FR2863893A1 - Utilisation de principes actifs stimulant les beta-defensines humaines de type 2 et/ou de type 3 - Google Patents

Utilisation de principes actifs stimulant les beta-defensines humaines de type 2 et/ou de type 3 Download PDF

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Abstract

L'invention concerne des principes actifs capables de stimuler l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 et/ou bêta-défensines humaines de type 3.Ainsi l'invention fournit un principe actif capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 et/ou bêta-défensines humaines de type 3 caractérisé en ce que ledit principe actif n'entraîne pas de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s) ou d'intolérance(s). L'invention fournit aussi une méthode de criblage permettant de sélectionner de tels principes actifsL'invention trouve l'application dans la préparation de composition cosmétique ou pharmaceutique contenant de tels principes actifs.

Description

La présente invention concerne principalement des principes actifs
capables de stimuler l'expression, directe ou indirecte, des bêtadéfensines humaines de type 2 et/ou des bêta-défensines humaines de type 3.
La présente invention concerne principalement les compositions cosmétiques ou pharmaceutiques contenant de tels principes actifs.
La présente invention concerne principalement une méthode de soin utilisant de telles compositions.
La présente invention concerne principalement une méthode de criblage permettant de sélectionner de tels principes actifs.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les peptides antibiotiques sont des molécules de petites tailles (10 à 50 acides aminés) capables de détruire des micro-organismes tels que bactéries, champignons ou virus, en perméabilisant leur membrane cellulaire. Depuis leur découverte en 1981 chez les arthropodes, près de 500 molécules présentant ces propriétés ont été identifiées chez les organismes supérieurs (végétaux, insectes, mammifères, humains). La caractéristique commune des peptides antimicrobiens est leur structure amphipathique, c'est à dire la répartition des acides aminés en zones cationiques (chargées positivement) distinctes de zones hydrophobiques. C'est cette structure qui leur confère leur activité et leur spécificité d'action sur les membranes cytoplasmiques bactériennes, car celles-ci présentent de nombreux phospholipides anioniques, chargés négativement, attirant la fixation des secteurs cationiques des peptides antibiotiques (Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002; 415: 389-395). Selon leur structure, les spectres d'action de ces peptides peuvent être très étroits ou très larges.
Les peptides antimicrobiens sont largement retrouvés dans le monde 30 animal: dans les venins (de scorpions, d'abeilles, d'araignées), chez la drosophile ou la mouche bleue, dans les neutrophiles bovins, dans les leucocytes et l'intestin grêle de porc, clans le lait, chez les grenouilles, dans les moules de méditerranée, etc....Dans le monde végétal, ce sont les thionines et les défensines qui assurent la protection antibactérienne des graines et des tissus végétatifs des plantes.
La majorité des peptides antibactériens sont retrouvés dans les tissus épithéliaux des animaux, où ils jouent un rôle prépondérant de première barrière immunitaire. Ils ont été mis en évidence dans la peau des grenouilles ou des souris, mais aussi dans l'appareil gastro-intestinal et respiratoire chez l'homme ainsi que dans sa peau et ses muqueuses.
Les défensines constituent une des classes de peptides antimicrobiens les plus étudiées. Elles désignent des molécules riches en cystéines, et présentant trois ponts disulfures. Elles sont présentes chez les plantes, les insectes, et divers mammifères. Chez l'homme, on distingue deux classes de défensines qui diffèrent l'une de l'autre par l'espacement et les connexions entre les six résidus cystéine: les a-défensines (6 représentants), isolées dans les neutrophiles (HNP1 à 4, Human Neutrophil Peptide) et dans les cellules de Paneth de l'appareil gastro-intestinal (a défensines 5 et 6) les fi-défensines, plus basiques et plus longues, exprimées dans les muqueuses et les cellules épithéliales (peau, trachée, langue, amygdales, salive...), existent sous 3 formes: Une forme constitutive, hBD1 (Human fi-defensin 1), retrouvée essentiellement dans les reins, ruais aussi dans le pancréas, la salive, les poumons, le placenta et la peau.
Deux formes inductibles: hBD2 et hBD3 (Human 8-defensin 2 et 3) : hBD2 est exprimée dans la peau, la trachée, les poumons; son expression est induite par une stimulation bactérienne, par le TNFa (Tumour Necrosis Factor a) (Harder J. et al., A peptide antibiotic from human skin. Nature 1997; 387: 861), par les LPS (Lipopolysaccharides) (Mathews E et al., Production of betadefensin antimicrobial peptides by the oral mucosa and salivary glands. Infect Immun 1999; 67: 2740-2745), par ILia et IL1p (Interleukin 1) (Liu AY et al., Human p-defensin-2 production in keratinocytes is regulated by interleukin-1, bacteria and the state of differentiation. J Invest Dermatol 2002; 118: 275-281), toutes ces molécules ayant comme propriété commune d'être impliquées dans les processus inflammatoires. L'activité antibactérienne de hBD2 vise en particulier les bactéries Gram négatif telles qu'Escherishia coll.
> hBD3 est retrouvée dans la peau, la trachée, les amygdales et la langue (Harder J. et al., Isolation and characterization of human 13- defensin-3, a novel humain inducible peptide antibiotic. J B/o/ Chem 2001; 276: 5707-5713), mais aussi dans les tissus musculaires et le coeur (Conejo Garcia et al., Identification of a novel, multifonctional p- defensin (humas p-defensin-3) with specific antimicrobial activity. Ce// tissue research 2001; 306: 257-264). hBD3 est induite par une stimulation bactérienne, le TNFa, et surtout l'IFNy (Interféron gamma), qui ont également comme dénominateur commun, le fait d'être des molécules impliquées dans les processus inflammatoires. Le spectre d'action de hBD3 est plus large que celui de hBD2 car elle est capable de lyser des bactéries Gram négatif et Gram positif, telles que Staphy/ococcus aureus.
L'induction de ces défensines dans la peau constitue la première ligne de défense qu'établit notre corps pour se protéger du nombre croissant de micro-organismes pathogènes auxquels il est confronté. De plus, hBD2 présente des propriétés chémotactiques pour les cellules dendritiques immatures et les lymphocytes T mémoires (Yang D. et al., Betadefensins: linking innate and adaptative immunity through dendritic and T cell CCR6. Science 1999; 286: 525-528) et jouerait donc un rôle important dans la promotion de la réponse immunitaire, de l'inflammation et de la cicatrisation.
L'augmentation de la quantité de 5-défensines sur la peau humaine contribue donc à préserver l'écosystème microbien cutané, en évitant des invasions trop fortes de certaines espèces qui peuvent être pathogènes (Staphy/ococcus aureus), ce qui permet de conserver une peau protégée et plus saine. Pour ce faire, deux stratégies peuvent être envisagées: - Soit l'application par voie topique de peptides synthétiques présentant des séquences ou des structures analogues à celles des peptides antibiotiques connus et décrits par l'homme de l'art.
- Soit l'induction provoquée des défensines par l'application par voie topique ou par voie orale d'un actif capable de stimuler la synthèse de 15 ces peptides au sein des cellules naturellement sécrétrices.
A l'exception des cytokines précédemrnent citées (TNFa, IFNy, IL1), peu de produits ont été décrits pour leur capacité d'induction des p- défensines, excepté chez l'animal, où la L-Isoleucine induit l'expression de hBD3 dans des lignées de cellules épithéliales rénales bovines (Fehlbaum P. et al., An essential amino acid induces epitheliall p.- defensin expression. PNAS 2000; 97: 12723-12728; Brevet W00168085 Anderson M. et al., Method for stimulation of defensin production. 20-09- 2001). Chez l'homme, il a été montré que la différenciation des kératinocytes stirnule la production de hBD2 (Liu AY. Et al., Human (3- defensin-2 production in keratinocytes is regulated by interleukin-1, bacteria and the state of clifferentiation. J Invest Dermato/ 2002; 118: 275-281).
Les études concernant la présence des défensines hBD2 et hBD3 dans la peau, ont été réalisées sur des coupes de peau, des expiants, des cellules en cultures ou des peaux reconstruites. L'augmentation de la quantité de défensines peut être visualisée par différentes techniques, mais aucune de ces techniques n'a été à ce jour appliquée à la recherche par screening, d'un principe actif capable de stimuler de façon quantitative hBD2 et hBD3 dans les cellules humaines. En effet, les techniques classiquement utilisées par l'homme de l'art ne sont pas applicables au problème soulevé à savoir la recherche de principes actifs capables de stimuler les défensines humaines de façon quantitativement prouvée (absence d'anticorps commerciaux ce qui induit l'impossibilité d'effectuer des dosages quantitatifs de protéines par des méthodes de type ELISA; méthodes de biologie moléculaire de type hybridation in situ, transfert de Northern, RT-PCR, qui sont plus qualitatives que quantitatives; modèles de cellules humaines en culture tridimensionnelle très complexes et non utilisables dans des méthodes de screening).
Un tel dosage sera mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention.
BUTS DE l'INVENTION Le but des inventeurs était de trouver des principes actifs capables d'induire l'expression des [i-défensines de type 2 et/ou de type 3 sans induire de réactions inflammatoires, et par exemple, sans stimuler de façon trop importante la sécrétion de molécules habituellement exprimées dans le cas de réactions inflammatoires.
En effet, jusqu'à présent, toutes les molécules décrites pour leur capacité de stimulation des défensines chez l'homme (TNFa, IL1, LPS, bactéries, IFNy...), ont des propriétés pro-inflammatoires; elles stimulent des cytokines de l'inflammation telles que ILia, IL8 ou MIP3a.
Ainsi, l'invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir un principe actif capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines, de type 2 et/ou des bêta-défensines humaines de type 3, sans entraîner de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s) ou d'intolérance(s).
L'invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir un principe actif capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 et/ou des bêta-défensines humaines de type 3 sans stimuler ou sensiblement sans stimuler la synthèse, directe ou indirecte, de molécules proinflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires.
L'invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir une composition comprenant au moins un principe actif tel que ci-dessus défini.
La présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir un modèle tissulaire ou cellulaire permettant de cribler les principes actifs tels que ci-dessus définis.
La présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir une méthode de criblage de principes actifs définis ci-dessus.
La présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir une composition contenant les principes actifs ci-dessus définis, pour une utilisation dans le domaine de la cosmétique ou de la pharmacie.
Cette utilisation est essentiellernent effectuée dans le but d'exercer une activité bactéricide et/ou fongicide, de préférence par application topique sur les tissus, par exemple la peau, les muqueuses, les phanères ou le cuir chevelu.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Les inventeurs entendent par "actifs", les principes actifs potentiels à cribler; par "défensines", les 1i-défensines de type 2 et/ou de type 3 2863893 7 lorsque ce terme est employé en référence aux défensines stimulées par les principes actifs de la présente invention.
La présente invention concerne,, selon un premier aspect, un principe actif capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte, des bêtadéfensines humaines de type 2 et/ou des bêta-défensines humaines de type 3 n'entraînant pas de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s), ou d'intolérance(s).
Les inventeurs entendent par n'entraînant pas de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s), ou d'intolérance(s) , le fait que l'utilisation de ces principes actifs ne produise pas d'effet(s) secondaire(s) gênant(s) pour un utilisateur de ce principe actif. Les inventeurs entendent par gênant(s) les réactions du type rougeurs, picotements, irritations, sensibilité accrue de la peau, etc. Avantageusement ledit principe actif capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 (hBD2) et/ou des bêta-défensines humaines de type 3 (hBD3) ne stimule pas ou sensiblement pas la synthèse, directe ou indirecte, de molécule(s) proinflammatoire(s) ou de molécules(s) habituellement co-exprimée(s) lors de processus inflammatoire(s).
Les inventeurs entendent par ne pas stimuler ou ne sensiblement pas stimuler la synthèse, directe ou indirecte de molécules proinflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires , le fait que ledit principe actif ne stimule pas ou stimule les molécules pro-inflammatoires ou habituellement coexprimées lors de processus inflammatoires, de façon à induire une stimulation inférieure à celle induite par le TNF alpha (TNFa) ou l'interféron gamma (IFNy), de préférence une stimulation inférieure à ; 75% de la stimulation maximale induite par l'utilisation du TNF alpha ou de l'interféron gamma, toutes conditions de température, de temps de contact, et de conditions opératoires identiques par ailleurs.
Avantageusement ladite molécule pro-inflammatoire ou habituellement coexprimée lors de processus inflammatoires est notamment le MIP 3 alpha, ou l'IL8 ou les IL1, ou une autre interleukine, ou l'histamine, ou la tryptase, ou la substance P, ou les leucotriènes, ou les prostaglandines.
Avantageusement ledit principe actif, ne stimule pas, de manière sensible, la production, directe ou indirecte, de molécule(s) proinflammatoire(s) ou habituellement co-exprimée(s) lors de processus inflammatoires, dans les cultures de cellules épithéliales humaines, en particulier les kératinocytes et/ou les cornéocytes en culture, ou dans les biopsies cutanées humaines maintenues en survie, ou dans des modèles d'épidermes reconstruits, ou dans des modèles de peaux reconstruites, construites ou non sur des matrices cellulaires ou sur des dermes désépidermisés. Lesdites cellules épithéliales sont de préférence normales .
Les inventeurs entendent par normales , les cellules épithéliales non issues de lignées cellulaires, non immortalisées, mais qui peuvent être des cellules issues de tissus pathologiques ou des cellules génétiquement modifiées.
Avantageusement ledit principe actif, est choisi parmi la racine d'armoise, la vergerette du Canada, l'écorce de sureau, l'herniaire, le jus d'ananas, la menthe poivrée, l'Arequier, le cacaoyer, le quinoa, l'arnica, le boldo, la salsepareille, la feuille de noyer, la fleur d'hibiscus, le potiron, le tournesol, la pivoine, le millepertuis, le marronnier d'inde ou l'un de leurs extraits; l'acide jasmonique ou la vitamine A, leurs dérivés et leurs précurseurs; l'alpha-MSH ou un des peptides constituant l'alpha-MSH ou une structure chimique mimant un de ces peptides; les esters de l'isoleucine; le calcium ou tous les sels organiques ou minéraux de calcium.
Avantageusement les principes actifs issus de végétaux sont obtenus par extraction préférentiellement aqueuse mais également par d'autres méthodes d'extraction comme dans un mélange eau/butylène glycol par exemple (de 1/99 à 99/1 en proportion p/p). L'acide jasmonique ou la vitamine A, leurs dérivés et leurs précurseurs, l'alpha-MSH ou un des peptides constituant l'alpha-MSH ou une structure chimique mimant un de ces peptides, les esters de l'isoleucine,et le calcium ou tous les sels organiques ou minéraux de calcium sont utilisés tels quels, dilués dans de l'eau ou de l'éthanol ou d'autres solvants compatibles avec le modèle décrit.
L'invention concerne, selon un second aspect une composition comprenant au moins un principe actif tel que défini ci-dessus.
Avantageusement, ladite composition comprend ledit principe actif à une concentration comprise entre 0,001 % et 20 %, de préférence entre 0,01 % et 10 %. Ces concentrations sont exprimées en pourcentage en poids, notamment lorsque ce pourcentage n'est pas clairement mentionné comme étant un pourcentage en poids.
Cette concentration est optimisée de manière à ce que le principe actif soit capable de stimuler l'expression des béta-défensines humaines de type 2 et/ou de type 3, et de ne pas induire d'irritation ou d'inflammation, notamment de ne pas stimuler ou sensiblement pas stimuler, la synthèse directe ou indirecte, d'au moins une molécule pro- inflammatoire ou habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoires.
L'invention concerne selon un troisième aspect, l'utilisation d'au moins un principe actif tel que défini précédemment pour la fabrication d'une composition cosmétique, ledit principe actif étant présent en une concentration capable de stimuler l'expression des béta-défensines humaines de type 2 ou/et de type 3, et de ne pas induire d'irritation ou d'inflammation, notamment de ne pas stimuler ou sensiblement pas stimuler la synthèse, directe ou indirecte, d'au moins une molécule proinflammatoire ou habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoires, ledit principe actif étant éventuellement en mélange avec un excipient cosmétiquement acceptable.
L'invention concerne selon un quatrième aspect l'utilisation d'au moins un principe actif tel que défini précédemment pour la fabrication d'une composition pharmaceutique, ledit principe actif étant présent en une concentration capable de stimuler l'expression des bêta-défensines humaines de type 2 ou/et de type 3, et de ne pas induire d'irritation ou d'inflammation, notamment de ne pas stimuler ou sensiblement pas stimuler la synthèse, directe ou indirecte, d'au moins une molécule proinflammatoire ou habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoire(s), ledit principe actif étant éventuellement en mélange avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement ladite composition comprend au moins un agent microbiocide et/ou microbiostatique. Les inventeurs entendent par agent microbiocide , le groupe des agents ayant une action destructrice vis-à- vis des bactéries et par agent microbiostatique , le groupe des agents ayant une action de limitation de la prolifération bactérienne.
L'invention concerne selon un cinquième aspect, un modèle cellulaire ou tissulaire, permettant de cribler au moins un principe actif capable de stimuler l'expression des bêta-défensines humaines de type 2 et/ou 3 et de ne pas induire d'irritation ou d'inflammation, notamment de ne pas stimuler ou sensiblement pas stimuler la synthèse directe ou indirecte, d'au moins une molécule pro-inflammatoire ou habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoires.
Avantageusement ledit modèle cellulaire ou tissulaire comprend des cellules épithéliales, par exemple des kératinocytes et/ou des cornéocytes, capables d'être mises en culture dans des conditions de culture appropriées avec en particulier une teneur en calcium comprise entre 0 et 100mM, de préférence de 1,7mM.
L'invention concerne, selon un sixième aspect, une méthode de criblage de principes actifs susceptibles de stimuler l'expression, directe ou indirecte, de bêta-défensines humaines de type 2 et/ou 3, et de ne pas induire d'irritation ou d'inflammation, notamment de ne pas ou sensiblement pas stimuler la synthèse directe ou indirecte d'au moins une molécule pro-inflammatoire ou d'une molécule habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoires (ces principes actifs sont décrits dans la présente invention comme principes actifs potentiels à cribler ), comprenant les étapes suivantes: a) culture d'un modèle cellulaire ou tissulaire, en présence de différents principes actifs potentiels à cribler, dans des conditions de culture appropriées; la méthode peut être effectuée sur au moins un principe actif potentiel à cribler, mais il est plus avantageux de tester un grand nombre de ces principes actifs (ou actifs ) en même temps., b) Mise en évidence, directe ou indirecte, de la présence ou non de la stimulation de l'expression des bêta-défensines humaines de type 2 et/ou 3; c) Mise en évidence des propriétés non irritantes et non inflammatoires de ces principes actifs, notamment par l'absence de stimulation, de façon directe ou indirecte, de molécules proinflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend une étape supplémentaire d) où il est effectué la sélection d'au moins un principe actif ainsi testé capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte, de bêtadéfensines humaines de type 2 et/ou 3, et simultanément de ne pas ou sensiblement pas stimuler la synthèse, directe ou indirecte, de molécules pro-inflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires.
Les lecteurs comprendront bien évidemment que les inventeurs ne limitent pas leur invention aux méthodes particulières d'analyse, qui ne sont qu'un moyen de mettre en oeuvre le principe de criblage de la présente invention.
En effet, dans le futur, d'autres méthodes d'analyses pourraient se substituer à celles utilisées par les inventeurs dans la présente invention, comme les méthodes mettant en oeuvre des anticorps capables de reconnaître les hBD2 et 3 (méthodes de type EL.ISA, immunoblotting, immuno-histologie, etc...).
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend à l'étape a) un modèle cellulaire ou tissulaire, comprenant des cellules épithéliales ou des biopsies cutanées maintenues en survie, ou des modèles d'épidermes reconstruits ou des modèles de peaux reconstruites, comprenant des cellules épithéliales, par exemple des kératinocytes et/ou des cornéocytes, capables d'être mises en culture dans des conditions de culture appropriées avec en particulier une teneur en calcium comprise entre 0 et 100 mM, de préférence 1,7mM.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend, à l'étape a), la présence des différents principes actifs potentiels à cribler avec le modèle cellulaire ou tissulaire, pendant un temps compris entre 6 et 48 h, de préférence d'environ 16 h (temps de mise en contact).
Les inventeurs entendent par "principe actif potentiel à cribler", l'ensemble des produits qui sont testés par la méthode de criblage, c'està- dire tous les produits pouvant être mis sous la forme nécessaire à réaliser cette méthode de criblage.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend à l'étape b) une extraction des ARN totaux et une analyse par RT-PCR de l'expression des ARNm codant pour les bêta-défensines humaines de type 2 et/ou de type 3 précitées.
Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape b) une RTPCR sur l'actine (gène rapporteur peu stimulable) de façon à rapporter les augmentations des ARNm codant les hBD2 et hBD3 par rapport à l'ARNm codant pour l'actine.
Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape b) un dépôt des ARNm amplifiés sur gel d'agarose contenant un intercalant des acides nucléiques visualisable sous UV (comme le bromure d'éthidium par exemple) Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape b) , suite à la migration des produits sur gel d'agarose, une comparaison des rapports d'intensité des bandes hBD2/actine et hBD3/actine sous lumière uv.
Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape c) un dosage de type ELISA pour doser les molécules pro-inflammatoires ou les molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires.
Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape d) la sélection d'au moins un principe actif qui est capable de stimuler l'expression des ARNm codant pour lesdites bêta-défensines humaines de type 2 et/ou de type 3 sans ou sensiblement sans stimuler la synthèse, directe ou indirecte, de molécules pro-inflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend la sélection des principes actifs stimulant l'expression des bêta-défensines humaines précitées et ne stimulant pas ou sensiblement pas de façon concomitante au moins une molécule pro-inflammatoire ou au moins une molécule habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoires, telles que IL1, IL8, MIP3a.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend les étapes suivantes: - La mise en contact des principes actifs potentiels à cribler avec des kératinocytes humains normaux, en monocouche, en milieu défini sans sérum et enrichi en calcium, par exemple en réalisant parallèlement un témoin non traité et deux témoins positifs (TNFa pour hBD2 et IFNy pour hBD3) ; L'extraction puis le dosage des ARN totaux sur un spectrophotomètre, de manière préférée à des longueurs d'onde de 260 et 280 nm; ces ARN sont éventuellement dilués; - Une RT-PCR sur l'actine, la hBD2 et la hBD3 est réalisée sur l'ARNtotal initial; La rétro-transcription de l'ARNtotal puis l'amplification du produit rétrotranscrit (ADNc), qui est effectuée par exemple dans un thermocycleur et suit un programme d'amplification, qui est éventuellement commun pour l'actine, hBD2 et hBD3; Le mélange des produits d'amplification de hBD2, hBD3 et de l'actine, puis l'ajout d'un mélange tampon de charge et d'eau (2/3), la solution finale étant déposée sur gel précoulé d'agarose contenant du bromure d'éthidium. Les échantillons migrent et les bandes obtenues par cette technique sont visualisées sous UV, de préférence en chambre noire et photographiées numériquement. Les bandes sont analysées dans cette étape pour quantifier leur l'intensité. Le niveau basal d'expression des défensines (témoin non traité) n'étant pas détectable, les rapports d'intensité des bandes hBD2/actine et hBD3/actine peuvent être comparés par exemple à ceux obtenus pour le térnoin positif (traité par le TNFa pour hBD2 et l'IFNy pour hBD3), ce qui permet de mettre en évidence une éventuelle stimulation de l'expression de la f3-défensine considérée; Avantageusement, cette méthode de criblage comprend une étape supplémentaire: - La sélection des principes actifs potentiels à cribler ayant exercé un effet sur l'expression des (3-défensines de type 2 et/ou de type 3; les surnageants correspondants à ces actifs sont testés pour doser les taux de molécules habituellement co-exprimées lors de processus pro- inflammatoires telles que MIP3a, IL1 et IL8 sécrétées dans le milieu de culture sous l'effet des actifs; par exemple les taux sont alors rapportés à la concentration en ARN dosée, afin de comparer les résultats entre eux.
Avantageusement, ladite méthode de criblage permet de mettre en évidence qu'un principe actif capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte de 5-défensines humaines de type 2 et/ou de type 3, peut simultanément ne pas ou sensiblement pas stimuler la synthèse, directe ou indirecte, de molécules pro-inflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires, lorsqu'il est choisi parmi la racine d'armoise, la vergerette du Canada, l'écorce de sureau, l'herniaire, le jus d'ananas, la menthe poivrée, l'Arequier, le cacaoyer, le quinoa, l'arnica, le boldo, la salsepareille, la feuille de noyer, la fleur d'hibiscus, le potiron, le tournesol, la pivoine, le millepertuis, Ile marronnier dinde ou l'un de leurs extraits; l'acide jasmonique ou la vitamine A, leurs dérivés et leurs précurseurs; l'alpha-MSH ou un des peptides constituant l'alpha-MSH ou une structure chimique mimant un de ces peptides; les esters de l'isoleucine; le calcium ou tous les sels organiques ou minéraux de calcium. L'invention concerne, selon un septième aspect, l'utilisation d'un principe actif pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à exercer une activité bactéricide et/oufongicide sur les tissus traités, notamment sur la peau, sur les muqueuses, sur les phanères ou le cuir chevelu. Dans le cas du cuir chevelu, ladite composition cosmétique peut être utilisée pour prévenir ou traiter les états pelliculaires.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les principes actifs objets de l'invention, peuvent être associés à d'autres substances cosmétiquement actives pour renforcer la protection des peaux fragilisées lors des processus de vieillissement et/ou soumises à des stress dus à l'environnement et/ou aux conditions climatiques (froid, UV....) et/ou à des procédés de nettoyage ne respectant pas l'écosystème cutané. Les compositions résultant de l'invention peuvent se présenter sous toutes les 1 6 formes galéniques utilisées en cosmétique et peuvent être notamment sous forme d'une solution aqueuse éventuellement gélifiée, d'une dispersion du type lotion éventuellement biphasée, d'une émulsion de type eau/huile ou huile/eau ou d'une émulsion triple ou d'une dispersion vésiculaire. Cette composition peut se présenter sous un aspect sec ou être plus ou moins fluide ou avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'un sérum, d'une mousse. Elle peut éventuellement être appliquée sur la peau sous forme d'aérosol ou de stick. Elle peut être 'utilisée comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage pour la peau et/ou comme produit de nettoyage pour la peau, les muqueuses, les phanères et le cuir chevelu. De façon connue, la composition résultant de l'invention peut contenir également tous les adjuvants utilisables en cosmétique tels que les gélifiants, les actifs, les conservateurs, les huiles, les solvants, les antioxydants, les parfums, les charges, les pigments, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes.
Avantageusement ladite composition comprenant au moins un agent microbiocide et/ou microbiostatique, est notamment utilisable dans le domaine cosmétique et pharmaceutique, de façon à combiner l'action bactéricide des bêta-défensines cutanées avec l'action de ces agents, notamment pour le contrôle de la flore cutanée.
L'invention concerne, selon un huitième aspect, l'utilisation d'un principe actif pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée à exercer une activité bactéricide et/ou fongicide sur les tissus traités, notamment pour le traitement et/ou la prévention de l'acné, des dermatoses bactériennes ou fongiques.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un principe actif stimulant l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 (hBD2) et/ou des bêta-défensines humaines de type 3 (hBD3) et n'entraînant pas de réactions iinflammatoire(s), d'irritation(s) ou d'intolérance(s) pour fabriquer une composition dans le domaine des tissus reconstruits, de façon à utiliser l'action bactéricide des bêtadéfensines cutanées dans la construction d'épidermes et de peaux reconstruites et dans le maintien en survie de biopsies cutanées.
Avantageusement ladite composition, comprenant au moins un agent microbiocide et/ou microbiostatique, est notamment utilisable dans le domaine pharmaceutique, de façon à combiner l'action bactéricide des bêtadéfensines cutanées avec l'action de ces agents, notamment pour le traitement des pathologies liées à une composante microbienne comme les états pelliculaires, l'acné, le vitiligo, les dermatites et autres pathologies de la peau, des muqueuses, du cuir chevelu et des phanères dont les ongles, à composantes microbiennes.
Les inventeurs ont utilisé des méthodes d'analyses mettant en évidence la synthèse, directe ou indirecte, de molécule(s) proinflammatoire(s) ou de molécule(s) habituellement c:o-exprimée(s) lors de processus inflammatoire(s), de manière à pouvoir mettre en évidence la ou les réactions inflammatoire(s), d'irritation(s), ou d'intolérance(s).
L'invention peut être mise en oeuvre de manière différente pour mettre en évidence le ou les réactions inflammatoire(s), d'irritation(s), ou d'intolérance(s), par exemple en évaluant les sensations de picotements, de gênes, de tiraillements ressentis par les individus lors de l'application sur le tissu à traiter.
Selon encore une autre caractéristique avantageuse de l'invention applicable pour l'un quelconque de ces aspects, on sélectionne un principe actif qui est capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte de bêta- défensine(s) humaine(s) de type 2 et/ou de type 3 et ne stimulant pas simultanément ou sensiblement pas la synthèse, directe ou indirecte, de molécules pro-inflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoire, par exemple une cytokine pro- inflammatoire ou au moins une cytokine habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoire(s), telle que II_1, IL8, MIP3a.
18 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La méthode de la présente invention développée par les inventeurs permet de sélectionner par criblage puis d'identifier des principes actifs capables d'augmenter la quantité d'ARNm des défensines hBD2 et/ou hBD3 dans les cellules épidermiques, caractérisés en ce que lesdits principes actifs n'entraînent pas ou sensiblement pas de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s) ou d'intolérance(s).
La méthode de criblage comprend notamment les étapes suivantes: Des cellules épithéliales humaines normales, de préférence des kératinocytes humains normaux, sont cultivées en rnonocouche en milieu défini sans sérum, la concentration en calcium étant comprise de préférence entre 0 et 100 mM, de préférence 1,7mM. A un certain degré de confluence des cultures cellulaires, de préférence compris entre 75 et 95%, de préférence 80% les cellules sont mises en contact avec les principes actifs potentiels à cribler, pendant une durée comprise entre 6 et 48 h, de préférence pendant 16 h. Il peut être effectué en parallèle, la réalisation d'au moins un témoin non traité et d'au moins un témoin positif, de préférence sur la même plaque de culture, ce qui facilite la réalisation du criblage. Les témoins positifs sont le TNFa pour hBD2 et IFNy pour hBD3 et remplacent le principe actif potentiel à cribler; avantageusement leurs concentrations sont comprises entre 1 et 500 ng/ml, de préférence 100 ng/ml. Après cette mise en contact, les surnageants sont collectés et les cellules peuvent être congelées à sec par exemple à -80 C après un rinçage au PBS (Phosphate Buffer Saline). Les ARN totaux sont extraits et dosés par spectrophotométrie, de préférence à 260 et 280 nm, puis la concentration de ces ARN totaux est de préférence diluée à une concentration comprise entre 2 et 50 ng/ml, de préférence 5 ng/ml. La RT- PCR qualitative est réalisée sur l'actine, hBD2 et hBD3. Les amorces sont issues de la littérature (pour hBD2: Harder J. et al., A peptide antibiotic from human skin. Nature 1997; 387: 861; pour hBD3 et actine: Harder 3. et al., Isolation and characterization of human f3-defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic. J Bic)/ Cham 2001; 276: 5707- 5713) et sont: Actine sens: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' (SEQ ID N 1) antisens: 5'-CTCCTfAATGTCACGCACGATTTC-3' (SEQ ID N 2) hBD2 sens: 5'CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3' (SEQ ID N 3) antisens: 5'-GGAGCCCTITCTGAATCCGC:A3' (SEQ ID N 4) hBD3 sens: 5'-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3' (SEQ ID N 5) antisens: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3' (SEQ ID N 6) Les séquences des primers utilisées pour la RT-PCR peuvent être différentes de celles citées à condition de rester spécifiques des gènes étudiés (actine, hBD2 et hBD3).
La RT-PCR est réalisée de préférence sur une quantité d'ARNm initial de 10 à 100 ng, de manière préférée de 50 ng, dans un thermocycleur, éventuellement suivant un programme commun. Cette étape permet d'amplifier l'ARN initial.
Les paramètres de température et de temps de la RT-PCR peuvent évoluer en fonction des amorces ou du matériel utilisé (thermocycleur, fournisseur de kit RT-PCR...).
Après amplification, les produits sont mélangés et il est ajouté un tampon de charge et d'eau (2/3). La solution finale est déposée sur un gel précoulé d'agarose contenant un intercalant des acides nucléiques visualisable sous UV (comme le bromure d'éthidium par exemple), qui peut être à 2 %. Les échantillons migrent et les bandes sont visualisées sous UV en chambre noire et photographiées numériquement. Les photos des gels sont analysées par un logiciel de traitement d'images qui quantifie l'intensité des bandes. Le niveau basal d'expression des défensines (témoin non traité) n'étant pas détectable, les rapports d'intensité des bandes hBD2 /actine et hBD3/actine peuvent être comparés à ceux du témoin positif (traité par le TNFa pour hBD2 et l'IFNy pour hBD3) et indiquer une éventuelle stimulation de l'expression de la 13-défensine considérée.
A l'issue de cette première étape, on sélectionne les actifs ayant exercé un effet sur l'expression des f3-défensines.
Les surnageants correspondant à ces actifs sont alors testés par Kit ELISA de façon à doser leur contenu en MIP3a, en IL1 et en IL8 sécrétées dans le milieu de culture sous l'effet des actifs. Les concentrations dosées sont rapportées aux concentrations d'ARN afin de pouvoir comparer les résultats entre eux. Les principes actifs potentiels à cribler induisant une stimulation trop importante de MIP3a, de IL1 ou de IL8 (significativement supérieure à 75% de la stimulation maximale induite par le TNFa ou l'IFNy) sont éliminés du criblage (qui peut être appelé également screening).
Les gels sont analysés par un logiciel de traitement d'images qui quantifie l'intensité des bandes. La visualisation des bandes peut évidemment être réalisée sur tout système d'électrophorèse des acides nucléiques, la nature de l'intercalant et la quantité des produits de RTPCR déposés variant, mais restant en dessous de la saturation de la luminosité.
La validation des résultats obtenus peut être effectuée par la méthode de criblage de la présente invention appliquée à une étude effet-dose en RT-PCR quantitative, qui est décrite ci-après, mais qui n'est pas limitée à cette méthode précise, puisque d'autres méthodes peuvent apparaître à l'homme de l'art comme pouvant se substituer à celle-ci.
Cette technique de RT-PCR en temps réel est la méthode actuellement préférée qui permet de donner des résultats quantifiables de différences d'expression des ARNm.
Une étude de la cytotoxicité des actifs retenus sur des doses croissantes de 0,001% à 10 %, de préférence de 0,01 % à 10 %, est 30 réalisée. Une viabilité doit être fixée, elle est de préférence supérieure à 65 %, et de manière encore plus préférée à 75%. Cette viabilité fixe la limite de concentration non cytotoxique.
Les principes actifs potentiels à cribler sont alors testés sur plusieurs concentrations, allant de préférence de 0,001% à la concentration limite non cytotoxique, sur des cellules épithéliales normales, de préférence kératinocytes humains normaux, en monocouche, en milieu défini sans sérum tel qu'il est décrit précédemment.
Les surnageants sont alors collectés et les cellules sont éventuellement congelées à sec à -80 C après un rinçage au PBS. Les ARN totaux sont extraits et dilués dans lai même plage de concentration que précédemment citée. Ces ARN dilués serviront à la RT-PCR quantitative sur l'actine, hBD2 et hBD3.
Cette technique est réalisée de préférence sur les mêmes quantités que précédemment d'ARN initial, de préférence à l'aide d'un kit en une étape contenant du SYBR Green, cependant le système de RT-PCR peut être basé sur une autre technique que le SYBR Green, tel que par exemple Scorpion , Molecular beacons , sondes TagmanTM, etc., avantageusement dans un thermocycleur à fluorescence avec les mêmes amorces que précédemment, où il est effectué un programme d'amplification, qui peut être identique à celui précédent.
La réalisation d'une étude des courbes de fusion permet de vérifier la spécificité des produits amplifiés. La courbe de fluorescence en fonction du nombre de cycles donne la valeur C(T) correspondant au nombre de cycles nécessaires pour avoir un décollement du signal de fluorescence.
Plus un ARNm est exprimé, plus le C(T) sera faible. Un calcul des Sgène=(1/2)c(T) pour chaque ARN permet de tenir compte de l'augmentation exponentielle du nombre de copies lors de l'amplification. Les rapports de Sgène hBD2/Sgène actine, et Sgène hBD3/Sgène actine peuvent être éventuellement comparés au témoin non traité et donner ainsi le pourcentage de stimulation obtenu.
Les témoins non traités peuvent être identiques à ceux de la première étape de la méthode de criblage de la présente invention.
Les surnageants des principes actifs potentiels à cribler ayant confirmé leur capacité d'induction des défensines sont testés éventuellement par Kit ELISA pour doser les taux de PMIP3a, IL8 et IL1a.
De préférence, ces dosages sont réalisés sur le surnageant. Les taux sont rapportés à la concentration d'ARN dosé de chaque échantillon. Il peut être ainsi confirmé le caractère non-inflammatoire des actifs sélectionnés et/ou trouver la dose optimale de stimulation des défensines sans induction de la sécrétion des molécules de l'inflammation.
La présente invention concerne également les principes actifs testés par cette méthode de criblage puisque le but principal des inventeurs était de trouver des principes actifs capables d'induire l'expression des [3défensines de type 2 et/ou de type 3 sans stimuler ladite sécrétion des molécules.
Dans une optique de criblage (ou de screening), une culture de cellules épithéliales humaines normales, de préférence des kératinocytes normaux est privilégiée lorsqu'elle est effectuée sur des plaques de 96 puits. L'expression des défensines hBD2 et hBD3 est très faible dans des kératinocytes basaux indifférenciés et elle varie beaucoup en fonction du donneur et du lieu de prélèvement des cellules. hBD2 est notamment retrouvée dans 100% des échantillons issus de peau de visage ou de prépuce, et dans seulement 50% des peaux de chirurgie abdominale ou mammaire (Ali RS et al., Expression of the peptide antibiotics hBD1 and hBD2 in normal human skin. J Invest Dermatol 2001; 117:106-111).
La présente invention permet de fournir un modèle reproductible, permettant de tester une large panoplie de principes actifs potentiels à cribler et de détecter l'expression des ARNm de hBD2 et hBD3.
La présente invention concerne un système de culture de kératinocytes en milieu défini en calcium. La différenciation induite par ces conditions de culture permet d'augmenter le niveau basal d'expression des ARNm des défensines hBD2 et hBD3 et donc de faciliter la détection de leur stimulation.
La culture des cellules en 96 puits est un modèle permettant de cribler l'effet recherché, et les analyses qualitatives et quantitatives ont été adaptées au format 96 puits.
La RT-PCR qualitative permet de sélectionner une large panoplie d'actifs et leur vérification par RT-PCR quantitative est une étape essentielle pour la validation des résultats. Les témoins positifs de stimulation (TNFa pour hBD2 et IFNy pour hBD3) donnent une valeur d'induction des défensines et des molécules de l'inflammation, servent de référence et valident la technique de RT-PCR quantitative.
Le dosage dans les surnageants des taux sécrétés de molécules marqueurs de l'inflammation permet de sélectionner les actifs non-inflammatoires. Il a été mis en évidence, par cette méthode de criblage, l'activité ci- dessus recherchée des principes actifs suivants: la racine d'armoise, la vergerette du Canada, l'écorce de sureau, l'herniaire, le jus d'ananas, la menthe poivrée, l'Arequier, le cacaoyer, le quinoa, l'arnica, le boldo, la salsepareille, la feuille de noyer, la fleur d'hibiscus, le potiron, le tournesol, la pivoine, le millepertuis, le marronnier d'inde ou l'un de leurs extraits; l'acide jasmonique ou la vitamine A, leurs clérivés et leurs précurseurs; l'alpha-MSH ou un des peptides constituant l'alpha-MSH ou une structure chimique mimant un de ces peptides; les esters de l'isoleucine; le calcium ou tous les sels organiques ou minéraux de calcium.
Dans les exemples, toute caractéristique qui apparaîtrait nouvelle par rapport à un état de la technique quelconque fait partie intégrante de la présente invention et la protection est recherchée dans sa fonction et sa généralité.
D'autre part, dans la description et les revendications, tous les pourcentages sont donnés en poids, la température est en degrés Celsius, sauf indication contraire.
Exemple 1
gère étape de la méthode de criblage: Les actifs sont testés à 1% sur des kératinocytes humains normaux, en monocouche sur plaques de culture 96 puits, en milieu défini sans sérum et 10 enrichi en calcium (concentration finale 1,7mM).
A 80% de confluence, les cellules sont mises en contact avec les actifs (1 actif par puits) pendant 16h. En parallèle, un témoin non traité et 2 témoins positifs (TNFa 100ng/mi pour hBD2, et IFNy 100ng/mI pour hBD3) sont réalisés sur la même plaque de culture.
Après 16h, les surnageants sont collectés et les cellules sont congelées à sec à -80 C après un rinçage au PBS.
Les ARN totaux sont extraits à l'aide d'un kit d'extraction en 96 puits sur colonnes de silice et dosés sur un spectrophotomètre 96 puits à 260 et 280nm. Les ARN sont dilués à 5ng/ l.
La RT-PCR qualitative en 1 étape est réalisée sur 50 ng d'ARN initial en 96 puits, sur actine, hBD2 et hBD3. Les primers sont utilisés à 0,51uM et sont issus de la littérature: hBD2sens: 5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3' ; hBD2antisens: 5'-GGAGCCCTfTCTGAATC CGCA-3' (Harder J. et al., A peptide antibiotic from human skin. Nature 1997; 387: 861) ; hBD3sens: 5'-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3', hE3D3 antisens: 5'-CTTCGGCAGCATT TTCGGCCA-3' ; actine sens: 5'-GTGGGGCGCCCC:AGGCACCA-3', actine antisens: 5'CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (Harder J. et al., Isolation and characterization of hBD3, a novel human inducible peptide antibiotic. J. Biol. Chem. 2001; 276: 5707-5713).
Les échantillons sont placés dans un thermocycleur et suivent un programme d'amplification commun: 50 C, 30 min; 94 C, 2 min; (94 C, s; 60 C, 30s; 68 C, 30s) 32 cycles pour les défensines et 30 cycles pour l'actine; 72 C, 10 min; 14 C, infini.
Après amplification, les produits sont mélangés à raison de 311I de produits d'amplification de l'actine + 6 pl de produits d'amplification de hBD2 + 6 l de produits d'amplification de hBD3. 5 pl d'un mélange de tampon de charge et d'eau (2/3) sont ajoutés et les 20 pl finaux sont déposés sur un gel précoulé d'agarose à 2%. Les échantillons migrent en 30 min et les bandes sont visualisées sous UV en chambre noire et photographiées numériquement.
Les photos des gels sont analysées par un logiciel de traitement d'images qui quantifie l'intensité des bandes. Le niveau basal d'expression des défensines (témoin non traité) n'étant pas détectable, les rapports d'intensité des bandes hBD2/actine et hBD3/actine peuvent être comparés par exemple à ceux obtenus pour le témoin positif ( traité par le TNFa pour hBD2 et l'IFNy pour hBD3), et indiquer une éventuelle stimulation de l'expression de la (3-défensine considérée.
A l'issue de cette première étape, on sélectionne les actifs ayant exercé un effet sur l'expression des 13-défensines et les surnageants correspondants à ces actifs sont testés par Kit ELISA pour doser les taux de MIP3a, d'IL1 et d'IL8 sécrétés dans le milieu de culture sous l'effet des actifs. Les taux sont alors rapportés à la concentration en ARN dosée dans chaque puits, afin de comparer les résultats entre-eux.
Tableaux de résultats de la première étape: Etant donné que le niveau basal d'expression des défensines est généralement non-détectable, les stimulations de hBD2 et hBD3 sont exprimées en pourcentage des témoins positifs (TNFa pour hBD2 et IFNy pour hBD3). Les taux de IL8 et MIP3 a sont exprimés en pg/ml/concentration d'ARN (en ng/ l).
Effets des actifs sur l'expression de hBD2 (Tableau I) Actifs (utilisés à 1%, p/p) HBD2 MIP3a IL8 Contrôle 0% 6,7 30,9 TNFa 100% 33 186 Spiruline 137% 28,8 87 Farine de graine de Quinoa 85% - - Racine d'armoise 76% 7,2 30,2 Ecorce de sureau 65% 7,5 17,9 Tournesol 58% 10,9 68,6 Vergerette du Canada 50% 6,1 29,4 Jus d'ananas 50% 7,6 39 Herniaire plante 44% 7,8 55 Cacaoyer 39% 4,9 22,5 Potiron 35% 5,2 33,1 Menthe poivrée 26% 1 4,8 Racine de salsepareille 26% 4,7 15,4 Arequier 1% 0 25,7 Arnica capitule floral 0% 3, 9 27,8 Pivoine fleur 0% 0 2 Millepertuis 0% .2,81 19,7 Marronnier d'inde 0% 0,6 36,7 Boldo 0% 1,8 20,1 Feuille de noyer 0% 1,4 19,4 Fleur d'hibiscus 0% 6,5 29,3 Feuille de basilic 0% - - Thé noir de Chine 0% - Framboise 0% - - L-Isoleucine 10 g/ml 0% _ -
_
D,L-Isoleucine 100 g/ml 0% 5,6 30,6 Isoleucine Méthyl Ester 100 g/ml 16% 3 8 7 7
_
Acide Jasmonique 100 g/ml 7% 6 25,3 Effets des actifs sur l'expression de hBD3 (Tableau II) Actifs (utilisés à 1%, p/p) HBD3 MIP3a IL8 Contrôle 0% 6,7 30,9 IFNy 100% 13,8 97 _ Arnica capitule floral 460% 3, 9 27,8 Pivoine fleur 192% 0 2 Millepertuis 126% 2,81 19,7 Marronnier d'inde 103% 0,6 36,7 Boldo 86% 1,8 20,1 Herniaire Étante 73% 7,8 55 Fleur d'hibiscus 50% 6,5 29,3 Ares uier 45% 0 25,7 Menthe Éoivrée 40% 1 4,8 Feuille de noyer 27 h 1,4 19,4 Cacaoyer 15% 4,9 22,5 Spiruline 28,8 87 Feuille de basilic 0% - Thé noir de Chine 0% - - Framboise 0% - - Racine d'armoise 0% 7,2 30,2 Vergerette du Canada _ 6,1 29,4 0% Ecorce de sureau 0% 7,5 17,9 Jus d'ananas 0% 7,6 39 Farine de graine de Quinoa _ 8 39 0% Racine de salsepareille 0% 4,7 15,4 Tournesol 0% 10,9 68, 6 Potiron 0% _ 5,2 33,1 L-Isoleucine 10 g/ml - - D,L-Isoleucine 100 g/ml 0% 5,6 30,6 Isoleucine Méthyl Ester 100 g/ml 3, 8 7,7 Acide Jasmonique 100 g/ml 0% 6 25,3 Parmi ces actifs, ceux répondant aux critères de notre première étape, c'est à dire qui stimulent hBD2 et/ou 3 sans induire d'expression des cytokines MIP3 ou IL8 sont: la racine d'armoise, la vergerette du Canada, l'écorce de sureau, l'herniaire, le jus d'ananas, la menthe poivrée, l'Arequier, le cacaoyer, le quinoa, l'arnica, le boldo, la salsepareille, la feuille de noyer, la fleur d'hibiscus, le potiron, le tournesol, la pivoine, le millepertuis, le marronnier d'inde ou l'un quelconque de leurs extraits; l'acide jasmonique, ses dérivés et ses précurseurs; les esters de l'isoleucine.
La spiruline stimule fortement hBD2 mais induit la sécrétion de IL8 et MIP3 donc n'est pas retenue. D'autres actifs ne stimulent pas les défensines. La L-Isoleucine et certains dérivés ont été testés: aucune stimulation significative des défensines humaines 2 ou 3 n'a été mise en évidence par RT-PCR qualitative.
Exemple 2
2ème étape de la méthode de criblage: Les actifs ayant les mieux répondu aux critères de la première étape sont 10 analysés en effet-dose.
Une étude de la cytotoxicité des actifs retenus sur des doses croissantes de 0,01% à 10% est réalisée. Une viabilité de 75% est fixée comme limite de concentration non cytotoxique (max viabilité%).
Les actifs sont alors testés sur 5 concentrations (de 0,001% à max viabilité) en quadruplicates, sur des kératinocytes humains normaux en monocouche sur plaques de culture 96 puits, en milieu défini sans sérum enrichi en calcium (CaCl2 1,7mM) (mêmes conditions que exemple 1).
Après 16h, les surnageants sont alors collectés et les cellules sont congelées à sec à -80 C après un rinçage au PBS.
Les ARN totaux sont extraits à l'aide d'un kit d'extraction en 96 puits sur colonnes de silice et dosés sur un spectrophotomètre 96 puits à 260 et 280nm. Les ARN sont dilués à 5ng/ l.
La RT-PCR quantitative en 96 puits sur l'actine, hBD2 et hBD3 est réalisée sur 50ng d'ARN au départ, à l'aide d'un kit en une étape contenant du sybrgreen, sur un thermocycleur à fluorescence avec les mêmes primers que précédemment, à 0,5 M. Le programme d'amplification est le suivant: 50 C, 30 min; 94 C, 15 min; (94 C,, 15 s; 60 C, :30s; 72 C, 30s) x 50 cycles; 90 C, 1 min; 30 C, 1 min; 50 C à 95 C (10s tous les C) ; 14 C, infini.
L'étude des courbes de fusion permet de vérifier la spécificité des produits amplifiés. La courbe de fluorescence en fonction du nombre de cycles donne la valeur C(T) correspondant au nombre de cycles nécessaires pour avoir un décollement du signal de fluorescence. Plus un ARNm est exprimé, plus le C(T) sera faible. Un calcul des Sgène=(1/2)c(T) pour chaque ARN permet de tenir compte de l'augmentation exponentielle du nombre de copies lors de l'amplification. Les rapports de Sgène hBD2/Sgène actine et de Sgène hBD3/Sgène actine peuvent être comparés à ceux du témoin non traité et donner ainsi le pourcentage de stimulation obtenu.
Les surnageants des actifs ayant confirmé leur capacité d'induction des défensines sont testés par Kit ELISA pour doser les taux de MIP3a, IL8 et ILia. Ces dosages sont réalisés sur un même surnageant (200 I) en effectuant une série de dilution (par 1,5 pour doser MIP3a et IL8, puis par 2 pour doser IL1). Les taux sont alors rapportés à la concentration en ARN dosée dans chaque puits, afin de comparer les résultats entre eux.
Les inventeurs peuvent ainsi confirmer le caractère non-inflammatoire des actifs sélectionnés et/ou trouver la dose optimale de stimulation des défensines sans induction de la sécrétion des cytokines de l'inflammation.
Tableau de résultats de l'étape 2: La RT-PCR quantitative permet d'avoir une valeur basale de l'expression des défensines pour les témoins non traités, donc les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport au témoin. Les cytokines IL8, IL1 et MIP3 sont exprimées en pg/mI/concentration d'ARN (en ng/ l).
Effets doses des actifs sélectionnés dans la première étape (Tableau III) Actifs Conc. Viabilité hBD2 hBD3 MIP3a IL8 ILia Contrôle 100% 100% 100% 5, 6 47,4 26,9 TNFa 100ng/ml - 1755% 774% 23,6 175 21,8 IFNy 100ng/ml 472% 4631% 11,6 100,5 40,1 Boldo 0,1% 84% 182% 168% 2,2 33,6 28,2 0,5% 87% 92% 213% 1,45 27,5 25,3 1% 76% 72% 703% 0,4 31,7 20,2 Arnica 0,01% 93% 117% 173% 4,6 51,2 30,1 0,1% 91% 128% 561% 2,5 34,1 38,5 0,3% 75% 138% 1830% 4,1 24,6 37,9 Quinoa 0,1 h 83% 143% 102% 6 58,7 23,4 1% 91% 264% 112% 5,8 50,2 17,7 5% 90% 401% 237% 12,4 150,2 34,4 10% 92 h 92% 438% 7,6 102,8 40,8 Armoise 0,1% 87% 88% 103% 3,2 36,9 39,5 1% 75% 117% 116% 2,9 35 34,9 5% 78% 130 h 452% 3,2 61,6 22,3 10% 83% 104% 3962% 2,3 66,3 25,8 Arequier 0,1% 87% 88% 84% 2,8 32,2 28,3 1% 77% 35% 261% 0,28 23,7 39,5 2% 70% 98% 2781% 0 7,6 44,8 L-Isoleucine 3,125 - 110% 89% 5,2 36,9 21 ( g/ml) 6,25 - 107% 94% 4,9 33,6 22,3 12,5 - 95% 101% 5,9 42,2 25,3 - 110 h 106% 4,5 35,1 22,8 Acide 100.. 86% 477% 4,6 37,9 31,2 jasmonique 500 - 134% 26919 13,6 103,3 97,1 ( g/ml) a-MSH 1.. 198% 254% 4, 5 34,6 24,7 (ng/ml) 100 - 186% 217% 3,9 41,7 26,1 La technique de RT-PCR quantitative permet donc de confirmer l'effet stimulateur du Boldo, de l'Arnica et de l'aréquier sur hBD3 sans induction des cytokines pro-inflammatoires. L'armoise à 10% stimule hBD3 sans stimuler significativement la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires, et la farine de graine de Quinoa stimule hBD2 dès la concentration de 1% d'actif. A 5% elle exerce une stimulation de hBD2 et hBD3.
La L-Isoleucine a été testée sur les 4 concentrations (3,125; 6,25; 12,5 et 25 g/ml) décrites comme étant capables de stimuler la défensine 3 bovine (Fehlbaum P. et al., An essential amino acid induces epithelial 3defensin expression. PNAS 2000; 97: 12723-12728). Cet acide aminé n'a pas été capable d'induire l'expression de hBD2 ni de hBD3, dans leskératinocytes humains normaux.
L'acide jasmonique à 100 g/ml et l'a-MSH sont également capables 10 d'induire les défensines 2 et/ou 3.
Parmi ces actifs, ceux répondant aux critères de l'invention, c'est à dire qui stimulent hBD2 et/ou 3 sans induire d'expression des cytokines MIP3 ou IL8 ou IL1 sont: le boldo, l'arnica, le quinoa, l'armoise, l'aréquier, ou l'un quelconque de leurs extraits; l'acide jasmonique, ses dérivés et ses précurseurs, la aMSH ou un des peptides constituant l'alpha-MSH ou une structure chimique mimant un de ces peptides.
Exemple 3:
De la même façon que dans l'exemple 2, l'acide rétinoïque et le rétinol sont testés pour leur capacité à stimuler hBD2 et/ou hBD3.
Les résultats sont les suivants: Actifs Conc. hBD2 hBD3 Contrôle 100% 100% TNFa 100ng/m/ 1755% ;774% IFNy 100ng/m/ 472% 4631 % Acide 0,005% 26% 1.61% rétinoïque Rétinol 0,01% 168% 17 562% On constate que l'acide rétinoïque utilisé à 0,005% stimule faiblement la synthèse de hBD3, et que le rétinol (ou vitamine A) stimule faiblement hBD2 et stimule très fortement hBD3.
Afin de déterminer si ces produits induisent des réactions d'irritation ou 5 d'intolérance, trois formulations cosmétiques ont été réalisées selon l'exemple 4, en utilisant les variations suivantes: É Crème placebo A: Aucun produit n'est rajouté à la formulation: les Produits de l'invention selon cet exemple ne sont pas ajoutés à la formulation 10. Crème B: le Produit de l'invention selon cet exemple est l'acide rétinoïque et sa concentration d'utilisation dans la formule est de 0, 005% Crème C: le Produit de l'invention selon cet exemple est le rétinol et sa concentration d'utilisation dans la formule est de 0,01% 15 Ces trois formulations sont testées de deux façons différentes: 1) Par applications répétées sur animaux, afin de déterminer l'indice d'irritation primaire cutanée des préparations 2) Par applications de patch répétés sur volontaires humains, afin de déterminer le potentiel irritant ou sensibilisant des formulations. 20 Pour les trois formulations, dans les deux études, aucune irritation ou allergie n'a été décelée et l'acide rétinoïque et le rétinol (ainsi que leurs précurseurs et leurs dérivés) peuvent donc être considérés, à ces concentrations d'utilisation, comme n'induisant aucune réaction inflammatoire, irritation ou intolérance.
Exemple 4: CREME ANTI-RIDES Nom INCI Quantité EAU (WATER) QSP 100 GLYCERINE (GLYCERIN) 5 CARBOMER 0,2 TETRASODIUM EDTA 0,1 HUILE DE FEUILLES (LEAF OIL) de CAMELLIA 2
SINENSIS
POLYISOBUTENE HYDROGENE 8 GLYCERYL STEARATE SE 2 DIMETHICONE 1 GLYCERYL STEARATE ET PEG- 100 STEARATE 1,5 TRIETHYL.HEXANOINE 5 ACIDE STEARIQUE 2 CETYL ALCOOL 1 SILICE 1 DICAPRYLYL MALEATE 6 GLYCERYLSTEARATE 1 DIMETHICONE 3,5 EAU (WATER) 2,3 TRIETHANOLAMINE 0,5 PHENOXYETHANOL, METHYLPARABEN, 0,7 PROPYLPARABEN, BUTYLPARABEN, ETHYLPARABEN FRAGRANCE 0, 3 TOCOPHERYL ACETATE 0,5 RETINOL 0,1 SODIUM HYALURONATE 0,03 EXTRAIT DE CENTELLA ASIATICA 1 PROTEINE DE SOJA HYDROLYSEE 0,4 PRODUITS DE L'INVENTION 0,001 à 20 Exemple 5: SERUM ANTI-TACHES Nom INCI Quantité EAU (WATER) QSP 100 TRISODIUM EDTA 0,1 HYDROXYETHYLCELLULOSE 0,1 GOMME DE XANTHANE (XANTHAN GUM) 0,3 PHENOXYETHANOL, METHYLPARABEN, 0,65 PROPYLPARABEN, BUTYLPARABEN, ETHYLPARABEN BUTYLENE GLYCOL 5 POLYSORBATE 20 1 FRAGRANCE 0,05 TOCOPHEROL ACETATE 0,1 SODIUM CITRATE 0,65 MAGNESIUM ASCORBYL PHOSPHATE 1 PRODUITS DE L'INVENTION 0,001 à 20 Exemple 6: FOND DE TEINT Nom INCI Quantité EAU (WATER) QSP 100 MAGNESIUM ALUMINIUM SILICATE 0,5 GOMME DE CELLULOSE (CELLULOSE GUM) 0,35 GLYCERINE 3 POLYVINYL PYRROLIDONE (P'VP) 5 DIPROPYLENE GLYCOL 0,05 PROPYLENE GLYCOL 2 PHENOXYETHANOL, METHYLPARABEN, 1 PROPYLPARABEN, BUTYLPARABEN, ETHYLPARABEN GOMME DE XANTHANE (XANTHAN GUM) 0,2 TRIETHANOLAMINE 0,7 ISOPROPYL PALMITATE 4 HUILE MINERALE (MINERAL OIL) 2 HEXYLDECANOL 3 GLYCERYLSTEARATE 2 ACIDE STEARIQUE (STEARIC ACID) 2,4 ACIDE OLEIQUE (OLEIC ACID) 0,5 POLYSORBATE 60 0,7 TOCOPHEROL 0,5 DIOXYDE DE TITANE (TITANIUM DIOXIDE) 7 OXYDE DE FER (IRON OXIDE) 4 NYLON-2 6 SODIUM HYALURONATE 0,01 FRAGRANCE 0,5 PROPYLENE GLYCOL DICAPRYLATE/DICAPRATE 7,2 PRODUITS DE L'INVENTION 0,001 à 20 Exemple 7: EMULSION BLANCHISSANTE PROTECTRICE UVA/UVB Nom INCI Quantité OCTYLMETHOXYCINNAMATE 4 CETHYL PEG/PPG-10/1 DIMETHICONE 3 Bis-PEG/PPG-14/14 DIMETHICONE 3 DIMETHICONE 6 CYCLOMETHICONE 4 POLYDECENE 4 METHYLPARABEN, PROPYLPARABEN, BUTYLPARABEN, 0,65
ETHYLPARABEN
TOCOPHEROL 0,5 FRAGRANCE 0,8 PPG-3 MYRISTYL ETHER 0,5 DIOXYDE DE TITANE (TITANIUM DIOXYDE) 8 PHENOXYETHANOL 0,35 SODIUM CITRATE 0,65 MAGNESIUM ASCORBYL PHOSPHATE 3 EAU (WATER) QSP 100 GOMME DE XANTHANE (XANTHAN GUM) 0,4 BUTYLENE GLYCOL 2 PRODUITS DE L'INVENTION 0,001 à 20 Exemple 8: GEL AMINCISSANT Nom INCI Quantité EAU (WATER) QSP 100 TETRASODIUM EDTA 0,2 CARBOMER 0,5 GLYCERINE 3,0 POLYGLYCERYLMETHACRYLATE AND PROPYLENE 5,0
GLYCOL
DIPROPYLENE GLYCOL 3,0 BUTYLENE GLYCOL 5,0 PHENOXYETHANOL, METHYLPARABEN, 0,65 PROPYLPARABEN, BUTYLPARABEN, ETHYLPARABEN TRIETHANOLAMINE 0,5 CAFEINE 2 DE RUSCUS ACULEATUS 1
_EXTRAIT
PRODUITS DE L'INVENTION 0,001 à 20 36 Exemple 9: CREME HYDRATANTE Nom INCI Quantité EAU (WATER) QSP 100 g CARBOMER 0,35 TETRASODIUM EDTA 0,1 POLYSORBATE 60 3 SORBITAN STEARATE 2, 6 ISOPROPYL PALMITATE 2,5 CETYL PALMITATE 4 ETHYLHEXYL PALMITATE 5,1 SQUALANE 1 CETHYL ALCOOL 2,5 CYCLOMETHICONE 1 DIMETHICONE 0,5 TRIETHANOLAMINE 0,53 BUTYLENE GLYCOL 5 FRAGRANCE 0,3 PHENOXYETHANOL, METHYLPARABEN, 0,65 ETHYLPARABEN, PROPYLPARABEN, BUTYLPARABEN TOCOPHERYL ACETATE 0,5 SODIUM HYALURONATE 0,03 PROTEINE ET GLYCERINE D'AMANDES DOUCES 2 (SWEET ALMOND PROTEIN AND GLYCERIN) POLYGLYCERYLMETHACRYLATE 5 PRODUITS DE L'INVENTION 0,001 à 20 Exemple 10: SHAMPOOING Nom INCI Quantité EAU (WATER) QSP 100 g GOMME DE XANTHANE (XANTHAN GUM) 0,8 ACIDE CITRIQUE (CITRIC ACID) 0,8 SODIUM LAURETH SULFATE 40 PHENOXYETHANOL, METHYLIPARABEN, 2 ETHYLPARABEN, PROPYLPARABEN, BUTYLPARABEN PRODUITS DE L'INVENTION 0,001 à 20

Claims (10)

Revendications
1. Utilisation d'un principe actif stimulant l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 (hBD2) et/ou des bêtadéfensines humaines de type 3 (hBD3) et n'entraînant pas de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s) ou cl'intolérance(s) pour fabriquer une composition cosmétique destinée à exercer une activité bactéricide et/ou fongicide sur des tissus à traiter, notamment sur la peau, les muqueuses, les phanères ou le cuir chevelu.
2. Utilisation d'un principe actif stimulant l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 (hBD2) et/ou des bêtadéfensines humaines de type 3 (hBD3) et n'entraînant pas de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s) ou cl'intolérance(s) pour fabriquer une composition pharmaceutique destinée à exercer une activité bactéricide et/ou fongicide sur des tissus à traiter, notamment pour le traitement et/ou la prévention de l'acné, des dermatoses bactériennes ou fongiques.
3. Utilisation d'un principe actif stimulant l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 (hBD2) et/ou des bêtadéfensines humaines de type 3 (hBD3) et n'entraînant pas de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s) ou cl'intolérance(s) pour fabriquer une composition dans le domaine des tissus reconstruits, de façon à utiliser l'action bactéricide des bêta-défensines cutanées dans la construction d'épidermes et de peaux reconstruites et dans le maintien en survie de biopsies cutanées.
4. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la composition comprend en outre au moins un 30 agent microbiocide ou microbiostatique.
5. Utilisation d'un principe actif stimulant l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 (hBD2) et/ou des bêtadéfensines humaines de type 3 (hBD3) et n'entraînant pas de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s) ou d'intolérance(s) pour fabriquer une composition pharmaceutique, comprenant en outre au moins un agent microbiocide ou microbiostatique, de façon à combiner l'action bactéricide des bêta-défensines cutanées avec l'action d'agents anti- microbiens, notamment pour le traitement des manifestations liées à une composante microbienne comme les états pelliculaires, l'acné, le vitiligo, les dermatites et autres pathologies de la peau, des muqueuses, du cuir chevelu et des phanères dont les ongles.
6. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le principe actif ne stimule pas, de manière sensible, la production, directe ou indirecte, de molécule(s) proinflammatoire(s) ou habituellement co-exprimée(s) lors de processus inflammatoires.
7. Utilisation, selon la revendication 6, caractérisée en ce que lesdites molécules pro-inflammatoires ou habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires sont notamment le MIP 3 alpha (Macrophage Inflammatory Protein), ou l'IL8 ou les IL1 ou une autre interleukine, ou l'histamine, ou la tryptase, ou la substance P, ou les leucotriènes, ou les prostaglandines.
8. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le principe actif ne stimule pas, de manière sensible, la production, directe ou indirecte, de molécule(s) proinflammatoire(s) ou habituellement co-exprimée(s) lors de processus inflammatoires, dans les cultures de cellules épithéliales en particulier les kératinocytes et/ou les cornéocytes en culture, ou dans les biopsies cutanées humaines maintenues en survie, ou dans des modèles d'épidermes reconstruits, ou dans des modèles de peaux reconstruites.
9. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit principe actif est présent à une concentration comprise entre 0,001% et 20%, de préférence entre 0,01% et 10%, en poids.
10. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le principe actif est choisi parmi la racine d'armoise, la vergerette du Canada, l'écorce de sureau, l'herniaire, le jus d'ananas, la menthe poivrée, l'Arequier, le cacaoyer, le quinoa, l'arnica, le boldo, la salsepareille, la feuille de noyer, la fleur d'hibiscus, le potiron, le tournesol, la pivoine, le millepertuis, le marronnier d'inde ou un de leurs extraits; l'acide jasmonique ou la vitamine A, leurs dérivés et leurs précurseurs; l'alpha-MSH ou un des peptides constituant l'alpha-MSH ou une structure chimique mimant un de ces peptides; les esters de l'isoleucine; le calcium ou tous les sels organiques ou minéraux de calcium.
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