FR2834991A1

FR2834991A1 - New antibodies that bind to human insulin-like growth factor receptor, useful for treatment, prevention and diagnosis of cancers

Info

Publication number: FR2834991A1
Application number: FR0205753A
Authority: FR
Inventors: Liliane Goetsch; Olivier Leger; Nathalie Corvaia
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2002-05-07
Publication date: 2003-07-25
Anticipated expiration: 2022-05-07
Also published as: FR2834991B1

Abstract

An isolated antibody (Ab), and its functional fragments, that bind to human insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) and optionally: (i) inhibit natural binding of insulin-like growth factors (IGF)-1 and/or -2; and/or (ii) inhibit specifically tyrosine kinase activity of IGF-1R. An isolated antibody (Ab), and its functional fragments, that bind to human insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) and optionally inhibit natural binding of insulin-like growth factors (IGF)-1 and/or -2 and/or inhibit specifically tyrosine kinase activity of IGF-1R, is new. Ab comprises: (a) a light chain containing at least one complementarity-determining region (CDR) of one of 3 fully defined sequences comprising 16, 7 or 9 amino acids as given in the specification; or (b) a heavy chain containing at least one of the CDRs of one of 3 fully defined sequences comprising 6, 16 or 8 amino acids as given in the specification or sequences with 80% identity after optimal alignment. Independent claims are also included for the following: (1) murine hybridomas that secrete Ab; (2) an isolated nucleic acid (I) that: (a) is RNA or DNA and encodes Ab or its fragments; (b) is the complement of (a); or (c) has at least 18 nucleotides that can hybridize under stringent conditions with any of six sequences fully defined in the specification that encode the specified CDR, or with sequences having 80% identity after optimal alignment; (3) a vector containing (I); (4) a host cell containing the vector of (3); (5) a non-human transgenic animal containing at least one cell transfected with the vector of (3); (6) producing Ab or its fragments; (7) in vitro diagnosis of diseases induced by over- or under-expression of IGF-1R and or EGFR (epidermal growth factor receptor) by reaction with optionally labeled Ab; and (8) kit for performing method (7).

Description

La présente invention est relative à de nouveaux anticorps capables de se fixer spécifiquement au récepteur humain du facteur de croissance I apparenté à l'insuline IGF-IR, notamment monoclonaux d'origine murine, chimériques et humanisés, ainsi que les séquences d'acide aminé et nucléiques codant pour ces anticorps. L'invention comprend également l'utilisation de ces anticorps à titre de médicament pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de cancers ainsi que dans des procédés ou nécessaire de diagnostic de maladies liées à la surexpression du récepteur IGF-IR. L'invention comprend enfin des compositions comprenant de tels anticorps en association avec des agents anticancéreux ou conjugués avec des toxines et leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement de certains cancers. The present invention relates to novel antibodies capable of binding specifically to the human IGF-IR insulin-like growth factor I receptor, especially murine monoclonal, chimeric and humanized, as well as amino acid sequences. and nucleic acids encoding these antibodies. The invention also includes the use of these antibodies as a medicament for the prophylactic and / or therapeutic treatment of cancers as well as in methods or diagnostic kits for diseases related to overexpression of the IGF-IR receptor. The invention further comprises compositions comprising such antibodies in combination with anticancer agents or conjugated with toxins and their use for the prevention and / or treatment of certain cancers.

Le récepteur du facteur de croissance 1 apparenté à l'insuline dénommé IGF-IR ("IGF-IR"pour"Insuline-like Growth Factor-1 Receptor") est un récepteur à activité tyrosine kinase comportant 70 % d'homologie avec le récepteur à l'insuline IR ("IR" pour"Insuline Receptor"). L'IGF-IR est une glycoprotéine de poids moléculaire d'environ 350 000. C'est un récepteur hétérotétramérique dont chaque moitié-reliée par des ponts disulfures-est composée d'une sous unité a extracellulaire et d'une sous unité ss transmembranaire (voir figure 1). L'IGF-IR fixe l'IGF I et l'IGF II avec une très forte affinité (Kd &num; 1 nM) mais est également capable de fixer l'insuline avec une affinité 100 à 1 000 fois moindre. Inversement, l'IR fixe l'insuline avec une très forte affinité alors que les IGFs ne se fixent au récepteur à l'insuline qu'avec une affinité 100 fois inférieure. Le domaine tyrosine kinase de l'IGF-IR et de l'IR présentent une très forte homologie de séquence alors que les zones de plus faible homologie concernent respectivement la région riche en cystéine située sur la sous unité a et la partie Cterminale de la sous unité ss. Les différences de séquences observées dans la sous unité a sont situées dans la zone de fixation des ligands et sont donc à l'origine des affinités relatives de l'IGF-IR et de l'IR pour les IGFs et l'insuline respectivement. Les différences dans la partie C-terminale de la sous unité ss résultent en une divergence dans les voies de signalisation des deux récepteurs ; l'IGF-IR médiant des effets mitogéniques, de différenciation et d'anti-apoptose, alors que l'activation de l'IR entraîne principalement des effets au niveau des voies métaboliques (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332 : F105-126, 1997 ; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253 : 1-6,1999). The insulin-like growth factor receptor 1, referred to as IGF-IR ("IGF-IR" for "Insulin-like Growth Factor-1 Receptor"), is a tyrosine kinase receptor with 70% homology to the receptor IR insulin ("IR" for "Insulin Receptor"). IGF-IR is a glycoprotein with a molecular weight of approximately 350 000. It is a heterotetrameric receptor, each half of which is linked by disulfide bridges. It is composed of an extracellular subunit and a transmembrane subunit. (see Figure 1). IGF-IR binds IGF I and IGF II with very high affinity (Kd + 1 nM) but is also capable of binding insulin with a 100 to 1000-fold lower affinity. Conversely, IR binds insulin with a very high affinity while IGFs bind to the insulin receptor only with a 100-fold lower affinity. The tyrosine kinase domain of IGF-IR and IR show very strong sequence homology, whereas the areas of lower homology concern respectively the cysteine-rich region located on the subunit a and the Cterminal part of the sub-unit. unit ss. The sequence differences observed in the α-subunit are located in the ligand binding zone and are therefore responsible for the relative affinities of IGF-IR and IR for IGFs and insulin respectively. The differences in the C-terminal part of the ss subunit result in a divergence in the signaling pathways of the two receptors; IGF-IR mediates mitogenic effects, differentiation and anti-apoptosis, whereas activation of IR results mainly in metabolic pathway effects (Baserga et al., Biochim Biophys Acta, 1332 F105-126, 1997, Baserga R., Exp Cell Res, 253: 1-6, 1999).

Les protéines tyrosine-kinases cytoplasmiques sont activées par la fixation du ligand au domaine extracellulaire du récepteur. L'activation des kinases entraîne à son tour la stimulation de différents substrats intracellulaires, incluant l'IRS-l, l'IRS-2, Shc et Grb 10 (Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125 : 166-173,1999). Les deux substrats majeurs de l'IGF-IR sont IRS et Shc qui médient, par l'activation de nombreux effecteurs en aval, la plupart des effets de croissance et de différenciation liés à la fixation des IGFs à ce récepteur (figure 2). La disponibilité de substrats peut par conséquent dicter l'effet biologique final lié à l'activation de l'IGF-IR. Lorsque l'IRS-l prédomine, les cellules tendent à proliférer et à se transformer. Lorsque Shc domine, les cellules tendent à se différencier (Valentinis B. et al., J. Biol. Chem., 274 : 12423-12430, 1999). Il semble que la voie principalement en cause pour les effets de protection contre l'apoptose soit la voie des phosphatidylinositol 3-kinases (PI 3-kinases) (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31 : 80-89,1999 ; Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125 : 166-173,1999). Cytoplasmic tyrosine kinase proteins are activated by binding of the ligand to the extracellular domain of the receptor. Kinase activation in turn stimulates various intracellular substrates, including IRS-1, IRS-2, Shc, and Grb (Peruzzi, F. et al., J. Cancer Res., Clin Oncol. 125: 166-173, 1999). The two major IGF-IR substrates are IRS and Shc mediating, by the activation of many downstream effectors, most of the growth and differentiation effects related to the binding of IGFs to this receptor (Figure 2). The availability of substrates may therefore dictate the ultimate biological effect related to activation of IGF-IR. When IRS-1 predominates, cells tend to proliferate and transform. When Shc dominates, cells tend to differentiate (Valentinis B. et al., J. Biol Chem., 274: 12423-12430, 1999). It appears that the predominant pathway for protection effects against apoptosis is the phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) pathway (Prisco M. et al., Horm Metab Res., 31:80). 89, 1999, Peruzzi, F. et al., J. Cancer Res., Clin Oncol., 125: 166-173, 1999).

Le rôle du système IGF dans la cancérogenèse est devenu le sujet de recherches intensives dans les dix dernières années. Cet intérêt a suivi la découverte du fait qu'en plus de ses propriétés mitogéniques et anti-apoptotiques, l'IGF-IR semble être requis pour l'établissement et la maintenance d'un phénotype transformé. En fait, il a été bien établi qu'une surexpression ou une activation constitutive de l'IGF-IR conduit, dans une grande variété de cellules, à une croissance des cellules indépendante du support dans des milieux dépourvus de sérum de veau foetal, et à la formation de tumeurs chez la souris nude. Ceci n'est pas en soi une propriété unique puisqu'une grande variété de produits de gènes surexprimés peuvent transformer des cellules, incluant un bon nombre de récepteurs de facteurs de croissance. Mais la découverte cruciale qui a clairement mis en évidence le rôle majeur joué par l'IGF-IR dans la transformation a été la démonstration que les cellules R-, dans lesquelles le gène codant pour l'IGF-IR a été inactivé, sont totalement réfractaires à la transformation par différents agents qui sont habituellement capables de transformer les cellules comme la protéine E5 du papilloma virus bovin, une surexpression de l'EGFR ou du PDGFR, l'antigène T de SV40, ras activé ou la combinaison de ces deux derniers facteurs (Sell C. et al., Proc. Natl. Acad. The role of the IGF system in carcinogenesis has become the subject of intensive research in the last ten years. This interest followed the discovery that in addition to its mitogenic and anti-apoptotic properties, IGF-IR appears to be required for the establishment and maintenance of a transformed phenotype. In fact, it has been well established that overexpression or constitutive activation of IGF-IR leads in a wide variety of cells to cell-independent growth in media lacking fetal calf serum, and tumor formation in nude mice. This is not in itself a unique property since a wide variety of overexpressed gene products can transform cells, including a number of growth factor receptors. But the crucial discovery that has clearly highlighted the major role played by IGF-IR in the transformation has been the demonstration that R- cells, in which the gene encoding IGF-IR has been inactivated, are totally refractory to transformation by different agents that are usually capable of transforming cells such as E5 protein of bovine papilloma virus, overexpression of EGFR or PDGFR, SV40 T-antigen, activated ras or the combination of these two factors (Sell C. et al., Proc Natl Acad.

Sci., USA, 90 : 11217-11221,1993 ; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14 : 3604-3612,1994 ; Sci., USA, 90: 11217-11221, 1993; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 3604-3612, 1994;

Morrione A. J., Virol., 69 : 5300-5303,1995 ; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14 : 4588-4595, 1994 ; DeAngelis T et al., J. Cell. Physio, 164 : 214-221,1995). Morrione A.J., Virol., 69: 5300-5303, 1995; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 4588-4595, 1994; DeAngelis T et al., J. Cell. Physio, 164: 214-221, 1995).

L'IGF-IR est exprimé dans une grande variété de tumeurs et de lignées tumorales et les IGFs amplifient la croissance tumorale via leur fixation à l'IGF-IR. D'autres arguments en faveur du rôle de IGF-IR dans la cancérogenèse proviennent d'études utilisant des anticorps monoclonaux murins dirigés contre le récepteur ou des dominants négatifs de l'IGF-IR. En effet, des anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'IGF-IR inhibent la prolifération de nombreuses lignées cellulaires en culture et la croissance de cellules tumorales in vivo (Arteaga C. et al., Cancer Res., 49 : 6237-6241,1989 ; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Corn., 196 : 92-98,1993 ; Zia F et al., J. Cell. Biol., 24 : 269-275, 1996 ; Scotlandi K et al., Cancer Res., 58 : 4127-4131,1998). Il a également été montré dans les travaux de Jiang et al. (Oncogene, 18 : 6071-6077,1999) qu'un dominant négatif de l'IGF-IR est capable d'inhiber la prolifération tumorale. IGF-IR is expressed in a wide variety of tumors and tumor lines, and IGFs enhance tumor growth via their attachment to IGF-IR. Other arguments in favor of the role of IGF-IR in carcinogenesis come from studies using murine monoclonal antibodies against the receptor or negative dominant IGF-IR. In fact, murine monoclonal antibodies directed against IGF-IR inhibit the proliferation of numerous cell lines in culture and the growth of tumor cells in vivo (Arteaga C. et al., Cancer Res., 49: 6237-6241, 1989 Li et al., Biochem Biophys Res., Corn., 196: 92-98, 1993, Zia F et al., J. Cell Biol., 24: 269-275, 1996, Scotlandi K et al. Cancer Res., 58: 4127-4131, 1998). It has also been shown in the work of Jiang et al. (Oncogene, 18: 6071-6077, 1999) that a dominant negative of IGF-IR is able to inhibit tumor proliferation.

La présente invention a pour objet de pouvoir disposer d'un anticorps monoclonal murin, de préférence un anticorps chimérisé ou humanisé, qui reconnaîtra spécifiquement et avec une forte affinité l'IGF-IR. Cet anticorps n'interagira pas ou peu avec le récepteur IR à l'insuline. Sa fixation devra inhiber in vitro la croissance des tumeurs exprimant l'IGF-IR en interagissant principalement avec les voies de transduction du signal activées lors des interactions IGF1/IGF-IR et IGF2/IGF-IR. Cet anticorps devra être actif in vivo sur tout les types de tumeurs exprimant l'IGF-IR y compris les tumeurs du sein estrogène dépendantes et les tumeurs de la prostate, ce qui n'est pas le cas pour les anticorps monoclonaux (notés AcM ou ACM) anti-IGF-IR actuellement disponibles. En effet l'aIR3, qui fait référence dans le domaine de l'IGFIR, inhibe totalement la croissance de tumeurs du sein estrogène dépendantes (MCF-7) in vitro mais est sans effet sur le modèle correspondant in vivo (Artega C. et al., J. Clin. The object of the present invention is to provide a murine monoclonal antibody, preferably a chimeric or humanized antibody, which will specifically and with high affinity recognize IGF-IR. This antibody will not or will not interact with the insulin IR receptor. Its binding will inhibit in vitro the growth of tumors expressing IGF-IR by interacting primarily with the signal transduction pathways activated during IGF1 / IGF-IR and IGF2 / IGF-IR interactions. This antibody should be active in vivo on all types of tumors expressing IGF-IR including estrogen-dependent breast tumors and prostate tumors, which is not the case for monoclonal antibodies (noted as mAbs or ACM) anti-IGF-IR currently available. Indeed the aIR3, which refers in the field of IGFIR, totally inhibits the growth of estrogen dependent breast tumors (MCF-7) in vitro but has no effect on the corresponding model in vivo (Artega C. et al. J. Clin.

Invest. 84 : 1418-1423,1989). De même, le fragment scFv-Fc dérivé du monoclonal murin 1 H7, n'est que faiblement actif sur la tumeur du sein MCF-7 et totalement inactif sur une tumeur de la prostate androgène indépendante (Li S. L. et al., Cancer Immunol. Invest. 84: 1418-1423, 1989). Similarly, the scFv-Fc fragment derived from the murine monoclonal H7 is only weakly active on the MCF-7 breast tumor and completely inactive on an independent androgenic prostate tumor (Li S. L. et al., Cancer Immunol.

Immunother., 49 : 243-252,2000). Immunother., 49: 243-252,2000).

De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence un anticorps chimérique (dénommé C7CI0) et deux anticorps humanisés dénommés respectivement Surprisingly, the inventors have demonstrated a chimeric antibody (called C7C10) and two humanized antibodies called respectively

h7CI0 forme humanisée 1 et h7C10 forme humanisée 2, dérivés de l'anticorps monoclonal murin 7C10, reconnaissant l'IGF-IR et répondant à tous les critères énoncés ci-dessus, c'est-à-dire à une non reconnaissance du récepteur à l'insuline, à un blocage in vitro de la prolifération IGF1 et/ou IGF2 induite mais également à l'inhibition in vivo de la croissance de différentes tumeurs exprimant l'IGF-IR parmi lesquelles un ostéosarcome et une tumeur du poumon non à petites cellules mais également et plus particulièrement la tumeur du sein estrogène dépendante MCF-7 et une tumeur de la prostate. De même, et de façon surprenante, l'intensité d'inhibition de la croissance tumorale de la cellule MCF-7 in vivo par l'anticorps 7C10 est comparable, voire significativement supérieure, à celle observée avec le tamoxifen l'un des composés de référence dans le traitement des tumeurs du sein estrogènes dépendantes. Ces anticorps ont pu être caractérisés par leur séquence peptidique et nucléique, notamment par la séquence de leurs régions déterminant leur complémentarité (CDR) pour l'IGF-IR. h7CI0 humanized form 1 and h7C10 humanized form 2, derived from murine monoclonal antibody 7C10, recognizing IGF-IR and fulfilling all the criteria set out above, that is to say to a nonrecognition of the insulin, in vitro blockade of IGF1 and / or IGF2-induced proliferation but also in vivo inhibition of the growth of various tumors expressing IGF-IR, including osteosarcoma and non-small lung tumors. cells but also and more particularly the estrogen-dependent breast tumor MCF-7 and a tumor of the prostate. Likewise, and surprisingly, the intensity of inhibition of the tumor growth of the MCF-7 cell in vivo by the 7C10 antibody is comparable to, or even significantly greater than that observed with tamoxifen, one of the compounds of reference in the treatment of estrogen-dependent breast tumors. These antibodies could be characterized by their peptide and nucleic sequence, in particular by the sequence of their complementarity determining regions (CDRs) for IGF-IR.

Ainsi, la présente invention a pour objet un anticorps isolé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ledit anticorps ou l'un de sesdits fragments étant capable de se fixer spécifiquement au récepteur humain du facteur de croissance 1 apparenté à l'insuline IGF-IR et, le cas échéant, de préférence capable en outre d'inhiber la fixation naturelle des ligands IGF1 et/ou IGF2 de IGF-IR, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant au moins une région CDR déterminant la complémentarité choisie parmi les CDRs de séquence d'acide aminé SEQ ID Nos. 2,4 ou 6, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité après alignement optimale avec la séquence SEQ ID Nos. 2,4 ou 6, ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisie parmi les CDRs de séquence d'acide aminé SEQ ID Nos. 8,10 et 12, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 8,10 et 12. Thus, the subject of the present invention is an isolated antibody, or a functional fragment thereof, wherein said antibody or a fragment thereof is capable of binding specifically to the human IGF insulin-related growth factor-1 receptor. -IR and, where appropriate, preferably also capable of inhibiting the natural binding of IGF1 and / or IGF2 ligands of IGF-IR, characterized in that it comprises a light chain comprising at least one CDR region determining the complementarity selected from the CDRs of amino acid sequence SEQ ID Nos. 2.4 or 6, or at least one CDR whose sequence has at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 98% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID Nos. 2,4 or 6, or in that it comprises a heavy chain comprising at least one CDR chosen from the CDRs of amino acid sequence SEQ ID Nos. 8, 10 and 12, or at least one CDR whose sequence exhibits at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 98% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 8,10 and 12.

Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences polypeptidiques, peptides et protéines attachés aux composés anticorps ou à leur séquence sont interchangeables. In the present description, the terms polypeptides, polypeptide sequences, peptides and proteins attached to the antibody compounds or their sequence are interchangeable.

Il doit être compris ici que l'invention ne concerne pas les anticorps sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être isolés ou obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou par synthèse chimique, et qu'ils peuvent alors comporter des acides aminés non naturels comme cela sera décrit plus loin. It should be understood here that the invention does not relate to antibodies in natural form, that is to say that they are not taken in their natural environment but that they could be isolated or obtained by purification from from natural sources, or obtained by genetic recombination, or by chemical synthesis, and they may then include non-natural amino acids as will be described later.

Par région CDR ou CDR, on entend désigner les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines comme définies par Kabat et al. By CDR region or CDR is meant the hypervariable regions of immunoglobulin heavy and light chains as defined by Kabat et al.

(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U. S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later editions). Il existe 3 CDRs de chaîne lourde et 3 CDRs de chaîne légère. Le terme CDR ou CDRs est utilisé ici pour désigner suivant les cas, l'une de ces régions ou plusieurs, voire l'ensemble, de ces régions qui contiennent la majorité des résidus d'acide aminés responsables de la liaison par affinité de l'anticorps pour l'antigène ou l'épitope qu'il reconnaît. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later editions). There are 3 heavy chain CDRs and 3 light chain CDRs. The term CDR or CDRs is used herein to designate, as appropriate, one or more or all of these regions which contain the majority of the amino acid residues responsible for the affinity binding of the antibody for the antigen or epitope that it recognizes.

Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminé au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminé sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison pouvant être réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison . L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Watennan (1981) [Ad. App. Math. 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. By percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences in the sense of the present invention, it is meant to designate a percentage of nucleotides or identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment (optimal alignment), this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being randomly distributed over their entire length. The sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally performed by comparing these sequences after optimally aligning them, said comparison being possible by segment or by comparison window. The optimal alignment of the sequences for comparison can be realized, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Watennan (1981) [Ad. App. Math. 2: 482], using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol.

Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Soi. USA 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P). Biol. 48: 443], using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Self. USA 85: 2444], using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, or by BLAST comparison software N or BLAST P).

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminé est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acide nucléique ou d'acide aminé à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. The percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences in which the nucleic acid or amino acid sequence to be compared may comprise additions or deletions. relative to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences. The percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window. and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences.

Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 sequences (Tatusova et al.,"Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174 : 247-250) disponible sur le site http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/bl2. html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et extension gap penaltie : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. For example, one may use the BLAST program, BLAST 2 sequences (Tatusova et al., "Blast 2 sequences-a new tool for comparing proteins and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett., 174: 247-250) available at http. : // www. ncbi. nlm. nih. gov / Gorf / bl2. html, the parameters used being those given by default (in particular for the parameters open gap penalty: 5, and gap gap penalty: 2, the chosen matrix being for example the matrix BLOSUM 62 proposed by the program), the percentage of identity between the two sequences to be compared being calculated directly by the program.

Par séquence d'acide aminé présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité avec une séquences d'acide aminé de référence, on préfère celles présentant par rapport à la séquence de référence, certaines modifications, en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncation ou un allongement. Dans le cas d'une substitution, d'un ou plusieurs acide (s) aminé (s) consécutif (s) ou non consécutif (s), on préfère les substitutions dans lesquelles les acides aminés substitués sont remplacés par des acides aminés équivalents . By amino acid sequence having at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 98% identity with a reference amino acid sequence, those with respect to the reference sequence are preferred. certain modifications, in particular deletion, addition or substitution of at least one amino acid, truncation or elongation. In the case of a substitution, of one or more consecutive or non-consecutive amino acid (s), substitutions in which the substituted amino acids are replaced by equivalent amino acids are preferred.

L'expression acides aminés équivalents vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les activités biologiques des anticorps correspondants et telles qu'elles seront définies par la suite, notamment dans les exemples. The expression "equivalent amino acids" is intended herein to designate any amino acid that may be substituted for one of the amino acids of the basic structure without essentially modifying the biological activities of the corresponding antibodies and as they will be defined thereafter. , especially in the examples.

Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique entre les différents anticorps susceptibles d'être effectués. These equivalent amino acids can be determined either on the basis of their structural homology with the amino acids to which they are substituted, or on results of comparative tests of biological activity between the different antibodies that may be carried out.

A titre d'exemple, on mentionne les possibilités de substitution susceptibles d'être effectuées sans qu'il résulte en une modification approfondie de l'activité biologique de l'anticorps modifié correspondant. On peut remplacer ainsi la leucine par la valine ou l'isoleucine, l'acide aspartique par l'acide glutamine, la glutamine par l'asparagine, l'arginine par la lysine, etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. By way of example, mention is made of the possibilities of substitution that can be carried out without it resulting in a thorough modification of the biological activity of the corresponding modified antibody. Leucine can thus be replaced by valine or isoleucine, aspartic acid with glutamine acid, glutamine with asparagine, arginine with lysine, etc., the reverse substitutions being naturally conceivable in the same way. conditions.

Les anticorps selon la présente invention sont de préférence des anticorps monoclonaux spécifiques, notamment d'origine murine, chimériques ou humanisés qui pourront être obtenus selon les méthodes standards bien connues de l'homme de l'art. The antibodies according to the present invention are preferably specific monoclonal antibodies, in particular of murine origin, chimeric or humanized that can be obtained according to the standard methods well known to those skilled in the art.

En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments fonctionnels, notamment d'origine murine, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel Antibodies (Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein (Nature, 256 : 495-497,1975). In general, for the preparation of monoclonal antibodies or their functional fragments, in particular of murine origin, reference may be made to the techniques which are in particular described in the Antibodies manual (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) or the preparation technique from hybridomas described by Kohler and Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).

Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être obtenus par exemple à partir de cellule d'un animal immunisé contre le récepteur IGF-IR, ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon l'invention. Ledit récepteur IGF-IR, ou un de sesdits fragments, pourra notamment être produit selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la séquence de l'ADNc codant pour le récepteur IGF-IR ou par synthèse peptidique à partir d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique du récepteur IGF-IR. The monoclonal antibodies according to the invention can be obtained for example from cells of an animal immunized against the IGF-IR receptor, or a fragment thereof comprising the epitope specifically recognized by said monoclonal antibodies according to the invention. Said IGF-IR receptor, or one of its fragments, may in particular be produced according to the usual procedures, by genetic recombination from a nucleic acid sequence contained in the sequence of the cDNA coding for the IGF-IR receptor. or by peptide synthesis from an amino acid sequence included in the peptide sequence of the IGF-IR receptor.

Les anticorps monoclonaux selon l'invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisé le récepteur IGFIR ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon l'invention. The monoclonal antibodies according to the invention may, for example, be purified on an affinity column on which the IGFIR receptor has previously been immobilized or one of its fragments comprising the epitope specifically recognized by said monoclonal antibodies according to the invention.

Sont également compris par anticorps selon la présente invention, les anticorps chimériques ou humanisés. Antibodies according to the present invention also include chimeric or humanized antibodies.

Par anticorps chimérique, on entend désigner un anticorps qui contient une région variable (chaîne légère et chaîne lourde) naturelle dérivée d'un anticorps d'une espèce donnée en association avec les régions constantes de chaîne légère et chaîne lourde d'un anticorps d'une espèce hétérologue à ladite espèce donnée. By chimeric antibody is meant an antibody which contains a naturally occurring variable (light chain and heavy chain) derived from an antibody of a given species in association with the light chain and heavy chain constant regions of an antibody of a heterologous species to said given species.

Les anticorps ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être préparés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps chimérique pourra être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal non humain, notamment murin, selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Pour les méthodes de préparation d'anticorps chimériques, on pourra par exemple se référer au document Verhoeyn et al. (BioEssays, 8 : 74, 1988). The antibodies or their chimeric-like fragments according to the invention can be prepared using genetic recombination techniques. For example, the chimeric antibody may be made by cloning a recombinant DNA comprising a promoter and a sequence coding for the variable region of a non-human monoclonal antibody, in particular murine monoclonal antibody, according to the invention and a sequence coding for the constant region. human antibody. A chimeric antibody of the invention encoded by such a recombinant gene will for example be a mouse-human chimera, the specificity of this antibody being determined by the variable region derived from murine DNA and its isotype determined by the constant region derived from the murine DNA. Human DNA. For methods for the preparation of chimeric antibodies, reference may be made for example to Verhoeyn et al. (BioEssays, 8: 74, 1988).

Par anticorps humanisés, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivée d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. En outre, certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être modifiés pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al., Nature, 321 : 522-525, 1986 ; Verhoeyen et al., Science, 239 : 1534-1536, 1988 ; Riechmann et al., Nature, 332 : 323-327, 1988). By humanized antibodies is meant an antibody which contains CDRs regions derived from an antibody of non-human origin, the other parts of the antibody molecule being derived from one (or more) human antibodies. In addition, some of the skeletal segment residues (referred to as FR) can be modified to maintain binding affinity (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986, Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 1536, 1988, Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988).

Les anticorps humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (comme par exemple celles décrites dans les documents Singer et al., J. Immun. 150 : 2844-2857, 1992 ; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10 : 1-142, 1992 ; ou Bebbington et al., Bio/Technology, 10 : 169-175, 1992). De tels anticorps humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, ou de traitement prophylactique et/ou thérapeutique in vivo. The humanized antibodies according to the invention or their fragments may be prepared by techniques known to those skilled in the art (as for example those described in the documents Singer et al., J. Immun 150: 2844-2857, 1992 Mountain et al., Biotechnol, Genet Eng.Rev., 10: 1-142, 1992 or Bebbington et al., Bio / Technology, 10: 169-175, 1992). Such humanized antibodies according to the invention are preferred for use in in vitro diagnostic methods, or in vivo prophylactic and / or therapeutic treatment.

Par fragment fonctionnel d'un anticorps selon l'invention, on entend désigner en particulier un fragment d'anticorps, tel que des fragments Fv, scFv (sc pour simple chaîne), Fab, F (ab') 2, Fab', scFv-Fc ou diabodies, ou tout fragment dont la durée de demie-vie aurait été augmentée par modification chimique, comme l'ajout de poly (alkylène) glycol tel que le poly (éthylène) glycol ("PEGylation"), ou par incorporation dans un liposome, lesdits fragments présentant au moins un des CDRs de séquence SEQ ID No. 2,4, 6,8, 10 ou 12 caractéristiques selon l'invention, et, notamment, en ce qu'il est capable d'exercer de manière générale une activité même partielle de l'anticorps dont il est issu, telle qu'en particulier la capacité à reconnaître et à se fixer sur le récepteur IGF-IR, et, le cas échéant, à inhiber l'activité du récepteur IGF-IR. By functional fragment of an antibody according to the invention is meant in particular an antibody fragment, such as fragments Fv, scFv (sc for single chain), Fab, F (ab ') 2, Fab', scFv -Fc or diabodies, or any fragment whose half-life time would have been increased by chemical modification, such as the addition of poly (alkylene) glycol such as poly (ethylene) glycol ("PEGylation"), or by incorporation into a liposome, said fragments having at least one of the CDRs of sequence SEQ ID No. 2,4, 6,8, 10 or 12 characteristics according to the invention, and in particular that it is capable of exerting general, even partial activity of the antibody from which it is derived, such as in particular the ability to recognize and bind to the IGF-IR receptor, and, where appropriate, to inhibit the activity of the IGF-IR receptor .

De préférence, lesdits fragments fonctionnels seront constitués ou comprendront une séquence partielle de la chaîne variable lourde ou légère de l'anticorps dont ils sont dérivés, ladite séquence partielle étant suffisante pour retenir la même spécificité de liaison que l'anticorps dont elle est issue et une affinité suffisante, de préférence au moins égale à 1/100, de manière plus préférée à au moins 1/10 de celle de l'anticorps dont elle est issue, vis-à-vis du récepteur IGF-IR. Preferably, said functional fragments will comprise or comprise a partial sequence of the heavy or light variable chain of the antibody from which they are derived, said partial sequence being sufficient to retain the same binding specificity as the antibody from which it is derived and sufficient affinity, preferably at least equal to 1/100, more preferably at least 1/10 that of the antibody from which it is derived, vis-à-vis the IGF-IR receptor.

Un tel fragment fonctionnel comportera au minimum 5 acides aminés, de préférence 10,15, 25,50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence de l'anticorps dont il est issu. Such a functional fragment will comprise at least 5 amino acids, preferably 10, 15, 25, 50 and 100 consecutive amino acids of the sequence of the antibody from which it is derived.

De préférence, ces fragments fonctionnels seront des fragments de type Fv, scFv, Fab, F (ab') 2, F (ab'), scFv-Fc ou diabodies, qui possèdent généralement la même spécificité de fixation que l'anticorps dont ils sont issus. Selon la présente invention, des fragments d'anticorps de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. Preferably, these functional fragments will be fragments of the Fv, scFv, Fab, F (ab ') 2, F (ab'), scFv-Fc or diabodies type, which generally have the same binding specificity as the antibody for which they are present. are from. According to the present invention, antibody fragments of the invention can be obtained from antibodies as previously described by methods such as digestion with enzymes, such as pepsin or papain and / or by cleavage of disulfide bridges. by chemical reduction.

D'une autre manière les fragments d'anticorps compris dans la présente invention peuvent être obtenus par des techniques de recombinaisons génétiques bien connues également de l'homme de l'art ou encore par synthèse peptidique au moyen par exemple de synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc.. In another way, the antibody fragments included in the present invention may be obtained by genetic recombination techniques well known to those skilled in the art or by peptide synthesis using, for example, automatic peptide synthesizers such as than those provided by Applied Biosystems, etc.

De manière plus préférée, l'invention comprend les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, selon la présente invention, notamment chimériques ou humanisés, obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique. More preferably, the invention comprises the antibodies, or their functional fragments, according to the present invention, in particular chimeric or humanized, obtained by genetic recombination or by chemical synthesis.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde comprenant au moins un CDR de séquence SEQ ID No. 12 ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 12. In a preferred embodiment, the subject of the invention is an antibody, or one of its functional fragments, according to the invention, characterized in that it comprises a heavy chain comprising at least one CDR of sequence SEQ ID No. Or a sequence having at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 12.

Parmi les six courtes séquences de CDR, le troisième CDR de la chaîne lourde (CDRH3) a une plus grande variabilité de taille (grande diversité essentiellement due aux mécanismes d'arrangement des gènes qui lui donnent naissance). Il peut être aussi court que 2 acides aminés alors que la taille la plus longue connue est de 26. Among the six short CDR sequences, the third CDR of the heavy chain (CDRH3) has greater size variability (large diversity mainly due to the mechanisms of arrangement of the genes that give rise to it). It can be as short as 2 amino acids while the longest known size is 26.

Fonctionnellement, le CDRH3 joue un rôle à part dans la détermination de la spécificité de l'anticorps (Segal et al., PNAS, 71 : 4298-4302,1974 ; Amit et al., Science, 233 : 747- 753,1986 ; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196 : 901-917, 1987 ; Chothia et al., Nature, 342 : 877-883,1989 ; Caton et al., J. Immunol., 144 : 1965-1968,1990 ; Sharon et al., PNAS, 87 : 4814-4817,1990 ; Sharon et al., J. Immnuol., 144 : 4863-4869,1990 ; Kabat et al., J. Immunol, 147 : 1709-1719,1991). Functionally, CDRH3 plays a role in determining the specificity of the antibody (Segal et al., PNAS, 71: 4298-4302, 1974, Amit et al., Science, 233: 747-753, 1986; Chothia et al., J. Mol Biol., 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342: 877-883, 1989; Caton et al., J. Immunol., 144: 1965-1968. 1990, Sharon et al., PNAS 87: 4814-4817, 1990, Sharon et al., J. Immnuol., 144: 4863-4869,1990, Kabat et al., J. Immunol, 147: 1709-1719. 1991).

Il est connu que seul un faible pourcentage des acides aminés des CDRs contribue à la construction de site de liaison de l'anticorps, mais ces résidus doivent être maintenus dans une conformation tridimensionnelle très spécifique. It is known that only a small percentage of the amino acids of the CDRs contribute to the binding site construction of the antibody, but these residues must be maintained in a very specific three-dimensional conformation.

De manière plus préférée, la présente invention est relative à un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID Nos. 8,10 et 12, ou au moins deux de trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 8,10 et 12. More preferably, the present invention relates to an antibody, or a functional fragment thereof, according to the invention, characterized in that it comprises a heavy chain comprising at least two of the three CDRs or the three CDRs of sequence SEQ ID Nos. 8, 10 and 12, or at least two of three CDRs or three sequence CDRs having respectively at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID Nos. 8, 10 and 12.

Dans un mode de réalisation également préféré, l'invention a pour objet un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs In a also preferred embodiment, the subject of the invention is an antibody, or one of its functional fragments, according to the invention, characterized in that it comprises a light chain comprising at least one CDR chosen from CDRs.

de séquence SEQ ID No. 2,4 ou 6, ou un CDR dont la séquence présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2,4 ou 6. of sequence SEQ ID No. 2,4 or 6, or a CDR whose sequence has at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 2,4 or 6.

Dans un mode de réalisation plus préféré, l'invention a pour objet un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID Nos. 2,4 et 6, ou au moins deux de trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2,4 et 6. In a more preferred embodiment, the subject of the invention is an antibody, or one of its functional fragments according to the invention, characterized in that it comprises a light chain comprising at least two of the three CDRs or the three Sequence CDRs SEQ ID Nos. 2,4 and 6, or at least two of three CDRs or three sequence CDRs having respectively at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 2,4 and 6.

De manière la plus préférée, l'anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde comprenant les trois CDRs de séquence SEQ ID Nos. 8,10 et 12, ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 8,10 et 12 et en ce qu'il comprend en outre une chaîne légère comprenant les trois CDRs de séquence SEQ ID Nos. 2,4 et 6, ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2,4 et 6. Most preferably, the antibody, or one of its functional fragments according to the invention, is characterized in that it comprises a heavy chain comprising the three CDRs of sequence SEQ ID Nos. 8, 10 and 12, or three sequence CDRs having respectively at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID Nos. 8, 10 and 12 and in that it further comprises a light chain comprising the three Sequence CDRs SEQ ID Nos. 2,4 and 6, or three sequence CDRs having respectively at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 2,4 and 6.

Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce qu'il ne se fixe pas ou qu'il ne se fixe pas de manière significative au récepteur humain IR de l'insuline. In another aspect, the subject of the present invention is an antibody, or one of its functional fragments, according to the invention, characterized in that it does not settle or that it does not settle significantly at human IR receptor of insulin.

De manière préférée, lesdits fragments fonctionnels selon la présente invention seront choisis parmi les fragments Fv, scFv, Fab, (Fab') 2, Fab', scFv-Fc ou diabodies, ou tout fragment fonctionnel dont la demie vie aurait été augmentée par une modification chimique, notamment par PEGylation, ou par l'incorporation dans un liposome. Preferably, said functional fragments according to the present invention will be chosen from Fv, scFv, Fab, (Fab ') 2, Fab', scFv-Fc or diabodies fragments, or any functional fragment whose half life has been increased by a chemical modification, in particular by PEGylation, or by incorporation into a liposome.

Sous un autre aspect, l'invention est relative à un hybridome murin capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention, notamment l'hybridome d'origine murine tel que déposé au Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 19 septembre 2001 sous le numéro 1-2717. In another aspect, the invention relates to a murine hybridoma capable of secreting a monoclonal antibody according to the present invention, in particular the hybridoma of murine origin as deposited at the National Microorganism Culture Center (CNCM) (Pasteur Institute, Paris, France) on September 19, 2001 under the number 1-2717.

L'anticorps monoclonal dénommé ici 7C10, ou l'un de ses fragments fonctionnels, caractérisé en ce que ledit anticorps est sécrété par l'hybridome déposé à la CNCM le 19 septembre 2001 sous le numéro 1-2717 fait bien entendu partie de la présente invention. The monoclonal antibody referred to herein as 7C10, or one of its functional fragments, characterized in that said antibody is secreted by the hybridoma deposited at the CNCM on September 19, 2001 under the number 1-2717 is of course part of the present invention. invention.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention est relative à un anticorps murin, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 54, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimale avec la séquence SEQ ID No. 54, ou/et en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 69, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 69. In a particular embodiment, the present invention relates to a murine antibody, or a functional fragment thereof, according to the invention, characterized in that said antibody comprises a light sequence chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 54, or a sequence having at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 54, and / or comprising a sequence heavy chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 69, or a sequence having at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 69.

Sous un aspect également particulier, la présente invention est relative à un anticorps chimérique, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend en outre les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps d'une espèce hétérologue à la souris, notamment de l'Homme, et de manière préférée, en ce que les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps humain sont respectivement la région kappa et, gamma-1 ou gamma-4. In a particularly particular aspect, the present invention relates to a chimeric antibody, or a functional fragment thereof, according to the invention, characterized in that said antibody further comprises the derived light chain and heavy chain constant regions. an antibody of a heterologous species to the mouse, in particular of the human, and preferably, in that the light chain and heavy chain constant regions derived from a human antibody are respectively the kappa region and, gamma-1 or gamma-4.

Sous un aspect également particulier, la présente invention est relative à un anticorps humanisé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend une chaîne légère et/ou une chaîne lourde dans lesquelles les segments de squelette FRI à FR4 (tels que définis ci-après dans les exemples 12 et 13, aux tableaux 5 et 6) de ladite chaîne légère et/ou chaîne lourde sont dérivés respectivement de segments de squelette FRI à FR4 de chaîne légère et/ou de chaîne lourde d'anticorps humains. In a particularly particular aspect, the present invention relates to a humanized antibody, or a functional fragment thereof, according to the invention, characterized in that said antibody comprises a light chain and / or a heavy chain in which the segments of backbone FRI to FR4 (as defined hereinafter in Examples 12 and 13, in Tables 5 and 6) of said light chain and / or heavy chain are respectively derived from segments of backbone FRI to FR4 of light chain and / or of heavy chain of human antibodies.

Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps humanisé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la présente invention est caractérisé en ce que ledit anticorps humanisé comprend une chaîne légère comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 61 ou 65, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 61 ou 65, ou/et en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 75, 79 ou 83, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 75,79 ou 83. According to a preferred embodiment, the humanized antibody, or one of its functional fragments, according to the present invention is characterized in that said humanized antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 61 or 65, or a sequence having at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 61 or 65, and / or comprising a sequence heavy chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 75, 79 or 83, or a sequence having at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 75,79 or 83.

De préférence, l'anticorps humanisé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention est caractérisé en ce que ledit anticorps humanisé comprend une chaîne légère comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 65, et en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 79 ou 83, de préférence SEQ ID No. 83. Preferably, the humanized antibody, or one of its functional fragments, according to the invention is characterized in that said humanized antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 65, and in that it comprises a sequence heavy chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 79 or 83, preferably SEQ ID No. 83.

Sous un nouvel aspect, la présente invention est relative à un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique, ADN ou ARN, codant pour un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention ; b) un acide nucléique complémentaire d'un acide nucléique tel que défini en a) ; et c) un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides capable d'hybrider dans des conditions de forte stringence avec au moins l'un des CDRs de séquence d'acide nucléique SEQ
ID No. 1,3, 5,7, 9 ou 11, ou avec une séquence présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 1,3, 5,7, 9 ou 11. In a new aspect, the present invention relates to an isolated nucleic acid characterized in that it is selected from the following nucleic acids: a) a nucleic acid, DNA or RNA, encoding an antibody, or one of its functional fragments according to the invention; b) a nucleic acid complementary to a nucleic acid as defined in a); and c) a nucleic acid of at least 18 nucleotides capable of hybridizing under conditions of high stringency with at least one of the nucleic acid sequence CDRs SEQ
ID No. 1,3, 5,7, 9 or 11, or with a sequence having at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 98% identity after optimal alignment with SEQ ID sequence No. 1,3, 5,7, 9 or 11.

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. By nucleic acid, nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used indifferently in the present description, is meant to designate a precise sequence of nucleotides, modified or otherwise, to define a fragment or a region of a nucleic acid, with or without unnatural nucleotides, and which may correspond to both a double-stranded DNA, a single-stranded DNA and transcripts of said DNAs.

Il doit être aussi compris ici que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner ici les acides nucléiques isolés obtenus par recombinaison génétique au moyen par exemple de cellules hôtes ou obtenus par synthèse chimique. It should also be understood that the present invention does not relate to nucleotide sequences in their natural chromosomal environment, i.e., in the natural state. These are sequences that have been isolated and / or purified, that is to say that they were taken directly or indirectly, for example by copy, their environment having been at least partially modified. It is thus also meant here to designate isolated nucleic acids obtained by genetic recombination by means of, for example, host cells or obtained by chemical synthesis.

Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 %, après alignement optimal avec une séquence By nucleic sequences having an identity percentage of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 98%, after optimal alignment with a sequence

de préférence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique et/ou une substitution, notamment ponctuelle. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences codent pour les mêmes séquences d'acide aminés que la séquence de référence, ceci lié à la dégénérescence du code génétique, ou de séquences complémentaires qui sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences de référence de préférence dans des conditions de forte stringence notamment telles que définies ci-après. preferably, it is intended to designate the nucleic sequences having, with respect to the reference nucleic sequence, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion and / or a substitution, in particular punctual. These are preferably sequences whose sequences encode the same amino acid sequences as the reference sequence, this linked to the degeneracy of the genetic code, or complementary sequences that are likely to hybridize specifically with the sequences. reference preferably under conditions of high stringency especially as defined below.

Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. Hybridization under high stringency conditions means that the temperature and ionic strength conditions are chosen such that they allow the maintenance of hybridization between two complementary DNA fragments.

A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes. As an illustration, conditions of high stringency of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotide fragments described above are advantageously as follows.

L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i. e. : 42 C,

pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0, 1 x SSC + 0, 1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0, 1 x SSC + 0, 1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor). DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two steps: (1) prehybridization at 42 ° C. for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 × SSC (1 × SSC corresponds to a solution 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) hybridization proper for 20 hours at a temperature dependent on the size of the probe (ie: 42 C,

for a probe of size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C. in 2 × SSC + 2% SDS, 1 washing of 20 minutes at 20 ° C. in 0.1 × SSC + 0.1% SDS. The last wash is carried out in 0.1 × SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. for a probe of size> 100 nucleotides. The high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size may be adapted by those skilled in the art for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor).

L'invention est également relative à un vecteur comprenant un acide nucléique selon la présente invention. The invention also relates to a vector comprising a nucleic acid according to the present invention.

L'invention vise notamment les vecteurs de clonage et/ou d'expression qui contiennent une séquence nucléotidique selon l'invention. The invention particularly relates to the cloning and / or expression vectors which contain a nucleotide sequence according to the invention.

Les vecteurs selon l'invention comportent de préférence des éléments qui permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques dans une cellule hôte déterminée. Le vecteur doit alors comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. The vectors according to the invention preferably comprise elements which allow the expression and / or the secretion of the nucleotide sequences in a specific host cell. The vector must then include a promoter, translation initiation and termination signals, as well as appropriate transcriptional regulatory regions. It must be able to be stably maintained in the host cell and may possibly have particular signals that specify the secretion of the translated protein. These different elements are chosen and optimized by those skilled in the art depending on the cellular host used. For this purpose, the nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or be integrative vectors of the chosen host.

De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telle que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. Such vectors are prepared by methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into a suitable host by standard methods, such as lipofection, electroporation, heat shock, or chemical methods. .

Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques selon l'invention. The vectors according to the invention are for example vectors of plasmid or viral origin. They are useful for transforming host cells in order to clone or express the nucleotide sequences according to the invention.

L'invention comprend également les cellules hôtes transformées par ou comprenant un vecteur selon l'invention. The invention also includes host cells transformed with or comprising a vector according to the invention.

L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes. The cellular host may be chosen from prokaryotic or eukaryotic systems, for example bacterial cells, but also yeast cells or animal cells, in particular mammalian cells. Insect cells or plant cells can also be used.

L'invention concerne également les animaux, excepté l'Homme, qui comprennent une cellule transformée selon l'invention. The invention also relates to animals, except humans, which comprise a transformed cell according to the invention.

Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de production d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : In another aspect, the subject of the invention is a method for producing an antibody, or one of its functional fragments according to the invention, characterized in that it comprises the following steps:

a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule hôte selon l'invention ; et b) la récupération desdits anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ainsi produits à partir du milieu de culture ou desdites cellules cultivées. a) culturing in a suitable medium and culture conditions of a host cell according to the invention; and b) recovering said antibodies, or a functional fragment thereof, thereby produced from the culture medium or said cultured cells.

Les cellules transformées selon l'invention sont utilisables dans des procédés de préparation de polypeptides recombinants selon l'invention. Les procédés de préparation d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre un vecteur et/ou une cellule transformée par un vecteur selon l'invention sont eux-mêmes compris dans la présente invention. De préférence, on cultive une cellule transformée par un vecteur selon l'invention dans des conditions qui permettent l'expression dudit polypeptide et on récupère ledit peptide recombinant. The cells transformed according to the invention can be used in processes for preparing recombinant polypeptides according to the invention. The methods for preparing a polypeptide according to the invention in recombinant form, characterized in that they implement a vector and / or a cell transformed with a vector according to the invention are themselves included in the present invention. Preferably, a cell transformed with a vector according to the invention is cultured under conditions which allow the expression of said polypeptide and said recombinant peptide is recovered.

Ainsi qu'il a été dit, l'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes. En particulier, il est possible d'identifier des séquences nucléotidiques selon l'invention, facilitant la sécrétion dans un tel système procaryote ou eucaryote. Un vecteur selon l'invention portant une telle séquence peut donc être avantageusement utilisé pour la production de protéines recombinantes, destinées à être sécrétées. En effet, la purification de ces protéines recombinantes d'intérêt sera facilitée par le fait qu'elles sont présentes dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu'à l'intérieur des cellules hôtes. As has been said, the cellular host may be selected from prokaryotic or eukaryotic systems. In particular, it is possible to identify nucleotide sequences according to the invention, facilitating secretion in such a prokaryotic or eukaryotic system. A vector according to the invention carrying such a sequence can therefore be advantageously used for the production of recombinant proteins, intended to be secreted. Indeed, the purification of these recombinant proteins of interest will be facilitated by the fact that they are present in the supernatant of the cell culture rather than inside the host cells.

On peut également préparer les polypeptides selon l'invention par synthèse chimique. Un tel procédé de préparation est également un objet de l'invention. The polypeptides according to the invention can also be prepared by chemical synthesis. Such a preparation method is also an object of the invention.

L'homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en oeuvre des phases solides (voir notamment Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2ème éd., (1984)) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention. Those skilled in the art are familiar with chemical synthesis processes, for example techniques involving solid phases (see, in particular, Steward et al., 1984, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem Company, Rockford, 111, 2nd ed. (1984)) or techniques using partial solid phases, by fragment condensation or by conventional solution synthesis. The polypeptides obtained by chemical synthesis and which may comprise corresponding non-natural amino acids are also included in the invention.

Les anticorps, ou l'un de leurs fragments fonctionnels, susceptibles d'être obtenus par un procédé selon l'invention sont également compris dans la présente invention. The antibodies, or one of their functional fragments, obtainable by a process according to the invention are also included in the present invention.

Sous encore un autre aspect, l'invention a pour objet un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention à titre de médicament, de préférence un anticorps humanisé tel que défini ci-avant. In yet another aspect, the subject of the invention is an antibody, or one of its functional fragments, according to the invention, as a medicament, preferably a humanized antibody as defined above.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, de préférence additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising as active principle an antibody, or one of its functional fragments, according to the invention, preferably supplemented with an excipient and / or a pharmaceutically acceptable vehicle.

La présente invention comprend en outre l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie induite par une surexpression ou une activation anormale du récepteur IGF-IR. The present invention further comprises the use of an antibody, or a functional fragment thereof, preferably humanized, according to the invention for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of an induced disease. overexpression or abnormal activation of the IGF-IR receptor.

De préférence, ladite utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que l'administration dudit médicament n'induit pas ou peu d'effets secondaires liés à une inhibition du récepteur IR de l'insuline, c'est-à-dire à une inhibition de l'interaction du récepteur IR avec ses ligands naturels due à la présence dudit médicament, notamment par une inhibition compétitive liée à la fixation dudit médicament sur l'IR. Preferably, said use according to the invention is characterized in that the administration of said drug does not induce or few side effects related to an inhibition of the IR insulin receptor, that is to say to a inhibition of the interaction of the IR receptor with its natural ligands due to the presence of said drug, in particular by a competitive inhibition linked to the fixing of said drug on the IR.

La présente invention comprend en outre l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la transformation de cellules normales en cellules à caractère tumoral, de préférence IGF dépendante, notamment IGF1 et/ou IGF2 dépendante. The present invention further comprises the use of an antibody, or a functional fragment thereof, preferably humanized, according to the invention for the preparation of a medicament for inhibiting the transformation of normal cells into cells of a tumor, preferably dependent IGF, in particular IGF1 and / or IGF2 dependent.

La présente invention est relative également à l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, de préférence IGF dépendante, notamment IGF1 et/ou IGF2 dépendante, ou estrogènes dépendantes, notamment E2 dépendante. The present invention also relates to the use of an antibody, or one of its functional fragments, preferably humanized, according to the invention for the preparation of a medicament intended to inhibit the growth and / or proliferation of tumor cells, preferably dependent IGF, in particular IGF1 and / or IGF2 dependent, or dependent estrogens, in particular E2 dependent.

De manière générale, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer exprimant l'IGF-IR et/ou de cancer présentant une hyperactivation In general, the subject of the present invention is the use of an antibody, or one of its functional fragments, preferably humanized, according to the invention, for the preparation of a medicament intended for the prevention or treatment of cancer expressing IGF-IR and / or cancer with hyperactivation

de la voie de transduction du signal médié par l'interaction de l'IGF1 ou IGF2 avec IGFIR, comme par exemple la surexpression de IRIS 1. of the signal transduction pathway mediated by the interaction of IGF1 or IGF2 with IGFIR, such as overexpression of IRIS 1.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du psoriasis, psoriasis dont l'hyperprolifération épidermique peut être liée à l'expression ou la surexpression de l'IGF-IR et/ou à l'hyperactivation de la voie de transduction du signal médié par l'interaction d'IGF-IR avec ses ligands naturels (Wraight C. J. et al. Nat. The subject of the present invention is also the use of an antibody, or one of its functional fragments, preferably humanized, according to the invention, for the preparation of a medicament intended for the prevention or treatment of psoriasis, psoriasis whose epidermal hyperproliferation may be related to the expression or overexpression of IGF-IR and / or the hyperactivation of the signal transduction pathway mediated by the interaction of IGF-IR with its natural ligands (Wraight CJ et al., Nat.

Biotechnol., 2000,18 (5) : 521-526. Reversal of epidermal hyperproliferation in psoriasis by insulin-like growth factor 1 receptor antisense oligonucleotides). Biotechnol., 2000, 18 (5): 521-526. Reversal of epidermal hyperproliferation in psoriasis by insulin-like growth factor 1 receptor antisense oligonucleotides).

Parmi les cancers qui peuvent être prévenus et/ou traiter, on préfère le cancer de la prostate, les ostéosarcomes, le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer du sein, le cancer de l'endomètre ou le cancer du côlon. Of the cancers that can be prevented and / or treated, prostate cancer, osteosarcomas, non-small cell lung cancer, breast cancer, endometrial cancer or colon cancer are preferred.

Sous encore un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode de diagnostic, de préférence in vitro, de maladies liées par une surexpression ou une sousexpression, de préférence une surexpression du récepteur IGF-IR à partir d'un échantillon biologique dont on suspecte la présence anormale en récepteur IGF-IR, caractérisée en ce qu'on met en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, ledit anticorps pouvant être, le cas échéant, marqué. In yet another aspect, the present invention relates to a diagnostic method, preferably in vitro, diseases related by overexpression or under-expression, preferably over-expression of the IGF-IR receptor from a biological sample which is suspects the abnormal presence of IGF-IR receptor, characterized in that said biological sample is brought into contact with an antibody, or one of its functional fragments, according to the invention, said antibody possibly being labeled as appropriate .

De préférence, lesdites maladies liées par la surexpression du récepteur IGF-IR dans ladite méthode de diagnostic seront des cancers. Preferably, said diseases linked by overexpression of the IGF-IR receptor in said diagnostic method will be cancers.

Ledit anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, peut se présenter sous forme d'immunoconjugué ou d'anticorps marqué afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. The antibody, or a functional fragment thereof, may be in the form of an immunoconjugate or labeled antibody to provide a detectable and / or quantifiable signal.

Les anticorps marqués selon l'invention ou leurs fragments fonctionnels incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, l'a-Dgalactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétylcholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo- The labeled antibodies according to the invention or their functional fragments include, for example, so-called immunoconjugated antibodies which may be conjugated for example with enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, α-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose amylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase or glucose-6 phosphate dehydrogenase or by a molecule such as biotin, digoxigenin or 5-bromo-

désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps ou leurs fragments fonctionnels selon l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour Green Fluorescent Protein ), le dansyl, Fumbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps de l'invention ou leurs fragments fonctionnels peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhyde, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate. deoxyuridine. Fluorescent markers may also be conjugated to the antibodies or their functional fragments according to the invention and include, in particular, fluorescein and its derivatives, fluorochrome, rhodamine and its derivatives, GFP (GFP for Green Fluorescent Protein), dansyl, Fumbelliferone etc. In such conjugates, the antibodies of the invention or their functional fragments can be prepared by methods known to those skilled in the art. They can be coupled to the fluorescent enzymes or markers directly or via a spacer group or a linker group such as polyaldehyde, such as glutaraldehyde, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DPTA), or in the presence of coupling agents such as periodate, etc. Conjugates having fluorescein-type labels may be prepared by reaction with an isothiocyanate.

D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes, des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine, ou encore des marqueurs radioactifs. Other conjugates may also include chemiluminescent markers such as luminol and dioxetanes, bioluminescent markers such as luciferase and luciferin, or radioactive labels.

Ainsi, les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, selon l'invention peuvent être employés dans un procédé pour la détection et/ou la quantification d'une surexpression ou d'une sousexpression, de préférence une surexpression du récepteur IGF-IR dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention ; et b) la mise en évidence du complexe IGF-IR/anticorps éventuellement formé. Thus, the antibodies, or their functional fragments, according to the invention can be used in a method for the detection and / or quantification of overexpression or under-expression, preferably overexpression of the IGF-IR receptor in a sample biological system, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing the biological sample into contact with an antibody, or one of its functional fragments, according to the invention; and b) the detection of the IGF-IR complex / antibody possibly formed.

Dans un mode de réalisation particulier, les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, selon l'invention, pourront être employés dans un procédé pour la détection et/ou la quantification du récepteur IGF-IR dans un échantillon biologique, pour le suivi de l'efficacité d'un traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'un cancer IGF dépendant ou encore d'un psoriasis. In a particular embodiment, the antibodies, or their functional fragments, according to the invention may be used in a process for the detection and / or quantification of the IGF-IR receptor in a biological sample, for monitoring the effectiveness of a prophylactic and / or therapeutic treatment of a dependent IGF cancer or of psoriasis.

Plus généralement, les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, selon l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où More generally, the antibodies, or their functional fragments, according to the invention can be advantageously used in any situation where

l'expression du récepteur IGF-IR doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative. the expression of the IGF-IR receptor must be observed qualitatively and / or quantitatively.

De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide biologique, tel que le sérum, le sang total, des cellules, un échantillon de tissu ou des biopsies d'origine humaine. Preferably, the biological sample consists of a biological fluid, such as serum, whole blood, cells, a tissue sample, or biopsies of human origin.

Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun de type anticorps-antigène. Suivant les applications selon l'invention, l'anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels peut être immobilisé ou marqué. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles. Any conventional procedure or test may be implemented to perform such detection and / or assay. Said test may be a competition or sandwich test, or any test known to those skilled in the art depending on the formation of an antibody-antigen-type immune complex. Depending on the applications according to the invention, the antibody or one of its functional fragments can be immobilized or labeled. This immobilization can be performed on many supports known to those skilled in the art. These supports may include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, or natural or modified celluloses. These supports can be either soluble or insoluble.

A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radioimmunologique (RIA) ou équivalent. By way of example, a preferred method involves immunoenzymatic processes according to the ELISA technique, by immunofluorescence, or radioimmunoassay (RIA) or equivalent.

Ainsi, la présente invention comprend également les kits ou nécessaires pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic de maladies induites par une surexpression ou une sousexpression du récepteur IGF-IR ou pour la mise en oeuvre d'un procédé pour la détection et/ou la quantification d'une surexpression ou d'une sousexpression du récepteur IGF-IR dans un échantillon biologique, de préférence une surexpression dudit récepteur, caractérisé en ce que ledit kit ou nécessaire comprend les éléments suivants : a) un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention ; b) éventuellement, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c) éventuellement, les réactifs permettant la mise en évidence des complexes IGF-
IR/anticorps produits par la réaction immunologique. Thus, the present invention also comprises the kits or kits necessary for the implementation of a method for diagnosing diseases induced by overexpression or under-expression of the IGF-IR receptor or for the implementation of a method for the detection and / or the quantification of overexpression or under-expression of the IGF-IR receptor in a biological sample, preferably an overexpression of said receptor, characterized in that said kit or kit comprises the following elements: a) an antibody, or one of its functional fragments, according to the invention; b) optionally, the reagents for the constitution of the environment conducive to the immunological reaction; c) optionally, the reagents allowing the detection of the IGF-complexes
IR / antibodies produced by the immunological reaction.

Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition comprenant au moins un premier composé anticorps selon l'invention, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, et un deuxième composé agent In another aspect, the present invention relates to a composition comprising at least a first antibody compound according to the invention, or one of its functional fragments, preferably humanized, and a second compound agent.

cytotoxique choisi parmi les agents interagissant avec l'ADN, les antimétabolites, les inhibiteurs de topoisomérases I ou II, ou encore les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destinée à la prévention ou au traitement de cancer. cytotoxic agent selected from DNA interacting agents, antimetabolites, topoisomerase I or II inhibitors, or spindle inhibitory or stabilizing agents, as a combination product for simultaneous, separate or time-course use for prevention or treatment of cancer.

On entend par"utilisation simultanée", l'administration des deux composés de la composition selon l'invention compris dans une seule et même forme pharmaceutique. By "simultaneous use" is meant the administration of the two compounds of the composition according to the invention included in one and the same pharmaceutical form.

On entend par"utilisation séparée", l'administration, en même temps, des deux composés de la composition selon l'invention, compris dans des formes pharmaceutiques distinctes. By "separate use" is meant the administration, at the same time, of the two compounds of the composition according to the invention, included in different pharmaceutical forms.

On entend par"utilisation étalée dans le temps", l'administration successive des deux composés de la composition selon l'invention, compris chacun dans une forme pharmaceutique distincte. The term "use spread over time", the successive administration of the two compounds of the composition according to the invention, each included in a separate pharmaceutical form.

Dans le cas de cette"utilisation étalée dans le temps", de préférence le laps de temps écoulé entre l'administration du premier composé de la composition selon l'invention et l'administration du deuxième composé de la même composition selon l'invention n'excède pas 48 heures ou 24 heures. In the case of this "use spread over time", preferably the lapse of time elapsed between the administration of the first compound of the composition according to the invention and the administration of the second compound of the same composition according to the invention. does not exceed 48 hours or 24 hours.

D'une façon générale, la composition selon l'invention augmente considérablement l'efficacité du traitement du cancer. En d'autres termes, l'effet thérapeutique de l'anticorps anti-IGF-IR selon l'invention est potentialisé de manière inattendue par l'administration d'un agent cytotoxique. Un autre avantage subséquent majeur produit par une composition selon l'invention, concerne la possibilité d'utiliser des doses efficaces en principe actif plus faibles, ce qui permet d'éviter ou de réduire les risques d'apparition des effets secondaires, en particulier l'effet de l'agent cytotoxique. In general, the composition according to the invention considerably increases the effectiveness of cancer treatment. In other words, the therapeutic effect of the anti-IGF-IR antibody according to the invention is unexpectedly potentiated by the administration of a cytotoxic agent. Another major subsequent advantage produced by a composition according to the invention concerns the possibility of using lower effective doses of active ingredient, which makes it possible to avoid or reduce the risks of occurrence of side effects, in particular the effect of the cytotoxic agent.

De plus, cette composition selon l'invention permettrait d'atteindre l'effet thérapeutique escompté plus rapidement. In addition, this composition according to the invention would make it possible to achieve the desired therapeutic effect more rapidly.

De tels agents cytotoxiques, pour chacune des classes d'agents cytotoxiques précitées, sont par exemple cités dans l'édition 2001 du VIDAL, à la page consacrée aux composés attachés à la cancérologie et l'hématologie colonne Cytotoxiques , ces composés cytotoxiques cités par référence à ce document sont cités ici comme agents cytotoxiques préférés. Such cytotoxic agents, for each of the classes of cytotoxic agents mentioned above, are, for example, cited in the 2001 edition of VIDAL, on the page devoted to the compounds attached to oncology and hematology cytotoxic column, these cytotoxic compounds cited by reference. to this document are cited here as preferred cytotoxic agents.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition comme produit de combinaison selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique est choisi parmi les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau, de préférence la vinorelbine. In a particularly preferred embodiment, said composition as a combination product according to the invention is characterized in that said cytotoxic agent is chosen from inhibitory agents or spindle stabilizers, preferably vinorelbine.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition comme produit de combinaison selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique est couplé chimiquement audit anticorps pour une utilisation simultanée. In a particularly preferred embodiment, said composition as a combination product according to the invention is characterized in that said cytotoxic agent is chemically coupled to said antibody for simultaneous use.

Afin de faciliter le couplage entre ledit agent cytotoxique et ledit anticorps selon l'invention, on pourra notamment introduire des molécules espaceurs entre les deux composés à coupler, telles que des poly (alkylènes) glycols comme le polyéthylèneglycol, ou encore des acides aminés, ou, dans un autre mode de réalisation, utiliser des dérivés actifs desdits agents cytotoxiques dans lesquels auront été introduites des fonctions capables de réagir avec ledit anticorps selon l'invention. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description. In order to facilitate the coupling between said cytotoxic agent and said antibody according to the invention, it will be possible in particular to introduce spacer molecules between the two compounds to be coupled, such as poly (alkylenes) glycols such as polyethylene glycol, or else amino acids, or in another embodiment, using active derivatives of said cytotoxic agents in which have been introduced functions capable of reacting with said antibody according to the invention. These coupling techniques are well known to those skilled in the art and will not be developed in the present description.

Sous encore un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition comprenant au moins un premier composé anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, et un deuxième composé anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire du récepteur HER2/neu, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destinée à la prévention et au traitement de cancer, notamment les cancers surexprimant ledit récepteur HER2/neu et le récepteur IGF-IR, comme notamment le cancer du sein. In yet another aspect, the subject of the present invention is a composition comprising at least a first antibody compound, or one of its functional fragments, according to the invention, and a second antibody compound directed against the extracellular domain of the HER2 receptor. neu, as a combination product for simultaneous, separate or spread over time for the prevention and treatment of cancer, especially cancers overexpressing said HER2 / neu receptor and the IGF-IR receptor, such as breast cancer.

On pourra notamment se référer aux publications de Albanell et al. (J. of the National Cancer Institute, 93 (24) : 1830-1831,2001) et de Lu et al. (J. of the National Cancer Institute, 93 (24) : 1852-1857,2001) justifiant l'intérêt inattendu d'associer un anticorps anti-HER2/neu avec un anticorps anti-IGF-IR selon la présente invention. In particular, we can refer to Albanell et al. (J. of the National Cancer Institute, 93 (24): 1830-1831, 2001) and Lu et al. (J. of the National Cancer Institute, 93 (24): 1852-1857, 2001) justifying the unexpected interest of associating an anti-HER2 / neu antibody with an anti-IGF-IR antibody according to the present invention.

De manière particulière, ledit anticorps anti-HER2/neu de la composition selon l'invention est l'anticorps dénommé Trastuzumab (dénommé encore Herceptin). In particular, said anti-HER2 / neu antibody of the composition according to the invention is the antibody called Trastuzumab (also called Herceptin).

L'invention est en outre relative à l'utilisation d'une composition comme produit de combinaison selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer, notamment des cancers pour lesquels ledit agent The invention further relates to the use of a composition as a combination product according to the invention, for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of cancer, in particular cancers for which said agent

cytotoxique ou ledit anticorps anti-HER2/neu est généralement prescrit et, notamment, pour lesquels cancers, les cellules tumorales expriment ou surexpriment le récepteur IGF-IR. cytotoxic or said anti-HER2 / neu antibody is generally prescribed and, in particular, for which cancers, the tumor cells express or overexpress the IGF-IR receptor.

L'invention est sous un dernier aspect relative à une composition comprenant un anticorps anti-IGF-IR, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, conjugué avec une toxine cellulaire ou un radioélément. The invention is in a final aspect relating to a composition comprising an anti-IGF-IR antibody, or one of its functional fragments, according to the invention, conjugated with a cellular toxin or a radioelement.

De préférence, ladite toxine ou ledit radioélément est capable d'inhiber au moins une activité cellulaire de cellules exprimant le récepteur IGF-IR, de manière plus préférée capable d'empêcher la croissance ou la prolifération de ladite cellule, notamment d'inactiver totalement ladite cellule. Preferably, said toxin or said radioelement is capable of inhibiting at least one cellular activity of cells expressing the IGF-IR receptor, more preferably capable of preventing the growth or proliferation of said cell, in particular of totally inactivating said cell.

De préférence encore, ladite toxine est une toxine d'entérobactéries, notamment l'exotoxine A de Pseudomonas. More preferably, said toxin is an enterobacterial toxin, especially exotoxin A of Pseudomonas.

Par toxine ou radioélément conjugué à l'anticorps anti-IGF-IR, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, on entend désigner tout moyen permettant de lier ladite toxine ou ledit radioélément audit anticorps anti-IGF-IF, notamment par couplage covalent entre les deux composés, avec ou sans introduction de molécule de liaison. By toxin or radioelement conjugated to the anti-IGF-IR antibody, or one of its functional fragments, according to the invention is meant any means for binding said toxin or radioelement to said anti-IGF-IF antibody, in particular by covalent coupling between the two compounds, with or without the introduction of a binding molecule.

De préférence également, l'anticorps anti-IGF-IR formant ledit conjugué selon l'invention est choisi parmi ses fragments fonctionnels, notamment les fragments amputés de leur composante Fc tels que les fragments scFv. Also preferably, the anti-IGF-IR antibody forming said conjugate according to the invention is chosen from among its functional fragments, in particular fragments amputated from their Fc component such as scFv fragments.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps anti-IGF-IR, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique d'un composé biologiquement actif vers des cellules exprimant ou surexprimant le récepteur IGF-IR. The subject of the invention is also the use of an anti-IGF-IR antibody, or one of its functional fragments, according to the invention, for the preparation of a medicinal product intended for the specific targeting of a biologically active compound active to cells expressing or overexpressing the IGF-IR receptor.

On entend désigner ici par composé biologiquement actif tout composé capable de moduler, notamment d'inhiber, l'activité cellulaire, en particulier leur croissance, leur prolifération, la transcription ou la traduction de gène. Here, the term "biologically active compound" is intended to mean any compound capable of modulating, in particular of inhibiting, cell activity, in particular their growth, proliferation, transcription or gene translation.

L'invention a aussi pour objet un réactif de diagnostic in vivo comprenant un anticorps anti-IGF-IR, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence marqué, notamment radiomarqué, et son utilisation en imagerie médicale, en particulier pour la The subject of the invention is also an in vivo diagnostic reagent comprising an anti-IGF-IR antibody, or one of its functional fragments, preferably labeled, in particular radiolabelled, and its use in medical imaging, in particular for the

détection de cancer lié à l'expression ou à la surexpression par une cellule du récepteur IGF-IR. cancer detection related to the expression or overexpression by a cell of the IGF-IR receptor.

L'invention est également relative à une composition comme produit de combinaison ou à un conjugué anti-IGF-IR/toxine ou radioélément, selon l'invention, à titre de médicament. The invention also relates to a composition as a combination product or an anti-IGF-IR / toxin or radioelement conjugate, according to the invention, as a medicament.

De préférence, ladite composition comme produit de combinaison ou ledit conjugué selon l'invention sera additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Preferably, said composition as a combination product or said conjugate according to the invention will be supplemented with an excipient and / or a pharmaceutically acceptable vehicle.

Dans la présente description, on entend désigner par véhicule pharmaceutiquement acceptable, un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des composés actifs, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode d'administration du ou des composés actifs choisis. In the present description, the term "pharmaceutically acceptable carrier" is intended to denote a compound or combination of compounds used in a pharmaceutical composition that does not cause side reactions and that makes it possible, for example, to facilitate the administration of the active compound or compounds. increase its life and / or effectiveness in the body, increase its solubility in solution or improve its conservation. These pharmaceutically acceptable vehicles are well known and will be adapted by those skilled in the art depending on the nature and mode of administration of the selected active compound (s).

De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie orale. De manière plus préférée, la composition comprenant les anticorps selon l'invention, sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. Preferably, these compounds will be administered systemically, in particular intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally or subcutaneously, or orally. More preferably, the composition comprising the antibodies according to the invention will be administered several times, spread over time.

Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés. Their modes of administration, dosages and optimal dosage forms can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a treatment adapted to a patient such as the age or the body weight of the patient, the severity of his general condition, tolerance to treatment and side effects noted.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ciaprès. Other features and advantages of the invention appear in the following description with the examples and figures whose legends are shown below.

LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : Représentation schématique de l'IGF-IR. LEGENDS OF FIGURES Figure 1: Schematic representation of IGF-IR.

Figure 2 : Schéma de la transduction des signaux médiée par l'IGF-IR lors de la fixation des IGFs. Figure 2: Diagram of signal transduction mediated by IGF-IR when binding IGFs.

Figures 3A, 3B et 3C : Reconnaissance de l'IGF-IR natif exprimé à la surface des cellules MCF-7 par l'anticorps monoclonal 7C10. Figures 3A, 3B and 3C: Recognition of native IGF-IR expressed on the surface of MCF-7 cells by monoclonal antibody 7C10.

Pour cette expérience, les cellules MCF-7 sont incubées avec l'anticorps 7C10 ou avec un anticorps contrôle négatif, puis révélées à l'aide d'un anticorps secondaire anti-espèce fluorescent. Le marquage est lu au FACS. Le premier histogramme (figure 3A) correspond aux cellules MCF-7 seules. Dans le deuxième histogramme (figure 3B) la courbe non grisée correspond au marquage non spécifique par un anticorps murin isotype contrôle. Dans le troisième histogramme (figure 3C), la courbe non grisée montre la reconnaissance de l'IGF-IR par l'ACM 7C10. For this experiment, the MCF-7 cells are incubated with the 7C10 antibody or with a negative control antibody, and then revealed with a fluorescent anti-species secondary antibody. The marking is read in the FACS. The first histogram (FIG. 3A) corresponds to the MCF-7 cells alone. In the second histogram (FIG. 3B), the ungulated curve corresponds to non-specific labeling by a murine isotype control antibody. In the third histogram (FIG. 3C), the ungulated curve shows the recognition of IGF-IR by ACM 7C10.

Figures 4A, 4B et 4C : Marquage de cellules d'insectes Sf9 exprimant respectivement l'IGF-IR ou l'IR. Figures 4A, 4B and 4C: Labeling of Sf9 insect cells respectively expressing IGF-IR or IR.

La figure 4A montre le marquage de cellules non transfectées seules (1) ou marquées avec des anticorps monoclonaux commerciaux témoins reconnaissant respectivement l'IGF-IR (2) ou FIR (3). En figure 4B, des cellules Sf9 exprimant uniquement l'IGF-IR sont marquées avec l'aIR3 (2) ou l'anti-IR (3), le pic (1) représentant les cellules seules. En figure 4C, des cellules Sf9 exprimant uniquement l'IR sont marquées avec un anti-IR (3) ou l'aIR3 (2), le pic (1) représentant les cellules seules. Figure 4A shows the labeling of untransfected cells alone (1) or labeled with control commercial monoclonal antibodies recognizing respectively IGF-IR (2) or FIR (3). In Figure 4B, Sf9 cells expressing only IGF-IR are labeled with aIR3 (2) or anti-IR (3), peak (1) representing the cells alone. In Figure 4C, Sf9 cells expressing only IR are labeled with anti-IR (3) or aIR3 (2), peak (1) representing single cells.

Figure 5 : Effet inhibiteur de l'anticorps 7C10 sur la prolifération des cellules MCF-7 induite par l'IGF-I. Figure 5: Inhibitory effect of the 7C10 antibody on IGF-I-induced MCF-7 cell proliferation.

Les cellules MCF-7 sont incubées en présence de concentrations croissantes d'IGFI en présence ou en absence des ACM à tester. La prolifération cellulaire est

évaluée par suivi de l'incorporation de 3H Thymidine. L'anticorps commercial aIR3 est utilisé comme contrôle positif de l'expérience. Le 7G3 est une IgGl murine anti-IGF-IR sans activité sur la prolifération et utilisée comme isotype contrôle. The MCF-7 cells are incubated in the presence of increasing concentrations of IGFI in the presence or absence of the ACMs to be tested. Cell proliferation is

evaluated by monitoring the incorporation of 3H Thymidine. Commercial antibody aIR3 is used as a positive control of the experiment. 7G3 is a murine anti-IGF-IR IgG1 with no activity on proliferation and used as a control isotype.

Figures 6A, 6B et 6C : - figure 6A : effet in vivo de l'anticorps monoclonal 7C10 sur la croissance de tumeurs MCF-7 établies chez la souris nude ; - figures 6B et 6C : figures provenant respectivement des publications d'Arteaga et al., 1989 (J. Clin. Invest., 84, 1418-1423, 1989) et de Li et al., 2000 (Cancer Immunol. Immonother., 49, 243-252), et montrant pour la figure 6B l'effet de aIR3 murin et pour la figure 6C l'effet d'un scFv-Fc recombinant dérivé de l'anticorps 1H7 sur la croissance tumorale. FIGS. 6A, 6B and 6C: FIG. 6A: in vivo effect of the monoclonal antibody 7C10 on the growth of established MCF-7 tumors in the nude mouse; Figures 6B and 6C: Figures respectively from the publications of Arteaga et al., 1989 (J. Clin Invest, 84, 1418-1423, 1989) and Li et al., 2000 (Cancer Immunol. 49, 243-252), and showing for FIG. 6B the effect of murine aIR3 and for FIG. 6C the effect of a recombinant scFv-Fc derived from the 1H7 antibody on tumor growth.

Figure 7 : Etude comparée de l'effet de l'AcM 7C10 et du tamoxifen sur la croissance in vivo de la tumeur MCF-7. Figure 7: Comparative study of the effect of MAb 7C10 and tamoxifen on the in vivo growth of the MCF-7 tumor.

Figures 8A, 8B et 8C : Etude de l'activité antitumorale de l'anticorps murin 7C10 dans différents modèles de xénogreffe de cellules tumorales in vivo. Figures 8A, 8B and 8C: Study of the anti-tumor activity of murine 7C10 antibody in different models of tumor cell xenograft in vivo.

La figure 8A montre les résultats obtenus sur un modèle d'ostéosarcome SK-ES- 1, la figure 8B concerne une tumeur de la prostate androgène indépendante DU-145 et la figure 8C un modèle de tumeur du poumon non à petites cellules A549. Dans ces trois modèles, le traitement a été effectué 2 fois par semaine en i. p. à raison de 250 g/dose/souris. Les courbes 7G3, EC2 et 904 correspondent respectivement à trois IgG1 murines utilisées comme isotype contrôle d'expérience dans chacun des modèles. FIG. 8A shows the results obtained on a SK-ES-1 osteosarcoma model, FIG. 8B relates to an independent androgen prostate tumor DU-145 and FIG. 8C shows a non-small cell lung tumor model A549. In these three models, the treatment was carried out twice a week in i. p. at a rate of 250 g / dose / mouse. Curves 7G3, EC2 and 904 respectively correspond to three murine IgG1 used as isotype control experience in each of the models.

Figure 9 : Etude de l'effet antitumoral de l'AcM 7C10 comparé à la navelbine (vinorelbine) ainsi que de la synergie des deux composés sur la croissance in vivo de la lignée A549. Figure 9: Study of the antitumor effect of the mAb 7C10 compared with navelbine (vinorelbine) as well as the synergy of the two compounds on the in vivo growth of the A549 line.

Figure 10 : Activité comparée des AcM aIR3, 7C10 et 1H7 sur la prolifération IGF-2 induite des cellules MCF-7. Figure 10: Compared activity of MAbs aIR3, 7C10 and 1H7 on induced IGF-2 proliferation of MCF-7 cells.

Figure 11 : Comparaison des AcM 7C10 murin et C7C10 chimérique pour l'inhibition de la prolifération IGF1 des cellules MCF-7 in vitro. L'anticorps 9G4 est une IgG 1 murine utilisée comme isotype contrôle d'expérience. Figure 11: Comparison of murine 7C10 mAbs and chimeric C7C10 for inhibition of IGF1 proliferation of MCF-7 cells in vitro. The 9G4 antibody is a murine IgG 1 used as an isotype control experiment.

Figure 12 : Effet comparé des AcM 7C10 et h7CI0 (humanisé 1, noté ici 7H2HM) sur le modèle in vitro de prolifération IGF1 induite des cellules MCF-7. Figure 12: Comparative effect of the mAb 7C10 and h7CI0 (humanized 1, noted here 7H2HM) on the in vitro model of proliferation IGF1 induced MCF-7 cells.

Figure 13 : Effet des AcM 7C10 et h7ClO (humanisé 1, noté ici 7H2HM) sur la transduction du signal induite par F IGF1. La première ligne de spots correspond à la révélation, par un anticorps anti-phospho-tyrosine, de la phosphorylation de la chaîne ss Figure 13: Effect of mAbs 7C10 and h7ClO (humanized 1, noted here 7H2HM) on the signal transduction induced by F IGF1. The first line of spots corresponds to the discovery, by an anti-phospho-tyrosine antibody, of the phosphorylation of the ss chain

immunoprécipitée en présence d'IGFI seul ou d'IGFI additionné des différents anticorps à tester. Le 9G4 et l'IgG 1 sont respectivement les isotypes contrôle des formes 7C10 et h7C10. La seconde ligne de spots correspond à la révélation de la chaîne ss et montre que la quantité déposée dans l'ensemble des puits est parfaitement équivalente. immunoprecipitated in the presence of IGFI alone or IGFI supplemented with the different antibodies to be tested. 9G4 and IgG 1 are respectively control isotypes 7C10 and h7C10. The second line of spots corresponds to the revelation of the ss chain and shows that the quantity deposited in all the wells is perfectly equivalent.

Figure 14 : Séquence de l'ADNc (SEQ ID No. 48), de son brin complémentaire (SEQ ID No. 50) et sa traduction en acides aminés (SEQ ID No. 49), du fragment de PCR amplifié à partir de l'hybridome de souris 7C10 avec les amorces MKV-1 et MKC et qui code pour l'extrémité 3'du peptide leader et 7C10 VL. Figure 14: Sequence of the cDNA (SEQ ID No. 48), its complementary strand (SEQ ID No. 50) and its amino acid translation (SEQ ID No. 49), of the PCR fragment amplified from the mouse hybridoma 7C10 with primers MKV-1 and MKC and which encodes the 3'end of the leader peptide and 7C10 VL.

Figure 15 : Séquence de l'ADNc (SEQ ID No. 51), de son brin complémentaire (SEQ ID No. 53) et sa traduction en acides aminés (SEQ ID No. 52), du fragment de PCR amplifié à partir de l'hybridome de souris 7C10 avec les couples amorces MHV-12 et MHC-1, ou MHV-8 et MHC-1 et qui code pour l'extrémité 3'du peptide leader et 7C10 VH. Figure 15: Sequence of the cDNA (SEQ ID No. 51), its complementary strand (SEQ ID No. 53) and its amino acid translation (SEQ ID No. 52), of the PCR fragment amplified from the mouse hybridoma 7C10 with the primer pairs MHV-12 and MHC-1, or MHV-8 and MHC-1 and which encodes the 3'end of the leader peptide and 7C10 VH.

Figure 16 : Reconnaissance de l'IGF-1 récepteur par l'anticorps chimérique 7C10 (surnageant de culture de cellules cos7 transfectées). Figure 16: Recognition of the IGF-1 receptor by the chimeric antibody 7C10 (culture supernatant of transfected cos7 cells).

Figure 17 : Comparaison de la séquence en acides aminés de 7C10 VL de souris (SEQ ID No. 54) avec celles d'autres anticorps de souris ayant la plus forte homologie de séquence. Figure 17: Comparison of the amino acid sequence of mouse 7C10 VL (SEQ ID No. 54) with those of other mouse antibodies with the highest sequence homology.

La numérotation des acides aminés est celle de Kabat et al. (1991). Les résidus dans les régions charpentes (hors CDRs) qui diffèrent entre 7C10 VL et Kabat sousgroupe II de souris (SEQ ID No. 57) sont soulignés. Un point indique que le résidu est identique à cette position par rapport à la séquence de 7C10 VL. DRBI-4. 3 (SEQ ID No. 55) représente la séquence de la chaîne légère d'un anticorps de souris anti-human MHC CLASS II B-Chain (numéro d'accès dans la banque de données de Kabat est N011794). C94-5B1'CL (SEQ ID No. 56) représente la séquence de la chaîne légère d'un anticorps de souris (numéro d'accès dans la banque de données de Kabat est P019314). The numbering of amino acids is that of Kabat et al. (1991). The residues in the framework regions (excluding CDRs) that differ between 7C10 VL and Kabat mouse subgroup II (SEQ ID No. 57) are underlined. One point indicates that the residue is identical to this position with respect to the 7C10 VL sequence. DRBI-4. 3 (SEQ ID NO: 55) represents the light chain sequence of an MHC CLASS II B-Chain anti-human mouse antibody (accession number in the Kabat databank is N011794). C94-5B1'CL (SEQ ID No. 56) represents the light chain sequence of a mouse antibody (access number in the Kabat databank is P019314).

Figure 18 : Comparaison des séquences en acides aminés de 7C10 VL de souris (SEQ ID No. 54) avec celles de chaînes légères humaines appartenant au sous-groupe II humain de Kabat (SEQ ID No. 60) et ayant la plus forte homologie de séquence. FIG. 18: Comparison of the amino acid sequences of mouse 7C10 VL (SEQ ID No. 54) with those of human light chains belonging to Kabat human subgroup II (SEQ ID No. 60) and having the highest homology of sequence.

Les séquences en acides aminés sont alignées et comparées avec celle de 7C10 VL de souris. Un point indique que le résidu est identique à cette position par rapport à la séquence de 7C10 VL. GM607 (SEQ ID No. 58) représente la séquence de la chaîne légère kappa sécrétée par la lignée lymphoblastoide humaine GM607 (Klobeck et al., Nucleic Acids Res., 12 : 6995-7006,1984a et Klobeck et al., Nature, 309 : 73-76,1984b, le numéro d'accès dans la banque de données Kabat est N011606). DPK15/A19 (SEQ ID No. 59) représente la séquence de la lignée germinale humaine V kappa II. The amino acid sequences are aligned and compared with that of mouse 7C10 VL. One point indicates that the residue is identical to this position with respect to the 7C10 VL sequence. GM607 (SEQ ID No. 58) represents the kappa light chain sequence secreted by the human lymphoblastoid line GM607 (Klobeck et al., Nucleic Acids Res., 12: 6995-7006, 1984a and Klobeck et al., Nature, 309). 73-76.1984b, the access number in the Kabat database is N011606). DPK15 / A19 (SEQ ID No. 59) represents the sequence of the human kappa II V germ line.

Figure 19 : Comparaison des séquences d'acides aminés des régions variables des chaînes légères (VL) de 7C10 de souris (SEQ ID No. 54), de l'anticorps humain GM 607 (SEQ ID No. 58) et des deux versions de 7C10 humanisées 1 et 2 (SEQ ID Nos. 61 et 65). Figure 19: Comparison of the amino acid sequences of the light chain variable (VL) regions of mouse 7C10 (SEQ ID No. 54), human antibody GM 607 (SEQ ID No. 58) and both versions of Humanized 7C10 1 and 2 (SEQ ID Nos. 61 and 65).

Les séquences en acides aminés sont alignées et comparées avec celle de 7C10 VL de souris. Un point indique que le résidu est identique à cette position par rapport à la séquence de 7C10 VL. GM607 représente la séquence de la chaîne légère kappa sécrétée par la lignée lymphoblastoide humaine GM607 (Klobeck et al., 1984a et 1984b, numéro d'accès dans la banque de données Kabat : N011606). The amino acid sequences are aligned and compared with that of mouse 7C10 VL. One point indicates that the residue is identical to this position with respect to the 7C10 VL sequence. GM607 represents the sequence of the kappa light chain secreted by the human lymphoblastoid line GM607 (Klobeck et al., 1984a and 1984b, accession number in the Kabat database: N011606).

Figure 20 : Séquence de l'ADNc (SEQ ID No. 62), de son brin complémentaire (SEQ ID No. 64) et sa traduction en acides aminés (SEQ ID No. 63), du gène construit par assemblage de novo codant pour le peptide leader et la version humanisée 1 de 7C10 VL. Figure 20: Sequence of the cDNA (SEQ ID No. 62), its complementary strand (SEQ ID No. 64) and its translation into amino acids (SEQ ID No. 63), of the gene constructed by de novo assembly coding for the leader peptide and the humanized version 1 of 7C10 VL.

Figure 21 : Séquence de l'ADNc (SEQ ID No. 66), de son brin complémentaire (SEQ ID No. 68) et sa traduction en acides aminés (SEQ ID No. 67), du gène construit par assemblage de novo codant pour le peptide leader et la version humanisée 2 de 7C10 VL. Figure 21: Sequence of the cDNA (SEQ ID No. 66), its complementary strand (SEQ ID No. 68) and its translation into amino acids (SEQ ID No. 67), of the gene constructed by de novo assembly coding for the leader peptide and the humanized version 2 of 7C10 VL.

Figure 22 : Comparaison des séquences en acides aminés de 7C10 VH de souris (SEQ ID No. 69) avec celles de chaînes lourdes de souris humaines appartenant au sousgroupe I (A) souris de Kabat et ayant la plus forte homologie de séquence. Figure 22: Comparison of amino acid sequences of mouse 7C10 VH (SEQ ID No. 69) with those of heavy chains of human mice belonging to subgroup I (A) mouse Kabat and having the highest sequence homology.

La numérotation des acides aminés est celle de Kabat et al. (1991). Les résidus dans les régions charpentes (hors CDRs) qui diffèrent entre 7C10 VH et Kabat sousgroupe I (A) (SEQ ID No. 71) de souris sont soulignés. Un point indique que le résidu est identique à cette position par rapport à la séquence de 7C10 VH souris. AN03'CL The numbering of amino acids is that of Kabat et al. (1991). The residues in the framework regions (excluding CDRs) that differ between 7C10 VH and Kabat subgroup I (A) (SEQ ID No. 71) of mice are underlined. One point indicates that the residue is identical to this position with respect to the 7C10 VH mouse sequence. AN03'CL

(SEQ ID No. 70) représente la séquence de la chaîne lourde d'un anticorps de souris (numéro d'accès dans la banque de données de Kabat : P001289). (SEQ ID NO: 70) represents the heavy chain sequence of a mouse antibody (access number in the Kabat database: P001289).

Figure 23 : Comparaison des séquences en acides aminés de 7C10 VH de souris (SEQ ID No. 69) avec celles de chaînes lourdes humaines appartenant au sous-groupe II humain de Kabat (SEQ ID No. 72) et ayant la plus forte homologie de séquence. FIG. 23: Comparison of the amino acid sequences of mouse 7C10 VH (SEQ ID No. 69) with those of human heavy chains belonging to the human subgroup II of Kabat (SEQ ID No. 72) and having the highest homology of sequence.

Les résidus soulignés font partie des structures canoniques définies par Chothia et al. (1989). Un point indique que le résidu est identique à cette position par rapport à la séquence de 7ClO VH souris. Human VH FURl'CL (SEQ ID No. 73) représente la séquence de la chaîne lourde d'un anticorps humain anti-lamin B IgM/K d'origine autoimmune (Mariette et al., Arthritis and Rheumatism, 36 : 1315-1324,1993 ; numéro d'accès dans Kabat : N020619). Human germline (SEQ ID No. 74) représente la séquence de la lignée germinale 4.22 VH IV humaine (Sanz et al., EMBO. J. 8 : 3741- 3748,1989). The underlined residues are part of the canonical structures defined by Chothia et al. (1989). One point indicates that the residue is identical to this position with respect to the 7ClO VH mouse sequence. Human VH FUR1'CL (SEQ ID NO: 73) represents the heavy chain sequence of an autoimmune anti-laminm B human IgM / K antibody (Mariette et al., Arthritis and Rheumatism, 36: 1315-1324). , 1993, access number in Kabat: N020619). Human germline (SEQ ID No. 74) represents the sequence of the human 4.22 VH IV germline (Sanz et al., EMBO J. 8: 3741-3748, 1989).

Figure 24 : Comparaison des séquences d'acides aminés des régions variables des chaînes lourdes (VH) de 7C10 de souris (SEQ ID No. 69) et des trois versions humanisées par CDR-grafting VH humanisé 1,2 et 3 (respectivement SEQ ID Nos. 75, 79 et 83). FIG. 24: Comparison of the amino acid sequences of the heavy chain (VH) variable regions of mouse 7C10 (SEQ ID No. 69) and of the three versions humanized by CDR-grafting humanized VH 1,2 and 3 (respectively SEQ ID Nos. 75, 79 and 83).

La numérotation des résidus correspond à celle de Kabat. Les séquences sont alignées et comparées à celle de 7C10 VH de souris. Un point indique que le résidu est identique à cette position par rapport à la séquence de 7C10 VH souris. The numbering of the residues corresponds to that of Kabat. The sequences are aligned and compared to that of mouse 7C10 VH. One point indicates that the residue is identical to this position with respect to the 7C10 VH mouse sequence.

Figure 25 : Séquence de l'ADNc (SEQ ID No. 76), de son brin complémentaire (SEQ ID No. 78) et sa traduction en acides aminés (SEQ ID No. 77), du gène construit par assemblage de novo codant pour le peptide leader et la version humanisée 1 de 7C10 VH. Figure 25: Sequence of the cDNA (SEQ ID No. 76), its complementary strand (SEQ ID No. 78) and its translation into amino acids (SEQ ID No. 77), of the gene constructed by de novo assembly coding for the leader peptide and the humanized version 1 of 7C10 VH.

Figure 26 : Séquence de l'ADNc (SEQ ID No. 80), de son brin complémentaire (SEQ ID No. 82) et sa traduction en acides aminés (SEQ ID No. 81), du gène construit par assemblage de novo codant pour le peptide leader et la version humanisée 2 de 7ClO VH. Figure 26: Sequence of the cDNA (SEQ ID No. 80), its complementary strand (SEQ ID No. 82) and its translation into amino acids (SEQ ID No. 81), of the gene constructed by de novo assembly coding for the leader peptide and the humanized version 2 of 7ClO VH.

Figure 27 : Séquence l'ADNc (SEQ ID No. 84), de son brin complémentaire (SEQ ID No. 86) et sa traduction en acides aminés (SEQ ID No. 85), du gène construit par Figure 27: Sequence the cDNA (SEQ ID No. 84), its complementary strand (SEQ ID No. 86) and its amino acid translation (SEQ ID No. 85), of the gene constructed by

assemblage de novo codant pour le peptide leader et la version humanisée 3 de 7C10 VH. de novo assembly encoding the leader peptide and the humanized version 3 of 7C10 VH.

Figure 28 : Comparaison de l'activité de reconnaissance de l'IGF-1 récepteur par l'anticorps chimérique 7C10 (dénommé"C7C10") et sa version humanisée 1 (7C10 hum 1) en ELISA. Figure 28: Comparison of the recognition activity of the IGF-1 receptor by the chimeric antibody 7C10 (called "C7C10") and its humanized version 1 (7C10 hum 1) in ELISA.

Figure 29 : Influence sur l'activité de reconnaissance de l'IGF-1 récepteur des versions humanisées 1 et 2 de la chaîne légère de l'anticorps 7C10 en ELISA. Figure 29: Influence on the recognition activity of the IGF-1 receptor of humanized versions 1 and 2 of the light chain of antibody 7C10 in ELISA.

Figure 30 : Comparaison de l'activité de reconnaissance de l'IGF-1 récepteur par l'anticorps chimérique 7C10 et trois versions humanisées de la chaîne lourde (7C10 hum 1,2 et 3) en association avec 7C10 VL humanisée 2 en ELISA. Figure 30: Comparison of the recognition activity of the IGF-1 receptor by the chimeric antibody 7C10 and three humanized versions of the heavy chain (7C10 hum 1,2 and 3) in combination with 7C10 humanized VL 2 in ELISA.

Figure 31 : Activité antitumorale de l'anticorps 7C10 dans un modèle orthotopique A549. Figure 31: Antitumor activity of the antibody 7C10 in an orthotopic model A549.

Figures 32A, 32B, 32C et 32D : Etude de l'ADCC observée au niveau de cellules A549 et MCF-7 cultivées durant 4 heures en présence de l'anticorps 7H2HM (respectivement Figures 32C et 32D). L'anticorps h4D5 est utilisé en parallèle comme témoin positif d'expérience pour les cellules A549 et MCF-7 (respectivement Figures 32A et 32B). 32A, 32B, 32C and 32D: Study of the ADCC observed at A549 and MCF-7 cells cultured for 4 hours in the presence of the 7H2HM antibody (respectively Figures 32C and 32D). The h4D5 antibody is used in parallel as a positive control for the A549 and MCF-7 cells (Figures 32A and 32B, respectively).

Figures 33A, 33B et 33C : Effet des anticorps 7C10 et 7H2HM sur le cycle cellulaire des cellules MCF-7. Figures 33A, 33B and 33C: Effect of 7C10 and 7H2HM antibodies on the cell cycle of MCF-7 cells.

La figure 33A représente la proportion de cellules MCF-7 en phase GO/G1, S et G2/M en absence d'IGFl, exprimée en pourcentage de cellules MCF-7 totales observées significative. Figure 33A shows the proportion of MCF-7 cells in the GO / G1, S and G2 / M phase in the absence of IGF1, expressed as a percentage of observed total MCF-7 cells significant.

La figure 33B représente la proportion de cellules MCF-7 en phase GO/G1, S et G2/M en présence d'IGFl, exprimée en pourcentage de cellules MCF-7 totales observées. FIG. 33B represents the proportion of MCF-7 cells in the GO / G1, S and G2 / M phase in the presence of IGF1, expressed as a percentage of total MCF-7 cells observed.

La figure 33C représente la proportion de cellules MCF-7 en phase S (8) et G2/M () exprimée en pourcentage de cellules MCF-7 totales observées, en présence des composés indiqués sur la figure comparée à un témoin contrôle en absence d'IGFI ( 0 ). FIG. 33C represents the proportion of MCF-7 cells in the S (8) and G2 / M () phase expressed as a percentage of total MCF-7 cells observed, in the presence of the compounds indicated in the figure compared to a control control in the absence of IGFI (0).

Figure 34 : Effet comparé des anticorps 7C10 et 7H2HM sur la croissance des cellules A549. Figure 34: Comparative effect of 7C10 and 7H2HM antibodies on growth of A549 cells.

Figures 35A et 35B : Etude de la synergie de l'anticorps 7H2HM associé à la navelbine (NA) sur le modèle A549 in vivo, comparée aux témoins de contrôle. La figure 35A représente l'évolution du volume de la tumeur implantée en fonction du traitement effectué à partir du commencement du traitement et sur environ 50 jours (figure 35A). La Figure 35B représente de manière particulière les résultats obtenus pour cette évolution comparée à environ 48 jours. Dans cette figure, les résultats obtenus avec l'anticorps 7C10 ont été introduits à titre de comparaison (les astérisques (*) correspondent à la comparaison groupe contrôle/groupe (7CIO + Na) ou groupe contrôle/groupe (7H2HM + Na) dans un test t). FIGS. 35A and 35B: Study of the synergism of the navelbine-associated antibody 7H2HM (NA) on the A549 model in vivo, compared with the control controls. Figure 35A shows the evolution of implanted tumor volume as a function of the treatment performed from the beginning of treatment and over approximately 50 days (Figure 35A). Figure 35B shows in particular the results obtained for this evolution compared to approximately 48 days. In this figure, the results obtained with the 7C10 antibody were introduced for comparison (the asterisks (*) correspond to the comparison control group / group (7CIO + Na) or group control / group (7H2HM + Na) in a test t).

Figure 36 : Etude de l'effet des anticorps 7C10 et 7H2HM sur l'apoptose. Figure 36: Study of the effect of 7C10 and 7H2HM antibodies on apoptosis.

Cette figure représente la potentialisation de l'effet de la doxorubicine par les

anticorps 7C 10 et 7H2HM (doxorubicine 2 ug/ml). This figure represents the potentiation of the effect of doxorubicin by

antibodies 7C and 7H2HM (doxorubicin 2 μg / ml).

Exemple 1. Génération et sélection de l'anticorps monoclonal (AcM) murin. Example 1. Generation and Selection of Mouse Monoclonal Antibody (mAb).

Dans le but de générer des AcM dirigés spécifiquement contre l'IGF-IR et ne reconnaissant pas l'IR, un protocole comprenant 6 étapes de criblage a été envisagé. In order to generate mAbs directed specifically against IGF-IR and not recognizing IR, a protocol comprising 6 screening steps has been envisaged.

Il consistait à : - immuniser des souris avec l'IGF-IR recombinant, pour générer des hybridomes, - cribler les surnageant de culture par ELISA sur la protéine recombinante ayant servi à l'immunisation, - tester tous les surnageant d'hybridomes positifs en ELISA sur le récepteur natif surexprimé à la surface de cellules tumorales MCF-7, - évaluer les surnageant d'hybridomes positifs dans les deux premiers criblages en terme de reconnaissance différentielle de l'IGF-IR et de l'IR sur des cellules d'insectes infectées avec des bacullovirus exprimant respectivement l'IGF-IR ou l'IR, - vérifier que les anticorps sélectionnés à cette étape étaient capables d'inhiber in vitro la prolifération IGF1 induite des cellules MCF-7, - s'assurer de l'activité in vivo, chez la souris nude du candidat retenu en terme d'impact sur la croissance de la tumeur MCF-7. It consisted in: - immunizing mice with recombinant IGF-IR, to generate hybridomas, - screening culture supernatants by ELISA on the recombinant protein used for immunization, - testing all hybridoma supernatants positive for ELISA on the native receptor overexpressed on the surface of MCF-7 tumor cells, - evaluate the hybridoma supernatants positive in the first two screens in terms of differential recognition of IGF-IR and IR on cells of insects infected with baculloviruses respectively expressing IGF-IR or IR, - verify that the antibodies selected at this stage were able to inhibit in vitro IGF1 proliferation induced MCF-7 cells, - make sure the in vivo activity, in the nude mouse of the candidate selected in terms of impact on the growth of the MCF-7 tumor.

L'ensemble de ces différentes étapes et des résultats obtenus sera brièvement décrit ci-après dans l'exemple 1. All of these different steps and the results obtained will be briefly described below in Example 1.

Pour l'étape d'immunisation, des souris ont été injectées deux fois, par voie sous-cutanée avec 8 ug d'IGF-IR recombinant. Trois jours avant la fusion des cellules de la rate avec les cellules du myélome murin Sp20Agl4, les souris ont été stimulées

par une injection intra-veineuse de 3 gg du récepteur recombinant. Quatorze jours après la fusion, les surnageant d'hybridomes ont été criblés par ELISA, sur des plaques sensibilisées par l'IGF-IR recombinant. Les hybridomes dont les surnageant ont été trouvés positifs ont été conservés et amplifiés avant d'être testés au FACScan afin de vérifier que les anticorps produits étaient également capables de reconnaître l'IGF-IR natif. Pour ce faire, des cellules MCF-7 issues d'une tumeur du sein estrogène dépendante et surexprimant l'IGF-IR ont été incubées avec chacun des surnageant de culture produits par les hybridomes sélectionnés en ELISA. Les complexes récepteur natif/AcM à la surface de la cellule ont été révélés par un anticorps secondaire antiespèce couplé à un fluorochrome. Les figures 3A à 3C montrent un histogramme type obtenu avec le surnageant de l'hybridome 7C10 (figure 3C) comparé à un marquage cellules seules + anticorps secondaire (figure 3A) ou à un marquage utilisant un isotype contrôle (figure 3B). For the immunization step, mice were injected twice, subcutaneously with 8 μg of recombinant IGF-IR. Three days before fusion of spleen cells with Sp20Agl4 murine myeloma cells, the mice were stimulated

by intravenous injection of 3 g of the recombinant receptor. Fourteen days after fusion, the hybridoma supernatants were screened by ELISA on plates sensitized with recombinant IGF-IR. Hybridomas whose supernatants were found to be positive were stored and amplified prior to FACScan testing to verify that the produced antibodies were also capable of recognizing native IGF-IR. To this end, MCF-7 cells derived from an estrogen-dependent and IGF-IR overexpressing breast tumor were incubated with each of the culture supernatants produced by the hybridomas selected by ELISA. The native receptor / mAb complexes on the cell surface were revealed by a secondary antibody antispecies coupled to a fluorochrome. FIGS. 3A to 3C show a standard histogram obtained with the supernatant of the hybridoma 7C10 (FIG. 3C) compared with a single cell + secondary antibody labeling (FIG. 3A) or with a labeling using a control isotype (FIG. 3B).

A ce stade de la sélection, seuls les hybridomes sécrétant des AcM reconnaissant à la fois le récepteur recombinant et le récepteur natif ont été sélectionnés et clonés. Les AcM sécrétés par ces hybridomes ont été produits puis purifiés avant d'être testés au FACScan, selon la méthode décrite ci-dessus, sur des cellules d'insectes Sf9 exprimant l'IGF-IR ou l'IR afin d'éliminer les hybridomes reconnaissant à la fois les deux récepteurs. La figure 4A montre un recouvrement total des histogrammes 1,2, 3 correspondant respectivement aux cellules non infectées + anticorps secondaires (1), aux cellules non infectées marquées par l'cIR3 (2) et aux cellules non infectées marquées par un anticorps anti-IR (3). Ce premier résultat montre bien l'absence d'IGFIR et d'IR détectables à la surface de ces cellules d'insecte non infectées. La figure 4B montre un marquage de cellules infectées par un bacullovirus exprimant l'IGF-IR. Dans cette seconde figure l'aIR3, utilisé comme témoin positif, marque bien comme attendu les cellules (pic 2), alors que l'anti-IR (pic 3) se superpose au pic de cellules seules. Enfin, en figure 4C, il est montré que l'anti-IR marque bien comme attendu les cellules At this stage of selection, only those hybridomas secreting mAbs recognizing both the recombinant and native receptors were selected and cloned. The mAbs secreted by these hybridomas were produced and then purified before being tested with FACScan, according to the method described above, on Sf9 insect cells expressing IGF-IR or IR in order to eliminate hybridomas. recognizing both receivers. FIG. 4A shows a total overlap of histograms 1,2, 3 corresponding respectively to the uninfected cells + secondary antibodies (1), to the uninfected cells labeled with cIR3 (2) and to the uninfected cells labeled with an anti-human antibody. IR (3). This first result clearly shows the absence of detectable IGFIR and IR on the surface of these uninfected insect cells. Figure 4B shows a stain of cells infected with a bacullovirus expressing IGF-IR. In this second figure, aIR3, used as a positive control, scores well as expected cells (peak 2), while the anti-IR (peak 3) is superimposed on the peak of single cells. Finally, in FIG. 4C, it is shown that the anti-IR marks well as expected the cells

Sf9 exprimant l'IR (pic 3), mais de manière inattendue, FaIR3 décrit dans la littérature comme spécifique de l'IGF-IR, semble reconnaître également FIR (pic 2). Sf9 expressing IR (peak 3), but unexpectedly, FaIR3 described in the literature as specific to IGF-IR, also seems to recognize FIR (peak 2).

Les résultats obtenus dans ce troisième système de criblage sont résumés dans le tableau 1 et montrent la génération d'un AcM : le 7C10, satisfaisant aux critères de reconnaissance de l'IGF-IR et de non reconnaissance de l'IR. L'isotypage de l'AcM 7C10 a montré qu'il s'agissait d'une IgGl. The results obtained in this third screening system are summarized in Table 1 and show the generation of a mAb: 7C10, satisfying the criteria for recognition of IGF-IR and non-recognition of IR. Isotyping of mAb 7C10 showed that it was IgG1.

TABLEAU 1 : Réactivité comparée d'AcM 7C10 sur des cellules d'insectes Sf9 exprimant l'IGF-IR ou l'IR

TABLE 1 Comparative Reactivity of AcM 7C10 on Sf9 Insect Cells Expressing IGF-IR or IR

<tb>
<tb> MFI
<tb> (Moyenne <SEP> de <SEP> l'intensité <SEP> de <SEP> fluorescence)
<tb> Cellules <SEP> non <SEP> infectées <SEP> Cellules <SEP> IGF1R <SEP> + <SEP> Cellules <SEP> IR <SEP> +
<tb> Cellules <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 7
<tb> Anti-IR <SEP> 4,6 <SEP> 9 <SEP> 91
<tb> Anti-IGF-IR <SEP> (atR3) <SEP> 9 <SEP> 35 <SEP> 32
<tb> EC2 <SEP> 8 <SEP> 13 <SEP> 11
<tb> Anti-souris <SEP> FITC <SEP> 4,3 <SEP> 9 <SEP> 13
<tb> Milieu <SEP> UltraCulture <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11
<tb> 15B9 <SEP> 7,5 <SEP> 25 <SEP> 77,8
<tb> 9F5D <SEP> 8 <SEP> 41 <SEP> 40
<tb> 13G5 <SEP> 7,8 <SEP> 37 <SEP> 24
<tb> 7C10 <SEP> 8,6 <SEP> 49 <SEP> 13
<tb> <Tb>
<tb> MFI
<tb> (Mean <SEP> of <SEP> intensity <SEP> of <SEP> fluorescence)
<tb> Infected <SEP> No <SEP> Cells <SEP><SEP> IGF1R <SEP> + <SEP> Cells <SEP> IR <SEP> + Cells
<tb> Cells <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 7
<tb> Anti-IR <SEP> 4.6 <SEP> 9 <SEP> 91
<tb> Anti-IGF-IR <SEP> (atR3) <SEP> 9 <SEP> 35 <SEP> 32
<tb> EC2 <SEP> 8 <SEP> 13 <SEP> 11
<tb> Anti-mouse <SEP> FITC <SEP> 4.3 <SEP> 9 <SEP> 13
<tb> Medium <SEP> UltraCulture <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11
<tb> 15B9 <SEP> 7.5 <SEP> 25 <SEP> 77.8
<tb> 9F5D <SEP> 8 <SEP> 41 <SEP> 40
<tb> 13G5 <SEP> 7.8 <SEP> 37 <SEP> 24
<tb> 7C10 <SEP> 8.6 <SEP> 49 <SEP> 13
<Tb>

Les deux derniers criblages prévus pour la sélection de l'AcM consistaient à vérifier que ce dernier était bien capable d'inhiber la prolifération cellulaire induite par l'IGF-1 in vitro et in vivo sur la lignée cellulaire MCF-7. The last two screens for MAb selection were to verify that the MAb was able to inhibit IGF-1-induced cell proliferation in vitro and in vivo on the MCF-7 cell line.

Pour la sélection in vitro, les cellules MCF-7 ont été ensemencées, déprivées en sérum de veau foetal, puis incubées en présence de concentrations croissantes d'IGF-1 (de 1 à 50 ng/ml) en présence ou en absence de l'anticorps 7CIO à tester additionné à une concentration finale de 10 llglml. Dans cette expérience, l'AcM commercial aIR3 a été introduit comme témoin positif et l'AcM 7G3 (isolé parallèlement au 7C10 et ne reconnaissant pas le récepteur natif) comme isotype contrôle. La prolifération cellulaire est estimée par suivi au compteur ss de l'incorporation de thymidine tritiée par les cellules. Les résultats sont exprimés en index de prolifération. Les données présentées dans la figure 5 montrent que l'IGFI est capable de stimuler de façon dose dépendante la prolifération des cellules MCF-7. L'AcM aIR3, utilisé comme contrôle positif inhibe For in vitro selection, MCF-7 cells were seeded, released into fetal calf serum, and then incubated in the presence of increasing concentrations of IGF-1 (1 to 50 ng / ml) in the presence or absence of 7C10 antibody to be tested added to a final concentration of 10 μg / ml. In this experiment, the commercial mAb aIR3 was introduced as a positive control and the mAb 7G3 (isolated parallel to 7C10 and not recognizing the native receptor) as control isotype. The cell proliferation is estimated by monitoring the counter ss of the incorporation of tritiated thymidine by the cells. The results are expressed in proliferation index. The data presented in Figure 5 show that IGFI is able to stimulate the proliferation of MCF-7 cells in a dose-dependent manner. MAb aIR3, used as a positive control inhibits

complètement la prolifération des cellules MCF-7 induite par l'IGF-l. De la même manière, l'AcM 7C10 est capable d'inhiber significativement la croissance des cellules MCF-7 induite par l'IGF-l. Enfin, l'AcM 7G3 utilisé comme contrôle isotypique s'avère bien, comme attendu, sans effet sur la croissance cellulaire tumorale in vitro de la cellule MCF-7. completely proliferation of IGF-1-induced MCF-7 cells. Similarly, mAb 7C10 is able to significantly inhibit IGF-1-induced growth of MCF-7 cells. Finally, the mAb 7G3 used as an isotypic control proves to be well, as expected, without any effect on the cell tumor growth in vitro of the MCF-7 cell.

La sélection in vivo a été effectuée dans un modèle de tumeur établie. Pour ce faire, des souris nudes ont reçu un implant sous-cutané d'estrogène à libération lente,

indispensable à la prise de la tumeur dans un modèle murin. Vingt quatre heures après implantation des estrogènes, 5. 106 cellules MCF-7 sont greffées sur le flanc droit de la souris en sous-cutané. Cinq jours après cette greffe cellulaire les tumeurs sont mesurables et des lots de 6 souris sont constitués au hasard. Le traitement des souris est effectué deux fois par semaine, durant 5 à 6 semaines, à la dose de 250 ug/dose/souris. In vivo selection was performed in an established tumor model. To do this, nude mice received a subcutaneous estrogen implant with slow release,

essential for taking the tumor in a mouse model. Twenty four hours after implantation of the estrogens, 5, 106 MCF-7 cells are grafted on the right flank of the mouse subcutaneously. Five days after this cell transplant tumors are measurable and batches of 6 mice are randomly constituted. The treatment of the mice is carried out twice a week for 5 to 6 weeks at a dose of 250 μg / dose / mouse.

Dans le groupe contrôle, les souris sont traitées de la même façon avec un isotype contrôle murin. Les résultats présentés dans la figure 6A montrent une inhibition très significative de la croissance tumorale induite par l'anticorps 7C10. Cette activité est particulièrement inattendue si l'on se réfère aux données disponibles concernant l'aIR3, toujours utilisé comme référence dans le domaine du récepteur à l'IGFl, et connu pour n'avoir aucune activité in vivo sur la croissance des tumeurs estrogènes dépendantes (voir figure 6B). De même, comparé aux résultats obtenus avec l'anticorps recombinant scFv-Fc dérivé de l'AcM murin 1H7 (voir figure 6C), l'AcM 7C10 est beaucoup plus efficace dans l'inhibition in vivo de la croissance des cellules MCF-7. In the control group, the mice are treated in the same way with a murine control isotype. The results presented in FIG. 6A show a very significant inhibition of the tumor growth induced by the 7C10 antibody. This activity is particularly unexpected when referring to available data for aIR3, still used as a reference in the IGF1 receptor domain, and known to have no in vivo activity on the growth of estrogen-dependent tumors. (see Figure 6B). Similarly, compared to the results obtained with the scFv-Fc recombinant antibody derived from the murine mAb 1H7 (see FIG. 6C), the mAb 7C10 is much more effective in the in vivo inhibition of the growth of the MCF-7 cells. .

Exemple 2. Comparaison de l'effet du 7C10 et du tamoxifen sur la croissance in vivo de la tumeur MCF-7
Dans le but de déterminer la puissance du traitement par l'anticorps 7C10 dans le cadre du cancer du sein estrogène dépendant, le 7C10 a été comparé au tamoxifen composé couramment utilisé pour le traitement du carcinome mammaire dans le cadre des formes évoluées avec progression locale et/ou métastatiques et dans le cadre de la prévention des récidives (voir VIDAL 2000, pages 1975-1976). Example 2. Comparison of the Effect of 7C10 and Tamoxifen on the In Vivo Growth of the MCF-7 Tumor
In order to determine the potency of 7C10 antibody treatment in estrogen-dependent breast cancer, 7C10 was compared to the compound tamoxifen commonly used for the treatment of breast carcinoma in locally advanced and advanced forms. metastatic and in the context of the prevention of recurrence (see VIDAL 2000, pages 1975-1976).

Dans les cancers du sein hormone-dépendants, il existe une corrélation significative entre l'expression des récepteurs aux estrogènes (ER) et celle de l'IGF-IR (Surmacz E. et al., Breast Cancer Res. Treat., Feb., 47 (3) : 255-267,1998). Par ailleurs, il In hormone-dependent breast cancers, there is a significant correlation between estrogen receptor (ER) and IGF-IR expression (Surmacz, et al., Breast Cancer Res., Treat., Feb. , 47 (3): 255-267, 1998). Moreover, he

semble que les estrogènes (E2) agissent en synergie avec l'IOF1 (parfois noté IGF-I ou IGFI) pour stimuler la prolifération cellulaire. Il a en effet été montré qu'un traitement par E2 augmentait d'environ 10 fois le taux de mRNA de l'IGF-IR ainsi que le niveau d'expression de la protéine (Lee A. V. et al., Mol. Endocrinol., May, 13 (5) : 787-796, 1999). Cette augmentation se traduit par une augmentation significative de la phosphorylation de l'IGF-IR. De plus, les E2 stimulent significativement l'expression de l'IRS-1 ("IRS-1"pour"Insulin Receptor Substrat-1") qui est l'un des substrats de l'IGF-IR phosphorylé. estrogens (E2) appear to work synergistically with IOF1 (sometimes referred to as IGF-I or IGFI) to stimulate cell proliferation. It has indeed been shown that treatment with E2 increased by approximately 10 times the mRNA level of IGF-IR as well as the level of expression of the protein (Lee AV et al., Mol. Endocrinol., May, 13 (5): 787-796, 1999). This increase results in a significant increase in phosphorylation of IGF-IR. In addition, E2 significantly stimulate the expression of IRS-1 ("IRS-1" for "Insulin Receptor Substrate-1") which is one of the substrates of phosphorylated IGF-IR.

Le tamoxifen est largement utilisé depuis plusieurs années en hormonothérapie pour le traitement des patientes atteintes de cancers de sein E2-dépendants (Forbes J. F., Semin. Oncol., Feb., 24 (l. Suppl. l) : Sl-5-S1-19, 1997). Cette molécule entre en compétition avec l'estradiol et inhibe la fixation de celui-ci à son récepteur (Jordan V. C., Breast Cancer Res. Treat., 31 (1) : 41-52,1994). Il a par ailleurs été démontré que le tamoxifen est capable d'inhiber la prolifération IGF-IR dépendante en inhibant l'expression du récepteur et sa phosphorylation (Guvakova M. A. et al., Cancer Res., July 1,57 (13) : 2606-2610,1997). L'ensemble de ces données semble indiquer que l'IGFIR est un important médiateur de la prolifération induite par l'interaction E2/ER. Tamoxifen has been widely used for many years in hormone therapy for the treatment of patients with E2-dependent breast cancer (Forbes JF, Semin Oncol., Feb., 24 (1 Suppl.1): Sl-5-S1- 19, 1997). This molecule competes with estradiol and inhibits its binding to its receptor (Jordan V.C., Breast Cancer Res. Treat., 31 (1): 41-52, 1994). Tamoxifen has also been shown to inhibit IGF-IR dependent proliferation by inhibiting receptor expression and phosphorylation (Guvakova MA et al., Cancer Res., July 1, 57 (13): 2606). -2,610.1997). All of these data seem to indicate that IGFIR is an important mediator of proliferation induced by the E2 / ER interaction.

L'utilisation à long terme du tamoxifen étant associée avec une augmentation significative du risque de cancer de l'endomètre (Fisher et al., J. of National Cancer Institute, 86,7 : 527-537, 1994 ; VIDAL 2000,1975-1976) et de récidive collatérale de cancer du sein E2 indépendants (Li C. I. et al., J Natl. Cancer Inst., July 4,93 (13) : 1008- 1013,2001). Dans ce contexte, une comparaison de l'effet antitumoral in vivo de l'anticorps 7C10 et du tamoxifen a été effectuée sur le modèle MCF-7 afin de déterminer la part de l'activité liée à l'IGF-IR dans la prolifération ER médiée. Pour ce faire, 7. 106 cellules MCF-7 ont été implantées en sc (sous-cutanée) chez des souris nude, 24 heures après implantation chez ces mêmes souris d'un granule d'estradiol à libération prolongée (0,72 mg/comprimé libéré sur 60 jours), indispensable à l'établissement de toute tumeur humaine E2 dépendante chez cette espèce animale. Cinq jours après cette implantation, les tumeurs sont mesurées et des groupes de 6 souris constitués. Ces groupes sont respectivement traités avec 1) l'anticorps 7C10 injecté en ip (intra péritonéal) à raison de 250 f. 1g/souris, 2 fois par semaine, 2) 10 f. 1g de tamoxifen The long-term use of tamoxifen is associated with a significant increase in the risk of endometrial cancer (Fisher et al., J. of National Cancer Institute, 86, 7: 527-537, 1994; VIDAL 2000,1975- 1976) and collateral recurrence of independent E2 breast cancer (Li CI et al., J Natl Cancer Inst., July 4.93 (13): 1008-1013,2001). In this context, a comparison of the in vivo antitumor effect of 7C10 antibody and tamoxifen was performed on the MCF-7 model to determine the share of IGF-IR-related activity in ER proliferation. mediated. To do this, 7. 106 MCF-7 cells were implanted in sc (subcutaneous) in nude mice, 24 hours after implantation in these same mice of an extended-release estradiol granule (0.72 mg / ml). tablet released over 60 days), essential for the establishment of any human tumor E2 dependent in this animal species. Five days after this implantation, the tumors are measured and groups of 6 mice are constituted. These groups are respectively treated with 1) 7C10 antibody injected ip (intra peritoneal) at 250 f. 1g / mouse, 2 times a week, 2) 10 f. 1g tamoxifen

repris dans en PBS contenant 3 % hydroxypropyl-cellulose (HPC) ip ou 3) le solvant dans lequel est repris le tamoxifen (hydroxypropyl cellulose). Le tamoxifen est administré quotidiennement pendant 4 semaines excepté le week-end. Les souris traitées avec l'ACM 7C10 reçoivent également quotidiennement une injection de PBS 3 % HPC. Une étude a préalablement été effectuée pour vérifier que le solvant seul est sans influence sur la croissance tumorale. taken up in PBS containing 3% hydroxypropyl-cellulose (HPC) ip or 3) the solvent in which is taken tamoxifen (hydroxypropyl cellulose). Tamoxifen is given daily for 4 weeks except weekends. Mice treated with ACM 7C10 are also injected daily with 3% HPC PBS. A study was previously carried out to verify that the solvent alone has no influence on tumor growth.

Les résultats présentés dans la figure 7 montrent que l'ACM 7C10 est capable d'inhiber significativement la croissance de la tumeur MCF-7 in vivo (les astérisques (*) correspondent à la comparaison groupe contrôle/groupe 7C10 dans un test t). De façon surprenante, l'anticorps 7C10 semble être significativement plus efficace que le tamoxifen pour l'inhibition de la croissance tumorale (les ronds ( ) correspondent à la comparaison groupe Tamoxifen/groupe 7C10 dans un test t) suggérant que ce type de traitement par ACM puisse se substituer au traitement par le tamoxifen.

The results presented in Figure 7 show that ACM 7C10 is able to significantly inhibit the growth of MCF-7 tumor in vivo (the asterisks (*) correspond to the control group / 7C10 group comparison in a t test). Surprisingly, the 7C10 antibody appears to be significantly more effective than tamoxifen in inhibiting tumor growth (the rounds () correspond to the Tamoxifen / 7C10 group comparison in a t) test suggesting that this type of treatment is ACM can replace tamoxifen treatment.

Exemple 3. Mise en évidence de l'activité antitumorale de l'AcM 7C10 in vivo sur des tumeurs humaines de différentes origines a) Activité in vivo de l'anticorps 7C10 dans trois modèles tumoraux Afin de généraliser l'activité de l'anticorps 7Cl0 à d'autres tumeurs exprimant le récepteur à l'IGFl, le 7C10 a été testé in vivo dans un modèle de tumeur de la prostate androgène indépendant DU145, dans un modèle d'ostéosarcome SKES-1 et dans un modèle de tumeur du poumon non à petites cellules A549. Le protocole est similaire à celui décrit ci-dessus pour MCF-7 et les résultats présentés figures 8A à 8C montrent une activité significative de cet ACM dans les 3 modèles tumoraux. L'activité observée dans le modèle de tumeur de la prostate est à noter tout particulièrement dans la mesure où la simple chaîne scFv de l'ACM 1H7 est sans activité dans un modèle de tumeur de la prostate androgène indépendante (Li et al., 2000). b) Activité in vivo de l'anticorps 7C10 dans un modèle orthotopique A549. Example 3 Demonstration of the anti-tumor activity of the mAb 7C10 in vivo on human tumors of different origins a) In vivo activity of the antibody 7C10 in three tumor models In order to generalize the activity of the antibody 7Cl0 to other tumors expressing the IGF1 receptor, 7C10 was tested in vivo in a DU145 independent androgenic prostate tumor model, in a SKES-1 osteosarcoma model and in a non-lung tumor model. small cell A549. The protocol is similar to that described above for MCF-7 and the results shown in FIGS. 8A to 8C show a significant activity of this ACM in the 3 tumor models. The activity observed in the prostate tumor model is particularly noteworthy since the single scFv chain of ACM 1H7 is inactive in an independent androgenic prostate tumor model (Li et al., 2000). ). b) In vivo activity of the 7C10 antibody in an orthotopic A549 model.

Les modèles de xénogreffe classique comme décrit ci-dessus ne permettent pas l'étude des drogues sur la dissémination métastatique. En effet, les tumeurs implantées en s. c. (sous-cutané) restent localisées au site d'injection et ne sont donc pas réellement le reflet de la situation chez l'homme. Afin d'évaluer notre anticorps dans un modèle plus proche de la réalité, les cellules A549 ont été implantées en localisation intra Classic xenograft models as described above do not allow the study of drugs on metastatic spread. Indeed, tumors implanted in s. c. (subcutaneous) remain localized at the injection site and therefore do not really reflect the situation in humans. In order to evaluate our antibody in a model closer to reality, A549 cells were implanted in intra

pleurale. Ce modèle, bien décrit (Clin. Cancer Res. 2000 Jan ; 6 (1) : 297-304) permet d'observer une dissémination métastatique proche de celle observée chez l'homme avec des métastases médiastinales, pulmonaires cardiaques et vertébrales. Dans l'étude qui a été effectuée, 106 cellules A549 ont été injectées en intra pleurale chez des souris nudes femelles. 7 jours après l'implantation, les souris ont été réparties en 2 lots de 22. L'un de ces lots a reçu une dose d'appel de 500 g/souris et a ensuite été traité deux fois par semaine à raison de 250 Jlg de 7C10/dose. Le second lot a été traité selon le même schéma avec l'isotype contrôle 9G4. La figure 31 montre un délai significatif de la survie chez les souris traitées avec l'ACM 7C10 indiquant que cet anticorps est capable d'avoir une action sur la dissémination métastatique.

Pleural. This well-described model (Clin Cancer Res, 2000 Jan, 6 (1): 297-304) shows a metastatic spread similar to that observed in humans with mediastinal, pulmonary and vertebral metastases. In the study that was performed, 106 A549 cells were injected intratracheally into female nude mice. 7 days after implantation, the mice were divided into 2 lots of 22. One of these lots received a 500 g / mouse dose and was then treated twice weekly at 250 μg / day. 7C10 / dose. The second batch was treated according to the same scheme with the 9G4 control isotype. Figure 31 shows a significant delay in survival in ACM 7C10 treated mice indicating that this antibody is capable of acting on metastatic spread.

Exemple 4. Comparaison de l'AcM 7CIO avec la navelbine in vivo ; effet d'une co-administration des deux traitements
La navelbine est un composé de chimiothérapie indiqué dans le cancer du poumon non à petites cellules et dans le cancer du sein métastatique. L'étude comparative du 7C10 et de la navelbine et la synergie éventuelle entre les deux produits a été étudiée sur le modèle tumoral A549. Pour cette étude 5. 106 cellules A549 ont été greffées en sous-cutané sur le flanc droit de la souris. Cinq jours après la greffe cellulaire, les tumeurs sont mesurables et les traitements avec l'AcM et/ou la navelbine sont commencés. La dose d'AcM est toujours de 250 g/dose/souris, deux fois par semaine, en intra-péritonéale. Concernant la navelbine, elle sera administrée à la dose maximale tolérée par la souris soit 10 mg/kg, en intra-péritonéale. Pour ce traitement trois injections seront effectuées à 7 jours d'intervalle. Lors des co-administrations, les deux produits sont mélangés avant injection. Example 4. Comparison of mAb 7CIO with navelbine in vivo; effect of co-administration of both treatments
Navelbine is a chemotherapy compound indicated for non-small cell lung cancer and metastatic breast cancer. The comparative study of 7C10 and navelbine and the possible synergy between the two products was studied on the A549 tumor model. For this study 5. 106 A549 cells were grafted subcutaneously on the right flank of the mouse. Five days after the cell transplant, tumors are measurable and treatments with mAb and / or navelbine are started. The dose of mAb is always 250 g / dose / mouse, twice a week, intraperitoneally. Regarding navelbine, it will be administered at the maximum dose tolerated by the mouse, ie 10 mg / kg, intraperitoneally. For this treatment, three injections will be performed 7 days apart. In co-administrations, both products are mixed before injection.

Les résultats présentés dans la figure 9 montrent de façon surprenante que, dans ce modèle, l'anticorps 7C10 est aussi actif que le traitement classique par la navelbine. The results presented in FIG. 9 surprisingly show that, in this model, the 7C10 antibody is as active as the conventional navelbine treatment.

Une synergie très significative des deux produits est également observée avec cinq souris sur sept ne présentant pas de tumeurs mesurables à J72. A very significant synergy of the two products is also observed with five mice out of seven not having tumors measurable on J72.

Exemple 5. Etude de l'inhibition in vitro de la croissance IGF2 induite des tumeurs MCF-7
Comme signalé précédemment, l'IGF-IR est surexprimé par de nombreuses tumeurs mais il a été décrit par ailleurs que dans une bonne partie des cancers du sein et Example 5. Study of In Vitro Inhibition of IGF2 Growth Induced by MCF-7 Tumors
As previously reported, IGF-IR is overexpressed by many tumors but it has been described elsewhere that in a good part of breast and

du côlon notamment, le signal de prolifération est donné à ce récepteur via l'IGF2 (parfois noté IGF-II ou IGFII). Il est donc primordial de s'assurer que l'AcM 7C10 est également capable d'inhiber la croissance IGF2 induite sur la tumeur MCF-7 in vitro. Pour ce faire, des cellules ont été ensemencées en plaque 96 puits, déprivées de sérum de veau foetal et stimulées par l'addition de 200 ng d'IGF2 par ml final de milieu, en présence et en absence des AcM à tester introduits à une concentration de 10 ug/ml. Les résultats présentés dans la figure 10 montrent que l'IGF2, comme l'IGF1 stimule significativement la croissance des cellules MCF-7. L'addition d'un isotype contrôle, le 9G4 reste sans effet sur cette stimulation. Comme déjà décrit par De Léon et al. (Growth Factors, 6 : 327-334,1992), aucun effet n'est observé lors de l'addition de l'AcM aIR3. of the colon in particular, the proliferation signal is given to this receptor via IGF2 (sometimes called IGF-II or IGFII). It is therefore essential to ensure that mAb 7C10 is also able to inhibit IGF2 growth induced on the MCF-7 tumor in vitro. For this purpose, cells were seeded into a 96-well plate, which was deprived of fetal calf serum and stimulated by the addition of 200 ng of IGF2 per final ml of medium, in the presence and in the absence of the mAbs to be tested introduced at a minimum. concentration of 10 μg / ml. The results presented in Figure 10 show that IGF2, like IGF1, significantly stimulates the growth of MCF-7 cells. The addition of an isotype controls, 9G4 has no effect on this stimulation. As already described by De Leon et al. (Growth Factors, 6: 327-334, 1992), no effects were observed when adding MAb aIR3.

En revanche, le 7C10 inhibe totalement la croissance induite par l'IGF2. Son activité est significativement meilleure que celle du 1H7. On the other hand, 7C10 completely inhibits the growth induced by IGF2. Its activity is significantly better than that of 1H7.

Exemple 6. Activité biologique des anticorps 7C10 chimériques (C7C10) et humanisés (h7C10) a) Comparaison 7CIO/C7CIO et 7C1O/h7C1O sur le modèle MCF-7 in vitro
La forme chimérique de l'AcM 7C10 et la forme humanisée 1 (notée ici 7H2HM) purifiée ont été testées in vitro dans le modèle MCF-7 comme décrit ci-dessus. Example 6. Biological Activity of chimeric (C7C10) and humanized (C7C10) 7C10 antibodies (a7C10) a) Comparison of 7C10 / C7C10 and 7C10 / h7C10O on in vitro MCF-7 model
The chimeric form of mAb 7C10 and purified humanized form 1 (denoted herein 7H2HM) were tested in vitro in the MCF-7 model as described above.

Les résultats présentés respectivement dans les figures 11 et 12 montrent que ces deux formes ont parfaitement conservé leurs propriétés d'inhiber la croissance IGF1 induite de la tumeur MCF-7. b) Effet comparé des AcM 7C10 et h7CIO sur la transduction du signal induit par la fixation de l'IGF1 à son récepteur. The results presented respectively in FIGS. 11 and 12 show that these two forms perfectly preserved their properties of inhibiting the IGF1 growth induced by the MCF-7 tumor. b) Compared effect of mAbs 7C10 and h7CIO on the signal transduction induced by the binding of IGF1 to its receptor.

L'activité d'inhibition de la croissance IGF1 induite in vitro sur la lignée MCF-7 devrait être la traduction d'une inhibition de la transduction du signal médié par l'IGF1 lors de la fixation de l'AcM 7C10 au récepteur. Afin de vérifier cette hypothèse, des cellules MCF-7 ont été incubées avec ou sans IGF1, en présence ou en absence des anticorps à tester. Après un temps court d'incubation, les cellules ont été lysées, la chaîne ss immunoprécipitée et la phosphorylation de cette sous unité estimée à l'aide d'un anticorps antiphosphotyrosine kinase. Les résultats présentés dans la figure 13 montrent que la fixation du 7C10 ou du h7C10 inhibent significativement la The IGF1 growth inhibition activity induced in vitro on the MCF-7 line should be a translation of an inhibition of IGF1-mediated signal transduction when attaching the mAb 7C10 to the receptor. In order to verify this hypothesis, MCF-7 cells were incubated with or without IGF1, in the presence or absence of the antibodies to be tested. After a short incubation period, the cells were lysed, the chain immunoprecipitated and the phosphorylation of this subunit estimated using an antiphosphotyrosine kinase antibody. The results presented in Figure 13 show that the binding of 7C10 or h7C10 significantly inhibits the

phosphorylation de la sous unité ss de l'IGF-IR contrairement à un anticorps irrelevant murin (9G4) ou humain (noté IgG 1 sur le schéma). c) Implication de l'anticorps 7H2HM dans les mécanismes d'ADCC L'inhibition de la transduction du signal décrite ci-dessus dans le paragraphe b) est le principal mécanisme d'action impliqué dans l'activité biologique des anticorps 7C10 et 7H2HM. Il est cependant probable que lors de son administration chez l'homme, l'anticorps 7H2HM, d'isotype IgGl, soit capable d'induire une lyse cellulaire par un mécanisme de type ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity). Afin de vérifier ce point, des cellules NK (Natural Killer) provenant du sang périphérique de donneurs humains sont mises en présence de cellules A549 ou MCF-7 préalablement incubées 4 heures avec de 10 llg d'anticorps 7H2HM pour 5. 105 cellules et, marquées au 51Cr (50 llg). Dans cette expérience l'herceptin (notée sur les figures 32A et 32B h 4D5) est utilisée comme témoin positif d'expérience. Les figures 32A à 32D montrent que, comme attendu, l'herceptin induit une ADCC significative sur les deux cellules A549 et MCF-7 (voir respectivement les figures 32A et 32B). Le 7H2HM est également capable d'induite une ADCC sur les cellules A549 (voir figure 32C), mais ce phénomène est de moindre amplitude sur les cellules MCF-7 (voir figure 32D). d) Effet des anticorps 7C10 et 7H2HM sur le cycle cellulaire L'inhibition de la croissance cellulaire observée in vitro sur la lignée MCF-7 devrait se traduire par un effet sur le cycle cellulaire. Afin de répondre à cette question 4. 105 cellules sont ensemencées en plaque 6 puits. 24 heures après ensemencement, le sérum de veau est enlevé et l'IGFI ajouté en présence ou en absence des anticorps à tester. Après 24 heures d'incubation, les cellules sont récupérées pour l'étude du cycle cellulaire. La figure 33B met en évidence l'effet de l'IGFI sur l'entrée en cycle et la croissance des cellules MCF-7 ceci comparé à l'entrée en cycle et la croissance des cellules MCF-7 en absence d'IGFI (voir figure 33A). Après addition du facteur de croissance une diminution significative de la phase GO/G 1 (de 88, 2% à 56, 3%) au profit des phases S (de 7, 8% à 31%) et G2/M (de 4% à 12, 7%) est observée. Lors de l'addition des anticorps 7C10 et 7H2HM ( (voir figure 33C), une inhibition significative de l'entrée en cycle est observée. Il est à noter que l'anticorps murin et son homologue humanisé ont une activité comparable sur le cycle cellulaire. L'aIR3, introduit comme témoin

phosphorylation of the subunit ss of IGF-IR in contrast to an irrelevant murine (9G4) or human antibody (noted IgG 1 in the scheme). c) Involvement of the 7H2HM Antibody in the ADCC Mechanisms The inhibition of signal transduction described above in b) is the main mechanism of action involved in the biological activity of the 7C10 and 7H2HM antibodies. It is, however, likely that when administered to humans, the 7H2HM antibody, of IgG1 isotype, is capable of inducing cell lysis by an ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) type mechanism. In order to verify this point, NK (Natural Killer) cells from the peripheral blood of human donors are placed in the presence of A549 or MCF-7 cells previously incubated for 4 hours with 10 μg of 7H 2 HM antibody for 5 × 10 5 cells and marked at 51 Cr (50 μg). In this experiment, herceptin (noted in Figures 32A and 32B-4D5) is used as a positive test of experience. Figures 32A-32D show that, as expected, the herceptin induces significant ADCC on both A549 and MCF-7 cells (see Figures 32A and 32B, respectively). 7H2HM is also capable of inducing ADCC on A549 cells (see Figure 32C), but this phenomenon is of lesser amplitude on MCF-7 cells (see Figure 32D). d) Effect of 7C10 and 7H2HM antibodies on the cell cycle Inhibition of cell growth observed in vitro on the MCF-7 line is expected to result in an effect on the cell cycle. In order to answer this question 4. 105 cells are seeded in 6-well plate. 24 hours after inoculation, the calf serum is removed and the IGFI added in the presence or absence of the antibodies to be tested. After 24 hours of incubation, the cells are recovered for the study of the cell cycle. FIG. 33B shows the effect of IGFI on the entry into the cycle and the growth of MCF-7 cells, compared with the entry into the cycle and the growth of MCF-7 cells in the absence of IGFI (see FIG. Figure 33A). After addition of the growth factor, a significant decrease in the GO / G 1 phase (from 88.2% to 56.3%) in favor of the S phases (from 7.8% to 31%) and G2 / M (from 4%). % to 12.7%) is observed. Upon addition of antibodies 7C10 and 7H2HM (see Figure 33C), significant inhibition of cycle entry is observed.It should be noted that the murine antibody and its humanized counterpart have comparable activity on the cell cycle IAr3, introduced as a control

positif semble légèrement moins actif que le 7C10 et le 7H2HM dans ce test. positive appears slightly less active than 7C10 and 7H2HM in this test.

L'anticorps 9G4 utilisé comme isotype contrôle est sans effet sur le cycle cellulaire.

e) Activité comparée in vivo des anticorps 7C10 et 7H2HM sur le modèle A549
Afin de confirmer l'activité de l'anticorps humanisé 7H2HM in vivo, ce dernier a été comparé au 7C 10 dans le modèle de tumeur du poumon non à petites cellules A549. The 9G4 antibody used as a control isotype has no effect on the cell cycle.

e) In vivo comparative activity of 7C10 and 7H2HM antibodies in the A549 model
In order to confirm the activity of the humanized 7H2HM antibody in vivo, the latter was compared to 7C10 in the non-small cell lung tumor model A549.

Cette expérience a été effectuée exactement comme décrit ci-avant excepté la dose d'anticorps qui est de 125 ug/dose deux fois par semaine au lieu de 250 u. g/dose deux fois par semaine et ce du fait de la non disponibilité de fortes quantités de 7H2HM. This experiment was performed exactly as described above except for the dose of antibody which is 125 μg / dose twice a week instead of 250 μg. g / dose twice a week due to the unavailability of large quantities of 7H2HM.

L'anticorps 9G4 a été utilisé comme contrôle isotypique pour le 7ClO et une immunoglobuline humaine irrelevante d'isotype IGGI (ci après dénommée HIGGI) a été utilisée comme contrôle pour l'anticorps humanisé 7H2HM. The 9G4 antibody was used as an isotype control for 7ClO and an irrelevant human immunoglobulin of IGGI isotype (hereinafter referred to as HIGGI) was used as a control for the humanized 7H2HM antibody.

La figure 34 montre qu'il n'y a pas de différences significatives entre les courbes contrôles 9G4 et HIgGl. Comme attendu une inhibition significative de la croissance tumorale est observée avec l'anticorps murin 7C10. Concernant l'anticorps humanisé 7H2HM, l'activité observée est exactement de la même intensité que celle observée avec sa contrepartie murine. Cette donnée, additionnée aux observations décrites ciavant in vitro, indique que l'humanisation n'a pas modifié les propriétés de l'anticorps généré. D'autre part, dans les modèles de xénogreffe chez la souris, l'activité de l'anticorps humanisé semble être intégralement liée à un mécanisme d'inhibition de la transduction du signal. En effet si une part ADCC était en jeu dans l'inhibition de la croissance tumorale chez la souris Nude, une différence devrait être observée entre l'activité des anticorps murins et humanisés. Figure 34 shows that there are no significant differences between the 9G4 and HIgG1 control curves. As expected a significant inhibition of tumor growth is observed with the murine antibody 7C10. Regarding the humanized antibody 7H2HM, the observed activity is exactly the same intensity as that observed with its murine counterpart. This data, added to the observations described previously in vitro, indicates that the humanization did not modify the properties of the antibody generated. On the other hand, in mouse xenograft models, the activity of the humanized antibody appears to be integrally related to a mechanism of inhibition of signal transduction. Indeed if an ADCC share was involved in the inhibition of tumor growth in Nude mice, a difference should be observed between the activity of murine and humanized antibodies.

Une expérience in vivo a également été effectuée sur le modèle de tumeur du sein MCF-7 et montre que, comme attendu, l'anticorps 7H2HM est parfaitement comparable à l'anticorps murin 7C10 pour l'inhibition de la croissance de cette tumeur in vivo (résultats non montrés). f) Mise en évidence d'une synergie entre le 7H2HM et la navelbine. An in vivo experiment was also performed on the MCF-7 breast tumor model and shows that, as expected, the 7H2HM antibody is perfectly comparable to the murine 7C10 antibody for the inhibition of the growth of this tumor in vivo. (results not shown). f) Demonstration of a synergy between 7H2HM and navelbine.

Le protocole décrit dans l'exemple 4 a été repris dans le but de reproduire les résultats obtenus avec le 7C10 avec son homologue humanisé : l'anticorps 7H2HM. The protocol described in Example 4 was repeated in order to reproduce the results obtained with 7C10 with its humanized counterpart: the antibody 7H2HM.

Les résultats présentés aux figures 35A et 35B montrent que, comme dans le cas du 7CIO, une synergie significative est mise en évidence entre l'anticorps humanisé 7H2HM et la navelbine. g) Effet des anticorps 7C10 et 7H2HM sur l'apoptose des cellules MCF-7 in vitro. The results presented in FIGS. 35A and 35B show that, as in the case of 7C10, a significant synergy is demonstrated between the humanized antibody 7H2HM and navelbine. g) Effect of 7C10 and 7H2HM antibodies on apoptosis of MCF-7 cells in vitro.

Comme indiqué ci-avant, l'IGF-IR est capable de conférer une protection contre l'apoptose lorsqu'il est surexprimé à la surface des cellules. Par ailleurs il a été montré dans ces exemples que les anticorps 7C10 et 7H2HM étaient capable de potentialiser un composé actif en chimiothérapie. Afin de tester le pouvoir des anticorps 7C10 et 7H2HM à induire l'apoptose, et d'expliquer en partie leur potentiel de synergie avec la chimiothérapie, des expériences ont été menées sur les cellules MCF-7 en présence ou en absence de doxorubicine, un médicament connu pour induire l'apoptose de cette lignée cellulaire in vitro. Dans ces expériences, les cellules MCF-7 sont ensemencées à 2. 104/cm2 en boîte de Pétri et cultivées 24 h dans du RPMI sans rouge de phénol supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF). Les cellules sont ensuite lavées 2 fois avec du PBS et remises en culture dans du milieu à 0% SVF. Un temps d'adaptation

de 10 minutes à 37 C leur est laissé avant l'ajout des anticorps à lOug/ml. Après 10 minutes supplémentaires à 37 C, on ajoute au milieu de culture l'IGF-I recombinant (Sigma) à une concentration finale de 50 ng/ml. Les cellules sont à nouveau laissées à 37 C pendant une heure pour permettre la fixation des anticorps et de l'IGF-I. Enfin, la doxorubicine (Sigma) est ajoutée au milieu de culture à 2flg/ml et les cellules sont incubées 24 heures à 37 C. As indicated above, IGF-IR is capable of conferring protection against apoptosis when overexpressed on the surface of cells. Moreover, it has been shown in these examples that the antibodies 7C10 and 7H2HM were capable of potentiating a compound that is active in chemotherapy. In order to test the ability of 7C10 and 7H2HM antibodies to induce apoptosis, and to partly explain their potential for synergy with chemotherapy, experiments were conducted on MCF-7 cells in the presence or absence of doxorubicin, a drug known to induce apoptosis of this cell line in vitro. In these experiments, the MCF-7 cells are seeded at 2. 104 / cm 2 in a petri dish and cultured for 24 h in RPMI without phenol red supplemented with 10% fetal calf serum (FCS). The cells are then washed twice with PBS and resuspended in medium at 0% FCS. A time of adaptation

10 minutes at 37 ° C is left before the addition of the antibodies at 10 μg / ml. After another 10 minutes at 37 ° C., recombinant IGF-I (Sigma) is added to the culture medium at a final concentration of 50 ng / ml. The cells are again left at 37 C for one hour to allow the binding of the antibodies and IGF-I. Finally, doxorubicin (Sigma) is added to the culture medium at 2 μg / ml and the cells are incubated for 24 hours at 37 ° C.

Les expériences ont également été menées avec la navelbine à une concentration de 10 ng/ml. The experiments were also conducted with navelbine at a concentration of 10 ng / ml.

L'analyse de la viabilité cellulaire est effectuée par analyse au cytomètre de flux après marquage à l'annexine V-FITC (20 min, 4 C) et DAPI (2ug/ml). Le pourcentage de cellules mortes considéré est la population marquées Annexine +/DAPI +. The analysis of the cell viability is performed by flow cytometric analysis after labeling with Annexin V-FITC (20 min, 4 C) and DAPI (2 μg / ml). The percentage of dead cells considered is the population marked Annexin + / DAPI +.

*L'anticorps 5C2 est utilisé comme isotype contrôle. * The 5C2 antibody is used as a control isotype.

Les résultats représentés à la figure 36 montrent que la doxorubicine induit une apoptose chez 8% des cellules MCF-7. Lorsque les cellules sont traitées conjointement avec l'anticorps 7CIO et la doxorubicine une augmentation significative de la mort The results shown in Figure 36 show that doxorubicin induces apoptosis in 8% of MCF-7 cells. When the cells are treated together with 7CIO antibody and doxorubicin a significant increase in death

cellulaire est observée. Un même effet est montré avec l'anticorps 7H2HM. Le même type de résultats a été observé lorsque l'anticorps est associé à la navelbine. cell is observed. The same effect is shown with the 7H2HM antibody. The same type of results was observed when the antibody is associated with navelbine.

Exemple 7. Stratégie de clonage des gènes codant pour les régions variables des chaînes lourde et légère de l'anticorps monoclonal (AcM) 7C10
L'ARN total a été extrait à partir de 107 cellules d'hybridomes secrétant l'anticorps 7C10 en utilisant le TRI REAGENT (selon les instructions données par le fournisseur, SIGMA, T9424). Le premier brin de cADN a été synthétisé à l'aide du kit 'First strand cDNA synthesis'd'Amersham-Pharmacia (&num;27-9261-01, selon les instructions données par le fournisseur). Pour les deux chaînes, la réaction a été amorcée avec l'oligonucléotide Not I-d (T) 18, compris dans le Kit. Example 7: Cloning strategy of the genes coding for the variable regions of the heavy and light chains of the monoclonal antibody (mAb) 7C10
Total RNA was extracted from 107 hybridoma cells secreting antibody 7C10 using TRI REAGENT (according to the instructions given by the supplier, SIGMA, T9424). The first strand of cDNA was synthesized using Amersham-Pharmacia's First strand cDNA synthesis kit (&num; 27-9261-01, as instructed by the supplier). For both chains, the reaction was initiated with the oligonucleotide Not Id (T) 18, included in the Kit.

L'hybride cADN : mARN ainsi obtenu a été utilisé pour l'amplification par PCR des gènes codant pour les chaînes lourde et légère de l'AcM 7C10. Les PCR ont été réalisées en utilisant une combinaison d'oligonucléotides spécifiques pour les chaînes lourdes et légères (Kappa) des immunoglobulines de souris. Les amorces correspondant aux extrémités 5's'hybrident dans la région correspondant aux peptides de signal (Tableau 2 pour chaînes lourdes, Tableau 3 pour chaînes légères). Ces amorces ont été compilées à partir d'un grand nombre de séquences d'anticorps de souris trouvées dans les banques de données (Jones S. T. et al., Bio/Technology 9 : 88-89,1991). Les amorces correspondant aux extrémités 3's'hybrident dans les régions constantes des chaînes lourdes (domaine CHI de la sous classe IgGl, non loin de la jonction V-C, amorce MHC-1 Tableau 4) et légères (domaine Kappa non loin de la jonction V-C, amorce MKC Tableau 4). The cDNA: mRNA hybrid thus obtained was used for the PCR amplification of the genes encoding the heavy and light chains of the mAb 7C10. The PCRs were performed using a combination of oligonucleotides specific for heavy and light chains (Kappa) of mouse immunoglobulins. The primers corresponding to the 5 'ends hybridize in the region corresponding to the signal peptides (Table 2 for heavy chains, Table 3 for light chains). These primers were compiled from a large number of mouse antibody sequences found in the databases (Jones S.T. et al., Bio / Technology 9: 88-89, 1991). The primers corresponding to the 3 'ends hybridize in the constant regions of the heavy chains (CHI domain of the IgG1 subclass, not far from the VC junction, MHC-1 primer Table 4) and light (Kappa domain not far from the VC junction, MKC primer Table 4).

TABLEAU 2 : Amorces oligonucléotidiques pour la région 5'des domaines variables des chaînes lourdes d'immunoglobuline de souris (MHV) ("MHV"pour "Mouse Heavy Variable")

TABLE 2 Oligonucleotide primers for the mouse immunoglobulin heavy chain (MHV) heavy mouse variable domain ("MHV") region ("MHV" for "Mouse Heavy Variable")

<tb>
<tb> MHV-1 <SEP> : <SEP> 5'ATGAAATGCAGCTGGGTCATSTTCTT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 13)
<tb> MHV-2 <SEP> : <SEP> 5'ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 14)
<tb> MHV-3 <SEP> : <SEP> 5'ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 15)
<tb> MHV-4 <SEP> : <SEP> 5'ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 16)
<tb> <Tb>
<tb> MHV-1 <SEP>: <SEP>5'ATGAAATGCAGCTGGGTCATSTTCTT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 13)
<tb> MHV-2 <SEP>: <SEP>5'ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 14)
<tb> MHV-3 <SEP>: <SEP>5'ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 15)
<tb> MHV-4 <SEP>: <SEP>5'ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 16)
<Tb>

<tb>
<tb> MHV-5 <SEP> : <SEP> 5'ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 17)
<tb> MHV-6 <SEP> : <SEP> 5'ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTG <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 18)
<tb> MHV-7 <SEP> : <SEP> 5'ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 19)
<tb> MHV-8 <SEP> : <SEP> 5'ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 20)
<tb> MHV-9 <SEP> : <SEP> 5'ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 21)
<tb> MHV-10 <SEP> : <SEP> 5'ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 22)
<tb> MHV-11 <SEP> : <SEP> 5'ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 23)
<tb> MHV-12 <SEP> : <SEP> 5'ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 24)
<tb> NB <SEP> KEY <SEP> : <SEP> R=A/G, <SEP> Y=T/C, <SEP> W=A/T, <SEP> K=T/G, <SEP> M=A/C, <SEP> S=C/G.
<tb> <Tb>
<tb> MHV-5 <SEP>: <SEP>5'ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 17)
<tb> MHV-6 <SEP>: <SEP>5'ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTG<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 18)
<tb> MHV-7 <SEP>: <SEP>5'ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 19)
<tb> MHV-8 <SEP>: <SEP>5'ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 20)
<tb> MHV-9 <SEP>: <SEP>5'ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 21)
<tb> MHV-10 <SEP>: <SEP>5'ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 22)
<tb> MHV-11 <SEP>: <SEP>5'ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTTATTATT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 23)
<tb> MHV-12 <SEP>: <SEP>5'ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 24)
<tb> NB <SEP> KEY <SEP>: <SEP> R = A / G, <SEP> Y = T / C, <SEP> W = A / T, <SEP> K = T / G, <SEP > M = A / C, <SEP> S = C / G.
<Tb>

TABLEAU 3 : Amorces oligonucléotidiques pour la région 5'des domaines variables des chaînes kappa (légères) d'immunoglobuline de souris (MKV) ("MKV"pour"Mouse Kappa Variable")

TABLE 3: Oligonucleotide primers for the 5 'region of the mouse immunoglobulin (MKV) kappa (light) kappa chains ("MKV" for "Mouse Kappa Variable")

<tb>
<tb> MKV-1 <SEP> : <SEP> 5'ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 25)
<tb> MKV-2 <SEP> : <SEP> 5'ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 26)
<tb> MKV-3 <SEP> : <SEP> 5'ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 27)
<tb> MKV-4 <SEP> : <SEP> 5'ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGG <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 28)
<tb> MKV-5 <SEP> : <SEP> 5'ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 29)
<tb> MKV-5A <SEP> : <SEP> 5'ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 30)
<tb> MKV-6 <SEP> : <SEP> 5'ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRG <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 31)
<tb> MKV-7 <SEP> : <SEP> 5' <SEP> ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACA <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 32)
<tb> MKV-8 <SEP> : <SEP> 5'ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAAT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 33)
<tb> MKV-9 <SEP> : <SEP> 5'ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 34)
<tb> MKV-10 <SEP> : <SEP> 5'ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 35)
<tb> MKV-l1 <SEP> : <SEP> 5'ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 36)
<tb> MKV-12A <SEP> : <SEP> 5' <SEP> ATGRAGTYWCAGACCCAGGTCTTYRT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 37)
<tb> MKV-12B <SEP> : <SEP> 5'ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 38)
<tb> MKV-13 <SEP> : <SEP> 5'ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT <SEP> 3' <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 39)
<tb> NB <SEP> KEY <SEP> : <SEP> R=A/G, <SEP> Y=T/C, <SEP> W=A/T, <SEP> K=T/G, <SEP> M=A/C, <SEP> S=C/G.
<tb> <Tb>
<tb> MKV-1 <SEP>: <SEP>5'ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 25)
<tb> MKV-2 <SEP>: <SEP>5'ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 26)
<tb> MKV-3 <SEP>: <SEP>5'ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 27)
<tb> MKV-4 <SEP>: <SEP>5'ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGG<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 28)
<tb> MKV-5 <SEP>: <SEP>5'ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 29)
<tb> MKV-5A <SEP>: <SEP>5'ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 30)
<tb> MKV-6 <SEP>: <SEP>5'ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRG<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 31)
<tb> MKV-7 <SEP>: <SEP> 5 '<SEP> ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACA <SEP>3'<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 32)
<tb> MKV-8 <SEP>: <SEP>5'ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAAT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 33)
<tb> MKV-9 <SEP>: <SEP>5'ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 34)
<tb> MKV-10 <SEP>: <SEP>5'ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 35)
<tb> MKV-11 <SEP>: <SEP>5'ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 36)
<tb> MKV-12A <SEP>: <SEP> 5 '<SEP> ATGRAGTYWCAGACCCAGGTCTTYRT <SEP>3'<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 37)
<tb> MKV-12B <SEP>: <SEP>5'ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 38)
<tb> MKV-13 <SEP>: <SEP>5'ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT<SEP> 3 '<SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 39)
<tb> NB <SEP> KEY <SEP>: <SEP> R = A / G, <SEP> Y = T / C, <SEP> W = A / T, <SEP> K = T / G, <SEP > M = A / C, <SEP> S = C / G.
<Tb>

TABLEAU 4 : Amorces oligonucléotidiques pour les extrémités 3'des gènes VH et VL de souris Chaîne légère (MKC) : 5'ACTGGATGGTGGGAAGATGG 3' (SEQ ID No. 40) Région constante du domaine Kappa de souris :

TABLE 4 Oligonucleotide primers for the 3'ends of the mouse VH and VL genes Light chain (MKC): 5'ACTGGATGGTGGGAAGATGG 3 '(SEQ ID No. 40) Constant region of the mouse Kappa domain:

<tb>
<tb> A <SEP> D <SEP> A <SEP> A <SEP> P <SEP> T <SEP> V <SEP> S <SEP> I <SEP> F <SEP> P <SEP> P <SEP> S <SEP> S <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 41)
<tb> GCT <SEP> GAT <SEP> GCT <SEP> GCA <SEP> CCA <SEP> ACT <SEP> GTA <SEP> TCC <SEP> ATC <SEP> TTC <SEP> CCA <SEP> CCA <SEP> TCC <SEP> AGT <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 42)
<tb> || <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> |||
<tb> (MKC) <SEP> CC <SEP> ATC <SEP> TTC <SEP> CCA <SEP> CCA <SEP> TCC <SEP> AGT <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 43)
<tb>
Chaîne lourde (MHC-H 5'CCAGTGGATAGACAGATG 3' (SEQ ID No. 44) Domaine CH1 de gamma-1 de souris (sous-classe IgGl) :

<Tb>
<tb> A <SEP> D <SEP> A <SEP> A <SEP> P <SEP> T <SEP> V <SEP> S <SEP> I <SEP> F <SEP> P <SEP> P <SEP > S <SEP> S <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 41)
<tb> GCT <SEP> GAT <SEP> GCT <SEP> GCA <SEP> CCA <SEP> ACT <SEP> GTA <SEP> TCC <SEP> ATC <SEP> TTC <SEP> CCA <SEP> CCA <SEP > TCC <SEP> AGT <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 42)
<tb> || <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> |||
<tb> (MKC) <SEP> CC <SEP> ATC <SEP> TTC <SEP> CCA <SEP> CCA <SEP> TCC <SEP> AGT <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP > 43)
<Tb>
Heavy chain (MHC-H 5'CCAGTGGATAGACAGATG 3 '(SEQ ID No. 44) CH1 domain of mouse gamma-1 (subclass IgG1):

<tb>
<tb> A <SEP> K <SEP> T <SEP> T <SEP> P <SEP> P <SEP> S <SEP> V <SEP> Y <SEP> P <SEP> L <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 46)
<tb> GCC <SEP> AAA <SEP> ACG <SEP> ACA <SEP> CCC <SEP> CCA <SEP> TCT <SEP> GTC <SEP> TAT <SEP> CCA <SEP> CTG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 45)
<tb> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> |||
<tb> (MHC-1) <SEP> CCC <SEP> CCA <SEP> TCT <SEP> GTC <SEP> TAT <SEP> CCA <SEP> CTG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 47)
<tb>
Exemple 8. Séquences des immunoglobulines clonées à partir de l'hybridome de souris 7C10
En suivant la stratégie d'amplification décrite ci-dessus, des produits de PCR correspondant aux régions variables des chaînes lourde (VH) et légère (VL) ont été

clonés en utilsant le pGEM&commat;-T Easy Vector Systems (Promega). Pour 7C10 VL, des produits de PCR ont été obtenus avec l'amorce MKC en combinaison avec les amorces MKV1 et MKV2. Pour 7C10 VH, des produits de PCR ont été obtenus avec l'amorce MHC-1 en association avec les amorces MHV8 et MHV12. Un séquençage approfondi des produits de PCR clonés dans les vecteurs pGEM-T easy a révélé deux séquences

différentes pour la chaîne légère et une séquence unique pour la chaîne lourde. a) Région variable isolée à partir de l'oligo MKV1
La séquence d'ADN obtenue est caractéristique d'une région variable d'Ig fonctionnelle. Cette nouvelle séquence est donc présumée être celle codant pour 7C10 VL. Les séquences ADN (SEQ ID Nos. 48 et 50) et acides aminés (SEQ ID No. 49) du cDNA codant pour 7C10 VL sont représentées à la figure 14. b) Région variable isolée à partir de l'oligo MKV2
Le gène codant pour cette chaîne légère provient d'un transcrit de mRNA aberrant qui est présent dans tous les partenaires de fusion standard dérivés de la tumeur <Tb>
<tb> A <SEP> K <SEP> T <SEP> T <SEP> P <SEP> P <SEP> S <SEP> V <SEP> Y <SEP> P <SEP> L <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 46)
<tb> GCC <SEP> AAA <SEP> ACG <SEP> ACA <SEP> CCC <SEP> CCA <SEP> TCT <SEP> GTC <SEP> TAT <SEP> CCA <SEP> CTG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 45)
<tb> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> ||| <SEP> |||
<tb> (MHC-1) <SEP> CCC <SEP> CCA <SEP> TCT <SEP> GTC <SEP> TAT <SEP> CCA <SEP> CTG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 47)
<Tb>
Example 8. Immunoglobulin sequences cloned from mouse hybridoma 7C10
Following the amplification strategy described above, PCR products corresponding to the variable regions of the heavy (VH) and light (VL) chains were

cloned using pGEM & -T Easy Vector Systems (Promega). For 7C10 VL, PCR products were obtained with the MKC primer in combination with the MKV1 and MKV2 primers. For 7C10 VH, PCR products were obtained with MHC-1 primer in combination with primers MHV8 and MHV12. In-depth sequencing of PCR products cloned into pGEM-T easy vectors revealed two sequences

different for the light chain and a unique sequence for the heavy chain. a) Variable region isolated from MKV1 oligo
The resulting DNA sequence is characteristic of a functional Ig variable region. This new sequence is thus presumed to be that encoding 7C10 VL. The DNA sequences (SEQ ID Nos. 48 and 50) and amino acids (SEQ ID No. 49) of the cDNA coding for 7C10 VL are shown in FIG. 14. b) Variable region isolated from the MKV2 oligo
The gene encoding this light chain is derived from an aberrant mRNA transcript that is present in all standard tumor-derived fusion partners

originelle MOPC-21 dont fait parti le myélome de souris Sp2/0agl4 qui a été utilisé pour produire l'hybridome 7C10. Cette séquence comporte une recombinaison aberrante entre les gènes V et J (délétion de quatre bases nucléotidiques entraînant un changement du cadre de lecture) et une mutation de la cystéine invariable en position 23 en tyrosine. original MOPC-21 including Sp2 / Oagl4 mouse myeloma that was used to produce the 7C10 hybridoma. This sequence comprises an aberrant recombination between the V and J genes (deletion of four nucleotide bases leading to a change of frame of reading) and a mutation of the invariable cysteine at position 23 in tyrosine.

Ces changements suggèrent que cette chaîne légère serait non fonctionnelle bien que néanmoins transcrite en ARN messager. La séquence ADN de cette pseudo chaîne légère n'est pas montrée. c) Région variable isolée à partir des oligos MHV8 et MHV12
Les séquences ADN obtenues avec ces deux oligos sont identiques, en dehors de la séquence codée par l'oligo lui-même. Cette séquence est une nouvelle séquence

codant pour une chaîne lourde fonctionnelle présumée être celle de l'anticorps monoclonal 7C10. Les séquences ADN (SEQ ID Nos. 51 et 53) et acides aminés (SEQ ID No. 52) du cDNA codant pour 7C 10 VH sont représentées à la figure 15. These changes suggest that this light chain would be non-functional although nevertheless transcribed into messenger RNA. The DNA sequence of this pseudo light chain is not shown. c) Variable region isolated from oligos MHV8 and MHV12
The DNA sequences obtained with these two oligos are identical, apart from the sequence encoded by the oligo itself. This sequence is a new sequence

coding for a functional heavy chain presumed to be that of the monoclonal antibody 7C10. The DNA sequences (SEQ ID Nos. 51 and 53) and amino acids (SEQ ID No. 52) of the cDNA coding for 7C 10 VH are shown in FIG.

Exemple 9. Construction des gènes chimériques souris-homme
L'anticorps chimérique 7C10 a été construit de manière à avoir les régions 7C10 VL et VH de souris reliées aux régions constantes humaines kappa et gamma-1, respectivement. Des oligos ont été utilisés pour modifier les extrémités 5'et 3'des séquences flanquant l'ADN codant pour 7C10 VL et VH afin de permettre leur clonage dans des vecteurs d'expression en cellules mammaliennes. Ces vecteurs utilisent le

promoteur fort HCMV pour transcrire efficacement les chaînes lourde et légère de l'anticorps chimérique 7C10. D'autre part, ces vecteurs contiennent également l'origine de réplication de SV40 permettant une réplication efficace de l'ADN et par voie de conséquence une expression transitoire des protéines en cellules cos. Example 9. Construction of mouse-human chimeric genes
Chimeric antibody 7C10 was constructed to have mouse 7C10 VL and VH regions connected to the human kappa and gamma-1 constant regions, respectively. Oligos were used to modify the 5 'and 3' ends of sequences flanking the 7C10 VL and VH encoding DNA to allow their cloning into mammalian cell expression vectors. These vectors use the

strong HCMV promoter to efficiently transcribe the heavy and light chains of chimeric 7C10 antibody. On the other hand, these vectors also contain the SV40 origin of replication allowing efficient replication of the DNA and consequently transient expression of the proteins in cos cells.

Exemple 10. Expression et évaluation de l'activité de reconnaissance de l'IGF-l récepteur de l'anticorps chimérique 7C10
Les deux plasmides contenant l'ADN codant pour l'anticorps 7C10 chimérique ont été co-transfectés dans des cellules cos-7 (ATCC number CRL-1651) pour étudier l'expression transitoire de l'anticorps recombinant. Après 72 heures d'incubation, le milieu de culture a été prélevé, centrifugé pour éliminer les débris cellulaires et analysé par technique ELISA pour la production en IgGl humaine (voir Exemple 16) et la reconnaissance du récepteur à l'IGF-1 (voir Exemple 17). EXAMPLE 10 Expression and Evaluation of the Recognition Activity of the IGF-1 Receptor of the Chimeric Antibody 7C10
Both plasmids containing the DNA encoding the chimeric 7C10 antibody were cotransfected into cos-7 cells (ATCC number CRL-1651) to study transient expression of the recombinant antibody. After 72 hours of incubation, the culture medium was removed, centrifuged to remove cell debris and analyzed by ELISA for production of human IgG1 (see Example 16) and recognition of the IGF-1 receptor (see Example 17).

Les tests ELISA de mesure de concentrations en IgGl/Kappa humaines ont montré que l'expression de l'anticorps chimérique 7C10 dans les cellules cos7 était comprise entre 300 et 500 ng/ml ce qui est comparable aux valeurs obtenues avec la majorité des anticorps. The ELISA tests for measuring human IgG1 / Kappa concentrations showed that the expression of the chimeric 7C10 antibody in the cos7 cells was between 300 and 500 ng / ml, which is comparable to the values obtained with the majority of the antibodies.

Les tests ELISA de reconnaissance du récepteur à l'IGF-1 montrent que l'anticorps chimérique le reconnaît spécifiquement et avec une bonne avidité relative (voir figures 3A, 3B et 3C). Ceci apporte la preuve fonctionnelle que les bonnes VH et VL de l'anticorps 7ClO ont été identifiées. De plus, cette forme chimérique de 7C10 apparaît comme étant un outil indispensable à l'évaluation de l'affinité des formes humanisées. The IGF-1 receptor recognition ELISA tests show that the chimeric antibody recognizes it specifically and with good relative avidity (see FIGS. 3A, 3B and 3C). This provides functional evidence that the good VH and VL of the 7ClO antibody have been identified. In addition, this chimeric form of 7C10 appears to be an indispensable tool for evaluating the affinity of humanized forms.

Exemple 11. Modélisation moléculaire des régions variables de l'anticorps de souris 7C10
Afin d'aider et d'affiner le processus d'humanisation par CDR-grafting , un

modèle moléculaire des régions VL et VH de l'anticorps de souris 7C10 a été construit. Le modèle est basé sur la structure cristallographique de la chaîne lourde lAY1 et de la chaîne légère 2PCP. Example 11. Molecular Modeling of Variable Regions of the Mouse Antibody 7C10
In order to help and refine the humanization process by CDR-grafting, a

Molecular model of the VL and VH regions of the 7C10 mouse antibody was constructed. The model is based on the crystallographic structure of the heavy chain lAY1 and the light chain 2PCP.

Exemple 12. Processus d'humanisation par CDR-grafting de la région variable de la chaîne légère de l'anticorps 7C10 (7C10 VL) a) Comparaison de la séquence en acides aminés de 7C10 VL avec toutes les séquences de souris VL connues
Comme étape préliminaire à l'humanisation par CDR-grafting, la séquence en acides aminés de 7C 10 VL a été comparée dans un premier temps à toutes les séquences de VL de souris présentes dans la banque de données de Kabat (adresse Internet : ftp : //ftp. ebi. ac. uk/pub/database/kabat/fasta~format/, dernière mise à jour des données date de 1999). 7C10 VL a ainsi été identifié comme appartenant au sous-groupe II des chaînes légères Kappa comme défini par Kabat et al. (In Sequences of proteins of immunological interest (5th edn. ), NIH publication No 91-3242, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991). Des régions VL d'anticorps monoclonaux de souris ayant une identité de séquences allant jusqu'à 95 % ont été identifiées (DRB 1-4. 3 (SEQ ID No. 55) : 95 % et C94-5Bll'CL (SEQ ID No. 56) : 95 %, voir figure 17). Afin de tenter d'identifier les Example 12: CDR-grafting humanization process of the variable region of the light chain of the 7C10 antibody (7C10 VL) a) Comparison of the amino acid sequence of 7C10 VL with all the known VL mouse sequences
As a preliminary step to humanization by CDR-grafting, the amino acid sequence of 7C VL was first compared to all mouse VL sequences present in the Kabat databank (Internet address: ftp: // ftp. ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta ~ format /, last updated data date from 1999). 7C10 VL has thus been identified as belonging to subgroup II of Kappa light chains as defined by Kabat et al. (In Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th edn.), NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991). VL regions of mouse monoclonal antibodies having sequence identity of up to 95% have been identified (DRB 1-4.3 (SEQ ID No. 55): 95% and C94-5B11'CL (SEQ ID No 56): 95%, see Figure 17). In an attempt to identify the

résidus hors du commun dans la séquence de 7C10 VL, la séquence en acides aminés de 7C10 VL (SEQ ID No. 54) a été alignée avec la séquence consensus du sous-groupe II des chaînes kappa de souris (SEQ ID No. 57) comme défini par Kabat (voir figure 17). uncommon residues in the sequence of 7C10 VL, the amino acid sequence of 7C10 VL (SEQ ID No. 54) was aligned with the consensus sequence of mouse kappa subgroup II (SEQ ID No. 57) as defined by Kabat (see Figure 17).

A la position Kabat numéro 3, la valine (V) normalement présente dans le sousgroupe II des chaînes légères Kappa selon Kabat (71 %) est remplacée par une leucine (L). Une leucine à cette position n'est pas rare puisqu'on la trouve par exemple dans DRB1-4. 3 et C94-5B11'CL. D'après le modèle moléculaire, ce résidu ne semble pas jouer un rôle particulier. En conséquence la conservation de ce résidu dans la forme humanisée ne sera pas envisagée. At the Kabat position number 3, the valine (V) normally present in subgroup II Kappa light chains according to Kabat (71%) is replaced by a leucine (L). A leucine at this position is not uncommon since it is found for example in DRB1-4. 3 and C94-5B11'CL. According to the molecular model, this residue does not seem to play a particular role. As a consequence, the preservation of this residue in the humanized form will not be considered.

A la position Kabat numéro 7, la thréonine (T) normalement présente dans le sous-groupe II des chaînes légères Kappa selon Kabat (66 %) est remplacée par une isoleucine (1). Une isoleucine à cette position est relativement rare puisqu'on ne la trouve que 15 fois parmi toutes les séquences VL de souris connues et jamais parmi des séquences VL humaines. Le modèle moléculaire montre que ce résidu (17) pointe vers la surface de la molécule mais ne contacte pas les CDRs (le résidu d'un CDR le plus proche serait l'arginine à la position Kabat numéro 42). De plus, il semble peu probable que ce résidu 17 contacte directement l'antigène. En conséquence la conservation de ce résidu dans la forme humanisée ne sera pas envisagée du moins dans un premier temps. At the Kabat position number 7, the threonine (T) normally present in subgroup II Kappa light chains according to Kabat (66%) is replaced by an isoleucine (1). Isoleucine at this position is relatively rare since it is found only 15 times among all known mouse VL sequences and never among human VL sequences. The molecular model shows that this residue (17) points towards the surface of the molecule but does not contact the CDRs (the residue of a closest CDR would be arginine at Kabat position number 42). Moreover, it seems unlikely that this residue 17 directly contacts the antigen. Consequently, the preservation of this residue in the humanized form will not be considered at least initially.

A la position Kabat numéro 77, l'arginine (R) normalement présente dans le sous-groupe Il des chaînes légères Kappa selon Kabat (95,5 %) est remplacée par une sérine (S). Une Sérine à cette position n'est pas rare. b) Comparaison de la séquence en acides aminés de 7C10 VL avec toutes les séquences humaines VL connues
Afin d'identifier le meilleur candidat humain pour le CDR-grafting on a recherché la région VL kappa d'origine humaine ayant la plus grande homologie possible avec 7C10 VL. A cette fin, on a comparé la séquence en acides aminés de 7C10 VL kappa de souris avec toutes les séquences VL kappa humaines présentes dans la base de données de Kabat. 7C10 VL de souris avait la plus grande homologie de séquence avec les régions VL kappa humaines du sous-groupe Il comme défini par Kabat et al. (1991). Des régions VH d'anticorps monoclonaux d'origine humaine ont été identifiées ayant une identité de séquences allant jusqu'à 75,9 % (GM607 (SEQ ID No. 58), voir At the Kabat position number 77, the arginine (R) normally present in subgroup Il Kappa light chains according to Kabat (95.5%) is replaced by a serine (S). A Serine at this position is not uncommon. b) Comparison of the amino acid sequence of 7C10 VL with all known human VL sequences
In order to identify the best human candidate for CDR-grafting, the human-derived kappa VL region with the highest possible homology with 7C10 VL was searched for. For this purpose, the amino acid sequence of 7C10 VL mouse kappa was compared with all human kappa VL sequences present in the Kabat database. Mouse 7C10 VL had the highest sequence homology with human kappa VL regions of subgroup Il as defined by Kabat et al. (1991). VH regions of monoclonal antibodies of human origin have been identified having a sequence identity of up to 75.9% (GM607 (SEQ ID No. 58), see

figure 18) sur la totalité des 112 acides aminés composant la région variable. Une lignée germinale d'origine humaine, DPKI5/AI9 (SEQ ID No. 59), ayant une identité de séquence de 76 % (voir figure 18) fut aussi identifiée. GM607 (Klobeck et al., 1984). GM607 fut donc choisi comme séquence humaine receveuse des CDRs (selon la définition de Kabat) de 7C10 VL de souris. En comparant les séquences de GM607 avec celle de la séquence consensus du sous-groupe II humain (SEQ ID No. 60) (figure 18), aucun résidu particulier dans les régions charpentes (Rch) ne put être identifié, indiquant par là même que GM607 était un bon candidat pour le CDR-grafting. c) Versions humanisées de 7ClO VL
L'étape suivante dans le procédé d'humanisation consista à joindre les CDRs de 7C10 VL de souris aux régions charpentes (Rch) de la chaîne légère humaine sélectionnée, GM607 (Klobeck et al., 1984). A ce stade du procédé le modèle moléculaire des régions Fv de souris de 7C10 est particulièrement utile dans le choix des résidus de souris à conserver car pouvant jouer un rôle soit dans le maintien de la structure tridimensionnelle de la molécule (structure canonique des CDRs, interface VH/VL, etc. ) ou dans la liaison à l'antigène. Dans les Rch, chaque différence entre les acides aminés de souris (7C10 VL) et humain (GM607) a été examinée scrupuleusement (voir Tableau 5). De plus, les résidus particuliers à la séquence 7C10 VL de souris que l'on avait identifiés (voir Exemple 12. a)) ont été pris en compte si besoin était. Figure 18) on all 112 amino acids composing the variable region. A germline of human origin, DPKI5 / AI9 (SEQ ID No. 59), having a sequence identity of 76% (see Fig. 18) was also identified. GM607 (Klobeck et al., 1984). GM607 was therefore chosen as the recipient human sequence of CDRs (according to the definition of Kabat) of 7C10 VL of mice. By comparing the GM607 sequences with that of the consensus sequence of human subgroup II (SEQ ID No. 60) (Fig. 18), no particular residues in the framework regions (Rch) could be identified, thereby indicating that GM607 was a good candidate for CDR-grafting. c) Humanized versions of 7ClO VL
The next step in the humanization process was to join the mouse 7C10 VL CDRs to the framework regions (Rch) of the selected human light chain, GM607 (Klobeck et al., 1984). At this stage of the method, the molecular model of mouse Fv regions of 7C10 is particularly useful in the choice of mouse residues to be conserved because they may play a role either in maintaining the three-dimensional structure of the molecule (canonical structure of the CDRs, interface VH / VL, etc.) or in antigen binding. In the Rchs, each difference between mouse (7C10 VL) and human (GM607) amino acids was carefully examined (see Table 5). In addition, residues specific to the mouse 7C10 VL sequence that had been identified (see Example 12.a)) were taken into account if necessary.

Dans la première version humanisée par CDR-grafting de 7C10 VL, humain 1, un seul changement dans les régions charpentes (Rch) de GM607 a été effectué. Ce changement concerne le résidu 2 (nomenclature de Kabat) situé dans Rch 1. Ce résidu entre en effet dans la composition de la structure canonique du CDR 1 de 7C10 VL et pourrait donc être critique pour le maintien de cette loupe dans sa bonne conformation. In the first version humanized by CDR-grafting of 7C10 VL, human 1, only one change in the framework regions (Rch) of GM607 was made. This change concerns residue 2 (Kabat nomenclature) located in Rch 1. This residue indeed enters into the composition of the canonical structure of CDR 1 of 7C10 VL and could therefore be critical for the maintenance of this magnifying glass in its good conformation.

La valine présente à cette position dans la séquence 7C10 VL de souris est donc conservée à cette même position dans la forme humanisée (voir le Tableau 5 et la figure 19 pour la séquence en acides aminés (SEQ ID No. 61) et la figure 20 pour la séquence ADN (SEQ ID Nos. 62 et 64) et la séquence en acides aminés comprenant le peptide signal (SEQ ID No. 63). Valine present at this position in the mouse sequence 7C10 VL is therefore conserved at this same position in the humanized form (see Table 5 and Figure 19 for the amino acid sequence (SEQ ID No. 61) and FIG. for the DNA sequence (SEQ ID Nos. 62 and 64) and the amino acid sequence comprising the signal peptide (SEQ ID No. 63).

Dans la deuxième version humanisée par CDR-grafting de 7C 10 VL, humain 2, aucun changement dans les Rchs de la chaîne légère humaine GM 607 n'a été fait. In the second version humanized by CDR-grafting of 7C10 VL, human 2, no change in the Rchs of the human light chain GM 607 was made.

Tous les résidus des Rchs sont donc d'origine humaine y compris le résidu 2 qui a donc été muté pour remplacer la valine présente dans 7C10 VL de souris par une isoleucine trouvée à cette même position dans la chaîne légère humaine GM 607 (voir le Tableau 5 et la figure 19 pour la séquence en acides aminés (SEQ ID No. 65) et la figure 21 pour la séquence ADN (SEQ ID Nos. 66 et 68) et la séquence en acides aminés comprenant le peptide signal (SEQ ID No. 67)). Cette forme humaine 2 est donc totalement humanisée (en dehors bien entendu des CDRs eux-mêmes) puisque tous les résidus des Rchs sont ceux de la chaîne légère d'origine humaine, GM 607. All residues of Rchs are thus of human origin including residue 2 which has thus been mutated to replace the valine present in 7C10 VL of mice with an isoleucine found at this same position in the GM 607 human light chain (see Table And Figure 19 for the amino acid sequence (SEQ ID No. 65) and Figure 21 for the DNA sequence (SEQ ID Nos. 66 and 68) and the amino acid sequence comprising the signal peptide (SEQ ID No. 67)). This human form 2 is therefore completely humanized (apart of course from the CDRs themselves) since all the residues of the Rchs are those of the light chain of human origin, GM 607.

TABLEAU 5 : Alignement des séquences d'amino acides ayant conduit au dessin des régions 7CIO VL humaines refaçonnées

TABLE 5: Alignment of the amino acid sequences which led to the drawing of reshaped human 7C10 VL regions

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Légende : La première colonne (Kabat) indique la position du résidu d'acide aminé selon Kabat et al. (1991) ; la deuxième colonne (&num;) indique la position du résidu d'acide <Tb>
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Caption: The first column (Kabat) indicates the position of the amino acid residue according to Kabat et al. (1991); the second column (&num;) indicates the position of the acid residue

aminé dans la séquence régulière ; la troisième colonne (FR ou CDR) a été réalisée pour

identifier facilement les segments du squelette (FR1, FR2, FR3 et FR4) et les segments CDR (CDR1, CDR2 et CDR3) ("CDR"pour"Complementary-Detennining Region") avec les trois CDRs séparant les quatre FRs ; la quatrième colonne (Chaîne légère de souris 7C10) représente la séquence d'amino acides (SEQ ID No. 54) de la région VL de l'anticorps de souris 7C10 ; la cinquième colonne (Lignée germinale humaine DPK15/A19) représente la séquence d'amino acides (SEQ ID No. 59) de la chaîne légère humaine V kappa II de la lignée germinale ; la sixième colonne (GM 607) représente la séquence d'amino acides (SEQ ID No. 58) de la région VL de l'anticorps GM 607 humain ; les septième et huitième colonnes (7C10 L humains 1 et 2 refaçonnés) représentent les séquences d'amino acides des anticorps 7C10 VL humanisée 1 et 2 (respectivement SEQ ID Nos. 61 et 65)."*"indique les parties de la structure canonique de la boucle CDR telle que définie par Chothia et al. (Nature, 342,877-883, 1989). amine in the regular sequence; the third column (FR or CDR) was produced for

easily identify backbone segments (FR1, FR2, FR3 and FR4) and CDR segments (CDR1, CDR2 and CDR3) ("CDR" for "Complementary-Detennining Region") with the three CDRs separating the four FRs; the fourth column (mouse light chain 7C10) represents the amino acid sequence (SEQ ID No. 54) of the VL region of mouse antibody 7C10; the fifth column (DPK15 / A19 human germline) represents the amino acid sequence (SEQ ID No. 59) of the human kappa II V light chain of the germ line; the sixth column (GM 607) represents the amino acid sequence (SEQ ID No. 58) of the VL region of the human GM 607 antibody; the seventh and eighth columns (reshaped human 7C10 L 1 and 2) represent the amino acid sequences of humanized 7C10 VL antibodies 1 and 2 (SEQ ID Nos. 61 and 65 respectively). "*" indicates the parts of the canonical structure of the CDR loop as defined by Chothia et al. (Nature, 342, 877-883, 1989).

Exemple 13. Processus d'humanisation par CDR-grafting de la région variable de

la chaîne lourde de l'anticorps 7CI0 (7CIO VH) a) Comparaison de la séquence en acides aminés de 7C10 VH avec toutes les séquences de souris VH connues
Comme étape préliminaire à l'humanisation par CDR-grafting, la séquence en acides aminés de 7C 10 VH a été comparée dans un premier temps à toutes les séquences de VH de souris présentes dans la banque de données de Kabat (adresse Internet :

ftp ://ftp. ebi. ac. uk/pub/database/kabat/fasta~format/, dernière mise à jour des données date de 1999). 7C10 VH a ainsi été identifié comme appartenant au sous-groupe I (A) des chaînes lourdes comme défini par Kabat et al. (1991). Des régions VH d'anticorps monoclonaux de souris ayant une identité de séquences allant jusqu'à 90,5 % ont été identifiées (AN03'CL (SEQ ID No. 70), voir figure 22). Afin de tenter d'identifier les résidus hors du commun dans la séquence de 7C10 VH, nous avons aligné la séquence en acides aminés de 7C10 VH (SEQ ID No. 69) avec la séquence consensus (SEQ ID No. 71) du sous-groupe I (A) des chaînes lourdes de souris comme défini par Kabat (voir figure 22). Example 13. Humanization process by CDR-grafting of the variable region of

the heavy chain of the antibody 7C10 (7CIO VH) a) Comparison of the amino acid sequence of 7C10 VH with all the known VH mouse sequences
As a preliminary step to humanization by CDR grafting, the amino acid sequence of 7C VH was first compared to all the mouse VH sequences present in the Kabat database (Internet address:

ftp: // ftp. ebi. ac. uk / pub / database / kabat / fasta ~ format /, last data update dates from 1999). 7C10 VH has thus been identified as belonging to the subgroup I (A) of the heavy chains as defined by Kabat et al. (1991). VH regions of mouse monoclonal antibodies having a sequence identity of up to 90.5% have been identified (AN03'CL (SEQ ID No. 70), see Figure 22). In an attempt to identify the uncommon residues in the 7C10 VH sequence, we aligned the amino acid sequence of 7C10 VH (SEQ ID No. 69) with the consensus sequence (SEQ ID No. 71) of the subclass. group I (A) mouse heavy chains as defined by Kabat (see Figure 22).

Le résidu 17 (numérotation de Kabat), Thr pour la séquence consensus du sousgroupe I (A) et Ser dans 7C10 VH, est localisé à la surface de la molécule du côté de l'interface avec la région constante. Ce résidu ne semble pas important. The residue 17 (Kabat numbering), Thr for the consensus sequence of subgroup I (A) and Ser in 7C10 VH, is located on the surface of the molecule on the interface side with the constant region. This residue does not seem important.

Le résidu 27 (numérotation de Kabat), Asp pour la séquence consensus du sousgroupe I (A) et Tyr dans 7C10 VH, est un résidu canonique pour le CDR 1. Tyr à cette position n'est pas rare et est probablement critique pour le maintien du CDR 1 dans sa bonne conformation. The residue 27 (Kabat numbering), Asp for the consensus sequence of subgroup I (A) and Tyr in 7C10 VH, is a canonical residue for CDR 1. Tyr at this position is not uncommon and is probably critical for the maintaining CDR 1 in its correct conformation.

Le résidu 84 (numérotation de Kabat), Thr pour la séquence consensus du sousgroupe I (A) et Asn dans 7C10 VH. Asn, a été trouvé 93 fois dans VH de souris et 3 fois dans VH humaine. D'après le modèle moléculaire, c'est un résidu de surface éloigné du paratope. The residue 84 (Kabat numbering), Thr for the consensus sequence of subgroup I (A) and Asn in 7C10 VH. Asn, was found 93 times in mouse VH and 3 times in human VH. According to the molecular model, it is a surface residue far from the paratope.

La numérotation des acides aminées est celle de Kabat et al. (1991). Les résidus dans les régions charpentes (hors CDRs) qui diffèrent entre 7C10 VH et Kabat sousgroupe I (A) de souris sont soulignés. AN03'CL représente la séquence de la chaîne lourde d'un anticorps de souris (numéro d'accès dans la banque de données de Kabat est P001289). b) Comparaison de la séquence en acides aminés de 7C10 VH avec toutes les séquences humaines VH connues Afin d'identifier le meilleur candidat humain pour le CDR-grafting , on a recherché la région VH d'origine humaine ayant la plus grande homologie possible avec 7C10 VH. A cette fin on a comparé la séquence en acides aminés de 7C10 VH de souris avec toutes les séquences VH humaines présentes dans la base de données de Kabat. The numbering of amino acids is that of Kabat et al. (1991). The residues in the framework regions (excluding CDRs) that differ between 7C10 VH and Kabat subgroup I (A) of mice are underlined. AN03'CL represents the heavy chain sequence of a mouse antibody (access number in the Kabat databank is P001289). b) Comparison of the amino acid sequence of 7C10 VH with all known human VH sequences In order to identify the best human candidate for CDR-grafting, the human-made VH region having the greatest homology possible with 7C10 VH. For this purpose, the amino acid sequence of mouse 7C10 VH was compared with all human VH sequences present in the Kabat database.

7C10 VH de souris avait la plus grande homologie de séquence avec les régions VH humaines du sous-groupe II comme défini par Kabat et al. (1991). Des régions VH d'anticorps monoclonaux d'origine humaine ont été identifiées ayant une identité de séquences allant jusqu'à 67, 3 % (human VH FURl'CL (SEQ ID No. 73, voir figure 23) sur la totalité des 98 acides aminés codés par le gène variable (c'est-à-dire hors CDR3 et région J). Une lignée germinale d'origine humaine, 4. 22 VH IV (Sanz et al., 1989), ayant une identité de séquence de 68, 4 %, selon les mêmes critères que pour VH FURl'CL, fut aussi identifiée (human Germ-line (SEQ ID No. 74), voir figure 23). La séquence codée par la lignée germinale 4. 22 VH IV fut choisie comme séquence Mouse 7C10 VH had the highest sequence homology with the human VH regions of subgroup II as defined by Kabat et al. (1991). VH regions of monoclonal antibodies of human origin have been identified having a sequence identity of up to 67.3% (human VH FUR1'CL (SEQ ID No. 73, see FIG. 23) on all 98 acids. amines encoded by the variable gene (i.e., excluding CDR3 and J region) A germ line of human origin, 4. 22 VH IV (Sanz et al., 1989), having a sequence identity of 68 4%, according to the same criteria as for VH FUR1'CL, was also identified (human Germ-line (SEQ ID No. 74), see Fig. 23) .The sequence encoded by the germ line 4. 22 VH IV was chosen as a sequence

humaine receveuse des CDRs (selon la définition de Kabat) de 7C10 VH de souris plutôt que VH FURl'CL car en comparant les séquences de 4.22 VH IV et VH FURS'CL avec celle de la séquence consensus du sous-groupe II humain (human Kabat sg II (SEQ ID No. 72), voir figure 23 et tableau 6), aucun résidu atypique dans les régions charpentes (Rch) ne put être identifié pour 4.22 VH IV alors que la présence de deux résidus atypiques (Gln et Arg aux positions 81 et 82A selon la nomenclature de Kabat, respectivement) furent identifiés dans la séquence codée par VH FUR1'CL. c) Versions humanisées de 7C 10 VH
L'étape suivante dans le procédé d'humanisation consista à joindre les CDRs de 7C10 VH de souris aux régions charpentes (Rch) de la lignée germinale humaine 4.22 VH IV (Sanz et al., 1989). A ce stade du procédé, le modèle moléculaire des régions Fv de souris de 7C10 est particulièrement utile dans le choix des résidus de souris à conserver car pouvant jouer un rôle soit dans le maintien de la structure tridimensionnelle de la molécule (structure canonique des CDRs, interface VH/VL, etc. ) ou dans la liaison à l'antigène (appartenance au paratope). Dans les Rch, chaque différence entre les acides aminés de souris (7C10 VH) et humain (4.22 VH IV) a été examinée scrupuleusement (voir Tableau 6). De plus, les résidus particuliers à la séquence 7C10 VH de souris que l'on avait identifiés (voir Exemple 8. a)) ont été pris en compte si besoin était. human recipient of CDRs (according to Kabat's definition) of mouse 7C10 VH rather than VH FUR1'CL because by comparing the sequences of 4.22 VH IV and VH FURS'CL with that of the consensus sequence of human subgroup II (human Kabat sg II (SEQ ID NO: 72), see Figure 23 and Table 6), no atypical residues in the framework regions (Rch) could be identified for 4.22 VH IV while the presence of two atypical residues (Gln and Arg at positions 81 and 82A according to Kabat nomenclature, respectively) were identified in the sequence encoded by VH FUR1'CL. c) Humanized versions of 7C 10 VH
The next step in the humanization process was to join the mouse 7C10 VH CDRs to the framework regions (Rch) of the human 4.22 VH IV germline (Sanz et al., 1989). At this stage of the method, the molecular model of mouse Fv regions of 7C10 is particularly useful in the choice of mouse residues to be conserved because they may play a role either in maintaining the three-dimensional structure of the molecule (canonical structure of the CDRs, VH / VL interface, etc.) or in antigen binding (paratope membership). In the Rchs, each difference between mouse (7C10 VH) and human (4.22 VH IV) amino acids was carefully examined (see Table 6). In addition, residues specific to the mouse 7C10 VH sequence that had been identified (see Example 8.a)) were taken into account if necessary.

Dans la première version humanisée par CDR-grafting de 7C10 VH, humanisé 1, quatre changements dans les régions charpentes (Rch) de 4.22 VH IV ont été effectués (voir le Tableau 6, figure 24 pour la séquence en acides aminés (SEQ ID No. 75) et la figure 25 pour la séquence d'ADN (SEQ ID Nos. 76 et 78) et la séquence d'acides aminés comprenant le peptide signal (SEQ ID No. 77)). Ces quatre changements concernent : Le résidu 30 (nomenclature de Kabat) situé dans Rch 1. Ce résidu entre en effet dans la composition structurale du CDR1 de 7C10 VH (comme défini par Chothia et al.,
1989) et pourrait donc être critique pour le maintien de cette loupe dans sa bonne conformation. La Thr présente à cette position dans la séquence 7C10 VH de souris est donc conservée à cette même position dans la forme humanisée. In the first version humanized by CDR-grafting of 7C10 VH, humanized 1, four changes in the framework regions (Rch) of 4.22 VH IV were performed (see Table 6, Figure 24 for the amino acid sequence (SEQ ID No 75) and Figure 25 for the DNA sequence (SEQ ID Nos. 76 and 78) and the amino acid sequence comprising the signal peptide (SEQ ID No. 77)). These four changes concern: The residue (Kabat nomenclature) located in Rch 1. This residue indeed enters into the structural composition of CDR1 of 7C10 VH (as defined by Chothia et al.,
1989) and could therefore be critical for maintaining this magnifying glass in its proper conformation. The Thr present at this position in the mouse 7C10 VH sequence is therefore conserved at this same position in the humanized form.

'Le résidu 48 (nomenclature de Kabat) situé dans Rch 2. Ce résidu est proche des CDRs, bien que d'après le modèle moléculaire pas en contact direct avec ces derniers, et pourrait influer sur leur conformation fine. La méthionine présente à cette position dans la séquence 7C10 VH de souris est donc conservée à cette même position dans la forme humanisée 1.

The residue 48 (Kabat nomenclature) located in Rch 2. This residue is close to the CDRs, although according to the molecular model not in direct contact with them, and could influence their fine conformation. The methionine present at this position in the mouse 7C10 VH sequence is therefore conserved at this same position in the humanized form 1.

* Le résidu 67 (nomenclature de Kabat) situé dans Rch 3. Ce résidu est proche des
CDRs et d'après le modèle moléculaire pourrait contacter la Lysine 60 (nomenclature de Kabat) dans le CDR 2. L'isoleucine présente à cette position dans la séquence 7C10 VH de souris est donc conservée à cette position dans la forme humanisée 1. * The residue 67 (nomenclature Kabat) located in Rch 3. This residue is close to
CDRs and according to the molecular model could contact Lysine 60 (Kabat nomenclature) in CDR 2. The isoleucine present at this position in the mouse 7C10 VH sequence is therefore conserved at this position in the humanized form 1.

'Le résidu 71 (nomenclature de Kabat) situé dans Rch 3. Ce résidu fait partie de la structure canonique du CDR 2 et devrait donc être critique pour maintenir cette loupe dans sa bonne conformation. L'arginine présente à cette position dans la séquence 7C10 VH de souris est donc conservée à cette position dans la forme humanisée 1. The residue 71 (Kabat nomenclature) located in Rch 3. This residue is part of the canonical structure of CDR 2 and should therefore be critical to maintain this magnifying glass in its proper conformation. The arginine present at this position in the mouse 7C10 VH sequence is thus conserved at this position in the humanized form 1.

Dans la deuxième version humanisée par CDR-grafting de 7C10 VH, humanisé 2, deux changements dans les régions charpentes (Rch) de 4.22 VH IV ont été effectués. Ces deux changements concernent les résidus 30 et 71 (nomenclature de Kabat), déjà décrits dans la forme humanisée 1 (voir le Tableau 6, figure 24 pour la séquence en acides aminés (SEQ ID No. 79) et la figure 26 pour la séquence d'ADN (SEQ ID Nos. 80 et 82) et la séquence d'acides aminés comprenant le peptide signal (SEQ ID No. 81)). In the second version humanized by CDR-grafting of 7C10 VH, humanized 2, two changes in the framework regions (Rch) of 4.22 VH IV were made. These two changes concern residues 30 and 71 (Kabat nomenclature), already described in humanized form 1 (see Table 6, FIG. 24 for the amino acid sequence (SEQ ID No. 79) and FIG. 26 for the sequence DNA (SEQ ID Nos. 80 and 82) and the amino acid sequence comprising the signal peptide (SEQ ID No. 81)).

Dans la troisième forme humanisée par CDR-grafting de 7C10 VH, humanisé 3, aucun changement dans les régions charpentes (Rch) de 4.22 VH IV n'a été effectué. Tous les résidus des Rchs sont donc d'origine humaine y compris les résidus 30,48, 67 et 71 (nomenclature de Kabat) qui ont été conservés (voir le Tableau 6, figure 24 pour la séquence en acides aminés (SEQ ID No. 83) et la figure 27 pour la séquence d'ADN (SEQ ID Nos. 84 et 86) et la séquence d'acides aminés comprenant le peptide signal (SEQ ID No. 85)). Cette forme humanisée 3 est donc totalement humanisée (en dehors bien entendu des CDRs eux-mêmes comme défini par Kabat) puisque tous les résidus des Rchs sont ceux codés par le gène VH de la lignée germinale 4.22 VH IV. In the third form humanized by CDR-grafting of 7C10 VH, humanized 3, no change in the framework regions (Rch) of 4.22 VH IV was performed. All residues of Rchs are therefore of human origin including residues 30,48, 67 and 71 (nomenclature of Kabat) which have been preserved (see Table 6, figure 24 for the amino acid sequence (SEQ ID No. 83) and Figure 27 for the DNA sequence (SEQ ID Nos. 84 and 86) and the amino acid sequence comprising the signal peptide (SEQ ID No. 85)). This humanized form 3 is therefore completely humanized (apart of course from the CDRs themselves as defined by Kabat) since all the residues of the Rchs are those encoded by the VH gene of the germ line 4.22 VH IV.

TABLEAU 6 : Alignement des séquences d'amino acides ayant conduit au dessin des régions 7C10 VH humaines refaçonnées

TABLE 6: Alignment of amino acid sequences leading to the drawing of reshaped human 7C10 VH regions

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Légende : La première colonne (Kabat) indique la position du résidu d'acide aminé selon Kabat et al. (1991) ; la deuxième colonne (FR ou CDR) a été réalisée pour identifier facilement les segments du squelette (FR1, FR2, FR3 et FR4) et les segments CDR (CDR1, CDR2 et CDR3) avec les trois CDRs séparant les quatre FRs ; la troisième colonne (Chaîne lourde de souris 7C10) représente la séquence d'amino

acides (SEQ ID No. 69) de la région VH de l'anticorps de souris 7C10 ; la quatrième colonne (Lignée germinale 4. 22 VH IV) représente la séquence d'amino acides du gène 4. 22 VH IV (Sanz et al., 1989) (SEQ ID No. 74) ; la cinquième colonne (FURl'CL VH humaine, kabat numéro d'accession N020619) représente la séquence d'amino acides (SEQ ID No. 73) IgMK antilamine B d'origine humaine (Mariette et al., 1993) ; les sixième, septième et huitième colonnes (7C10 H humains 1,2 et 3 refaçonnés) représentent les séquences d'amino acides de la région VH de 7C10 humain refaçonné respectivement pour les versions 1 (SEQ ID No. 75), 2 (SEQ ID No. 79) et 3 (SEQ ID No. 83)."*" indique les parties de la structure canonique de la boucle CDR telle que définie par Chothia et al. (1989). <Tb>
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Caption: The first column (Kabat) indicates the position of the amino acid residue according to Kabat et al. (1991); the second column (FR or CDR) was performed to easily identify backbone segments (FR1, FR2, FR3 and FR4) and CDR segments (CDR1, CDR2 and CDR3) with the three CDRs separating the four FRs; the third column (mouse heavy chain 7C10) represents the amino sequence

acids (SEQ ID NO: 69) of the VH region of mouse antibody 7C10; the fourth column (4.22 VH IV germline) represents the amino acid sequence of the VH IV gene 4. (Sanz et al., 1989) (SEQ ID No. 74); the fifth column (FUR1'CL VH human, kabat accession number N020619) represents the amino acid sequence (SEQ ID No. 73) IgMK antilamine B of human origin (Mariette et al., 1993); the sixth, seventh and eighth columns (reshaped human 7C10H 1,2 and 3) represent the amino acid sequences of the VH region of human 7C10 reshaped respectively for versions 1 (SEQ ID No. 75), 2 (SEQ ID No. 79) and 3 (SEQ ID No. 83). "*" Indicates the parts of the canonical structure of the CDR loop as defined by Chothia et al. (1989).

Exemple 14. Construction des gènes codant pour les versions humanisées 1 de
7C10 VL et VH par assemblage d'oligonucléotides. a) Principe
Les gènes (peptide leader + régions variables VDJ pour VH ou VJ pour VK) codant pour les régions variables humanisées ont été synthétisés par assemblage en phase solide sur billes magnétiques cotées à la streptavidine. Les gènes codant pour 7C10 VH humanisée (445 paires de bases) et 7C10 VL humanisée (433 paires de bases) sont construits en fusionnant deux fragments d'ADN grâce à la présence d'un site de restriction Kpnl présent dans les deux séquences et situé à peu près à la moitié du gène (à 200 et 245 nucléotides par rapport à l'extrémité 5'du gène pour VL et VH, respectivement). Les deux fragments qui sont fusionnés ensemble sont eux-mêmes assemblés par une technique d'assemblage qui consiste à utiliser des oligonucléotides phosphorylés (environ 30-35 mer) hybridés deux par deux (un oligo sens et l'autre antisens, sur une homologie d'environ 50 %) de façon à ce qu'ils se chevauchent lors de l'élongation. Un premier oligonucléotide biotinylé en 5'est fixé sur les billes magnétiques puis les paires d'oligonucléotides phosphorylés sont rajoutées une par une. Example 14. Construction of genes encoding humanized versions 1 of
7C10 VL and VH by assembly of oligonucleotides. a) Principle
The genes (leader peptide + VDJ variable regions for VH or VJ for VK) encoding the humanized variable regions were synthesized by solid phase assembly on streptavidin-labeled magnetic beads. The genes encoding humanized 7C10 VH (445 base pairs) and humanized 7C10 VL (433 base pairs) are constructed by fusing two DNA fragments through the presence of a KpnI restriction site present in both sequences and located about half of the gene (at 200 and 245 nucleotides to the 5 'end of the gene for VL and VH, respectively). The two fragments which are fused together are themselves assembled by an assembly technique which consists in using phosphorylated oligonucleotides (approximately 30-35 mer) hybridized two by two (one sense oligo and the other antisense, on a homology d about 50%) so that they overlap during elongation. A first biotinylated oligonucleotide 5 is attached to the magnetic beads and the pairs of phosphorylated oligonucleotides are added one by one.

La liaison phosphodiester entre les oligonucléotides phosphorylés juxtaposés est réalisée par l'enzyme T4 DNA ligase. The phosphodiester bond between the juxtaposed phosphorylated oligonucleotides is carried out by the enzyme T4 DNA ligase.

Les gènes ainsi synthétisés de novo peuvent être directement clonés (par digestion avec des enzymes de restriction compatibles avec le vecteur d'expression choisi) ou amplifiés par PCR pour obtenir plus de matériel en préambule au clonage directionnel par digestion enzymatique. La séquence du gène ainsi construit par assemblage de novo est alors vérifiée par séquençage automatique de l'ADN. b) Protocole expérimental de la technique d'assemblage de novo
Des oligonucléotides phosphorylés en 5'ou biotinylés en 5'dont la concentration a été ajustée à 100 uM ont été commandés chez MWG Biotech (voir les séquences des oligonucléotides utilisés dans le Tableau 7 pour la construction de 7C10 VL humanisée, et le Tableau 8 pour la construction de 7C10 VH humanisée). Les oligonucléotides ont été hybridés par paires (un mélange équimolaire, 500 pmoles, d'un oligo sens et d'un oligo antisens dans le tampon T4 DNA ligase est chauffé à 950C pendant 5 minutes puis The genes thus synthesized de novo can be directly cloned (by digestion with restriction enzymes compatible with the chosen expression vector) or amplified by PCR to obtain more material in the preamble to directional cloning by enzymatic digestion. The gene sequence thus constructed by de novo assembly is then verified by automatic sequencing of the DNA. b) Experimental protocol of the de novo assembly technique
5 'or biotinylated 5'-phosphorylated oligonucleotides whose concentration was adjusted to 100 μM were ordered from MWG Biotech (see the sequences of the oligonucleotides used in Table 7 for the construction of humanized 7C10 VL, and Table 8 for the construction of humanized 7C10 VH). The oligonucleotides were hybridized in pairs (an equimolar mixture, 500 pmol, of a trace and an antisense oligo in the T4 DNA ligase buffer is heated at 950C for 5 minutes then

laissé à refroidir sur la paillasse jusqu'à température ambiante) selon un schéma décrit dans le Tableau 9. allowed to cool on the bench to room temperature) according to a scheme described in Table 9.

Le premier oligonucléotide biotinylé est fixé sur des billes magnétiques cotées à la streptavidine (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal product no 112-05). Pour cela, à 50 ul de billes décantées (utilisation d'un porte aimant) préalablement lavées deux fois avec 100 ul de tampon TE IX (tampon Tris-EDTA 100X : 1M Tris-HCl, pH 8,0, 1 M EDTA, Sigma T-9285) on ajoute 500 pmol de l'oligonucléotide biotinylé dans une solution NaCI à 15 mM. Après une incubation à 37 C pendant 15 min, les billes sont lavées deux fois avec le tampon de lavage (10 mM Tris-HCI pH 7,6, 10 mM EDTA et 50 mM NaCI) et les couples d'oligonucléotides hybridés sont alors ajoutés un par un. A chaque rajout d'une paire d'oligonucléotides on chauffe à 95 C pendant 5 min puis on laisse refroidir sur la paillasse jusqu'à température ambiante. Une fois la température

ambiante atteinte, on ajoute de 2 ul de T4 DNA ligase à 10 U/1l1 (Biolabs) et on incube pendant 20 min à 37 C. Les billes sont ensuite lavées (tampon de lavage) et les paires d'oligonucléotides suivantes sont ajoutées ainsi de suite. The first biotinylated oligonucleotide is attached to streptavidin-labeled magnetic beads (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal product No. 112-05). For this, 50 μl of decanted beads (use of a magnet carrier) previously washed twice with 100 μl of TE IX buffer (100X Tris-EDTA buffer: 1M Tris-HCl, pH 8.0, 1 M EDTA, Sigma T-9285) 500 pmol of the biotinylated oligonucleotide is added in a 15 mM NaCl solution. After incubation at 37 ° C. for 15 minutes, the beads are washed twice with the washing buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM EDTA and 50 mM NaCl) and the hybridized oligonucleotide pairs are then added. one by one. Each addition of a pair of oligonucleotides is heated at 95 C for 5 min and then allowed to cool on the bench to room temperature. Once the temperature

2 μl of T4 DNA ligase (Biolabs) are added and the mixture is incubated for 20 min at 37 ° C. The beads are then washed (wash buffer) and the following oligonucleotide pairs are thus added. right now.

Le dernier oligo (antisens) non apparié est assemblé de la façon suivante. 5 (il d'oligo (500 pmol) et 43 III de tampon T4 DNA ligase sont ajoutés aux billes décantées puis on chauffe le mélange à 95 C pendant 5 min et on le laisse refroidir sur la paillasse jusqu'à température ambiante. Une fois la température ambiante atteinte on ajoute 2 ul de T4 DNA ligase et on incube à 37 C pendant 20 min. Les billes sont ensuite lavées deux fois avec le tampon de lavage puis deux fois avec le tampon TE IX. The last unpaired oligo (antisense) is assembled as follows. 5 μl of oligo (500 pmol) and 43 μl of T4 DNA ligase buffer are added to the decanted beads and the mixture is then heated at 95 ° C. for 5 minutes and allowed to cool on the bench to room temperature. at room temperature, 2 μl of T4 DNA ligase is added and incubated at 37 ° C. for 20 minutes The beads are then washed twice with washing buffer and then twice with TE IX buffer.

Les billes peuvent alors être conservées à 4 C avant de procéder au clonage et séquençage du gène assemblé de novo. The beads can then be stored at 4 C before cloning and sequencing the assembled de novo gene.

TABLEAU 7 : Séquence d'ADN des oligonucléotides ayant été utilisés pour la construction de 7C10 VL humanisée 1 par assemblage de novo LeaderMluI. biotin 5'-GTCAGAACGCGTGCCGCC (SEQ ID No. 87) 7ClOLresh. lsens 5'-ACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT (SEQ ID No. 88) 7ClOLresh. 2sens 5'-GATGTTCTGGTTTCCTGCTTCCAGCAGTGATG (SEQ ID No. 89) 7C10Lresh.3sens 5'-TTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCC (SEQ IDNo. 90) 7ClOLresh. 4sens 5'-GTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTG (SEQIDNo. 91) TABLE 7 DNA sequence of the oligonucleotides that were used for the construction of humanized 7C10 VL 1 by Novo LeaderMluI assembly. biotin 5'-GTCAGAACGCGTGCCGCC (SEQ ID No. 87) 7ClOLresh. lsens 5'-ACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT (SEQ ID NO: 88) 7ClOLresh. 2sens 5'-GATGTTCTGGTTTCCTGCTTCCAGCAGTGATG (SEQ ID NO: 89) 7C10Lresh.3sens 5'-TTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCC (SEQ ID NO: 90) 7ClOLresh. 4sens 5'-GTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTG (SEQ ID NO 91)

7ClOLresh. 5sens 5'-CAGGTCTAGTCAGACCATTATACATAGTAATG (SEQ ID No. 92) 7C1OLresh. 6sens 5'-GAAACACCTATTTGGAATGGTACCTGCAGA (SEQ ID No. 93) 7C1OLresh. 7anti 5'-GGCAACTTCATGGTGGCGGCACGCGTTCTGAC (SEQIDNo. 94) 7C1OLresh. 8anti 5'-GAAACCAGAACATCAGCACCAACAGCCTAACA (SEQ ID No. 95) 7C1OLresh. 9anti 5'-CTGAGTCATCACAACATCACTGCTGGAAGCAG (SEQ ID No. 96) 7C1OLresh. lOanti 5'-TCTCCAGGGGTGACGGGCAGGGAGAGTGGAGA (SEQ ID No. 97) 7C10Lresh. llanti 5'-TCTGACTAGACCTGCAGGAGATGGAGGCCGGC (SEQIDNo. 98) 7C10Lresh. 12anti 5'-AAATAGGTGTTTCCATTACTATGTACAATGC (SEQ ID No. 99) 7ClOLresh. 13sens 5'-CAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAA (SEQIDNo. 100) 7ClOLresh. 14sens 5'-GTTTCTAATCGGCTTTATGGGGTCCCTGACAG (SEQ ID No. 101) 7ClOLresh. 15sens 5'-GTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTA (SEQIDNo. 102) 7ClOLresh. 16sens 5'-CACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGAT (SEQ ID No. 103) 7ClOLresh. 17sens 5'-GTTGGGGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACA (SEQ ID No. 104) 7ClOLresh. 18sens 5'-TGTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG (SEQ ID No. 105) 7ClOLresh. 19sens 5'-TGGAAATCAAACGTGAGTGGATCCTCTGCG (SEQ ID No. 106)

7C1OLresh. KpnIREV 5'-TCTGCAGGTACCATTGC (SEQ ID No. 107) 7C1OLresh. Kpnlbiotin 5'-TGCAATGGTACCTGCAGAAGC (SEQ ID No. 108) 7C1OLresh. 20anti 5'-AGACTGCCCTGGCTTCTGCAGGTACCATTGCA (SEQ ID No. 109) 7C1OLresh. 21anti 5'-CGATTAGAAACTTTATAGATCAGGAGCTGTGG (SEQIDNo. 110) 7C1OLresh. 22anti 5'-TGCCACTGAACCTGTCAGGGACCCCATAAAGC (SEQ IDNo. 111) 7C1OLresh. 23anti 5'-GATTTTCAGTGTAAAATCTGTGCCTGATCCAC (SEQIDNo. 112) 7ClOLresh. 24anti 5'-TAAACCCCAACATCCTCAGCCTCCACTCTGCT (SEQ ID No. 113) 7ClOLresh. 25anti 5'-TCCACGGAACATGTGAACCTTGAAAGCAGTAA (SEQIDNo. 114) 7ClOLresh. 26anti 5'-TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAAC (SEQIDNo. 115) 7ClOLresh. BamHIantisens 5'-CGCAGAGGATCCACTCACG (SEQIDNo. 116) TABLEAU 8 : Séquence d'ADN des oligonucléotides ayant été utilisés pour la construction de 7C10 VH humanisée 1 par assemblage de novo LeaderMluI. biotin 5'-GTCAGAACGCGTGCCGCC (SEQ ID No. 117) 7ClOHresh. lsens 5'-ACCATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTCTTGA (SEQIDNo. 118) 7ClOHresh. 2sens 5'-CAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTCAGGTGCAGCT (SEQIDNo. 119) 7ClOHresh. 3sens 5'-TCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCG (SEQIDNo. 120) 7ClOHresh. 4sens 5'-GAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGT (SEQIDNo. 121) 7ClOLresh. 5'-CAGGTCTAGTCAGACCATTATACATAGTAATG (SEQ ID NO: 92) 7C1OLresh. 6sens 5'-GAAACACCTATTTGGAATGGTACCTGCAGA (SEQ ID NO: 93) 7C1OLresh. 7anti 5'-GGCAACTTCATGGTGGCGGCACGCGTTCTGAC (SEQ ID NO: 94) 7C1OLresh. 8anti 5'-GAAACCAGAACATCAGCACCAACAGCCTAACA (SEQ ID No. 95) 7C1OLresh. 9anti 5'-CTGAGTCATCACAACATCACTGCTGGAAGCAG (SEQ ID No. 96) 7C1OLresh. Anti 5'-TCTCCAGGGGTGACGGGCAGGGAGAGTGGAGA (SEQ ID NO: 97) 7C10Lresh. llanti 5'-TCTGACTAGACCTGCAGGAGATGGAGGCCGGC (SEQ ID NO: 98) 7C10Lresh. 12anti 5'-AAATAGGTGTTTCCATTACTATGTACAATGC (SEQ ID No. 99) 7ClOLresh. 13sens 5'-CAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAA (SEQ ID NO 100) 7ClOLresh. 14sens 5'-GTTTCTAATCGGCTTTATGGGGTCCCTGACAG (SEQ ID NO: 101) 7ClOLresh. 15sens 5'-GTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTA (SEQ ID NO 102) 7ClOLresh. 16sens 5'-CACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGAT (SEQ ID NO: 103) 7ClOLresh. 17sens 5'-GTTGGGGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACA (SEQ ID NO: 104) 7ClOLresh. 18sens 5'-TGTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG (SEQ ID NO: 105) 7ClOLresh. 19sens 5'-TGGAAATCAAACGTGAGTGGATCCTCTGCG (SEQ ID NO: 106)

7C1OLresh. KpnIREV 5'-TCTGCAGGTACCATTGC (SEQ ID No. 107) 7C1OLresh. Kpnlbiotin 5'-TGCAATGGTACCTGCAGAAGC (SEQ ID No. 108) 7C1OLresh. Anti 5'-AGACTGCCCTGGCTTCTGCAGGTACCATTGCA (SEQ ID No. 109) 7C1OLresh. 21anti 5'-CGATTAGAAACTTTATAGATCAGGAGCTGTGG (SEQ ID NO: 110) 7C1OLresh. 22anti 5'-TGCCACTGAACCTGTCAGGGACCCCATAAAGC (SEQ ID NO: 111) 7C1OLresh. 23anti 5'-GATTTTCAGTGTAAAATCTGTGCCTGATCCAC (SEQ ID NO: 112) 7ClOLresh. 24anti 5'-TAAACCCCAACATCCTCAGCCTCCACTCTGCT (SEQ ID NO: 113) 7ClOLresh. Anti 5'-TCCACGGAACATGTGAACCTTGAAAGCAGTAA (SEQ ID NO: 114) 7ClOLresh. 26anti 5'-TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAAC (SEQ ID NO: 115) 7ClOLresh. BamHIantisens 5'-CGCAGAGGATCCACTCACG (SEQ ID NO: 116) TABLE 8 DNA sequence of the oligonucleotides that were used for the construction of humanized 7C10 VH 1 by Novo LeaderMluI assembly. biotin 5'-GTCAGAACGCGTGCCGCC (SEQ ID No. 117) 7ClOHresh. lsens 5'-ACCATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTCTTGA (SEQ ID NO: 118) 7ClOHresh. 2sens 5'-CAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTCAGGTGCAGCT (SEQ ID NO 119) 7ClOHresh. 3sens 5'-TCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCG (SEQ ID NO: 120) 7 ClOHresh. 4sens 5'-GAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGT (SEQ ID NO 121)

7C1OHresh. 5sens 5'-TACTCCATCACCGGTGGTTATTTATGGAACTGG (SEQIDNo. 122) 7C1OHresh. 6sens 5'-ATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGG (SEQIDNo. 123) 7C1OHresh. 7sens 5'-ATGGGGTATATCAGCTACGACGGTACCAATAAC (SEQ ID No. 124) 7C1OHresh. 8antisens 5'-TCAACACTTTCATGGTGGCGGCACGCGTTCTGAC (SEQ ID No. 125) 7C1OHresh. 9antisens 5'-ATACCAGGAATGGCTGTCAAGAGGTACAACAGAC (SEQ ID No. 126) 7C1OHresh. 10antisens5'-TGGGCCCGACTCCTGAAGCTGCACCTGAGACAGG (SEQ ID No. 127)

7C1OHresh. llantisens5'-TGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCACCAGTCC (SEQIDNo. 128) 7C1OHresh. 12antisens5'-CCACCGGTGATGGAGTAACCAGAGACAGTGCAGG (SEQIDNo. 129) 7C1OHresh. 13antisens5' -CCCTGGGGGCTGCCGTATCCAGTTCCATAAATAA (SEQ ID No. 130) 7C1 OHresh. 14 antisens 5'-TAGCTGATATACCCCATCCACTCCAGTCCCTT (SEQ ID No. 131) 7C1OHresh. KpnIREV 5'-GTTATTGGTACCGTCG (SEQ ID No. 132) 7C1OHresh. KpnIbiotin 5'-TACGACGGTACCAATAACTAC (SEQIDNo. 133) 7C1OHresh. 15sens 5'-AAACCCTCCCTCAAGGATCGAATCACCATATC (SEQ ID No. 134) 7C1 OHresh. 16sens 5'-ACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA (SEQ ID No. 135) 7C10Hresh. 17sens 5'-AGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACTGCA (SEQ ID No. 136) 7C1OHresh. 18sens 5'-GTGTATTACTGTGCGAGATACGGTAGGGTCTT (SEQIDNo. 137) 7C1 OHresh. 19sens 5'-CTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA (SEQ ID No. 138) 7C10Hresh. 20sens 5'-CCGTCTCCTCAGGTGAGTGGATCCTCTGCG (SEQ ID No. 139) 710Hresh. 21antisens 5'-AGGGAGGGTTTGTAGTTATTGGTACCGTCGTA (SEQ ID No. 140) 7C10Hresh. 22antisens 5'-ACGTGTCACGTGATATGGTGATTCGATCCTTG (SEQIDNo. 141) 7C10Hresh. 23antisens 5'-AGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTGG (SEQ ID No. 142) 7C10Hresh. 24antisens 5'-CAGTAATACACTGCAGTGTCCGCAGCGGTCAC (SEQIDNo. 143) 7C10Hresh. 25antisens 5'-AGTAGTCAAAGAAGACCCTACCGTATCTCGCA (SEQ ID No. 144) 7C10Hresh. 26antisens 5'-CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCC (SEQ ID No. 145) 7C10Hresh. BamHIantisens 5'-CGCAGAGGATCCACTCAC (SEQ ID No. 146) TABLEAU 9 : Protocole d'appariement des oligonucléotides pour l'assemblage de

novo des gènes codant pour les formes humanisées de 7C10 VH et VL Assemblage de novo du fragment Assemblage de novo du fragment MluI-Kpnl de 7C 10 VL humanisée 1 Kpnl-BamHI de 7C10 VL humanisée 1 Oligo leader MluI 7C 10 VL Biotinylé Oligo 7C 10 L Kpnl Biotinylé Couple d'oligo 1 et 7 Couple d'oligo 13 et 20 Couple d'oligo 2 et 8 Couple d'oligo 14 et 21 7C1OHresh. 5'-TACTCCATCACCGGTGGTTATTTATGGAACTGG (SEQ ID NO: 122) 7C1OHresh. 6sens 5'-ATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGG (SEQ ID NO: 123) 7C1OHresh. 7sens 5'-ATGGGGTATATCAGCTACGACGGTACCAATAAC (SEQ ID NO: 124) 7C1OHresh. 8antisens 5'-TCAACACTTTCATGGTGGCGGCACGCGTTCTGAC (SEQ ID NO: 125) 7C1OHresh. 9antisens 5'-ATACCAGGAATGGCTGTCAAGAGGTACAACAGAC (SEQ ID NO: 126) 7C1OHresh. 10antisens 5'-TGGGCCCGACTCCTGAAGCTGCACCTGAGACAGG (SEQ ID NO: 127)

7C1OHresh. Lantisens 5'-TGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCACCAGTCC (SEQ ID NO: 128) 7C1OHresh. 12antisens 5'-CCACCGGTGATGGAGTAACCAGAGACAGTGCAGG (SEQ ID NO: 129) 7C1OHresh. 13antisens 5 '-CCCTGGGGGCTGCCGTATCCAGTTCCATAAATAA (SEQ ID NO: 130) 7C1 OHresh. Antisense 5'-TAGCTGATATACCCCATCCACTCCAGTCCCTT (SEQ ID No. 131) 7C1OHresh. KpnIREV 5'-GTTATTGGTACCGTCG (SEQ ID No. 132) 7C1OHresh. KpnIbiotin 5'-TACGACGGTACCAATAACTAC (SEQ ID NO: 133) 7ClOHresh. 15sens 5'-AAACCCTCCCTCAAGGATCGAATCACCATATC (SEQ ID NO: 134) 7C1 OHresh. 16sens 5'-ACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA (SEQ ID NO: 135) 7C10Hresh. 17sens 5'-AGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACTGCA (SEQ ID NO: 136) 7C1OHresh. 18sens 5'-GTGTATTACTGTGCGAGATACGGTAGGGTCTT (SEQ ID NO: 137) 7C1 OHresh. 19sens 5'-CTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA (SEQ ID NO: 138) 7C10Hresh. 20sens 5'-CCGTCTCCTCAGGTGAGTGGATCCTCTGCG (SEQ ID NO: 139) 710Hresh. 21antisens 5'-AGGGAGGGTTTGTAGTTATTGGTACCGTCGTA (SEQ ID NO: 140) 7C10Hresh. 22antisens 5'-ACGTGTCACGTGATATGGTGATTCGATCCTTG (SEQ ID NO: 141) 7C10Hresh. 23antisens 5'-AGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTGG (SEQ ID NO: 142) 7C10Hresh. 24antisens 5'-CAGTAATACACTGCAGTGTCCGCAGCGGTCAC (SEQ ID NO: 143) 7C10Hresh. 25antisens 5'-AGTAGTCAAAGAAGACCCTACCGTATCTCGCA (SEQ ID NO: 144) 7C10Hresh. 26antisens 5'-CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCCC (SEQ ID NO: 145) 7C10Hresh. BamHIantisens 5'-CGCAGAGGATCCACTCAC (SEQ ID NO: 146) TABLE 9: Oligonucleotide Pairing Protocol for the Assembly of

de novo genes coding for the humanized forms of 7C10 VH and VL De novo assembly of the fragment De novo assembly of the MluI-KpnI fragment of 7C humanized VL 1 KpnI-BamHI of humanized 7C10 VL 1 Oligo leader MluI 7C 10 VL Biotinylated Oligo 7C 10 L Kpnl Biotinylé Couple of oligo 1 and 7 Couple of oligo 13 and 20 Couple of oligo 2 and 8 Couple of oligo 14 and 21

<tb>
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 3 <SEP> et <SEP> 9 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 15 <SEP> et <SEP> 22
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 4 <SEP> et <SEP> 10 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 16 <SEP> et <SEP> 23
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 11 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 17 <SEP> et <SEP> 24
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 6 <SEP> et <SEP> 12 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 18 <SEP> et <SEP> 25
<tb> Oligo <SEP> antisens <SEP> 7C10 <SEP> VL <SEP> Kpnl <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 19 <SEP> et <SEP> 26
<tb> Oligo <SEP> antisens <SEP> 7C10 <SEP> L <SEP> BamHI
<tb>
Assemblage de novo du fragment Assemblage de novo du fragment MluI-Kpnl de 7C 10 VH humanisée 1 Kpnl-BamHI de 7C 10 VH humanisée 1

<Tb>
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 3 <SEP> and <SEP> 9 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 15 <SEP> and <SEP> 22
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 4 <SEP> and <SEP> 10 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 16 <SEP> and <SEP> 23
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 5 <SEP> and <SEP> 11 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 17 <SEP> and <SEP> 24
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 6 <SEP> and <SEP> 12 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 18 <SEP> and <SEP> 25
<tb> Oligo <SEP> antisense <SEP> 7C10 <SEP> VL <SEP> Kpnl <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 19 <SEP> and <SEP> 26
<tb> Oligo <SEP> antisense <SEP> 7C10 <SEP> L <SEP> BamHI
<Tb>
De novo assembly of the fragment De novo assembly of the MluI-KpnI fragment of 7C humanized VH 1 KpnI-BamHI of humanized 7C 10 VH 1

<tb>
<tb> Oligo <SEP> leader <SEP> Mlul <SEP> 7C <SEP> 10 <SEP> VH <SEP> Biotinylé <SEP> Oligo <SEP> 7C <SEP> 10 <SEP> H <SEP> Kpnl <SEP> Biotinylé
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 1 <SEP> et <SEP> 8 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 15 <SEP> et <SEP> 21
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 2 <SEP> et <SEP> 9 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 16 <SEP> et <SEP> 22
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 3 <SEP> et <SEP> 10 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 17 <SEP> et <SEP> 23
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 4 <SEP> et <SEP> 11 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 18 <SEP> et <SEP> 24
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 5 <SEP> et <SEP> 12 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 19 <SEP> et <SEP> 25
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 6 <SEP> et <SEP> 13 <SEP> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 20 <SEP> et <SEP> 26
<tb> Couple <SEP> d'oligo <SEP> 7 <SEP> et <SEP> 14 <SEP> Oligo <SEP> antisens <SEP> 7C10 <SEP> VH <SEP> BamHI
<tb> Oligo <SEP> antisens <SEP> 7C10 <SEP> VH <SEP> Kpnl
<tb>
Exemple 15. Construction des gènes codant pour les versions humanisées 2 de
7C10 VL et 7C10 VH et 3 de 7C10 VH par mutagenèse dirigée. <Tb>
<tb> Oligo <SEP> Leader <SEP> Mlul <SEP> 7C <SEP> 10 <SEP> VH <SEP> Biotinylated <SEP> Oligo <SEP> 7C <SEP> 10 <SEP> H <SEP> Kpnl <SEP > Biotinylated
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 1 <SEP> and <SEP> 8 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 15 <SEP> and <SEP> 21
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 2 <SEP> and <SEP> 9 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 16 <SEP> and <SEP> 22
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 3 <SEP> and <SEP> 10 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 17 <SEP> and <SEP> 23
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 4 <SEP> and <SEP> 11 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 18 <SEP> and <SEP> 24
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 5 <SEP> and <SEP> 12 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 19 <SEP> and <SEP> 25
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 6 <SEP> and <SEP> 13 <SEP> Couple <SEP> of oligo <SEP> 20 <SEP> and <SEP> 26
<tb> Couple <SEP> of oligo <SEP> 7 <SEP> and <SEP> 14 <SEP> Oligo <SEP> antisense <SEP> 7C10 <SEP> VH <SEP> BamHI
<tb> Oligo <SEP> antisense <SEP> 7C10 <SEP> VH <SEP> Kpnl
<Tb>
Example 15. Construction of Genes Encoding Humanized Versions 2 of
7C10 VL and 7C10 VH and 3 of 7C10 VH by site-directed mutagenesis.

La version humanisée 2 de 7C10 VH a été obtenue par mutation dirigée des résidus 48 et 67 (selon la nomenclature de Kabat) de la version 1. Cette mutagenèse

dirigée a été réalisée à l'aide du système QuikChange Site-directed mutagenesis de Stratagene (kit &num;200518) selon le protocole décrit par le fabricant. La construction s'est faite en deux temps, dans un premier temps le résidu 48 sur la version 1 a été muté à l'aide du couple d'amorces 7C10Hhumanisé1QCM48 sens et antisens (voir Tableau 10) et dans un deuxième temps cette version mutée au résidu 48 a elle-même été mutée au résidu 67 à l'aide du couple d'amorces 7ClOHhumanisé1 QCI67 sens et antisens (voir Tableau 10). The humanized version 2 of 7C10 VH was obtained by site-directed mutation of residues 48 and 67 (according to the Kabat nomenclature) of version 1. This mutagenesis

directed was performed using the Stratagene QuikChange Site-directed mutagenesis system (kit 200518) according to the protocol described by the manufacturer. The construction was done in two stages, firstly the residue 48 on the version 1 was transferred using the pair of primers 7C10Hhumanized1QCM48 sense and antisense (see Table 10) and in a second time this mutated version at residue 48 was itself mutated at residue 67 using the sense and antisense pair of primers 7ClOHhumanized QCI67 (see Table 10).

La version humanisée 3 de 7C10 VH a été obtenue par mutation dirigée des résidus 30 et 71 (selon la nomenclature de Kabat) de la version 2 en utilisant également le système QuikChangeTM. Cette construction s'est faite en deux temps. Dans un premier temps, le résidu 30 sur la version 2 a été muté à l'aide des amorces

7C10HhumaniséQCT30 sens et antisens (voir Tableau 10). Dans un deuxième temps, cette version mutée au résidu 30 a elle-même été mutée au résidu 71 en utilisant le couple d'amorces 7ClOHhumanisé1V67QCR71 sens et antisens (voir Tableau 10). The humanized version 3 of 7C10 VH was obtained by directed mutation of residues 30 and 71 (according to the Kabat nomenclature) of version 2 also using the QuikChangeTM system. This construction was done in two stages. At first, the residue 30 on version 2 was mutated using the primers

7C10HumanizedQCT30 sense and antisense (see Table 10). In a second step, this mutated version at residue 30 was itself mutated at residue 71 using the sense and antisense pair of primers 7ClOHhumanized1V67QCR71 (see Table 10).

La version humanisée 2 de 7C10 VL a été obtenue par mutation dirigée du résidu 2 (selon la nomenclature de Kabat) de la version 1 en utilisant le système QuikChange. The humanized version 2 of 7C10 VL was obtained by directed mutation of residue 2 (according to the Kabat nomenclature) of version 1 using the QuikChange system.

Le résidu 2 sur la version 1 a été muté en utilisant le couple d'amorces 7C10L humanisé 1 QCV2 sens et antisens (voir Tableau 10). Residue 2 on version 1 was mutated using the humanized 7C10L primer pair 1 QCV2 sense and antisense (see Table 10).

TABLEAU 10 : Liste des oligonucléotides utilisés pour la mutagenèse dirigée par le système QuikChange de stratagène

TABLE 10 List of Oligonucleotides Used for QuikChange System-Directed Mutagenesis of Stratocene

<tb>
<tb> 7C10Hhumanisé1QCT30.
<tb> <Tb>
<tb> 7C10Hhumanized1QCT30.
<Tb>

5'-CTGGTTACTCCATCAGCGGTGGTTATTTATG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 147)
<tb> sens
<tb> 7C10Hhumanisé1QCT30.
<tb> 5'-CTGGTTACTCCATCAGCGGTGGTTATTTATG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 147)
<tb> meaning
<tb> 7C10Hhumanized1QCT30.
<Tb>

5'-CATAAATAACCACCGCTGATGGAGTAACCAG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 148)
<tb> antisens
<tb> 7C10Humanisé1QCM48.
<tb> 5'-CATAAATAACCACCGCTGATGGAGTAACCAG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 148)
<tb> antisense
<tb> 7C10Humanized1QCM48.
<Tb>

5'-GGGACTGGAGTGGATCGGGTATATCAGCTAC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 149)
<tb> sens
<tb> 7C10Humanisé1QCM48.
<tb> 5'-GGGACTGGAGTGGATCGGGTATATCAGCTAC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 149)
<tb> meaning
<tb> 7C10Humanized1QCM48.
<Tb>

5'-GTAGCTGATATACCCGATCCACTCCAGTCCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 150)
<tb> antisens
<tb> 7C10Hhumanisé1QCI67.
<tb> 5'-GTAGCTGATATACCCGATCCACTCCAGTCCC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 150)
<tb> antisense
<tb> 7C10Hhumanized1QCI67.
<Tb>

5'-TCCCTCAAGGATCGAGTCACCATATCACGTG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 151)
<tb> sens
<tb> 7C10Humanisé1QCI67.
<tb> 5'-TCCCTCAAGGATCGAGTCACCATATCACGTG <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 151)
<tb> meaning
<tb> 7C10Humanized1QCI67.
<Tb>

5'-CACGTGATATGGTGACTCGATCCTTGAGGGA <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 152)
<tb> antisens
<tb> 5'
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<tb> 5 '
<tb> 7C10Hhumanized1V67QCR71.
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-GATCGAGTCACCATATCAGTGGACACGTCCAAGAA <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 153)
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<tb> 7C10Hhumanisé1V67QCR71.
<tb> -GATCGAGTCACCATATCAGTGGACACGTCCAAGAA <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 153)
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<tb> 5 '
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-CTGGTTCTTGGACGTGTCCACTGATATGGTGACTC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 154)
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5'-ACTGAGTCATCACAATATCACTGCTGGAAGC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 156)
<tb> antisens
<tb> 5'-ACTGAGTCATCACAATATCACTGCTGGAAGC <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> No. <SEP> 156)
<tb> antisense
<Tb>

Exemple 16. Transfection des cellules cos7 par électroporation Les vecteurs d'expression mammalienne contenant les versions chimériques ou humanisées des chaînes lourdes et légères de l'anticorps 7CIO ont été testés en cellules cos7 pour l'expression transitoire des anticorps recombinants 7C10. L'ADN a été introduit dans les cellules cos par électroporation à l'aide d'un instrument Biorad (Gene Pulsar). L'ADN (10 ug de chaque vecteur) est ajouté à des aliquotes de 0, 8 ml de cellules cos à une concentration de 1 x 107 cellules par ml dans du tampon PBS (sans Ca++ et Mg++). Une pulsation de 1, 900 volts et d'une capacité de 25 uF a été délivrée.

Example 16. Transfection of cos7 cells by electroporation Mammalian expression vectors containing the chimeric or humanized versions of the heavy and light chains of antibody 7C10 were tested in cos7 cells for transient expression of recombinant antibodies 7C10. The DNA was introduced into the cos cells by electroporation using a Biorad instrument (Gene Pulsar). The DNA (10 μg of each vector) is added to aliquots of 0.8 ml of cos cells at a concentration of 1 × 10 7 cells per ml in PBS buffer (without Ca ++ and Mg ++). A pulse of 1, 900 volts and a capacity of 25 uF was delivered.

Les cellules cos transfectées sont alors ajoutées à 8 ml de milieu DMEM contenant 5 % de sérum de veau et incubées à 37 C pendant 72 heures. Le surnageant est alors récolté, The transfected cos cells are then added to 8 ml of DMEM medium containing 5% calf serum and incubated at 37 ° C. for 72 hours. The supernatant is then harvested,

centrifugé pour éliminer les débris cellulaires et testé par ELISA pour la mesure de sa concentration en anticorps 7C10 recombinant de type IgGl/Kappa humaine. centrifuged to remove cell debris and tested by ELISA for the measurement of its recombinant human IgG1 / Kappa 7C10 antibody concentration.

Exemple 17. Méthode ELISA pour mesurer les concentrations en anticorps recombinants IgGl/Kappa humain présentes dans le surnageant des transfectants cos
Les surnageant produits par expression transitoire en cellules cos7 ont été testés pour la présence d'anticorps 7C10 de type IgGl/Kappa humaine. Pour la détection de l'immunoglobuline IgGl/Kappa humaine, des plaques ELISA de 96 puits (Maxisorb, Nunc) ont été cotées avec un anticorps polyclonal de chèvre anti-IgG humaine (spécifique pour le fragment Fc gamma, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., &num;109-005-098). Les surnageant de cellules cos ont été dilués en série et ajoutés aux puits cotés. Après une incubation d'une heure à 37 C et lavage, un anticorps polyclonal de chèvre anti-chaîne légère Kappa humaine conjugué à péroxidase (HRP, Sigma, A- 7164) a été ajouté. Après 45 minutes d'incubation à 37 C et lavage, le substrat TMB (KPL &num;50-76-04) a été ajouté. Après 10 minutes d'incubation la réaction fut stoppée par l'addition d'acide sulfurique 1M et la densité optique lue à 450 nm. Une immunoglobuline humaine IgGl/Kappa humaine purifiée (Sigma, 1-3889) de concentration connue a été utilisée comme anticorps de référence standard. Example 17. ELISA Method for Measuring the Levels of Human IgG1 / Kappa Recombinant Antibodies Present in the Supernatant of the Cos Transfectants
Supernatants produced by transient expression in cos7 cells were tested for the presence of human IgG1 / Kappa type 7C10 antibodies. For the detection of human IgG1 / Kappa immunoglobulin, 96-well ELISA plates (Maxisorb, Nunc) were scored with polyclonal goat anti-human IgG antibody (specific for the Fc gamma fragment, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc. 109-005-098). The cos cell supernatants were serially diluted and added to the listed wells. After incubation for one hour at 37 ° C. and washing, a peroxidase conjugated human Kappa anti-human light chain polyclonal antibody (HRP, Sigma, A-7164) was added. After 45 minutes incubation at 37 ° C. and washing, the TMB substrate (KPL &num; 50-76-04) was added. After 10 minutes of incubation the reaction was stopped by the addition of 1M sulfuric acid and the optical density read at 450 nm. A human immunoglobulin IgG1 / human kappa purified (Sigma, 1-3889) of known concentration was used as the standard reference antibody.

Exemple 18. Méthode ELISA pour déterminer l'activité de reconnaissance des anticorps recombinants 7C10 de type IgGl/Kappa humains sur le récepteur à l'IGF-1 (IGF-IR)
Les surnageant de culture cos7 ont été testés pour leur capacité à reconnaître l'IGF-l R par une méthode ELISA. Des plaques ELISA de 96 puits (Dynex Immulon 2HB) ont été cotées avec 100 ul par puit d'une solution de PBS contenant 0,31 nglJ.. lI d'IGF-I R (Human Insulin-like Growth Factor 1 soluble Receptor, R & D Systems, &num;391-GR) par incubation pour une nuit à 4 C. Après lavage avec du PBS contenant 0,05 % Tween 20, les plaques ont été saturées par l'addition d'une solution de PBS contenant 0,5 % Gélatine et incubation à 37 C pendant 1 heure. Après 3 lavages avec du PBS, les échantillons de surnageant cos à tester, préalablement dilués en série dans du PBS contenant 0,1 % Gelatine et 0,05 % Tween 20, ont été ajoutés aux plaques. Après une incubation à 37 C pendant 1 heure suivie de 3 lavages (PBS contenant 0,05 % Example 18. ELISA Method for Determining the Recognition Activity of Human IgG1 / Kappa-type 7C10 Recombinant Antibodies on the IGF-1 Receptor (IGF-IR)
Cos7 culture supernatants were tested for their ability to recognize IGF-1 R by an ELISA method. 96-well ELISA plates (Dynex Immulon 2HB) were scored with 100 μl per well of a PBS solution containing 0.31 μg / ml of IGF-I R (Human Insulin-like Growth Factor 1 soluble Receptor, R & D Systems, 391-GR) by incubation overnight at 4 C. After washing with PBS containing 0.05% Tween 20, the plates were saturated by the addition of a solution of PBS containing 0 , 5% gelatin and incubation at 37 C for 1 hour. After 3 washes with PBS, samples of the cos supernatant to be tested, previously serially diluted in PBS containing 0.1% gelatin and 0.05% Tween 20, were added to the plates. After incubation at 37 C for 1 hour followed by 3 washes (PBS containing 0.05%

Tween 20), un anticorps anti-IgG humaine (spécifique pour le fragment Fc) conjugué à la péroxidase (HRP, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., &num;109-035-098) a été ajouté (dilution au 1/5000 dans du PBS contenant 0,1 % Gélatine et 0,05 % Tween 20). Tween 20), an anti-human IgG antibody (specific for the Fc fragment) conjugated to peroxidase (HRP, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., # 109-035-098) was added (1/5000 dilution in PBS containing 0.1% gelatin and 0.05% Tween 20).

Après 45 minutes d'incubation à 37 C et 3 lavages (PBS contenant 0,05 % Tween 20), le substrat TMB (KPL &num;50-76-04) a été ajouté. Après 10 minutes d'incubation la réaction fut stoppée par l'addition d'acide sulfurique 1M et la densité optique lue à 450 nm. After 45 minutes of incubation at 37 ° C. and 3 washes (PBS containing 0.05% Tween 20), the TMB substrate (KPL &num; 50-76-04) was added. After 10 minutes of incubation the reaction was stopped by the addition of 1M sulfuric acid and the optical density read at 450 nm.

Exemple 19. Détermination de l'activité de reconnaissance de l'IGFl-R par les différentes versions de l'anticorps 7C10 humanisé par CDR- grafting
Dans un premier temps, nous avons comparé l'activité de reconnaissance des formes humanisées 1 des chaînes lourde et légère de 7C10 pour l'IGF-1 récepteur par rapport à la forme chimérique. La figure 28 montre les résultats d'un test ELISA de reconnaissance de l'IGF-1R (voir Exemple 18) à partir de surnageant de cellules cos7 dont la concentration en IgGl/Kappa humaine avait été préalablement déterminée par ELISA (voir Exemple 17). Les courbes de titration des quatre anticorps recombinants testés se chevauchent parfaitement indiquant que leurs affinités relatives pour l'IGF-IR sont très similaires. On en conclut donc que la forme humanisée 1 de 7C10, composée de la chaîne légère humanisée 1 (1 seul résidu de souris présent dans les régions charpentes) en combinaison avec la chaîne lourde humanisée 1 (4 résidus de souris présents dans les régions charpentes), reconnaît spécifiquement l'IGF-1 récepteur et a une affinité très similaire à celle de l'anticorps chimérique (régions variables de souris). EXAMPLE 19 Determination of IGF1-R Recognition Activity by the Different Versions of Humanized 7C10 Antibody by CDR-grafting
In a first step, we compared the recognition activity of humanized forms 1 of heavy and light 7C10 chains for the IGF-1 receptor relative to the chimeric form. Figure 28 shows the results of an IGF-1R recognition ELISA assay (see Example 18) from cos7 cell supernatant whose human IgG1 / Kappa concentration had previously been determined by ELISA (see Example 17). . The titration curves of the four recombinant antibodies tested overlap perfectly, indicating that their relative affinities for IGF-IR are very similar. It is therefore concluded that the humanized form 1 of 7C10, composed of the humanized light chain 1 (1 single mouse residue present in the framework regions) in combination with the humanized heavy chain 1 (4 mouse residues present in the framework regions) specifically recognizes the IGF-1 receptor and has an affinity very similar to that of the chimeric antibody (variable regions of mice).

Dans un deuxième temps nous avons regardé l'influence du résidu 2 (selon la nomenclature de Kabat) de la chaîne légère humanisée de 7C10 (version humanisée 1 versus humanisée 2, voir figure 19) sur la reconnaissance de l'IGF-IR. La figure 29 montre les résultats du test ELISA de reconnaissance de l'IGF-IR (voir Exemple 18) à partir de surnageant de cellules cos7 dont la concentration en IgGl/Kappa humaine avait été préalablement déterminée par ELISA (voir Exemple 17). Les deux versions humanisées 1 et 2 de la chaîne légère ont été associées successivement avec 7C10 VH humanisée 1. Les courbes de titration des deux combinaisons se superposent indiquant que la mutation du résidu 2 de la chaîne légère, qui a été changé d'une valine dans la In a second time we looked at the influence of the residue 2 (according to the Kabat nomenclature) of the humanized light chain of 7C10 (humanized version 1 versus humanized 2, see figure 19) on the recognition of the IGF-IR. Figure 29 shows the results of the IGF-IR recognition ELISA assay (see Example 18) from cos7 cell supernatant whose human IgG1 / Kappa concentration had previously been determined by ELISA (see Example 17). The two humanized versions 1 and 2 of the light chain were successively associated with humanized 7C10 VH 1. The titration curves of the two combinations are superimposed indicating that the mutation of residue 2 of the light chain, which has been changed from a valine in the

version humanisée 1 pour une isoleucine dans la forme humanisée 2, n'a apparemment aucune influence sur l'affinité relative de reconnaissance de l'IGFl récepteur. La forme humanisée 2 de la chaîne légère de 7C10 constitue ainsi une version ou aucun résidu de souris (hors CDRs) n'a été conservé. Cette version, totalement humanisée, représente la version préférée de 7C10 VL. humanized version 1 for an isoleucine in humanized form 2, apparently has no influence on the relative affinity of recognition of the IGF1 receptor. The humanized form 2 of the 7C10 light chain thus constitutes a version where no mouse residues (excluding CDRs) have been preserved. This version, completely humanized, represents the preferred version of 7C10 VL.

La version totalement humanisée de la chaîne légère 7C10 (version humanisée 2, voir ci-dessus) a été testée en association avec les trois versions humanisées de la chaîne lourde de 7C10. La figure 30 montre les résultats du test ELISA de reconnaissance de l'IGF-IR à partir de surnageants de cellules cos7 dont la concentration en IgGl/Kappa humaine avait été préalablement déterminée par ELISA (voir Exemple 17). Les courbes de titration sont très similaires et se chevauchent pratiquement avec la courbe référence correspondant à l'anticorps chimérique, indiquant que les trois versions humanisées 1,2 et 3 de 7C10 VH donnent une même affinité relative pour l'IGF-lR quand elles sont associées à 7C10 VL humanisée 2. D'autres tests ELISA menés en parallèle (résultats non montrés) ont toutefois révélé qu'une mutation ponctuelle du résidu 71 (nomenclature de Kabat) d'une arginine (souris) à une valine (humain) entraînait une petite perte d'affinité de l'anticorps correspondant pour l'IGF-IR. Il est ainsi raisonnable de penser que 7C10 VH humanisée 2 a la même affinité relative pour l'IGF-IR que 7CIO VH humanisée 1. Cette forme humanisée 2 sera donc préférée par rapport à la forme 1 puisqu'elle ne comporte que deux acides aminés de souris (résidus 30 et 71, voir figure 24). La forme humanisée 3 qui ne comporte plus aucun résidu de souris (en dehors des CDRs) sera elle aussi préférée puisqu'elle ne semble entraîner qu'une perte minimale d'affinité. The fully humanized version of the 7C10 light chain (humanized version 2, see above) was tested in combination with the three humanized versions of the 7C10 heavy chain. Figure 30 shows the results of the IGF-IR recognition ELISA assay from supernatants of cos7 cells whose human IgG1 / Kappa concentration had previously been determined by ELISA (see Example 17). The titration curves are very similar and overlap substantially with the reference curve corresponding to the chimeric antibody, indicating that the three humanized versions 1,2 and 3 of 7C10 VH give the same relative affinity for IGF-1R when they are associated with humanized 7C10 VL 2. Other parallel ELISA assays (results not shown), however, revealed that a point mutation of residue 71 (Kabat nomenclature) from arginine (mouse) to valine (human) resulted in a small loss of affinity of the corresponding antibody for IGF-IR. It is thus reasonable to think that humanized 7C10 VH 2 has the same relative affinity for IGF-IR as 7CIO humanized VH 1. This humanized form 2 will therefore be preferred over form 1 since it comprises only two amino acids mouse (residues 30 and 71, see Figure 24). The humanized form 3 which no longer contains any mouse residues (apart from CDRs) will also be preferred since it seems to result in only a minimal loss of affinity.

En conclusion, il apparaît que deux formes humanisées de l'anticorps 7C10 selon la présente invention sont particulièrement préférées. Une forme constituée de l'association de 7C10 VH humanisée 2 (2 résidus de souris conservés) avec 7C10 VL humanisée 2 (aucun résidu de souris conservé) et une autre forme constituée de l'association de 7C10 VH humanisée 3 (aucun résidu de souris conservé) avec 7C10 VL humanisée 2 (aucun résidu de souris conservé). Cette dernière forme constitue la version humanisée ultime puisqu'aucun résidu de souris n'est présent à la fois dans les chaînes lourde et légère. In conclusion, it appears that two humanized forms of the 7C10 antibody according to the present invention are particularly preferred. A form consisting of the combination of 7C10 Humanized VH 2 (2 conserved mouse residues) with humanized 7C10 VL 2 (no conserved mouse residues) and another form consisting of the association of humanized 7C10 VH 3 (no mouse residues conserved) with humanized 7C10 VL 2 (no mouse residues retained). The latter form is the ultimate humanized version since no mouse residues are present in both the heavy and light chains.

Claims

REVENDICATIONS

1. Anticorps isolé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ledit anticorps ou l'un de sesdits fragments étant capable de se fixer au récepteur humain du facteur de croissance 1 apparenté à l'insuline IGF-IR et, le cas échéant, d'inhiber la fixation naturelle de ses ligands IGF1 et/ou IGF2, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant au moins une région CDR déterminant la complémentarité choisie parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 2,4 ou 6, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2,4 ou 6, ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisie parmi les CDRs de séquence SEQ ID Nos. 8,10 et 12, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 8,10 et 12. An isolated antibody, or a functional fragment thereof, said antibody or fragment thereof capable of binding to the human IGF-IR insulin-like growth factor-1 receptor and, if appropriate, to inhibit the natural binding of its ligands IGF1 and / or IGF2, characterized in that it comprises a light chain comprising at least one CDR region determining the complementarity chosen from the CDRs of sequence SEQ ID No. 2,4 or 6, or at least one CDR whose sequence has at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 2,4 or 6, or in that it comprises a heavy chain comprising at least one CDR chosen from the Sequence CDRs SEQ ID Nos. 8, 10 and 12, or at least one CDR whose sequence has at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID Nos. 8, 10 and 12.

2. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde comprenant au moins un CDR de séquence SEQ ID No. 12 ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 12. 2. Antibody, or one of its functional fragments, according to claim 1, characterized in that it comprises a heavy chain comprising at least one CDR of sequence SEQ ID No. 12 or a sequence exhibiting at least 80% of identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 12.

3. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID Nos. 8, 10 et 12, ou au moins deux de trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 8,10 et 12. 3. Antibody, or a functional fragment thereof, according to claim 1 or 2, characterized in that it comprises a heavy chain comprising at least two of the three CDRs or the three CDRs of sequence SEQ ID Nos. 8, 10 and 12, or at least two of three CDRs or three sequence CDRs having respectively at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID Nos. 8, 10 and 12.

4. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisie parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 2,4 ou 6, ou un CDR dont la séquence présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2,4 ou 6. 4. Antibody, or one of its functional fragments, according to one of claims 1 to 3, characterized in that it comprises a light chain comprising at least one CDR chosen from the CDRs of sequence SEQ ID No. 2, 4 or 6, or a CDR whose sequence has at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 2,4 or 6.

5. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID Nos. 2,4 et 6, ou au 5. Antibody, or a functional fragment thereof, according to one of claims 1 to 4, characterized in that it comprises a light chain comprising at least two of the three CDRs or the three CDRs of sequence SEQ ID Nos. 2,4 and 6, or

moins deux de trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2,4 et 6. at least two of three CDRs or three sequence CDRs having respectively at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 2,4 and 6.

6. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il ne se fixe pas de manière significative au récepteur humain IR de l'insuline. 6. Antibody, or a functional fragment thereof, according to one of claims 1 to 5, characterized in that it does not bind significantly to the human IR receptor of insulin.

7. Anticorps selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit fragment fonctionnel est choisi parmi les fragments Fv, Fab, (Fab') 2, Fab', scFv, scFv-Fc et les diabodies, ou tout fragment dont la demie-vie aurait été augmentée. 7. Antibody according to one of claims 1 to 6, characterized in that said functional fragment is selected from Fv fragments, Fab, (Fab ') 2, Fab', scFv, scFv-Fc and diabodies, or any fragment whose half-life was increased.

8. Hybridome murin capable de sécréter un anticorps selon l'une des revendications 1 à 6. 8. Murine hybridoma capable of secreting an antibody according to one of claims 1 to 6.

9. Hybridome murin selon la revendication 8 déposé à la CNCM, Institut Pasteur, Paris, le 19 septembre 2001 sous le numéro 1-2717. 9. murine hybridoma according to claim 8 deposited at the CNCM, Institut Pasteur, Paris, September 19, 2001 under the number 1-2717.

10. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, caractérisé en ce que ledit anticorps est sécrété par l'hybridome selon la revendication 9. 10. Antibody, or a functional fragment thereof, characterized in that said antibody is secreted by the hybridoma according to claim 9.

Il. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 54, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 54, ou/et en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 69, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 69. He. An antibody, or a functional fragment thereof, according to one of claims 1 to 7, characterized in that said antibody comprises a sequence light chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 54, or a sequence having at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 54, or / and in that it comprises a sequence heavy chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 69, or a sequence having at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 69.

12. Anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps chimérique et comprend en outre les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps d'une espèce hétérologue à la souris. The antibody or functional fragment thereof according to claim 11, characterized in that said antibody is a chimeric antibody and further comprises the light chain and heavy chain constant regions derived from an antibody of a species. heterologous to the mouse.

13. Anticorps chimérique, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite espèce hétérologue est l'Homme. The chimeric antibody, or a functional fragment thereof, according to claim 12, characterized in that said heterologous species is human.

14. Anticorps chimérique, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 13, caractérisé en ce que les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps humain sont respectivement la région kappa et, The chimeric antibody, or a functional fragment thereof, according to claim 13, characterized in that the light chain and heavy chain constant regions derived from a human antibody are respectively the kappa region and,

gamma-1 ou gamma-4. gamma-1 or gamma-4.

15. Anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps humanisé et comprend une chaîne légère et/ou une chaîne lourde dans lesquelles les segments de squelette FRI à FR4 de ladite chaîne légère et/ou chaîne lourde sont dérivés respectivement de segments de squelette FR1 à FR4 de chaîne légère et/ou de chaîne lourde d'anticorps humains. Antibody or a functional fragment thereof according to one of claims 1 to 7, characterized in that said antibody is a humanized antibody and comprises a light chain and / or a heavy chain in which the FRI backbone segments FR4 of said light chain and / or heavy chain are respectively derived from backbone segments FR1 to FR4 of light chain and / or heavy chain of human antibodies.

16. Anticorps humanisé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend une chaîne légère comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 61 ou 65, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 61 ou 65, ou/et en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 75,79 ou 83, ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 75,79 ou 83. A humanized antibody, or a functional fragment thereof, according to claim 15, characterized in that said antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 61 or 65, or a sequence exhibiting at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 61 or 65, and / or in that it comprises a sequence heavy chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 75,79 or 83, or a sequence having at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 75,79 or 83.

17. Anticorps humanisé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend une chaîne légère comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 65, et en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 79 ou 83, de préférence SEQ ID No. 83. 17. A humanized antibody, or a functional fragment thereof, according to claim 15 or 16, characterized in that said antibody comprises a light chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 65, and in that comprises a sequence heavy chain comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 79 or 83, preferably SEQ ID No. 83.

18. Acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique, ADN ou ARN, codant pour un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7 et 10 à 17 ; b) un acide nucléique complémentaire d'un acide nucléique tel que défini en a) ; et c) un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides capable d'hybrider dans des conditions de forte stringence avec au moins l'un des CDRs de séquence SEQ ID No. 1,3, 5,7, 9 ou 11, ou avec une séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 1,3, 5,7, 9 ou 11. 18. Isolated nucleic acid characterized in that it is chosen from the following nucleic acids: a) a nucleic acid, DNA or RNA, encoding an antibody, or a functional fragment thereof, according to one of claims 1 at 7 and 10 to 17; b) a nucleic acid complementary to a nucleic acid as defined in a); and c) a nucleic acid of at least 18 nucleotides capable of hybridizing under conditions of high stringency with at least one of the CDRs of sequence SEQ ID No. 1,3, 5,7, 9 or 11, or with a sequence having at least 80% identity after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 1,3, 5,7, 9 or 11.

19. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 18. Vector comprising a nucleic acid according to claim 18.

20. Cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 19. 20. Host cell comprising a vector according to claim 19.

21. Animal transgénique à l'exception de l'Homme comprenant une cellule transformée par un vecteur selon la revendication 19. 21. Transgenic animal with the exception of humans comprising a cell transformed with a vector according to claim 19.

22. Procédé de production d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7 et 10 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule selon la revendication 20 ; et b) la récupération desdits anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ainsi produits à partir du milieu de culture ou desdites cellules cultivées. 22. Process for the production of an antibody, or a functional fragment thereof, according to one of claims 1 to 7 and 10 to 17, characterized in that it comprises the following steps: a) the cultivation in a appropriate culture medium and conditions of a cell according to claim 20; and b) recovering said antibodies, or a functional fragment thereof, thereby produced from the culture medium or said cultured cells.

23. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, susceptible d'être obtenu par un procédé selon la revendication 22. 23. An antibody or a functional fragment thereof obtainable by a process according to claim 22.

24. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7,10 à 17 et 23 à titre de médicament. 24. The antibody, or a functional fragment thereof, according to any one of claims 1 to 7, 10 to 17 and 23 as a medicament.

25. Composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7,10 à 17 et 23. 25. A pharmaceutical composition comprising as active principle an antibody, or a functional fragment thereof, according to one of claims 1 to 7, 10 to 17 and 23.

26. Utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7,10 à 17 et 23 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie liée à une surexpression et/ou une activation anormale du récepteur IGF-IR et/ou liée à une hyperactivation de la voie de transduction du signal médié par l'interaction de l'IGF1 ou IGF2 avec IGF-IR. 26. Use of an antibody, or a functional fragment thereof, according to one of claims 1 to 7, 10 to 17 and 23 for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of a disease. related to overexpression and / or abnormal activation of the IGF-IR receptor and / or linked to hyperactivation of the signal transduction pathway mediated by the interaction of IGF1 or IGF2 with IGF-IR.

27. Utilisation selon la revendication 26, caractérisée en ce que l'administration dudit médicament n'induit pas ou peu d'effets secondaires liés à une inhibition du récepteur IR de l'insuline. 27. Use according to claim 26, characterized in that the administration of said drug does not induce or few side effects related to inhibition of the IR receptor insulin.

28. Utilisation selon la revendication 26 ou 27 pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la transformation de cellules normales en cellules à caractère tumoral, de préférence IGF dépendante, notamment IGF1 et/ou IGF2 dépendante. 28. Use according to claim 26 or 27 for the preparation of a medicament for inhibiting the transformation of normal cells into tumor cells, preferably dependent IGF, in particular IGF1 and / or IGF2 dependent.

29. Utilisation selon l'une des revendications 26 à 28 pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, de préférence IGF dépendante, notamment IGF1 et/ou IGF2 dépendante, ou estrogènes dépendantes, notamment E2 dépendante. 29. Use according to one of claims 26 to 28 for the preparation of a medicament for inhibiting the growth and / or proliferation of tumor cells, preferably dependent IGF, in particular IGF1 and / or IGF2 dependent, or dependent estrogens, in particular E2 dependent.

30. Utilisation selon l'une des revendications 26 à 29, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer. 30. Use according to one of claims 26 to 29 for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of cancer.

31. Utilisation selon la revendication 30, caractérisée en ce que ledit cancer est un cancer choisi parmi le cancer de la prostate, les ostéosarcomes, le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer du sein, le cancer de l'endomètre ou le cancer du côlon. 31. Use according to claim 30, characterized in that said cancer is a cancer selected from prostate cancer, osteosarcomas, non-small-cell lung cancer, breast cancer, endometrial cancer or cancer. Colon Cancer.

32. Utilisation selon l'une des revendications 26 à 27, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du psoriasis. 32. Use according to one of claims 26 to 27, for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of psoriasis.

33. Méthode de diagnostic in vitro de maladies induites par une surexpression ou une sousexpression du récepteur IGF-IR à partir d'un échantillon biologique dont on suspecte la présence anormale en récepteur IGF-IR, caractérisée en ce qu'on met en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des revendications 1 à 7,10 à 17 et 23, ledit anticorps pouvant être, le cas échéant, marqué. 33. In vitro diagnostic method for diseases induced by overexpression or under-expression of the IGF-IR receptor from a biological sample suspected of being abnormally present in an IGF-IR receptor, characterized in that said biological sample with an antibody according to one of claims 1 to 7, 10 to 17 and 23, said antibody possibly being labeled.

34. Composition pharmaceutique comprenant au moins un anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, 10 à 17 et 23, et un agent cytotoxique choisi parmi les agents interagissant avec l'ADN, les antimétabolites, les inhibiteurs de topoisomérases 1 ou II, ou encore les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destinée à la prévention ou au traitement de cancer. 34. Pharmaceutical composition comprising at least one antibody according to one of claims 1 to 7, 10 to 17 and 23, and a cytotoxic agent chosen from agents interacting with DNA, antimetabolites, topoisomerase 1 or II inhibitors, or spindle inhibitory or stabilizing agents, as a combination product for simultaneous, separate or time-course use for the prevention or treatment of cancer.

35. Composition selon la revendication 34, caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique est couplé par synthèse chimique audit anticorps pour une utilisation simultanée. 35. Composition according to claim 34, characterized in that said cytotoxic agent is coupled by chemical synthesis to said antibody for simultaneous use.

36. Composition selon la revendication 34 ou 35, caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique est choisi parmi les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau, de préférence la vinorelbine. 36. Composition according to claim 34 or 35, characterized in that the said cytotoxic agent is chosen from inhibitory agents or spindle stabilizers, preferably vinorelbine.

37. Composition comprenant au moins un premier composé anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7, 10 à 17 et 23, et un deuxième composé anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire du récepteur HER2/neu, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destinée à la prévention et au traitement de cancer. 37. A composition comprising at least one first antibody compound, or one of its functional fragments, according to one of claims 1 to 7, 10 to 17 and 23, and a second antibody compound directed against the extracellular domain of the HER2 receptor. as a combination product for simultaneous, separate or time-course use for the prevention and treatment of cancer.

38. Composition selon la revendication 37, caractérisée en ce que ledit anticorps dirigé contre le domaine extramembranaire du récepteur HER2/neu est le Trastuzumab, ou l'un de ses fragments fonctionnels. 38. Composition according to claim 37, characterized in that said antibody directed against the extramembrane domain of the HER2 / neu receptor is Trastuzumab, or one of its functional fragments.

39. Composition comprenant un anticorps selon l'une des revendications 1 à 7, 10 à 17 et 23, ou l'un de ses fragments fonctionnels, conjugué avec une toxine cellulaire ou un radioélément. 39. A composition comprising an antibody according to one of claims 1 to 7, 10 to 17 and 23, or one of its functional fragments, conjugated with a cellular toxin or a radioelement.

40. Composition selon la revendication 39, caractérisée en ce que ledit fragment fonctionnel est choisi parmi les fragments d'anticorps dont le fragment Fc a été amputé, de préférence les fragments simple chaîne scFv. 40. Composition according to claim 39, characterized in that said functional fragment is chosen from antibody fragments whose Fc fragment has been amputated, preferably single-chain fragments scFv.

41. Composition selon l'une des revendications 34 à 40, à titre de médicament. 41. Composition according to one of claims 34 to 40, as medicament.

42. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 34 à 41, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer. 42. Use of a composition according to one of claims 34 to 41 for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of cancer.

43. Utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7, 10 à 17 et 23, pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique d'un composé biologiquement actif vers des cellules exprimant ou surexprimant le récepteur IGF-IR. 43. Use of an antibody, or a functional fragment thereof, according to one of claims 1 to 7, 10 to 17 and 23, for the preparation of a medicament for the specific targeting of a biologically active compound to cells expressing or overexpressing the IGF-IR receptor.

44. Réactif de diagnostic in vivo comprenant un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1 à 7,10 à 17 et 23. 44. An in vivo diagnostic reagent comprising an antibody, or a functional fragment thereof, according to one of claims 1 to 7, 10 to 17 and 23.