FR2842424A1 - USE OF NAD OR ONE OF ITS ANALOGS, SUBSTRATE OF MONO-ADP-RIBOSYL TRANFERASES, FOR THE PREPARATION OF A MEDICAMENT FOR THE TREATMENT OF CONDITIONS RELATED TO PURINERGIC RECEPTORS - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à l'utilisation du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) ou d'au moins un de ses analogues, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique, avantageusement de type P2X ou P2Y, ledit médicament étant particulièrement destiné au traitement des pathologies dans lesquelles les récepteurs purinergiques participent au processus physiopathologique ou des pathologies liées à une dérégulation de l'activité des récepteurs purinergiques.The present invention relates to the use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) or of at least one of its analogues, substrate of mono-ADP-ribosyl transferases (ART) in the preparation of a medicament intended to modulate the activity of at least one purinergic receptor, advantageously of the P2X or P2Y type, said medicament being particularly intended for the treatment of pathologies in which the purinergic receptors participate in the physiopathological process or of pathologies linked to deregulation of the activity of the purinergic receptors.

Description

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Utilisation du NAD ou de l'un de ses analogues, substrat des mono-ADP- ribosyl transferases, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées aux récepteurs purinergiques.  Use of NAD or one of its analogs, substrate of mono-ADP-ribosyl transferases, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies linked to purinergic receptors.

La présente invention est relative à l'utilisation du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) ou d'au moins un de ses analogues, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique, avantageusement de type P2X ou P2Y, ledit médicament étant particulièrement destiné au traitement des pathologies dans lesquelles les récepteurs purinergiques participent au processus physiopathologique ou des pathologies liées à une dérégulation de l'activité des récepteurs purinergiques.  The present invention relates to the use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) or at least one of its analogues, substrate of mono-ADP-ribosyl transferases (ART) in the preparation of a medicament intended to modulate the activity at least one purinergic receptor, advantageously of the P2X or P2Y type, the said drug being particularly intended for the treatment of pathologies in which the purinergic receptors participate in the pathophysiological process or of pathologies linked to a deregulation of the activity of the purinergic receptors.

L'analyse du génome de nombreuses espèces ne cesse de révéler de nouvelles protéines capables de lier les purines naturelles que sont l'adénosine, l'adénosine triphosphate (ATP) ou le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et qui interviennent dans la communication cellulaire par des actions pharmacologiques spécifiques. Il s'agit en particulier des récepteurs purinergiques de type P1, principalement sensibles à l'adénosine, ou P2, principalement sensibles à l'ATP, et des adénosine diphosphate-ribosyl transférases (ADP-ribosyl transférases) qui ont une activité enzymatique qui leur permet de transférer un groupement ADP-ribose du NAD sur des protéines cibles.  Genome analysis of many species continues to reveal new proteins capable of binding natural purines such as adenosine, adenosine triphosphate (ATP) or nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and which are involved in cellular communication by specific pharmacological actions. These are in particular purinergic receptors of type P1, mainly sensitive to adenosine, or P2, mainly sensitive to ATP, and adenosine diphosphate-ribosyl transferases (ADP-ribosyl transferases) which have an enzymatic activity which their makes it possible to transfer an ADP-ribose group from NAD to target proteins.

Il est connu que l'ATP, outre son rôle de co-facteur enzymatique et son rôle dans la formation de liaisons phosphates, est aussi un messager extracellulaire impliqué dans de nombreux processus biologiques, produisant ces effets via une famille particulière de récepteurs purinergiques présents à la surface des cellules de nombreux tissus, les récepteurs P2.  It is known that ATP, in addition to its role as an enzyme co-factor and its role in the formation of phosphate bonds, is also an extracellular messenger involved in numerous biological processes, producing these effects via a particular family of purinergic receptors present in the cell surface of many tissues, the P2 receptors.

Les récepteurs P2 existent sous la forme de deux familles distinctes, les récepteurs P2X dont il est connu sept isoformes (P2Xi.7) et qui sont des canaux ioniques qui sont constitués après activation par la formation d'homo- ou d'hétéro-polymères dans les membranes, et les récepteurs P2Y, protéines à sept domaines transmembranaires, qui sont couplés aux protéines G et dont il est connu 11 isoformes (P2Y1-11)
Les récepteurs P2, du fait de leur présence dans de P2 receptors exist in the form of two distinct families, the P2X receptors of which seven isoforms are known (P2Xi.7) and which are ion channels which are formed after activation by the formation of homo- or hetero-polymers in membranes, and P2Y receptors, proteins with seven transmembrane domains, which are coupled to G proteins and of which 11 isoforms are known (P2Y1-11)
P2 receptors, due to their presence in

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nombreux tissus, sont impliqués dans une grande variété de fonctions biologiques et ainsi potentiellement impliqués dans de nombreuses pathologies comme par exemple et sans limitation, les maladies neurologiques et neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires et l'ischémie, les maladies inflammatoires systémiques, le cancer ou encore les maladies autoimmunes comme le diabète. On peut à cet égard se référer à la revue de G. Burnstock et M. Williams (The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2000, 295 :862-869).  many tissues, are involved in a wide variety of biological functions and thus potentially involved in many pathologies such as for example and without limitation, neurological and neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases and ischemia, systemic inflammatory diseases, cancer or even autoimmune diseases like diabetes. In this regard, we can refer to the review by G. Burnstock and M. Williams (The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2000, 295: 862-869).

Les récepteurs P2X et P2Y sont décrits dans les systèmes nerveux central et périphérique sur lesquels on sait que l'ATP produit des effets aussi bien sédatifs qu'excitants. Ils sont aussi décrits dans le système auditif.  The P2X and P2Y receptors are described in the central and peripheral nervous systems on which it is known that ATP produces both sedative and exciting effects. They are also described in the auditory system.

Il en est de même dans le système oculaire où les récepteurs P2X et P2Y seraient impliqués dans la régulation des flux sanguins rétiniens et de la pression intraoculaire qui peut être réduite par l'utilisation d'analogues de l'ATP via les récepteurs P2. A l'inverse, une activation du récepteur P2Y2 entraîne une augmentation des sécrétions oculaires, ce qui permet d'envisager l'utilisation d'activateur de ces récepteurs P2 pour le traitement des pathologies liées à la sécheresse oculaire. Au niveau rétinien, l'augmentation de l'activité des récepteurs P2Y2 serait impliquée dans les décollements de la rétine.  The same is true in the ocular system where the P2X and P2Y receptors are believed to be involved in the regulation of retinal blood flow and intraocular pressure which can be reduced by the use of ATP analogs via the P2 receptors. Conversely, activation of the P2Y2 receptor leads to an increase in ocular secretions, which makes it possible to envisage the use of activator of these P2 receptors for the treatment of pathologies linked to dry eye. At the retinal level, the increased activity of P2Y2 receptors is implicated in detachments of the retina.

Des antagonistes des récepteurs P2X sont décrits comme de potentiels agents anti-épileptiques.  P2X receptor antagonists are described as potential anti-epileptic agents.

Il a été montré que des souris déficientes en récepteur P2X3 présentent une perception de la douleur fortement diminuée. Dans cet ordre d'idée, des antagonistes des récepteurs P2 présentent des propriétés analgésiques.  It has been shown that mice deficient in the P2X3 receptor have a greatly diminished perception of pain. In this connection, P2 receptor antagonists have analgesic properties.

L'implication des récepteurs P2 est aussi décrite dans les phénomènes d'homéostasie cellulaire, dans les processus de neuroviabilité et de neurorégénération ainsi que dans les pathologies neurodégénératives, dans les pathologies de l'incontinence urinaire (P2X), dans le psoriasis (P2X), dans la sclérodermie (P2X), l'infertilité masculine (P2X) ou encore dans les carcinomes cellulaires basaux.  The involvement of P2 receptors is also described in the phenomena of cellular homeostasis, in the processes of neuroviability and neuroregeneration as well as in neurodegenerative pathologies, in pathologies of urinary incontinence (P2X), in psoriasis (P2X) , in scleroderma (P2X), male infertility (P2X) or even in basal cell carcinomas.

Des souris déficientes en récepteurs P2Y1 présentent une résistance accrue aux thromboses. Des antagonistes des récepteurs P2Y  Mice deficient in P2Y1 receptors exhibit increased resistance to thrombosis. P2Y receptor antagonists

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sont connus comme présentant une activité anti-thrombique.  are known to have anti-thrombic activity.

Il est également évoqué que la modulation de l'activité des récepteurs P2 (X et Y) pourrait être un traitement potentiel de l'ostéoporose, de l'arthrite rhumatoïde, de la périodontite ou encore de l'ostéopénie.  It is also suggested that modulating the activity of P2 receptors (X and Y) could be a potential treatment for osteoporosis, rheumatoid arthritis, periodontitis or even osteopenia.

L'augmentation des sécrétions dans le colon et les canaux biliaires et pancréatiques, de même que la sécrétion de l'insuline par le pancréas sont décrites comme liées à une modification de l'activité des récepteurs P2Y.  Increased secretions in the colon and bile and pancreatic ducts, as well as secretion of insulin by the pancreas are described as linked to a change in the activity of P2Y receptors.

L'implication des récepteurs purinergiques est aussi décrite dans les maladies inflammatoires systémiques telles le lupus ou la polyarthrite, les maladies inflammatoires du colon, le cancer et les maladies autoimmunes comme le diabète.  The involvement of purinergic receptors is also described in systemic inflammatory diseases such as lupus or polyarthritis, inflammatory colon diseases, cancer and autoimmune diseases such as diabetes.

L'implication des récepteurs P2X dans l'apoptose cellulaire est bien décrite. L'activation des récepteurs P2 déclenche l'apoptose pour faciliter l'embryogenèse, mais également pour éliminer des tissus les cellules cancéreuses ou infectées. L'activation du récepteur P2X via l'ATP, induit une cytolyse des macrophages infectés, ce qui représente une voie potentielle de traitement des pathologies infectieuses, comme cela est par exemple décrit pour le traitement de la tuberculose (Stober C. B. et al., The Journal of Immunology, 2001, 166 : 6276-6286).  The involvement of P2X receptors in cellular apoptosis is well described. Activation of P2 receptors triggers apoptosis to facilitate embryogenesis, but also to remove cancerous or infected cells from tissue. Activation of the P2X receptor via ATP induces cytolysis of infected macrophages, which represents a potential pathway for the treatment of infectious pathologies, as described for example for the treatment of tuberculosis (Stober CB et al., The Journal of Immunology, 2001, 166: 6276-6286).

On comprend de ce qui précède l'importance des récepteurs purinergiques, particulièrement des récepteurs P2, (P2X et P2Y), et de la modulation de leur activité dans les mécanismes biologiques.  We understand from the above the importance of purinergic receptors, particularly P2 receptors (P2X and P2Y), and the modulation of their activity in biological mechanisms.

Cependant, il apparaît que peu de modulateurs (agonistes ou antagonistes) de l'activité des récepteurs P2 ont été décrits, n'offrant ainsi qu'un nombre restreint d'agents potentiellement utilisables dans la voie de la modulation de l'activité des récepteurs purinergiques pour le traitement desdites pathologies (voir le document G. Burnstock et M. Williams, précédemment cité). Il reste donc un réel besoin pour de nouveaux modulateurs de l'activité des récepteurs purinergiques. C'est un des buts de la présente invention que de fournir de tels modulateurs.  However, it appears that few modulators (agonists or antagonists) of P2 receptor activity have been described, thus offering only a limited number of agents potentially usable in the pathway of modulating receptor activity. purinergics for the treatment of said pathologies (see the document G. Burnstock and M. Williams, previously cited). There therefore remains a real need for new modulators of the activity of purinergic receptors. It is one of the aims of the present invention to provide such modulators.

Par ailleurs, parmi les ADP-ribosyl transférases, les monoADP-ribosyl transférases (ART) sont connues depuis longtemps car elles correspondent aux toxines de nombreuses bactéries pathogènes comme  Furthermore, among ADP-ribosyl transferases, monoADP-ribosyl transferases (ART) have been known for a long time because they correspond to the toxins of many pathogenic bacteria such as

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Corynebacterium diphteriae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bordetella petrussis, Clostridium botulinum, Vibrio cholerae ou encore certaines salmonelles (Schmitt et al., Emerging Infectious Diseases, 5 : 224, 1999) ,
Ce n'est que récemment que l'existence d'ART a été décrite chez les vertébrés. On en connaît aujourd'hui au moins 5 isôformes (Haa g et Koch-Nolte, J. Biol Regul. Homeost. Agents, 1998,12 ; 53. Okazaki et Moss, Ann. Rev. Nutr. 1999,19 : 485). Chez l'Homme, la .souris ou le rat, ces protéines sont en majorité des protéines membranaires glypiées, ancrées dans la membrane par un groupement phosphatidyl innositol (GPI anchored). Corynebacterium diphteriae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bordetella petrussis, Clostridium botulinum, Vibrio cholerae or certain salmonella (Schmitt et al., Emerging Infectious Diseases, 5: 224, 1999),
It is only recently that the existence of ART has been described in vertebrates. At least 5 isoforms are known today (Haa g and Koch-Nolte, J. Biol Regul. Homeost. Agents, 1998,12; 53. Okazaki and Moss, Ann. Rev. Nutr. 1999,19: 485). In humans, mice or rats, these proteins are mostly glypiated membrane proteins, anchored in the membrane by a phosphatidyl innositol group (GPI anchored).

Elles sont donc présentes à la surface des cellules mais peuvent être relarguées dans certaines conditions grâce, en particulier, à l'intervention de métalloprotéases (Kahl et al., J. Immunol., 2000,165 : 4463-4469). They are therefore present on the surface of cells but can be released under certain conditions thanks, in particular, to the intervention of metalloproteases (Kahl et al., J. Immunol., 2000,165: 4463-4469).

On sait encore peu de choses sur le rôle de ces ART. Elles sont capables de fixer un groupement ADP-ribose à partir du NAD sur les arginines, les cystéines, les asparagines ou les acides glutamiques de protéines cibles. Chez certaines souches de souris, cela peut aussi conduire à une inhibition de la migration cellulaire par ADP-ribosylation des intégrines et à un blocage des interactions cellulaires. Chez l'homme, l'activité des ART1 dans la peau semble conduire à une ADP-ribosylation de facteurs de croissances comme le facteur de croissance fibroblastique (FGF) et de son récepteur, modifiant ainsi l'homéostasie du tissu. D'une manière plus générale, des déficits dans l'expression des ART ont été décrits, chez le rat et chez la souris, comme des facteurs de prédisposition au diabète et aux maladies auto-immunes, ce qui confirme leur intervention vraisemblable dans la régulation de l'immunité naturelle et acquise.  We still know little about the role of these ART. They are capable of fixing an ADP-ribose group from NAD on the arginines, cysteines, asparagines or glutamic acids of target proteins. In certain strains of mice, this can also lead to an inhibition of cell migration by ADP-ribosylation of integrins and to a blocking of cellular interactions. In humans, the activity of ART1 in the skin seems to lead to ADP-ribosylation of growth factors such as fibroblastic growth factor (FGF) and its receptor, thus modifying the homeostasis of the tissue. More generally, deficits in the expression of ART have been described, in rats and mice, as predisposing factors for diabetes and autoimmune diseases, which confirms their probable intervention in the regulation natural and acquired immunity.

Récemment, le sous-type ART2. 2 a été décrit comme sélectivement présent dans les lymphocytes T matures de souris (Koch-Nolte et al., J.Immunol., 1999, 163 :6014) Le NAD est connu pour ces propriétés antagonistes des narcotiques et son utilisation comme produit dissuasif dans le traitement de l'alcoolisme. Recently, the ART2 subtype. 2 has been described as selectively present in mature mouse T lymphocytes (Koch-Nolte et al., J. Immunol., 1999, 163: 6014) NAD is known for these antagonistic properties of narcotics and its use as a deterrent in the treatment of alcoholism.

A ce jour aucun lien n'a été établi entre les ART, leur activité d'ADP-ribosylation et les récepteurs purinergiques, particulièrement ceux de type P2.  To date, no link has been established between ART, their ADP-ribosylation activity and purinergic receptors, particularly those of the P2 type.

Or de manière surprenante, les inventeurs viennent  Surprisingly, the inventors come

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maintenant de démontrer que l'utilisation de NAD ou de ses analogues, substrat des ART, peut entraîner un effet pharmacologique lié à la modulation de l'activité des récepteurs purinergiques, particulièrement ceux de type P2.  now to demonstrate that the use of NAD or its analogues, substrate of ART, can cause a pharmacological effect linked to the modulation of the activity of purinergic receptors, particularly those of the P2 type.

II a été démontré que le NAD, via une ART, particulièrement le sous-type ART2. 2, induit rapidement l'apoptose des lymphocytes T naïfs chez la souris (Adriouch et al., J. Immunol., 2001, 167: 196-203).  It has been demonstrated that NAD, via an ART, particularly the ART2 subtype. 2, rapidly induces apoptosis of naive T lymphocytes in mice (Adriouch et al., J. Immunol., 2001, 167: 196-203).

Les inventeurs ont maintenant démontré qu'un analogue du NAD, l'éthéno-NAD, qui ne diffère du NAD que par une modification du groupement adénosine, mais qui demeure un substrat efficace des ART, particulièrement le sous-type ART2. 2, n'induit pas l'apoptose des lymphocytes T naïfs chez la souris. Cela suggère donc l'existence d'un effecteur secondaire sensible à l'adénosine et non à ses analogues, dont la modulation de l'activité conduit au déclenchement de l'apoptose induite par le NAD via les ART. Les inventeurs ont de manière surprenante découvert que cet effecteur est un récepteur purinergique de type P2X7. L'utilisation d'inhibiteurs des récepteurs P2X7 bloque en effet l'apoptose ART-dependante induite par le NAD.  The inventors have now demonstrated that an analog of NAD, etheno-NAD, which differs from NAD only by a modification of the adenosine group, but which remains an effective substrate for ART, particularly the ART2 subtype. 2, does not induce apoptosis of naive T lymphocytes in mice. This therefore suggests the existence of a secondary effector sensitive to adenosine and not to its analogs, whose modulation of activity leads to the triggering of NAD-induced apoptosis via ART. The inventors have surprisingly discovered that this effector is a P2X7 type purinergic receptor. The use of P2X7 receptor inhibitors indeed blocks NAD-induced ART-dependent apoptosis.

De plus les inventeurs ont démontré que cet effet pharmacologique du NAD sur les lymphocytes T via les récepteurs purinergiques s'exerce à des concentrations cent fois inférieures à celles requises pour induire le même phénomène, via une activation directe par l'ATP des récepteurs purinergiques.  In addition, the inventors have demonstrated that this pharmacological effect of NAD on T lymphocytes via the purinergic receptors is exerted at concentrations one hundred times lower than those required to induce the same phenomenon, via direct activation by ATP of the purinergic receptors.

Cela démontre qu'il est possible de moduler l'activité des récepteurs purinergiques par une ADP-ribosylation induite par le NAD ou ses analogues, substrat des ART, et qu'ainsi il doit être possible de moduler les effets pharmacologiques dépendants desdits récepteurs et ce à des concentrations plus faibles que celles nécessaires pour obtenir des effets identiques avec les ligands libres spécifiques des récepteurs purinergiques.  This demonstrates that it is possible to modulate the activity of purinergic receptors by ADP-ribosylation induced by NAD or its analogues, substrate of ART, and that thus it must be possible to modulate the pharmacological effects dependent on said receptors and this. at lower concentrations than those necessary to obtain identical effects with the free ligands specific for the purinergic receptors.

C'est cette découverte qui est à la base de la présente invention. En effet, cela ouvre une nouvelle voie de modulation de l'activité des récepteurs purinergiques et en conséquence de nouvelles voies dans le traitement des pathologies liées à une dérégulation de l'activité des récepteurs purinergiques.  It is this discovery which is the basis of the present invention. Indeed, this opens up a new way of modulating the activity of purinergic receptors and consequently new ways in the treatment of pathologies linked to a deregulation of the activity of purinergic receptors.

Ainsi, l'invention a pour objet l'utilisation du NAD ou d'au moins un de ses analogues, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases  Thus, the subject of the invention is the use of NAD or of at least one of its analogs, substrate for mono-ADP-ribosyl transferases

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(ART) dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique, avantageusement de type P2X ou P2Y.  (ART) in the preparation of a medicament intended to modulate the activity of at least one purinergic receptor, advantageously of the P2X or P2Y type.

Par modulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique on entend une activation ou une stimulation ou une diminution ou une inhibition de l'activité dudit récepteur.  By modulation of the activity of at least one purinergic receptor is meant activation or stimulation or a decrease or inhibition of the activity of said receptor.

Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le médicament est destiné au traitement des pathologies liées à une dérégulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique, particulièrement un récepteur de type P2X ou P2Y.  According to another preferred embodiment of the invention, the medicament is intended for the treatment of pathologies linked to a deregulation of the activity of at least one purinergic receptor, particularly a receptor of the P2X or P2Y type.

Par pathologies liées à une dérégulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique, on entend les pathologies liées soit à l'apparition, l'augmentation, la diminution ou la disparition de l'activité dudit récepteur.  By pathologies linked to a deregulation of the activity of at least one purinergic receptor, is meant the pathologies linked either to the appearance, the increase, the decrease or the disappearance of the activity of said receptor.

Par analogues du NAD substrats des ART on entend selon l'invention, des molécules sur lesquelles ont été introduites des modifications du groupement nicotinamide, des modifications de la liaison 5'-5' pyrophosphate, des modifications du groupement ribose de la partie ADP du NAD, des modifications du groupement adénine ou une combinaison de ces différentes modifications.  By analogues of NAD ART substrates is meant according to the invention, molecules onto which modifications of the nicotinamide group have been introduced, modifications of the 5'-5 'pyrophosphate bond, modifications of the ribose group of the ADP part of NAD , modifications of the adenine group or a combination of these different modifications.

A titre d'exemple d'analogues du NAD connus utilisables selon l'invention on peut citer l'éthéno-NAD, le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD) ou le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD).  Examples of known NAD analogs which can be used according to the invention include etheno-NAD, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (NHD) or nicotinamide guanosine dinucleotide (NGD).

Les travaux de Kim et al., (EMBO Journal, Vol. 20, N 22, pp 6347-6358, 2001)montrent que dans les cellules embryonnaires humaines de rein, le récepteur P2X7 est associé à 11 autres protéines, dont certaines pourraient avoir un rôle régulateur du récepteur P2X7.  The work of Kim et al. (EMBO Journal, Vol. 20, N 22, pp 6347-6358, 2001) show that in human embryonic kidney cells, the P2X7 receptor is associated with 11 other proteins, some of which may have a regulatory role for the P2X7 receptor.

Ainsi, la modulation de l'activité des récepteurs purinergiques par une ADP-ribosylation induite par le NAD ou ses analogues, substrat des ART, peut se faire soit par ADP-ribosylation directe des récepteurs purinergiques, soit par ADP-ribosylation d'autres facteurs protéiques environnants qui eux-mêmes interviendraient alors sur les récepteurs purinergiques.  Thus, the modulation of the activity of purinergic receptors by ADP-ribosylation induced by NAD or its analogues, substrate of ART, can be done either by direct ADP-ribosylation of purinergic receptors, or by ADP-ribosylation of other factors. surrounding proteins which themselves would then intervene on the purinergic receptors.

Les différentes ART ainsi que les différents récepteurs purinergiques ont des distributions ubiquitaires dans l'organisme. Plusieurs  The different ARTs as well as the different purinergic receptors have ubiquitous distributions in the organism. Many

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ART et plusieurs récepteurs purinergiques peuvent être présents sur une même cellule. Cependant ni toutes les ART, ni tous les récepteurs purinergiques ne sont présents sur tous les types cellulaires. Ainsi, il peut exister à la surface des cellules des couples ART/récepteurs purinergiques spécifiques d'un type cellulaire considéré.  ART and several purinergic receptors can be present on the same cell. However, neither all ART nor all purinergic receptors are present on all cell types. Thus, there may exist on the surface of the cells couples ART / purinergic receptors specific for a cell type considered.

Dès lors il est envisageable d'utiliser des analogues du NAD spécifiques d'une ART particulière, elle-même impliquée dans un couple ART/récepteurs purinergiques spécifique d'un type cellulaire donné, pour moduler spécifiquement l'activité dudit récepteur purinergique.  Therefore it is possible to use NAD analogs specific for a particular ART, itself involved in an ART / purinergic receptor pair specific for a given cell type, to specifically modulate the activity of said purinergic receptor.

Les nombreuses fonctions biologiques dans lesquelles les récepteurs purinergiques sont impliqués, permettent d'envisager l'utilisation du NAD ou d'au moins un de ses analogues, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies des systèmes nerveux central et périphérique, comme les troubles neurologiques ou les pathologies neurodégénératives, particulièrement en intervenant sur les processus de neuroviabilité et de neurorégénération, au traitement des pathologies du système cardiovasculaire, particulièrement les thromboses comme agent antithrombique, au traitement des pathologies du système auditif, au traitement des pathologies du système oculaire particulièrement celles liées à la régulation des flux sanguins rétiniens et de la pression intraoculaire ou encore celles liées à la sécheresse oculaire par une augmentation des sécrétions oculaires ou encore le traitement des décollements de la rétine, au traitement de la douleur par exemple comme analgésiques, au traitement des pathologies inflammatoires systémiques comme l'arthrite rhumatoïde, le lupus ou encore la polyarthrite, au traitement des pathologies du système gastrointestinal comme les pathologies inflammatoires du colon ou les pathologies nécessitant une modulation des sécrétions dans le colon ou les canaux biliaires, au traitement des pathologies autoimmunes comme le diabète, par exemple par la stimulation de la sécrétion de l'insuline par le pancréas, au traitement du cancer et des carcinomes cellulaires basaux, au traitement de l'épilepsie, au traitement de l'incontinence urinaire, du psoriasis, de la sclérodermie, de l'infertilité masculine, de l'ostéoporose, de la périodontite ou encore de l'ostéopénie, au traitement des pathologies infectieuses.  The numerous biological functions in which the purinergic receptors are involved, make it possible to envisage the use of NAD or of at least one of its analogues, substrate of mono-ADP-ribosyl transferases (ART) in the preparation of a medicament intended to the treatment of pathologies of the central and peripheral nervous systems, such as neurological disorders or neurodegenerative pathologies, particularly by intervening in the processes of neuroviability and neuroregeneration, to the treatment of pathologies of the cardiovascular system, particularly the thromboses as an antithrombic agent, to the treatment of pathologies of the auditory system, treatment of pathologies of the ocular system, particularly those linked to the regulation of retinal blood flow and intraocular pressure or those linked to dry eyes by an increase in ocular secretions or the treatment of detachment ts of the retina, for the treatment of pain, for example as analgesics, for the treatment of inflammatory systemic pathologies such as rheumatoid arthritis, lupus or polyarthritis, for the treatment of pathologies of the gastrointestinal system such as inflammatory pathologies of the colon or pathologies requiring modulation of secretions in the colon or bile ducts, in the treatment of autoimmune pathologies such as diabetes, for example by stimulation of the secretion of insulin by the pancreas, in the treatment of cancer and basal cell carcinomas, in the treatment epilepsy, to the treatment of urinary incontinence, psoriasis, scleroderma, male infertility, osteoporosis, periodontitis or osteopenia, to the treatment of infectious pathologies.

L'invention a aussi pour objet un procédé d'évaluation de l'effet modulateur d'une mono-ADP-ribosyl transférase présente à la surface  The invention also relates to a method for evaluating the modulating effect of a mono-ADP-ribosyl transferase present on the surface.

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d'une cellule, sur un récepteur purinergique présent à la surface de la même cellule, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ladite cellule avec un composé connu comme substrat de ladite mono-ADPribosyl transférase, et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité dudit récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins, placées dans les mêmes conditions expérimentales.  of a cell, on a purinergic receptor present on the surface of the same cell, characterized in that in a first step, said cell is brought into contact with a compound known as a substrate for said mono-ADPribosyl transferase, and that in a second step, the activity level of said purinergic receptor in said cells is evaluated by any appropriate means relative to the activity level of the same receptor in control cells, placed under the same experimental conditions.

L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation de l'effet d'un composé, substrat d'une mono-ADP-ribosyl transférase, sur les récepteurs purinergiques, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ledit composé avec des cellules porteuses de ladite monoADP-ribosyl transférase et d'au moins un récepteur purinergique et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité du récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins placées dans les mêmes conditions expérimentales.  The invention also relates to a method for evaluating the effect of a compound, substrate of a mono-ADP-ribosyl transferase, on purinergic receptors, characterized in that in a first step, said contact is brought into contact compound with cells carrying said monoADP-ribosyl transferase and at least one purinergic receptor and that, in a second step, the activity level of the purinergic receptor in said cells is evaluated relative to the activity level of the same receptor in control cells placed under the same experimental conditions.

Dans les procédés selon l'invention, les cellules témoins sont des cellules qui, dans les mêmes conditions expérimentales, soit n'ont été mises en contact avec aucun composé substrat des mono-ADP-ribosyl transférases, susceptible d'induire un effet sur les récepteurs purinergiques, soit ont été mises en contact avec un composé substrat des mono-ADPribosyl transférases, connu pour avoir un effet sur les récepteurs purinergiques.  In the methods according to the invention, the control cells are cells which, under the same experimental conditions, either have not been brought into contact with any substrate compound of the mono-ADP-ribosyl transferases, capable of inducing an effect on the purinergic receptors, or have been brought into contact with a substrate compound of mono-ADPribosyl transferases, known to have an effect on purinergic receptors.

De même, les moyens appropriés pour évaluer le niveau d'activité du récepteur purinergique sont ceux que connaît l'homme du métier dans la mesure où il sait évaluer, indépendamment de tout effet dû à une mono-ADP-ribosyl transférase, l'activité du récepteur purinergique. On peut citer à titre d'exemple la détection d'un marqueur de ladite activité du récepteur purinergique par des anticorps spécifiques dudit marqueur, l'induction de flux calciques, l'activation de protéines G, la synthèse d'AMP-cyclique, l'ouverture d'un canal ionique détectable en électrophysiologie, l'induction d'une perméabilité à des molécules comme le YOPRO-1 ou le bromure d'éthidium, l'expression des phosphatidyl serines détectable par l'annexine-V, l'apoptose mesurée par l'analyse de la fragmentation de l'ADN, la sécrétion de cytokines, sans que cette liste soit limitative .  Likewise, the appropriate means for evaluating the level of activity of the purinergic receptor are those known to a person skilled in the art insofar as he can evaluate, independently of any effect due to a mono-ADP-ribosyl transferase, the activity of the purinergic receptor. By way of example, mention may be made of the detection of a marker for said purinergic receptor activity by antibodies specific for said marker, the induction of calcium flows, the activation of G proteins, the synthesis of cyclic AMP, opening of an ion channel detectable in electrophysiology, induction of permeability to molecules such as YOPRO-1 or ethidium bromide, expression of phosphatidyl serines detectable by annexin-V, apoptosis measured by the analysis of DNA fragmentation, the secretion of cytokines, without this list being exhaustive.

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Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'Invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
La Figure 1 représente les résultats des expériences réalisées en vue de démontrer l'implication des ART2 dans l'apoptose des cellules T. In addition to the foregoing provisions, the invention also comprises other provisions which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the invention as well as to the appended drawings, in which:
Figure 1 represents the results of the experiments carried out in order to demonstrate the implication of ART2 in the apoptosis of T cells.

- Les Figures 2 et 3 représentent les résultats des expériences réalisées en vue de montrer les effets d'un analogue du NAD sur les cellules T.  - Figures 2 and 3 represent the results of experiments carried out to show the effects of an analog of NAD on T cells.

- La Figure 4 représente les résultats des expériences réalisées en vue de montrer les effets du NAD et de l'ATP sur la formation de pores membranaires dans les cellules de ganglions lymphatiques.  - Figure 4 represents the results of the experiments carried out in order to show the effects of NAD and ATP on the formation of membrane pores in the cells of lymph nodes.

- La Figure 5 représente les résultats des expériences réalisées en vue de montrer que l'apoptose des lymphocytes T, induite par le NAD, passe par l'activation du récepteur P2X7.  - Figure 5 represents the results of the experiments carried out with a view to showing that the apoptosis of T lymphocytes, induced by NAD, requires activation of the P2X7 receptor.

- Les Figures 6 et 7 représentent les résultats des expériences réalisées en vue de montrer que l'apoptose des lymphocytes T, induite par le NAD, requiert la présence d'une ART2.  - Figures 6 and 7 show the results of experiments carried out to show that apoptosis of T cells, induced by NAD, requires the presence of an ART2.

- La Figure 8 représente les résultats des expériences réalisées en vue de montrer que l'apoptose cellulaire induite par le NAD requiert la présence simultanée d'une ART2 et du récepteur P2X7.  - Figure 8 represents the results of the experiments carried out in order to show that the cellular apoptosis induced by NAD requires the simultaneous presence of an ART2 and the P2X7 receptor.

Les exemples suivants sont illustratifs de l'invention et ne la limitent aucunement.  The following examples are illustrative of the invention and do not limit it in any way.

EXEMPLE 1 : Matériel et Méthodes
1. Produits
L'adénosine triphosphate (ATP), le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), l'éthéno-NAD, le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD), le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD), l'ATP oxydé (oATP), benzoyl-benzoyl ATP (bzATP) sont vendus par la société SIGMA ; le YOPROYellow (ou YOPRO-1) est vendu par la société Molecular Probes. EXAMPLE 1: Materials and Methods
1. Products
Adenosine triphosphate (ATP), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), etheno-NAD, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (NHD), nicotinamide guanosine dinucleotide (NGD), oxidized ATP (oATP), benzoyl-benzoyl AT (bzATP) are sold by SIGMA; YOPROYellow (or YOPRO-1) is sold by the company Molecular Probes.

La molécule KN62, l'acide pyridoxal-phosphate-6-azophenyl- 2',4'-disulfonic (PPADS) ou la suramine sont vendus par la société SIGMA.  The KN62 molecule, pyridoxal-phosphate-6-azophenyl-2 ', 4'-disulfonic acid (PPADS) or suramin are sold by the company Sigma.

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Le milieu RPMI est vendu par la société INVITROGEN.  The RPMI medium is sold by the company INVITROGEN.

2. Cellules, anticorps et analyse par immunofluorescence :
L'anticorps monoclonal spécifique de l'ART2-2, NIKA102, (IgG2a de rat) a été produit selon la méthode décrite par Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163 : 6014). 2. Cells, antibodies and immunofluorescence analysis:
The monoclonal antibody specific for ART2-2, NIKA102, (rat IgG2a) was produced according to the method described by Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163: 6014).

Les suspensions de cellules individualisées issues de thymus, de rate ou de ganglion lymphatique ont été analysées par cytométrie de flux à l'aide d'un FACScan (Becton Dickinson) selon la méthode décrite par KochNolte F. et al , (J. Immunology, 1999, 163 : 6014).  The suspensions of individualized cells originating from the thymus, spleen or lymph node were analyzed by flow cytometry using a FACScan (Becton Dickinson) according to the method described by KochNolte F. et al, (J. Immunology, 1999, 163: 6014).

Lorsque nécessaire, la déplétion en cellule B a été réalisée par la technique de séparation cellulaire à l'aide d'anticorps anti-souris de chèvre (IgG) immobilisées sur billes magnétiques Dynabead (Dynal, Hambourg, Germany).  When necessary, depletion in B cell was carried out by the cell separation technique using anti-goat mouse antibodies (IgG) immobilized on Dynabead magnetic beads (Dynal, Hamburg, Germany).

L'anticorps monoclonal de souris 1 G4 (IgG2a) spécifique de l'éthéno-adénosine a été produit selon la méthode décrite par Young and Santella (Carcinogenesis, 1988,9 : 589)
Les autres anticorps monoclonaux utilisés dans les essais d'immunofluorescence, anti-CD3e (145-2C11), anti-CD4 (GK1. 5), anti-CD8 (53-6. 72) proviennent de la société CALTAG. The monoclonal antibody of mouse 1 G4 (IgG2a) specific for etheno-adenosine was produced according to the method described by Young and Santella (Carcinogenesis, 1988,9: 589)
The other monoclonal antibodies used in the immunofluorescence tests, anti-CD3e (145-2C11), anti-CD4 (GK1.5), anti-CD8 (53-6.72) come from the company CALTAG.

La biotine, la phycoérythrine (PE) et la fluorescéine isothiocyanate (FITC) proviennent de la société Pharmigen (BectonDickinson/Pharmigen).  Biotin, phycoerythrin (PE) and fluorescein isothiocyanate (FITC) come from the company Pharmigen (BectonDickinson / Pharmigen).

L'anticorps GK1.5 (anti-CD4) a été marqué avec l'indocarbocyanine Cy3TM selon la méthode décrite par Koch-Nolte F. et al., (J.  The antibody GK1.5 (anti-CD4) was labeled with the indocarbocyanine Cy3TM according to the method described by Koch-Nolte F. et al., (J.

Immunology, 1999, 163 : 6014). Immunology, 1999, 163: 6014).

3. Exposition des phosphatidylsérines et formation des pores membranaires :
Les cellules apoptotiques et nécrotiques ont été marquées avec le conjugué annexine-V-FITC ou de l'iodure de propidium, tel que décrit dans Koch-Nolte F. étal., (J. Immunology, 1999,163 : 6014). Après traitement au NAD ou à l'ATP à 37 C, les cellules ont été lavées en milieu RPMI additionnée de 2 mM de CaCl2, puis marquées dans le même milieu pendant 20 minutes sur de la glace avec du conjugué annexine-V-FITC (1 g/ml) et de 3. Exposure of phosphatidylserines and formation of membrane pores:
Apoptotic and necrotic cells were labeled with the annexin-V-FITC conjugate or propidium iodide, as described in Koch-Nolte F. et al., (J. Immunology, 1999, 163: 6014). After treatment with NAD or ATP at 37 ° C., the cells were washed in RPMI medium supplemented with 2 mM CaCl2, then labeled in the same medium for 20 minutes on ice with annexin-V-FITC conjugate ( 1 g / ml) and

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l'iodure de propidium (10 g/ml), ou des IgG anti-souris PE-conjuguées.  propidium iodide (10 g / ml), or PE-conjugated anti-mouse IgG.

L'exposition des phosphatidylsérines à la surface cellulaire, signe précoce de l'apoptose détectable grâce à l'annexine-V, est alors mesurée par cytométrie de flux avec le conjugué annexine-V-FITC.  The exposure of phosphatidylserines to the cell surface, an early sign of apoptosis detectable by annexin-V, is then measured by flow cytometry with the annexin-V-FITC conjugate.

Pour les essais de formation de pores perméables au YOPRO-1, les cellules ont d'abord été incubées en présence des nucléotides dans du milieu RPMI à 37 C. Le YOPRO-1 (concentration finale de 10 g/ml) est ajouté dans les 2 dernières minutes de l'incubation. Les cellules sont placées sur la glace et lavées avec du milieu réfrigéré à la température de la glace puis contrecolorées pendant 20 minutes à 4 C avec du conjugué annexine-V-FITC (1 g/ml), de l'iodure de propidium (10 g/ml) ou des IgG anti-souris PE-conjuguées. La coloration des cellules au bromure d'éthidium (1 g/ml) est réalisée dans du milieu RPMI en présence des nucléotides à 37 C. Les cellules ont ensuite été lavées et contrecolorées au conjugué annexine-V-FITC pendant 20 minutes sur de la glace.  For the pore formation tests permeable to YOPRO-1, the cells were first incubated in the presence of the nucleotides in RPMI medium at 37 C. The YOPRO-1 (final concentration of 10 g / ml) is added to the Last 2 minutes of incubation. The cells are placed on ice and washed with refrigerated medium at ice temperature and then counter-colored for 20 minutes at 4 ° C. with annexin-V-FITC conjugate (1 g / ml), propidium iodide (10 g / ml) or PE-conjugated anti-mouse IgG. Staining of cells with ethidium bromide (1 g / ml) is carried out in RPMI medium in the presence of nucleotides at 37 C. The cells were then washed and back-colored with annexin-V-FITC conjugate for 20 minutes on ice cream.

La formation de pores perméables est ensuite mesurée par la mesure de l'incorporation de YOPRO-1 et du bromure d'éthidium en cytométrie de flux.  The formation of permeable pores is then measured by measuring the incorporation of YOPRO-1 and ethidium bromide in flow cytometry.

4. Protection des cellules contre l'apoptose par préincubation avec des anticorps, de l'éthéno-NAD ou des antagonistes P2X7 :
Les cellules ont été préincubées soit 30 minutes sur de la glace dans du milieu RPMI contenant des anticorps anti-ART2 spécifiques (à 3 g/ml), soit pendant 45 minutes à 37 C en milieu complet (RPMI additionné de 10 % de sérum de veau foetal, de pyruvate, de glutamate)), contenant 10- 50 M d'éthéno-NAD ou encore pendant 2 heures à 37 C en milieu complet contenant des antagonistes P2X7 aux concentrations indiquées. 4. Protection of cells against apoptosis by preincubation with antibodies, etheno-NAD or P2X7 antagonists:
The cells were preincubated either for 30 minutes on ice in RPMI medium containing specific anti-ART2 antibodies (at 3 g / ml), or for 45 minutes at 37 ° C. in complete medium (RPMI supplemented with 10% serum fetal calf, pyruvate, glutamate)), containing 10-50 M of etheno-NAD or for 2 hours at 37 C in complete medium containing P2X7 antagonists at the concentrations indicated.

Les cellules ont ensuite été incubées en milieu RPMI contenant du NAD, de l'ATP pendant 30 minutes à 37 C et soumises à une coloration avec de l'annexine-V, de l'iodure de propidium, du YOPRO-1 ou des anticorps fluorescents selon la méthode décrite précédemment.  The cells were then incubated in RPMI medium containing NAD, ATP for 30 minutes at 37 ° C. and subjected to staining with annexin-V, propidium iodide, YOPRO-1 or antibodies. fluorescent according to the method described above.

EXEMPLE 2 : des cellules T est induite au travers de l'ADP-ribosylation des protéines cellulaires de surface catalysée par les ART2 :
L'incubation des cellules T de ganglions lymphatiques en EXAMPLE 2 T cells is induced through ADP-ribosylation of cellular surface proteins catalyzed by ART2:
Incubation of T cells from lymph nodes in

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présence de NAD exogène (10 M) induit rapidement l'exposition de phosphatidylsérines, un signe précoce de l'apoptose (Figure 1A, encart central). A l'inverse, l'ADP-ribose, qui peut être généré à partir du NAD par les NAD-glycohydrolases, n'induit pas l'apoptose, même à des concentrations 100 fois supérieures (1 mM) (Figure 1A, encart droit). L'exposition de phosphatidylsérines induite par le NAD peut être prévenue par pré-incubation des cellules avec un mélange d'anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine de surface ADP-ribosyltransferase ART2. 2 (Figure 1 B, encart droit).  presence of exogenous NAD (10 M) rapidly induces exposure of phosphatidylserines, an early sign of apoptosis (Figure 1A, central insert). Conversely, ADP-ribose, which can be generated from NAD by NAD-glycohydrolases, does not induce apoptosis, even at concentrations 100 times higher (1 mM) (Figure 1A, right insert ). NAD-induced phosphatidylserine exposure can be prevented by pre-incubating cells with a mixture of monoclonal antibodies against the surface protein ADP-ribosyltransferase ART2. 2 (Figure 1 B, right insert).

Cela indique que l'ADP-ribosylation NAD-dépendante d'autres protéines de la surface cellulaire, catalysée par l'ART2.2, déclenche l'apoptose des cellules T.  This indicates that NAD-dependent ADP-ribosylation of other cell surface proteins, catalyzed by ART2.2, triggers apoptosis of T cells.

EXEMPLE 3 : L'éthéno-ADP-ribosylation des protéines de surface prévient l'apoptose NAD induite :
L'analogue du NAD, l'éthéno-NAD est un substrat efficace des ecto-ART2. 2 et l'éthéno-ADP-ribosylation des protéines de surface peut être facilement suivie par cytométrie de flux avec l'anticorps anti-éthéno-adénosine 1 G4 (Figure 2A, encart central). L'incubation des cellules T avec de l'éthénoNAD n'induit pas l'apoptose (Figure 2B, encart central), malgré une incorporation efficace d'éthéno-ADP-ribose dans les protéines de la surface cellulaire. EXAMPLE 3 The etheno-ADP-ribosylation of the surface proteins prevents the induced NAD apoptosis:
The NAD analog, etheno-NAD is an effective substrate for ecto-ART2. 2 and the etheno-ADP-ribosylation of the surface proteins can be easily followed by flow cytometry with the anti-etheno-adenosine 1 G4 antibody (FIG. 2A, central insert). Incubation of T cells with ethenoNAD does not induce apoptosis (Figure 2B, central insert), despite efficient incorporation of etheno-ADP-ribose into the proteins of the cell surface.

Cela suggère que l'ADP-ribosylation, mais non l'éthéno-ADPribosylation d'un même effecteur secondaire, peut déclencher l'apoptose.  This suggests that ADP-ribosylation, but not etheno-ADPribosylation of the same secondary effector, can trigger apoptosis.

Cela est démontré par un traitement préventif des cellules avec de l'éthéno-NAD, qui prévient l'induction de l'apoptose par un traitement subséquent des cellules avec du NAD (Figure 2C). La préincubation avec de l'éthéno-NAD protège les cellules de l'exposition des phosphatidylsérines induite par le NAD et de l'apoptose.  This is demonstrated by preventive treatment of cells with etheno-NAD, which prevents induction of apoptosis by subsequent treatment of cells with NAD (Figure 2C). Preincubation with etheno-NAD protects cells from NAD-induced exposure to phosphatidylserines and from apoptosis.

EXEMPLE 4 : nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD) et le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD) préviennent l'apoptose NAD induite :
Le nicotinamide hypoxanthine dinucléoide (NHD) et le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD) sont des analogues structuraux du NAD. EXAMPLE 4 nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (NHD) and nicotinamide guanosine dinucleotide (NGD) prevent induced NAD apoptosis:
Nicotinamide hypoxanthine dinucleoide (NHD) and nicotinamide guanosine dinucleotide (NGD) are structural analogs of NAD.

L'incubation des cellules T avec des concentrations  Incubation of T cells with concentrations

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croissantes de NHD (Figure 3A) ou de NGD (Figure 3B) pendant 30 minutes à 37 C n'induit pas l'apoptose. Cependant, la préincubation des mêmes cellules avec des concentrations croissantes de NHD (Figure 3A) ou de NGD (Figure 3B) pendant 15 minutes, suivi d'une incubation avec 30 M de NAD pendant 30 minutes, prévient l'exposition des phosphatidylsérines induite par le NAD et l'apoptose.  increasing NHD (Figure 3A) or NGD (Figure 3B) for 30 minutes at 37 C does not induce apoptosis. However, preincubation of the same cells with increasing concentrations of NHD (Figure 3A) or NGD (Figure 3B) for 15 minutes, followed by incubation with 30 M NAD for 30 minutes, prevents exposure of phosphatidylserines induced by NAD and apoptosis.

Ces observations démontrent, comme dans le cas de l'éthéno-NAD, que le NGD et le NHD sont de substrats des ART. Comme l'éthéno-NAD, les NHD et le NGD ne sont pas des analogues agonistes du NAD mais des antagonistes qui inhibent son activité.  These observations demonstrate, as in the case of etheno-NAD, that NGD and NHD are substrates of ART. Like etheno-NAD, NHD and NGD are not agonist analogues of NAD but antagonists which inhibit its activity.

Elles démontrent également qu'une modification du groupement adénosine du NAD est compatible avec le maintien de la propriété de substrat des ART mais prévient la capacité d'induire un signal apoptotique.  They also demonstrate that a modification of the adenosine group of NAD is compatible with the maintenance of the substrate property of ART but prevents the ability to induce an apoptotic signal.

EXEMPLE 5 : traitement des cellules T déclenche la formation de pores membranaires perméables au YOPRO-1, colorant de l'ADN :
Le NAD et l'éthéno-NAD ne différent que par le groupement adénosine. La découverte que l'ADP-ribosylation, mais pas l'éthéno-ADPribosylation, induit l'apoptose indique qu'un effecteur secondaire essentiel de l'apoptose NAD-induite doit être sensible à une différence dans le groupement adénosine. EXAMPLE 5 Treatment of T cells triggers the formation of membrane pores permeable to YOPRO-1, DNA dye:
NAD and etheno-NAD differ only in the adenosine group. The discovery that ADP-ribosylation, but not etheno-ADPribosylation, induces apoptosis indicates that an essential secondary effector of NAD-induced apoptosis must be sensitive to a difference in the adenosine group.

Le récepteur P2X7 est décrit comme impliqué dans la formation de pores membranaires, induite par l'ATP, qui peut être facilement suivie par la capture de colorant de l'ADN tels que le bromure d'éthidium ou le YOPRO-1.  The P2X7 receptor is described as involved in the formation of membrane pores, induced by ATP, which can be easily followed by the capture of DNA dye such as ethidium bromide or YOPRO-1.

Les résultats présentés à la Figure 4A montrent que l'incubation de cellules de ganglions lymphatiques avec soit de l'ATP exogène, soit du NAD, résulte en une coloration des cellules par le bromure d'éthidium ou le YOPRO-1.  The results presented in Figure 4A show that the incubation of lymph node cells with either exogenous ATP or NAD results in staining of the cells with ethidium bromide or YOPRO-1.

La capture du colorant de l'ADN suit rapidement l'exposition des phosphatidylsérines et est complète après 30 à 45 minutes d'exposition au NAD (Figure 4B).  The capture of the DNA dye rapidly follows the exposure of phosphatidylserines and is complete after 30 to 45 minutes of exposure to NAD (Figure 4B).

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EXEMPLE 6 : prétraitement des cellules T prévient l'apoptose NAD-induite :
Les résultats présentés à la Figure 5A, obtenus par cytométrie de flux montrent qu'une préincubation des cellules avec de l'o-ATP, qui se fixe irréversiblement au récepteur P2X7 et bloque sa capacité à induire la formation de pores membranaires, bloque l'apoptose NAD-induite des cellules T. De manière similaire, d'autres antagonistes des récepteurs P2X7 comme le KN62, le PPADS ou la suramine bloquent l'induction de l'apoptose NADinduite des cellules T (Figure 5B). EXAMPLE 6 Pretreatment of T cells prevents NAD-induced apoptosis:
The results presented in FIG. 5A, obtained by flow cytometry show that preincubation of the cells with o-ATP, which irreversibly binds to the P2X7 receptor and blocks its capacity to induce the formation of membrane pores, blocks the NAD-induced T cell apoptosis Similarly, other P2X7 receptor antagonists such as KN62, PPADS or suramin block the induction of NAD-induced apoptosis of T cells (Figure 5B).

Ces résultats suggèrent que l'apoptose induite par le NAD passe par l'activation du récepteur P2X7.  These results suggest that NAD-induced apoptosis requires activation of the P2X7 receptor.

EXEMPLE 7 : induite par le NAD, mais pas celle induite par l'ATP, requiert la présence d'une ART2 :
Les résultats présentés dans la Figure 6 montrent que des cellules T déficientes en ART2~(W Ohlrogge, et al., T cells of ART2 knockout mice can not ADP-ribosylate cell surface proteins and are less sensitive to NAD-mediated supression of proliferation, Immunobiol., 2000,203, 181) (Figure 6B), ayant perdu la capacité d'ADP-ribosylation des protéines cellulaires de surface, sont aussi sensibles à l'apoptose ATP-induite que des cellules T de souris normales non déficientes (Figure 6A) ayant conservé la capacité d'ADP-ribosylation des protéines cellulaires de surface. EXAMPLE 7: induced by NAD, but not that induced by ATP, requires the presence of an ART2:
The results presented in Figure 6 show that T cells deficient in ART2 ~ (W Ohlrogge, et al., T cells of ART2 knockout mice can not ADP-ribosylate cell surface proteins and are less sensitive to NAD-mediated supression of proliferation, Immunobiol., 2000,203, 181) (Figure 6B), having lost the ability of ADP-ribosylation of cell surface proteins, are as sensitive to ATP-induced apoptosis as normal non-deficient mouse T cells (Figure 6A) having retained the capacity of ADP-ribosylation of cellular surface proteins.

Au contraire, les cellules T ART2-déficientes sont totalement résistantes à l'apoptose NAD induites.  In contrast, ART2-deficient T cells are completely resistant to induced NAD apoptosis.

Cela confirme l'existence d'un effet du NAD sur le récepteur P2X7 via une ADP-ribosylation directe du récepteur ou via une ADPribosylation de protéines de la surface cellulaire agissant sur le récepteur.  This confirms the existence of an effect of NAD on the P2X7 receptor via direct ADP-ribosylation of the receptor or via ADPribosylation of cell surface proteins acting on the receptor.

Le fait que le NAD n'affecte pas directement le récepteur P2X7 est confirmé par le fait qu'un pré-traitement des cellules avec de l'éthéno-NAD (eNAD) (Figure 7B) bloque l'apoptose NAD-induite mais pas l'apoptose ATPinduite (bzATP). Cet effet est à comparer à celui obtenu sans prétraitement à l'éthéno-NAD (Figure 7A).  The fact that NAD does not directly affect the P2X7 receptor is confirmed by the fact that pre-treatment of the cells with etheno-NAD (eNAD) (Figure 7B) blocks NAD-induced apoptosis but does not ATP-induced apoptosis (bzATP). This effect is to be compared to that obtained without pretreatment with etheno-NAD (Figure 7A).

EXEMPLE 8 : Effet-dose de l'ATP et du NAD sur l'apoptose induite :
Les résultats présentés dans les Figures 6 et 7 montrent des EXAMPLE 8 Dose effect of ATP and NAD on induced apoptosis:
The results presented in Figures 6 and 7 show

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différences dans la coloration à l'annexine-V induite par le NAD ou par l'ATP.  differences in annexin-V staining induced by NAD or ATP.

La réponse à l'ATP montre un effet de seuil : en dessous de
50 M, l'ATP n'induit pas l'apoptose alors que celle-ci est induite par des doses d'ATP de 100 M et plus. Au contraire, le NAD induit immédiatement la coloration des cellules à l'annexine-V à une concentration aussi basse que 1 M. The response to ATP shows a threshold effect: below
50 M, ATP does not induce apoptosis whereas this is induced by doses of ATP of 100 M and more. On the contrary, NAD immediately induces cell staining with annexin-V at a concentration as low as 1 M.

EXEMPLE 9 : Seules les cellules transfectées par l'ART2 et le récepteur P2X7 sont sensibles à l'apoptose induite par le NAD :
1. Clonage du P2X7 et de L'ART2.2 :
Les ADNc de lymphocytes T purifiés provenant de la souris
BALB/c ont été préparés puis amplifiés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant des amorces nucléotidiques spécifiques du gène codant pour le P2X7 de souris décrites par ailleurs (Chessell, I. P. et al., 1998. EXAMPLE 9 Only the cells transfected with ART2 and the P2X7 receptor are sensitive to apoptosis induced by NAD:
1. Cloning of P2X7 and ART2.2:
Purified T cell cDNAs from mice
BALB / c were prepared and then amplified by polymerase chain reaction (PCR) using nucleotide primers specific for the gene coding for mouse P2X7 described elsewhere (Chessell, IP et al., 1998.

Cloning and functional characterisation of the mouse P2X7 receptor., FEBS Lett., 439 : 26). L'enzyme utilisée dans cette réaction de PCR est une polymérase de fidélité supérieure (High fidelity Platinium Taq polymerase, Invitrogen). Le produit de la réaction de PCR a ensuite été cloné dans le vecteur commercial pCRBlunt-Topo (Invitrogen) en utilisant les recommandations du fabricant. La séquence nucléotidique du gène ainsi inséré dans ce vecteur a ensuite été vérifiée par séquençage (Génome Express, Montreuil, France). Le gène a ensuite été sous-cloné dans le vecteur d'expression pCDNA6/V5-HisB (Invitrogen) en utilisant les techniques standards de clonage. Cloning and functional characterization of the mouse P2X7 receptor., FEBS Lett., 439: 26). The enzyme used in this PCR reaction is a high fidelity platinium Taq polymerase (Invitrogen) polymerase. The PCR reaction product was then cloned into the commercial vector pCRBlunt-Topo (Invitrogen) using the manufacturer's recommendations. The nucleotide sequence of the gene thus inserted into this vector was then verified by sequencing (Génome Express, Montreuil, France). The gene was then subcloned into the expression vector pCDNA6 / V5-HisB (Invitrogen) using standard cloning techniques.

Le clonage du gène codant pour l'ART2.2 a été décrit en détail dans la publication de Koch-Nolte, F., et al., 1999. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADPribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J. Immunol., 163 : 6014)
2. Transfection et expression dans les cellules HEK293 :
Les transfections ont été réalisées en combinant 1 g de l'un ou l'autre des vecteurs codant pour le gène d'intérêt avec le réactif de transfection FuGENE 6 (ROCHE) en respectant les recommandations du fournisseur. Les cellules utilisées dans ces expériences sont des cellules HEK293 qui proviennent de l'American Type Cell collection (ATCC nb : CRL- The cloning of the gene coding for ART2.2 was described in detail in the publication by Koch-Nolte, F., et al., 1999. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADPribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J. Immunol., 163: 6014)
2. Transfection and expression in HEK293 cells:
The transfections were carried out by combining 1 g of one or other of the vectors coding for the gene of interest with the transfection reagent FuGENE 6 (ROCHE) in accordance with the recommendations of the supplier. The cells used in these experiments are HEK293 cells which come from the American Type Cell collection (ATCC nb: CRL-

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1573). Ces cellules ont été transfectées puis sélectionnées par la généticine 600 g/ml ou la blasticidine 6 g/ml (Invitrogen) pendant une semaine avant d'être analysées pour leurs sensibilités au NAD et à l'ATP. Les cellules HEK293 transfectées par les deux gènes ont d'abord été transfectées par le gène codant par le P2X7, sélectionnées pendant une semaine par la blasticidine 6 g/ml avant d'être transfectées par le gène codant pour l'ART2.2 puis sélectionnées par la généticine 600 g/ml et enfin analysées pour leurs sensibilités au NAD et à l'ATP. 1573). These cells were transfected and then selected with geneticin 600 g / ml or blasticidin 6 g / ml (Invitrogen) for one week before being analyzed for their sensitivities to NAD and ATP. The HEK293 cells transfected with the two genes were first transfected with the gene coding for P2X7, selected for one week by blasticidin 6 g / ml before being transfected with the gene coding for ART2.2 and then selected by geneticin 600 g / ml and finally analyzed for their sensitivities to NAD and ATP.

3. Analyse de la sensibilité à l'apoptose induite par le NAD ou l'ATP
Les cellules HEK293 transfectées ont été préalablement décollées des flasques de culture par traitement à la trypsine, puis incubées à 37 C pendant 1 heure dans du milieu de culture complet (DMEM/F12, Invitrogen). Ces cellules ont été ensuite traitées par de l'ATP ou du NAD à la concentration indiquée pendant 30 min à 37 C avant d'être lavées puis marquées par l'annexine-V-FITC (BD Biosciences) et l'iodure de propidium (BD Biosciences) comme décrit dans les exemples précédents. Les cellules ainsi traitées ont ensuite été analysées en cytomètrie de flux. 3. Analysis of sensitivity to apoptosis induced by NAD or ATP
The transfected HEK293 cells were previously detached from the culture flasks by treatment with trypsin, then incubated at 37 ° C. for 1 hour in complete culture medium (DMEM / F12, Invitrogen). These cells were then treated with ATP or NAD at the concentration indicated for 30 min at 37 ° C. before being washed and then labeled with annexin-V-FITC (BD Biosciences) and propidium iodide ( BD Biosciences) as described in the previous examples. The cells thus treated were then analyzed by flow cytometry.

Les résultats présentés sur la Figure 8A, montrent que les cellules HEK293 non transfectées sont résistantes à l'apoptose induite par le NAD ou l'ATP, même à de fortes concentrations. La Figure 8B montre que les cellules HEK293 transfectées par le récepteur P2X7 sont sensibles à l'apoptose induite par l'ATP mais pas à celle induite par le NAD. La Figure 8C révèle que seule les cellules double transfectées par les gènes codant pour l'ART2 et le récepteur P2X7 sont sensibles à l'apoptose induite par le NAD.  The results presented in FIG. 8A show that the non-transfected HEK293 cells are resistant to apoptosis induced by NAD or ATP, even at high concentrations. Figure 8B shows that HEK293 cells transfected with the P2X7 receptor are sensitive to apoptosis induced by ATP but not to that induced by NAD. FIG. 8C reveals that only the double cells transfected with the genes coding for ART2 and the P2X7 receptor are sensitive to apoptosis induced by NAD.

Les résultats présentés dans les exemples précédents démontrent qu'il existe une voie de modulation de l'activité des récepteurs purinergiques, très puissante, via l'ADP-ribosylation induite par le NAD, soit directement sur les récepteurs soit au travers de l'ADP-ribosylation de protéines membranaires qui agiraient alors sur les récepteurs et leur activité. The results presented in the previous examples demonstrate that there is a very potent pathway for modulating the activity of purinergic receptors, via NAD-induced ADP-ribosylation, either directly on the receptors or through ADP. -ribosylation of membrane proteins which would then act on receptors and their activity.

Claims (9)

1. Utilisation du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) ou d'au moins un de ses analogues, substrat des mono-ADP-ribosyl transférases (ART) dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique.  1. Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) or at least one of its analogues, substrate of mono-ADP-ribosyl transferases (ART) in the preparation of a medicament intended to modulate the activity of at least one receptor purinergic. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité d'au moins un récepteur purinergique de type P2X ou P2Y.  2. Use according to claim 1, in the preparation of a medicament intended to modulate the activity of at least one purinergic receptor of the P2X or P2Y type. 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans la préparation d'un médicament destiné à activer ou stimuler ou diminuer ou inhiber l'activité d'au moins un récepteur purinergique.  3. Use according to any one of claims 1 or 2, in the preparation of a medicament intended to activate or stimulate or decrease or inhibit the activity of at least one purinergic receptor. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à une dérégulation de l'activité d'au moins un récepteur purinergique.  4. Use according to any one of claims 1 to 3, in the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies linked to a deregulation of the activity of at least one purinergic receptor. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies des systèmes nerveux central et périphérique, comme les troubles neurologiques ou les pathologies neurodégénératives, particulièrement en intervenant sur les processus de neuroviabilité et de neurorégénération, au traitement des pathologies du système cardiovasculaire, particulièrement les thromboses comme agent antithrombique, au traitement des pathologies du système auditif, au traitement des pathologies du système oculaire particulièrement celles liées à la régulation des flux sanguins rétiniens et de la pression intraoculaire ou encore celles liées à la sécheresse oculaire par une augmentation des sécrétions oculaires ou encore le traitement des décollements de la rétine, au traitement de la douleur par exemple comme analgésiques, au traitement des pathologies inflammatoires systémiques comme l'arthrite rhumatoïde, le lupus ou encore la polyarthrite, au traitement des pathologies du système gastrointestinal comme les pathologies inflammatoires du colon ou les pathologies nécessitant une modulation des sécrétions dans le colon ou les canaux biliaires, au traitement des pathologies autoimmunes comme le diabète, par exemple par la stimulation de la sécrétion de l'insuline par le pancréas, au traitement du cancer et des carcinomes cellulaires basaux, au traitement de l'épilepsie, au traitement de  5. Use according to any one of claims 1 to 4, in the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies of the central and peripheral nervous systems, such as neurological disorders or neurodegenerative pathologies, particularly by intervening in the neuroviability processes and neuroregeneration, to the treatment of pathologies of the cardiovascular system, particularly thromboses as an antithrombic agent, to the treatment of pathologies of the auditory system, to the treatment of pathologies of the ocular system particularly those related to the regulation of retinal blood flows and intraocular pressure or still those related to dry eyes by an increase in ocular secretions or the treatment of detachments of the retina, to the treatment of pain for example as analgesics, to the treatment of systemic inflammatory pathologies like rheumatoid arthritis e, lupus or polyarthritis, for the treatment of pathologies of the gastrointestinal system such as inflammatory pathologies of the colon or pathologies requiring modulation of secretions in the colon or the bile ducts, to the treatment of autoimmune pathologies such as diabetes, for example stimulation of insulin secretion by the pancreas, treatment of cancer and basal cell carcinoma, treatment of epilepsy, treatment of <Desc/Clms Page number 18><Desc / Clms Page number 18> l'incontinence urinaire, du psoriasis, de la sclérodermie, de l'infertilité masculine, de l'ostéoporose, de la périodontite ou encore de l'ostéopénie, au traitement des pathologies infectieuses.  urinary incontinence, psoriasis, scleroderma, male infertility, osteoporosis, periodontitis or even osteopenia, for the treatment of infectious pathologies. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'analogue du NAD, substrat d'au moins une des ART, est choisi parmi des molécules sur lesquelles ont été introduites des modifications du groupement nicotinamide, des modifications de la liaison 5'-5' pyrophosphate, des modifications du groupement ribose de la partie adénosine diphosphate (ADP) du NAD, des modifications du groupement adénine ou une combinaison de ces différentes modifications.  6. Use according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the analog of NAD, substrate of at least one of the ARTs, is chosen from molecules onto which modifications of the nicotinamide group have been introduced, modifications of the 5'-5 'pyrophosphate bond, modifications of the ribose group of the adenosine diphosphate (ADP) part of the NAD, modifications of the adenine group or a combination of these different modifications. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'analogue du NAD, substrat d'au moins une des ART, est choisi parmi l'éthéno-NAD, le nicotinamide hypoxanthine dinucléotide (NHD) ou le nicotinamide guanosine dinucléotide (NGD).  7. Use according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the analog of NAD, substrate of at least one of the ARTs, is chosen from etheno-NAD, nicotinamide hypoxanthine dinucleotide (NHD) or nicotinamide guanosine dinucleotide (NGD). 8. Procédé d'évaluation de l'effet modulateur d'une monoADP-ribosyl transférase présente à la surface d'une cellule, sur un récepteur purinergique présent à la surface de la même cellule, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ladite cellule avec un composé connu comme substrat de ladite mono-ADP-ribosyl transférase, et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité dudit récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins, placées dans les mêmes conditions expérimentales.  8. Method for evaluating the modulating effect of a monoADP-ribosyl transferase present on the surface of a cell, on a purinergic receptor present on the surface of the same cell, characterized in that in a first step, in contact with said cell with a compound known as a substrate for said mono-ADP-ribosyl transferase, and in a second step, the activity level of said purinergic receptor in said cells is evaluated by means of the activity level of the same receptor in control cells, placed under the same experimental conditions. 9. Procédé d'évaluation de l'effet d'un composé, substrat d'une mono-ADP-ribosyl transférase (ART), sur les récepteurs purinergiques, caractérisé en ce que dans une première étape on met en contact ledit composé avec des cellules porteuses d'au moins ladite mono-ADP-ribosyl transférase (ART) et d'au moins un récepteur purinergique et que dans une deuxième étape on évalue par tout moyen approprié le niveau d'activité du récepteur purinergique dans lesdites cellules par rapport au niveau d'activité du même récepteur dans des cellules témoins placées dans les mêmes conditions expérimentales. 9. Method for evaluating the effect of a compound, substrate of a mono-ADP-ribosyl transferase (ART), on purinergic receptors, characterized in that in a first step, said compound is brought into contact with cells carrying at least said mono-ADP-ribosyl transferase (ART) and at least one purinergic receptor and that, in a second step, the level of activity of the purinergic receptor in said cells is evaluated by means of the level of activity of the same receptor in control cells placed under the same experimental conditions.