FR2842746A1 - Colonne d'immunoaffinite pour epuration d'anticorps comportant des microparticules polymeres encapsulant des antigenes associes a des phospholipides - Google Patents

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Philippe Maincent
Claude Vigneron
Nathalie Ubrich
Valerie Hoffart
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Universite Henri Poincare Nancy I
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Abstract

L'invention concerne une colonne d'immunoaffinité à composition adsorbante pour épuration d'anticorps contenus dans un fluide circulant dans ladite colonne. Selon l'invention, la composition adsorbante comporte au moins un ensemble de microparticules polymères encapsulant des antigènes avec des phospholipides. Les microparticules sont obtenues par élimination d'au moins un solvant organique dans une émulsion double eau dans l'huile dans l'eau obtenue par préparation d'émulsion primaire eau dans l'huile en combinant une première phase liquide avec une seconde phase liquide, la première phase liquide comportant au moins des phospholipides avec des antigènes correspondant à des membranes porteuses d'antigènes, la seconde phase liquide comportant le/les solvants organiques et au moins un polymère, puis par ajout dans l'émulsion primaire d'une phase aqueuse avec au moins un agent tensioactif, le polymère permettant la diffusion des anticorps à l'intérieur des microparticules tout en empêchant la libération des antigènes et des complexes antigène/anticorps, un gel pouvant être associé aux microparticules dans la colonne.

Description

La présente invention concerne une colonne d'immunoaffinité pour épuration
d'anticorps comportant des microparticules polymères encapsulant des antigènes associés à des phospholipides. Elle a des applications dans le domaine thérapeutique et plus particulièrement en tant que dispositif pour l'extraction ou l'épuration extracorporelle humaine ou animale de produits pathologiques ou non. Elle met en oeuvre une composition adsorbante pouvant être rendue compatible avec les substances biologiques de l'organisme et permet un fonctionnement aussi bien 10 en circuit fermé avec retour vers l'organisme, qu'en circuit ouvert, sans retour. Elle peut ainsi également permettre la préparation de produits thérapeutiques que ce soit par élimination de produits indésirables ou par adsorption/récupération de produits utiles. Elle peut être adaptée en spécificité et affinité en fonction de l'antigène 15 mis en oeuvre. Enfin, elle peut être appliquée à d'autres domaines que la thérapeutique et, par exemple, dans l'analyse biologique, chimique ou d'autres domaines dans lesquels il est nécessaire de pouvoir séparer d'une manière spécifique des corps chimiques.
De nombreuses pathologies d'ordre génétique ou 20 immunologique (hypercholestérolémie familiale, myasthénies, incompatibilité fetomaternelle, syndrome des antiphospholipides, lupus érythémateux...) ou réactions immunologiques (hétérogreffes avec incompatibilité) ont pour origine la présence dans le sang d'anticorps ou d'antigènes pathogènes qu'il faut éliminer.
Différentes techniques thérapeutiques sont actuellement utilisées:
- la plasmaphérèse ou échange plasmatique: c'est une technique non spécifique qui élimine tous les constituants du plasma sanguin avec notamment une déplétion importante des immunoglobulines, ce qui peut entraîner des risques de 30 développements infectieux. En effet, la perte de 50 à 70% des immunoglobulines peut être responsable d'infections à répétition, ce qui est susceptible d'aggraver le pronostic.
- l'immunoadsorption sur protéine A: c'est une technique sélective mais non spécifique qui consiste à fixer le fragment Fc
des IgGl, IgG2, IgG4 mais pas les IgG3.
Ces deux techniques sont souvent associées à une
corticothérapie et/ou des immunodépresseurs.
- l'immunoadsorption spécifique relative à la formation d'un complexe antigène/anticorps: un ligand (antigène ou anticorps) est fixé sur un support chromatogiraphique (immunoadsorbant) de façon à fixer par immunoaffinité l'affinant (anticorps ou antigène correspondant) contenu dans une solution ou un milieu biologique élué au travers d'une colonne contenant l'immunoadsorbant. La technique d'immunoadsorption spécifique a déjà été 10 utilisée notamment pour le traitement de l'hypercholestérolémie familiale et le lupus érythémateux. Cependant, l'immunoadsorbant est préparé par activation chimique du support de façon à fixer le ligand par liaison covalente. L'utilisation d'activateurs chimiques tels que le bromure de cyanogène qui est le plus utilisé peut 15 entraîner des problèmes de toxicité. D'autre part, la stabilité de la liaison covalente n'étant pas absolue, le ligand, souvent d'origine animale, peut être libéré en sortie de colonne dans le milieu épuré destiné à être réadministré aux patients. Cette contamination peut être à l'origine de troubles immunologiques chez les patients dont
le plus grave est le choc anaphylactique.
Les inventeurs ont montré de manière surprenante que des microparticules polymères encapsulant des antigènes présents sur une membrane phospholipidique préparées selon une technique particulière et introduite dans une colonne permettent de diminuer 25 le titre de l'anticorps spécifique de l'antigène encapsulé lorsqu'une solution ou un milieu biologique contenant l'anticorps est élué au travers de la colonne. Ainsi, la présente invention est relative au domaine biologique et médical, voire chimique plus généralement, et a donc pour objet une colonne d'immunoaffinité pour épuration 30 d'anticorps comportant des microparticules chargées en antigènes membranaires distribués dans une matrice polymère. Les microparticules polymères sont préférentiellement non biodégradables dans le cas d'une application médicale ou biologique. La technique de préparation des microparticules utilise 35 des polymères non biodégradables et insolubles dans l'eau, seuls ou en mélange, et une double émulsion, puis la mise en colonne de ces particules destinées à être utilisées comme support chromatographique d'immunoaffinité. Les microparticules ont un diamètre entre 10 pm et 1 mm, et de préférence compris entre 200 pm et 600 pm. Enfin, les produits mis en oeuvre dans l'invention sont préférentiellement biocompatibles dans les applications médicales ou biologiques. L'invention concerne donc une colonne d'immunoaffinité à composition adsorbante pour épuration d'anticorps contenus dans
un fluide circulant dans ladite colonne.
Selon l'invention la composition adsorbante comporte au moins un ensemble de microparticules polymères encapsulant des antigènes associés à des phospholipides, les microparticules étant obtenues par élimination d'au moins un solvant organique dans une 15 émulsion double eau dans l'huile dans l'eau, l'émulsion double étant obtenue en deux étapes: la première étape consistant à préparer une émulsion primaire eau dans l'huile par combinaison d'une première phase liquide avec une seconde phase liquide, la première phase liquide 20 comportant au moins des phospholipides associés à des antigènes dans une solution aqueuse tamponnée, les phospholipides et antigènes de la première phase correspondant à des membranes porteuses d'antigènes, la seconde phase liquide comportant au moins un solvant organique non miscible à l'eau et au moins un polymère soluble dans ledit solvant et non soluble dans l'eau, la seconde étape consistant à ajouter l'émulsion primaire dans une troisième phase aqueuse comportant au moins un agent tensioactif afin de former l'émulsion double, le polymère formant les microparticules permettant la 30 diffusion des anticorps du fluide à l'intérieur des microparticules tout en empêchant la libération des antigènes membranaires et des complexes antigène/anticorps fixés sur les membranes, un gel pouvant être associé aux microparticules dans la colonne. Dans divers modes de mise en oeuvre de l'invention, les moyens suivants pouvant être combinés selon toutes les possibilités techniquement envisageables, sont employés: - outre l'eau, le solvant organique est éliminé de la double émulsion par évaporation et/ou dessiccation, la dessiccation étant obtenue notamment par nébulisation ou lyophilisation, ou par l'utilisation d'un fluide supercritique, - les membranes sont biologiques et extraites à partir de cellules biologiques, - les membranes sont artificielles, - l'antigène est un antigène érythrocytaire, - l'antigène est un antigène du système HLA, - l'antigène est la P2-glycoprotéine 1, - le polymère est non biodégradable et choisi parmi le groupe 15 des dérivés de la cellulose dont l'éthylcellulose, l'acétate de cellulose, le triméllitate de cellulose et le groupe des dérivés polyacryliques, - le solvant organique est volatil et insoluble dans l'eau (< 0,5%) et est choisi parmi des solvants ou des mélanges de 20 solvants tels que chloroforme, dichlorométhane, acétate d'éthyle, et tout autre solvant organique susceptible de dissoudre le ou les polymères, - le gel est choisi parmi l'agarose, dextran, silice ou autre produit compatible avec le fluide, - le ou les polymères représentent 1 à 20% en volume dans l'émulsion primaire et, de préférence, 4 à 10%, le ou les solvants organiques représentent 10 à 90% en volume dans l'émulsion primaire et, de préférence, de 50 à 90%, - l'émulsion primaire représentant 0,1 à 10% en volume dans l'émulsion double et, de préférence 1%, - en outre au moins une des deux phases liquides destinée à former l'émulsion primaire comporte en outre au moins un agent tensioactif, ledit agent tensioactif étant choisi parmi les agents tensioactifs naturels, synthétiques ioniques, synthétiques non 35 ioniques ou amphotères, l'agent tensioactif ou le mélange d'agents
tensioactifs représentant plus de 0 à 10% en poids de la phase correspondante et, de préférence, de 0,1 à 2% en poids.
La colonne peut être appliquée aux traitements par épuration extracorporelle de plasma sanguin humain ou animal, notamment aux personnes hyper-immunisées en attente de greffe. Plus particulièrement, elle peut être appliquée au traitement de patients souffrant d'une hypercholestérolémie familiale afin d'éliminer des apolipoprotéines B de leur plasma. Il est également possible d'appliquer l'invention à la préparation de fractions sanguines en 10 excluant des anticorps anti-A ou anti-B chez des patients à
incompatibilité ABO majeure dans les opérations de greffe ou transplantation.
Ainsi la présente invention concerne une colonne à base de microparticules poreuses chargées en antigènes conservés dans un 15 environnement phospholipidique et destinée à étendre l'application de l'immunoadsorption à des domaines dans lesquels elle n'est actuellement pas utilisée. C'est le cas du problème des incompatibilités lors de transplantations d'organes (système HLA) et du syndrome des antiphospholipides d à la présence 20 d'autoanticorps pathogènes antiphospholipidiques et/ou antiprotéiques dont les anti-132- glycoprotéine 1. En particulier, il existe une forme catastrophique du syndrome des antiphospholipides caractérisée par un certain nombre de patients en échec thérapeutique et pour laquelle l'élimination des anticorps
anti-j32-glycoprotéine 1 apparaît une alternative efficace.
La présente invention et ses déclinaisons vont maintenant être exemplifiées et explicitées par la description non limitative qui
suit et en relation avec: la Figure 1 qui est une première illustration de la capacité d'adsorption de stromas érythrocytaires, la Figure 2 qui est une deuxième illustration de la capacité d'adsorption de stromas érythrocytaires,
les Figures 3 et 4 qui donnent respectivement les capacités d'adsorption en passages multiples pour trois concentrations de 35 protéines membranaires et trois anticorps (anti-A, anti-B, anti-Kell).
Dans la suite de la description on explicitera d'abord la technique de préparation des microparticules puis de la colonne et on donnera enfin des résultats obtenus.
En ce qui concerne les micro-particules 1) on prépare une première phase liquide constituée par une
suspension de membranes (" ghosts ") biologiques ou artificielles porteuses d'antigènes dans une solution aqueuse tamponnée et pouvant contenir au moins un agent tensioactif.
2) on prépare une deuxième phase liquide constituée par un 10 solvant organique non miscible à l'eau et contenant le ou les
polymères et éventuellement un agent tensioactif.
3) la suspension de membranes biologiques ou artificielles porteuses d'antigènes est ajoutée à la solution organique de polymère(s) sous agitation. On obtient ainsi une émulsion primaire 15 de type eau dans huile (E/H). Le solvant peut constituer de 10 à 90% en volume du mélange formant l'émulsion primaire et, de préférence, de 50 à 90%.
4) cette émulsion primaire est ajoutée sous agitation à une phase aqueuse éventuellement tamponnée et contenant au moins 20 un agent tensioactif. L'émulsion primaire peut constituer de 0.1 à 10% du mélange final, de préférence 1 % du mélange final. On obtient ainsi une émulsion double de type eau dans huile dans eau (E/H/E). L'agitation est poursuivie jusqu'à extraction/évaporation totale du solvant organique conduisant ainsi à la précipitation des 25 microparticules sphériques encapsulant les membranes porteuses d'antigènes. ) Les microparticules ainsi formées sont recueillies après
filtration ou centrifugation ou tout autre procédé approprié.
A l'étape 4, on peut également obtenir une poudre de 30 microparticules en mettant en oeuvre une technique de dessiccation (nébulisation, lyophilisation) après addition de substances stabilisantes. Dans un autre procédé avantageux, on peut également obtenir des microparticules par la technologie en fluide supercritique avec ou sans solvant organique. Ainsi, d'autres 35 méthodes peuvent également être envisagées, notamment la nébulisation, l'enrobage, I'extrusion, la lyophilisation, l'utilisation
des fluides supercritiques.
Les microparticules sont formées d'une matrice polymère
comprenant au moins 1 polymère non biodégradable.
Avantageusement le polymère non biodégradable est choisi dans le groupe des polymères non biodégradables insolubles dans l'eau préférentiellement les dérivés de la cellulose (éthylcellulose, acétate de cellulose, triméllitate de cellulose...) et les dérivés polyacryliques. L'emploi de polymères considérés comme biocompatibles même s'ils sont non biodégradables est une
garantie de l'absence de toxicité desdites microparticules.
Les membranes mises en oeuvre peuvent être d'origine biologique ou d'origine artificielle. Les suspensions de membranes biologiques portant les antigènes sont réalisées selon des 15 techniques bien connues dans le domaine et faisant appel à la lyse cellulaire suivie de lavages successifs par centrifugations ou filtration tangentielle et éventuellement d'une étape de sonication. Les suspensions de membranes artificielles font appel à une solution de phospholipides mélangée par sonication dans une 20 solution aqueuse. Des techniques permettant d'éliminer des agents infectieux ou pathogènes, dont les prions, sont préférentiellement utilisées pour des applications thérapeutiques. Dans le cas des membranes artificielles, l'antigène est ajouté extemporanément dans la suspension de phospholipides afin de se fixer sur ces
derniers.
Le solvant organique, de préférence volatil, est insoluble dans l'eau et de préférence choisi parmi des solvants ou des mélanges de solvants tels que le chloroforme, le dichlorométhane, l'acétate d'éthyle, et tout autre solvant organique susceptible de
dissoudre le ou les polymères.
Avantageusement la concentration du ou des polymères dans le solvant organique ou le mélange de solvants organiques de la première émulsion est comprise de préférence entre 1 et 20% en volume et préférentiellement entre 4 et 10%.
Les agents tensioactifs utilisés peuvent être des agents tensioactifs naturels, synthétiques ioniques et synthétiques non ioniques ou amphotères. Dans chacune des phases, l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs peut être présent à raison de 0 à 10% en poids, de préférence de 0,1 à 2% en poids.
En tant qu'agents tensioactifs, on utilisera de préférence l'alcool polyvinylique (PVA, MW 30 000, 88% hydrolysé) et un dérivé de sorbitane polyoxoéthyléné de type Tween . D'autres agents tensioactifs non ioniques peuvent être utilisés comme par 10 exemple des copolymères d'oxyde d'éthylène et de propylène (de type Pluronic ) ou des esters d'alcool gras et de polyoxyéthylèneglycol, ou des dérivés du sorbitane (de type Span ).
Les polymères utilisés sont des polymères non 15 biodégradables et non solubles dans l'eau. Sans que cette liste soit limitative, on peut citer les polymères de la cellulose de différentes masses moléculaires, les silicones, les dérivés acryliques, les polymères vinyliques, polyamides, polyurées, polyuréthannes, polyéthylènes, polycarbonates, polysulfonates. On obtient ainsi des 20 microparticules non biodégradables et insolubles servant de
réservoir d'antigènes membranaires.
La porosité des microparticules permet la diffusion des anticorps plasmatiques à l'intérieur des microparticules tandis qu'elle empêche la libération des antigènes membranaires en 25 raison de leur taille plus importante. Elle peut être modulée en incorporant dans la phase aqueuse interne ou la phase organique polymère, des substances biocompatibles et de petite masse moléculaire. De même, le complexe antigène/anticorps fixé sur les membranes ne peut être libéré en raison également de sa taille 30 plus importante que le diamètre des pores de la paroi polymère et
du caractère amphiphile du complexe encapsulé.
En ce qui concerne la préparation de la colonne d'immunoaffinité destinée à extraire du fluide circulant les anticorps et de sa mise en oeuvre, les microparticules qui ont été 35 préparées selon la description précédente sont introduites avec ou
sans gel dans une colonne cylindrique de volume et de dimensions adaptées à l'utilisation. Le gel est choisi pour ne pas présenter d'interaction avec le plasma sanguin (agarose, dextran, silice). Il permet d'homogénéiser parfaitement le remplissage de la composition adsorbante dans la colonne. Chaque colonne est équipée d'un filtre en entrée et en sortie de colonne, de diamètre de filtration inférieur au diamètre des microparticules afin d'éviter que les microparticules s'échappent de la colonne. Les colonnes sont en verre ou en plastique traité afin 10 de réduire les adsorptions propres à ce type de matériau. Elles peuvent également être en acier ou tout autre matériau compatible avec les substances biologiques et, par exemple, le plasma sanguin. Enfin, ces divers matériaux peuvent être associés au sein
d'une même colonne.
La colonne est reliée à une première de ses extrémités à une
pompe péristaltique permettant la circulation et l'élution du fluide, par exemple un plasma sanguin d'un patient après séparation des cellules sanguines dans le cas d'une circulation extracorporelle chez l'homme. Dans ce type d'application, la colonne est de 20 préférence à usage unique pour un patient (on verra qu'il est possible de l'utiliser sur plusieurs cycles) sans désorption de l'anticorps fixé sur l'antigène membranaire encapsulé. De plus, les matériaux et produits mis en oeuvre pour le gel, la substance adsorbante et la colonne sont stérilisés.
Comme on l'a indiqué, les membranes mises en oeuvre peuvent être d'origine biologique ou d'origine artificielle, ces deux types pouvant éventuellement être combinés dans une même colonne. Il est également possible de disposer un ou plusieurs types d'antigènes dans une même colonne. Ces combinaisons de 30 types de membranes et/ou antigènes dans la colonne peuvent être homogènes, différentielles ou segmentées. Dans le premier cas, les microcapsules sont réparties d'une manière homogène tout le long de la colonne, dans le second cas, la concentration en microcapsules peut être variable en fonction de la position le long 35 de la colonne, enfin, dans le troisième cas, les microcapsules peuvent être réparties dans des zones homogènes ou non le long de la colonne. Pour le deuxième cas, dans certaines configurations liées à la taille de la colonne et au débit, on peut également utiliser une concentration différentielle perpendiculairement à la direction de circulation du fluide à traiter pour tenir compte de la différence de vitesse du fluide entre le centre de l'écoulement et la/les parois de la colonne. Le troisième cas peut, par exemple, être utile pour extraire un produit complexifié, par exemple une première protéine naturellement fixée sur un site d'une seconde protéine, la 10 complexification rendant difficile l'extraction de la première protéine, dans cet exemple, la première partie de la colonne comporte un antigène à forte affinité pour la seconde protéine et la seconde partie de la colonne un antigène pour la première protéine. Il est également possible de disposer des colonnes de 15 type différent en série afin d'obtenir un même résultat. Toutefois, dans l'exemple donné ci-dessus, si la seconde protéine doit être renvoyée vers le fluide, cette opération ultérieure à l'adsorption sera plus facile avec des colonnes indépendantes en série. Dans une application typique il est également possible d'associer en 20 série et/ou parallèle les colonnes en fonction des besoins. Il est également possible d'utiliser des polymères de type différent pour chaque type d'antigène, les polymères ayant des solvants spécifiques exclusifs permettant une récupération des anticorps spécifique au sein d'une même colonne. Il a été montré que, de manière surprenante et inattendue,
les microparticules ainsi mises en oeuvre dans une colonne donnaient des résultats plus satisfaisants que les mêmes types de microparticules en tube, le rapport masse microparticules/volume solution d'anticorps ou de plasma étant identique. Dans une 30 expérience comparative, le titre en anticorps diminue de 128 à 8 au bout d'une heure en colonne alors qu'il ne diminue qu'au bout de 3 heures de 128 à 64 en tube.
Pour les Figures 1 à 4, la préparation des microparticules contenant des antigènes membranaires de globules rouges de il donneurs de groupes sanguins A et B a été effectuée de la façon suivante Des concentrés érythrocytaires de donneurs sains de groupe sanguin B sont hémolysés dans une solution isotonique à pH 7,4 puis lavés par centrifugations successives dans une solution tamponnée physiologique jusqu'à ce que l'élimination de l'hémoglobine soit totale. La concentration en antigènes membranaires est évaluée par un dosage des protéines membranaires totales avec l'acide bicinchoninique et varie entre 6 10 et 10 g/L. L'activité des sites antigéniques, vérifiée par la méthode
d'hémagglutination, est conservée lors de la préparation.
La suspension d'antigènes membranaires (1ml, 2g/l) est émulsionnée sous agitation magnétique pendant trois minutes dans une solution de dichlorométhane (10 ml) contenant 500 mg de 15 polymère (éthylcellulose, masse moléculaire 146000). Cette première émulsion (eau/huile) est ensuite versée dans un volume d'eau (1500 mi) contenant deux agçnts tensioactifs, l'alcool polyvinylique (0,4%) et le Tween (1%), permettant d'obtenir par agitation mécanique à l'aide d'une hélice marine une seconde 20 émulsion de type eau/huile/eau. Après deux heures, l'agitation est arrêtée puis les microparticules sont recueillies par filtration et séchées à température ambiante. La taille des microparticules est évaluée par diffusion laser avec un MasterSizer . La taille moyenne est de 400 pm.
La figure 1 illustre la capacité d'adsorption de stromas
érythrocytaires (2, 4 et 6 mg/ml en protéines totales) porteurs d'antigènes de groupe A encapsulés dans des microparticules d'éthylcellulose (25 mg) après mise en contact pendant 1, 2, 3 et 4 heures avec 500 pi d'une solution d'anticorps polyclonaux anti-A.
Le titre en anticorps a été déterminé par hémagglutination. Pour ce qui concerne plus particulièrement la Figure 1, la capacité d'adsorption des antigènes membranaires encapsulés est testée en tube en mettant sous agitation douce 25 mg de microparticules avec 500pi d'une solution d'anticorps anti-A pendant 1 à 4 heures.
Le titre initial en anticorps puis après adsorption sur les antigènes membranaires a été testé par hémagglutination.
La figure 2 illustre la capacité d'adsorption de stromas érythrocytaires (2, 4 et 6 mg/ml en protéines totales) porteurs d'antigènes de groupe A encapsulés dans des microparticules d'éthylcellulose (750 mg) introduites dans une colonne chromatographique sur laquelle est éluée à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit de 1 ml/min une solution d'anticorps polygonaux anti-A (15 ml). Le titre en anticorps est déterminé par 10 hémagglutination à l'entrée et en sortie de colonne au cours des différentes phases d'élution sur la colonne. Pour ce qui concerne plus particulièrement la Figure 2, la capacité d'adsorption des antigènes membranaires encapsulés est testée en colonne, après avoir garni une colonne chromatographique avec 750 mg de 15 microparticules et 15 ml d'une solution d'anticorps anti-A sont élués sur la colonne à un débit de 1 ml/min. Le titre en anticorps est évalué par hémagglutination à l'entrée et en sortie de colonne. La figure 3 illustre la capacité d'adsorption de stromas érythrocytaires (2, 4, 6 et 10 mg/ml en protéines totales) porteurs 20 d'antigènes de groupe B encapsulés dans des microparticules d'éthylcellulose (750 mg) introduites dans une colonne chromatographique sur laquelle sont élués, à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit de 1 ml/min, 15 ml de plasma sanguin humain supplémenté en anticorps anti-B. Le titre en anticorps est 25 déterminé par hémagglutination à l'entrée et en sortie de colonne au cours des différentes phases d'élution sur la colonne. Pour ce qui concerne plus particulièrement la Figure 3, la capacité d'adsorption des antigènes membranaires encapsulés est testée comme pour la Figure 2 mais avec 15 ml de plasma sanguin
humain supplémenté en anticorps anti-A.
Des tests on également été effectués avec des membranes érythrocytaires de donneurs sains de groupe A ainsi qu'avec des membranes leucocytaires ou de fibroblastes pour épurer les anticorps anti-HLA. De même avec des vésicules plaquettaires 35 obtenues après activation de plaquettes et sur lesquelles est fixée la P2-glycoprotéine I pour épurer les anticorps antip2-glycoprotéine 1. Enfin, avec des membranes artificielles obtenues en mélangeant à l'aide d'une sonde à ultrasons de la phosphatidylcholine, de la phosphatidyléthanolamine et de la phosphatidylsérine, la f32glycoprotéine 1 est fixée sur ces membranes artificielles pour épurer les anticorps anti-p2-glycoprotéine 1. Dans les deux exemples qui suivent en relation avec les Figures 3 et 4, une colonne en verre de 1,5cm de diamètre et de 10 10cm de longueur a été mise en oeuvre. La colonne est utilisée pendant plusieurs cycles chromatographiques consécutifs. Il est donc possible dans des applications médicales ou biologiques d'utiliser des colonnes plus petites que des colonnes classiques ne fonctionnant que pour un seul cycle et qui ont un volume plus
important de l'ordre de 200 à 300ml.
Sur la Figure 3, la capacité d'adsorption d'une colonne comportant des microparticules d'éthylcellulose (750mg) incluant des membranes d'érythrocytes du groupe B est exprimée en décroissance du titre d'anticorps. Pour chaque passage de la 20 solution d'anticorps on a donné les résultats concernant respectivement de gauche à droite des microparticules correspondant à 2, 6, et 10 mg/ml de protéines totales encapsulées. Huit passages consécutifs de 15 ml d'une solution d'anticorps anti-B avec un débit de lml/min sont représentés. Plus 25 la quantité de protéines totales est importante plus la décroissance est rapide. Après un nombre de passage dépendant de la quantité de protéines totales les sites de fixation des anticorps sont pratiquement tous occupés et le taux d'anticorps reste en plateau.
Sur la Figure 4, la capacité d'adsorption d'une colonne 30 comportant des microparticules d'éthylcellulose (750mg) incluant des membranes d'érythrocytes portant des antigènes B et Kell est exprimée en décroissance du titre d'anticorps. Pour chaque passage de la solution d'anticorps on a donné les résultats concernant respectivement à gauche une solution d'anticorps anti35 B et à droite une solution d'anticorps anti-Kell. Huit passages consécutifs de 15 ml de ces solutions avec un débit de 1ml/min
sont représentés.

Claims (10)

REVENDICATIONS
1. Colonne d'immunoaffinité à composition adsorbante pour épuration d'anticorps contenus dans un fluide circulant dans ladite colonne, caractérisée en ce que la composition adsorbante comporte au moins un ensemble de microparticules polymères encapsulant des antigènes associés à des phospholipides, les microparticules étant obtenues par élimination d'au moins un solvant organique dans une émulsion double eau dans l'huile dans l'eau, l'émulsion double étant obtenue en deux étapes: la première étape consistant à préparer une émulsion primaire eau dans l'huile par combinaison d'une première phase liquide avec une seconde phase liquide, la première phase liquide comportant au moins des phospholipides associés à des antigènes 15 dans une solution aqueuse tamponnée, les phospholipides et antigènes de la première phase correspondant à des membranes porteuses d'antigènes, la seconde phase liquide comportant au moins un solvant organique non miscible à l'eau et au moins un polymère soluble dans ledit solvant et non soluble dans l'eau, la seconde étape consistant à ajouter dans l'émulsion primaire une troisième phase aqueuse comportant au moins un agent tensioactif afin de former l'émulsion double, le polymère formant les microparticules permettant la diffusion des anticorps du fluide à l'intérieur des microparticules 25 tout en empêchant la libération des antigènes membranaires et des complexes antigène/anticorps fixés sur les membranes, un gel pouvant être associé aux microparticules dans la colonne. 2. Colonne selon la revendication 1 caractérisée en ce que, 30 outre l'eau, le solvant organique est éliminé de la double émulsion par évaporation et/ou dessiccation, la dessiccation étant obtenue
notamment par nébulisation ou lyophilisation.
3. Colonne selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que les membranes sont biologiques et extraites à partir de cellules
biologiques.
4. Colonne selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce
que les membranes sont artificielles.
5. Colonne selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'antigène est un antigène
érythrocytaire de groupe A ou de groupe B.
6. Colonne selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'antigène est un antigène du système HLA.
7. Colonne selon l'une quelconque des revendications 10 précédentes caractérisée en ce que l'antigène est la
P2-glycoprotéine 1.
8. Colonne selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le polymère est non biodégradable et choisi parmi le groupe des dérivés de la cellulose 15 dont l'éthylcellulose, l'acétate de cellulose, le triméllitate de
cellulose et le groupe des dérivés polyacryliques.
9. Colonne selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le solvant organique est volatil et est choisi parmi des solvants ou des mélanges de solvants tels 20 que le chloroforme, le dichlorométhane, l'acétate d'éthyle, ou tout autre solvant organique susceptible de dissoudre le ou les polymères.
10. Colonne selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le gel est choisi parmi 25 l'agarose, dextran, silice ou autre produit compatible avec le fluide. Il. Colonne selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le ou les polymères représentent 1 à 20% en volume dans l'émulsion primaire et, de préférence, 4 à 10%, le ou les solvants organiques représentent 10 30 à 90% en volume dans l'émulsion primaire et, de préférence, de 50
à 90%,
l'émulsion primaire représentant 0,1 à 10% en volume dans
l'émulsion double et, de préférence 1%.
12. Colonne selon l'une quelconque des revendications 35 précédentes caractérisée en ce qu'au moins une des phases
liquides destinée à former l'émulsion primaire comporte en outre au moins un agent tensioactif, ledit agent tensioactif étant choisi parmi les agents tensioactifs naturels, synthétiques ioniques, synthétiques non ioniques ou amphotères, l'agent tensioactif ou le mélange d'agents tensioactifs représentant plus de 0 à 10% en
poids de la phase correspondante et, de préférence, de 0,1 à 2% en poids.
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