FR2850872A1 - Composition vaccinale destinee a induire une reponse immunitaire contre le virus responsable du sida - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une composition pharmaceutique contenant une dispersion ou une suspension dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable de vésicules multilamellaires à structure interne cristal-liquide, formées d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse, de liquide polaire ou de solution d'un liquide polaire, et au sein desquelles se trouve incorporé au moins un antigène protéique du virus VIH.L'antigène est en particulier la protéine P 24.La composition permet d'amplifier et d'orienter la réponse immunitaire induite contre cet antigène aussi bien par injection qu'après administration par voie muqueuse.

Description

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La présente invention concerne une composition pharmaceutique vaccinale destinée à induire une réponse immunitaire contre le virus responsable du sida.

Plus précisément, l'invention concerne une composition vaccinale destinée à administrer un antigène du virus d'immunodéficience humaine (VIH) et à amplifier et orienter la réponse immunitaire induite contre cet antigène aussi bien par injection qu'après administration par 10 voie muqueuse.

On rappelle tout d'abord ci-après quelques notions et définitions.

Le système immunitaire assure la protection de l'organisme contre les pathogènes et les agents exogènes. Il met en place une 15 immunité humorale composée d'anticorps sériques répartis en différentes sousclasses ou isotypes et une immunité cellulaire. La composante cellulaire est caractérisée par l'activation des lymphocytes TCD4+ et TCD8+ cytotoxiques (CTL) et des cellules NK. Elle est mise en évidence par la lymphoprolifération, la sécrétion d'interleukines et/ou la lyse des cellules 20 infectées ou tumorales. Les interleukines (IL) sont des médiateurs solubles qui agissent de manière autocrine ou paracrine sur les différents types cellulaires du système immunitaire. Les lymphocytes TCD4+ peuvent être classé en deux types selon le profil d'interleukines qu'ils sécrètent. Ainsi, les lymphocytes de type 1 ou Thl sécrètent de lIL-2 et de l'Interféron 25 gamma alors que les lymphocytes de type 2 ou Th2 sécrètent de 1IL-4, de l'IL-5 et de lIL-10. Le mode de présentation de l'antigène aux cellules présentatrices d'antigènes (cellules dendritiques et macrophages) va également conditionner précocement le type de réponse induite. Ainsi, la dose, la fréquence, le mode de présentation et la voie d'administration ont 30 une influence sur la réponse immunitaire.

Les antigènes peuvent être administrés par immunisation parentérale, systémique ou par voie muqueuse.

On entend par voie muqueuse une administration non invasive de l'antigène à un site muqueux, par exemple - aire naso-pharyngée - aire buccale arbre bronchique - intestin - tractus uro-génital - oreille interne conjonctive - glandes mammaires, salivaires et lacrymales. Parmi ces différents constituants du tissu lymphode associé aux muqueuses (MALT), certaines voies d'introduction sont d'un accès et d'une 15 acceptabilité plus aisés: nasale, buccale, gastro-intestinale, rectale et vaginale.

La réponse muqueuse est la réponse du système immunitaire au niveau des muqueuses caractérisée par une production d'IgA (isotype en concentration importante dans les muqueuses) et d'IgG et/ou par une 20 réponse cellulaire au sein du site muqueux et des ganglions drainants.

La réponse systémique est la réponse du système immunitaire généralisée se traduisant par la présence d'anticorps circulants (IgG répartis en différentes sous-classes et aussi IgA) et/ou par une réponse cellulaire (Thelper ou CTL) dans les organes lymphoides secondaires (rate, 25 ganglions).

Un adjuvant est une substance ajoutée à l'antigène de manière à amplifier et orienter la réponse immunitaire spécifique dirigée contre cet antigène.

La vectorisation par un vecteur synthétique consiste à 30 incorporer l'antigène dans et/ou à la surface d'une particule ou vésicule, de manière à protéger l'antigène et/ou à faciliter sa capture par les cellules compétentes du système immunitaire et/ou à faciliter l'apprètement de l'antigène par lesdites cellules, et ainsi à amplifier la réponse immunitaire. L'addition d'un vecteur vide à l'antigène libre n'apporte en général pas ou peu d'amplification.

Les antigènes du virus d'immunodéficience humain (VIH) sont des polyprotéines ou protéines codées par le génome du VIH. Neuf gènes codent pour * des polyprotéines ou des protéines de structure, * des protéines à activité enzymatique: protéases ou protéines impliquées dans l'intégration, la reverse-transcription et la réplication, et * des protéines de régulation de cette activité.

Ces protéines peuvent être glycosylées (glycoprotéines).

Par antigène protéique du virus VIH, au sens de la présente invention, on entend tous les antigène du virus VIH sous forme de protéines ou de polyprotéines, glycosylées ou non.

Le sida est un fléau qui touche plus de 30 millions d'humains et pour lequel il n'existe aujourd'hui aucun vaccin, ni prophylactique, ni 20 thérapeutique. Cependant, compte tenu de la très grande prévalence de cette maladie dans les pays aux revenus les plus faibles, le vaccin apparaît comme le seul moyen de lutte efficace, les thérapies antivirales étant d'un cot prohibitif.

Les difficultés de mise au point d'un vaccin dirigé contre le virus 25 d'immunodéficience humain sont principalement liées à la rapidité de mutation du virus. Les différentes études sur les personnes résistantes à l'infection par le VIH ou infectées par ce virus, mais ne développant pas la maladie, ont suggéré que la présence simultanée d'anticorps neutralisants (anticorps systémiques IgG et anticorps muqueux IgA) et l'induction d'une 30 réponse lymphocytaire T cytotoxique sont les effecteurs majeurs de l'immunité anti-virale. L'induction d'une réponse TCD4+ de type 1 est également un facteur favorable à la sélection ou l'expansion des populations cellulaires cytotoxiques. L'orientation de la réponse immunitaire vers ces composantes est donc une piste sérieuse pour la 5 mise au point d'un vaccin contre le VIH. Plusieurs antigènes sont actuellement utilisés pour ces mises au point. Les plus connus sont les protéines d'enveloppe du type GP160 ou ses dérivées GP120 ou GP41 (cf. par exemple WO 92/06113 de Smithkline Beecham Biologicals), la protéine de la capside codée par le motif GAG, ainsi que ses dérivées comme P24 10 ou P17 ou les protéines de fusion entre ces dernières et les précédentes (cf. WO 90/03735 de Pharmacia Genetics Engineering Inc), ainsi que les protéines Nef et Tat modifiées pour perdre leur caractère régulateur et leurs dérivées ou protéines de fusion (cf. WO 01/00232 de Smithkline Beecham Biologicals).

L'une des difficultés techniques pour la mise au point de ces vaccins est l'obtention d'un véhicule capable de protéger la protéine antigène, de permettre son administration, et de stimuler le système immunitaire afin d'induire une réponse immunitaire efficace. Ce véhicule doit donc présenter des propriétés adjuvantes suffisantes, et être capable 20 d'orienter la réponse vers le profil le plus favorable.

Aujourd'hui, les seuls adjuvants acceptés en médecine humaine sont principalement l'hydroxyde ou le phosphate d'aluminium. Ces sels se présentent sous la forme d'une suspension de grains de sel d'aluminium, à la surface desquels est adsorbé l'antigène. Ils présentent plusieurs 25 inconvénients: ils induisent des réactions locales inflammatoires et la production dIgE, ils ne sont pas efficaces pour tous les antigènes et ils sont incapables d'engendrer des réactions à médiation cellulaire de type CTL. De plus, de récentes craintes sont apparues sur la possibilité de toxicité locale des adjuvants à base d'aluminium, ce qui a conduit à 30 restreindre leur utilisation dans le développement de nouveaux vaccins.

Enfin ils ne sont pas utilisables dans une administration nasale. Un substitut aux sels d'aluminium est constitué des phosphates de calcium, qui connaissent récemment un regain d'intérêt, compte tenu des craintes liées à l'utilisation de l'aluminium.

On trouve de nombreux documents faisant état de stratégies de mise au point de vaccins contre le sida, utilisant les antigènes cités précédemment, et divers systèmes adjuvants. Outre les sels d'aluminium, utilisés dans les demandes EP 0,327,180, et WO 92/22654 de MicroGeneSys Inc, les principaux adjuvants sont les toxines détoxifiées, 10 par exemple l'endotoxine sensible à la chaleur d'E Co/i(cf. WO 98/32461 de The Administrators of the Tulane Educational Fund), ou des modifications du lipide A, par exemple le 3D Mpl (monophosphoryl 3 déacylé du lipide A) comme décrit dans WO 92/06113. Bien d'autres adjuvants ont été développés, comme les dérivés de saponine, le muramyl 15 dipeptide, les toxines tétaniques ou cholériques détoxifiées, mais peu de documents décrivent leur utilisation dans des vaccins dirigés contre le sida.

Plus récemment, on a vu apparaître de nouveaux adjuvants, comme le DCChol (obtenu par réaction du choloroformiate sur la N,N20 diméthyléthylènediamine selon WO 96/40067) en mélange avec l'une des protéines citées ci-dessus (cf. WO 02/28427 d'Aventis Pasteur). Une autre approche récente est l'utilisation d'oligonucléotides présentant une séquence CpG, connue pour sa capacité à amplifier et orienter la réponse immunitaire. Ils sont décrits pour une application contre le virus du sida 25 dans WO 01/00232. Leur mode d'action est différent des adjuvants plus classiques, puisqu'ils peuvent être administrés avant l'immunisation ellemême.

Enfin on peut noter que dans certaines demandes de brevets, plusieurs adjuvants sont utilisés simultanément afin de bénéficier d'un 30 effet de synergie. C'est le cas de WO 01/00232 qui couple un adjuvant à base d'aluminium et un oligonucléotide CpG. Dans d'autres demandes, l'adjuvant et/ou l'antigène sont formulés sous forme d'une émulsion, en général de type huile dans l'eau (cf. WO 92/06113 et WO 02/28427).

On trouve peu de documents enseignant l'utilisation de 5 liposomes ou d'autres vésicules à base de lipides ou d'amphiphiles couplées à des protéines du VIH dans une stratégie vaccinale contre le sida. L'utilisation de liposomes est citée dans WO 02/28427 mais la lecture de l'exemple 8 enseigne que seul l'adjuvant DC-Chol est incorporé dans les liposomes. WO 99/00142 enseigne l'utilisation de liposomes lyophilisés 10 pour administrer oralement une protéine virale, en particulier du VIH.

WO 96/40243, de US Department of the Army, enseigne l'utilisation de liposomes comprenant la protéine GP120 et le lipide A pour induire une réponse immunitaire. La partie bibliographique de ce document démontre, à l'aide de nombreuses citations que l'utilisation de liposomes pour 15 amplifier une réponse immunitaire contre un antigène donné n'est pas évidente, et qu'aucun outil prédictif n'existe pour anticiper le résultat.

Dans une infection telle que celle du VIH, la voie d'administration du vaccin joue certainement un rôle important. Le pathogène ayant une porte d'entrée muqueuse, la génération d'anticorps 20 IgA, spécifiques du tissu muqueux, et qui plus est, au niveau de la muqueuse urogénitale est une caractéristique recherchée dans un vaccin prophylactique contre le sida.

La plupart des travaux présentés dans les demandes citées font appel à la voie injectable, même si d'autres voies d'administration sont 25 décrites dans le texte des demandes. WO 99/00142 décrit et enseigne uniquement la voie orale, alors que WO 02/28427 propose outre la voie injectable une voie muqueuse (nasale). Il est connu que les systèmes basés sur des sels d'aluminium ou de calcium ne sont pas utilisables dans une administration muqueuse, à cause de leur intolérance locale sur les 30 muqueuses nasales et en particulier sur la fonction ciliée.

Aucune des technologies de délivrance d'antigènes ou d'adjuvants n'a pour le moment permis d'aboutir à un vaccin contre le sida sur le marché. Les méthodes de présentation de l'antigène doivent donc encore être améliorées et le développement de nouveaux adjuvants ou 5 vecteurs d'antigènes demeure un besoin urgent dans la mise au point d'un vaccin contre le VIH.

Parmi les vésicules, objets sphériques formés d'arrangements moléculaires de molécules amphiphiles, les vésicules multilamellaires à structure en oignon ont fait l'objet d'importantes recherches et ont donné 10 lieu à plusieurs brevets (WO 93/19735; WO 95/18601; WO 97/00623; WO 98/02144; WO 99/16468). Elles se distinguent des liposomes par: t leur mode de préparation qui part d'une phase lamellaire à l'équilibre thermodynamique I leur structure interne cristal-liquide formée d'un empilement 15 régulier de bicouches concentriques d'amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de liquide polaire, de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire (glycérol, par exemple) > la nature variée des molécules amphiphiles qui peuvent être utilisées pour les constituer, seules ou en mélange.

La demande internationale WO 99/16468 décrit des vésicules à structure en oignon incorporant en leur sein un antigène et permettant d'amplifier la réponse immunitaire de cet antigène. Cette demande internationale qui décrit pour la première fois l'incorporation (également désignée dans ce document par encapsulation) d'antigènes au sein d'une 25 vésicule multilamellaire à structure en oignon montre clairement dans ses exemples qu'une telle encapsulation permet très nettement d'amplifier la réponse immunitaire lors d'une administration parentérale d'un antigène encapsulé dans une vésicule multilamellaire à structure en oignon.

On a également décrit dans la demande internationale 30 WO 01/19335 un nouveau mode d'administration par voie muqueuse d'un antigène incorporé dans le même type de vésicule multilamellaire et mis en évidence que ce type d'administration par voie muqueuse permettait d'engendrer une réponse immunitaire non seulement au sein des différents sites muqueux mais également dans le compartiment systémique.

Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert que l'administration par voie sous-cutanée d'une composition comprenant un antigène protéique du VIH incorporé dans des vésicules du type de celles décrites dans la demande WO 99/16468, engendre une 10 réponse immunitaire dirigée contre cet antigène et qu'en plus, cette réponse est orientée, avec une modification importante de la distribution des sous-classes d'anticorps en faveur des anticorps IgG2a. De plus l'administration de la même composition par voie muqueuse entraîne l'induction à la fois d'anticorps IgG, mais aussi d'IgA spécifiques du VIH 15 dans le compartiment systémique et dans différents sites muqueux En effet, comme cela ressort de la description et des exemples qui suivent, il s'est avéré que les compositions dans lesquelles l'antigène du VIH se trouve incorporé dans une vésicule à structure en oignon, telle que définie ci- dessus, permettent lorsqu'elles sont administrées par voie 20 muqueuse, d'engendrer une réponse immune IgA muqueuse délocalisée (pulmonaire, intestinale et vaginale) et donc de stimuler le tissu lymphode muqueux commun. De telles capacités se révèlent d'une importance particulière lorsque l'on s'adresse à des antigènes à potentiel vaccinant, face à des pathogènes invasifs à tropisme muqueux tel que le VIH, dont la 25 porte d'entrée est justement muqueuse.

La double possibilité d'induire à la fois une réponse muqueuse et une réponse systémique présente un grand intérêt en vaccination car elle simplifie l'administration tout en offrant une immunité à plusieurs niveaux: muqueux pour défendre les voies d'accès du virus et systémique 30 pour combattre l'infection plus disséminée ou généralisée.

Ceci constitue un avantage particulièrement remarquable de la présente invention.

Par ailleurs, la mise en évidence du fait que les compositions de l'invention modifient l'isotypie vers une réponse IgG2a suggère une 5 orientation de la réponse cellulaire vers un profil de type 1 (la polarisation vers les IgG2a étant dépendante de la sécrétion dInterféron, y). Cette orientation constitue un avantage particulier des compositions de l'invention puisque ce profil est particulièrement recherché quand il s'agit de lutter contre les virus et en particulier contre le VIH.

D'autre part, les vésicules multilamellaires utilisées selon l'invention peuvent être préparées à partir de constituants biocompatibles connus pour leur innocuité.

De plus, le procédé de préparation est de mise en oeuvre simple et ne fait appel qu'à des appareils courants de la chimie. Le fait que le 15 procédé fasse appel à une phase lamellaire initiale à l'équilibre thermodynamique lui donne une excellente reproductibilité et permet une grande stabilité des vésicules obtenues.

Ainsi, selon l'une de ses caractéristiques essentielles, l'invention concerne une composition pharmaceutique contenant une dispersion ou 20 une suspension dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable de vésicules multilamellaires à structure interne cristal-liquide, formées d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse, de liquide polaire ou de solution d'un liquide polaire et au sein desquelles se trouve 25 incorporé au moins un antigène protéique du virus VIH.

Par le terme "incorporé" dont l'utilisation nous semble préférable à celle du terme "encapsulé", on entend que le ou les antigènes font partie intégrante de l'entité constituée par la vésicule. En effet, on peut trouver des molécules d'antigène(s) dans n'importe quelle couche 30 comprise entre le centre et la périphérie de ladite vésicule.

Comme cela ressort de la description détaillée qui suit ainsi que des exemples, les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont utilisables comme vaccin destiné à induire une réponse systémique ou muqueuse.

Ainsi que cela ressort clairement des exemples, les vésicules à structure en oignon telles que définies précédemment incorporant un antigène du VIH induisent, chez l'homme ou l'animal, la production d'anticorps spécifiques dirigés contre le VIH et ce, que ce soit par injection ou par administration muqueuse, en particulier nasale.

Selon une autre de ses caractéristiques essentielles, l'invention concerne un procédé de fabrication des compositions de l'invention, comprenant la préparation de vésicules à structure cristal-liquide par transformation d'une phase cristal-liquide renfermant au moins un agent amphiphile et au moins un antigène protéique du VIH et la dispersion 15 desdites vésicules dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Les vésicules utilisées selon l'invention, ont généralement des diamètres compris entre 0,1 et 25 pm, de préférence entre 0,2 et 15 pm.

Plus précisément, les vésicules contenues dans les compositions de l'invention sont constituées de plusieurs couches d'agents amphiphiles 20 alternant avec des couches de phase aqueuse ou polaire. L'épaisseur de chacune de ces couches est une épaisseur moléculaire, typiquement de l'ordre de 5 à 10 nanomètres. Pour un empilement d'une dizaine à quelques centaines de couches, on obtient donc un diamètre compris entre 0,1 pnm et quelques dizaines de micromètres. C'est ce qui est 25 observé expérimentalement, les vésicules étant observables en microscopie optique (en lumière polarisée afin d'avoir un meilleur contraste lié à leur biréfringence), soit comme des points non résolus pour les plus petites d'entre elles, soit comme des sphères biréfringentes pour les plus grosses. Le profil de tailles peut être étudié à l'aide d'un 30 granulomètre laser (utilisant la diffusion statique d'un faisceau laser, il analysée sous plusieurs angles). On obtient en général un profil gaussien centré sur une valeur variant entre 0,1 et 25 pm montrant une faible hétérogénéité de la taille pour une formulation donnée, dans des conditions opératoires de préparation données.

Les vésicules dans lesquelles se trouve incorporé l'antigène ont, comme exposé précédemment, une structure multilamellaire en oignon et sont constituées, de leur centre jusqu'à leur périphérie, d'une succession de couches lamellaires séparées par un milieu liquide. Ces vésicules peuvent être obtenues par un procédé comprenant la préparation d'une 10 phase lamellaire cristal-liquide et sa transformation par application d'un cisaillement. Un tel procédé est en particulier décrit dans le brevet WO 93/19735 issu du brevet français FR-2 689 418 ou WO 95/18601.

Selon le brevet français FR-2 689 418, cette transformation peut être faite lors d'une étape de cisaillement homogène de la phase 15 cristalliquide, ce qui conduit à des vésicules encore appelées microcapsules de taille contrôlée. Toutefois, en jouant sur la formulation de la phase lamellaire cristal-liquide, en particulier sur la nature des tensioactifs entrant dans sa composition, la transformation de cette phase cristalliquide en vésicules peut être obtenue par simple sollicitation 20 mécanique, en particulier lors du mélange des constituants.

De telles vésicules présentent, entre autres, l'avantage de pouvoir être préparées par un procédé de préparation particulièrement simple permettant d'utiliser une grande variété de tensioactifs.

Un autre avantage, lié lui aussi essentiellement au procédé 25 utilisé pour préparer les vésicules à structure en oignon utilisées selon l'invention, réside dans le fait que l'on incorpore les actifs et les additifs préalablement à la formation des vésicules, ce qui permet un excellent rendement d'encapsulation, d'o une meilleure efficacité et une économie très importante pour des molécules extrêmement coteuses.

De telles structures sont avantageusement obtenues par incorporation d'au moins un antigène protéique du VIH dans une phase lamellaire cristalliquide comprenant au moins un agent tensioactif puis transformation de cette phase cristal-liquide lamellaire en une phase dense de vésicules multilamellaires de petite taille.

Ainsi, les vésicules utilisées selon l'invention peuvent être obtenues selon un procédé selon lequel on prépare une phase cristalliquide lamellaire incorporant au moins un antigène et on provoque le réarrangement de ladite phase cristal-liquide en vésicules multilamellaires 10 par application d'un cisaillement.

Ce cisaillement pourra être un cisaillement homogène, ce qui présente l'avantage de conduire à des vésicules de taille parfaitement homogène. Toutefois, une simple agitation mécanique pourra s'avérer suffisante pour conduire à la formation des vésicules multilamellaires de 15 l'invention.

L'antigène pourra être tout antigène protéique du virus VIH.

Il pourra s'agir aussi bien d'un antigène sous forme d'une protéine ou d'une polyprotéine, glycosylée ou non.

Il pourra s'agir en particulier d'une protéine ou d'une 20 glycoprotéine dite protéine de structure, issue de l'enveloppe du virus ou de sa nucléocapside ou d'une protéine régulatrice ou enzymatique ou toute protéine dérivée de ce type de protéines.

L'antigène pourra en particulier être une protéine d'enveloppe du virus VIH, en particulier une protéine du type GP 160 ou une protéine 25 dérivée de type GP 120 ou GP 4lcodée par le gène env.

L'antigène pourra aussi être une protéine enzymatique impliquée dans l'intégration, la transcription, la réplication du virus et de son matériel génétique.

Il pourra aussi être une protéine régulatrice de la transcription 30 ou de la réplication.

Il pourra également s'agir d' une protéine de la capside du virus VIH codée par le gène gag ou une protéine dérivée d'une telle protéine telle que la protéine P 24 ou P 17 ou une protéine de fusion.

Un exemple de telle protéine préférée selon l'invention est la protéine P24.

Les vésicules multilamellaires à structure en oignon sont préparées selon les méthodes décrites précédemment, en particulier dans la demande internationale WO 99/16468. Les molécules amphiphiles utilisées pour leur préparation seront choisies, sans que cela soit une 10 obligation, parmi les molécules faisant l'objet d'une description dans la pharmacopée, ou déjà utilisées dans des médicaments appliqués aux muqueuses ou injectés par voie parentérale.

Selon une variante avantageuse, les bicouches des vésicules contenues dans les compositions de l'invention contiennent au moins un 15 agent tensioactif choisi dans le groupe constitué: - des phospholipides hydrogénés ou non hydrogénés, - des esters des acides gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol) , - des esters, éthoxylés ou non, des acides gras en C6 à C30, 20 saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et > de saccharose, > de sorbitan, > de mannitol, > de glycérol ou de polyglycérol, 25 > de glycol, - des éthers des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol) - des éthers, éthoxylés ou non, des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, éthoxylés ou non 30 et > de saccharose, > de sorbitan, > de mannitol, > de glycérol ou de polyglycérol, > de glycol, A ces tensioactifs qui peuvent être utilisés seuls ou en mélange, on peut éventuellement ajouter des co-tensioactifs afin d'améliorer la rigidité et/ou l'étanchéité des bicouches formant la vésicule. Parmi ces molécules, on peut citer: - le cholestérol et ses dérivés, en particulier les esters de cholestérol chargés ou neutres comme le sulfate de cholestérol - les autres dérivés à squelette stérol, en particulier ceux d'origine végétale communément appelés phytostérols (sitostérol, sigmastérol...) - les céramides.

La formulation fait avantageusement intervenir un mélange de molécules tensioactives. Il est généralement utilisé au moins deux tensioactifs différents ayant des balances hydrophile-lipophile différentes, ce qui permet de régler en continu les propriétés des bicouches et ainsi de 20 contrôler l'apparition de l'instabilité qui gouverne la formation des vésicules multilamellaires.

Ainsi, on choisira avantageusement parmi les tensioactifs cidessus, deux tensioactifs présentant des propriétés relativement différentes, en particulier une balance hydrophile-lipophile (HLB) 25 différente. Le premier tensioactif présentera avantageusement une balance hydrophilelipophile comprise entre 1 et 6, de préférence entre 1 et 4, alors que le deuxième tensioactif aura une balance hydrophilelipophile supérieure à 3, de préférence supérieure à 4.

Selon une variante particulièrement avantageuse de l'invention, 30 les agents amphiphiles utilisés pour la préparation des vésicules selon l'invention seront constitués d'un mélange d'un phospholipide et d'un tensioactif non ionique.

Le tensioactif non ionique sera avantageusement un ester d'acide gras, de préférence un ester d'acide gras et de polyéthylène glycol 5 ou de sorbitan ou un polysorbate; le phospholipide sera, quant à lui, avantageusement une phosphatidylcholine.

Selon une variante particulièrement préférée de l'invention les amphiphiles constitutifs des vésicules seront constitués d'un mélange de phosphatidylcholine et d'oléate de macrogol (oléate de polyéthylène 10 glycol) ou d'un mélange de phosphatidylcholine et de polysorbate 80.

La préparation obtenue après transformation de la phase cristal-liquide lamellaire en vésicules multilamellaires peut ensuite être diluée, en particulier avec un solvant aqueux tel que, par exemple, une solution tampon, une solution saline ou une solution physiologique, pour 15 obtenir ainsi une suspension aqueuse de vésicules.

La technique d'encapsulation utilisée selon la présente invention permet d'atteindre aisément des rendements d'encapsulation très élevés, voire voisins de 100 %. Toutefois, de tels rendements ne sont pas toujours indispensables en fonction des applications visées.

Ainsi, le rendement d'encapsulation du (ou des) antigène(s) dans les compositions de l'invention est avantageusement supérieur à %, de préférence supérieur à 80 %. Il semble que la structure des vésicules soit responsable des résultats

particulièrement avantageux obtenus, et que les vésicules 25 multilamellaires de l'invention permettent à l'antigène d'arriver intact jusqu'aux cellules présentatrices de l'antigène (CPA) et de favoriser sa capture par ces cellules ou leur activation. Il semble donc bien que la fonction des vésicules de l'invention est de vectoriser, de protéger et d'améliorer la capture de l'antigène par le système immunitaire.

Un autre avantage de la technologie est que l'on peut rajouter à cette formulation des polymères naturels ou artificiels tels que les polysaccharides (alginates, chitosan, etc.) afin de renforcer la solidité de la vésicule, et lui permettre de rester plus longtemps sur le site 5 d'administration ou dans l'organisme, délivrant ainsi l'antigène sur un temps plus long. Ces polymères peuvent être aussi bien incorporés dans la vésicule, que déposés autour sous la forme d'un enrobage. Dans ce cas la vésicule ou la particule formée des vésicules enrobées dans la matrice polymère a un diamètre supérieur à celui des vésicules seules. Ces 10 polymères peuvent éventuellement être réticulés pour renforcer encore leur solidité.

De plus, et c'est un des autres avantages de la technologie, la formulation peut être complétée par l'addition de molécules immunomodulatrices (chitosan, interleukines...) qui renforceront par leurs 15 propriétés intrinsèques l'amplification et/ou l'orientation de la réponse immunitaire.

Les vésicules incorporant les antigènes sont avantageusement préparées dans un procédé consistant à préparer, dans un premier temps, la phase lamellaire. Celle-ci s'obtient par simple mélange des ingrédients, 20 dans un ordre déterminé par l'expérimentateur d'après les miscibilités de chacun des constituants. Il peut être nécessaire de chauffer certains constituants pâteux ou solides afin de faciliter leur incorporation. Dans ce cas on additionne l'antigène de préférence en fin de mélange, après refroidissement afin de lui éviter de subir une température trop élevée. On 25 peut aussi préparer un mélange de tous les constituants sauf de l'antigène ou sa solution aqueuse sous forme d'un mélange " stock " qu'on utilisera selon les besoins pour préparer la phase lamellaire. La solution aqueuse peut contenir différents constituants destinés à assurer sa compatibilité biologique et en particulier des mélanges tampons mais également 30 différents antigènes. La phase lamellaire ainsi préparée est ensuite soumise à un cisaillement modéré (de 0 à 1000 s-1) pendant un temps limité (de 0 à 60 minutes).

Dans la plupart des cas, ce cisaillement est obtenu directement par l'action du dispositif ayant servi au mélange. Pour les très petites 5 quantités, il peut être obtenu à la main par mélange de la préparation par exemple à l'aide d'une microspatule dans un tube conique plastique de 1,5 mL.

La phase lamellaire cisaillée est ensuite dispersée dans un milieu final, en général de l'eau ou un tampon, identique ou différent de 10 celui ayant servi lors de la préparation de la phase lamellaire. Cette dispersion se fait avantageusement à température ambiante (20-250C) par addition lente du milieu sur la phase lamellaire sous agitation constante.

Un conservateur et éventuellement d'autres additifs destinés à compléter la formulation galénique peuvent être ajoutés au produit.

Les compositions pharmaceutiques décrites précédemment constituent des compositions vaccinales formulées aussi bien pour une administration par voie parentérale que par voie muqueuse, en particulier par voie nasale.

Toutes les compositions décrites précédemment comprenant au 20 moins un antigène protéique de VIH incorporé au sein des vésicules à structure lamellaire en oignon présentent l'avantage de pouvoir être utilisées pour une administration par voie muqueuse et tout particulièrement par voie nasale et d'induire une réponse muqueuse et/ou systémique.

L'invention concerne également un procédé de vaccination destiné à immuniser un être humain contre le virus responsable du sida par administration par voie parentérale ou par voie muqueuse, en particulier par voie nasale d'une composition pharmaceutique telle que définie précédemment, avec les avantages exposés précédemment, en particulier avec la possibilité d'induire une réponse immunitaire de type THi.

Selon un dernier aspect, l'invention concerne l'utilisation de vésicules multilamellaires incorporant au moins un antigène protéique du 5 virus VIH, telle que décrite précédemment, pour la fabrication d'une composition vaccinale destinée à l'immunisation contre le virus responsable du sida.

Dans une telle utilisation, l'administration peut être réalisée aussi bien par voie parentérale que par voie muqueuse, en particulier par 10 voie nasale, avec tous les avantages exposés précédemment.

Les exemples ci-après illustrent de façon non-limitative l'invention.

Plus précisément, l'exemple I donné ci-après met clairement en évidence un tel effet par administration nasale de la protéine P24 de VIH. 15 L'exemple II illustre un procédé d'immunisation par voie souscutanée utilisant la protéine P24 du VIH.

Les figures 1 à 4 données en référence à l'exemple I montrent les titres obtenus après administration nasale de la protéine libre et de la protéine incorporée dans les vésicules de l'invention ainsi que les écart20 types (notés SD): > Figure 1, les titres en anticorps IgG spécifiques de P24, circulant dans le sérum, après administration nasale > Figure 2, les titres en anticorps IgA spécifiques de P24, circulant dans le sérum, après administration nasale > Figure 3, les titres en anticorps IgG spécifiques de P24, présents dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA), dans les lavages vaginaux (LV) et dans les lavages intestinaux (LI), après immunisation nasale > Figure 4, les titres en anticorps IgA spécifiques de P24, 30 présents dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA), dans les lavages vaginaux (LV) et dans les lavages intestinaux (LI), après administration nasale Les figures 5 et 6 données en référence à l'exemple II montrent les titres obtenus après immunisation sous-cutanée avec la protéine P24 libre et avec la protéine incorporée dans les vésicules de l'invention: > Figure 5, les titres en anticorps IgGl spécifiques de P24, ainsi que les écart- type dans les sérums après immunisations souscutanées.

> Figure 6, les titres en anticorps IgG2a spécifiques de P24, 10 ainsi que les écart-type dans les sérums après immunisations souscutanées.

EXEMPLES

EXEMPLE 1: PRODUCTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES DE HIV-1 P24 SUITE A UNE ADMINISTRATION MUOUEUSE I - Préparation de vésicules contenant l'antigène P24 de HIV-i Formulation (en pourcentage en masse) O Oléate de macrogol (Simulsol 2599, SEPPIC) : 8,0 % * Lécithine de soja Phospholipon 90G (NATTERMANN) :57,0 % 20 * HIV-1 P24 (TEBU) à 1 mg/ml dans du tampon phosphate de sodium pH8:35,0 % Mode opératoire Les composants sont stérilisés par irradiation UV pendant min. Les contenants et accessoires (spatules, agitateurs...) sont 25 stérilisés à la flamme juste avant utilisation.

Les constituants O et 0 sont introduits dans un tube plastique de 1,5ml, dans un ordre indifférent, mélangés à la spatule puis chauffés à 370C pendant 60 min à l'étuve. On introduit à température ambiante en une étape le constituant *. L'ensemble est homogénéisé à l'aide d'une 30 spatule stérilisée puis laissé au repos une nuit à 40C.

La préparation est ensuite dispersée à 28.46 % dans du tampon phosphate de sodium à pH 8.

Il - Protocole d'immunisation Voie nasale Afin de tester l'effet des vésicules selon l'invention lors d'une administration muqueuse, des souris BALB/c femelles (n=7) de 7 semaines ont reçu, par voie nasale, deux fois (à 30 et J21), différentes 10 préparations décrites ci-dessous. L'administration par voie nasale a été réalisée après anesthésie des animaux par une solution, mélange de Kétamine, Valium et Atropine, injectée par voie intra-péritonéale. Trois semaines après la dernière immunisation, les animaux sont sacrifiés, les sérums sont collectés et les prélèvements des sécrétions muqueuses 15 effectués, à l'exception des lavages vaginaux qui sont prélevés sur la souris vivante pendant les quatre jours précédents la fin de l'expérimentation.

Groupes d'immunisation Les souris ont été réparties en 2 groupes notés I et II, soumis à 20 un protocole d'immunisation tel que défini précédemment au moyen des produits suivants: > groupe I HIV-1 P24 encapsulée: 15 pl par narine de dispersion de vésicules selon l'invention HIV-1 P24 ce qui correspond à 3 pg de HIV-1 25 P24 par souris à chaque immunisation > groupe II: HIV-1 P24: 15 pl par narine d'une solution de HIV-1 P24 correspondant à 3 pg par souris à chaque immunisation Prélèvements des sécrétions Tous les prélèvements sont effectués avec des solutions froides (40C) et sont entreposés sur glace au fur et à mesure afin de limiter les dégradations par les enzymes protéolytiques.

Lavages broncho-alvéolaires: La trachée des souris est canulée à l'aide d'une sonde et 750 pl de PBS sont injectés lentement afin de ne pas créer d'hémorragie, les poumons sont lavés ainsi 3 fois avec la même solution, le prélèvement est ensuite centrifugé afin d'éliminer les cellules pulmonaires et séparé en 10 fractions aliquotes conservées à -201C jusqu'au dosage.

Lavages vaginaux Ces prélèvements sont réalisés sur la souris vigile, par injection de 50pl de PBS dans l'orifice du vagin, le vagin est lavé 3 fois avec la même solution. Ce type de prélèvement est renouvelé durant 4 jours 15 consécutifs afin de couvrir les variations dues au cycle hormonal de la souris. Les sécrétions sont groupées et conservées à -200C.

Lavages intestinaux L'intestin est prélevé, libéré du mésentère et rincé dans l'eau afin d'éliminer le sang extérieur. Il est ensuite découpé longitudinalement 20 et incubé sur glace dans 1 mil d'une solution de lavage enrichie en inhibiteur de protéases. L'ensemble est centrifugé et le surnageant est récupéré et congelé à -200C.

Dosage des anticorps Les anticorps spécifiques de HIV-1 P24 présents dans les 25 sérums et sécrétions sont dosés par technique ELISA o l'on détermine les IgA et IgG spécifiques de HIV-1 P24 (anti-IgA biotinylé (Jackson laboratories)/Streptavidine peroxydase, anti-IgG peroxydase (Diagnostic Pasteur)). Les résultats sont exprimés en moyenne géométrique des titres d'anticorps par rapport à un pool de référence (prélèvement de souris 30 naves). Le titre en anticorps correspond à l'inverse de la dilution supérieure ou égale au seuil de référence (Moyenne des valeurs des souris naves +2SD).

III - Résultats Les résultats du dosage des anticorps spécifiques sont présentés dans les 4 figures (figures 1 à 4) illustrant respectivement > Figure 1, les titres en anticorps IgG spécifiques de P24, circulant dans le sérum, après administration nasale > Figure 2, les titres en anticorps IgA spécifiques de P24, circulant dans le sérum, après administration nasale > Figure 3, les titres en anticorps IgG spécifiques de P24, présents dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA), dans les lavages vaginaux (LV) et dans les lavages intestinaux (LI), après administration 15 nasale > Figure 4, les titres en anticorps IgA spécifiques de P24, présents dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA), dans les lavages vaginaux (LV) et dans les lavages intestinaux (LI), après administration nasale L'exemple I démontre la capacité de l'invention à induire des anticorps spécifiques du virus VIH. L'incorporation de l'antigène viral et son administration nasale permettent d'amplifier les réponses IgG et IgA sériques par rapport à l'antigène libre (amplification d'un facteur 100 et 500, respectivement pour les IgG et IgA).

Seul, l'antigène P24 ne permet pas d'induire des réponses muqueuses. L'incorporation dans les vésicules de l'invention permet l'induction d'une immunité locale (IgA et IgG) aussi bien dans les poumons que dans le vagin.

EXEMPLE Il: PRODUCTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES DE HIV-1 P24 suite à une administration sous-cutanée.

ORIENTATION DE LA REPONSE ANTICORPS

I - Préparation de vésicules contenant l'antigène P24 de HIV-1 Formulation (en pourcentage en masse) O Oléate de macrogol (Simulsol 2599, SEPPIC): 8,0 % O Lécithine de soja Phospholipon 90G (NATTERMANN) :57,0 % * HIV-1 P24 (TEBU) à 1 mg/ml dans du tampon phosphate de 10 sodium à pH 8:35,0 % Mode opératoire Les composants sont stérilisés par irradiation UV pendant min. Les contenants et accessoires (spatules, agitateurs...) sont stérilisés à la flamme juste avant utilisation.

Les constituants O et 0 sont introduits dans un tube plastique de 1,5ml, dans un ordre indifférent mélangés à la spatule puis chauffés à 370C pendant 60 min à l'étuve. On introduit à température ambiante en une étape le constituant O. L'ensemble est homogénéisé à l'aide d'une spatule stérilisée puis laissé au repos une nuit à 41C.

La préparation est ensuite dispersée à 5,7 % dans du tampon phosphate de sodium à pH 8.

II - Protocole d'immunisation 25 Voie sous-cutanée Afin de tester l'effet des vésicules selon l'invention lors d'une administration parentérale, des souris BALB/c femelles (n=7) de 7 semaines ont reçu, par voie souscutanée à la base de la queue, deux fois (à J0 et J21), différentes préparations décrites ci-dessous. Trois semaines après la dernière immunisation, les sérums sont collectés.

Groupes d'immunisation Les souris ont été réparties en 2 groupes notés I et II, soumis à 5 un protocole d'immunisation tel que défini précédemment au moyen des produits suivants: > groupe I: HIV-1 P24 encapsulée: 150 pl de dispersion de vésicules selon l'invention HIV-1 P24 ce qui correspond à 3 pg de HIV-1 P24 par injection, 10 > groupe II: HIV-1 P24: 150 pl d'une solution de HIV-1 P24 correspondant à 3 pg par injection Préparation des sérums Les prélèvements sanguins sont effectués sur animal 15 anesthésié. Les sérums sont collectés après exsudat du sang et centrifugation afin d'éliminer le caillot sanguin. Ils sont conservés à -200C jusqu'à l'analyse.

Dosage des anticorps Les anticorps spécifiques de HIV-1 P24 présents dans les 20 sérums sont dosés par technique ELISA à l'aide de conjugués marqués à la peroxydase (anti-IgG1 et IgG2a, SouthernBiotechnology Associates). Les titres d'anticorps obtenus sont déterminés selon un protocole identique à celui décrit dans l'exemple 1.

III - Résultats Les résultats du dosage des anticorps spécifiques sont présentés dans les figures 5 et 6 et le tableau I ci-dessous illustrant > Figure 5, les titres en anticorps IgGl spécifiques de P24, ainsi que les écart-type (SD) dans les sérums après immunisations souscutanées.

> Figure 6, les titres en anticorps Ig2a spécifiques de P24, ainsi 5 que les écart-type (SD) dans les sérums après immunisations souscutanées.

> Tableau I: les rapports des titres en sous-classes IgGl sur IgG2a des anticorps spécifiques de P24,après injection sous-cutanée de l'antigène P24, en vésicules selon l'invention ou libre; (n = 7). 10

TABLEAU I

Rapports des titres en sous-classes IgGl sur IgG2a des anticorps spécifiques de P24, après injection sous-cutanée de l'antigène P24, en vésicules selon l'invention ou libre; (n = 7) P24 en vésicules P24 libre IgGl/IgG2a 3,3 1524 L'incorporation dans les vésicules de l'invention permet d'induire des titres très élevés d'anticorps sériques comparativement à l'antigène libre. L'étude des sous-classes d'anticorps révèle une 20 modification du rapport des IgGl et IgG2a suite à l'incorporation de l'antigène dans les vésicules de l'invention.

La production dIgG2a est particulièrement augmentée par l'administration des vésicules contenant l'antigène P24.

La modification du rapport IgGl/ IgG2a en faveur des IgG2a 25 par les compositions de l'invention, suggère que l'encapsulation dans les vésicules de l'invention modifie la présentation, l'apprêtement ou l'activation des cellules présentatrices de l'antigène et/ou favorise la sécrétion d'un profil d'interleukines de type 1.

Claims (24)

REVENDICATIONS

1.Composition pharmaceutique contenant une dispersion ou une suspension dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable de 5 vésicules multilamellaires à structure interne cristal-liquide, formées d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse, de liquide polaire ou de solution d'un liquide polaire, et au sein desquelles se trouve incorporé au moins un antigène protéique du virus VIH.

2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit antigène protéique est une protéine ou une glycoprotéine d'enveloppe dudit virus VIH, en particulier une protéine du type GP 160 ou une protéine dérivée de type GP 120 ou GP 41.

3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 15 caractérisée en ce que ledit antigène est une protéine enzymatique impliquée dans l'intégration, la transcription, la réplication du virus et de son matériel génétique.

4. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit antigène est une protéine régulatrice de la 20 transcription ou de la réplication.

5. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 caractérisée en ce que ledit antigène est une protéine de la capside dudit virus VIH codée par le gène gag ou une protéine dérivée d'une telle protéine telle que la protéine P 24 ou P 17 ou une protéine de fusion.

6. Composition pharmaceutique selon la revendication 5 caractérisée en ce que ledit antigène protéique est la protéine P 24.

7.Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que lesdites vésicules ont des diamètres compris entre 0,1 et 25 pm, de préférence entre 0,2 et 15 pm.

8.Composition selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que les bicouches desdites vésicules contiennent au moins un agent tensioactif choisi dans le groupe constitué: - des phospholipides hydrogénés ou non hydrogénés, - des esters des acides gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol) , - des esters, éthoxylés ou non, des acides gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et > de saccharose, > de sorbitan, > de mannitol, > de glycérol ou de polyglycérol, > de glycol, des éthers des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou 15 polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et de macrogol (polyéthylène glycol) - des éthers, éthoxylés ou non, des alcools gras en C6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, et > de saccharose, > de sorbitan, > de mannitol, > de glycérol ou de polyglycérol, > de glycol.

9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que lesdites bicouches contiennent, en outre, au moins un agent 25 destiné à améliorer la rigidité et/ou l'étanchéité desdites bicouches.

10. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce que ledit agent est choisi dans le groupe constitué du cholestérol et de ses dérivés, en particulier des esters de cholestérol chargés ou neutres tels que le sulfate de cholestérol, des autres dérivés à squelette stérol, en particulier ceux d'origine végétale communément appelés phytostérols tels que le sitostérol ou le sigmastérol, des céramides.

11 Composition selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce que lesdites bicouches contiennent à titre d'agents 5 amphiphiles un phospholipide en association avec un tensioactif non ionique.

12.Composition selon la revendication 11 caractérisée en ce que ledit tensioactif non ionique est un ester d'acide gras.

13.Composition selon la revendication 12 caractérisée en ce que 10 ledit ester d'acide gras est un ester de polyéthylène glycol ou de sorbitan ou un polysorbate.

14.Composition selon l'une des revendications 11 à 13 caractérisée en ce que ledit phospholipide est une phosphatidylcholine.

15.Composition selon l'une des revendications 11 à 14 15 caractérisée en ce que les agents amphiphiles sont constitués d'un mélange de phosphatidylcholine et d'oléate de polyéthylène glycol ou de polysorbate 80.

16. Composition selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisée en ce que lesdites vésicules comprennent en outre un 20 polymère naturel ou artificiel destiné à renforcer leur solidité.

17.Composition selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisée en ce qu'elle contient en outre des molécules immunomodulatrices renforçant l'amplification et/ou l'orientation de la réponse immunitaire.

18. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition vaccinale formulée pour une administration par voie parentérale.

19. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition vaccinale formulée 30 pour une administration par voie muqueuse, en particulier par voie nasale.

20.Procédé de fabrication d'une composition selon l'une des revendications 1 à 19 caractérisé en ce qu'il comprend la préparation de vésicules à structure cristal-liquide par transformation d'une phase cristalliquide lamellaire renfermant au moins un agent amphiphile et au moins 5 un antigène protéique du VIH et la dispersion desdites vésicules dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

21.Utilisation de vésicules multilamellaires incorporant au moins un antigène protéique du virus VIH, telles que définies dans l'une des revendications 1 à 17 pour la fabrication d'une composition vaccinale 10 destinée à l'immunisation contre le virus responsable du sida.

22.Utilisation selon la revendication 21 caractérisée en ce que ladite composition vaccinale est destinée à une administration par voie parentérale.

23.Utilisation selon la revendication 21 caractérisée en ce que 15 ladite composition vaccinale est destinée à une administration par voie muqueuse, en particulier par voie nasale.

24.Utilisation selon l'une des revendications 21 à 23 caractérisée en ce que ladite composition vaccinale est destinée à induire une réponse immunitaire de type TH1. 20