FR2862974A1 - Use of proteins, peptides or antibodies for detecting and serotyping coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome - Google Patents

Abstract

Use of specific proteins, peptides and antibodies to prepare a reagent for detecting and optionally serotyping a coronavirus (CV) associated with severe acute respiratory syndrome (SARS). Use of specific proteins, peptides and antibodies to prepare a reagent for detecting and optionally serotyping a coronavirus (CV) associated with severe acute respiratory syndrome (SARS). The specific reagents are: (a) a protein or peptide (I) encoded by a 29746 base pair (bp) sequence (1), given in the specification; (b) a mono- or poly-clonal antibody (Ab), or its fragment, directed against (I); or (c) a protein/peptide chip or filter that contains (I) or Ab, or its fragments. Independent claims are also included for the following: (1) method for detecting CV by treating a sample with the specified reagents and detecting any antigen-antibody complex formed; (2) a kit for detecting CV that includes any of the specified reagents; (3) an immunogenic composition that contains at least one of (I), specified DNA or RNA sequences (II), a recombinant expression vector that contains (II), or a cDNA bank that contains (II); and (4) immune complexes formed between an isolated protein or peptide and an Ab directed specifically against an epitope of CV. ACTIVITY : Virucide. No details of tests for virucidal activity are given. MECHANISM OF ACTION : Vaccine.

Description

La présente invention est relative à une nouvelle souche de coronavirusThe present invention relates to a new strain of coronavirus

associé au syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), issue d'un prélèvement répertorié sous le n 031589 et prélevé à Hanoi (Vietnam), à des molécules d'acide nucléique issues de son génome, aux protéines et peptides codés par lesdites  associated with Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS), from a sample numbered 031589 taken in Hanoi (Vietnam), nucleic acid molecules derived from its genome, proteins and peptides encoded by said

molécules d'acide nucléique ainsi qu'à leurs applications, notamment en tant que réac-tifs de diagnostic et/ou comme vaccin.  nucleic acid molecules and their applications, especially as diagnostic reagents and / or as a vaccine.

Le coronavirus est un virus à ARN monocaténaire, de polarité positive, d'approximativement 30 kilobases qui se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes; l'extrémité 5' du génome a une structure en coiffe et l'extrémité 3' comporte une queue polyA. Ce virus est enveloppé et comprend, à sa surface, -des structures péplomériques- dénommées spicules.  The coronavirus is a single-stranded, positive polarity, approximately 30 kilobase RNA virus that replicates in the cytoplasm of host cells; the 5 'end of the genome has a cap structure and the 3' end has a polyA tail. This virus is enveloped and includes, on its surface, -peplomeric structures-called spicules.

Le génome comprend les cadres ouverts de lecture ou ORF suivants, de son extrémité 5' vers son extrémité 3' : ORF 1 a et ORF lb correspondant aux protéines du complexe de transcription-réplication, et ORF-S, ORF-E, ORFM et ORF-N correspondant aux protéines structurales S, E, M et N. Il comprend également des ORFs correspondant à des protéines de fonction inconnue codées par: la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E et chevauchant cette dernière, la région située entre l'ORF-M et l'ORF-N, et la région incluse dans l'ORF-N.  The genome comprises the following open reading frames or ORFs, from its 5 'end to its 3' end: ORF 1a and ORF 1b corresponding to the proteins of the transcription-replication complex, and ORF-S, ORF-E, ORFM and ORF-N corresponding to the structural proteins S, E, M and N. It also comprises ORFs corresponding to proteins of unknown function encoded by: and overlapping the region between the ORF-S and the ORF-E, the region between the ORF-M and the ORF-N, and the region included in the ORF-N.

La protéine S est une glycoprotéine membranaire (200-220 kDa) qui se présente sous la forme de spicules ou "Spike" émergeant de la surface de l'enveloppe virale. Elle est responsable de l'attachement du virus aux récepteurs de la cellule hôte et de l'induction de la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire.  Protein S is a membrane glycoprotein (200-220 kDa) that is in the form of spikes or "spike" emerging from the surface of the viral envelope. It is responsible for the attachment of the virus to the receptors of the host cell and the induction of viral envelope fusion with the cell membrane.

La petite protéine d'enveloppe (E) également dénommée sM (small membrane) qui est une protéine trans-membranaire non glycosylée d'environ 10 kDa, est la protéine présente en plus faible quantité dans le virion. Elle joue un rôle moteur dans le processus de bourgeonnement des coronavirus qui se produit au niveau du compartiment intermédiaire dans le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi La protéine M ou protéine de matrice (25-30 kDa) est une glyco- protéine membranaire plus abondante qui est intégrée dans la particule virale par une interaction M/E, tandis que l'incorporation de S dans les particules est dirigée par une interaction S/M. Elle semble être importante pour la maturation virale des coronavirus et pour la détermination du site au niveau duquel les particules virales sont assemblées.  The small envelope protein (E) also called sM (small membrane), which is an unglycosylated trans-membrane protein of about 10 kDa, is the protein present in a smaller amount in the virion. It plays a driving role in the process of budding of coronaviruses that occurs at the level of the intermediate compartment in the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. The protein M or matrix protein (25-30 kDa) is a membrane glyco-protein more abundant that is integrated into the viral particle by an M / E interaction, while the incorporation of S into the particles is directed by an S / M interaction. It appears to be important for the viral maturation of coronaviruses and for the determination of the site at which viral particles are assembled.

La protéine N ou protéine de nucléocapside (45-50 kDa) qui est la plus conservée parmi les protéines structurales des coronavirus, est nécessaire pour encapsider l'ARN génomique puis pour diriger son incorporation dans le virion. Cette protéine est vraisemblablement également impliquée dans la réplication de l'ARN.  N protein or nucleocapsid protein (45-50 kDa), which is the most conserved among the structural proteins of coronaviruses, is necessary to encapsidate the genomic RNA and then to direct its incorporation into the virion. This protein is also likely to be involved in RNA replication.

Lorsqu'une cellule hôte est infectée, le cadre de lecture (ORF) situé en 5' du génome viral est traduit en une polyprotéine qui est clivée par les protéases virales et libère alors plusieurs protéines non-structurales telles que l'ARN- polymérase ARN dépendante (Rep) et l'ATPase hélicase (Hel). Ces deux protéines sont impliquées dans la réplication du génome viral ainsi que dans la génération de transcrits qui sont utilisés dans la synthèse des protéines virales. Les mécanismes par lesquels ces ARNms sub-génomiques sont produits, ne sont pas complètement compris; cependant des faits récents indiquent que les séquences de régulation de la transcription à l'extrémité 5' de chaque gène représentent des signaux qui régulent la transcription discontinue des ARNms sub-génomiques.  When a host cell is infected, the reading frame (ORF) located 5 'of the viral genome is translated into a polyprotein which is cleaved by the viral proteases and then releases several nonstructural proteins such as RNA polymerase RNA dependent (Rep) and ATPase helicase (Hel). Both proteins are involved in the replication of the viral genome as well as in the generation of transcripts that are used in the synthesis of viral proteins. The mechanisms by which these sub-genomic mRNAs are produced are not fully understood; however, recent evidence indicates that the transcriptional regulatory sequences at the 5 'end of each gene represent signals that regulate the discontinuous transcription of sub-genomic mRNAs.

Les protéines de la membrane virale (protéines S, E et M) sont insérées dans le compartiment intermédiaire, alors que l'ARN répliqué (brin +) s'assemble avec la protéine N (nucléocapside). Ce complexe protéine-ARN s'associe ensuite avec la protéine M incluse dans les membranes du réticulum endoplasmique et les particules virales se forment lorsque le complexe de la nucléocapside bourgeonne dans le réticulum endoplasmique. Le virus migre ensuite à travers le complexe du Golgi et éventuellement sort de la cellule, par exemple par exocytose. Le site de l'attachement du virus à la cellule hôte se trouve au niveau de la protéine S. Les coronavirus sont responsables de 15 à 30 % des rhumes chez l'Homme et d'infections respiratoires ou digestives chez les animaux, notamment le chat (FIPV: Feline infectious peritonitis virus), la volaille (IBV: Avian Infectious bronchitis virus), la souris (MHV: Mouse Hepatitis virus), le porc (TGEV: Transmissible gastroenterititis virus, PEDV: Porcine Epidemic Diarrhea virus, PRCoV: Porcine Respiratory Coronavirus, HEV: Hemagglutinating encephalomyelitis Virus) et les bovins (BcoV: Bovine coronavirus).  The proteins of the viral membrane (S, E and M proteins) are inserted into the intermediate compartment, whereas the replicated RNA (+ strand) assembles with the N protein (nucleocapsid). This protein-RNA complex then associates with the M protein included in the endoplasmic reticulum membranes and the viral particles are formed when the core nucleocapsid complex buds into the endoplasmic reticulum. The virus then migrates through the Golgi complex and eventually exits the cell, for example by exocytosis. The site of attachment of the virus to the host cell is at the level of the S protein. Coronaviruses are responsible for 15 to 30% of colds in humans and respiratory or digestive infections in animals, including cats. (FIPV: Feline infectious peritonitis virus), poultry (IBV: Avian Infectious bronchitis virus), mouse (MHV: Mouse Hepatitis virus), pig (TGEV: Transmissible gastroenteritis virus, PEDV: Porcine Epidemic Diarrhea virus, PRCoV: Porcine Respiratory Coronavirus, HEV: Hemagglutinating encephalomyelitis Virus) and cattle (BcoV: Bovine coronavirus).

En général, chaque coronavirus n'affecte qu'une seule espèce; chez les individus immunocompétents, l'infection induit des anticorps éventuellement neutralisants et une immunité cellulaire, capables de détruire les cellules infectées.  In general, each coronavirus affects only one species; in immunocompetent individuals, the infection induces possibly neutralizing antibodies and cellular immunity, capable of destroying the infected cells.

Une épidémie de pneumonie atypique, dénommée syndrome respi- ratoire aigu sévère (SARS ou Severe acute respiratory syndrome, SRAS en français) s'est propagée dans différents pays (Vietnam, Hong-Kong, Singapour, Thaïlande et Canada) au cours du premier trimestre 2003, à partir d'un foyer initial apparu en Chine dans le dernier trimestre de 2002. La sévérité de cette maladie est telle que son taux de mortalité est d'environ 3 à 6 %. La détermination de l'agent causatif de cette maladie a été entreprise par de nombreux laboratoires, à travers le monde.  An epidemic of atypical pneumonia, known as SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS in French) has spread to different countries (Vietnam, Hong Kong, Singapore, Thailand and Canada) during the first trimester. 2003, from an initial outbreak appeared in China in the last quarter of 2002. The severity of this disease is such that its mortality rate is about 3 to 6%. The determination of the causative agent of this disease has been undertaken by many laboratories around the world.

En mars 2003, un nouveau coronavirus (SARS-CoV, SARS virus ou virus SRAS, en français) a été isolé, en association avec des cas de syndrome respiratoire aigu sévère (T.G.KSIAZEK et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1319-1330; C. DROSTEN et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1967-1976; Peiris et al., Lancet, 2003, 361, 1319-).  In March 2003, a new coronavirus (SARS-CoV, SARS virus or SARS virus, in French) was isolated, in association with cases of severe acute respiratory syndrome (TGKSIAZEK et al., The New England Journal of Medicine, 2003 , 348, 1319-1330, C. DROSTEN et al., The New England Journal of Medicine, 2003, 348, 1967-1976, Peiris et al., Lancet, 2003, 361, 1319-).

Des séquences génomiques de ce nouveau coronavirus ont ainsi été obtenues, notamment celles de l'isolat Urbani (Genbank n d'accès AY274119.3 et A. MARRA et al., Science, May 1, 2003, 300, 1399-1404) et de l'isolat de Toronto (Tor2, Genbank n d'accès AY 278741 et A. ROTA et al., Science, 2003, 300, 1394- 1399).  Genome sequences of this new coronavirus have thus been obtained, in particular those of the Urbani isolate (Genbank n access AY274119.3 and A. MARRA et al., Science, May 1, 2003, 300, 1399-1404) and of the Toronto isolate (Tor2, Genbank Access No. AY 278741 and A. ROTA et al., Science, 2003, 300, 1394-1399).

L'organisation du génome est comparable à celle des autres coronavirus connus permettant ainsi de confirmer l'appartenance du SARS-CoV à la famille des Coronaviridae; les cadres ouverts de lecture ORF1a et lb et les cadres ouverts de lecture correspondant aux protéines S, E, M, et N, ainsi qu'à des protéines codées par: la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E (ORF3), la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E et chevauchant l'ORF-E (ORF4), la région située entre l'ORF-M et l'ORF-N (ORF7 à ORF 11) et la région correspondant à l'ORF-N (ORF13 et ORF 14), ont notamment été identifiées.  The organization of the genome is comparable to that of other known coronaviruses, thus confirming the SARS-CoV membership of the family Coronaviridae; the open reading frames ORF1a and lb and the open reading frames corresponding to the S, E, M, and N proteins, as well as proteins encoded by: the region between the ORF-S and the ORF-E (ORF3), the region between the ORF-S and the ORF-E and straddling the ORF-E (ORF4), the region between the ORF-M and the ORF-N (ORF7 to ORF 11 ) and the region corresponding to the ORF-N (ORF13 and ORF14) have been identified.

Sept différences ont été mises en évidence entre les séquences des isolats Tor2 et Urbani; 3 correspondent à des mutations silencieuses (c/t en position 16622 et a/g en position 19064 de l'ORFlb, t/c en position 24872 de l'ORF- S) et 4 modifient la séquence en acides aminés de respectivement: les protéines codées par l'ORFla (c/t en position 7919 correspondant à la mutation AN), la protéine S (g/t en position 23220 correspondant à la mutation AIS), la protéine codée par l'ORF3 (a/g en position 25298 correspondant à la mutation R/G) et de la protéine M (tic en position 26857 correspondant à la mutation S/P).  Seven differences were found between the sequences of isolates Tor2 and Urbani; 3 correspond to silent mutations (c / t in position 16622 and a / g in position 19064 of ORFlb, t / c in position 24872 of ORF-S) and 4 modify the amino acid sequence of respectively: proteins encoded by ORFla (c / t at position 7919 corresponding to the AN mutation), the protein S (g / t at position 23220 corresponding to the AIS mutation), the protein encoded by ORF3 (a / g in position 25298 corresponding to the R / G mutation) and the M protein (tic at position 26857 corresponding to the S / P mutation).

En outre, l'analyse phylogénétique montre que le SARS-CoV est éloigné des autres coronavirus et qu'il est apparu, ni par mutation de coronavirus respiratoires humains, ni par recombinaison entre des coronavirus connus (pour une revue, voir Holmes, J.C.I., 2003, 111, 1605-1609).  In addition, phylogenetic analysis shows that SARS-CoV is far from other coronaviruses and has been shown to be either by mutation of human respiratory coronaviruses or by recombination between known coronaviruses (for a review, see Holmes, JCI, 2003, 111, 1605-1609).

La mise en évidence et la prise en compte de nouveaux variants sont importantes pour la mise au point de réactifs de détection et de diagnostic du SRAS suffisamment sensibles et spécifiques ainsi qu'à des compositions immunogènes aptes à protéger des populations contre des épidémies de SRAS.  The identification and consideration of novel variants is important for the development of sufficiently sensitive and specific SARS detection and diagnostic reagents as well as for immunogenic compositions capable of protecting populations against SARS outbreaks.

Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence une autre souche de coronavirus associé au SRAS, qui se distingue des isolats Tor2 et Urbani.  The inventors have now identified another strain of SARS-associated coronavirus, which is different from the Tor2 and Urbani isolates.

La présente invention a donc pour objet, une souche isolée ou purifiée de coronavirus humain associé au syndrome respiratoire aigu sévère, caractérisée en ce que son génome présente sous la forme d'ADN complémentaire un codon sérine en position 23220-23222 du gène de la protéine S ou un codon glycine en position 25298-25300 du gène de l'ORF3, et un codon alanine en position 7918-7920 de l'ORFIa ou un codon sérine en position 26857-26859 du gène de la protéine M, lesdites positions étant indiquées en référence à la séquence Genbank AY274119.3.  The subject of the present invention is therefore an isolated or purified strain of human coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome, characterized in that its genome presents in the form of complementary DNA a serine codon at position 23220-23222 of the protein gene. S or a glycine codon at position 25298-25300 of the ORF3 gene, and an alanine codon at position 7918-7920 of ORFIa or a serine codon at position 26857-26859 of the M protein gene, said positions being indicated with reference to Genbank sequence AY274119.3.

Selon un mode de réalisation avantageux de ladite souche, l'équivalent ADN de son génome présente une séquence correspondant à la séquence SEQ ID NO: 1; cette souche de coronavirus est issue du prélèvement de lavage bronchoalvéolaire d'un patient atteint de SRAS, répertorié sous le n 031589 et effectué à l'hôpital français de Hanoi (Vietnam).  According to an advantageous embodiment of said strain, the DNA equivalent of its genome has a sequence corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1; this strain of coronavirus is derived from the bronchoalveolar lavage sample of a patient with SARS, listed under the number 031589 and carried out at the French hospital in Hanoi (Vietnam).

Conformément à l'invention, ladite séquence SEQ ID NO:1 est celle de l'acide désoxyribonucléique correspondant à la molécule d'acide ribonucléique du génome de la souche isolée de coronavirus telle que définie ci- dessus.  According to the invention, said sequence SEQ ID NO: 1 is that of the deoxyribonucleic acid corresponding to the ribonucleic acid molecule of the genome of the strain isolated from coronavirus as defined above.

La séquence SEQ ID NO: 1 se distingue de la séquence Genbank AY274119.3 (isolat Tor2) en ce qu'elle possède les mutations suivantes: - g/t en position 23220; le codon alanine (gct) en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de Tor2 est remplacé par un codon sérine (tct), - a/g en position 25298; le codon arginine (aga) en position 11 de la 5 séquence en acide aminés de la protéine codée par l'ORF3 de Tor 2 est remplacé par un codon glycine (gga).  The sequence SEQ ID NO: 1 is distinguished from the Genbank sequence AY274119.3 (Tor2 isolate) in that it possesses the following mutations: g / t at position 23220; the alanine codon (gct) at position 577 of the amino acid sequence of the Tor2 protein S is replaced by a serine codon (tct), a / g at position 25298; the arginine (aga) codon at position 11 of the amino acid sequence of the Tor 2 ORF3 encoded protein is replaced by a glycine codon (gga).

En outre, la séquence SEQ ID NO: 1 se distingue de la séquence Genbank AY278741 (isolat Urbani) en ce qu'elle possède les mutations suivantes: tic en position 7919; le codon valine (gtt) en position 2552 de la 10 séquence en acides aminés de la protéine codée par l'ORFIa est remplacé par un codon alanine (gct), - tic en position 16622: cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par l'ORFIb (mutation silencieuse), - g/a en position 19064: cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés des protéines codées par l'ORFlb (mutation silencieuse), - c/t en position 24872: cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés de la protéine S, et - c/t en position 26857: le codon proline (ccc) en position 154 de la séquence en acides aminés de la protéine M est remplacé par un codon sérine (tcc).  In addition, the sequence SEQ ID NO: 1 differs from the Genbank sequence AY278741 (Urbani isolate) in that it possesses the following mutations: tic at position 7919; the valine codon (gtt) at position 2552 of the amino acid sequence of the protein encoded by ORFIa is replaced by an alanine codon (gct), tic at position 16622: this mutation does not modify the amino acid sequence proteins encoded by ORFIb (silent mutation), - g / a at position 19064: this mutation does not modify the amino acid sequence of the proteins encoded by ORFlb (silent mutation), - c / t at position 24872: this mutation does not modify the amino acid sequence of the S protein, and - c / t at position 26857: the proline codon (ccc) at position 154 of the amino acid sequence of the M protein is replaced by a serine codon ( cc).

En l'absence de mention particulière, les positions des séquences nucléotidiques et peptidiques sont indiquées en référence à la séquence Genbank AY274119.3.  In the absence of particular mention, the positions of the nucleotide and peptide sequences are indicated with reference to the Genbank sequence AY274119.3.

La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence est celle du génome de la souche isolée 25 de coronavirus telle que définie ci-dessus.  The present invention also relates to an isolated or purified polynucleotide, characterized in that its sequence is that of the genome of the isolated strain of coronavirus as defined above.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide il présente la séquence SEQ ID NO: 1.  According to an advantageous embodiment of said polynucleotide, it has the sequence SEQ ID NO: 1.

La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé ou purifié, caractérisé en ce que sa séquence hybride dans des conditions de forte 30 stringence avec la séquence du polynucléotide tel que défini cidessus.  The present invention also relates to an isolated or purified polynucleotide, characterized in that its hybrid sequence under conditions of high stringency with the polynucleotide sequence as defined above.

Les termes isolé ou purifié signifient modifié par la main de l'homme à partir de l'état naturel; autrement dit si un objet existe dans la nature, il est dit isolé ou purifié s'il a été modifié ou extrait de son environnement naturel ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou une protéine/un peptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est ni isolé, ni purifié ; en revanche le même polynucléotide ou protéine /peptide séparé des molécules coexistantes dans son environnement naturel, obtenu par clonage, amplification et/ou synthèse chimique est isolé au sens de la présente invention. De plus, un polynucléotide ou une protéine/peptide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par toute autre méthode, est isolé même s'il est présent dans ledit organisme. Le terme purifié tel qu'utilisé dans la présente invention, signifie que les protéines /peptides selon l'invention sont essentiellement libres d'association avec les autres protéines ou polypeptides, comme l'est par exemple le produit purifié de la culture de cellules hôtes recombinantes ou le produit purifié à partir d'une source non-recombinante.  The terms isolated or purified mean modified by the hand of man from the natural state; in other words, if an object exists in nature, it is said to be isolated or purified if it has been modified or extracted from its natural environment or both. For example, a polynucleotide or protein / peptide naturally present in a living organism is neither isolated nor purified; on the other hand, the same polynucleotide or protein / peptide separated from the coexisting molecules in its natural environment, obtained by cloning, amplification and / or chemical synthesis is isolated within the meaning of the present invention. In addition, a polynucleotide or a protein / peptide that is introduced into an organism by transformation, genetic manipulation or any other method is isolated even if it is present in said organism. The purified term as used in the present invention means that the proteins / peptides according to the invention are essentially free from association with other proteins or polypeptides, as is for example the purified product of the host cell culture. recombinant or the purified product from a non-recombinant source.

Au sens de la présente invention, on entend par conditions d'hybridation de forte stringence, des conditions de température et de force ionique choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation spécifique et sélective entre polynucléotides complémentaires.  Within the meaning of the present invention, high-stringency hybridization conditions are understood to mean temperature and ionic strength conditions chosen in such a way as to allow the maintenance of specific and selective hybridization between complementary polynucleotides.

A titre d'illustration, des conditions de forte stringence aux fins de définir les polynucléotides ci-dessus, sont avantageusement les suivantes: l'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes: (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0, 015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon; (2) hybridation pendant 20 heures à 42 C suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C.  By way of illustration, conditions of high stringency for the purpose of defining the above polynucleotides are advantageously as follows: DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 C during 3 hours in phosphate buffer (20 mM pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a solution 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), Denhardt's x 10, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) hybridization for 20 hours at 42 ° C. followed by 2 washes for 20 minutes at 20 ° C. in 2 × SSC + 2% SDS, 1 washing for 20 minutes at 20 ° C. in 0.1 × SSC + 0.1% SDS. The last washing is carried out in 0.1 x SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 C.

La présente invention a également pour objet un fragment représen- tatif du polynucléotide tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu, soit par l'utilisation d'enzymes de restriction dont les sites de reconnaissance et de coupure sont présents dans ledit polynucléotide tel que défini ci- dessus, soit par amplification à l'aide d'amorces oligonucléotidiques spécifiques dudit polynucléotide tel que défini ci-dessus, soit par transcription in vitro, soit par synthèse chimique.  The subject of the present invention is also a representative fragment of the polynucleotide as defined above, characterized in that it is capable of being obtained, either by the use of restriction enzymes whose recognition sites and cleavage are present in said polynucleotide as defined above, either by amplification using oligonucleotide primers specific for said polynucleotide as defined above, either by in vitro transcription or by chemical synthesis.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment, il est sélectionné dans le groupe constitué par: l'ADNc correspondant à au moins un cadre ouvert de lecture (ORF) choisi parmi: ORF1a, ORF lb, ORF-S, ORF- E, ORF-M, ORF-N, ORF3, ORF4, ORF7 à ORF11, ORF13 et ORF14, et l'ADNc correspondant aux extrémités 5' ou 3' non-codantes dudit polynucléotide.  According to an advantageous embodiment of said fragment, it is selected from the group consisting of: the cDNA corresponding to at least one open reading frame (ORF) chosen from: ORF1a, ORF lb, ORF-S, ORF-E, ORF -M, ORF-N, ORF3, ORF4, ORF7 to ORF11, ORF13 and ORF14, and the cDNA corresponding to the 5 'or 3' non-coding ends of said polynucleotide.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit fragment présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par: - les séquences SEQ ID NO: 2 et 4 représentant l'ADNc corres-10 pondant à l'ORF-S qui code pour la protéine S, - les séquences SEQ ID NO: 13 et 15 représentant l'ADNc correspondant à l'ORF-E qui code pour la protéine E, les séquences séquence SEQ ID NO: 16 et 18 représentant l'ADNc correspondant à l'ORF-M qui code pour la protéine M, - les séquences SEQ ID NO: 36 et 38 représentant l'ADNc correspondant à l'ORF-N qui code pour la protéine N, - les séquences représentant les ADNc correspondant respective-ment: aux ORFIa et ORF1b (ORF 1ab, SEQ ID NO: 31), aux ORF3 et ORF4 (SEQ ID NO: 7, 8), aux ORF 7 à 11 (SEQ ID NO: 19, 20), à l'ORF13 (SEQ ID NO: 32) et à l'ORF14 (SEQ ID NO: 34), et - les séquences représentant les ADNc correspondant respectivement aux extrémités 5'(SEQ ID NO: 39 et 72) et 3' non-codantes (SEQ ID NO: 40, 73) dudit polynucléotide.  According to an advantageous arrangement of this embodiment, said fragment has a sequence selected from the group consisting of: the sequences SEQ ID NO: 2 and 4 representing the cDNA corresponding to the ORF-S which encodes the protein S, the sequences SEQ ID NO: 13 and 15 representing the cDNA corresponding to the ORF-E which codes for the protein E, the sequences SEQ ID NO: 16 and 18 representing the cDNA corresponding to the ORF M coding for the M protein, the sequences SEQ ID NO: 36 and 38 representing the cDNA corresponding to the ORF-N which encodes the N protein, the sequences representing the corresponding cDNAs respectively to the ORFIa and ORF1b (ORF 1ab, SEQ ID NO: 31), ORF3 and ORF4 (SEQ ID NO: 7, 8), ORFs 7-11 (SEQ ID NO: 19, 20), ORF13 (SEQ ID NO 32) and ORF14 (SEQ ID NO: 34), and the cDNA sequences corresponding to the 5 '(SEQ ID NO: 39 and 72) and 3' non-coding (SEQ ID NO: 40, 73) of said polynucleotide.

La présente invention a également pour objet un fragment de l'ADNc codant pour la protéine S, tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 5 et 6 (fragments Sa et Sb).  The subject of the present invention is also a fragment of the cDNA coding for the protein S, as defined above, characterized in that it has a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 5 and 6 (fragments Sa and Sb).

La présente invention a également pour objet un fragment de l'ADNc correspondant aux ORFla et ORFlb tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 41 à 54 (fragments LO à L12).  The subject of the present invention is also a fragment of the cDNA corresponding to ORF1a and ORF1b as defined above, characterized in that it has a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 41 to 54 ( fragments LO to L12).

La présente invention a également pour objet un fragment du polynucléotide tel que défini ci dessus, caractérisé en ce qu'il présente au moins 15 bases ou paires de bases consécutives de la séquence du génome de ladite souche incluant au moins une de celles situées en position 7979, 16622, 19064, 23220, 24872, 25298 et 26857. De préférence, il s'agit d'un fragment de 20 à 2500 bases ou paires de bases, de manière préférée de 20 à 400.  The subject of the present invention is also a fragment of the polynucleotide as defined above, characterized in that it has at least 15 consecutive bases or base pairs of the sequence of the genome of said strain including at least one of those located in position. 7979, 16622, 19064, 23220, 24872, 25298 and 26857. Preferably, it is a 20 to 2500 base or base pair fragment, preferably 20 to 400.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment, il inclut au moins un couple de bases ou de paires de bases correspondant aux positions suivantes: 7919 et 23220, 7919 et 25298, 16622 et 23220, 19064 et 23220, 16622 et 25298, 19064 et 25298, 23220 et 24872, 23220 et 26857, 24872 et 25298, 25298 et 26857.  According to an advantageous embodiment of said fragment, it includes at least one pair of bases or base pairs corresponding to the following positions: 7919 and 23220, 7919 and 25298, 16622 and 23220, 19064 and 23220, 16622 and 25298, 19064 and 25298 , 23220 and 24872, 23220 and 26857, 24872 and 25298, 25298 and 26857.

La présente invention a également pour objet des amorces d'au moins 18 bases aptes à amplifier un fragment du génome d'un coronavirus associé au SRAS ou de l'équivalent ADN de celui-ci.  The subject of the present invention is also primers of at least 18 bases capable of amplifying a fragment of the genome of a SARS-associated coronavirus or the DNA equivalent thereof.

Selon un mode de réalisation desdites amorces, elles sont sélection-nées dans le groupe constitué par: - la paire d'amorces n 1 correspondant respectivement aux positions 28507 à 28522 (amorce sens, SEQ ID NO: 60) et 28774 à 28759 (amorce anti- sens, SEQ ID NO: 61) de la séquence du polynucléotide tel que défini ci- dessus, et - la paire d'amorces n 2 correspondant respectivement aux positions 28375 à 28390 (amorce sens, SEQ ID NO: 62) et 28702 à 28687 (amorce anti- sens, SEQ ID NO: 63) de la séquence du polynucléotide tel que défini ci- dessus.  According to one embodiment of said primers, they are selected from the group consisting of: - primer pair n 1 corresponding respectively to positions 28507 to 28522 (sense primer, SEQ ID NO: 60) and 28774 to 28759 (primer antisense, SEQ ID NO: 61) of the polynucleotide sequence as defined above, and - primer pair n 2 corresponding to positions 28375 to 28390 (sense primer, SEQ ID NO: 62) and 28702 respectively. to 28687 (antisense primer, SEQ ID NO: 63) of the polynucleotide sequence as defined above.

La présente invention a également pour objet une sonde apte à détecter la présence du génome d'un coronavirus associé au SRAS ou d'un fragment de celui-ci, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par: les fragments tels que définis ci-dessus et les fragments correspondant aux positions suivantes de la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus: 28561 à 28586, 28588 à 28608, 28541 à 28563 et 28565 à 28589 (SEQ ID NO: 64 à 67).  The subject of the present invention is also a probe capable of detecting the presence of the genome of a SARS-associated coronavirus or of a fragment thereof, characterized in that it is selected from the group consisting of: fragments such as as defined above and the fragments corresponding to the following positions of the polynucleotide sequence as defined above: 28561 to 28586, 28588 to 28608, 28541 to 28563 and 28565 to 28589 (SEQ ID NO: 64 to 67).

Les sondes et amorces selon l'Invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'Homme du Métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou 1'125I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.  The probes and primers according to the invention may be labeled directly or indirectly by a radioactive or non-radioactive compound by methods well known to those skilled in the art, in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal. Among the radioactive isotopes used, mention may be made of 32P, 33P, 35S, 3H or 125I. Non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, digoxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.

L'invention englobe les sondes et les amorces marquées dérivées des séquences précédentes.  The invention encompasses probes and labeled primers derived from the foregoing sequences.

De telles sondes et amorces sont utiles pour le diagnostic de l'infection par un coronavirus associé au SRAS.  Such probes and primers are useful for the diagnosis of SARS-associated coronavirus infection.

La présente invention a également pour objet une méthode de détec-10 tion d'un coronavirus associé au SRAS, à partir d'un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins: (a) l'extraction d'acides nucléiques présents dans ledit échantillon biologique, (b) l'amplification d'un fragment de I'ORF-N par RT-PCR à l'aide 15 d'une paire d'amorces telle que définie ci-dessus, et (c) la détection par tout moyen approprié des produits d'amplifications obtenus en (b).  The present invention also relates to a method for detecting a SARS-associated coronavirus from a biological sample, which method is characterized by comprising at least: nucleic acids present in said biological sample, (b) amplification of a fragment of ORF-N by RT-PCR using a pair of primers as defined above, and c) the detection by any appropriate means of the amplification products obtained in (b).

Les produits d'amplifications (amplicons) en (b) sont de 268 pb pour la paire d'amorces n 1 et de 328 pb pour la paire d'amorces n 2.  The amplification products (amplicons) in (b) are 268 bp for primer pair n 1 and 328 bp for primer pair n 2.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'étape (b) de détection est réalisée à l'aide d'au moins une sonde correspondant aux positions 28561 à 28586, 28588 à 28608, 28541 à 28563 et 28565 à 28589 de la séquence du polynucléotide tel que défini ci-dessus.  According to an advantageous embodiment of said method, the detection step (b) is carried out using at least one probe corresponding to positions 28561 to 28586, 28588 to 28608, 28541 to 28563 and 28565 to 28589 of the sequence of the polynucleotide as defined above.

De préférence, le génome du coronavirus associé au SRAS est détecté et éventuellement quantifié par PCR en temps réel, à l'aide de la paire d'amorces n 2 et des sondes correspondant aux positions 28541 à 28563 et 28565 à 28589 marquées avec des composés différents, notamment des agents fluorescents différents.  Preferably, the SARS-associated coronavirus genome is detected and possibly quantified by real-time PCR, using primer pair n 2 and probes corresponding to positions 28541 to 28563 and 28565 to 28589 labeled with compounds. different, including different fluorescent agents.

La RT-PCR en temps réel qui met en oeuvre cette paire d'amorces et 30 cette sonde est très sensible puisqu'elle permet de détecter 102 copies d'ARN et jusqu'à 10 copies d'ARN, elle est en outre fiable et reproductible.  Real-time RT-PCR which uses this pair of primers and this probe is very sensitive since it makes it possible to detect 102 copies of RNA and up to 10 RNA copies, it is moreover reliable and reproducible.

L'invention englobe les polydésoxyribonucléotides et les polyribonucléotides simple-brin, double-brin et tripe-brin correspondant à la séquence du génome de la souche isolée de coronavirus et de ses fragments tels que définis ci-dessus, ainsi qu'à leurs séquences complémentaires, sens ou anti-sens, notamment les ARN et les ADNc correspondant à la séquence du génome et de ses fragments tels que définis ci-dessus.  The invention encompasses polydeoxyribonucleotides and single-stranded, double-stranded and tripe-stranded polyribonucleotides corresponding to the genome sequence of the isolated strain of coronavirus and its fragments as defined above, as well as to their complementary sequences. , meaning or antisense, especially RNAs and cDNAs corresponding to the sequence of the genome and its fragments as defined above.

La présente invention englobe également les fragments d'amplification obtenus à l'aide d'amorces spécifiques du génome de la souche purifiée ou isolée tel que défini ci-dessus, notamment à l'aide d'amorces et de paires d'amorces telles que définies ci-dessus, les fragments de restriction constitués par ou comprenant la séquence des fragments tels que définis ci-dessus, les fragments obtenus par transcription in vitro à partir d'un vecteur contenant la séquence SEQ ID NO: 1 ou un fragment tel que défini ci-dessus, ainsi que des fragments obtenus par synthèse chimique. Des exemples de fragments de restriction sont déduits de la carte de restriction de la séquence SEQ ID NO: 1 illustrée par la figure 13. Conformément à l'invention lesdits fragments sont, soit sous forme de fragments isolés, soit sous forme de mélanges de fragments. L'invention englobe également les fragments modifiés, par rapport aux précédents, par enlèvement, ou addition de nucléotides dans une proportion d'environ 15 %, par rapport à la longueur des fragments ci-dessus et/ou modifiés au niveau de la nature des nucléotides, dès lors que les fragments nucléotidiques modifiés conservent une capacité d'hybridation avec les séquences d'ARN génomiques ou antigénomiques de l'isolat tel que défini ci-dessus.  The present invention also encompasses the amplification fragments obtained using primers specific to the genome of the purified or isolated strain as defined above, in particular using primers and primer pairs such as defined above, the restriction fragments constituted by or comprising the sequence of the fragments as defined above, the fragments obtained by in vitro transcription from a vector containing the sequence SEQ ID NO: 1 or a fragment such as defined above, as well as fragments obtained by chemical synthesis. Examples of restriction fragments are deduced from the restriction map of the sequence SEQ ID NO: 1 illustrated in FIG. 13. In accordance with the invention, said fragments are either in the form of isolated fragments or in the form of mixtures of fragments. . The invention also encompasses modified fragments, relative to the above, by removal, or addition of nucleotides in a proportion of about 15%, relative to the length of the fragments above and / or modified at the nature of the nucleotides, since the modified nucleotide fragments retain a hybridization capacity with the genomic or antigenome RNA sequences of the isolate as defined above.

Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, elles peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RTPCR ou bien par synthèse chimique totale ou partielle.  The nucleic acid molecules according to the invention are obtained by conventional methods, known in themselves, following the standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA). For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RTPCR or by total or partial chemical synthesis.

La présente invention a également pour objet une puce ou filtre à 30 ADN ou à ARN, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polynucléotide ou l'un de ses fragments tels que définis ci-dessus.  The present invention also relates to a DNA or RNA chip or filter, characterized in that it comprises at least one polynucleotide or one of its fragments as defined above.

Les puces ou filtres à ADN ou à ARN selon l'invention sont préparés par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comme par exemple greffage chimique ou électrochimique d'oligonucléotides sur support de verre ou de nylon.  The chips or DNA or RNA filters according to the invention are prepared by conventional methods, known per se, such as, for example, chemical or electrochemical grafting of oligonucleotides on a glass or nylon support.

La présente invention a également pour objet un vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant, notamment un plasmide ou un phage comprenant un fragment d'acide nucléique tel que défini ci-dessus. De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ledit fragment d'acide nucléique est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. En outre, ledit vecteur peut comprendre des séquences (étiquettes ou tag) fusionnées en phase avec l'extrémité 5' et/ou 3' dudit insert, utiles pour l'immobilisation, et/ou la détection et/ou la purification de la protéine exprimée à partir dudit vecteur.  The subject of the present invention is also a vector for cloning and / or recombinant expression, in particular a plasmid or a phage comprising a nucleic acid fragment as defined above. Preferably, said recombinant vector is an expression vector wherein said nucleic acid fragment is under the control of appropriate transcriptional and translational regulatory elements. In addition, said vector may comprise sequences (labels or tag) fused in phase with the 5 'and / or 3' end of said insert, useful for the immobilization, and / or the detection and / or purification of the protein expressed from said vector.

Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte, sont connus en eux-mêmes; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.  These vectors are constructed and introduced into host cells by conventional methods of recombinant DNA and genetic engineering, which are known per se. Many vectors in which a nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a host cell are known per se; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form or integration into the chromosomal material of the host ), as well as the nature of the host cell.

Conformément à l'invention, ledit plasmide est notamment sélectionné parmi les plasmides suivants: - le plasmide, dénommé SARS-S, compris dans la souche bacté- rienne déposée sous le n I-3059, le 20 juin 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 25348 (SEQ ID NO: 4), en référence à la séquence Genbank AY2741 19.3, - le plasmide, dénommé SARS-S1, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3020, le 12 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient un fragment 5' de la séquence d'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, lequel fragment correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 23454 (SEQ ID NO:5), en référence à la séquence Genbank AY274119.3 Tor2, - le plasmide, dénommé SARS-S2, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3019, le 12 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient un fragment 3'de la séquence d'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, lequel fragment correspondant aux nucléotides des positions 23322 à 25348 (SEQ ID NO:6), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide, dénommé SARS-SE, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3126, le, 13 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc correspondant à la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E et chevauchant l'ORF-E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle région correspondant aux nucléotides des positions 25110 à 26244 (SEQ ID NO:8), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide, dénommé SARS-E, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3046, le 28 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26082 à 26413 (SEQ ID NO:15), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide, dénommé SARS-M; compris dans la souche bacté- rienne déposée sous le n I-3047, le 28 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus; laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26330 à 27098 (SEQ ID NO:18), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide dénommé SARS-MN,compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3125, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc correspondant à la région située entre l'ORF-M et l'ORF-N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 et prélevée à Hanoi, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26977 à 28218 (SEQ ID NO:20), en réfé- rence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide dénommé SARS-N, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n 1-3048, le 5 juin 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc codant pour la protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie cidessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 28054 à 29430 (SEQ ID NO:38), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide dénommé SARS-5'NC, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I- 3124, le 7 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc correspondant à l'extrémité 5'non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 1 à 204 (SEQ ID NO:39), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, - le plasmide dénommé SARS-3'NC, compris dans la souche bactérienne déposée sous le n I-3123 le 7 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15. ; il contient la séquence d'ADNc correspondant à l'extrémité 3'non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant à celle située entre le nucléotide en position 28933 à 29727 (SEQ ID NO:40), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, se termine par une série de nucléotides a., - le plasmide d'expression dénommé pIV2.3N, contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion C-terminale de la protéine N (SEQ ID NO: 37) avec une étiquette polyhistidine, - le plasmide d'expression dénommé p1V2.3Sc, contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion C-terminale du fragment correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine, - le plasmide d'expression pIV2.3SL, contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion C-terminale du fragment correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine, - le plasmide d'expression dénommé pIV2.4N, contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion N-terminale de la protéine N (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine, - le plasmide d'expression dénommé pIV2.4Sc ou pIV2.4S1, contenant un insert codant pour une fusion N-terminale du fragment correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine, et - le plasmide d'expression dénommé pIV2.4SL contenant un fragment d'ADNc codant pour une fusion N-terminale du fragment correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S (SEQ ID NO: 3) avec une étiquette polyhistidine.  According to the invention, said plasmid is in particular selected from the following plasmids: the plasmid, called SARS-S, included in the bacterial strain deposited under the No. I-3059, on June 20, 2003, from the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA sequence coding for the S protein of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under 031589, which sequence corresponding to the nucleotides of the positions 21406 to 25348 (SEQ ID NO: 4), with reference to the Genbank sequence AY2741 19.3, the plasmid, called SARS-S1, included in the bacterial strain deposited under No. I-3020, on May 12, 2003, from the National Collection of Microorganism Cultures, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains a 5 'fragment of the cDNA sequence coding for the S protein of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under the number 031589, as defined above, which fragment corresponding to the nucleotides of the positions 21406 to 23454 (SEQ ID NO: 5), with reference to the Genbank sequence AY274119.3 Tor2, - the plasmid, called SARS-S2, included in the bacterial strain deposited under No. I-3019, on May 12, 2003, from the Collection National Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains a fragment 3 'of the cDNA sequence coding for the S protein of the SARS-CoV strain resulting from the sample indexed under 031589, as defined above, which fragment corresponding to the nucleotides of positions 23322 to 25348 (SEQ ID NO: 6), with reference to the Genbank sequence of access AY274119.3, the plasmid, called SARS-SE, included in the bacterial strain deposited under No. I-3126, on, November 13, 2003, from the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA corresponding to the region between the ORF-S and the ORF-E and overlapping the ORF-E of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under the number 031589, as defined above. above, which region corresponding to the nucleotides of positions 25110 to 26244 (SEQ ID NO: 8), with reference to the Genbank n access sequence AY274119.3, the plasmid, called SARS-E, included in the bacterial strain deposited under I-3046, May 28, 2003, from the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA sequence coding for the E protein of the SARS-CoV strain resulting from the sample indexed under the number 031589, as defined above, which sequence corresponding to the nucleotides of the positions 26082 to 26413 (SEQ ID NO: 15), with reference to Genbank accession sequence AY274119.3, - the plasmid, called SARS-M; included in the bacterial strain deposited under No. I-3047, on May 28, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA sequence coding for the M protein of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under the number 031589, as defined above; which sequence corresponding to the nucleotides of the positions 26330 to 27098 (SEQ ID NO: 18), with reference to the Genbank n access sequence AY274119.3, the plasmid called SARS-MN, included in the bacterial strain deposited under the name -3125, November 13, 2003, at the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA sequence corresponding to the region between the ORF-M and the ORF-N of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under 031589 and taken from Hanoi, as defined above which sequence corresponds to the nucleotides of the positions 26977 to 28218 (SEQ ID NO: 20), with reference to the Genbank n access sequence AY274119.3, the plasmid called SARS-N, included in the bacterial strain deposited under No. 1-3048, June 5, 2003, from the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA coding for the N protein of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under 031589, as defined above, which sequence corresponding to the nucleotides of the positions 28054 to 29430 (SEQ ID NO: 38), in reference to the Genbank sequence of access AY274119.3, - the plasmid called SARS-5'NC, included in the bacterial strain deposited under No. I-3124, on November 7, 2003, from the National Collection of Cultures of Microorganisms , 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA corresponding to the 5 'non-coding end of the genome of the strain of SARS-CoV resulting from the sample numbered under 031589, as defined above, which sequence corresponding to the nucleotides of positions 1 to 204 ( SEQ ID NO: 39), with reference to Genbank sequence AY274119.3 access, - the plasmid called SARS-3'NC, included in the bacterial strain deposited under No. I-3123 on November 7, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.; it contains the cDNA sequence corresponding to the 3 'non-coding end of the genome of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under 031589, as defined above, which sequence corresponds to that located between the nucleotide in position 28933 to 29727 (SEQ ID NO: 40), with reference to Genbank sequence AY274119.3 access, ends with a series of nucleotides a .- the expression plasmid called pIV2.3N, containing a cDNA fragment coding for a C-terminal fusion of the N protein (SEQ ID NO: 37) with a polyhistidine label, - the expression plasmid called p1V2.3Sc, containing a cDNA fragment coding for a C-fusion. end of the fragment corresponding to positions 475 to 1193 of the amino acid sequence of protein S (SEQ ID NO: 3) with a polyhistidine tag, - the expression plasmid pIV2.3SL, containing a cDNA fragment coding for a C-terminal fusion of the fragment corresponding to the posi 14 to 1193 of the amino acid sequence of the protein S (SEQ ID NO: 3) with a polyhistidine label, - the expression plasmid called pIV2.4N, containing a cDNA fragment coding for an N-terminal fusion. of the N protein (SEQ ID NO: 3) with a polyhistidine label, the expression plasmid called pIV2.4Sc or pIV2.4S1, containing an insert coding for an N-terminal fusion of the fragment corresponding to positions 475 to 1193 of the amino acid sequence of the protein S (SEQ ID NO: 3) with a polyhistidine tag, and the expression plasmid called pIV2.4SL containing a cDNA fragment coding for an N-terminal fusion of the fragment corresponding to the positions 14 to 1193 of the amino acid sequence of protein S (SEQ ID NO: 3) with a polyhistidine tag.

Selon une disposition avantageuse du plasmide d'expression tel que défini ci-dessus, il est compris dans une souche bactérienne qui a été déposée sous le n I- 3117, le 23 octobre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.  According to an advantageous arrangement of the expression plasmid as defined above, it is included in a bacterial strain which was deposited under the number I-3117, on October 23, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.

Selon une autre disposition avantageuse du plasmide d'expression tel que défini ci-dessus, il est compris dans une souche bactérienne qui a été déposée sous le n I- 3118, le 23 octobre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.  According to another advantageous arrangement of the expression plasmid as defined above, it is included in a bacterial strain which was deposited under the number I-3118, on October 23, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.

La présente invention a également pour objet une banque d'ADNc caractérisée en ce qu'elle comprend des fragments tels que définis cidessus, en parti- culier des fragments d'amplification ou des fragments de restriction, clonés dans un vecteur recombinant, notamment un vecteur d'expression (banque d'expression).  The subject of the present invention is also a cDNA library characterized in that it comprises fragments as defined above, in particular amplification fragments or restriction fragments, cloned in a recombinant vector, in particular a vector of expression (expression bank).

La présente invention a également pour objet des cellules, notamment des cellules procaryotes, modifiées par un vecteur recombinant tel que défini ci- dessus.  The subject of the present invention is also cells, in particular prokaryotic cells, modified with a recombinant vector as defined above.

Les vecteurs recombinants tels que définis ci-dessus et les cellules transformées par lesdits vecteurs d'expression sont avantageusement utilisés pour la production des protéines et des peptides correspondants. Les banques d'expression dérivées desdits vecteurs, ainsi que les cellules transformées par lesdites banques d'expression sont avantageusement utilisées pour identifier les épitopes immunogènes (épitopes B et T) des protéines du coronavirus associé au SRAS.  The recombinant vectors as defined above and the cells transformed with said expression vectors are advantageously used for the production of the corresponding proteins and peptides. The expression libraries derived from said vectors, as well as the cells transformed by said expression libraries, are advantageously used to identify the immunogenic epitopes (B and T epitopes) of the SARS-associated coronavirus proteins.

La présente invention a également pour objet les protéines et les peptides purifiées ou isolées, caractérisés en ce qu'ils sont codés par le polynucléotide ou l'un de ses fragments tels que définis ci-dessus.  The present invention also relates to purified or isolated proteins and peptides, characterized in that they are encoded by the polynucleotide or one of its fragments as defined above.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite protéine est sélectionnée dans le groupe constitué par: - la protéine S de séquence SEQ ID NO:3 - la protéine E de séquence SEQ ID NO:14 - la protéine M de séquence SEQ ID NO:17 - la protéine N de séquence SEQ ID NO: 37 - les protéines codées par les ORFs: ORFIa, ORFlb, ORF3, ORF4 et ORF7 à ORF11, ORF13 et ORF14 de séquence respectivement, SEQ ID NO:74, 75, 10, 12, 22, 24, 26, 28, 30, 33 et 35.  According to an advantageous embodiment of the invention, said protein is selected from the group consisting of: the protein S of sequence SEQ ID NO: 3 - the protein E of sequence SEQ ID NO: 14 - the protein M of sequence SEQ ID NO: 17 - the protein N of sequence SEQ ID NO: 37 - the proteins encoded by the ORFs: ORFIa, ORF1b, ORF3, ORF4 and ORF7 to ORF11, ORF13 and ORF14 of sequence respectively, SEQ ID NO: 74, 75, 10, 12, 22, 24, 26, 28, 30, 33 and 35.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit 25 peptide est sélectionné dans le groupe constitué par: a) les peptides correspondant aux positions 14 à 1193 et 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S, b) les peptides correspondant aux positions 2 à 14 (SEQ ID NO: 69) et 100 à 221 de la séquence en acides aminés de la protéine M; ces peptides corres- pondent respectivement à l'ectodomaine et à l'endodomaine de la protéine M, et c) les peptides correspondant aux positions 1 à 12 (SEQ ID NO: 70) et 53 à 76 (SEQ ID NO: 71) de la séquence en acides aminés de la protéine E; ces peptides correspondent respectivement à l'ectodomaine et à l'extrémité C-terminale de la protéine E, et d) les peptides de 5 à 50 acides aminés consécutifs, de préférence de 10 à 30 acides aminés, inclus ou chevauchant partiellement ou totalement la séquence 5 des peptides tels que définis en a), b) ou c).  According to an advantageous embodiment of the invention, said peptide is selected from the group consisting of: a) the peptides corresponding to the positions 14 to 1193 and 475 to 1193 of the amino acid sequence of the protein S, b) the peptides corresponding to positions 2 to 14 (SEQ ID NO: 69) and 100 to 221 of the amino acid sequence of protein M; these peptides correspond respectively to the ectodomain and endodomain of the M protein, and c) the peptides corresponding to positions 1 to 12 (SEQ ID NO: 70) and 53 to 76 (SEQ ID NO: 71) of the amino acid sequence of protein E; these peptides correspond respectively to the ectodomain and the C-terminus of the protein E, and d) the peptides of 5 to 50 consecutive amino acids, preferably from 10 to 30 amino acids, included or overlapping partially or totally the sequence 5 peptides as defined in a), b) or c).

La présente invention a également pour objet un peptide caractérisé en ce qu'il présente une séquence de 7 à 50 acides aminés incluant un résidu d'acide aminé sélectionné dans le groupe constitué par: - L'alanine située en position 2552 de la séquence en acides aminés 10 de la protéine codée par l'ORFla.  The present invention also relates to a peptide characterized in that it has a sequence of 7 to 50 amino acids including an amino acid residue selected from the group consisting of: - Alanine located at position 2552 of the sequence in amino acids 10 of the protein encoded by ORFla.

- la sérine située en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de la souche de SARS-CoV telle que définie ci-dessus, - la glycine en position 11 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par l'ORF3 de la souche de SARS-CoV telle que définie ci- dessus, la sérine en position 154 de la séquence en acides aminés de la protéine M de la souche de SARS-CoV telle que définie ci-dessus.  the serine located at position 577 of the amino acid sequence of the S protein of the SARS-CoV strain as defined above, the glycine at position 11 of the amino acid sequence of the protein encoded by the ORF3 of the SARS-CoV strain as defined above, the serine at position 154 of the amino acid sequence of the M protein of the SARS-CoV strain as defined above.

La présente invention a également pour objet un anticorps ou un fragment d'anticorps polyclonal ou monoclonal, susceptible d'être obtenu par immunisation d'un animal avec un vecteur recombinant tel que défini cidessus, une banque d'ADNc telle que définie ci-dessus ou bien une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il se lie avec l'une au moins des protéines codées par le SARS-CoV telles que définies ci-dessus.  The subject of the present invention is also an antibody or a polyclonal or monoclonal antibody fragment, obtainable by immunization of an animal with a recombinant vector as defined above, a cDNA library as defined above or a protein or a peptide as defined above, characterized in that it binds with at least one of the proteins encoded by the SARS-CoV as defined above.

L'invention englobe les anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux, les anticorps chimériques tels que les anticorps humanisés, ainsi que leurs 25 fragments (Fab, Fv, scFv).  The invention encompasses polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies such as humanized antibodies, and fragments thereof (Fab, Fv, scFv).

Au sens de la présente invention, on entend par anticorps chimérique, relativement à un anticorps d'une espèce animale particulière ou d'une classe particulière d'anticorps, un anticorps comprenant tout ou partie d'une chaîne lourde et/ou d'une chaîne légère d'un anticorps d'une autre espèce animale ou d'une autre classe d'anticorps.  For the purposes of the present invention, the term "chimeric antibody" means, relative to an antibody of a particular animal species or of a particular class of antibody, an antibody comprising all or part of a heavy chain and / or a a light chain of an antibody of another animal species or another class of antibodies.

Au sens de la présente invention, on entend par anticorps humanisé une immmunoglobuline humaine dans laquelle les résidus des CDRs (Complementary-Determining Regions) qui forment le site de liaison à l'antigène sont remplacés par ceux d'un anticorps monoclonal non-humain possédant la spécificité, l'affinité ou l'activité recherchées. Par comparaison avec les anticorps non-humains, les anticorps humanisés sont moins immunogènes et possèdent une demi-vie prolon- gée chez l'Homme car ils ne possèdent qu'une faible proportion de séquences non-humaines étant donné que la quasi-totalité des résidus des régions FR (Framework) et de la région constante (Fc) de ces anticorps sont ceux d'une séquence consensus d'immunoglobulines humaines.  For the purposes of the present invention, the term "humanized antibody" is intended to mean a human immunoglobulin in which the residues of the CDRs (Complementary-Determining Regions) which form the antigen-binding site are replaced by those of a non-human monoclonal antibody possessing the specificity, affinity or activity sought. In comparison with non-human antibodies, humanized antibodies are less immunogenic and have a prolonged half-life in humans because they have only a small proportion of non-human sequences, since almost all The residues of the FR regions (Framework) and the constant region (Fc) of these antibodies are those of a consensus sequence of human immunoglobulins.

La présente invention a également pour objet une puce à protéine, 10 caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine, un peptide ou bien un anticorps tels que définis ci-dessus.  The present invention also relates to a protein chip, characterized in that it comprises a protein, a peptide or an antibody as defined above.

Les puces à protéine selon l'invention sont préparées par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes. Parmi les supports appropriés sur lesquels peuvent être immobilisés des protéines, on peut citer ceux en matière plastique ou en verre, notamment sous la forme de microplaques.  The protein chips according to the invention are prepared by conventional methods, known in themselves. Suitable carriers on which proteins may be immobilized include those made of plastic or glass, especially in the form of microplates.

La présente invention a également pour objet des réactifs dérivés de la souche isolée de coronavirus associé au SRAS, issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, utiles pour l'étude et le diagnostic de l'infection provoquée par un coronavirus associé au SRAS, lesquels réactifs sont sélectionnés dans le groupe cons- titué par: (a) une paire d'amorces, une sonde ou une puce à ADN telles que définies ci-dessus, (b) un vecteur recombinant ou une cellule modifiée tels que définis cidessus, (c) une souche isolée de coronavirus ou un polynucléotide tels que définis ci-dessus, (d) une protéine ou un peptide tel que défini ci-dessus, (e) un anticorps ou fragment d'anticorps tels que définis ci-dessus, et (f) une puce à protéine telle que définie ci-dessus.  The present invention also relates to reagents derived from the strain isolated from SARS-associated coronavirus derived from the sample numbered 031589, useful for the study and diagnosis of infection caused by a SARS-associated coronavirus, which The reagents are selected from the group consisting of: (a) a primer pair, a probe or a microarray as defined above, (b) a recombinant vector or a modified cell as defined above, c) an isolated strain of coronavirus or a polynucleotide as defined above, (d) a protein or a peptide as defined above, (e) an antibody or antibody fragment as defined above, and (f) a protein chip as defined above.

Ces différents réactifs sont préparés et utilisés selon les techniques classiques de biologie moléculaire et d'immunologie, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA) , dans Current Protocols in Immunology (John E. Cologan, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA) et dans Antibodies: A Laboratory Manual (E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).  These different reagents are prepared and used according to the standard techniques of molecular biology and immunology, following standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA), in Current Protocols in Immunology (John C. Cologan, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA) and Antibodies: A Laboratory Manual (E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). ).

Les fragments d'acide nucléique selon l'invention sont préparés et utilisés selon les techniques classiques telles que définies ci-dessus. Les peptides et les protéines selon l'invention sont préparés par les techniques d'ADN recombinant, connues de l'Homme du métier, notamment à l'aide des vecteurs recombinants tels que définis ci-dessus. Alternativement, les peptides selon l'invention peuvent être préparés par les techniques classiques de synthèse en phase solide ou liquide, connues de l'Homme du métier.  The nucleic acid fragments according to the invention are prepared and used according to the conventional techniques as defined above. The peptides and proteins according to the invention are prepared by recombinant DNA techniques known to those skilled in the art, in particular using the recombinant vectors as defined above. Alternatively, the peptides according to the invention can be prepared by conventional solid or liquid phase synthesis techniques known to those skilled in the art.

Les anticorps polyclonaux sont préparés par immunisation d'un animal approprié avec une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus, éventuellement couplé à la KLH ou à l'albumine et/ou associé à un adjuvant approprié tel que l'adjuvant de Freund (complet ou incomplet) ou l'hydroxyde d'alumine; après obtention d'un titre en anticorps satisfaisant, les anticorps sont récoltés par prélèvement du sérum des animaux immunisés et enrichis en IgG par précipitation, selon les techniques classiques, puis les IgG spécifiques des protéines du SARS-CoV sont éventuellement purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne appropriée sur laquelle sont fixés ledit peptide ou ladite protéine, tels que définis ci-dessus, de façon à obtenir une préparation d'IgG monospécifiques.  The polyclonal antibodies are prepared by immunizing an appropriate animal with a protein or a peptide as defined above, optionally coupled to KLH or albumin and / or combined with a suitable adjuvant such as Freund's adjuvant. (complete or incomplete) or alumina hydroxide; after obtaining a satisfactory antibody titre, the antibodies are harvested by taking the serum of the immunized animals and enriched with IgG by precipitation, according to standard techniques, then the SARS-CoV protein-specific IgGs are optionally purified by chromatography of affinity on an appropriate column to which said peptide or said protein, as defined above, is attached so as to obtain a monospecific IgG preparation.

Les anticorps monoclonaux sont produits à partir d'hybridomes obtenus par fusion de lymphocytes B d'un animal immunisé par une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus avec des myélomes, selon la technique de Kôhler et Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) ; les hybridomes sont cultivés in vitro, notamment dans des fermenteurs ou produits in vivo, sous forme d'ascite; alternativement lesdits anticorps monoclonaux sont produits par génie génétique comme décrit dans le brevet américain US 4, 816,567.  The monoclonal antibodies are produced from hybridomas obtained by fusion of B lymphocytes of an animal immunized with a protein or a peptide as defined above with myelomas, according to the technique of Kohler and Milstein (Nature, 1975, 256 495-497); the hybridomas are cultured in vitro, in particular in fermentors or produced in vivo, in the form of ascites; alternatively, said monoclonal antibodies are produced by genetic engineering as described in US Pat. No. 4,816,567.

Les anticorps humanisés sont produits par des méthodes générales 30 comme celles décrites dans la Demande Internationale WO 98/45332.  Humanized antibodies are produced by general methods such as those described in International Application WO 98/45332.

Les fragments d'anticorps sont produits à partir des régions VH et VL clonées, à partir des ARNm d'hybridomes ou de lymphocytes spléniques d'une souris immunisée; par exemple, les fragments Fv, scFv ou Fab sont exprimés à la surface de phages filamenteux selon la technique de Winter et Milstein (Nature, 1991, 349, 293-299) ; après plusieurs étapes de sélection, les fragments d'anticorps spécifiques de l'antigène sont isolés et exprimés dans un système d'expression appro- prié, par les techniques classiques de clonage et d'expression d'ADN recombinant.  Antibody fragments are produced from the cloned VH and VL regions from the hybridoma mRNAs or splenic lymphocytes of an immunized mouse; for example, Fv, scFv or Fab fragments are expressed on the surface of filamentous phages according to the technique of Winter and Milstein (Nature, 1991, 349, 293-299); after several selection steps, the antigen-specific antibody fragments are isolated and expressed in a suitable expression system, by standard techniques of cloning and expression of recombinant DNA.

Les anticorps ou leur fragments tels que définis ci-dessus, sont purifiés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, telles que la chromatographie d'affinité.  The antibodies or their fragments as defined above are purified by standard techniques known to those skilled in the art, such as affinity chromatography.

La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par: une paire d'amorces, une sonde, une puce à ADN, un vecteur recombinant, une cellule modifiée, une souche isolée de coronavirus, un polynucléotide, une protéine ou un peptide, un anticorps ou un fragment d'anticorps, et une puce à protéine tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un réactif de détection et éventuellement de génotypage/sérotypage, d'un coronavirus associé au SRAS.  The present invention further relates to the use of a product selected from the group consisting of: a pair of primers, a probe, a DNA chip, a recombinant vector, a modified cell, an isolated strain of coronavirus, a polynucleotide, a protein or a peptide, an antibody or an antibody fragment, and a protein chip as defined above, for the preparation of a reagent for detecting and possibly genotyping / serotyping a coronavirus associated with SARS.

Les protéines et les peptides selon l'invention, qui sont aptes à être reconnus et/ou à induire la production d'anticorps spécifiques du coronavirus associé au SRAS, sont utiles pour le diagnostic de l'infection par un tel coronavirus; l'infection est détectée, par une technique appropriée- notamment EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence-, à partir d'un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté.  The proteins and peptides according to the invention, which are capable of being recognized and / or of inducing the production of antibodies specific for SARS-associated coronavirus, are useful for the diagnosis of infection by such a coronavirus; the infection is detected by a suitable technique - in particular EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence-, from a biological sample taken from an individual likely to be infected.

Selon une disposition avantageuse de ladite utilisation, lesdites protéines sont sélectionnées dans le groupe constitué par les protéines S, E, M et/ou N et les peptides tels que définis ci-dessus.  According to an advantageous arrangement of said use, said proteins are selected from the group consisting of the S, E, M and / or N proteins and the peptides as defined above.

Les protéines S, E, M et/ou N et les peptides dérivés de ces protéines tels que définis ci-dessus, par exemple la protéine N, sont utilisées pour le diagnostic indirect d'une infection à coronavirus associé au SRAS (diagnostic sérologique; détection d'anticorps spécifiques du SARS-CoV), notamment par une méthode immunoenzymatique (ELISA).  The S, E, M and / or N proteins and the peptides derived from these proteins as defined above, for example the N protein, are used for the indirect diagnosis of a coronavirus infection associated with SARS (serological diagnosis; detection of SARS-CoV specific antibodies), in particular by an immunoenzymatic method (ELISA).

Les anticorps et les fragments d'anticorps selon l'invention, notamment ceux dirigés contre les protéines S, E, M et/ou N et les peptides dérivés tels que définis ci-dessus, sont utiles pour le diagnostic direct d'une infection à coro- navirus associé au SRAS; la détection de protéine(s) du SARS-CoV est réalisée par une technique appropriée, notamment EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence à partir d'un échantillon biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté.  The antibodies and the antibody fragments according to the invention, in particular those directed against the proteins S, E, M and / or N and the peptides derived as defined above, are useful for the direct diagnosis of a human infection. coronavirus associated with SARS; the detection of SARS-CoV protein (s) is carried out by an appropriate technique, in particular EIA, ELISA, RIA, immunofluorescence from a biological sample taken from an individual susceptible to infection.

La présente invention a également pour objet une méthode de détec- tion d'un coronavirus associé au SRAS, à partir d'un échantillon biologique, Iaquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins: (a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps, une protéine, un peptide ou bien une puce ou un filtre à protéine ou à peptide tels que définis ci-dessus, et (b) la révélation par tout moyen approprié des complexes antigène- anticorps formés en (a), par exemple par EIA, ELISA, RIA, ou par immunofluorescence.  The present invention also relates to a method for detecting a coronavirus associated with SARS, from a biological sample, which method is characterized in that it comprises at least: (a) contacting said biological sample with at least one antibody or an antibody fragment, a protein, a peptide or a protein or peptide chip or filter as defined above, and (b) revealing by any appropriate means the complexes antigen-antibodies formed in (a), for example by EIA, ELISA, RIA, or by immunofluorescence.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé l'étape (a) comprend: (al) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un premier anticorps ou un fragment d'anticorps qui est fixé sur un support approprié, notamment une microplaque, (a2) le lavage de la phase solide, et (a3) l'addition d'au moins un second anticorps ou un fragment 20 d'anticorps, différent du premier, ledit anticorps ou fragment d'anticorps étant éventuellement marqué de façon appropriée.  According to an advantageous embodiment of said method, step (a) comprises: (a1) bringing said biological sample into contact with at least a first antibody or an antibody fragment which is fixed on a suitable support, in particular a microplate, (a2) washing the solid phase, and (a3) adding at least a second antibody or an antibody fragment, different from the first, said antibody or antibody fragment being optionally labeled with appropriate.

Ce procédé qui permet de capturer les particules virales présentes dans l'échantillon biologique est également dénommé procédé d'immunocapture. Par exemple: - l'étape (al) est réalisée avec au moins un premier anticorps monoclonal ou polyclonal ou un fragment de ceux-ci, dirigé contre la protéine S, M, et/ou E, et/ou un peptide correspondant à l'ectodomaine de l'une de ces protéines (peptides M2-14 ou E1-12) l'étape (a3) est réalisée avec au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre un autre épitope de la même protéine ou de préférence contre une autre protéine, de manière préférée contre une protéine interne telle que la nucléo- protéine N ou l'endodomaine de la protéine E ou M, de manière encore plus préférée il s'agit d'anticorps ou de fragments d'anticorps dirigés contre la protéine N qui est très abondante dans la particule virale; lorsqu'un anticorps ou un fragment d'anticorps dirigé contre une protéine interne (N) ou contre l'endodomaine des protéines E ou M est utilisé, le dit anticorps est incubé en présence de détergent, comme le Tween 20 par exemple, à des concentrations de l'ordre de 0,1 %.  This method which makes it possible to capture the viral particles present in the biological sample is also called the immunocapture method. For example: step (a1) is carried out with at least a first monoclonal or polyclonal antibody or a fragment thereof, directed against the protein S, M, and / or E, and / or a peptide corresponding to the ectodomain of one of these proteins (peptides M2-14 or E1-12) step (a3) is carried out with at least one antibody or an antibody fragment directed against another epitope of the same protein or preferably against another protein, preferably against an internal protein such as nucleoprotein N or the endodomain of the protein E or M, even more preferably it is antibodies or fragments of antibodies directed against the N protein which is very abundant in the viral particle; when an antibody or an antibody fragment directed against an internal protein (N) or against the endodomain of the E or M proteins is used, said antibody is incubated in the presence of detergent, such as Tween 20 for example, with concentrations of the order of 0.1%.

- l'étape (b) de révélation des complexes antigène-anticorps formés est réalisée, soit directement à l'aide d'un second anticorps marqué par exemple avec de la biotine ou une enzyme appropriée telle que la peroxydase ou la phosphatase alcaline, soit indirectement à l'aide d'un sérum anti-immunoglobulines marqué comme ci-dessus. Les complexes ainsi formés sont révélés à l'aide d'un substrat approprié.  step (b) of revealing the antigen-antibody complexes formed is carried out, either directly with the aid of a second antibody labeled for example with biotin or an appropriate enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase, or indirectly using an anti-immunoglobulin serum labeled as above. The complexes thus formed are revealed using a suitable substrate.

La présente invention a en outre pour objet un kit de détection d'un coronavirus associé au SRAS, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par: une paire d'amorces, une sonde, une puce à ADN ou à ARN, un vecteur recombinant, une cellule modifiée, une souche isolée de coronavirus, un polynucléotide, une protéine ou un peptide, un anticorps, et une puce à protéine tels que définis ci-dessus.  The present invention further relates to a kit for detecting a coronavirus associated with SARS, characterized in that it comprises at least one reagent selected from the group consisting of: a pair of primers, a probe, a chip to DNA or RNA, a recombinant vector, a modified cell, an isolated strain of coronavirus, a polynucleotide, a protein or a peptide, an antibody, and a protein chip as defined above.

La présente invention a en outre pour objet, une composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un produit sélectionné 20 dans le groupe constitué par: a) une protéine ou un peptide tels que définis ci-dessus, b) un polynucléotide de type ADN ou ARN ou l'un de ses fragments représentatifs tels que définis ci-dessus, de séquence choisie parmi: (i) la séquence SEQ ID NO: 1 ou son équivalent ARN (ii) la séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence SEQ ID NO: 1, (iii) la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 1 ou de la séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence SEQ ID NO: 1, (iv) la séquence nucléotidique d'un fragment représentatif du polynucléotide tel que défini en (i), (ii) ou (iii), (v) la séquence telle que définie en (i), (ii), (iii) ou (iv), modifiée, et c) un vecteur d'expression recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini en b), et d) une banque d'ADNc telle que définie ci-dessus, ladite composition immunogène étant capable d'induire une immunité humorale ou cellulaire protectrice spécifique du coronavirus associé au SRAS, notamment la production d'un anticorps dirigé contre un épitope spécifique du coronavirus associé au SRAS.  The present invention further relates to an immunogenic composition, characterized in that it comprises at least one product selected from the group consisting of: a) a protein or a peptide as defined above, b) a polynucleotide of DNA or RNA type or one of its representative fragments as defined above, of sequence chosen from: (i) the sequence SEQ ID NO: 1 or its RNA equivalent (ii) the sequence hybridizing under conditions of strong stringency with the sequence SEQ ID NO: 1, (iii) the sequence complementary to the sequence SEQ ID NO: 1 or the hybridizing sequence under conditions of high stringency with the sequence SEQ ID NO: 1, (iv) the nucleotide sequence a representative fragment of the polynucleotide as defined in (i), (ii) or (iii), (v) the sequence as defined in (i), (ii), (iii) or (iv), modified, and c) a recombinant expression vector comprising a polynucleotide as defined in b), and d) a b cDNA ance as defined above, said immunogenic composition being capable of inducing protective humoral or cellular immunity specific for SARS-associated coronavirus, including the production of an antibody directed against a SARS-associated coronavirus-specific epitope.

Les protéines et les peptides tels que définis ci-dessus, notamment les protéines S, M, E et/ou N et les peptides dérivés, ainsi que les molécules d'acide nucléique (ADN ou ARN) codant lesdites protéines ou lesdits peptides, sont de bons candidats vaccin et peuvent être utilisées dans des compositions immunogènes pour la production d'un vaccin contre le coronavirus associé au SRAS.  The proteins and peptides as defined above, in particular the S, M, E and / or N proteins and the derived peptides, as well as the nucleic acid molecules (DNA or RNA) coding for said proteins or said peptides, are good vaccine candidates and can be used in immunogenic compositions for the production of a vaccine against SARS-associated coronavirus.

Selon un mode de réalisation avantageux des compositions selon l'invention, elles contiennent en outre, au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement des substances porteuses et/ou des adjuvants.  According to an advantageous embodiment of the compositions according to the invention, they also contain at least one pharmaceutically acceptable vehicle and optionally carrier substances and / or adjuvants.

Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.  The pharmaceutically acceptable vehicles, the carrier substances and the adjuvants are those conventionally used.

Les adjuvants sont avantageusement choisis dans le groupe constitué par des émulsions huileuses, de la saponine, des substances minérales, des extraits 20 bactériens, de l'hydroxyde d'alumine et le squalène.  The adjuvants are advantageously selected from the group consisting of oily emulsions, saponin, mineral substances, bacterial extracts, alumina hydroxide and squalene.

Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par des liposomes unilamellaires, des liposomes multilamellaires, des micelles de saponine ou des microsphères solides de nature saccharidique ou aurifère.  The carrier substances are advantageously selected from the group consisting of unilamellar liposomes, multilamellar liposomes, saponin micelles or solid microspheres of saccharide or auriferous nature.

Les compositions selon l'invention, sont administrées par voie générale, notamment intramusculaire ou sous-cutanée ou bien par voie locale notamment nasale (aérosol).  The compositions according to the invention are administered by the general route, in particular intramuscularly or subcutaneously, or by the local route, in particular the nasal route (aerosol).

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine ou d'un peptide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75 pour former un complexe immun avec un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus associé au SRAS.  The present invention also relates to the use of an isolated or purified protein or peptide having a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24 , 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 and 75 to form an immune complex with an antibody specifically directed against a SARS-associated coronavirus epitope.

La présente invention a également pour objet un complexe immun formé d'une protéine ou d'un peptide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75, et d'un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus associé au SRAS.  The subject of the present invention is also an immune complex formed of an isolated or purified protein or peptide having a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 and 75, and an antibody directed specifically against a SARS-associated coronavirus epitope.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine ou d'un peptide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75 pour induire la production d'un anticorps capable de reconnaître spécifiquement un épitope du coronavirus associé au SRAS.  The present invention also relates to the use of an isolated or purified protein or peptide having a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24 , 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 and 75 to induce the production of an antibody capable of specifically recognizing a SARS-associated coronavirus epitope.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 8, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 31, 36 et 38 pour induire la production d'un anticorps dirigé contre la protéine codée par ledit polynucléotide et capable de reconnaître spécifiquement un épitope du coronavirus associé au SRAS Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du polynucléotide représentant le génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589, et des fragments d'ADNc dérivés objets de la présente invention, ainsi qu'au Tableau I présentant la liste des séquences: Tableau I: Liste des séquences numéro Séquence Position de Numéro de d'identification l'ADNc en dépôt à la CNCM référence à du plasmide Genbank correspondant AY274119.3 SEQ ID NO: 1 génome de la - - souche issue du prélèvement SEQ ID NO: 2 ORF-S* 21406-25348 - SEQ ID NO: 3 Protéine S - SEQ ID NO: 4 ORF-S** 21406-25348 1-3059 SEQ ID NO: 5 fragment Sa 2140623454 1-3020 SEQ ID NO: 6 fragment Sb 23322-25348 I-3019 SEQ ID NO: 7 ORF-3+ORF-4* 25110-26244 - SEQ ID NO: 8 ORF-3+ORF-4** 25110-26244 I-3126 SEQ ID NO: 9 ORF3 - - SEQ ID NO: 10 Protéine ORF-3 - - SEQ ID NO: 11 ORF4 - - SEQ ID NO: 12 Protéine ORF-4 - - SEQ ID NO: 13 ORF-E* 26082-26413 SEQ ID NO: 14 Protéine E - - SEQ ID NO: 15 ORF-E** 26082-26413 I-3046 SEQ ID NO: 16 ORF-M* 26330-27098 - SEQ ID NO: 17 Protéine M - - SEQ ID NO: 18 ORF-M** 26330-27098 I-3047 SEQ ID NO: 19 ORF7 à 11* 26977-28218 - SEQ ID NO: 20 ORF7 à 11** 26977-28218 1-3125 SEQ ID NO: 21 ORF7 - - SEQ ID NO: 22 Protéine ORF7 - - SEQ ID NO: 23 ORF8 - - SEQ ID NO: 24 Protéine ORF8 - SEQ ID NO: 25 ORF9 - - SEQ ID NO: 26 Protéine ORF9 - - SEQ ID NO: 27 ORF10 - - SEQ ID NO: 28 Protéine ORF10 - - SEQ ID NO: 29 ORF11 - - SEQ ID NO: 30 Protéine ORF11 - - SEQ ID NO: 31 OrF1 ab 265-21485 - SEQ ID NO: 32 ORF13 28130-28426 - SEQ ID NO: 33 Protéine ORF13 - - SEQ ID NO: 34 ORF14 - - SEQ ID NO: 35 Protéine ORF14 28583-28795 - SEQ ID NO: 36 ORF-N* 28054-29430 SEQ ID NO: 37 Protéine N - - SEQ ID NO: 38 ORF-N** 28054-29430 1-3048 SEQ ID NO: 39 5'non-codante** 1- 204 I-3124 SEQ ID NO: 40 3'non-codante** 28933-29727 I-3123 SEQ ID NO: 41 ORFlab 30-500 - Fragment LO SEQ ID NO: 42 Fragment LI 211-2260 - SEQ ID NO: 43 Fragment L2 2136-4187 - SEQ ID NO: 44 Fragment L3 3892-5344 - SEQ ID NO: 45 Fragment L4b 4932-6043 - SEQ ID NO: 46 Fragment L4 5305-7318 - SEQ ID NO: 47 Fragment L5 7275-9176 - SEQ ID NO: 48 Fragment L6 9032-11086 - SEQ ID NO: 49 Fragment L7 10298-12982 SEQ ID NO: 50 Fragment L8 12815-14854 - SEQ ID NO: 51 Fragment L9 14745-16646 - SEQ ID NO: 52 Fragment L10 16514-18590 - SEQ ID NO: 53 Fragment L11 18500-20602 - _ SEQ ID NO: 54 Fragment L12 20319-22224 - SEQ ID NO: 55 Amorce N sens - - SEQ ID NO: 56 Amorce N - - antisens SEQ ID NO: 57 Amorce Sc sens - - SEQ ID NO: 58 Amorce SL sens - - SEQ ID NO: 59 Amorce Sc e t SL - - antisens SEQ ID NO: 60 Amorce sens 28507-28522 série 1 SEQ ID NO: 61 Amorce antisens 28774-28759 série 1 SEQ ID NO: 62 Amorce sens 28375-28390 - série 2 SEQ ID NO: 63 Amorce antisens 28702-28687 - série 2 SEQ ID NO: 64 Sonde 1/série 1 28561-28586 - SEQ ID NO: 65 Sonde 2/série 1 28588-28608 - SEQ ID NO: 66 Sonde 1/série 2 28541-28563 - SEQ ID NO: 67 Sonde 2/série 2 28565-28589 - SEQ ID NO: 68 Amorce ancre 14T SEQ ID NO: 69 Peptide M2-14 - - SEQ ID NO: 70 Peptide E1-12 - - SEQ ID NO: 71 Peptide E53-76 - - SEQ ID NO: 72 5'non-codante* 1-204 - SEQ ID NO: 73 3'non-codante* 28933-29727 - SEQ ID NO: 74 Protéine ORF1 a - - SEQ ID NO: 75 Protéine ORF1b - - SEQ ID NO:76-139 Amorces * produit d'amplification PCR (amplicon) ** insert cloné dans le plasmide déposé à la CNCM ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 illustre l'analyse par Western-blot de l'expression in vitro des protéines recombinantes N, Sc et SL à partir des vecteurs d'expression pIVEX. Piste 1: pIV2.3N. Piste 2: pIV2.3Sc. Piste 3: pW2.3SL. Piste 4: pIV2.4N. Piste 5: pIV2.4S1 ou pIV2.4Sc. Piste 6: pIV2.4SL. L'expression de la protéine GFP exprimée à partir du même vecteur est utilisée comme contrôle.  The present invention also relates to the use of an isolated or purified polynucleotide having a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 8, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 31, 36 and 38 for inducing the production of an antibody directed against the protein encoded by said polynucleotide and capable of specifically recognizing a SARS-associated coronavirus epitope. In addition to the foregoing, the invention further comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the polynucleotide representing the genome of the SARS-CoV strain from the sample numbered 031589, and fragments of cDNA derivatives Objects of the present invention, as well as in Table I showing the sequence listing: Table I: Sequence list Sequence number Sequence number of the identification number cDNA in depot at CNCM refers to the corresponding Genbank plasmid AY274119.3 SEQ ID NO: 1 genome of the - strain resulting from the sampling SEQ ID NO: 2 ORF-S * 21406-25348 - SEQ ID NO: 3 Protein S - SEQ ID NO: 4 ORF-S ** 21406-25348 1-3059 SEQ ID NO: 5 fragment Sa 2140623454 1-3020 SEQ ID NO: 6 fragment Sb 23322-25348 I-3019 SEQ ID NO: 7 ORF-3 + ORF-4 * 25110- 26244 - SEQ ID NO: 8 ORF-3 + ORF-4 ** 25110-26244 I-3126 SEQ ID NO: 9 ORF3 - - SEQ ID NO: 10 ORF-3 Protein - - SEQ ID NO: 11 ORF4 - - SEQ ID NO: 12 ORF-4 Protein - - SEQ ID NO: 13 ORF-E * 26082-26413 SEQ ID NO: 14 Protein E - - SEQ ID NO: 15 ORF-E ** 26082-26413 I-3046 SEQ ID NO : 16 ORF-M * 26330-27098 - SEQ ID NO: 17 Protein M - - SEQ ID NO: 18 ORF-M ** 26330-27098 I-3047 SEQ ID NO: 19 ORF7 to 11 * 26977-28218 - SEQ ID NO: 20 ORF7 to 11 ** 26977-28218 1-3125 SEQ ID NO: 21 ORF7 - - SEQ ID NO: 22 ORF7 Protein - - SEQ ID NO: 23 ORF8 - - SEQ ID NO: 24 ORF8 Protein - SEQ ID NO : 25 ORF9 - - SEQ ID NO: 26 ORF9 protein - - SEQ ID NO: 27 ORF10 - - SEQ ID NO: 28 Protein ORF10 - - SEQ ID NO: 29 ORF11 - - SEQ ID NO: 30 Protein ORF11 - - SEQ ID NO: 31 OrF1 ab 265-21485 - SEQ ID NO: 32 ORF13 28130-28426 - SEQ ID NO : 33 ORF13 Protein - - SEQ ID NO: 34 ORF14 - - SEQ ID NO: 35 ORF14 Protein 28583-28795 - SEQ ID NO: 36 ORF-N * 28054-29430 SEQ ID NO: 37 N Protein - - SEQ ID NO: ORF-N ** 28054-29430 1-3048 SEQ ID NO: 39 5'non-coding ** 1- 204 I-3124 SEQ ID NO: 40 3'non-coding ** 28933-29727 I-3123 SEQ ID NO: 41 ORFlab 30-500 - Fragment LO SEQ ID NO: 42 Fragment LI 211-2260 - SEQ ID NO: 43 Fragment L2 2136-4187 - SEQ ID NO: 44 Fragment L3 3892-5344 - SEQ ID NO: 45 Fragment L4b 4932-6043 - SEQ ID NO: 46 Fragment L4 5305-7318 - SEQ ID NO: 47 Fragment L5 7275-9176 - SEQ ID NO: 48 Fragment L6 9032-11086 - SEQ ID NO: 49 Fragment L7 10298-12982 SEQ ID NO : 50 Fragment L8 12815-14854 - SEQ ID NO: 51 Fragment L9 14745-16646 - SEQ ID NO: 52 Fragment L10 16514-18590 - SEQ ID NO: 53 Fragment L11 18500-20602 - _ SEQ ID NO: 54 Fragment L12 203 19-22224 - SEQ ID NO: 55 Primer N sense - - SEQ ID NO: 56 Primer N - - antisense SEQ ID NO: 57 Primer Sc sense - - SEQ ID NO: 58 Primer SL sense - - SEQ ID NO: 59 Primer Sc and SL - - antisense SEQ ID NO: 60 Primer sense 28507-28522 series 1 SEQ ID NO: 61 Primer antisense 28774-28759 series 1 SEQ ID NO: 62 Primer sense 28375-28390 - series 2 SEQ ID NO: 63 Primer antisense 28702-28687 - Series 2 SEQ ID NO: 64 1 / Series 1 probe 28561-28586 - SEQ ID NO: 65 2 / Series 1 probe 28588-28608 - SEQ ID NO: 66 1 / Series 2 probe 28541-28563 - SEQ ID NO: 67 Probe 2 / series 2 28565-28589 - SEQ ID NO: 68 14T anchor primer SEQ ID NO: 69 M2-14 peptide - - SEQ ID NO: 70 Peptide E1-12 - - SEQ ID NO: 71 Peptide E53- 76 - - SEQ ID NO: 72 5'non-coding * 1-204 - SEQ ID NO: 73 3'non-coding * 28933-29727 - SEQ ID NO: 74 ORF1 protein a - - SEQ ID NO: 75 ORF1b protein - - SEQ ID NO: 76-139 Primers * amplification product PCR (amplicon) ** insert cloned into the plasmid deposited at the CNCM and the accompanying drawings in which: FIG. 1 illustrates the Western-blot analysis of the in vitro expression of the N, Sc and SL recombinant proteins from the pIVEX expression vectors. Lane 1: pIV2.3N. Track 2: pIV2.3Sc. Track 3: pW2.3SL. Lane 4: pIV2.4N. Lane 5: pIV2.4S1 or pIV2.4Sc. Track 6: pIV2.4SL. Expression of the GFP protein expressed from the same vector is used as a control.

- la figure 2 illustre l'analyse par électrophorèse en gel de 10 polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) et coloration au bleu de Coomassie, de l'expression in vivo de la protéine N à partir des vecteurs d'expression pIVEX. La souche d'E.coli BL21(DE3)pDIA17 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants est cultivée à 30 C dans du milieu LB, en présence ou en l'absence d'inducteur (IPTG 1mM). Piste 1: pIV2.3N Piste 2: pIV2.4N.  FIG. 2 illustrates the denaturing polyacrylamide gel electrophoresis analysis (SDS-PAGE) and Coomassie staining, of the in vivo expression of the N protein from the pIVEX expression vectors. The E. coli strain BL21 (DE3) pDIA17 transformed with the recombinant pIVEX vectors is cultured at 30 ° C. in LB medium, in the presence or absence of inducer (1 mM IPTG). Track 1: pIV2.3N Track 2: pIV2.4N.

- la figure 3 illustre l'analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) et coloration au bleu de Coomassie, de l'expression in vivo des polypeptides SL et Sc à partir des vecteurs d'expression pIVEX. La souche d'E.coli BL21(DE3) pDIA17 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants est cultivée à 30 C dansdu milieu LB, en présence ou en l'absence d'inducteur (IPTG 1mM) . Piste 1: pIV2.3Sc Piste 2: pN2.3SL. Piste 3: pIV2.4S1 Piste 4: p12.4SL.  FIG. 3 illustrates the denaturing polyacrylamide gel electrophoresis analysis (SDS-PAGE) and Coomassie blue staining of the in vivo expression of the SL and Sc polypeptides from the pIVEX expression vectors. The E. coli strain BL21 (DE3) pDIA17 transformed with the recombinant pIVEX vectors is cultured at 30 ° C. in LB medium, in the presence or absence of inducer (1 mM IPTG). Track 1: pIV2.3Sc Track 2: pN2.3SL. Track 3: pIV2.4S1 Track 4: p12.4SL.

- la figure 4 illustre l'activité antigénique des protéines N, SL et Sc recombinantes produites dans la souche E. coli BL21(DE3)pDIA17 transformée par les vecteurs pIVEX recombinants. A: électrophorèse (SDS- PAGE) des lysats bacté- riens.B et C: Western blot avec les sérums, provenant d'un même patient infecté par le SARS-CoV, prélevés respectivement 8 jours (B: sérum M12) et 29 jours-(C: sérum M13) après le début des symptômes du SRAS. Piste 1: pIV2.3N. Piste 2: pIV2.4N. Piste 3: pW2.3Sc. Piste 4: pIV2.4 Si. Piste 5: pIV2.3SL. Piste 6: pIV2.4SL - la figure 5 illustre la purification sur colonne Ni-NTA agarose de la protéine N recombinante produite dans la souche E. coli BL21(DE3)pDIA17 à partir du vecteur pIV2.3N. Piste 1: Extrait bactérien total. Piste 2: Extrait soluble. Piste 3: Extrait insoluble. Piste 4: Extrait déposé sur la colonne Ni-NTA. Piste 5: protéines non-retenues. Piste 6: Fractions du pic 1. Piste 7: Fractions du pic 2.  FIG. 4 illustrates the antigenic activity of the recombinant N, SL and Sc proteins produced in E. coli strain BL21 (DE3) pDIA17 transformed by the recombinant pIVEX vectors. A: electrophoresis (SDS-PAGE) bacterial lysates.B and C: Western blot with sera, from the same patient infected with SARS-CoV, taken respectively 8 days (B: M12 serum) and 29 days - (C: M13 serum) after the onset of SARS symptoms. Lane 1: pIV2.3N. Track 2: pIV2.4N. Lane 3: pW2.3Sc. Lane 4: pIV2.4 Si. Lane 5: pIV2.3SL. Lane 6: pIV2.4SL FIG. 5 illustrates the purification on a Ni-NTA agarose column of the recombinant N protein produced in E. coli strain BL21 (DE3) pDIA17 from the pIV2.3N vector. Lane 1: Total bacterial extract. Lane 2: Soluble extract. Lane 3: Insoluble extract. Lane 4: Extract deposited on the Ni-NTA column. Lane 5: Non-retained proteins. Track 6: Peak 1 Fractions. Track 7: Peak 2 Fractions.

- la figure 6 illustre la purification de la protéine Sc recombinante à partir des corps d'inclusions produits dans la souche E. coli BL21(DE3) pDIA17 transformée par le pIV2.4S1.A. Traitement au Triton X-100 (2%) : Piste 1: Extrait bactérien total. Piste 2: Extrait soluble. Piste 3: Extrait insoluble. Piste 4: Surnageant après traitement au Triton X-100 (2 %). Pistes 5 et 6: Culot après traitement au Triton X-100 (2 %).B: Traitement à l'urée 4M, 5M, 6M et 7M des extraits solubles et insolubies.  FIG. 6 illustrates the purification of the recombinant Sc protein from the inclusion bodies produced in the E. coli strain BL21 (DE3) pDIA17 transformed with pIV2.4S1.A. Treatment with Triton X-100 (2%): Track 1: Total bacterial extract. Lane 2: Soluble extract. Lane 3: Insoluble extract. Lane 4: Supernatant after treatment with Triton X-100 (2%). Lane 5 and 6: Pellet after treatment with Triton X-100 (2%) B: Treatment with 4M, 5M, 6M and 7M urea of soluble and insolubic extracts.

- la figure 7 représente l'immunoempreinte réalisée à l'aide d'un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV et d'un sérum de patient atteint de pneumopathie atypique.  FIG. 7 represents the immunoblotting carried out using a lysate of cells infected with SARS-CoV and a serum of a patient suffering from atypical pneumonitis.

- la figure 8 représente des immunoempreintes réalisées à l'aide d'un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV et d'immunsérums de lapins spécifiques de la nucléoprotéine N (A) et de la protéine de spicule S (B). I.S. : sérum immun. p.i.: sérum pré-immun. L'immunsérum anti-N a été utilisé au 1/50000 et l' irnmunsérum anti-S au 1/10000.  FIG. 8 represents immunoblots made using a lysate of cells infected with SARS-CoV and antisera of rabbits specific for nucleoprotein N (A) and spike protein S (B). I. S. : immune serum p.i .: pre-immune serum. Anti-N antiserum was used at 1/50000 and anti-S serum antiserum at 1/10000.

- la figure 9 illustre la réactivité en ELISA des sérums polyclonaux monospécifiques de lapin dirigés contre la protéine N ou le fragment court de la protéine S (Sc), vis-à-vis des protéines recombinantes correspondantes utilisées pour l'immunisation. A: lapins P13097, P13081, et P13031 immunisés avec la protéine N recombinante purifié. B: lapins P11135, P13042, et P14001 immunisés avec une préparation de corps d'inclusions correspondants au fragment court de la protéine S (Sc). I.S. : sérum immun. p.i. : sérum pré-immun.  FIG. 9 illustrates the ELISA reactivity of the monospecific rabbit polyclonal sera directed against the N protein or the short fragment of the S (Sc) protein, with respect to the corresponding recombinant proteins used for the immunization. A: rabbits P13097, P13081, and P13031 immunized with purified recombinant N protein. B: rabbits P11135, P13042, and P14001 immunized with an inclusion body preparation corresponding to the short fragment of the protein S (Sc). I. S. : immune serum p.i .: pre-immune serum.

- la figure 10 illustre la réactivité en ELISA de la protéine N recombinante purifiée, vis-à-vis de sérum de patients atteints de pneumonie atypique causée par le SARS-CoV. Figure 10a: plaques ELISA préparés avec la protéine N à la concentration de 4 gg/ml et 2 pg/ml. Figure 10b: plaque ELISA préparée avec la protéine N à la concentration de 1 gg/ml. Les sérums désignés A, B, D, E, F, G, H correspondent à ceux du Tableau IV.  FIG. 10 illustrates the ELISA reactivity of the purified recombinant N protein with respect to serum of patients suffering from atypical pneumonia caused by SARS-CoV. Figure 10a: ELISA plates prepared with N protein at a concentration of 4 μg / ml and 2 μg / ml. Figure 10b: ELISA plate prepared with N protein at the concentration of 1 gg / ml. Serums designated A, B, D, E, F, G, H correspond to those of Table IV.

- la figure 11 illustre l'amplification par RT-PCR de quantités décroissantes d'ARN synthétique du gène N du SARS-CoV (107 à 1 copie), à l'aide des couples d'amorces n 1 (N/+/28507,N/-/28774) (A) et n 2 (N/+ /28375,N/-/28702) (B). T: amplification réalisée en l'absence d'ARN. MW: marqueur d'ADN.  FIG. 11 illustrates the amplification by RT-PCR of decreasing amounts of synthetic SARS-CoV N gene RNA (107 to 1 copy), using primer pairs n 1 (N / + / 28507). , N / - / 28774) (A) and n 2 (N / + / 28375, N / - / 28702) (B). T: amplification carried out in the absence of RNA. MW: DNA marker.

- la figure 12 illustre l'amplification par RT-PCR en temps réel d'ARN synthétique du gène N du SARS-CoV: des quantités décroissantes d'ARN synthétique en répliquat (repli. ; pistes 16 à 29) ainsi que de l'ARN viral dilué au 1/20x104 (piste 32) ont été amplifiés par RT-PCR en temps réel à l'aide du kit "Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes" et des couples d'amorces et de sondes de la série n 2, dans les conditions décrites à l'exemple 7.  FIG. 12 illustrates the real-time RT-PCR amplification of synthetic SARS-CoV N gene RNA: decreasing amounts of synthetic RNA in replicate (folds, lanes 16 to 29) as well as 1 / 20x104 diluted viral RNA (lane 32) were amplified by RT-PCR in real time using the "Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes" kit and n 2 series of primers and probes under the conditions described in Example 7.

- la figurel3 (figure 13.1 à 13.70) représente la carte de restriction de la séquence SEQ ID NO: 1 correspondant à l'équivalent ADN du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589.  FIG. 13.1 to 13.70 represents the restriction map of the sequence SEQ ID NO: 1 corresponding to the DNA equivalent of the genome of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under the number 031589.

II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.  It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they in no way constitute a limitation.

Exemple 1: Clonage et séquençage du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589 L'ARN de la souche de SARS-CoV a été extrait à partir du prélè-10 vement de lavage bronchoalvéolaire répertorié sous le numéro 031589, effectué sur un patient de l'hôpital français de Hanoi (Vietnam) atteint de SRAS.  EXAMPLE 1 Cloning and Sequencing of the Genome of the SARS-CoV Strain Derived from the Collection Listed Under the Number 031589 RNA from the strain of SARS-CoV was extracted from the bronchoalveolar lavage sample under the number 031589, carried out on a patient of the French hospital of Hanoi (Vietnam) with SARS.

L'ARN isolé a été utilisé comme matrice pour amplifier les ADNc correspondant aux différents cadres ouverts de lecture du génome (ORF la, ORFIb, ORF-S, ORF-E, ORF-M, ORF-N (incluant les ORF-13 et ORF-14), ORF3, ORF4, ORF7 à ORF 11), et aux extrémités 5' et 3' non-codantes. Les séquences des amorces et des sondes utilisées pour l'amplification/détection ont été définies d'après la séquence nucléotidique disponible du SARS-CoV.  Isolated RNA was used as a template to amplify the cDNAs corresponding to the different open reading frames of the genome (ORF 1a, ORF1b, ORF-5, ORF-E, ORF-M, ORF-N (including ORF-13 and ORF-14), ORF3, ORF4, ORF7 to ORF11), and the 5 'and 3' non-coding ends. The sequences of primers and probes used for amplification / detection were defined according to the available nucleotide sequence of SARS-CoV.

Dans ce qui suit les amorces et les sondes sont identifiées par: la lettre S, suivie d'une lettre qui indique la région correspondante du génome (L pour l'extrémité S'incluant ORFla et ORFIb; S, M et N pour les ORF-S, ORF-M, ORF-N, SE et MN pour les régions intergéniques correspondantes), puis éventuellement de Fn, Rn, avec n inclus entre 1 et 6 correspondant aux amorces utilisées pour la PCR nichée ou imbriquée (paire FI + R1 pour la première amplification, paire F2 + R2 pour la deuxième amplification, etc...), puis de /+/ ou / / correspondant à une amorce sens ou antisens et enfin des positions des amorces en référence à la séquence Genbank AY27411.3; pour les amorces S et N sens et antisens et les autres amorces sens uniquement, lorsqu'une seule position est indiquée elle correspond à celle de l'extrémité 5' d'une sonde ou d'une amorce d'environ 20 bases; pour les amorces antisens autres que les amorces S et N, lorsqu'une seule position est indiquée elle correspond à celle de l'extrémité 3' d'une sonde ou d'une amorce d'environ 20 bases.  In what follows the primers and probes are identified by: the letter S, followed by a letter that indicates the corresponding region of the genome (L for the end including ORFla and ORFIb; S, M and N for the ORFs -S, ORF-M, ORF-N, SE and MN for the corresponding intergenic regions), then optionally Fn, Rn, with n included between 1 and 6 corresponding to the primers used for the nested or nested PCR (pair FI + R1 for the first amplification, pair F2 + R2 for the second amplification, etc.), then / + / or / / corresponding to a sense or antisense primer and finally positions of the primers with reference to the sequence Genbank AY27411.3 ; for S and N sense and antisense primers and other sense primers only, when a single position is indicated it corresponds to that of the 5 'end of a probe or primer of about 20 bases; for antisense primers other than S and N primers, when a single position is indicated it corresponds to that of the 3 'end of a probe or primer of about 20 bases.

Les produits d'amplifications ainsi générés ont été séquencés à l'aide d'amorces spécifiques afin de déterminer la séquence complète du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589. Ces produits d'amplification, à l'exception de ceux correspondant aux ORFIa et ORFlb, ont ensuite été clonés dans des vecteurs d'expression afin de produire les protéines virales correspondantes et les anticorps dirigés contre ces protéines, notamment par immunisation à base d'ADN.  The amplification products thus generated were sequenced using specific primers in order to determine the complete genome sequence of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under the number 031589. These amplification products, at the the exception of those corresponding to ORFIa and ORF1b, were then cloned into expression vectors in order to produce the corresponding viral proteins and the antibodies directed against these proteins, in particular by DNA-based immunization.

1. Extraction des ARN Les ARN ont été extraits à l'aide du kit Qlamp viral RNA extraction mini (QIAGEN) en suivant les recommandations du fabricant. De manière plus précise: 140 il du prélèvement et 560 l de tampon AVL ont été mélangés vigoureu- sement pendant 15 secondes, incubés 10 min à température ambiante puis centrifugés brièvement à vitesse maximale. 560 l d'éthanol à 100% ont été ajoutés au surnageant et le mélange ainsi obtenu a été agité très vigoureusement pendant 15 sec. 630 l du mélange ont ensuite été déposés sur la colonne.  1. RNA extraction The RNAs were extracted using the Qlamp viral RNA mini extraction kit (QIAGEN) following the manufacturer's recommendations. More precisely: 140 μl of the sample and 560 μl of AVL buffer were mixed vigorously for 15 seconds, incubated for 10 minutes at room temperature and then briefly centrifuged at maximum speed. 560 l of 100% ethanol was added to the supernatant and the resulting mixture was stirred very vigorously for 15 sec. 630 l of the mixture was then deposited on the column.

La colonne a été placée sur un tube de 2 ml, centrifugée 1 min à 8000 rpm, puis le reste du mélange précédent a été déposé sur la même colonne, centrifugé à nouveau, 1 min à 8000 rpm et la colonne a été transférée sur un tube de 2 ml propre. Ensuite, 500 l de tampon AW1 ont été ajoutés sur la colonne, puis la colonne a été centrifugée 1 min à 8000 rpm et l'éluat a été éliminé. 500 pl de tampon AW2 ont été ajoutés sur la colonne qui a ensuite été centrifugée 3 min à 14000 rpm et transférée sur un tube de 1,5 ml. Enfin, 60 l de tampon AVE ont été ajoutés sur la colonne qui a été incubée 1 à 2 min à température ambiante puis centrifugée 1 min à 8000 rpm. L'éluat correspondant à l'ARN purifié a été récupéré et congelé à -20 C.  The column was placed on a 2 ml tube, centrifuged for 1 min at 8000 rpm, then the rest of the previous mixture was deposited on the same column, centrifuged again, 1 min at 8000 rpm and the column was transferred to a 2 ml tube clean. Then, 500 μl of AW1 buffer was added to the column, then the column was centrifuged for 1 min at 8000 rpm and the eluate was removed. 500 μl of AW2 buffer was added to the column which was then centrifuged for 3 min at 14,000 rpm and transferred to a 1.5 ml tube. Finally, 60 l of AVE buffer was added to the column which was incubated for 1 to 2 min at room temperature and then centrifuged for 1 min at 8000 rpm. The eluate corresponding to the purified RNA was recovered and frozen at -20 ° C.

2. Amplification, séquençage et clonage des ADNc 2.1) ADNc codant pour la protéine S Les ARN extraits à partir du prélèvement ont été soumis à une transcription inverse à l'aide d'oligonucléotides hexamériques de séquence aléatoire (pdN6), afin de produire des fragments d'ADNc.  2. Amplification, sequencing and cloning of cDNAs 2.1) cDNA encoding protein S The RNAs extracted from the sample were reverse transcribed using random sequence hexameric oligonucleotides (pdN6) to produce cDNA fragments.

La séquence codant pour la glycoprotéine S du SARS-CoV a été amplifiée sous la forme de deux fragments d'ADN chevauchants: fragment 5' (SRAS-Sa, SEQ ID NO:5) et fragment 3'(SRAS-Sb, SEQ ID NO:6), en réalisant deux amplifications successives à l'aide d'amorces imbriquées. Les amplicons ainsi obtenus 2862974 30 ont été séquencés, clonés dans le vecteur plasmidique PCR 2.1-TOPOTM (IN VITROGEN), puis la séquence des ADNc clonés a été déterminée.  The sequence encoding S-glycoprotein of SARS-CoV was amplified as two overlapping DNA fragments: 5 'fragment (SARS-Sa, SEQ ID NO: 5) and 3' fragment (SARS-Sb, SEQ ID NO: 6), performing two successive amplifications using nested primers. The amplicons thus obtained 2862974 were sequenced, cloned into the plasmid vector PCR 2.1-TOPOTM (IN VITROGEN), and the sequence of the cloned cDNAs was determined.

a)clonage et séquençage des fragments Sa et Sb al) synthèse de I'ADNç Le mélange réactionnel contenant: ARN (5 l) , H2O ppi (3,5 p1), tampon de transcriptase inverse5X (4 l,), dNTP 5 mM (2 l), pdN6 100 ug/ml (4 l), RNasin 40 UI/ul (0,5 l) et transcriptase inverse AMV-RT, 10 UI/ul, PROMEGA (41l) a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: 45 min à 42 C, 15 min à 55 C, 5 min à 95 C, puis l'ADNc obtenu a été maintenu à +4 C.  a) cloning and sequencing fragments Sa and Sb a) synthesis of DNA The reaction mixture containing: RNA (5 l), H2O ppi (3.5 μl), 5X reverse transcriptase buffer (4 μl), 5 mM dNTP (2 l), pdN6 100 ug / ml (4 l), RNasin 40 IU / ul (0.5 l) and AMV-RT reverse transcriptase, 10 IU / ul, PROMEGA (411) was incubated in a thermocycler in the following conditions: 45 min at 42 ° C., 15 min at 55 ° C., 5 min at 95 ° C., then the cDNA obtained was maintained at +4 ° C.

a2) première_amplifiçation PÇR Les extrémités 5' et 3' du gène S ont été amplifiées respectivement avec les paires d'amorces S/F1/+/ 21350-21372 et S/R1/-/ 23518-23498, S/F3/+/ 23258-23277 et S/R3/-/25382-25363. Le mélange réactionnel de 50 Ill contenant: ADNc (2 l), amorces 50 M (0,5 pl), tampon 10 X (5 pl), dNTP 5 mM (2 l), Taq Expand High Fidelity, Roche (0,75 l) et H20 (39, 75 l) a été amplifié dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min a été suivie de 40 cycles comprenant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 30 sec, une étape d'hybridation à 55 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 2 min 30 sec, avec 10 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, puis d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. a3) deuxième amplification PCR Les produits de la première amplification PCR (amplicons 5' et 3') ont subi une seconde étape d'amplification PCR (PCR nichée) dans des conditions identiques à celles de la première amplification, avec les paires d'amorces S/F2/+/21406-21426 et S/R2/-/23454-23435, et S/F4/+ /23322-23341 et S/R4/-/25348-25329, respectivement pour l'amplicon 5' et l'amplicon 3'.  a2) first PCR amplification The 5 'and 3' ends of the S gene were amplified respectively with primer pairs S / F1 / + / 21350-21372 and S / R1 / - / 23518-23498, S / F3 / + / 23258-23277 and S / R3 / - / 25382-25363. The 50 μl reaction mixture containing: cDNA (2 μl), 50 M primers (0.5 μl), 10 μ buffer (5 μl), 5 mM dNTP (2 μl), Taq Expand High Fidelity, Roche (0.75 μg). 1) and H 2 O (39.75 l) was amplified in a thermal cycler under the following conditions: an initial denaturation step at 94 ° C. for 2 min was followed by 40 cycles comprising: a denaturation step at 94 ° C. for 30 min. dry, a hybridization step at 55 ° C. for 30 sec and then an extension step at 72 ° C. for 2 min 30 sec, with 10 sec of additional elongation at each cycle, followed by a final step of elongation at 72 ° C. C for 5 min. a3) second PCR amplification The products of the first PCR amplification (5 'and 3' amplicons) underwent a second PCR amplification step (nested PCR) under conditions identical to those of the first amplification, with the primer pairs S / F2 / + / 21406-21426 and S / R2 / - / 23454-23435, and S / F4 / + / 23322-23341 and S / R4 / - / 25348-25329 respectively for the 5 'amplicon and the 'amplicon 3'.

a4)_ çlonage_ et séquençage des_fraznents a_et_Sb Les amplicons Sa (extrémité 5') et Sb (extrémité 3') ainsi obtenus ont été purifiés à l'aide du kit QlAquick PCR purification (QIAGEN), en suivant les recommandations du fabricant, puis ils ont été clonés dans le vecteur PCR2.1-TOPO (kit Invitrogen), pour donner les plasmides dénommés SRAS-S1 et SRAS-S2.  The amplicons Sa (5 'end) and Sb (3' end) thus obtained were purified using the QlAquick PCR purification kit (QIAGEN), following the manufacturer's recommendations, and then they were purified using the QlAquick PCR purification kit (QIAGEN), following the manufacturer's recommendations. were cloned into the PCR2.1-TOPO vector (Invitrogen kit), to give the plasmids called SARS-S1 and SARS-S2.

L'ADN des clones Sa et Sb a été isolé puis l'insert correspondant a été séquencé à l'aide du Kit Big Dye, Applied Biosystem et des amorces universelles M13 forward et M13 reverse, ainsi que des amorces: S/S/+ /21867, S/S/+/22353, S/S/+/22811, S/S/+/23754, S/S/+/24207, SIS/+/24699, S/S/+/24348, S/SI-124209, SIS/-/23630, SISI-/23038, S/S/-/22454, SIS//21815, S/S/-/24784, S/S/+/21556, S/S/+/23130 et S/S/+/24465, en suivant les instructions du fabricant; les séquences des fragments Sa et Sb ainsi obtenues correspondent aux séquences SEQ ID NO:5 et SEQ ID NO:6 dans la liste de séquences jointe en annexe.  The DNA of clones Sa and Sb was isolated then the corresponding insert was sequenced using the Big Dye Kit, Applied Biosystem and universal primers M13 forward and M13 reverse, as well as primers: S / S / + / 21867, S / S / + / 22353, S / S / + / 22811, S / S / + / 23754, S / S / + / 24207, SIS / + / 24699, S / S / + / 24348, S / SI-124209, SIS / - / 23630, SISI- / 23038, S / S / - / 22454, SIS // 21815, S / S / - / 24784, S / S / + / 21556, S / S / + / 23130 and S / S / + / 24465, following the manufacturer's instructions; the sequences of fragments Sa and Sb thus obtained correspond to the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 in the attached sequence listing.

Le plasmide, dénommé SARS-S 1 a été déposé sous le n I-3020, le 12 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient un fragment 5' de la séquence du gène S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci- dessus, lequel fragment dénommé Sa correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 23454 (SEQ ID NO:5), en référence à la séquence Genbank AY274119.3 Tor2.  The plasmid, called SARS-S 1, was deposited under the No. I-3020, on May 12, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains a 5 'fragment of the S gene sequence of the SARS-CoV strain resulting from the sample indexed under the number 031589, as defined above, which fragment designated Sa corresponding to the nucleotides of the positions 21406 to 23454 (SEQ ID NO: 5), referring to Genbank sequence AY274119.3 Tor2.

Le plasmide, dénommé TOP10F'-SARS-S2 a été déposé sous le n I-3019, le 12 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient un fragment 3'de la séquence du gène S de la souche de SARS-CoV issue du prélève- ment répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, lequel fragment dénommé Sb correspondant aux nucléotides des positions 23322 à 25348 (SEQ ID NO: 6), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.  The plasmid, called TOP10F'-SARS-S2 was deposited under the I-3019, on May 12, 2003, at the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains a fragment 3 'of the S gene sequence of the strain of SARS-CoV resulting from the sample listed under No. 031589, as defined above, which fragment called Sb corresponding to the nucleotides of positions 23322 to 25348 ( SEQ ID NO: 6), with reference to the Genbank sequence of access AY274119.3.

b) clonage et séquençage de LADNc complet (clone SRAS-S de 4 kb) L'ADNc S complet a été obtenu à partir des clones SARS-S1 et 25 SARS-S2 précités, de la façon suivante: 1) une réaction d'amplification PCR a été réalisée sur un clone SARS-S2 en présence de l'amorce S/R4/-/25348-25329 précitée et de l'amorce S/S/+ /24696-24715: un amplicon de 633 bp a été obtenu, 2) une autre réaction d'amplification PCR a été réalisée sur un autre 30 clone SARS-S2, en présence des amorces S/F4/+/23322-23341 précitée et S/S/-/24803-24784: un amplicon de 1481 pb a été obtenu, La réaction d'amplification a été réalisée dans les conditions telles que définies cidessus pour l'amplification des fragments Sa et Sb, à l'exception que 30 cycles d'amplifications comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec et une étape d'élongation à 72 C pendant 2 min 30 sec ont été effectués.  b) Cloning and sequencing of complete cDNA (4kb SARAS-S clone) The complete S cDNA was obtained from the above SARS-S1 and SARS-S2 clones, as follows: PCR amplification was carried out on a SARS-S2 clone in the presence of the abovementioned S / R4 / - / 25348-25329 primer and the S / S / + / 24696-24715 primer: a 633 bp amplicon was obtained. 2) another PCR amplification reaction was performed on another SARS-S2 clone, in the presence of the abovementioned primers S / F4 / + / 23322-23341 and S / S / - / 24803-24784: an amplicon of 1481 bp was obtained. The amplification reaction was carried out under the conditions as defined above for the amplification of fragments Sa and Sb, except that 30 amplification cycles comprising a denaturation step at 94 ° C. 20 sec and an elongation step at 72 C for 2 min 30 sec were performed.

3) les 2 amplicons (633 pb et 1481 pb) ont été purifiés dans les conditions telles que définies ci-dessus pour les fragments Sa et Sb.  3) the 2 amplicons (633 bp and 1481 bp) were purified under the conditions as defined above for the fragments Sa and Sb.

4) une autre réaction d'amplification PCR à l'aide des amorces S/F4/+ /23322-23341 et S/R4/-/25348-25329 précitées, a été réalisée sur les amplicons purifiés obtenus en 3). La réaction d'amplification a été réalisée dans les conditions telles que définies ci-dessus pour l'amplification des fragments Sa et Sb, à l'exception que 30 cycles d'amplifications ont été effectués.  4) Another PCR amplification reaction using the primers S / F4 / + / 23322-23341 and S / R4 / - / 25348-25329 above, was carried out on the purified amplicons obtained in 3). The amplification reaction was carried out under the conditions as defined above for the amplification of fragments Sa and Sb, with the exception that 30 cycles of amplifications were carried out.

L'amplicon de 2026 pb ainsi obtenu a été purifié, cloné dans le vecteur PCR2.1-TOPO puis séquencé comme ci-dessus, à l'aide des amorces telles que définies ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. Le clone ainsi obtenu a été dénommé clone 3'.  The 2026 bp amplicon thus obtained was purified, cloned into the PCR2.1-TOPO vector and then sequenced as above, using the primers as defined above for the Sa and Sb fragments. The clone thus obtained was called clone 3 '.

5) Le clone SARS-SI précédemment obtenu et le clone 3'ont été digérés par EcoR I, les bandes d'environ 2kb ainsi obtenues ont été purifiées sur gel puis amplifiées par PCR avec les amorces S/F2/+/21406-21426 et S/R4//25348-25329 précitées. La réaction d'amplification a été réalisée dans les conditions telles que définies ci-dessus pour l'amplification des fragments Sa et Sb, à l'exception que 30 cycles d'amplifications ont été effectués. L'amplicon d'environ 4 kb a été purifié et séquencé. Il a ensuite été cloné dans le vecteur PCR2.1-TOPO pour donner le plasmide, dénommé SARS-S, et l'insert contenu dans ce plasmide a été séquencé comme ci-dessus, à l'aide des amorces telles que définies ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. Les séquences d'ADNc de l'insert et de l'amplicon codant pour la protéine S, correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 2 dans la liste de séquences jointe en annexe, elles codent pour la protéine S (SEQ ID NO: 3).  5) The SARS-SI clone previously obtained and the clone 3 'were digested with EcoR I, the bands of approximately 2 kb thus obtained were purified on gel and then amplified by PCR with primers S / F 2 / + / 21406-21426 and S / R4 / 25348-25329 supra. The amplification reaction was carried out under the conditions as defined above for the amplification of fragments Sa and Sb, with the exception that 30 cycles of amplifications were carried out. The amplicon of about 4 kb was purified and sequenced. It was then cloned into the PCR2.1-TOPO vector to give the plasmid, called SARS-S, and the insert contained in this plasmid was sequenced as above, using the primers as defined above. above for fragments Sa and Sb. The cDNA sequences of the insert and of the amplicon encoding the S protein correspond respectively to the sequences SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 2 in the attached sequence listing, they encode the protein S (SEQ ID NO: 3).

La séquence de l'amplicon correspondant à l'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 présente les deux mutations suivantes par rapport aux séquences correspondantes de respective- ment les isolats Tor2 et Urbani, les positions des mutations étant indiquées en référence à la séquence complète du génome de l'isolat Tor2 (Genbank AY274119.3) : - g/t en position 23220; le codon alanine (gct) en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S de Tor2 est remplacé par un codon sérine (tct), - c/t en position 24872: cette mutation ne modifie pas la séquence en acides aminés de la protéine S, et Le plasmide, dénommé SARS-S, a été déposé sous le n I-3059, le 20 juin 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 21406 à 25348 (SEQ ID NO:4), en référence à la séquence Genbank AY274119. 3.  The sequence of the amplicon corresponding to the cDNA coding for the S protein of the SARS-CoV strain obtained from the sample no. 031589 has the following two mutations with respect to the corresponding sequences of respectively the isolates Tor2 and Urbani, the positions mutations being indicated with reference to the complete genome sequence of the Tor2 isolate (Genbank AY274119.3): - g / t at position 23220; the alanine codon (gct) at position 577 of the amino acid sequence of the Tor2 protein S is replaced by a serine codon (tct), - c / t at position 24872: this mutation does not modify the amino acid sequence of the S protein, and the plasmid, called SARS-S, was deposited under the n I-3059, on June 20, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA sequence coding for the S protein of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under 031589, which sequence corresponding to the nucleotides of the positions 21406 to 25348 (SEQ ID NO: 4), with reference to the Genbank sequence AY274119. 3.

2.2) ADNc codant pour les protéines M et E Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse, associée, lors de la même étape (kit Titan One Step RT-PCR , Roche), à une réaction d'amplification par PCR, à l'aide des couples d'amorces: - S/E/F1/+/26051-26070 et S/E/R1/-/26455-26436 pour amplifier l'ORF-E, et - S/M/F1/+/26225-26244 et S/M/Rl/-/27148-27129 pour amplifier l'ORF-M.  2.2) cDNAs Encoding M and E Proteins RNAs from sampling 031589, extracted as above, were subjected to an associated reverse transcription, during the same step (Titan One Step RT-PCR kit, Roche), to a PCR amplification reaction, using primer pairs: - S / E / F1 / + / 26051-26070 and S / E / R1 / - / 26455-26436 to amplify the ORF-E and S / M / F1 / + / 26225-26244 and S / M / R1 / - / 27148-27129 for amplifying the ORF-M.

Un premier mélange réactionnel contenant: 8,6 l d'H2Oppi, 1 l de dNTP (5mM), 0,2 l de chacune des amorces (50 M), 1,25 l de DIT (100mM) et 0, 25 l de RNAsin (40UUgl) a été combiné avec un deuxième mélange réactionnel contenant: 1 l d'ARN, 7 l d'H2Oppi, 5 l de tampon de RTPCR 5X et 0,5 pl de mélange d'enzyme et les mélanges combinés ont été incubés dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: 30 min à 42 C, 10 min à 55 C, 2 min à 94 C suivi de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 10 sec, une étape d'hybridation à 55 C pendant 30 sec et une étape d'élongation à 68 C pendant 45 sec, avec 3 sec d'incrément par cycle et enfin une étape d'élongation terminale à 68 C pendant 7 min. Les produits d'amplification ainsi obtenus (amplicons M et E) ont subi une deuxième amplification PCR (PCR nichée) en utilisant le kit Expand High-Fi , Roche), à l'aide des couples d'amorces: SIE/F2/+/26082-26101 et S/EIR2/-/26413-26394 pour l'amplicon E, et S/M/F21+/26330-26350 et S/M/R2/-127098-27078 pour l'amplicon M. Le mélange réactionnel contenant: 2 pl du produit de la première PCR, 39,25 pl d'H2Oppi, 5 pl de tampon 10X contenant du MgC12, 2 pl de dNTP (5mM), 0, 5111 de chacune des amorces (50 M) et 0,75 1 de mélange d'enzyme a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: une étape de dénaturation à 94 C pendant 2 min a été suivie de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 60 C pendant 30 sec et une étape d'élongation à 72 C pendant 45 sec, avec 3 sec d'incrément par cycle, et enfin une étape d'élongation terminale à 72 C pendant 7 min. Les produits d'amplification obtenus correspondant aux ADNc codant pour les protéines E et M ont été séquencés comme ci-dessus, à l'aide des amorces: SIEIF2/+/26082 et S/E/R2/-/26394, S/M/F2/+/26330, S/M/R2/-/27078 précitées et des amorces S/M/+/26636-26655 et S/M/-/26567-26548. Ils ont ensuite été clonés, comme ci-dessus, pour donner les plasmides dénommés SARS-E et SARS-M. L'ADN de ces clones a ensuite été isolé et séquencé à l'aide des amorces universelles M13 forward et M13 reverse ainsi que des amorces S/M/+/26636 et S/M/-/26548 précitées.  A first reaction mixture containing: 8.6 l of H2Oppi, 1 l of dNTPs (5 mM), 0.2 l of each of the primers (50 M), 1.25 l of DIT (100 mM) and 0.25 l of RNAsin (40UUgl) was combined with a second reaction mixture containing: 1 l RNA, 7 l H2Oppi, 5 l 5X RTPCR buffer and 0.5 μl enzyme mixture and the combined mixtures were incubated in a thermocycler under the following conditions: 30 min at 42 C, 10 min at 55 C, 2 min at 94 C followed by 40 cycles including a denaturation step at 94 C for 10 sec, a hybridization step at 55 C during 30 sec and an elongation step at 68 C for 45 sec, with 3 sec increment per cycle and finally a step of terminal elongation at 68 C for 7 min. The amplification products thus obtained (amplicons M and E) underwent a second PCR amplification (nested PCR) using the Expand High-Fi kit, Roche), using the pairs of primers: SIE / F2 / + / 26082-26101 and S / EIR2 / - / 26413-26394 for amplicon E, and S / M / F21 + / 26330-26350 and S / M / R2 / -127098-27078 for amplicon M. The reaction mixture containing: 2 μl of the product of the first PCR, 39.25 μl of H2Oppi, 5 μl of 10X buffer containing MgCl2, 2 μl of dNTPs (5mM), 0.5111 of each of the primers (50M) and 0, 75 l of enzyme mixture was incubated in a thermocycler under the following conditions: a denaturation step at 94 C for 2 min was followed by 30 cycles including a denaturation step at 94 C for 15 sec, a step of hybridization at 60 C for 30 sec and an elongation step at 72 C for 45 sec, with 3 sec increment per cycle, and finally a terminal elongation step at 72 C for 7 min. The amplification products obtained corresponding to the cDNAs encoding the E and M proteins were sequenced as above, using the primers: SIEIF2 / + / 26082 and S / E / R2 / - / 26394, S / M / F2 / + / 26330, S / M / R2 / - / 27078 and primers S / M / + / 26636-26655 and S / M / - / 26567-26548. They were then cloned, as above, to give the plasmids called SARS-E and SARS-M. The DNA of these clones was then isolated and sequenced with the aid of the universal primers M13 forward and M13 reverse as well as primers S / M / + / 26636 and S / M / - / 26548 mentioned above.

La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc codant pour la protéine E (SEQ ID NO: 13) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani. La séquence de la protéine E de la souche de SARS-CoV 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO: 14 dans la liste de séquences jointe en annexe.  The sequence of the amplicon representing the cDNA coding for the protein E (SEQ ID NO: 13) of the strain SARS-CoV from the sample no. 031589 does not have differences with respect to the corresponding sequences of the isolates AY274119.3- Tor2 and AY278741-Urbani. The sequence of the protein E of the SARS-CoV strain 031589 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 14 in the attached sequence listing.

Le plasmide, dénommé SARS-E a été déposé sous le n I-3046, le 28 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26082 à 26413 (SEQ ID NO:15), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.  The plasmid, called SARS-E was deposited under n I-3046, on May 28, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA sequence coding for the E protein of the SARS-CoV strain resulting from the sample indexed under the number 031589, as defined above, which sequence corresponding to the nucleotides of the positions 26082 to 26413 (SEQ ID NO: 15), with reference to Genbank sequence access AY274119.3.

La séquence de l'amplicon représentant 1ADNc codant pour la M (SEQ ID NO:16) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport à la séquence correspondante de l'isolat AY274119.3-Tor2. En revanche, en position 26857, l'isolat AY278741-Urbani comporte un c et la séquence de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 un t. Cette mutation aboutit à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante: en position 154, une proline (AY278741-Urbani) est changée en sérine dans la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589. La séquence de la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO:17 dans la liste de séquences jointe en annexe.  The sequence of the amplicon representing 1 cDNA coding for the M (SEQ ID NO: 16) of the strain SARS-CoV from the sample no. 031589 does not have any differences with respect to the corresponding sequence of the isolate AY274119.3- Tor2. On the other hand, in position 26857, isolate AY278741-Urbani contains a c and the sequence of the strain of SARS-CoV resulting from the sample listed under No. 031589 a t. This mutation results in a modification of the amino acid sequence of the corresponding protein: in position 154, a proline (AY278741-Urbani) is changed to serine in the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under the number 031589. The sequence of the M protein of the SARS-CoV strain resulting from the sample indexed under 031589 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 17 in the attached sequence listing.

Le plasmide, dénommé SARS-M a été déposé sous le n I-3047, le 28 mai 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc codant pour la protéine M de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus; laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26330 à 27098 (SEQ ID NO:18), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.  The plasmid, called SARS-M was deposited under No. I-3047, on May 28, 2003, from the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA sequence coding for the M protein of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under the number 031589, as defined above; which sequence corresponds to the nucleotides of the positions 26330 to 27098 (SEQ ID NO: 18), with reference to the Genbank sequence of accession AY274119.3.

2.3) ADNc correspondant aux ORF3, ORF4, ORF7 à ORF11 La même stratégie d'amplification, de clonage et de séquençage a été utilisée pour obtenir les fragments d'ADNc correspondant respectivement aux ORF suivantes: ORF 3, ORF4, ORF7, ORF8, ORF9, ORF10 et ORF11. Les couples d'amorces utilisées pour la première amplification sont: - ORF3 et ORF4: S/SE/F1/+/25069-25088 et S/SE/R1/-/26300-26281 - ORF7 à ORF11: S/MN/F1/+/26898-26917 et S/MN/Rl/-/28287-28266 Les couples d'amorces utilisées pour la deuxième amplification sont: - ORF3 et ORF4: S/SEIF2/+/25110-25129 et S/SE/R2/-/26244-26225 - ORF7 à ORF11: S/MN/F2/+/26977-26996 et S/MN/R2/-/28218-28199 Les conditions de la première amplification (RT-PCR) sont les suivantes: 45 min à 42 C, 10 min à 55 C, 2 min à 94 C suivi de 40 cycles compre- nant une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 58 C pendant 30 sec et une étape d'élongation à 68 C pendant 1 min, avec 5 sec d'incrément par cycle et enfin une étape d'élongation terminale à 68 C pendant 7 min. Les conditions de la PCR nichée sont les suivantes: une étape de dénaturation à 94 C pendant 2 min a été suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec, une étape d'hybridation à 58 C pendant 30 sec et une étape d'élongation à 72 C pendant 50 sec, avec 4 sec d'incrément par cycle et enfin une étape d'élongation terminale à 72 C pendant 7 min. Les produits d'amplification obtenus correspondant aux ADNc contenant respectivement les ORF3 et 4 et les ORF7 à 11 ont été séquencés à l'aide des amorces: S/SE/+/25363, SISE/+/25835, S/SEI-125494, SISE/-/25875, SIMNI+/27839, S/MNI+/27409, SIMN/-/27836 S/MN/-/27799 et clonés comme ci- dessus pour les autres ORF, pour donner les plasmides dénommés SARS-SE et SARS-MN. L'ADN de ces clones a été isolé et séquencé à l'aide de ces mêmes amorces et des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens.  2.3) cDNA corresponding to ORF3, ORF4, ORF7 to ORF11 The same amplification, cloning and sequencing strategy was used to obtain the cDNA fragments respectively corresponding to the following ORFs: ORF3, ORF4, ORF7, ORF8, ORF9 , ORF10 and ORF11. The pairs of primers used for the first amplification are: - ORF3 and ORF4: S / SE / F1 / + / 25069-25088 and S / SE / R1 / - / 26300-26281 - ORF7 to ORF11: S / MN / F1 / + / 26898-26917 and S / MN / R1 / - / 28287-28266 The primer pairs used for the second amplification are: - ORF3 and ORF4: S / SEIF2 / + / 25110-25129 and S / SE / R2 / - / 26244-26225 - ORF7 to ORF11: S / MN / F2 / + / 26977-26996 and S / MN / R2 / - / 28218-28199 The conditions of the first amplification (RT-PCR) are as follows: min at 42 ° C, 10 min at 55 ° C., 2 min at 94 ° C. followed by 40 cycles including a denaturation step at 94 ° C. for 15 sec, a hybridization step at 58 ° C. for 30 sec and a step of elongation at 68 C for 1 min, with 5 sec of increment per cycle and finally a step of terminal elongation at 68 C for 7 min. The conditions of the nested PCR are as follows: a denaturation step at 94 ° C. for 2 min was followed by 40 cycles comprising a denaturation step at 94 ° C. for 20 sec, a hybridization step at 58 ° C. for 30 sec and an elongation step at 72 C for 50 sec, with 4 sec of increment per cycle and finally a step of terminal elongation at 72 C for 7 min. The amplification products obtained corresponding to the cDNAs respectively containing the ORF3 and 4 and the ORF7 to 11 were sequenced using the primers: S / SE / + / 25363, SISE / + / 25835, S / SEI-125494, SISE / - / 25875, SIMNI + / 27839, S / MNI + / 27409, SIMN / - / 27836 S / MN / - / 27799 and cloned as above for the other ORFs, to give the plasmids called SARS-SE and SARS- MN. The DNA of these clones was isolated and sequenced using these same primers and the universal primers M13 sense and M13 antisense.

La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc de la région contenant les ORF 3 et 4 (SEQ ID NO:7) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 comporte une différence nucléotidique par rapport à la séquence correspondante de l'isolat AY274119-Tor2. Cette mutation en position 25298 aboutit à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante (ORF 3): en position 11, une arginine (AY274119- Tor2) est changée en glycine dans la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589. En revanche, aucune mutation n'a été identifiée par rapport à la séquence correspondante de l'isolat AY278741-Urbani. Les séquences des ORF 3 et 4 la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO:10 et 12 dans la liste de séquences jointe en annexe.  The sequence of the amplicon representing the cDNA of the region containing the ORFs 3 and 4 (SEQ ID NO: 7) of the strain of SARS-CoV resulting from the sample 031589 has a nucleotide difference with respect to the corresponding sequence of the isolate AY274119-Tor2. This mutation in position 25298 results in a modification of the amino acid sequence of the corresponding protein (ORF 3): in position 11, an arginine (AY274119-Tor2) is changed to glycine in the strain of SARS-CoV resulting from sample n 031589. In contrast, no mutation was identified with respect to the corresponding sequence of isolate AY278741-Urbani. The sequences of the ORFs 3 and 4 the SARS-CoV strain resulting from the sampling No. 031589 respectively correspond to the sequences SEQ ID NO: 10 and 12 in the attached sequence listing.

Le plasmide, dénommé SARS-SE a été déposé sous le n I-3126, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc correspondant à la région située entre l'ORF-S et l'ORF-E et chevauchant l'ORF-E de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle région correspondant aux nucléotides des positions 25110 à 26244 (SEQ ID NO:8), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc correspondant à la région contenant les ORF7 à ORF11 (SEQ ID NO:19) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119-Tor2 et AY278741-Urbani. Les séquences des ORF7 à Il de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28 et 30 dans la liste de séquences jointe en annexe.  The plasmid, called SARS-SE was deposited under No. I-3126, on November 13, 2003, at the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA corresponding to the region between the ORF-S and the ORF-E and overlapping the ORF-E of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under the number 031589, as defined above. above, which region corresponding to the nucleotides of positions 25110 to 26244 (SEQ ID NO: 8), with reference to the Genbank n access sequence AY274119.3, the amplicon sequence representing the cDNA corresponding to the region containing the ORF7 to ORF11 (SEQ ID NO: 19) of the strain SARS-CoV from the sample no. 031589 does not differ from the corresponding sequences of isolates AY274119-Tor2 and AY278741-Urbani. The ORF7 to II sequences of the strain of SARS-CoV resulting from the sampling No. 031589 respectively correspond to the sequences SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28 and 30 in the attached sequence listing.

Le plasmide dénommé SARS-MN a été déposé sous le n I-3125, le 13 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient la séquence d'ADNc correspondant à la région située entre l'ORF- M et l'ORF-N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 et prélevée à Hanoi, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 26977 à 28218 (SEQ ID NO:20), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.  The plasmid called SARS-MN was deposited under No. I-3125, on November 13, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA sequence corresponding to the region situated between the ORF-M and the ORF-N of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under the number 031589 and taken from Hanoi, as defined above which sequence corresponds to the nucleotides of positions 26977 to 28218 (SEQ ID NO: 20), with reference to the Genbank sequence of accession AY274119.3.

La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc correspondant à la région contenant les ORF7 à ORF11 (SEQ ID NO:19) de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119-Tor2 et AY278741-Urbani. Les séquences des ORF7 à I 1 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28 et 30 dans la liste de séquences jointe en annexe.  The sequence of the amplicon representing the cDNA corresponding to the region containing the ORF7 to ORF11 (SEQ ID NO: 19) of the SARS-CoV strain derived from the sample no. 031589 has no differences with respect to the corresponding sequences of the isolates. AY274119-Tor2 and AY278741-Urbani. The sequences of the ORF7 to I 1 of the SARS-CoV strain resulting from the sampling No. 031589 correspond respectively to the sequences SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28 and 30 in the attached sequence listing.

2.4) ADNc codant pour la protéine N et incluant les ORF13 et ORF14 L'ADNc a été synthétisé et amplifié comme décrit ci-dessus pour les fragments Sa et Sb. De manière plus précise, le mélange réactionnel contenant: 5 il d'ARN, 5 pl d'H20 ppi 4 pl de tampon de reverse transcriptase 5X, 2 pl de dNTP (5 mM), 2 pl d'oligo 20T (511M), 0,5 pl de RNasin (40 UI/ul) et 1, 5 pl de AMV-RT (10 UI/ul Promega) a été incubé dans un thermocycleur dans les conditions suivantes: 45 min à 42 C, 15 min à 55 C, 5 min à 95 C, puis il a été maintenu à +4 C.  2.4) cDNA Encoding N Protein and Including ORF13 and ORF14 The cDNA was synthesized and amplified as described above for fragments Sa and Sb. More specifically, the reaction mixture containing: 5 μl of RNA, 5 μl of H20 ppi 4 μl of 5X reverse transcriptase buffer, 2 μl of dNTP (5 mM), 2 μl of 20T oligo (511M), 0.5 μl of RNasin (40 IU / μl) and 1.5 μl of AMV-RT (10 IU / μl Promega) was incubated in a thermocycler under the following conditions: 45 min at 42 ° C, 15 min at 55 ° C , 5 min at 95 C, then it was maintained at +4 C.

Une première amplification PCR a été réalisée avec la paire d'amorces S/N/F3/+/28023 et S/N/R3/-129480.  A first PCR amplification was carried out with primer pair S / N / F3 / + / 28023 and S / N / R3 / -129480.

Le mélange réactionnel comme ci-dessus pour l'amplification des fragments S1 et S2 a été incubé dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min a été suivie de 40 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec, une étape d'hybridation à 55 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 1 min 30 sec avec 10 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, puis d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. L'amplicon obtenu à la première amplification PCR a subi une seconde étape d'amplification PCR (PCR nichée) avec la paires d'amorce S/N/F41+128054 et S/N/R41-129430 dans des conditions identiques à celles de la première amplification.  The reaction mixture as above for the amplification of the S1 and S2 fragments was incubated in a thermocycler, under the following conditions: an initial denaturation step at 94 ° C. for 2 min was followed by 40 cycles comprising a denaturation step at 94 ° C. for 20 sec, a hybridization step at 55 ° C. for 30 sec and then an extension step at 72 ° C. for 1 min 30 sec with 10 sec of additional elongation at each cycle, followed by a final step of elongation at 72 C for 5 min. The amplicon obtained at the first PCR amplification underwent a second PCR amplification step (nested PCR) with the primer pairs S / N / F41 + 128054 and S / N / R41-129430 under conditions identical to those of the first amplification.

Le produit d'amplification obtenu correspondant à l'ADNc codant pour la protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589a été séquencé à l'aide des amorces: S/N/F4/+/28054, S/NIR41-129430, S/N/+/28468, S/N/+/28918 et SNI-128607 et cloné comme ci-dessus pour les autres ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-N. L'ADN de ces clones a été isolé et séquencé à l'aide des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens, ainsi que des amorces S/N/+/28468, S/N/+/28918 et S/NI-/28607.  The amplification product obtained corresponding to the cDNA coding for the N protein of the strain of SARS-CoV resulting from the sample no. 031589 was sequenced using the primers: S / N / F4 / + / 28054, S / NIR41 -129430, S / N / + / 28468, S / N / + / 28918 and SNI-128607 and cloned as above for the other ORFs, to give the plasmid called SARS-N. The DNA of these clones was isolated and sequenced using the universal primers M13 sense and M13 antisense, as well as primers S / N / + / 28468, S / N / + / 28918 and S / N. / 28607.

La séquence de l'amplicon représentant l'ADNc correspondant à l'ORF-N et incluant les ORF13 et ORF14 (SEQ ID NO:36) de la souche de SARSCoV issue du prélèvement n 031589 ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani. La séquence de la protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO: 37 dans la liste de séquences jointe en annexe.  The sequence of the amplicon representing the cDNA corresponding to the ORF-N and including the ORF13 and ORF14 (SEQ ID NO: 36) of the SARSCoV strain resulting from the sample no. 031589 has no differences with respect to the corresponding sequences. isolates AY274119.3-Tor2 and AY278741-Urbani. The sequence of the N protein of the SARS-CoV strain resulting from the sample no. 031589 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 37 in the attached sequence listing.

Les séquences des ORF13 et 14 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement n 031589 correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 32 et 34 dans la liste de séquences jointe en annexe.  The sequences of the ORF13 and 14 of the SARS-CoV strain resulting from the sampling No. 031589 respectively correspond to the sequences SEQ ID NO: 32 and 34 in the attached sequence listing.

Le plasmide dénommé SARS-N a été déposé sous le n I-3048, le 5 juin 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc codant pour la protéine N de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 28054 à 29430 (SEQ ID NO:38), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.  The plasmid called SARS-N was deposited under No. I-3048, on June 5, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA coding for the N protein of the SARS-CoV strain resulting from the sample numbered under 031589, as defined above, which sequence corresponds to the nucleotides of the positions 28054 to 29430 (SEQ ID NO: 38) , with reference to the Genbank sequence of access AY274119.3.

2.5) extrémités 5' et 3' non-codantes a) extrémité 5'non-codante (5'NC) al) Synthèse de l'AD.  2.5) 5 'and 3' non-coding ends a) 5 'non-coding end (5'NC) a1) Synthesis of AD.

Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse dans les conditions suivantes: L'ARN (15 l) et l'amorce S/L/-/443 (3 l à la concentration de 5 m, ont été incubés 10 min à 75 C.  The RNAs from sampling 031589, extracted as above, were subjected to reverse transcription under the following conditions: RNA (15 l) and primer S / L / - / 443 (3 l at the concentration of 5 ml were incubated for 10 minutes at 75 ° C.

Ensuite, du Tampon de transcriptase inverse 5X (6 l, INVITROGEN), des dNTP 10 mM (1 pl), du DTT 0,1M (3 pl) ont été ajoutés et le mélange a été incubé à 50 C pendant 3 min. Enfin la transcriptase inverse (3 p.l de Superscript , INVITROGEN) a été ajoutée au mélange précédent qui a été incubé à 50 C pendant 1h30 puis à 90 C pendant 2 min. L'ADNc ainsi obtenu a été purifié à l'aide du kit QlAquick PCR purification (QIAGEN), selon les recommandations du fabricant.  Then, 5X Reverse Transcriptase Buffer (6 L, INVITROGEN), 10mM dNTPs (1μl), 0.1M DTT (3μl) were added and the mixture was incubated at 50 ° C for 3 min. Finally the reverse transcriptase (3 μl of Superscript, INVITROGEN) was added to the previous mixture which was incubated at 50 ° C. for 1 hour and then at 90 ° C. for 2 minutes. The cDNA thus obtained was purified using the QlAquick PCR purification kit (QIAGEN), according to the manufacturer's recommendations.

b1) Réaction_ à la Terminal Transferase (TdT) L'ADNc (10 pl) est incubé 2 min à 100 C, conservé dans la glace, puis sont ajoutés: H20 (2,5 pl), tampon TdT 5X (4 pl, AMERSHAM), dATP 5mM (2 pl) et TdT (1,5 pl, AMERSHAM). Le mélange ainsi obtenu est incubé 45 min à 37 C puis 2 min à 65 C.  b1) Terminal Transferase (TdT) Reaction The cDNA (10 μl) is incubated for 2 min at 100 ° C., stored in ice, and then added: H 2 O (2.5 μl), 5 × TdT buffer (4 μl, AMERSHAM ), 5mM dATP (2μl) and TdT (1.5μl, AMERSHAM). The mixture thus obtained is incubated for 45 minutes at 37 ° C. and then for 2 minutes at 65 ° C.

Le produit obtenu est amplifié par une première réaction PCR à l'aide des amorces: SIL/-/225-206 et ancre 14T: 5'-AGATGAATTCGGTACCTTTTTTT"TTTTTTT3' (SEQ ID NO:68). Les conditions de l'amplification sont les suivantes: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min est suivie de 10 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C 30 pendant 10 sec, une étape d'hybridation à 45 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 30 sec puis de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 10 sec, une étape d'hybridation à 50 C pendant 30 sec puis 20 une étape d'élongation à 72 C pendant 30 sec, puis d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. Le produit de la première amplification PCR a subi une seconde étape d'amplification à l'aide des amorces: SIL/-1204-185 et ancre 14T précitée dans des conditions identiques à celles de la première amplification. L'amplicon ainsi obtenu a été purifié, séquencé à l'aide de l'amorce S/L/-/182-163 puis il a été cloné comme ci-dessus pour les différentes ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-5'NC. L'ADN de ce clone a été isolé et séquencé à l'aide des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens et de l'amorce S1L/-/182163 précitée.  The product obtained is amplified by a first PCR reaction using primers: SIL / - / 225-206 and anchor 14T: 5'-AGATGAATTCGGTACCTTTTTTT "TTTTTTT3 '(SEQ ID NO: 68) .The conditions of the amplification are the following: an initial denaturation step at 94 ° C. for 2 min is followed by 10 cycles comprising a denaturation step at 94 ° C. for 10 sec, a hybridization step at 45 ° C. for 30 sec and then a step of elongation at 72 C for 30 sec then 30 cycles including a denaturation step at 94 C for 10 sec, a hybridization step at 50 C for 30 sec and then an elongation step at 72 C for 30 sec, then a final elongation step at 72 ° C. for 5 min The product of the first PCR amplification underwent a second amplification step using the primers: SIL / -1204-185 and 14T anchor mentioned above under conditions identical to those of the first amplification, the amplicon thus obtained was purified, sequenced with of primer S / L / - / 182-163 and then cloned as above for the different ORFs, to give the plasmid called SARS-5'NC. The DNA of this clone was isolated and sequenced using the universal primers M13 sense and M13 antisense and primer S1L / - / 182163 supra.

L'amplicon représentant l'ADNc correspondant à l'extrémité 5'NC de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO: 72 dans la liste de séquences jointe en annexe; cette séquence ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani.  The amplicon representing the cDNA corresponding to the 5'NC end of the strain of SARS-CoV resulting from the sample numbered under the number 031589 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 72 in the attached sequence listing; this sequence does not differ from the corresponding sequences of isolates AY274119.3-Tor2 and AY278741-Urbani.

Le plasmide dénommé SARS-5'NC a été déposé sous le n I- 3124, le 7 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; il contient l'ADNc correspondant à l'extrémité 5'non codante du génome de la souche de SARSCoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant aux nucléotides des positions 1 à 204 (SEQ ID NO:39), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3.  The plasmid called SARS-5'NC was deposited under No. I-3124, on November 7, 2003, with the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; it contains the cDNA corresponding to the 5 'non-coding end of the genome of the SARSCoV strain resulting from the sample indexed under the number 031589, as defined above, which sequence corresponding to the nucleotides of the positions 1 to 204 (SEQ ID NO: 39), referring to the Genbank sequence of access AY274119.3.

b) extrémité 3'non-codante (3'NC) al) synthèse de l'ADN_ Les ARN issus du prélèvement 031589, extraits comme ci-dessus, ont été soumis à une transcription inverse, selon le protocole suivant: le mélange réactionnel contenant: ARN (5 l), H20 (5 l), tampon de transcriptase inverse 5X (4 pl), dNTP 5 mM (2 pl), Oligo 20T 5 M (2 pl), RNasin 40 U/ l (0,5 pl) et RT-AMV 10 UI/ pl (1,5 pl, PROMEGA) a été incubé dans un thermocycleur, dans les conditions suivantes: 45 min à 42 C, 15 min à 55 C, 5 min à 95 C, puis il a été maintenu à +4 C.  b) 3'non-coding end (3'NC) a1) synthesis of the DNA The RNAs from the sample 031589, extracted as above, were subjected to reverse transcription, according to the following protocol: the reaction mixture containing : RNA (5 l), H 2 O (5 l), 5X reverse transcriptase buffer (4 μl), 5 mM dNTP (2 μl), Oligo 20T 5 M (2 μl), RNasin 40 U / l (0.5 μl) ) and RT-AMV 10 IU / μl (1.5 μl, PROMEGA) was incubated in a thermocycler under the following conditions: 45 min at 42 ° C., 15 min at 55 ° C., 5 min at 95 ° C., then it was kept at +4 C.

L'ADNc obtenu a été amplifié par une première réaction PCR à l'aide des amorces S/N/+128468-28487 et ancre 14T précitée. Les conditions de l'amplification sont les suivantes: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min est suivie de 10 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec, une étape d'hybridation à 45 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 50 sec puis de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94 C pendant 20 sec, une étape d'hybridation à 50 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 50 sec, puis d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. Le produit de la première amplification PCR a subi une seconde étape d'amplification à l'aide des amorces S/N/+/28933-28952 et ancre I4T précitée, dans des conditions identiques à celles de la première amplification. L'amplicon ainsi obtenu a été purifié, séquencé à l'aide de l'amorce S/N/+/29257-29278 et cloné comme ci-dessus pour les différentes ORF, pour donner le plasmide dénommé SARS-3'NC. L'ADN de ce clone a été isolé et séquencé à l'aide des amorces universelles M13 sens et M13 anti-sens et de l'amorce S/N/+/29257-29278 précitée.  The cDNA obtained was amplified by a first PCR reaction using primers S / N / + 128468-28487 and 14T anchor mentioned above. The conditions of the amplification are as follows: an initial denaturation step at 94 ° C. for 2 min is followed by 10 cycles comprising a denaturation step at 94 ° C. for 20 sec, a hybridization step at 45 ° C. for 30 sec and then a step of elongation at 72 C for 50 sec then 30 cycles comprising a denaturation step at 94 C for 20 sec, a hybridization step at 50 C for 30 sec and then an elongation step at 72 C for 50 sec then a final step of elongation at 72 C for 5 min. The product of the first PCR amplification underwent a second amplification step using primers S / N / + / 28933-28952 and anchor I4T above, under conditions identical to those of the first amplification. The amplicon thus obtained was purified, sequenced with the primer S / N / + / 29257-29278 and cloned as above for the various ORFs, to give the plasmid called SARS-3'NC. The DNA of this clone was isolated and sequenced using the universal primers M13 sense and M13 antisense and primer S / N / + / 29257-29278 supra.

L'amplicon représentant 1ADNc correspondant à l'extrémité 3'NC de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589 correspond à la séquence SEQ ID NO:73 dans la liste de séquences jointe en annexe; cette séquence ne comporte pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats AY274119.3-Tor2 et AY278741-Urbani.  The amplicon representing 1 cDNA corresponding to the 3'NC end of the strain of SARS-CoV resulting from the sample numbered under the number 031589 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 73 in the attached sequence listing; this sequence does not differ from the corresponding sequences of isolates AY274119.3-Tor2 and AY278741-Urbani.

Le plasmide dénommé SARS-3'NC a été déposé sous le n I-3123 le 7 novembre 2003, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15. ; il contient la séquence d'ADNc correspondant à l'extrémité 3'non codante du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, telle que définie ci-dessus, laquelle séquence correspondant à celle située entre le nucléotide en position 28933 à 29727 (SEQ ID NO:40), en référence à la séquence Genbank n d'accès AY274119.3, se termine par une série de nucléotides a.  The plasmid called SARS-3'NC was deposited under the number I-3123 on November 7, 2003, from the National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.; it contains the cDNA sequence corresponding to the 3 'non-coding end of the genome of the strain of SARS-CoV resulting from the sample indexed under 031589, as defined above, which sequence corresponds to that located between the nucleotide in position 28933 to 29727 (SEQ ID NO: 40), referring to Genbank sequence access AY274119.3, ends with a series of nucleotides a.

2.6) ORF1a et ORFlb L'amplification de la région 5' contenant les ORF1a et ORF lb du génome du SARS-CoV issu du prélèvement 031589 a été réalisée en pratiquant des réactions de RT-PCR suivies de PCR nichées selon les mêmes principes que ceux précédemment décrits pour les autres ORF. Les fragments amplifiés sont chevau- chants sur plusieurs dizaines de bases, permettant ainsi la reconstruction informatique de la séquence complète de cette partie du génome. En moyenne, les fragments ampli-fiés sont de deux kilobases.  2.6) ORF1a and ORF1b The amplification of the 5 'region containing the ORF1a and ORF 1b of the SARS-CoV genome resulting from the sampling 031589 was carried out by performing RT-PCR reactions followed by PCRs nested according to the same principles as those previously described for other ORFs. The amplified fragments are overlapped over several tens of bases, thus allowing the computer reconstruction of the complete sequence of this part of the genome. On average, the amplified fragments are two kilobases.

14 fragments chevauchants dénommés LO à L12 ont ainsi été 5 amplifiés à l'aide des amorces suivantes: Tableau II: Amorces utilisées pour l'amplification de la région 5'(ORFla et ORF1b) REGION Amorce sens Amorce antisens Amorce sens Amorce  14 overlapping fragments designated LO to L12 were thus amplified using the following primers: Table II: Primers used for the amplification of the 5 'region (ORF1a and ORF1b) REGION Primer sense Primer antisense Primer sense Primer

AMPLIFIEEAMPLIFIEE

ET RT-PCR RT-PCR PCR nichée antisens PCR SEQUENCEE nichée (ne tient pas compte des amorces) LO SILO/F11+30 SILO/R1/-481 50-480 LI S/L1/F11+147 S/L 1 /RI 1-2336 S/L1/F2/+211 SIL 1 /R2/-2241 231-2240 L2 S/L21F1/+2033 S/L21R11-4192 S/L2/F2/+2136 S/L2/R2/-4168 2156-4167 L3 S/L3bis/F1/+3850 S/L3bis/R1/-5365 S/L3bis/F21+3892 S/L3bis/R2/-5325 3913-5324 L4b S/L4b/F1/+4878 S/L4b/R1/-6061 S/L4b/F2/+4932 S/L4b/R2/-6024 4952-6023 L4 S/L41F11+5272 S/L4/R1/-7392 SIL 41F 21+5305 S/L41R2/-7323 5325-7318 L5 S/L5/F1/+7111 SIL51R 1/-9253 S/1_5/F21+7275 SIL 5/R2/-91 57 7296-9156 L6 S/L6/F1/+8975 S/L6/R11-11151 S/L6/F21+9032 S/L6/R21-11067 9053-11066 L7 S/L7/F1/+10883 S/L7/R1/-13050 S/L7/F2/+10928 S/L7/R2/-12963 10928-12962 L8 S/L8/F11+12690 S/L81R1/-14857 S/L8/F2/+12815 S/1_8/R2/-1 4835 12835-14834 19 S/L9/F1/+14688 SIL9/R1/-16678 S/L9/F2/+14745 S/L9/R2/-16625 14765-16624 L10 S/L10/F1/+16451 S/L10/R1/-18594 S/L10/F2/+16514 S/L10/R21- 18571 16534-18570 L11 S/L111F11+18441 S/L11/R11-20612 SIL11/F2/+18500 S/L 1 1 /R2/-20583 18521-20582 L12 S/L12/F11+20279 S/L12/R1/-22229 S/L12/F2/+20319 SIL 12/R2/-22206 20338-22205.  RT-PCR and RT-PCR PCR nested PCR reverse SEQUENCEE nested (not including primers) LO SILO / F11 + 30 SILO / R1 / -481 50-480 LI S / L1 / F11 + 147 S / L 1 / RI 1-2336 S / L1 / F2 / + 211 SIL 1 / R2 / -2241 231-2240 L2 S / L21F1 / + 2033 S / L21R11-4192 S / L2 / F2 / + 2136 S / L2 / R2 / -4168 2156 -4167 L3 S / L3bis / F1 / + 3850 S / L3bis / R1 / -5365 S / L3bis / F21 + 3892 S / L3bis / R2 / -5325 3913-5324 L4b S / L4b / F1 / + 4878 S / L4b / R1 / -6061 S / L4b / F2 / + 4932 S / L4b / R2 / -6024 4952-6023 L4 S / L41F11 + 5272 S / L4 / R1 / -7392 SIL 41F 21 + 5305 S / L41R2 / -7323 5325- 7318 L5 S / L5 / F1 / + 7111 SIL51R 1 / -9253 S / 1_5 / F21 + 7275 SIL 5 / R2 / -91 57 7296-9156 L6 S / L6 / F1 / + 8975 S / L6 / R11-11151 S / L6 / F21 + 9032 S / L6 / R21-11067 9053-11066 L7 S / L7 / F1 / + 10883 S / L7 / R1 / -13050 S / L7 / F2 / + 10928 S / L7 / R2 / -12963 10928 -12962 L8 S / L8 / F11 + 12690 S / L81R1 / -14857 S / L8 / F2 / + 12815 S / 1_8 / R2 / -1 4835 12835-14834 19 S / L9 / F1 / + 14688 SIL9 / R1 / - 16678 S / L9 / F2 / + 14745 S / L9 / R2 / -16625 14765-16624 L10 S / L10 / F1 / + 16451 S / L10 / R1 / -18594 S / L10 / F2 / + 16514 S / L10 / R21 - 18571 16534-18570 L11 S / L111F11 + 18441 S / L11 / R11-20612 SIL11 / F2 / + 18500 S / L 1 1 / R2 / -20583 18521-20582 L12 S / L12 / F11 + 20279 S / L12 / R1 / -22229 S / L12 / F2 / + 20319 SIL 12 / R2 / -22206 20338-22205.

Tous les fragments ont été amplifiés dans les conditions suivantes, excepté le fragment LO qui a été amplifié comme décrit ci-dessus pour l'ORF-M: - RT-PCR: 30 min à 42 C, 15 min à 55 C, 2 min à 94 C, puis l'ADNc obtenu est amplifié dans les conditions suivantes: 40 cycles comprenant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 58 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 68 C pendant 1 min 30 sec, avec 5 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, puis une étape finale d'élongation à 68 C pendant 7 min. - PCR nichée: une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min est suivie de 35 cycles comprenant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 60 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 1 min 30 sec, avec 5 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, puis une étape finale d'élongation à 72 C pendant 7 min. Les produits d'amplifications ont été séquencés à l'aide des amorces définies dans le Tableau III ci-après: Tableau III: Amorces utilisées pour le séquençage de la région 5' (ORF1a et ORF1b) 10 Noms Séquences (SEQ ID NO: 76 à 139) SIL31+14932 5'-CCACACACAGCTTGTGGATA- 3' S/L41+16401 5'-CCGAAGTTGTAG G CAATGTC-3' SIL41+16964 5'- TTTGGTGCTCCTTCTTATTG-3' S/L41-/6817 5'-CCGGCATCCAAACATAATTT-3' S/L5/- 17633 5'-TGGTCAGTAGGGTTGATTGG-3' S/L5/-/8127 5'-CATCCTTTGTGTCAACATCG-3' S/L5/-18633 5'-GTCACGAGTGACACCATCCT-3' S/L51+17839 5'ATGCGACGAGTCTGCTTCTA-3' SIL51+18785 5'-TTCATAGTGCCTGGCTTACC-3' S/L51+ 18255 5'-ATCTTGGCGCATGTATTGAC-3' SIL61-19422 5'-TGCATTAGCAGCAACAACAT-3' SIL61-19966 5'-TCTGCAGAACAGCAGAAGTG-3' S/L61-110542 5'CCTGTGCAGTTTGTCTGTCA-3' S/L6/+110677 5'-CCTTGTGGCAATGAAGTACA-3' S/L61+ 110106 5'-ATGTCATTTGCACAGCAGAA-3' S/L6/+/9571 5'-CTTCAATG GTTTG CCATGTT3' S/L7/-111271 5'-TGCGAGCTGTCATGAGAATA-3' SIL7/-/11801 5'AACCGAGAGCAGTACCACAG-3' S/L7/-112383 5'-TTTGGCTGCTGTAGTCAATG-3' SIL71+ /12640 5'-CTACGACAGATGTCCTGTGC-3' SIL71+/12088 5'-GAGCAGGCTGTAGCTAATGG-3' S/L7/+/11551 5'-TTAGGCTATTGTTGCTGCTG-3' SIL 81-1 31 60 5'CAGACAACATGAAGCACCAC-3' S/L8/-1l3704 5'-CGCTGACGTGATATATGTGG-3' S/L8/l4284 5'-TGCACAATGAAGGATACACC-3' S/L8/+/14453 5'-ACATAGCTCGCGTCTCAGTT-3' S/L8/+113968 5'-GGCATTGTAGGCGTACTGAC-3' S/L8/+/13401 5'-GTTTGCG GTGTAAGTGCAG-3' S/L9/-15098 5'-TAGTGGCGGCTATTGACTTC-3' S/L9/-15677 5'CTAAACCTTGAGCCGCATAG-3' S/L9/-16247 5'-CATGGTCATAGCAGCACTTG-3' S/L9/+ 16323 5'-CCAGGTTGTGATGTCACTGAT-3' S/L9/+15858 5'-CCTTACCCAGATCCATCAAG-3' S/L9/+15288 5'-CGCAAACATAACACTTGCTG-3' S/L10/-16914 5'AGTGTTGGGTACAAGCCAGT-3' S/L10/-17466 5'-GTTCCAAGGAACATGTCTGG-3' S/L10/18022 5'-AGGTGCCTGTGTAGGATGAA-3' S/L10/+18245 5'-GGGCTGTCATGCAACTAGAG-3' S/L10/+17663 5'-TCTTACACGCAATCCTGCTT-3' Les séquences des fragments LO à L12 de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le n 031589, correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO:41 à SEQ ID NO:54 dans la liste de séquences jointe en annexe. Parmi ces séquences, seule celle correspondant aux fragments L5 comporte une différence nucléotidique par rapport à la séquence correspondante de l'isolat AY278741-Urbani. Cette mutation tic en position 7919 aboutit à une modification de la séquence en acides aminés de la protéine correspondante, codée par l'ORF la: en position 2552, une valine (codon gtt; AY278741) est changée en alanine (codon gct) dans la souche de SARSCoV 031589. En revanche, aucune mutation n'a été identifiée par rapport à la séquence correspondante de l'isolat AY2741I9.3-Urbani. Les autres fragments ne présentent pas de différences par rapport aux séquences correspondantes des isolats Tor2 et Urbani.  All fragments were amplified under the following conditions except the LO fragment which was amplified as described above for ORF-M: RT-PCR: 30 min at 42 C, 15 min at 55 C, 2 min at 94 ° C., then the cDNA obtained is amplified under the following conditions: 40 cycles comprising: a denaturation step at 94 ° C. for 15 sec, a hybridization step at 58 ° C. for 30 sec and then an extension step at 68 ° C. C for 1 min 30 sec, with a further 5 sec of elongation at each cycle, then a final step of elongation at 68 C for 7 min. Nested PCR: an initial denaturation step at 94 ° C. for 2 min is followed by 35 cycles comprising: a denaturation step at 94 ° C. for 15 sec, a hybridization step at 60 ° C. for 30 sec and then an elongation step at 72 ° C. for 1 min 30 sec, with a further 5 sec of elongation at each cycle, then a final elongation step at 72 ° C. for 7 min. The amplification products were sequenced using the primers defined in Table III below: Table III: Primers used for sequencing the 5 'region (ORF1a and ORF1b) 10 Sequence Names (SEQ ID NO: 76 at 139) SIL31 + 14932 5'-CCACACACAGCTTGTGGATA-3 'S / L41 + 16401 5'-CCGAAGTTGTAG G CAATGTC-3' SIL41 + 16964 5'-TTTGGTGCTCCTTCTTATTG-3 'S / L41- / 6817 5'-CCGGCATCCAAACATAATTT-3' S / L5 / - 17633 5'-TGGTCAGTAGGGTTGATTGG-3 'S / L5 / - / 8127 5'-CATCCTTTGTGTCAACATCG-3' S / L5 / -18633 5'-GTCACGAGTGACACCATCCT-3 'S / L51 + 17839 5'ATGCGACGAGTCTGCTTCTA-3 SIL51 + 18785 5'-TTCATAGTGCCTGGCTTACC-3 'S / L51 + 18255 5'-ATCTTGGCGCATGTATTGAC-3' SIL61-19422 5'-TGCATTAGCAGCAACAACAT-3 'SIL61-19966 5'-TCTGCAGAACAGCAGAAGTG-3' S / L61-110542 5'CCTGTGCAGTTTGTCTGTCA 3'S / L6 / + 110677 5'-CCTTGTGGCAATGAAGTACA-3 'S / L61 + 110106 5'-ATGTCATTTGCACAGCAGAA-3' S / L6 / + / 9571 5'-CTTCAATG GTTTG CCATGTT3 'S / L7 / -111271 5'- TGCGAGCTGTCATGAGAATA-3 'SIL7 / - / 11801 5'AACCGAGAGCAGTACCACAG-3' S / L7 / -112383 5'-TTTGGCTGCTGTAGTCAATG-3 'SIL7 1+ / 12640 5'-CTACGACAGATGTCCTGTGC-3 'SIL71 + / 12088 5'-GAGCAGGCTGTAGCTAATGG-3' S / L7 / + / 11551 5'-TTAGGCTATTGTTGCTGCTG-3 'SIL 81-1 31 60 5'CAGACAACATGAAGCACCAC-3' S / L8 Embedded image 5'-CGCTGACGTGATATATGTGG-3 'S / L8 / 14284 5'-TGCACAATGAAGGATACACC-3' S / L8 / + / 14453 5'-ACATAGCTCGCGTCTCAGTT-3 'S / L8 / + 113968 5'-GGCATTGTAGGCGTACTGAC-3' S / L8 / + / 13401 5'-GTTTGCG GTGTAAGTGCAG-3 'S / L9 / -15098 5'-TAGTGGCGGCTATTGACTTC-3' S / L9 / -15677 5'CTAAACCTTGAGCCGCATAG-3 'S / L9 / -16247 5'-CATGGTCATAGCAGCACTTG- 3 'S / L9 / + 16323 5'-CCAGGTTGTGATGTCACTGAT-3' S / L9 / + 15858 5'-CCTTACCCAGATCCATCAAG-3 'S / L9 / + 15288 5'-CGCAAACATAACACTTGCTG-3' S / L10 / -16914 5'AGTGTTGGGTACAAGCCAGT 5'-GTTCCAAGGAACATGTCTGG-3 'S / L10 / 18022 5'-AGGTGCCTGTGTAGGATGAA-3' S / L10 / + 18245 5'-GGGCTGTCATGCAACTAGAG-3 'S / L10 / + 17663 5'- TCTTACACGCAATCCTGCTT-3 'The sequences of the LO to L12 fragments of the SARS-CoV strain resulting from the sample indexed under the number 031589 correspond respectively to the sequences SEQ ID NO: 41 to SEQ ID NO: 54 in the list of s annexed consequences. Among these sequences, only that corresponding to the L5 fragments has a nucleotide difference with respect to the corresponding sequence of the AY278741-Urbani isolate. This tic mutation at position 7919 results in a modification of the amino acid sequence of the corresponding protein, encoded by ORF 1a: at position 2552, a valine (codon gtt; AY278741) is changed to alanine (codon gct) in the strain SARSCoV 031589. In contrast, no mutation was identified with respect to the corresponding sequence of isolate AY2741I9.3-Urbani. The other fragments do not differ from the corresponding sequences of the Tor2 and Urbani isolates.

S/LI 01+17061 S/L1 I/-/18877 S/L11 /-19396 SIL11/-20002 S/L111+20245 S/L111+119611 S/L 11 /+119021 SARS/L11F31+800 SARSIL11F4/+1391 SARS/L1 /F51+1925 SARS/L11R31-1674 SARSILI IR41-1107 SARS/L11R51-520 SARS/L2/F3/+ 2664 SARS/L2/F4/+3232 SARS/L2/F5/+3746 SARS/L2/R3/-3579 SARS/L2/R4/-2991 SARS/L21 R51-2529 SARSIL3IF31+4708 SARSIL31F41+5305 SARS/L31F5/+5822 SARSIL3/R3/-5610 SARS/L3/R4/-4988 SARS/L31R5/-4437 5'-TACCCATCTG CTC GCATAGT-3' 5'-GCAAGCAGAATTAACCCTCA-3' 5'-AG CACCACCTAAATTG CATC-3' 5'-TGGTCCCTTTGAAGGTGTTA-3' 5'-TCGAACACATCGTTTATGGA- 3' 5'-GAAGCACCTGTTTCCATCAT-3' 5'-ACGATGCTCAGCCATGTAGT-3' 5'GAGGTGCAGTCACTCGCTAT-3' 5'-CAGAGATTG GACCTGAG CAT-3' 5'-CAG CAAACCACT CAATTCCT-3' 5'-AAATGATGGCAACCTCTTCA-3' 5'-CACGTGGTTGAATGACTTTG-3' 5'ATTTCTGCAACCAGCTCAAC-3' 5'-CGCATTGTCTCCTGGTTTAC-3' 5'-GAGATTGAGCCAGMCCAGA3' 5'-ATGAGCAGGTTGTCATGGAT-3' 5'-CTGCCTTAAGAAGCTGGATG-3' 5'TTTCTTCACCAGCATCATCA-3' 5'-CACCGTTCTTGAGAACAACC-3' 5'TCTTTGGCTGGCTCTTACAG-3' 5'-GCTGGTGATGCTGCTAACTT-3' 5'-CCATCAAG CCTGTGTCGTAT-3' 5'-CAGGTGGTGCAGACATCATA-3' 5'-AACATCAGCACCATCCAAGT-3' 5'ATCGGACACCATAGTCAACG-3' Exemple 2: Production et purification de protéines N et S recombinantes de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589 La protéine entière et deux fragments polypeptidiques de la protéine S de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589 ont été produites chez E. coli, sous forme de protéines de fusion comprenant une étiquette polyhistidine N-ou C-terminale. Dans les deux polypeptides S, les séquences hydrophobes N et C-terminales de la protéine S (peptide signal: positions 1 à 13 et hélice transmembranaire: positions 1196 à 1218) ont été délétées alors que l'hélice (3 (positions 565 à 687) et les deux motifs de type coiled-coils (positions 895 à 980 et 1155 à 1186) de la protéine S ont été préservés. Ces deux polypeptides sont constitués par: un fragment long (SL) correspondant aux positions 14 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S et un fragment court (Sc) correspondant aux positions 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S. 1) Clonage des ADNc N, SL et Sc dans les vecteurs d'expression pIVEX2.3 et 15 pIVEX2.4 Les ADNc correspondant à la protéine N et aux fragments SL et Sc ont été amplifiés par PCR dans des conditions standard, à l'aide de l'ADN polymérase Platinium Pfx (INVITROGEN). Les plasmides SRAS-N et SRAS-S ont été utilisés comme matrice et les oligonucléotides suivants comme amorces: 5'-CCCATATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC-3' (N sens, SEQ ID NO:55) 5'- CCCCCGGGTGCCTGAGTTGAATCAGCAGAAGC-3' (N antisens, SEQ ID NO:56) 5'- CCCATATGAGTGACCTTGACCGGTGCACCAC-3' (Sc sens, SEQ ID NO:57) 5'CCCATATGAAACCTTGCACCCCACCTGCTC-3' (SL sens, SEQ ID NO:58) 5'CCCCCGGGTTTAATATATTGCTCATATTTTCCC-3' (Sc et SL antisens, SEQ ID NO:59).  S / LI 01 + 17061 S / L1 I / - / 18877 S / L11 / -19396 SIL11 / -20002 S / L111 + 20245 S / L111 + 119611 S / L 11 / + 119021 SARS / L11F31 + 800 SARSIL11F4 / + 1391 SARS / L1 / F51 + 1925 SARS / L11R31-1674 SARSILI IR41-1107 SARS / L11R51-520 SARS / L2 / F3 / + 2664 SARS / L2 / F4 / + 3232 SARS / L2 / F5 / + 3746 SARS / L2 / R3 / -3579 SARS / L2 / R4 / -2991 SARS / L21 R51-2529 SARSIL3IF31 + 4708 SARSIL31F41 + 5305 SARS / L31F5 / + 5822 SARSIL3 / R3 / -5610 SARS / L3 / R4 / -4988 SARS / L31R5 / -4437 5 5'-GCAAGCAGAATTAACCCTCA-3 '5'-AG CACCACCTAAATTG CATC-3' 5'-TGGTCCCTTTGAAGGTGTTA-3 '5'-TCGAACACATCGTTTATGGA-3' 5'-GAAGCACCTGTTTCCATCAT-3 '5'-ACGATGCTCAGCCATGTAGT-TACCCATCTG CTC GCATAGT-3' 5'-GCAAGCAGAATTAACCCTCA-3 ' 3 '5'GAGGTGCAGTCACTCGCTAT-3' 5'-CAGAGATTG GACCTGAG CAT-3 '5'-CAG CAAACCACT CAATTCCT-3' 5'-AAATGATGGCAACCTCTTCA-3 '5'-CACGTGGTTGAATGACTTTG-3' 5'ATTTCTGCAACCAGCTCAAC-3 '5'-CGCATTGTCTCCTGGTTTAC 5'-GAGATTGAGCCAGMCCAGA3 '5'-ATGAGCAGGTTGTCATGGAT-3' 5'-CTGCCTTAAGAAGCTGGATG-3 '5'TTTCTTCACCAGCATCATCA-3' 5'-CACCGTTCTTGAGAACAACC-3 '5'TCTTTGGCTGGCTCTTACAG-3' 5'-GCTGGTGATGCTGCTAACTT-3 '5' -CCATCAAG CCTGTGTCGTA EXAMPLE 2 Production and Purification of Recombinant N and S Proteins of the SARS-CoV Strain Derived from the Collection Listed Under the No. 3-5'-CAGGTGGTGCAGACATCATA-3 '5'-AACATCAGCACCATCCAAGT-3' 5'ATCGGACACCATAGTCAACG-3 ' The whole protein and two polypeptide fragments of the S protein of the SARS-CoV strain from the sample numbered 031589 were produced in E. coli, in the form of fusion proteins comprising a polyhistidine N-or C-label. terminal. In both S polypeptides, the N- and C-terminal hydrophobic sequences of the S protein (signal peptide: positions 1 to 13 and transmembrane helix: positions 1196 to 1218) were deleted while the helix (3 (positions 565 to 687) was deleted. ) and the two coiled-coil units (positions 895 to 980 and 1155 to 1186) of the S protein have been preserved.These two polypeptides consist of: a long fragment (SL) corresponding to positions 14 to 1193 of the sequence in amino acids of protein S and a short fragment (Sc) corresponding to positions 475 to 1193 of the amino acid sequence of protein S. 1) Cloning of N, SL and Sc cDNAs into pIVEX2.3 expression vectors and pIVEX2.4 cDNAs corresponding to N protein and SL and Sc fragments were amplified by PCR under standard conditions using Platinium Pfx DNA polymerase (INVITROGEN). Plasmids SARS-N and SARS-S were used as templates and the following oligonucleotides as primers: 5'-CCCATATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC-3 '(N sense, SEQ ID NO: 55) 5'- CCCCCGGGTGCCTGAGTTGAATCAGCAGAAGC-3' (N antisense, SEQ ID NO: 56) 5'- CCCATATGAGTGACCTTGACCGGTGCACCAC-3 '(Sc sense, SEQ ID NO: 57) 5'CCCATATGAAACCTTGCACCCCACCTGCTC-3' (SL sense, SEQ ID NO: 58) 5'CCCCCGGGTTTAATATATTGCTCATATTTTCCC-3 '(Sc and SL antisense, SEQ ID NO: 59).

Les amorces sens introduisent un site Ndel (souligné) alors que les amorces antisens introduisent un site Xmal ou Smal (souligné). Les 3 produits d'amplification on été purifiés sur colonne (kit QlAquick PCR Purification, QIAGEN) et clonés dans un vecteur approprié. L'ADN plasmidique purifié des 3 constructions (kit QIAFilter Midi Plasmid, QIAGEN) a été vérifié par séquençage et digéré par les enzymes Ndel et Xmal. Les 3 fragments correspondants aux ADNc N, SL et Sc ont été purifiés sur gel d'agarose puis insérés dans les plasmides pIVEX2.3MCS (étiquette polyhistidine C-terminale) et pIVEX2.4d (étiquette polyhistidine N-terminale) préalablement digérés par les mêmes enzymes. Après vérification des constructions, les 6 vecteurs d'expressions ainsi obtenus (pIV2.3N, pIV2.3Sc, pIV2.3SL, pIV2.4N, pIV2. 4Sc également dénommé pIV2.4S1, pIV2.4SL) ont été ensuite utilisés, d'une part pour tester l'expression des protéines in-vitro, et d'autre part pour transformer la souche bactérienne BL21(DE3)pDIA17 (NOVAGEN). Ces constructions codent pour des protéines dont la masse moléculaire attendue est la suivante: pIV2.3N (47174 Da), pIV2.3Sc (82897 Da), pIV2. 3SL (132056 Da), pIV2.4N (48996 Da), pIV2.4S1 (81076 Da) et pIV2. 4SL(133877 Da).  The sense primers introduce an Ndel (underlined) site whereas the antisense primers introduce an XmaI or SmaI (underlined) site. The 3 amplification products were purified on a column (QlAquick PCR Purification kit, QIAGEN) and cloned into an appropriate vector. The purified plasmid DNA of the 3 constructs (QIAFilter Midi Plasmid kit, QIAGEN) was verified by sequencing and digested with the NdeI and XmaI enzymes. The 3 fragments corresponding to the N, SL and Sc cDNAs were purified on agarose gel and then inserted into the plasmids pIVEX2.3MCS (C-terminal polyhistidine label) and pIVEX2.4d (N-terminal polyhistidine label) previously digested by the same enzymes. After verifying the constructions, the 6 expression vectors thus obtained (pIV2.3N, pIV2.3Sc, pIV2.3SL, pIV2.4N, pIV2.4Sc also called pIV2.4S1, pIV2.4SL) were then used, from one part to test the expression of the proteins in-vitro, and secondly to transform the bacterial strain BL21 (DE3) pDIA17 (NOVAGEN). These constructs encode proteins whose expected molecular weight is: pIV2.3N (47174 Da), pIV2.3Sc (82897 Da), pIV2. 3SL (132056 Da), pIV2.4N (48996 Da), pIV2.4S1 (81076 Da) and pIV2. 4SL (133877 Da).

2) Analyse de l'expression des protéines recombinantes in-vitro et in vivo L'expression de protéines recombinantes à partir des 6 vecteurs recombinants a été testée, dans un premier temps, dans un système invitro (RTS100, Roche). Les protéines produites in vitro, après une incubation des vecteurs recombinants pIVEX, 4h à 30 C, dans le système RTS100, ont été analysées par western-blot à l'aide d'un anticorps anti-(his)6 couplé à la péroxydase. Le résultat d'expression in-vitro (Figure 1) montre que seule la protéine N est exprimée en quantités importantes, cela quelle que soit la position, N- ou C-terminale, de l'étiquette polyhistidine. Dans une seconde étape, l'expression des protéines N et S a été testée in-vivo à 30 C dans du milieu LB, en présence ou en l'absence d'inducteur (IPTG 1mM). La protéine N est très bien produite dans ce système bactérien (Figure 2) et se retrouve principale-ment dans une fraction soluble après lyse des bactéries. En revanche, la version longue de S (SL) est très peu produite et complètement insoluble (Figure 3). La version courte (Sc) présente également une très faible solubilité, mais un taux d'expression beaucoup plus élevé que celui de la version longue. Par ailleurs, la construction Sc fusionnée à une étiquette polyhistidine en position C-terminale présente une taille plus faible que celle attendue. Une expérience d'immunodétection avec un anticorps anti-polyhistidine a montré que cette construction était incomplète. En conclusion, les deux constructions, pIV2.3N et pIV2.4S1, exprimant respectivement la protéine N entière fusionnée à l'étiquette polyhistidine en C-terminal et la protéine S courte fusionnée à l'étiquette polyhistidine en N-terminal, ont été retenues pour produire les deux protéines en grande quantité afin de les purifier.  2) Analysis of the expression of recombinant proteins in vitro and in vivo The expression of recombinant proteins from the 6 recombinant vectors was first tested in an invitro system (RTS100, Roche). The proteins produced in vitro, after an incubation of the pIVEX recombinant vectors, 4 h at 30 ° C., in the RTS100 system, were analyzed by Western blot using an anti-(his) 6 antibody coupled to the peroxidase. The in vitro expression result (FIG. 1) shows that only the N protein is expressed in large quantities, regardless of the position, N- or C-terminal, of the polyhistidine label. In a second step, the expression of the N and S proteins was tested in vivo at 30 ° C. in LB medium, in the presence or absence of inducer (1 mM IPTG). N protein is very well produced in this bacterial system (Figure 2) and is found mainly in a soluble fraction after lysis of bacteria. On the other hand, the long version of S (SL) is very little produced and completely insoluble (Figure 3). The short version (Sc) also has a very low solubility, but a much higher expression rate than the long version. Moreover, the Sc construct fused to a polyhistidine label in the C-terminal position is smaller than expected. An immunodetection experiment with an anti-polyhistidine antibody showed that this construct was incomplete. In conclusion, the two constructs, pIV2.3N and pIV2.4S1, expressing respectively the entire N protein fused to the C-terminal polyhistidine tag and the short S protein fused to the N-terminal polyhistidine tag, were retained. to produce both proteins in large quantities to purify them.

3) Analyse de l'activité antigénique des protéines recombinantes L'activité antigénique des protéines N, SL et Sc a été testée par westernblot, à l'aide de deux échantillons de sérum, provenant d'un même patient infecté par le SARS-CoV, prélevés 8 jours (M12) et 29 jours-(M13) après le début des symptômes du SRAS. Le protocole expérimental est comme décrit à l'exemple 3. Les résultats illustrés par la figure 4 montrent (i) la séroconversion du patient, et (ii) que la protéine N possède une plus forte réactivité antigénique que la protéine S courte.  3) Analysis of the Antigenic Activity of the Recombinant Proteins The antigenic activity of the N, SL and Sc proteins was tested by Westernblot, using two serum samples, from the same patient infected with SARS-CoV , taken 8 days (M12) and 29 days - (M13) after the onset of SARS symptoms. The experimental protocol is as described in Example 3. The results illustrated in FIG. 4 show (i) seroconversion of the patient, and (ii) that the N protein has a higher antigenic reactivity than the short S protein.

4) Purification de la protéine N à partir de pIV2.3N Plusieurs expériences de purification de la protéine N, produite à partir du vecteur pIV2.3N, ont été réalisées selon le protocole suivant. Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées par le vecteur d'expression plV2. 3N, ont été cultivées à 30 C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml d'ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand la densité cellulaire, équivalente à A600 = 0,8, est atteinte (environ 3 heures). Après 2 heures de culture en présence d'inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifugation (10 min à 5000 rpm), remises en suspension dans le tampon de lyse (50 mM NaH2PO4, NaCl 0,3 M, 20 mM imidazole, pH 8 contenant le mélange d'inhibiteurs de protéases Complete , Roche), et lysées par la presse de French (12000 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à 12000 rpm), le surnageant (50 ml) a été déposé à un débit de 1ml/min sur une colonne (15 ml) de chélation métallique (Ni-NTA superflow, Qiagen), équilibrée par le tampon de lyse. Après lavage de la colonne par 200 ml de tampon de lyse, la protéine N a été éluée par un gradient d'imidazole (20 -250 mM) en 10 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine N ont été rassemblées et analysées par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes puis coloration au bleu de Coomassie. Les résultats illustrés par la figure 5 montrent que le protocole employé permet de purifier la protéine N avec une homogénéité très satisfaisante (95%) et un rendement moyen de 15 mg de protéine par litre de culture.  4) Purification of the N Protein from pIV2.3N Several N protein purification experiments, produced from the pIV2.3N vector, were carried out according to the following protocol. BL21 (DE3) pDIA17 bacteria, transformed with the expression vector plV2. 3N, were grown at 30 C in 1 liter of culture medium containing 0.1 mg / ml ampicillin, and induced by 1 mM IPTG when the cell density, equivalent to A600 = 0.8, is reached (about 3 hours). After 2 hours of culture in the presence of inducer, the cells were recovered by centrifugation (10 min at 5000 rpm), resuspended in the lysis buffer (50 mM NaH2PO4, 0.3 M NaCl, 20 mM imidazole, pH 8 containing the mixture of protease inhibitors Complete, Roche), and lysed by the French press (12000 psi). After centrifugation of the bacterial lysate (15 min at 12000 rpm), the supernatant (50 ml) was deposited at a flow rate of 1 ml / min on a column (15 ml) of metal chelation (Ni-NTA superflow, Qiagen), equilibrated with the lysis buffer. After washing the column with 200 ml of lysis buffer, the N protein was eluted with an imidazole gradient (20-250 mM) in 10 column volumes. The fractions containing the N protein were pooled and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions followed by staining with Coomassie blue. The results illustrated in FIG. 5 show that the protocol used makes it possible to purify the N protein with a very satisfactory homogeneity (95%) and an average yield of 15 mg of protein per liter of culture.

5) Purification de la protéine Sc à partir de pIV2.4Sc (pIV2.4S1) Le protocole suivi pour purifier la protéine S courte est très différent de celui décrit ci-dessus car la protéine est fortement aggrégée dans le système bacté- rien (corps d'inclusion). Les bactéries BL21(DE3)pDIA17, transformées par le vecteur d'expression pIV2.4S1 ont été cultivées à 30 C dans 1 litre de milieu de culture contenant 0,1 mg/ml d'ampicilline, et induites par 1 mM IPTG quand la densité cellulaire, équivalente à A600 = 0,8, est atteinte (environ 3 heures). Après 2 heures de culture en présence d'inducteur, les cellules ont été récupérées par centrifugation (10 min à 5000 rpm), remises en suspension dans le tampon de lyse (0,1 M Tris-HC1, EDTA 1 mM, pH 7,5), et lysées par la presse de French (1200 psi). Après centrifugation du lysat bactérien (15 min à 12000 rpm), le culot a été remis en suspension dans 25 ml de tampon de lyse contenant 2% Triton X100 et 10 mM (3-mercaptoéthanol, puis centrifugé pendant 20 min à 12000 rpm. Le culot a été remis en suspension dans un tampon Tris-HCI 10 mM contenant 7 M urée, et mis en agitation douce pendant 30 min à température ambiante. Ce dernier lavage des corps d'inclusion avec 7 M urée est nécessaire pour éliminer la plupart des protéines membranaires d 'E. coll. qui co-sédimentent avec la protéine Sc aggrégée. Après une dernière centrifugation pendant 20 min à 12000 rpm, le culot final est remis en suspension dans le tampon Tris-HCI 10 mM. L'analyse électrophorétique de cette préparation (Figure 6) montre que la protéine S courte peut être purifiée avec une homogénéité satisfaisante (environ 90%) à partir des corps d'inclusion (extrait insoluble).  5) Purification of the Sc protein from pIV2.4Sc (pIV2.4S1) The protocol followed to purify the short S protein is very different from that described above because the protein is strongly aggregated in the bacterial system (body inclusion). The BL21 (DE3) pDIA17 bacteria, transformed with the pIV2.4S1 expression vector, were cultured at 30 ° C. in 1 liter of culture medium containing 0.1 mg / ml of ampicillin and induced by 1 mM IPTG when the cell density, equivalent to A600 = 0.8, is reached (approximately 3 hours). After 2 hours of culture in the presence of inducer, the cells were recovered by centrifugation (10 min at 5000 rpm), resuspended in the lysis buffer (0.1 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7, 5), and lysed by French press (1200 psi). After centrifugation of the bacterial lysate (15 min at 12000 rpm), the pellet was resuspended in 25 ml of lysis buffer containing 2% Triton X100 and 10 mM (3-mercaptoethanol, then centrifuged for 20 min at 12000 rpm. The pellet was resuspended in 10 mM Tris-HCl buffer containing 7 M urea, and gently stirred for 30 min at room temperature.The latter washing of inclusion bodies with 7 M urea is necessary to remove most E. coli membrane proteins which co-sediment with the aggregated protein Sc After a final centrifugation for 20 min at 12000 rpm, the final pellet is resuspended in 10 mM Tris-HCl buffer. this preparation (FIG. 6) shows that the short S protein can be purified with a satisfactory homogeneity (approximately 90%) from the inclusion bodies (insoluble extract).

Exemple 3: Immunodominance de la protéine N La réactivité des anticorps présents dans le sérum des patients atteints de pneumopathie atypique causée par le coronavirus associé au SRAS (SARSCoV), vis-à-vis des différentes protéines de ce virus, a été analysée par western-blot dans les conditions décrites ci-après.  Example 3 Immunodominance of the N Protein The reactivity of the antibodies present in the serum of patients suffering from atypical pneumonitis caused by the SARS-associated coronavirus (SARSCoV), with respect to the various proteins of this virus, was analyzed by Western -blot under the conditions described below.

1) Matériel a) lysat de cellules infectées par le SARS-CoV Des cellules Vero E6 (2x106) ont été infectées par le SARS-CoV (isolat répertorié sous le numéro FFMIMA104) à une multiplicité d'infection (M.O.I.) de 10-1 ou 10-2 puis incubées dans du milieu DMEM contenant 2% de SVF, à 35 C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. 48 heures plus tard, le tapis cellulaire a été lavé avec du PBS puis lysé avec 500 l de tampon de dépôt préparé selon LaemmIi et contenant du 13-mercaptoéthanol. Les échantillons ont ensuite été bouillis 10 minutes puis soniqués 3 fois 20 secondes.  1) Material a) lysate of cells infected with SARS-CoV Vero E6 cells (2x106) were infected with SARS-CoV (isolate listed under the number FFMIMA104) at a multiplicity of infection (MOI) of 10-1 or 10-2 and then incubated in DMEM medium containing 2% FCS at 35 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2. 48 hours later, the cell layer was washed with PBS and then lysed with 500 l of Laemmli-containing deposition buffer containing 13-mercaptoethanol. The samples were then boiled for 10 minutes and then sonicated 3 times 20 seconds.

2862974 49 b) anticorps bl) érum_de_patient_attei_nt de neumopathie_atypique Le sérum référencé au Centre National de Référence des virus influenzae (Région-Nord) sous le N 20033168 est celui d'un patient français atteint d'une pneumopathie atypique causée par le SARSCoV prélevé au jour 38 après le début des symptômes; le diagnostic d'infection par le SARS-CoV a été réalisé par RT-PCR nichée et PCR quantitative.  2862974 49 b) antibody bl) erum_de_patatient_attei_nt de neumopathie_atypique The serum referenced at the National Reference Center for Influenza Viruses (North Region) under N 20033168 is that of a French patient suffering from atypical pneumopathy caused by SARSCoV taken at day 38 after the onset of symptoms; the diagnosis of SARS-CoV infection was made by nested RT-PCR and quantitative PCR.

b2) sérums_ poly_çlonaux_ de _lapin monospéçifiques_ dirigés_ contre_ la _protéine _N_ ou_ la otéine_ S Les sérums sont ceux produits à partir des protéines recombinantes N et Sc (exemple 2), selon le protocole d'immunisation décrit à l'exemple 4; il s'agit du sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) et du sérum du lapin P11135 (sérum anti-S). 2) Méthode l de lysat de cellules infectées par le SARS-CoV à des M.O.I. de 10-I et 10-2 et, à titre de contrôle, 20 l d'un lysat de cellules non infectées (mock) ont été séparés sur un gel SDS à 10% de polyacrylamide puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. Après blocage dans une solution de PBS/lait 5%/Tween 0,1% et lavage en PBS/Tween 0,1%, cette membrane a été hybridée pendant une nuit à 4 C avec: (i) l'immun-sérum N 20033168 dilué au 1/300, 1/1000 et 1/3000 dans le tampon PBSBSA 1%/Tween 0,1%, (ii) le sérum du lapin P13097 (sérum anti-N) dilué au 1/50000 dans le même tampon et (iii) le sérum du lapin P11135 (sérum anti-S) dilué au 1/10000 dans le même tampon. Après lavage en PBS/Tween, une hybridation secondaire a été réalisée à l'aide, soit d'anticorps polyclonaux de mouton dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G humaines et couplés à la peroxidase (NA933V, Amersham), soit d'anticorps polyclonaux d'âne dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G de lapin et couplés à la peroxidase (NA934V, Amersham). Les anticorps fixés ont été révélés à l'aide du kit ECL+ (Amersham) et de films d'autoradiographie Hyperfilm MP (Amersham). Une échelle de masse moléculaire (kDa) est portée sur la figure.  b2) Polyester monospecific sera directed against N protein or S-cellase Sera are those produced from recombinant proteins N and Sc (Example 2), according to the immunization protocol described in Example 4; this is rabbit serum P13097 (anti-N serum) and rabbit serum P11135 (anti-S serum). 2) Method 1 of lysate of cells infected with SARS-CoV at M.O.I. of 10-I and 10-2 and, as a control, 20 l of a lysate of uninfected cells (mock) were separated on a 10% SDS polyacrylamide gel and then transferred onto a nitrocellulose membrane. After blocking in a solution of PBS / milk 5% / 0.1% Tween and washing in PBS / 0.1% Tween, this membrane was hybridized overnight at 4 ° C. with: (i) the immunoserum N 20033168 diluted 1/300, 1/1000 and 1/3000 in 1% PBSBSA buffer / 0.1% Tween, (ii) rabbit serum P13097 (anti-N serum) diluted 1/50000 in the same buffer and (iii) rabbit serum P11135 (anti-S serum) diluted 1/10000 in the same buffer. After washing in PBS / Tween, secondary hybridization was carried out using either polyclonal sheep antibodies directed against the heavy and light chains of human immunoglobulin G and coupled to peroxidase (NA933V, Amersham), or polyclonal donkey antibodies to the heavy and light chains of rabbit immunoglobulin G coupled to peroxidase (NA934V, Amersham). The fixed antibodies were revealed using the ECL + kit (Amersham) and Hyperfilm MP autoradiography films (Amersham). A molecular weight scale (kDa) is shown in the figure.

3) Résultats La figure 7 montre que trois polypeptides de masse moléculaire apparente 35, 55 et 200 kDa sont détectés spécifiquement dans les extraits de cellules infectées par le SARS-CoV.  3) Results Figure 7 shows that three 35, 55 and 200 kDa apparent molecular weight polypeptides are specifically detected in extracts of SARS-CoV infected cells.

Afin d'identifier ces polypeptides, deux autres immunoempreintes (figure 8) ont été réalisées sur les mêmes échantillons et dans les mêmes conditions avec des anticorps polyclonaux de lapins spécifique de la nucléoprotéine N (lapin P13097, figure 8A) et de la protéine de spicule S (lapin PI1135, figure 8B) Cette expérience montre que le polypeptide de 200 kDa correspond à la glycoprotéine de spicule S du SARS-CoV, que le polypeptide de 55 kDa correspond à la nucléoprotéine N tandis que le polypeptide de 35 kDa représente vraisemblablement une forme tronquée ou dégradée de la N. Les données présentées dans la figure 7 montrent donc que le sérum 20033168 réagit fortement avec la N et beaucoup plus faiblement avec la S du SARS- CoV, puisque les polypeptides de 35 et 55 kDa sont révélés sous la forme de bandes intenses pour des dilutions de 1/300, 1/1000 et 1/3000 de l'immunsérum alors que le polypeptide de 200 kDa n'est que faiblement révélé pour une dilution de 1/300. On peut noter également qu'aucun autre polypeptide du SARS-CoV n'est détecté pour des dilutions supérieures au 1/300 du sérum 20033168.  In order to identify these polypeptides, two other immunoblots (FIG. 8) were made on the same samples and under the same conditions with polyclonal rabbit antibodies specific for nucleoprotein N (rabbit P13097, FIG. 8A) and spike protein. S (rabbit PI1135, FIG. 8B) This experiment shows that the 200 kDa polypeptide corresponds to the S spike glycoprotein of SARS-CoV, that the 55 kDa polypeptide corresponds to nucleoprotein N while the 35 kDa polypeptide probably represents a truncated or degraded form of N. The data presented in Figure 7 therefore show that serum 20033168 reacts strongly with N and much more weakly with S of SARS-CoV, since the 35 and 55 kDa polypeptides are revealed under intense bands for 1/300, 1/1000 and 1/3000 dilutions of antiserum whereas the 200 kDa polypeptide is only weakly revealed for a dilute ion of 1/300. It may also be noted that no other SARS-CoV polypeptide is detected for dilutions greater than 1/300 of the 20033168 serum.

Cette expérience indique que la réponse en anticorps spécifique de la N du SARS-CoV domine les réponses en anticorps spécifiques des autres polypeptides du SARS-CoV et en particulier la réponse en anticorps dirigée contre la glycoprotéine S. Elle indique une immunodominance de la nucléoprotéine N lors des infections humaines par le SARS-CoV.  This experiment indicates that the SARS-CoV N-specific antibody response dominates the antibody responses specific for the other SARS-CoV polypeptides and in particular the antibody response against the S-glycoprotein. It indicates an immunodominance of the N-nucleoprotein. during human infections with SARS-CoV.

Exemple 4: Préparation d'anticorps polyclonaux monospécifiques dirigés contre les protéines N et S du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV) 1) Matériel et méthode Trois lapins (P13097, P13081, P13031) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant purifié correspondant à l'intégralité de la nucléoprotéine (N), préparé selon le protocole décrità l'exemple 2. Après une première injection de 0,35 mg par lapin de protéine émulsionnée en adjuvant complet de Freund (voie intra- dermique), les animaux ont reçus 3 injections de rappel à 3 puis 4 semaines d'intervalle, de 0,35 mg de protéine recombinante émulsionnée en adjuvant incomplet de Freund.  Example 4 Preparation of Monospecific Polyclonal Antibodies Directed Against SARS-Associated Coronavirus-Associated N and S Proteins (SARS-CoV) 1) Material and Method Three rabbits (P13097, P13081, P13031) were immunized with the purified recombinant polypeptide corresponding to the entire nucleoprotein (N), prepared according to the protocol described in Example 2. After a first injection of 0.35 mg per rabbit of protein emulsified in complete Freund's adjuvant (intradermal route), the animals received 3 booster injections at 3 and then 4 weeks apart, 0.35 mg of recombinant protein emulsified as incomplete Freund's adjuvant.

Trois lapins (P11135, P13042, P14001) ont été immunisés avec le polypeptide recombinant correspondant au fragment court de la protéine S (Sc), produit comme décrit à l'exemple 2. Comme ce polypeptide est retrouvé principale-ment sous la forme de corps d'inclusion dans le cytoplasme bactérien, les animaux ont reçus 4 injections intra-dermiques à 3-4 semaines d'intervalle d'une préparation de corps d'inclusion correspondant à 0,5 mg de protéine recombinante émulsionnée en adjuvant incomplet de Freund. Les 3 premières injections ont été réalisées avec une préparation de corps d'inclusion préparés selon le protocole décrit à l'exemple 2, tandis que la quatrième injection a été réalisée avec une préparation de corps d'inclusion qui ont été préparés selon le protocole décrit à l'exemple 2 puis purifiés sur gradient de saccharose et lavés en 2 % Triton X100.  Three rabbits (P11135, P13042, P14001) were immunized with the recombinant polypeptide corresponding to the short fragment of the protein S (Sc), produced as described in Example 2. As this polypeptide is found mainly in the form of body of inclusion in the bacterial cytoplasm, the animals received 4 intra-dermal injections at 3-4 week intervals of an inclusion body preparation corresponding to 0.5 mg of recombinant protein emulsified as incomplete Freund's adjuvant. The first 3 injections were carried out with an inclusion body preparation prepared according to the protocol described in Example 2, while the fourth injection was carried out with an inclusion body preparation which were prepared according to the described protocol. in Example 2 and then purified on a sucrose gradient and washed in 2% Triton X100.

Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (p.i.) a été préparé avant la 15 première immunisation et un immun-sérum (I.S.) 5 semaines après la quatrième immunisation.  For each rabbit, a pre-immune serum (p.i.) was prepared prior to the first immunization and an immun-serum (I.S.) 5 weeks after the fourth immunization.

Dans un premier temps, la réactivité des sérums a été analysée par test ELISA vis à vis de préparations de protéines recombinantes semblables à celles utilisées pour les immunisations; les tests ELISA ont été réalisés selon le protocole et avec les réactifs tels que décrits à l'exemple 6.  In a first step, the reactivity of the sera was analyzed by ELISA test with respect to recombinant protein preparations similar to those used for the immunizations; the ELISA tests were carried out according to the protocol and with the reagents as described in Example 6.

Dans un deuxième temps, la réactivité des sérums a été analysée en réalisant une immunoempreinte (western blot) d'un lysat de cellules infectées par le SARS-CoV, en suivant le protocole tel que décrit à l'exemple 3.  In a second step, the reactivity of the sera was analyzed by performing an immunoblot (western blot) of a lysate of cells infected with SARS-CoV, following the protocol as described in Example 3.

2) Résultats Les tests ELISA (figure 9) démontrent que les préparations de protéine N recombinante et de corps d'inclusion du fragment court de la protéine S (Sc) sont immunogènes chez l'animal et que le titre des sérums immuns est élevé (plus de 1/25000).  2) Results The ELISA tests (FIG. 9) demonstrate that the recombinant protein N and inclusion body preparations of the short fragment of the S (Sc) protein are immunogenic in the animal and that the titre of the immune sera is high ( more than 1/25000).

L'immunoempreinte (figure 8) montre que le sérum immun du lapin P13097 reconnaît deux polypeptides présents dans les lysats de cellules infectées par le SARS-CoV: un polypeptide dont la masse moléculaire apparente (50-55 kDa selon les expériences) est compatible avec celle de la nucléoprotéine N (422 résidus, masse moléculaire prédite de 46 kDa) et un polypeptide de 35 kDa, qui représente vraisemblablement une forme tronquée ou dégradée de la N. Cette expérience montre également que le sérum du lapin P11135 reconnaît principalement un polypeptide dont la masse moléculaire apparente (180- 220 kDa selon les expériences) est compatible avec une forme glycosylée de la S (1255 résidus, chaîne polypeptidique non glycosylée de 139 kDa), ainsi que des polypeptides plus légers, qui représentent vraisemblablement des formes tronquées et/ou non glycosylées de la S. En conclusion, l'ensemble de ces expériences démontrent que des polypeptides recombinants exprimés chez E. coli et correspondant aux protéines N et S du SARS-CoV permettent d'induire chez l'animal des anticorps polyclonaux capables de reconnaître les formes natives de ces protéines.  The immunoblotting (FIG. 8) shows that the rabbit immune serum P13097 recognizes two polypeptides present in the lysates of cells infected with SARS-CoV: a polypeptide whose apparent molecular mass (50-55 kDa according to the experiments) is compatible with that of nucleoprotein N (422 residues, molecular weight predicted 46 kDa) and a polypeptide of 35 kDa, which probably represents a truncated or degraded form of N. This experiment also shows that the serum of rabbit P11135 mainly recognizes a polypeptide of which the apparent molecular mass (180-220 kDa according to the experiments) is compatible with a glycosylated form of S (1255 residues, unglycosylated polypeptide chain of 139 kDa), as well as lighter polypeptides, which probably represent truncated forms and / or not glycosylated S. In conclusion, all of these experiments demonstrate that recombinant polypeptides expressed ch E. coli and corresponding to the N and S proteins of SARS-CoV allow to induce in the animal polyclonal antibodies capable of recognizing the native forms of these proteins.

Exemple 5: Préparation d'anticorps polyclonaux monospécifiques dirigés contre les protéines M et E du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV) 1) Analyse de la structure des protéines M et E a) Protéine E La structure de la protéine E du SARS-CoV (76 acides aminés) a été analysée in silico, à l'aide de différents logiciels comme signalP vl.l, NetNGlyc 1.0, THMM 1.0 et 2.0 (Krogh et al., 2001, J. Mol. Biol., 305(3):567-580) ou encore TOPPRED (von Heijne, 1992, J. Mol. Biol. 225, 487-494). L'analyse montre que ce polypeptide non glycosylé est une protéine membranaire de type 1, contenant une seule hélice transmembranaire (aa 12-34 d'après THMM), et dont la plus grande partie du domaine hydrophile (42 résidus) est localisée à l'extrémité C-terminale et vraisemblablement à l'intérieur de la particule virale (endodomaine). On peut noter une inver- sion dans la topologie prédite par les versions 1.0 (N-ter est externe) et 2.0 (N-ter est interne) du logiciel THMM, mais que d'autres algorithmes, notamment TOPPRED et THUMBUP (Zhou et Zhou, 2003, Protein Science 12:1547-1555) confirment une localisation externe de l'extrémité N-terminale de E. b) Protéine M Une analyse similaire réalisée sur la protéine M du SARS-CoV (221 acides aminés) montre que ce polypeptide ne possède pas de peptide signal (d'après le logiciel signalP vl.l) mais trois domaines transmembranaires (résidus 15-37, 50-72, 77-99 d'après THMM2.0) et un grand domaine hydrophile (aa 100-221) localisé à l'intérieur de la particule virale (endodomaine). Elle est vraisemblablement glycosylée sur l'asparagine en position 4 (d'après NetNGlyc 1.0).  Example 5 Preparation of Monospecific Polyclonal Antibodies Directed Against SARS-Associated Coronavirus (SARS-CoV) M and E Proteins 1) Analysis of M and E Protein Structure a) Protein E Structure of SARS-Protein E CoV (76 amino acids) was analyzed in silico, using various software such as SignalP v1.1, NetNGlyc 1.0, THMM 1.0 and 2.0 (Krogh et al., 2001, J. Mol Biol., 305 (3)). ): 567-580) or TOPPRED (von Heijne, 1992, J. Mol Biol 225, 487-494). The analysis shows that this non-glycosylated polypeptide is a type 1 membrane protein, containing a single transmembrane helix (aa 12-34 according to THMM), and the major part of the hydrophilic domain (42 residues) is localized to the membrane. C-terminus and presumably within the viral particle (endodomain). We can note an inversion in the topology predicted by the versions 1.0 (N-ter is external) and 2.0 (N-ter is internal) of the THMM software, but that other algorithms, in particular TOPPRED and THUMBUP (Zhou and Zhou , 2003, Protein Science 12: 1547-1555) confirm an external location of the N-terminus of E. b) Protein M A similar analysis carried out on the SARS-CoV M protein (221 amino acids) shows that this polypeptide does not have a signal peptide (according to the signalP vl.l software) but three transmembrane domains (residues 15-37, 50-72, 77-99 according to THMM2.0) and a large hydrophilic domain (aa 100- 221) located inside the viral particle (endodomain). It is presumably glycosylated on asparagine at position 4 (according to NetNGlyc 1.0).

* Ainsi, en accord avec les données expérimentales connues pour les autres coronavirus, il est remarquable que les deux protéines M et E présentent des endodomaines correspondant à la majeure partie des polypeptides et des ectodomaines de très petite taille.Thus, in agreement with the experimental data known for the other coronaviruses, it is remarkable that the two M and E proteins have endodomains corresponding to most polypeptides and ectodomains of very small size.

- l'ectodomaine de E correspond vraisemblablement aux résidus 1 à 11 ou 1 à 12 de la protéine: MYSFVSEETGT(L), SEQ ID NO: 70. En effet, la probabilité associée à la localisation transmembranaire du résidu 12 est intermédiaire (0,56 d'après THMM 2.0).  the ectodomain of E probably corresponds to residues 1 to 11 or 1 to 12 of the protein: MYSFVSEETGT (L), SEQ ID NO: 70. Indeed, the probability associated with the transmembrane localization of residue 12 is intermediate (0, 56 from THMM 2.0).

- l'ectodomaine de M correspond vraisemblablement aux résidus 2 à 14 de la protéine: ADNGTITVEELKQ, SEQ ID NO: 69. En effet, la méthionine Nterminale de M est très probablement clivée du polypeptide mature car le résidu en position 2 est une Alanine (Varshavsky, 1996, 93:12142-12149).  the ectodomain of M probably corresponds to residues 2 to 14 of the protein: ADNGTITVEELKQ, SEQ ID NO: 69. Indeed, the N-terminal methionine of M is very probably cleaved from the mature polypeptide because the residue in position 2 is an alanine ( Varshavsky, 1996, 93: 12142-12149).

Par ailleurs, l'analyse de l'hydrophobicité (Kyte & Doolittle, Hopp & Woods) de la protéine E met en évidence que l'extrémité C-terminale de l'endodomaine de E est hydrophile et donc vraisemblablement exposée à la surface de ce domaine. Ainsi, un peptide synthétique correspondant à cette extrémité est un bon candidat immunogène pour induire chez l'animal des anticorps dirigés contre l'endodomaine de E. En conséquence, un peptide correspondant aux 24 résidus C-terminaux de E a été synthétisé.  Moreover, the analysis of the hydrophobicity (Kyte & Doolittle, Hopp & Woods) of the protein E shows that the C-terminal end of the endodomain of E is hydrophilic and therefore presumably exposed on the surface of this protein. field. Thus, a synthetic peptide corresponding to this end is a good immunogenic candidate for inducing antibodies directed against the endodomain of E. As a result, a peptide corresponding to the 24 C-terminal residues of E was synthesized.

2) Préparation d'anticorps dirigés contre l'ectodomaine des protéines M et E et l'endodomaine de la protéine E Les peptides M2-14 (ADNGTITVEELKQ, SEQ ID NO: 69), El- 12 (MYSFVSEETGTL, SEQ ID NO: 70) et E53-76 (KPTVYVYSRV KNLNSSEGVP DLLV, SEQ ID NO: 71) ont été synthétisés par Neosystem. Ils ont été couplés à la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) à l'aide du MBS (m-maleimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimide ester) via une cystéine ajoutée au cours de la synthèse soit en N-terminal du peptide (cas de E53-76) soit en C-terminal (cas de M2-14 et El-12).  2) Preparation of Antibodies Against the Ectodomain of the M and E Proteins and the Endodomain of the E Protein M2-14 Peptides (GITVEELKQ DNA, SEQ ID NO: 69), EI-12 (MYSFVSEETGTL, SEQ ID NO: 70 ) and E53-76 (KPTVYVYSRV KNLNSSEGVP DLLV, SEQ ID NO: 71) were synthesized by Neosystem. They were coupled to KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) using MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) via a cysteine added during either N-terminal synthesis of the peptide (case of E53-76 ) or in C-terminal (case of M2-14 and El-12).

Deux lapins ont été immunisés avec chacun des conjugués, en suivant le protocole d'immunisation suivant: après une première injection de 0,5 mg de peptide couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant complet de Freund (voie intradermique), les animaux reçoivent 2 à 4 injections de rappel à 3 ou 4 semaines d'intervalle de 0,25 mg de peptide couplé à la KLH et émulsionné en adjuvant incomplet de Freund.  Two rabbits were immunized with each of the conjugates, following the following immunization protocol: after a first injection of 0.5 mg of peptide coupled to KLH and emulsified in complete Freund's adjuvant (intradermal route), the animals receive 2 at 4 booster injections at 3 or 4 week intervals of 0.25 mg peptide coupled to KLH and emulsified with Freund's incomplete adjuvant.

Pour chaque lapin, un sérum pré-immun (pi.) a été préparé avant la première immunisation et un immun-sérum (I.S.) est préparé 3 à 5 semaines après les injections de rappel.  For each rabbit, a pre-immune serum (pi) was prepared prior to the first immunization and an immune serum (I.S.) was prepared 3 to 5 weeks after the booster shots.

La réactivité des sérums est analysée dans un premier temps par test ELISA vis à vis du peptide utilisé pour l'immunisation, puis par immunoempreinte vis-à-vis de lysats de cellules infectées par le SARS-CoV, comme décrit pour les sérums anti-N et anti-S de l'exemple 4, selon des protocole similaires à ceux décrits aux exemples 3 et 6, respectivement pour l'immunoempreinte et le test ELISA.  The reactivity of the sera is first analyzed by ELISA with respect to the peptide used for the immunization, then by immunoblotting with lysates of cells infected with SARS-CoV, as described for the antiserum sera. N and anti-S of Example 4, according to similar protocols to those described in Examples 3 and 6, respectively for immunoblotting and ELISA.

Dans un second temps, la réactivité des immunsérums dirigés contre les peptides M2-14 et E1-12 à reconnaître les ectodomaines de M et de E présents à la surface de la particule virale native est analysée par des tests d'immunocapture et/ou d'immunoprécipitation de virions natifs.  In a second step, the reactivity of antisera directed against peptides M2-14 and E1-12 to recognize the ectodomains of M and E present on the surface of the native viral particle is analyzed by immunocapture and / or d immunoprecipitation of native virions.

Exemple 6: Analyse de la réactivité en ELISA de la protéine N recombinante, 20 vis-à-vis de sérums de patients atteints de SRAS 1) Matériel L'antigène utilisé pour préparer les phases solides est la nucléo- protéine N recombinante purifiée préparée selon le protocole décrit à l'exemple 2.  Example 6: ELISA Reactivity Analysis of Recombinant N-Protein Against Sera from SARS Patients 1) Material The antigen used to prepare the solid phases is the purified recombinant N-nucleoprotein prepared according to the protocol described in Example 2.

Les sérums à tester (Tableau IV) ont été choisis sur la base des 25 résultats d'analyse de leur réactivité par immunofluorescence (titre IFSRAS), vis-à- vis de lysats de cellules infectées par le SARS-CoV.  The sera to be tested (Table IV) were chosen on the basis of the results of analysis of their immunofluorescence reactivity (IFSRAS titre), vis-à-vis lysates of cells infected with SARS-CoV.

Tableau IV: Sérums testés en ELISA Référence N sérum Type Date du Titre IF-SRAS de sérum Sérum*** 3050 A Témoin na* nt** 3048 B Témoin na nt 033168 D Patient 1- SRAS 27/04/03 (J38) 320 033397 E Patient-1 SRAS 11/05/03 (J52) 320 032632 F Patient-2 SRAS 21/03/03 (J17) 2500 032791 G Patient-3 SRAS 04/04/03 (J3) <40 033258 H Patient-3 SRAS 28/04/03 (J27) 160 *na: non-applicable. ** nt: non-testé. *** les dates indiquées correspondent au nombre de jours après le début des symptômes de SRAS.  Table IV: Serums tested in ELISA Reference N Serum Type Date of Title IF-SARS serum Serum *** 3050 A Control na * nt ** 3048 B Control na nt 033168 D Patient 1- SARS 27/04/03 (D38) 320 033397 E Patient-1 SARS 11/05/03 (J52) 320 032632 F Patient-2 SARS 21/03/03 (D17) 2500 032791 G Patient-3 SARS 04/04/03 (D3) <40 033258 H Patient -3 SARS 28/04/03 (D27) 160 * na: not applicable. ** nt: not tested. *** the dates shown are the number of days after the onset of SARS symptoms.

2) Méthode La protéine N (100 l) diluée à différentes concentrations dans du tampon carbonate 0,1 M, pH 9,6 (1, 2 ou 4 tg/ml) est distribuée dans les puits de plaques ELISA, puis les plaques sont incubées une nuit à température du laboratoire.  2) Method The N protein (100 l) diluted at different concentrations in 0.1 M carbonate buffer, pH 9.6 (1, 2 or 4 μg / ml) is distributed in the wells of ELISA plates, then the plates are incubated overnight at laboratory temperature.

Les plaques sont lavées avec du tampon PBS-Tween, saturées avec du tampon PBS-lait écrémé-saccharose (5 %). Les sérums à tester (100 pl) préalablement dilués (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600 et 1/3200) sont ajoutés, puis les plaques sont incubées 1 h à 37 C. Après 3 lavages, le conjugué anti-IgG humaines marqué à la peroxydase (référence 209-035098, JACKSON) dilué au 1/18000 est ajouté puis les plaques sont incubées 1h à 37 C. Après 4 lavages, le chromogène (TMB) et le substrat (H202) sont ajoutés et les plaques sont incubées 30min à température ambiante, à l'abri de la lumière. La réaction est ensuite arrêtée puis l'absorbance à 450 nm est mesurée à l'aide d'un lecteur automatique.  Plates are washed with PBS-Tween buffer, saturated with PBS-skim-sucrose (5%). The sera to be tested (100 μl) diluted beforehand (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600 and 1/3200) are added, then the plates are incubated for 1 hour at C. After 3 washes, the anti-human IgG conjugate labeled with peroxidase (reference 209-035098, JACKSON) diluted 1/18000 is added and the plates are incubated for 1 h at 37 C. After 4 washes, the chromogen (TMB ) and the substrate (H2O2) are added and the plates are incubated for 30 min at room temperature, protected from light. The reaction is then stopped and the absorbance at 450 nm is measured using an automatic reader.

3) Résultats Les tests ELISA (figure 10) démontrent que la préparation de protéine N recombinante est reconnue spécifiquement par les anticorps de sérums de patients atteints de SRAS prélevés en phase tardive de l'infection (> 17 jours après le début des symptômes) alors qu'elle n'est pas reconnue de façon significative par les anticorps d'un sérum de patient prélevé en phase précoce de l'infection (3 jours après le début des symptômes) ni par des sérums témoins de sujets non atteints de SRAS.  3) Results The ELISA tests (FIG. 10) demonstrate that the recombinant protein N preparation is recognized specifically by the antibodies of sera of SARS patients taken in the late phase of the infection (> 17 days after the onset of symptoms). that it is not significantly recognized by the antibodies of a patient serum taken early in the infection (3 days after the onset of symptoms) or by control sera from subjects without SARS.

Exemple 7: Détection du coronavirus associé au SRAS (SARS-CoV) par RTPCR en temps réel à l'aide d'amorces spécifiques du gène de la nucléoprotéine 1) Mise au point des conditions de la RT-PCR a) conception des amorces et des sondes La conception des amorces et sondes a été réalisée à partir de la séquence du génome de la souche de SARS-CoV issue du prélèvement répertorié sous le numéro 031589, à l'aide du programme "Light Cycler Probe Design (Roche)". Ainsi les deux séries d'amorces et de sondes suivantes ont été sélectionnées: - série 1 (SEQ ID NO: 60, 61, 64, 65): amorce sens: N/+/28507: 5'-GGC ATC GTA TGG GTT G-3' [28507-28522] - amorce antisens: N/-/28774: 5'-CAG TTT CAC CAC CTC C-3' [28774-28759] - sonde 1: 5'-GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GC-fluorescéine 3' [28561- 28586] sonde 2: 5' Red705 GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT-phosphate [28588-28608] série 2 (SEQ ID NO: 62, 63, 66, 67) - amorce sens: N/+/28375: 5'-GGC TAC TAC CGA AGA G-3' [28375-28390] - amorce antisens: N/-/28702: 5'-AAT TAC CGC GAC TAC G-3' [28702-28687] - sonde 1: SRASIN/FL: 5'-ATA CAC CCA AAG ACC ACA TTG GC - fluorescéine 3' [28541-28563] - sonde 2: SRAS/NILC705: 5' Red705 -CCC GCA ATC CTA ATA ACA ATG CTG C- phosphate 3' [28565-28589] b) analyse de l'efficacité des deux couples amorces Afin de tester l'efficacité respective des deux couples d'amorces, une amplification par RT-PCR a été réalisée sur un ARN synthétique correspondant aux nucléotides 28054-29430 du génome de la souche de SARS- CoV issue du prélève-ment répertorié sous le numéro 031589et contenant la séquence du gène N. De manière plus précise: Cet ARN synthétique a été préparé par transcription in vitro à l'aide de l'ARN polymérase du phage T7, d'une matrice d'ADN obtenu par linéarisation du plasmide SRAS-N avec l'enzyme Bam Hl. Après élimination de la matrice d'ADN par digestion à l'aide de DNAse 1, les ARN synthétiques sont purifiés par une extraction au phénol-chloroforme suivie de deux précipitations successives en acétate d'ammonium et isopropanol. Ils sont alors quantifiés par mesure de l'absorbance à 260 nm et leur qualité est contrôlée par le rapport des absorbances à 260 et 280 nm ainsi que par une électrophorèse en gel d'agarose. Ainsi, la concentration de la préparation d'ARN synthétique utilisée pour ces études est de 1,6 mg/ml, ce qui correspond à 2, 1 copies/ml d'ARN.  Example 7: Detection of SARS-CoV Associated Coronavirus (SARS-CoV) by Real-Time RTPCR Using Primers Specific to the Nucleoprotein Gene 1) Development of RT-PCR Conditions a) Primer Design and probes The design of the primers and probes was carried out from the genome sequence of the strain of SARS-CoV resulting from the sampling indexed under the number 031589, using the program "Light Cycler Probe Design (Roche)". Thus the following two sets of primers and probes were selected: - series 1 (SEQ ID NO: 60, 61, 64, 65): sense primer: N / + / 28507: 5'-GGC ATC GTA TGG GTT G -3 '[28507-28522] - antisense primer: N / - / 28774: 5'-CAG TTT CAC CAC CTC C-3' [28774-28759] - probe 1: 5'-GGC ACC CGC AAT CCT AAT AAC AAT GC-fluorescein 3 '[28561-28586] probe 2: 5' Red705 GCC ACC GTG CTA CAA CTT CCT-phosphate [28588-28608] series 2 (SEQ ID NO: 62, 63, 66, 67) - primer sense: N / + / 28375: 5'-GGC TAC TAC CGA AGA G-3 '[28375-28390] - antisense primer: N / - / 28702: 5'-AAT TAC CGC GAC TAC G-3' [28702-28687] - Probe 1: SARSIN / FL: 5'-ATA CAC CCA ACCA ACA TTG GC - fluorescein 3 '[28541-28563] - probe 2: SARS / NILC705: 5' Red705-CCC GCA ATC CTA ATA ACA ATG CTG C-phosphate 3 '[28565-28589] b) analysis of the efficacy of the two primer pairs In order to test the respective efficacy of the two pairs of primers, an amplification by RT-PCR was performed on a synthetic RNA corresponding to the nucleotide s 28054-29430 of the genome of the strain of SARS-CoV resulting from the sample numbered 031589and containing the sequence of the N gene. More precisely: This synthetic RNA was prepared by in vitro transcription with the aid of phage T7 RNA polymerase, a DNA template obtained by linearization of the plasmid SARS-N with the enzyme Bam HI. After removal of the DNA template by digestion with DNAse 1, the synthetic RNAs are purified by phenol-chloroform extraction followed by two successive precipitations of ammonium acetate and isopropanol. They are then quantified by measuring the absorbance at 260 nm and their quality is controlled by the absorbance ratio at 260 and 280 nm as well as by agarose gel electrophoresis. Thus, the concentration of the synthetic RNA preparation used for these studies is 1.6 mg / ml, which corresponds to 2.1 copies / ml of RNA.

Des quantités décroissantes d'ARN synthétique ont été amplifiés par RTPCR à I'aide du kit "SuperscriptTM One-Step RT-PCR with Platinum Taq" et les couples d'amorces n 1 (N/+/28507, N/-/28774) (figure 1A) et n 2 (N/+ /28375, NI-/28702) (figure 1B), en suivant les indications du fournisseur. Les conditions d'amplification utilisées sont les suivantes: l'ADNc a été synthétisé par incubation 30 min à 45 C, 15 min à 55 C puis 2 min à 94 C puis il a été amplifié par 5 cycles comprenant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 45 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 30 sec, suivis de 35 cycles comprenant: une étape de dénaturation à 94 C pendant 15 sec, une étape d'hybridation à 55 C pendant 30 sec puis une étape d'élongation à 72 C pendant 30 sec, avec 2 sec d'élongation supplémentaire à chaque cycle, et d'une étape finale d'élongation à 72 C pendant 5 min. Les produits d'amplification obtenus ont ensuite été maintenus à 10 C.  Decreasing amounts of synthetic RNA were amplified by RTPCR using the "SuperscriptTM One-Step RT-PCR with Platinum Taq" kit and primer pairs # 1 (N / + / 28507, N / - / 28774). ) (Fig. 1A) and No. 2 (N / + / 28375, NI- / 28702) (Fig. 1B), following the indications of the supplier. The amplification conditions used are as follows: the cDNA was synthesized by incubation for 30 minutes at 45 ° C., 15 minutes at 55 ° C. and then for 2 minutes at 94 ° C. and then amplified by 5 cycles comprising: a denaturation step at 94 C for 15 sec, a hybridization step at 45 C for 30 sec and then an extension step at 72 C for 30 sec, followed by 35 cycles comprising: a denaturation step at 94 C for 15 sec, a step of hybridization at 55 ° C. for 30 sec then an extension step at 72 ° C. for 30 sec, with 2 sec of additional elongation at each cycle, and a final elongation step at 72 ° C. for 5 min. The amplification products obtained were then maintained at 10 ° C.

Les résultats présentés à la figure 11 montrent que le couple d'amorces n 2 (N/+/28375, N/-/28702) permet de détecter jusqu'à 10 copies d'ARN (bande de faible intensité) ou 102 copies (bande de bonne intensité) contre 104 copies pour le couple d'amorces n 1 (N/+/28507, N/-/28774). Les amplicons sont respectivement de 268 pb (couple 1) et de 328 pb (couple 2).  The results presented in FIG. 11 show that pair of primers n 2 (N / + / 28375, N / - / 28702) can detect up to 10 copies of RNA (low intensity band) or 102 copies ( band of good intensity) against 104 copies for primer pair # 1 (N / + / 28507, N / - / 28774). The amplicons are respectively 268 bp (torque 1) and 328 bp (torque 2).

c) mise au point de la RT-PCR en temps réel Une RT-PCR en temps réel a été mise au point à l'aide du couple 25 d'amorces n 2 et du couple de sonde constitué par SRAS/N/FL et SRAS/N/LC705 (figure 2).  c) development of real-time RT-PCR Real-time RT-PCR was developed using primer pair n 2 and the probe pair consisting of SARS / N / FL and SARS / N / LC705 (Figure 2).

L'amplification a été réalisée sur un LightCyclerTM (Roche) à l'aide du kit "Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes " (référence 2 015 145, Roche) dans les conditions optimisées suivantes. Un Mélange réactionnel conte- nant: H2O (6,8 l), MgC12 25 mM (0,8 l, 4 M final de Mg2+), mélange réactionnel 5X (4 l), sonde SRAS/N/FL 3 M (0,5 l, 0,075 M final), sonde SRAS/N/LC705 3 M (0,5 l, 0,075 M final), amorce N/+/28375 10 M (1 l, 0,5 M final), amorce N/-/28702 10 M (1 l, 0,5 M final), mélange d'enzyme (0,4 l) et échantillon (ARN viral, 5 l) a été amplifié en suivant le programme suivant: -Transcription inverse: 50 C 10:O0min analysis mode: none - Dénaturation: 95 C 30sec xl analysis mode: none - Amplification: 95 C 2sec 50 C 15sec analysis mode: quantification*x45 72 C 13sec rampe thermique 2,0 C/sec - refroidissement: 40 C 30sec xl analysis mode: none *La mesure de fluorescence se fait à la fin de l'hybridation et à chaque cycle (en mode SINGLE).  The amplification was carried out on a LightCyclerTM (Roche) using the "Light Cycler RNA Amplification Kit Hybridization Probes" kit (reference 2,015,145, Roche) under the following optimized conditions. A reaction mixture containing: H 2 O (6.8 L), 25 mM MgCl 2 (0.8 L, final 4 Mg 2+), 5X reaction mixture (4 l), 3 M SARS / N / FL probe (0, 5 l, 0.075 M final), 3 M SARAS / N / LC705 probe (0.5 l, final 0.075 M), 10M N / + / 28375 primer (1 L, final 0.5 M), N / - primer 10 M (1 l, 0.5 M final), enzyme mixture (0.4 l) and sample (viral RNA, 5 l) was amplified according to the following program: -Inverse transcription: 50 C 10 : O0min analysis mode: none - Denaturation: 95 C 30sec xl analysis mode: none - Amplification: 95 C 2sec 50 C 15sec analysis mode: quantification * x45 72 C 13sec thermal ramp 2.0 C / sec - cooling: 40 C 30sec xl analysis mode: none * The fluorescence measurement is done at the end of the hybridization and at each cycle (in SINGLE mode).

Les résultats présentés à la figure 12 montrent que cette RT-PCR en temps réel est très sensible puisqu'elle permet de détecter 102 copies d'ARN synthétique dans 100% des 5 échantillons analysés (29/29 échantillons dans 8 expé- riences) et jusqu'à 10 copies d'ARN dans 100% des 5 échantillons analysés (40/45 échantillons dans 8 expériences). Elle montre également que cette RT-PCR permet de détecter la présence du génome du SARS-CoV dans un échantillon et de quantifier le nombre de génomes présents. A titre d'exemple, l'ARN viral d'un stock de SARSCoV cultivé sur cellules Vero E6 a été extrait à l'aide du kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen), dilué à 0,05.104 et analysé par RT-PCR en temps réel selon le protocole décrit ci-dessus; l'analyse présentée à la figure 12 montre que ce stock de virus contient 6,5.109 génomes --équivalents/ml (geq/ml), ce qui est tout à fait similaire à la valeur de 1,0.1010 geq/ml mesurée à l'aide du kit "RealArtTM HPACoronavirus LC RT PCR Reagents" commercialisé par Artus.  The results presented in FIG. 12 show that this RT-PCR in real time is very sensitive since it makes it possible to detect 102 copies of synthetic RNA in 100% of the analyzed samples (29/29 samples in 8 experiments) and up to 10 copies of RNA in 100% of the 5 samples analyzed (40/45 samples in 8 experiments). It also shows that this RT-PCR makes it possible to detect the presence of the SARS-CoV genome in a sample and to quantify the number of genomes present. By way of example, the viral RNA of a stock of SARSCoV grown on Vero E6 cells was extracted using the "Qiamp viral RNA extraction" kit (Qiagen), diluted to 0.05 × 10 4 and analyzed by RT- Real-time PCR according to the protocol described above; the analysis presented in Figure 12 shows that this virus stock contains 6.5.109 equivalent genomes / ml (geq / ml), which is quite similar to the value of 1.0.1010 geq / ml measured at the same time. 'RealArtTM HPACoronavirus LC RT PCR Reagents' kit marketed by Artus.

d) détection de l'ARN du SARS-CoV par PCR en temps réel à partir de prélèvements respiratoires Une étude comparative a été réalisée sur une série de prélèvements respiratoires reçus par le Centre National de Référence du Virus Influenzae (région nord) et susceptibles de contenir du SARS-CoV. Pour ce faire, l'ARN a été extrait des prélèvements à l'aide du kit "Qiamp viral RNA extraction" (Qiagen) et analysé par RT-PCR en temps réel, d'une part à l'aide des couples d'amorces et de sondes de la série n 2 dans les conditions décrites ci-dessus d'une part, et d'autre part à l'aide du kit "LightCycler SARS-CoV quantification kit" commercialisé par Roche (référence 03 604 438). Les résultats sont résumés dans le Tableau ci-dessous. Ils montrent que 18 des 26 prélèvements sont négatifs et 5 des 26 prélèvements sont positifs pour les deux kits, tandis qu'un prélèvement est positif pour le seul kit Roche et deux pour les seuls réactifs N"sériel". En outre, pour 3 prélèvements (20032701, 20032712, 20032714) les quantités d'ARN détectés sont nettement supérieures avec les réactifs (sondes et amorces) de la série n 2. Ces résultats indiquent que les amorces et sondes N"série2" sont plus sensibles pour la détection du génome du SARS-CoV dans des prélèvements biologiques que celles du kit actuellement disponible.  d) detection of SARS-CoV RNA by real-time PCR from respiratory samples A comparative study was carried out on a series of respiratory samples received by the National Influenza Reference Center (North Region) and likely to contain SARS-CoV. To do this, the RNA was extracted from the samples using the "Qiamp viral RNA extraction" kit (Qiagen) and analyzed by RT-PCR in real time, on the one hand using pairs of primers. and probes of the n 2 series under the conditions described above on the one hand, and on the other hand using the kit "LightCycler SARS-CoV quantification kit" marketed by Roche (reference 03 604 438). The results are summarized in the Table below. They show that 18 of the 26 samples are negative and 5 of the 26 samples are positive for both kits, while one sample is positive for the only Roche kit and two for the only N "serial" reagents. In addition, for 3 samples (20032701, 20032712, 20032714) the detected amounts of RNA are clearly higher with the reagents (probes and primers) of the n 2 series. These results indicate that the N "series2" primers and probes are more sensitive for the detection of the genome of SARS-CoV in biological samples than those of the kit currently available.

Tableau V: Analyse par RT-PCR en temps réel des ARN extraits d'une série de prélèvements de 5 patients à l'aide des couples d'amorces et de sondes de la série n 2 (N "série 2") ou du kit "LightCycler SARS-CoV quantification kit" (Roche). Le type de prélèvement est indiqué ainsi que le nombre de copies de génome viral mesurées dans chacun des deux tests. NEG: RT-PCR négative.  Table V: Real-time RT-PCR analysis of the RNAs extracted from a series of samples of 5 patients using pairs of primers and probes of the series n 2 (N "series 2") or of the kit "LightCycler SARS-CoV Quantization Kit" (Roche). The type of sample is indicated as well as the number of viral genome copies measured in each of the two tests. NEG: negative RT-PCR.

Prélèvements n Patient Type de prélèvement KIT ROCHE N "sériel" 20033082 K nasal NEG NEG 20033083 K pharyngé NEG NEG 20033086 K nasal NEG NEG 20033087 K pharyngé NEG NEG 20032802 M nasal NEG NEG 20032803 M expectoration NEG NEG 20032806 M nasal ou pharyngé NEG NEG 20031746ARN2 C pharyngé NEG NEG 20032711 C nasal ou pharyngé 39 NEG 20032910 B nasal NEG NEG 20032911 B pharyngé NEG NEG 20033356 V expectoration NEG NEG 20033357 V expectoration NEG NEG 20031725 K asp. endotrachéale NEG 150 20032657 K asp. endotrachéale NEG NEG 20032698 K asp. endotrachéale NEG NEG 20032720 K asp. endotrachéale 3 5 20033074 K selles 115 257 20032701 M pharyngé 443 1676 20032702 M expectoration NEG 249 20031747ARN2 C pharyngé NEG NEG 20032712 C inconnu 634 6914 20032714 C pharyngé 17 223 20032800 B nasal NEG NEG 20033353 V nasal NEG NEG 20033384 V nasal NEG NEG  Collection n Patient Collection Specimen KIT ROCK N "serial" 20033082 K nasal NEG NEG 20033083 K pharyngeal NEG NEG 20033086 K nasal NEG NEG 20033087 K pharyngeal NEG NEG 20032802 M nasal NEG NEG 20032803 M expectoration NEG NEG 20032806 M nasal or pharyngeal NEG NEG 20031746ARN2 C pharyngeal NEG NEG 20032711 C nasal or pharyngeal 39 NEG 20032910 B nasal NEG NEG 20032911 B pharyngeal NEG NEG 20033356 Sputum NEG NEG 20033357 V expectoration NEG NEG 20031725 K asp. endotracheal NEG 150 20032657 K asp. endotracheal NEG NEG 20032698 K asp. endotracheal NEG NEG 20032720 K asp. endotracheal 3 5 20033074 K stool 115 257 20032701 M pharyngeal 443 1676 20032702 M expectoration NEG 249 20031747ARN2 C pharyngeal NEG NEG 20032712 C unknown 634 6914 20032714 C pharyngeal 17 223 20032800 B nasal NEG NEG 20033353 N nasal NEG NEG 20033384 N nasal NEG NEG

Claims (12)

REVENDICATIONS,CLAIMS, 1 ) Utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par: a) une protéine ou un peptide codé par le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1, b) un anticorps ou un fragment d'anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre ladite protéine ou ledit peptide en a), et c) une puce ou un filtre à protéine ou à peptide comprenant la protéine ou le peptide en a) ou bien l'anticorps ou le fragment d'anticorps en b), pour la préparation d'un réactif de détection et éventuellement de sérotypage, d'un coronavirus associé au SRAS.  1) Use of a product selected from the group consisting of: a) a protein or peptide encoded by the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 1, b) an antibody or a monoclonal or polyclonal antibody fragment directed against said protein or said peptide in a), and c) a protein or peptide chip or filter comprising the protein or peptide in a) or the antibody or antibody fragment in b), for the preparation of a detection reagent and possibly serotyping, a coronavirus associated with SARS. 2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine est sélectionnée dans le groupe constitué par: - la protéine S de séquence SEQ ID NO:3, - la protéine E de séquence SEQ ID NO: 14, - la protéine M de séquence SEQ ID NO: 17, - la protéine N de séquence SEQ ID NO: 37, et - les protéines codées par les ORF: ORF 1 a, ORF lb, ORF3, ORF4 et ORF7 à ORF 11, ORF13 et ORF 14 de séquence respectivement, SEQ ID NO: 74, 75, 10, 12, 22, 24, 26, 28, 30, 33 et 35.  2) Use according to claim 1, characterized in that said protein is selected from the group consisting of: the protein S of sequence SEQ ID NO: 3, the protein E of sequence SEQ ID NO: 14, the protein M of sequence SEQ ID NO: 17, the protein N of sequence SEQ ID NO: 37, and the proteins encoded by the ORFs ORF 1a, ORF 1b, ORF3, ORF4 and ORF7 to ORF 11, ORF13 and ORF 14 of sequence respectively, SEQ ID NO: 74, 75, 10, 12, 22, 24, 26, 28, 30, 33 and 35. 3 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par: a) les peptides correspondant aux positions 14 à 1193 et 475 à 1193 de la séquence en acides aminés de la protéine S, b) les peptides correspondant aux positions 2 à 14 (SEQ ID NO: 69) 25 et 100 à 221 de la séquence en acides aminés de la protéine M; et c) les peptides correspondant aux positions 1 à 12 (SEQ ID NO: 70) et 53 à 76 (SEQ ID NO: 71) de la séquence en acides aminés de la protéine E; et les peptides de 5 à 50 acides aminés consécutifs, de préférence de 10 à 30 acides aminés, inclus ou chevauchant partiellement ou totalement la séquence des peptides tels que définis en a), b) ou c).  3) Use according to claim 1, characterized in that said peptide is selected from the group consisting of: a) the peptides corresponding to the positions 14 to 1193 and 475 to 1193 of the amino acid sequence of the protein S, b) the peptides corresponding to positions 2 to 14 (SEQ ID NO: 69) and 100 to 221 of the amino acid sequence of protein M; and c) the peptides corresponding to positions 1 to 12 (SEQ ID NO: 70) and 53 to 76 (SEQ ID NO: 71) of the amino acid sequence of protein E; and peptides of 5 to 50 consecutive amino acids, preferably 10 to 30 amino acids, included or overlapping partially or totally the sequence of the peptides as defined in a), b) or c). 4 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit peptide est constitué de 7 à 50 acides aminés consécutifs codés par le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 1, lequel peptide est sélectionné dans le groupe constitué par: - un peptide comprenant l'alanine située en position 2552 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par 1'ORF1a, - un peptide comprenant la sérine située en position 577 de la séquence en acides aminés de la protéine S, - un peptide comprenant la glycine en position 11 de la séquence en acides aminés de la protéine codée par l'ORF3, et - un peptide comprenant la sérine en position 154 de la séquence en 10 acides aminés de la protéine M.  4) Use according to claim 1, characterized in that said peptide consists of 7 to 50 consecutive amino acids encoded by the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 1, which peptide is selected from the group consisting of: - a peptide comprising alanine located at position 2552 of the amino acid sequence of the protein encoded by ORF1a; - a peptide comprising serine located at position 577 of the amino acid sequence of protein S; - a peptide comprising glycine in position 11 of the amino acid sequence of the protein encoded by ORF3, and a peptide comprising serine at position 154 of the 10 amino acid sequence of protein M. 5 ) Méthode de détection d'un coronavirus associé au SRAS, à partir d'un échantillon biologique, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins: (a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un anticorps ou un fragment d'anticorps, une protéine, un peptide ou bien une puce ou un filtre à protéine ou à peptide tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 4, et (b) la révélation par tout moyen approprié des complexes antigène- anticorps formés en (a).5) Method for detecting a SARS-associated coronavirus from a biological sample, which method is characterized in that it comprises at least: (a) bringing said biological sample into contact with at least one antibody or an antibody fragment, a protein, a peptide or a protein or peptide chip or filter as defined in any one of claims 1 to 4, and (b) revealing by any suitable means antigen complexes antibodies formed in (a). 6 ) Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'étape (a) comprend: la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un premier anticorps ou fragment d'anticorps qui est fixé sur un support approprié, notamment une microplaque, (a2) le lavage de la phase solide, et (a3) l'addition d'au moins un second anticorps ou fragment d'anticorps, différent du premier, ledit anticorps ou fragment d'anticorps étant éventuellement marqué de façon appropriée.  6) Method according to claim 5, characterized in that step (a) comprises: bringing said biological sample into contact with at least a first antibody or antibody fragment which is fixed on a suitable support, in particular a microplate, (a2) washing the solid phase, and (a3) adding at least a second antibody or antibody fragment, different from the first, said antibody or antibody fragment being optionally labeled appropriately. 7 ) Kit ou coffret de détection d'un coronavirus associé au SRAS, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif sélectionné dans le groupe constitué par: une protéine ou un peptide, un anticorps ou un fragment d'anticorps et une puce ou un filtre à protéine ou à peptide tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 4.  7) Kit or kit for detecting a coronavirus associated with SARS, characterized in that it comprises at least one reagent selected from the group consisting of: a protein or a peptide, an antibody or an antibody fragment and a chip or a protein or peptide filter as defined in any one of claims 1 to 4. 8 ) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un produit sélectionné dans le groupe constitué par: a) une protéine ou un peptide tels que définis à la revendication 1, b) un polynucléotide de type ADN ou ARN ou l'un de ses fragments représentatifs, de séquence choisie parmi: (i) la séquence SEQ ID NO: 1 ou son équivalent ARN (ii) la séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la 10 séquence SEQ ID NO: 1, (iii) la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 1 ou de la séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence SEQ ID NO: 1, (iv) la séquence nucléotidique d'un fragment représentatif du poly-15 nucléotide tel que défini en (i), (ii) ou (iii), (v) la séquence telle que définie en (i), (ii), (iii) ou (iv), modifiée, et c) un vecteur d'expression recombinant comprenant un polynucléotide tel que défini en b), et d) une banque d'ADNc comprenant un polynucléotide tel que défini en b).  8) Immunogenic composition, characterized in that it comprises at least one product selected from the group consisting of: a) a protein or a peptide as defined in claim 1, b) a polynucleotide of DNA or RNA type or the one of its representative fragments, of a sequence chosen from: (i) the sequence SEQ ID NO: 1 or its RNA equivalent (ii) the sequence hybridizing under conditions of high stringency with the sequence SEQ ID NO: 1, (iii) the sequence complementary to the sequence SEQ ID NO: 1 or the hybridizing sequence under conditions of high stringency with the sequence SEQ ID NO: 1, (iv) the nucleotide sequence of a representative fragment of the poly-nucleotide as defined in (i), (ii) or (iii), (v) the sequence as defined in (i), (ii), (iii) or (iv), modified, and (c) a recombinant expression vector comprising a polynucleotide as defined in b), and d) a cDNA library comprising a polynucleotide as defined in B). 9 ) Utilisation d'une protéine ou d'un peptide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75, in vitro, pour former un complexe immun avec un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus associé au SRAS.  9) Use of an Isolated or Purified Protein or Peptide Having a Sequence Selected from the Group consisting of SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 and 75, in vitro, to form an immune complex with an antibody directed specifically against a SARS-associated coronavirus epitope. 10 ) Complexe immun formé d'une protéine ou d'un peptide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75, et d'un anticorps dirigé spécifiquement contre un épitope du coronavirus associé au SRAS.  10) an immune complex formed of an isolated or purified protein or peptide having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 and 75, and an antibody directed specifically against a SARS-associated coronavirus epitope. 11 ) Utilisation d'une protéine ou d'un peptide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 et 75, pour la préparation d'une composition immunogène apte à induire la production d'un anticorps capable de reconnaître spécifiquement un épitope du coronavirus associé au SRAS.  11) Use of an Isolated or Purified Protein or Peptide Having a Sequence Selected from the Group consisting of SEQ ID NO: 3, 10, 12, 14, 17, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37, 69, 70, 71, 74 and 75, for the preparation of an immunogenic composition capable of inducing the production of an antibody capable of specifically recognizing a SARS-associated coronavirus epitope. 12 ) Utilisation d'un polynucléotide isolé ou purifié présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 8, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 31, 36 et 38, pour la préparation d'une composition immunogène apte à induire la production d'un anticorps dirigé contre la protéine codée par ledit polynucléotide et capable de reconnaître spécifiquement un épitope du coronavirus associé au SRAS.  12) Use of an isolated or purified polynucleotide having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 8, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 31, 36 and 38, for the preparation of an immunogenic composition capable of inducing the production of an antibody directed against the protein encoded by said polynucleotide and capable of specifically recognizing a SARS-associated coronavirus epitope.