FR2844521A1 - Measuring activation of immune system effector cells, useful e.g. for selecting antibodies for therapy, by measuring cytokine release in presence of antibody and its antigen - Google Patents
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Abstract
Description
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La présente invention concerne un procédé pour mesurer l'activation d'une cellule effectrice appartenant au système immunitaire ou modifiée in vitro par un anticorps monoclonal (AcMo) ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules exprimant le récepteur CD 16 dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD16. The present invention relates to a method for measuring the activation of an effector cell belonging to the immune system or modified in vitro by a monoclonal antibody (AcMo) or polyclonal, characterized in that it comprises contacting cells expressing the receptor CD 16 in a reaction medium in the presence of the antibody and the antigen of said antibody and a measurement of the amount of at least one cytokine produced by the cell expressing the CD16 receptor.
L'immunothérapie à l'aide d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux est en passe de devenir un des aspect les plus importants de la médecine. En revanche, les résultats obtenus lors d'essais cliniques apparaissent contrastés. En effet, il peut s'avérer que l'anticorps monoclonal ne soit pas suffisamment efficace. Aujourd'hui, la recherche s'oriente sur le fragment Fcy de l'immunoglobuline afin d'améliorer les propriétés des anticorps. A terme, cela devrait permettre l'obtention d'anticorps qui interagissent et activent les récepteurs des cellules effectrices (macrophage, lymphocyte T, H et NK). Immunotherapy using polyclonal or monoclonal antibodies is fast becoming one of the most important aspects of medicine. On the other hand, the results obtained in clinical trials appear to be mixed. Indeed, it may turn out that the monoclonal antibody is not sufficiently effective. Today, research is focusing on the Fcy fragment of the immunoglobulin in order to improve the properties of the antibodies. Ultimately, this should make it possible to obtain antibodies which interact and activate the receptors of effector cells (macrophage, T, H and NK lymphocytes).
L'activité biologique de certaines immunoglobulines G est dépendante de la structure des oligosaccharides présents sur la molécule, et notamment sur sa partie Fc. Les molécules IgG de toutes les sous-classes humaines et murines possèdent un Noligosaccharide fixé au domaine CH2 de chaque chaîne lourde (au résidu Asn 297 pour les IgG humaines). L'influence de ce résidu glycannique sur la capacité de l'anticorps à interagir avec des molécules effectrices (Fc récepteurs et complément) a été démontrée. L'inhibition de glycosylation d'une IgGl humaine, par culture en présence de Tunicamycine, provoque par exemple une diminution de 50 fois de l'affinité de cet anticorps pour le récepteur FcyRI présent sur les monocytes et macrophages (Leatherbarrow et al, 1985). La fixation au récepteur FcyRIII est également affectée par la perte de carbohydrates sur l'IgG, puisqu'il a été décrit qu'une IgG3 non The biological activity of certain immunoglobulins G is dependent on the structure of the oligosaccharides present on the molecule, and in particular on its Fc part. The IgG molecules of all human and murine subclasses have a Noligosaccharide attached to the CH2 domain of each heavy chain (at residue Asn 297 for human IgG). The influence of this glycan residue on the ability of the antibody to interact with effector molecules (Fc receptors and complement) has been demonstrated. The inhibition of glycosylation of a human IgGl, by culture in the presence of Tunicamycin, causes for example a 50-fold decrease in the affinity of this antibody for the FcyRI receptor present on monocytes and macrophages (Leatherbarrow et al, 1985) . Binding to the FcyRIII receptor is also affected by the loss of carbohydrates on IgG, since it has been described that an IgG3 not
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glycosylée est incapable d'induire une lyse de type ADCC par l'intermédiaire du récepteur FcyRIII des cellules NK (Lund et al, 1990). glycosylated is unable to induce ADCC type lysis via the FcyRIII receptor of NK cells (Lund et al, 1990).
Mais, au-delà de la présence nécessaire de ces résidus glycanniques, c'est plus précisément l'hétérogénéité de leur structure qui peut aboutir à des différences dans la capacité à engager des fonctions effectrices. Des profils de galactosylation variables en fonction des individus (IgGl humaines sériques) ont été observés. Ces différences reflètent probablement des disparités dans l'activité des galactosyltransférases et autres enzymes entre les clones cellulaires de ces individus (Jefferis et al, 1990). Alors que cette hétérogénéité normale des processus post-traductionnels génère différentes glycoformes (même dans le cas d'anticorps monoclonaux), elle peut conduire à des structures atypiques associées à certains états pathologiques comme l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, pour lesquelles une proportion importante de résidus agalactosylés a été mise en évidence (Parekh et al, 1985). But, beyond the necessary presence of these glycan residues, it is more precisely the heterogeneity of their structure which can lead to differences in the capacity to engage effector functions. Profiles of galactosylation variable depending on the individual (human serum IgGl) were observed. These differences probably reflect disparities in the activity of galactosyltransferases and other enzymes between the cell clones of these individuals (Jefferis et al, 1990). While this normal heterogeneity of post-translational processes generates different glycoforms (even in the case of monoclonal antibodies), it can lead to atypical structures associated with certain medical conditions such as rheumatoid arthritis, Crohn's disease, for which a significant proportion of agalactosylated residues has been demonstrated (Parekh et al, 1985).
Devant la complexité posée par la relation existante entre les différentes structures glycanniques et l'activité des anticorps, il serait utile de pouvoir discriminer rapidement quels sont les anticorps efficaces et permettre ainsi de sélectionner des lignées cellulaires produisant des anticorps ayant une meilleur efficacité ou des propriétés spécifiques dans l'activation ou l'inhibition de certains composants du système immunitaire. Given the complexity posed by the existing relationship between the different glycan structures and the activity of the antibodies, it would be useful to be able to quickly discriminate which antibodies are effective and thus make it possible to select cell lines producing antibodies having better efficacy or properties. specific in the activation or inhibition of certain components of the immune system.
Dans la demande FR 0004685 du 12 avril 2000 (LFB), nous avions décrit un nouveau procédé de préparation d'un anticorps monoclonal capable d'activer les cellules effectrices exprimant le FcyRIII. Dans ce procédé, on teste des anticorps monoclonaux provenant d'hybridomes ou de lignées transfectées dans un mélange réactionnel comprenant les cellules cibles desdits anticorps, des cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le FcyRIII et des IgG polyvalentes. Ainsi, on peut déterminer le pourcentage de lyse des cellules cibles et sélectionner des anticorps monoclonaux qui activent les cellules effectrices provoquant une lyse significative des cellules cibles In application FR 0004685 of April 12, 2000 (LFB), we had described a new process for the preparation of a monoclonal antibody capable of activating effector cells expressing FcyRIII. In this method, monoclonal antibodies from hybridomas or transfected lines are tested in a reaction mixture comprising the target cells of said antibodies, effector cells comprising cells expressing FcyRIII and polyvalent IgGs. Thus, one can determine the percentage of lysis of the target cells and select monoclonal antibodies which activate the effector cells causing a significant lysis of the target cells.
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(activité ADCC de type FcyRIII). Par exemple, la partie Fab de l'anticorps anti-D va se fixer sur l'antigène Rhésus D porté par les hématies. Suite à cette fixation, sa partie Fc se fixe alors sur le récepteur Fc gamma RIII ou CD 16 de la cellule effectrice (cellule NK). Ce sandwich induit la sécrétion de substances chimiques de type perforines qui vont lyser le globule rouge. Il s'agit donc d'une cytotoxicité cellulaire anticorps dépendante (CCDA) ou ADCC en anglais. Pour se rapprocher des conditions physiologiques, le test est effectué en présence d'immunoglobulines polyvalentes humaines. (ADCC activity of type FcyRIII). For example, the Fab part of the anti-D antibody will bind to the Rhesus D antigen carried by the red cells. Following this fixation, its Fc part is then fixed on the Fc gamma RIII or CD 16 receptor of the effector cell (NK cell). This sandwich induces the secretion of chemical substances such as perforins which will lyse the red blood cell. It is therefore a cell antibody dependent cytotoxicity (CCDA) or ADCC in English. To approach physiological conditions, the test is carried out in the presence of polyvalent human immunoglobulins.
Dans le cadre de l'invention, on a trouvé que la fixation d'un anticorps sur son ligand peut induire une activation de la cellule Jurkat transfectée CD16 induisant la sécrétion d'IL2. Une forte corrélation est observée entre la sécrétion d'IL2 par Jurkat CD16 et l'activité ADCC médiée par le CD16 des cellules effectrices. In the context of the invention, it has been found that the binding of an antibody to its ligand can induce activation of the transfected Jurkat cell CD16 inducing the secretion of IL2. A strong correlation is observed between the secretion of IL2 by Jurkat CD16 and the CDCC-mediated ADCC activity of the effector cells.
L'invention propose l'utilisation du test jurkat CD16 par mesure d'IL2 sécrétée comme alternative aux tests ADCC, en particulier pour un suivi ou le criblage d'activité biologique d'anticorps à usage thérapeutique. The invention proposes the use of the jurkat CD16 test by measuring secreted IL2 as an alternative to ADCC tests, in particular for monitoring or screening for biological activity of antibodies for therapeutic use.
Description Ainsi, la présente invention se rapporte à un procédé pour mesurer l'activation d'une cellule effectrice appartenant au système immunitaire, transformée ou non, par un anticorps monoclonal (AcMo) ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules exprimant le récepteur CD16 dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD16. Description Thus, the present invention relates to a method for measuring the activation of an effector cell belonging to the immune system, transformed or not, by a monoclonal antibody (AcMo) or polyclonal, characterized in that it comprises contact of cells expressing the CD16 receptor in a reaction medium in the presence of the antibody and the antigen of said antibody and a measurement of the quantity of at least one cytokine produced by the cell expressing the CD16 receptor.
En entend par cellule transformée, une cellule modifiée génétiquement de sorte à exprimer un récepteur, en particulier le récepteur CD16. By transformed cell is meant a cell genetically modified so as to express a receptor, in particular the CD16 receptor.
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De préférence, on utilise une lignée Jurkat transfectée avec un vecteur d'expression codant pour le récepteur CD16 comme cellule effectrice. Cette lignée est particulièrement avantageuse car elle est immortalisée et se développe indéfiniment dans des milieux cultures. Preferably, a Jurkat line transfected with an expression vector coding for the CD16 receptor is used as the effector cell. This line is particularly advantageous because it is immortalized and develops indefinitely in culture media.
Parmi les cytokines que l'on peut quantifier au moins une cytokine sélectionnée parmi IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6..., TNFa et IFNy. On choisit avantageusement l'interleukine IL-2. Among the cytokines that can be quantified at least one cytokine selected from IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 ..., TNFα and IFNγ. The interleukin IL-2 is advantageously chosen.
Le taux de cytokine produite est un marqueur d'activation ou d'inhibition des cellules effectrices. The level of cytokine produced is a marker for activation or inhibition of effector cells.
De préférence le taux d'interleukine IL2 sécrétée reflète la qualité de l'anticorps fixé par le récepteur CD 16 quant à son intégrité (fonction FC) et à son efficacité (site antigénique) de liaison à l'antigène. La mesure du taux d'IL2 est corrélée à une activité du type ADCC. Preferably, the level of IL2 secreted interleukin reflects the quality of the antibody fixed by the CD 16 receptor as regards its integrity (FC function) and its efficiency (antigenic site) of binding to the antigen. The measurement of the level of IL2 is correlated with an activity of the ADCC type.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour évaluer l'efficacité d'un anticorps monoclonal ou polyclonal, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules effectrice du système immunitaire, transformée ou non, exprimant le récepteur CD16 dans un milieu réactionnel en présence d'un anticorps et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. In another aspect, the invention relates to a method for evaluating the effectiveness of a monoclonal or polyclonal antibody, characterized in that it comprises contacting effector cells of the immune system, transformed or not, expressing the CD16 receptor in a reaction medium in the presence of an antibody and of the antigen of said antibody and a measurement of the quantity of at least one cytokine produced by the cell expressing the CD 16 receptor.
Ce procédé est particulièrement adapté pour évaluer l'efficacité d'un anticorps monoclonal ou polyclonal de spécificité anti-Rh D du globule rouge humain. This method is particularly suitable for evaluating the effectiveness of a monoclonal or polyclonal antibody specific for anti-Rh D of the human red blood cell.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour évaluer la capacité d'une cellule à produire un anticorps monoclonal efficace, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules effectrice du système immunitaire, transformée ou non, exprimant le récepteur CD16 dans un milieu réactionnel en présence d'un anticorps et In another aspect, the invention relates to a method for evaluating the capacity of a cell to produce an effective monoclonal antibody, characterized in that it comprises contacting effector cells of the immune system, transformed or not, expressing the CD16 receptor in a reaction medium in the presence of an antibody and
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de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD16. the antigen of said antibody and a measurement of the quantity of at least one cytokine produced by the cell expressing the CD16 receptor.
Ce procédé peut être mise en #uvre pour des cellules utilisées pour la production d'anticorps thérapeutiques, telles que CHO, YB2/0, les cellules lymphoblastoïdes humaines, les cellules d'insectes et les cellules de myélomes murines. This method can be implemented for cells used for the production of therapeutic antibodies, such as CHO, YB2 / 0, human lymphoblastoid cells, insect cells and murine myeloma cells.
Ce procédé peut également être appliquée à l'évaluation de la production d'AcMo par des plantes transgéniques ou de mammifères transgéniques. This method can also be applied to the evaluation of the production of AcMo by transgenic plants or transgenic mammals.
Dans un aspect complémentaire, l'invention vise un procédé pour évaluer l'efficacité et de l'intégrité d'anticorps polyclonaux après une étape ou plusieurs étape de purification, caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de cellules effectrice du système immunitaire, transformée ou non, exprimant le récepteur CD 16 dans un milieu réactionnel en présence de l'anticorps purifié et de l'antigène dudit anticorps et une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CD 16. In a complementary aspect, the invention relates to a method for evaluating the efficiency and the integrity of polyclonal antibodies after one or more purification steps, characterized in that it comprises contacting effector cells of the system immune system, transformed or not, expressing the CD 16 receptor in a reaction medium in the presence of the purified antibody and the antigen of said antibody and a measurement of the amount of at least one cytokine produced by the cell expressing the CD 16 receptor .
Les procédés décrits ci-dessus peuvent éventuellement être réalisés en présence d'immunoglobulines humaines (IVIg). The methods described above can optionally be carried out in the presence of human immunoglobulins (IVIg).
A titre d'exemple, on sélectionnera les anticorps pour lesquels une augmentation supérieure à 100%, 250%, 500%, ou 1000% du taux de libération d'IL-2 est observée par rapport au contrôle en absence d'anticorps ou un anticorps donné comme référence négative. For example, we will select the antibodies for which an increase greater than 100%, 250%, 500%, or 1000% in the rate of release of IL-2 is observed compared to the control in the absence of antibody or a antibody given as negative reference.
L'invention vise également l'utilisation du procédé décrit ci-dessus pour sélectionner des anticorps efficace pour un traitement thérapeutique. The invention also relates to the use of the method described above for selecting effective antibodies for therapeutic treatment.
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A l'inverse, l'invention vise également à évaluer la capacité de réponse des cellules effectrices du patient lorsqu'elles sont mises en présence d'un anticorps monoclonal ou polyclonal donné destiné à traiter le patient et qu'elles sont mises dans les conditions décrites de l'invention. Conversely, the invention also aims to assess the response capacity of the patient's effector cells when they are put in the presence of a given monoclonal or polyclonal antibody intended to treat the patient and when they are put under the conditions described of the invention.
Légende Figure 1 : du test ADCC CMN. Caption Figure 1: of the ADCC CMN test.
Les cellules mononuclées en présence de Tégéline (IVIg) sont incubées avec les anticorps anti-Rhésus D et des hématies Rhésus + (cible). Après une nuit à 37 C, on mesure la lyse des hématies par mesure de l'hémoglobine relarguée dans le milieu réactionnel. Mononuclear cells in the presence of Tegeline (IVIg) are incubated with anti-Rhesus D antibodies and Rhesus + red cells (target). After a night at 37 ° C., the lysis of the red cells is measured by measuring the hemoglobin released in the reaction medium.
Figure 2 : Description du test ADCC NK Les cellules NK purifiées sont incubées avec les anticorps anti-Rhésus D et des hématies Rhésus + (cible). Après une nuit à 37 C, on mesure la lyse des hématies par mesure de l'hémoglobine relarguée dans le milieu réactionnel. Figure 2: Description of the ADCC NK test The purified NK cells are incubated with anti-Rhesus D antibodies and Rhesus + red cells (target). After a night at 37 ° C., the lysis of the red cells is measured by measuring the hemoglobin released in the reaction medium.
Figure 3 : Résultats ADCC NK et inhibition par l'anti-CD16 3G8 . Figure 3: ADCC NK results and inhibition by anti-CD16 3G8.
Figure 4 : du test Jurkat CD16 . Figure 4: Jurkat CD16 test.
Des cellules Jurkat CD 16 sont mélangées avec différents anticorps anti-D en présence d'hématies rhésus + et de PMA. Après une nuit d'incubation, la libération d'IL-2 dans le surnageant est quantifiée par ELISA. Jurkat CD 16 cells are mixed with different anti-D antibodies in the presence of rhesus + red blood cells and PMA. After overnight incubation, the release of IL-2 into the supernatant is quantified by ELISA.
Figure 5 : Résultats du test Jurkat CD16. Figure 5: Results of the Jurkat CD16 test.
Commentaires : les anticorps positifs en ADCC-NK induisent une sécrétion d'IL2 en présence de Jurkat CD 16 et de leur cible. Comments: ADCC-NK positive antibodies induce secretion of IL2 in the presence of Jurkat CD 16 and their target.
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Exemple 1 : Jurkat CD16 Anticorps témoins : Anticorps polyclonaux WinRho, anticorps monoclonal DF5-EBV, anticorps monoclonal DF5-YB2/0 Principe : Ce test estime la capacité des anticorps anti-D à se fixer sur le récepteur CD16 (Fc gamma RIII) exprimé sur les cellules Jurkat CD16 et à induire la secrétion d'IL2. Example 1: Jurkat CD16 Control antibodies: WinRho polyclonal antibodies, DF5-EBV monoclonal antibody, DF5-YB2 / 0 monoclonal antibody Principle: This test estimates the capacity of anti-D antibodies to bind to the CD16 receptor (Fc gamma RIII) expressed on Jurkat CD16 cells and to induce secretion of IL2.
Ce test consiste à mettre en contact en P96 : anticorps anti-D, les hématies Rhésus positives traitées à la papaïne, les cellules Jurkat CD16 et du PMA. This test consists in bringing into contact in P96: anti-D antibodies, Rhesus positive red cells treated with papain, Jurkat CD16 cells and PMA.
Après une nuit d'incubation à 37 C, on centrifuge les P96 et on dose dans le surnageant la quantité d'IL2 secrétée. After an overnight incubation at 37 ° C., the P96s are centrifuged and the quantity of IL2 secreted is assayed in the supernatant.
Mode opératoire Matériel Anticorps témoins positif : Poly-D WinRho, DF5 YB2/0. Procedure Material Positive control antibodies: Poly-D WinRho, DF5 YB2 / 0.
Anticorps témoins négatifs : DF5 Hématies Rhésus positif Cellules Jurkat CD 16 Kit dosage IL2 : de chez R/D. Negative control antibodies: DF5 Rhesus red cells positive Jurkat CD 16 cells IL2 assay kit: from R / D.
Methode Traitement à la papaïne des hématies. Method Papain treatment of red blood cells.
1ml de culot d'hématies incubé avec 1ml d'une solution de papaïne (lmg/ml) diluées en PBS incubée lOmn à 37 C. Puis 3 lavages en H20-NaCI O.15M. 1 ml of red cells pellet incubated with 1 ml of a papain solution (1 mg / ml) diluted in PBS incubated 10 min at 37 C. Then 3 washes in H20-NaCI O.15M.
Mélange réactionnel : -Anticorps : 50 l d'une dilution à 150ng/ml en IMDM 5% SVF -PMA 50 l d'une dilution à 40ng/ml en IMDM 5% SVF -Hématies traitées à la papaïne. 50 l à 8 106/ml en IMDM 5% SVF -Jurkat CD16. 50 l à 2xlO6/ml en IMDM 5% SVF Incubation 1 nuit à 37 C Reaction mixture: -Antibody: 50 l of a dilution to 150ng / ml in IMDM 5% SVF -PMA 50 l of a dilution to 40ng / ml in IMDM 5% SVF -Red cells treated with papain. 50 l at 8 106 / ml in IMDM 5% SVF -Jurkat CD16. 50 l at 2xlO6 / ml in 5% IMDM SVF Incubation 1 night at 37 C
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Puis centrifugation des plaques, prélèvement de 100 l de surnageants et dosage d'IL2 avec le kit commercial. lecture à 450nm. Then centrifugation of the plates, removal of 100 l of supernatants and determination of IL2 with the commercial kit. reading at 450nm.
On donne les valeurs (en pg/ml) sous forme d'histogramme pour chaque échantillon. The values (in pg / ml) are given in the form of a histogram for each sample.
Exemple 2 : Corrélation in vitro entre ADCC et libération d'IL-2 de Jurkat CD16. Example 2: In vitro correlation between ADCC and release of IL-2 from Jurkat CD16.
Pour cette étude, 3 anticorps monoclonaux anti-D ont été comparés. For this study, 3 anti-D monoclonal antibodies were compared.
Mab DF5-EBV a été produit par des Lymphocytes B humain obtenus chez un donneur immunisé D-négatif et immortalisés par transformation avec EBV. Cet anticoprs a été utilisé comme contrôle négatif étant donné qu'il a été montré qu'il est incapable d'éliminer les globules rouges rhésus positifs de la circulation lors d'un essai clinique. Mab DF5-EBV was produced by human B lymphocytes obtained from a D-negative immune donor and immortalized by transformation with EBV. This anticoprs has been used as a negative control since it has been shown to be unable to remove rhesus-positive red blood cells from the circulation in a clinical trial.
L'anticorps monoclonal (Mab) DF5-YB2/0 a été obtenu en exprimant la séquence primaire de EBV-DF5 dans la lignée YB2/0. L'anticorps monoclonal R297 et d'autres anticorps recombinants ont également été exprimés dans YB2/0. The monoclonal antibody (Mab) DF5-YB2 / 0 was obtained by expressing the primary sequence of EBV-DF5 in the line YB2 / 0. The monoclonal antibody R297 and other recombinant antibodies were also expressed in YB2 / 0.
On a testé ces anticorps in vitro pour leur capacité à induire une lyse des globules rouges traités à la papaïne en utilisant des cellules PBL comme effecteur. These antibodies were tested in vitro for their ability to induce lysis of red blood cells treated with papain using PBL cells as an effector.
Tous les tests ont été effectués en présence d'immunoglobulines humaines (IVIg) de sorte à reconstituer les conditions physiologiques. All the tests were carried out in the presence of human immunoglobulins (IVIg) so as to reconstitute the physiological conditions.
On pense que les IVIg se lient avec une haute affinité au FcgammaRI (CD64). Les deux Mab DF5-YB2/0 et R297 induisent une lyse des globules rouges à un niveau comparable à celui des anticorps WinRho. En revanche, le Mab DF5-EBV est complètement inefficace. IVIg is thought to bind with high affinity to FcgammaRI (CD64). Both Mab DF5-YB2 / 0 and R297 induce lysis of red blood cells at a level comparable to that of WinRho antibodies. In contrast, the Mab DF5-EBV is completely ineffective.
Dans une deuxième série d'expérience, des cellules NK purifiées et des globules rouges non traités ont été utilisés comme effecteur et cibles respectivement. Après 5 heures d'incubation, les Mabs antiD-R297 et DF5-YB2/0 se sont montrés capables de provoquer la lyse des globules rouges, alors que DF5-EBV reste inefficace. In a second series of experiments, purified NK cells and untreated red blood cells were used as effector and targets respectively. After 5 hours of incubation, the antiD-R297 and DF5-YB2 / 0 Mabs have been shown to be able to cause lysis of red blood cells, while DF5-EBV remains ineffective.
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Dans ces deux expériences, la lyse des globules rouges a été inhibée par Mab 3G8 dirigé contre le FcgammaRIII (CD 16). In these two experiments, the lysis of red blood cells was inhibited by Mab 3G8 directed against FcgammaRIII (CD 16).
Pris ensemble, ces résultats démontrent que l'ADCC provoquée par Mab R297 et Mab DF5-YB2/0 implique le FcgammaRIII exprimé à la surface des cellules NK. Taken together, these results demonstrate that the ADCC caused by Mab R297 and Mab DF5-YB2 / 0 involves FcgammaRIII expressed on the surface of NK cells.
Dans le cadre de l'invention, une troisième série d'expériences a mis en valeur un test in vitro à l'aide de cellule Jurkat CD16 pour évaluer l'efficacité d'anticorps anti-D. Les Mab ont été incubés pendant la nuit avec des globules rouges rhésus positifs et des cellules Jurkat CD 16. La libération d'IL-2 dans le surnageant à été évaluée par ELISA. In the context of the invention, a third series of experiments highlighted an in vitro test using Jurkat CD16 cell to assess the effectiveness of anti-D antibodies. The Mabs were incubated overnight with rhesus positive red blood cells and Jurkat CD 16 cells. The release of IL-2 in the supernatant was evaluated by ELISA.
Une forte corrélation entre l'ADCC et l'activation des cellules Jurkat a été observée, ce qui implique que ce test peut être utilisé pour faire la discrimination des Mabs anti-D en fonction de leur réactivité envers FcgammaRIII ( CD 16). A strong correlation between ADCC and activation of Jurkat cells has been observed, which implies that this test can be used to discriminate anti-D Mabs according to their reactivity towards FcgammaRIII (CD 16).
En conclusion, ces données montrent l'importance des modifications posttraductionnelles de la structure des anticorps pour leur activité ADCC spécifique du FcgammaRIII. La libération de cytokines telles que IL-2 reflète cette activité. In conclusion, these data show the importance of post-translational modifications of the structure of antibodies for their ADCC activity specific for FcgammaRIII. The release of cytokines such as IL-2 reflects this activity.
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