine a donc été utilisée comme modèle de structure amyloïde cellulaire. La capacité des protéases provenant des bactéries thermophiles de l'invention à hydrolyser le prion ovin natif ou dénaturé thermiquement a été étudiée. It has been demonstrated that the ovine recombinant prion protein is denatured at 80 ° C. and forms amyloid structures. This protein has therefore been used as a model of cellular amyloid structure. The ability of the proteases from the thermophilic bacteria of the invention to hydrolyze the native ovine prion or thermally denatured has been studied.
Les figures 2a et 2b montrent que les protéases produites par la souche S290 hydrolysent le prion natif et complètement dénaturé à 60 C en 4 heures. Les protéases produites par les souches AT1243 et AT1222 hydrolysent la protéine prion native ou dénaturée thermiquement à 80 C, ce qui correspond à leur température de croissance optimale. Cependant à 60 C, la protéine prion n'est pas hydrolysée complètement par ces souches. Dans ce cas, comme on l'observe avec la protéinase K, un fragment hydrolytique large d'une masse moléculaire d'environ 14 kDa s'accumule. Comme cela a été déjà démontré, la résistance de ce fragment à la protéolyse est causée par sa capacité à s'agréger. La formation de ces agrégats est dépendante de la concentration et de l'activité des protéases. Si la concentration et l'activité des protéases sont plus faibles qu'une valeur critique, les produits de cette protéolyse limitée s'agrègent et deviennent totalement résistants à une hydrolyse future. A 80 C, les agrégats sont déstabilisés et/ou dénaturés et l'activité des protéases augmente considérablement, donc l'accumulation du fragment de 14 kDa n'apparaît pas. Les inventeurs ont observé que l'introduction d'ions cuivre peut faciliter la transformation des molécules de prion dans leur forme amyloïde. Utilisant ce modèle de structure amyloïde, il a été montré que les protéases des souches S290 (à 60 C), AT1243 et AT1222 (à 80 C) hydrolysent complètement la protéine prion en 4 heures (figure 2c). Durant l'étude de l'activité protéolytique des protéases des souches AT1243 et AT1222 à 80 C, l'accumulation de larges fragments hydrolytiques de prion n'a pas été observée dans le cas de l'hydrolyse du prion natif et dénaturé contrairement à l'activité de ces souches à 60 C (figure 2c). Donc les structures amyloïdes sont déstabilisées à 80 C facilitant leur destruction par les protéases des thermophiles. Figures 2a and 2b show that the proteases produced by strain S290 hydrolyze the native prion and completely denatured at 60 ° C in 4 hours. The proteases produced by strains AT1243 and AT1222 hydrolyze the native prion protein or thermally denatured at 80 C, which corresponds to their optimum growth temperature. However, at 60 ° C., the prion protein is not completely hydrolysed by these strains. In this case, as seen with proteinase K, a large hydrolytic fragment with a molecular weight of about 14 kDa accumulates. As already demonstrated, the resistance of this fragment to proteolysis is caused by its ability to aggregate. The formation of these aggregates is dependent on the concentration and activity of the proteases. If the concentration and activity of the proteases are lower than a critical value, the products of this limited proteolysis aggregate and become completely resistant to future hydrolysis. At 80 C, the aggregates are destabilized and / or denatured and the activity of the proteases increases considerably, therefore the accumulation of the 14 kDa fragment does not appear. The inventors have observed that the introduction of copper ions can facilitate the transformation of the prion molecules into their amyloid form. Using this model of amyloid structure, it has been shown that the proteases of strains S290 (at 60 ° C.), AT1243 and AT1222 (at 80 ° C.) completely hydrolyze the prion protein in 4 hours (FIG. 2c). During the study of the proteolytic activity of AT1243 and AT1222 strain proteases at 80 ° C., the accumulation of large hydrolytic prion fragments was not observed in the case of the hydrolysis of the native and denatured prion, unlike the activity of these strains at 60 C (Figure 2c). So amyloid structures are destabilized at 80 C facilitating their destruction by thermophilic proteases.
Exemple 5: Activité protéolytique des surnaqeants de culture 30 bactérienne. Example 5: Proteolytic Activity of Bacterial Culture Supernatants
Après 24 heures d'incubation avec des farines de laine/poils, de viande, de sang et de mélange avec les surnageants des souches AT1243, AT1222, et S290 une dissolution partielle du substrat a été observée. La figure 3a montre que les protéases des souches AT1243 et AT1222 hydrolysent efficacement les farines de viande, les farines de laine/poils, les farines de sang et les farines mixtes Les enzymes des souches S290 montrent une activité plus faible mais satisfaisante. Cela pourrait résulter des faibles températures d'incubation à savoir 80 C dans le cas des souches AT1243 et AT1222 et 60 C dans le cas de la souche S290. After 24 hours of incubation with wool / hair, meat, blood and mixtures with the supernatants of strains AT1243, AT1222, and S290 a partial dissolution of the substrate was observed. Figure 3a shows that proteases of strains AT1243 and AT1222 effectively hydrolyze meat flours, wool / hair flours, blood flours and mixed flours. The enzymes of strains S290 show a lower but satisfactory activity. This could result from the low incubation temperatures of 80 C in the case of strains AT1243 and AT1222 and 60 C in the case of strain S290.
Par comparaison, les données obtenues pour l'activité de la protéinase K envers les protéines des farines sont également montrées sur la figure 3b. La protéinase K hydrolyse efficacement les farines de laine/poils et avec une plus faible efficacité, les farines de viande et les farines mixtes. La protéinase K est pratiquement inactive envers les farines de sang. In comparison, the data obtained for Proteinase K activity towards flour proteins are also shown in Figure 3b. Proteinase K effectively hydrolyzes wool / hair flours and with lower efficiency, meat flours and mixed flours. Proteinase K is virtually inactive against blood meal.
Tableau 1 Activité des protéases (pourcentage d'hydrolyse de substrat) des surnageants des bactéries thermophiles envers des substrats chromogènes de faible masse moléculaire. Les conditions de réactions sont données dans la partie matériel et méthode. Les substrats ont été incubés pendant trois heures à 80 C (AT1243 et AT1222) et à 60 C (S290). Les souches sont représentées dans la colonne de gauche, les substrats sont représentés sur la première ligne. TABLE 1 Activity of proteases (percentage of substrate hydrolysis) of supernatants of thermophilic bacteria to chromogenic substrates of low molecular weight. The reaction conditions are given in the material and method part. The substrates were incubated for three hours at 80 ° C (AT1243 and AT1222) and at 60 ° C (S290). The strains are represented in the left column, the substrates are represented on the first line.
Bzl-Arg-pNA Suc-Phe- Suc-Ala-Ala- Suc-Ala-Ala- pNA Pro-Phe-pNA Pro-Lys-pNA AT1243 0,8 0,6 0 0 AT1222 1,0 0,6 1,3 0 S290 0,1 0,4 30 0,3 Références Arai, K., Naito, S., Dang, V.B., Nagasawa, N., Hirano, M. (1996). Cross-linking structure of keratin. VI. Number, type, and location of disulfide cross linkages in Iow-sulphur protein of wool fibre and their relation to permanent set. J. Appt. Polym. Sci 60, 169-179. Bzl-Arg-pNA Suc-Phe-Suc-Ala-Ala-Suc-Ala-Ala-pNA Pro-Phe-pNA Pro-Lys-pNA AT1243 0.8 0.6 0 0 AT1222 1.0 0.6 1, S290 0.1 0.4 0.3 References Arai, K., Naito, S., Dang, VB, Nagasawa, N., Hirano, M. (1996). Cross-linking structure of keratin. VI. Number, type, and location of disulfide cross linkages in Iow-sulfur protein fiber and their relationship to permanent set. J. Appt. Polym. Sci 60, 169-179.
Atalo, K., Gashe, B.A. (1993). Protease production by a 5 thermophilic Bacillus species (P-001A), which degrades various kinds of fibrous proteins. Biotechnol. Lett. 15, 1151-1156 Bidlingmeyer, B.A., Cohen, S.A., and Tarvin, T.L. .1984. Rapid analysis of amino acids using precolumn derivatization. J. 10 Chromatogr. 336, 93-104. Atalo, K., Gashe, B.A. (1993). Protease production by a thermophilic Bacillus species (P-001A), which degrades various kinds of fibrous proteins. Biotechnol. Lett. 15, 1151-1156 Bidlingmeyer, B.A., Cohen, S.A., and Tarvin, T.L., 1984. Rapid analysis of amino acids using precolumn derivatization. J. Chromatogr. 336, 93-104.
Cheng, S.W., Hu, H.M., Shen, S.W., Takagi, H., Asano, A., Tsai, Y.C. (1995). Production and characterization of keratinase of a featherdegrading Bacillus licheniformis PWD-1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59. 2239-2243 Goddard, D.R., Michaelis, L.k (1934). A study on keratin. J. Biol. Chem. 106, 604-614. Cheng, S.W., Hu, H.M., Shen, S.W., Takagi, H., Asano, A., Tsai, Y.C. (1995). Production and characterization of keratinase of a featherdegrading Bacillus licheniformis PWD-1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59. 2239-2243 Goddard, D.R., Michaelis, L.k (1934). A study on keratin. J. Biol. Chem. 106, 604-614.
Han, X.Q., Damodaran, S. (1997). Stability of protease Q against autolysis and in sodium dodecyl sulphate and urea solutions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 240, 839-843. Han, X.Q., Damodaran, S. (1997). Stability of protease against autolysis and sodium dodecyl sulphate and urea solutions. Biochem. Biophys. Res. Common. 240, 839-843.
Kristie, L., Evans, J.C., Crowder, J., Miller, E.S. (2000). 25 Subtilisins of Bacillus spp. hydrolyze keratin and allow growth on feathers. Can. J. Microbiol. 46, 1004-1011. Kristie, L., Evans, J.C., Crowder, J., Miller, E.S. (2000). Subtilisins of Bacillus spp. hydrolyze keratin and allow growth on feathers. Can. J. Microbiol. 46, 1004-1011.
Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural protein during the assemblage of the head of bacteriophage T4. Nature 225, 650-30 657 Lin, X., Lee, C.G. , Gasale, E.S., Shih J.C.H. (1992). Purification and characterisation of a keratinase from a feather degrading Bacillus licheniformis strain. Appt. Environ. Microbiol. 58, 3271-3275. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 225, 650-30657 Lin, X., Lee, C.G., Gasale, E.S., Shih J.C.H. (1992). Purification and characterization of a keratinase from a feather degrading Bacillus licheniformis strain. Apt. About. Microbiol. 58, 3271-3275.
Nesterenko, M.V., Tilley, M., Upton, S.J. (1994). A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels. J. Biochem. Biophys. Methods 28, 239-242. Nesterenko, M.V., Tilley, M., Upton, S.J. (1994). A simple modification of Blum 's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels. J. Biochem. Biophys. Methods 28, 239-242.
Prusiner, S.B. (1998). Prions. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 95, 13363-13383. Prusiner, S.B. (1998). Let us pray. Proc. Nat /. Acad. Sci. USA 95, 13363-13383.
Rezaei, H., Marc, D., Choiset, Y., Takahashi, M., Hui Bon Hoa, G., Haertlé, T., Grosclaude, J., Debey, P. (2000). High yield purification and physico-chemical properties of full-length recombinant allelic variants of sheep prion protein linked to scrapie susceptibility. Eur. J. Biochem. 267, 2833-2839. Rezaei, H., Mark, D., Choiset, Y., Takahashi, M., Hui Bon Hoa, G., Haertle, T., Grosclaude, J., Debey, P. (2000). High yield purification and physico-chemical properties of full-length recombinant allelic variants of sheep protein prion protein linked to scrapie susceptibility. Eur. J. Biochem. 267, 2833-2839.
Williams, C.M., Richter C.S., Mackenzie, Jr, J.M. Shih, J.C.H. (1990). Isolation, identification and characterization of a featherdegrading bacterium. Appt. Environ. Microbiol. 56, 1509-1515. Williams, C.M., Richter C.S., Mackenzie, Jr., J.M. Shih, J.C.H. (1990). Isolation, identification and characterization of a featherdegrading bacterium. Apt. About. Microbiol. 56, 1509-1515.
Claims (16)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0450513A FR2867388B1 (en) | 2004-03-12 | 2004-03-12 | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DESTRUCTION OF INFECTIOUS PRION PROTEINS. |
PCT/FR2005/050158 WO2005092114A2 (en) | 2004-03-12 | 2005-03-11 | Compositions and methods for destruction of prion infectious proteins |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0450513A FR2867388B1 (en) | 2004-03-12 | 2004-03-12 | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DESTRUCTION OF INFECTIOUS PRION PROTEINS. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2867388A1 true FR2867388A1 (en) | 2005-09-16 |
FR2867388B1 FR2867388B1 (en) | 2006-06-23 |
Family
ID=34896776
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR0450513A Expired - Fee Related FR2867388B1 (en) | 2004-03-12 | 2004-03-12 | COMPOSITIONS AND METHODS FOR DESTRUCTION OF INFECTIOUS PRION PROTEINS. |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
FR (1) | FR2867388B1 (en) |
WO (1) | WO2005092114A2 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8110391B2 (en) | 2001-01-08 | 2012-02-07 | Health Protection Agency | Degradation and detection of TSE infectivity |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8034766B2 (en) | 2006-10-27 | 2011-10-11 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for prion decontamination |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0667352A1 (en) * | 1994-01-24 | 1995-08-16 | Imedex | Process for the removal of prions in collagens and collagens thus obtained |
US5633349A (en) * | 1991-08-19 | 1997-05-27 | Reichl; Herwig | Method of inactivating prions (slow viruses) conventional viruses and other infections agents in biological material |
WO2002083082A2 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-24 | Bioresource International, Inc. | Composition and method for destruction of infectious prion proteins |
US20020172989A1 (en) * | 2001-04-12 | 2002-11-21 | Bioresource International, Inc. | Composition and method for destruction of infectious prion proteins |
-
2004
- 2004-03-12 FR FR0450513A patent/FR2867388B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-03-11 WO PCT/FR2005/050158 patent/WO2005092114A2/en active Application Filing
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5633349A (en) * | 1991-08-19 | 1997-05-27 | Reichl; Herwig | Method of inactivating prions (slow viruses) conventional viruses and other infections agents in biological material |
EP0667352A1 (en) * | 1994-01-24 | 1995-08-16 | Imedex | Process for the removal of prions in collagens and collagens thus obtained |
WO2002083082A2 (en) * | 2001-04-12 | 2002-10-24 | Bioresource International, Inc. | Composition and method for destruction of infectious prion proteins |
US20020172989A1 (en) * | 2001-04-12 | 2002-11-21 | Bioresource International, Inc. | Composition and method for destruction of infectious prion proteins |
US20020192731A1 (en) * | 2001-04-12 | 2002-12-19 | H. Shih Jason C. | Method and composition for sterilizing surgical instruments |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
HUNTER G D ET AL: "Attempts to release the scrapie from tissue debris", 1967, JOURNAL OF COMPARATIVE PATHOLOGY, ACADEMIC PRESS, LONDON, GB, PAGE(S) 301-307, ISSN: 0021-9975, XP002962234 * |
MCKINLEY M P ET AL: "A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion", CELL, CELL PRESS, CAMBRIDGE, NA, US, vol. 35, November 1983 (1983-11-01), pages 57 - 62, XP002961643, ISSN: 0092-8674 * |
RUTALA W A ET AL: "CRUETZFELDT-JAKOB DISEASE: RECOMMENDATIONS FOR DISINFECTION AND STERILIZATION", CLINICAL INFECTIOUS DISEASES, THE UNIVERSITY OF CHICAGO PRESS, CHICAGO, IL, US, vol. 32, no. 9, 1 May 2001 (2001-05-01), pages 1348 - 1356, XP008012867, ISSN: 1058-4838 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8110391B2 (en) | 2001-01-08 | 2012-02-07 | Health Protection Agency | Degradation and detection of TSE infectivity |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2867388B1 (en) | 2006-06-23 |
WO2005092114A2 (en) | 2005-10-06 |
WO2005092114A3 (en) | 2006-03-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bhagwat et al. | Collagen and collagenolytic proteases: A review | |
Hassan et al. | Biochemical characterisation and application of keratinase from Bacillus thuringiensis MT1 to enable valorisation of hair wastes through biosynthesis of vitamin B-complex | |
Suphatharaprateep et al. | Production and properties of two collagenases from bacteria and their application for collagen extraction | |
Brandelli et al. | Biochemical features of microbial keratinases and their production and applications | |
Jagadeesan et al. | Sustainable production, biochemical and molecular characterization of thermo-and-solvent stable alkaline serine keratinase from novel Bacillus pumilus AR57 for promising poultry solid waste management | |
Łaba et al. | New keratinolytic bacteria in valorization of chicken feather waste | |
Riffel et al. | Purification and characterization of a keratinolytic metalloprotease from Chryseobacterium sp. kr6 | |
Pal et al. | Microbial collagenases: challenges and prospects in production and potential applications in food and nutrition | |
EP0115974B1 (en) | Highly active collagenolytic preparation and pharmaceutical compositions containing it | |
Balaji et al. | Purification and characterization of an extracellular keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC (9102) | |
CN101184770A (en) | Carrier for targeting nerve cells | |
Daboor et al. | Extraction and purification of collagenase enzymes: a critical review | |
Makinen et al. | The Enterococcus faecalis extracellular metalloendopeptidase (EC 3.4. 24.30; coccolysin) inactivates human endothelin at bonds involving hydrophobic amino acid residues | |
Chao et al. | Screening for a new Streptomyces strain capable of efficient keratin degradation | |
Singh et al. | Keratinases and microbial degradation of keratin | |
Tsiroulnikov et al. | Hydrolysis of the amyloid prion protein and nonpathogenic meat and bone meal by anaerobic thermophilic prokaryotes and Streptomyces subspecies | |
Zaghloul et al. | Key determinants affecting sheep wool biodegradation directed by a keratinase-producing Bacillus subtilis recombinant strain | |
Paul et al. | Biochemical and structural characterization of a detergent stable alkaline serine keratinase from Paenibacillus woosongensis TKB2: a potential additive for laundry detergent | |
Bezus et al. | Revalorization of chicken feather waste into a high antioxidant activity feather protein hydrolysate using a novel psychrotolerant bacterium | |
Yakul et al. | Characterization of thermostable alkaline protease from Bacillus halodurans SE5 and its application in degumming coupled with sericin hydrolysate production from yellow cocoon | |
Babalola et al. | Biochemical characterization of a surfactant-stable keratinase purified from Proteus vulgaris EMB-14 grown on low-cost feather meal | |
Hamdy | Extracellular collagenase from Rhizoctonia solani: Production, purification and characterization | |
Goshev et al. | Characterization of the enzyme complexes produced by two newly isolated thermophylic actinomycete strains during growth on collagen-rich materials | |
Corich et al. | Evaluation of a biomimetic 3D substrate based on the Human Elastin-like Polypeptides (HELPs) model system for elastolytic activity detection | |
Cheng et al. | Purification and characterization of an eggshell membrane decomposing protease from Pseudomonas aeruginosa strain ME-4 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ST | Notification of lapse |
Effective date: 20071130 |