FR2829498A1 - Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins - Google Patents
Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins Download PDFInfo
- Publication number
- FR2829498A1 FR2829498A1 FR0111736A FR0111736A FR2829498A1 FR 2829498 A1 FR2829498 A1 FR 2829498A1 FR 0111736 A FR0111736 A FR 0111736A FR 0111736 A FR0111736 A FR 0111736A FR 2829498 A1 FR2829498 A1 FR 2829498A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- vector
- feline
- igf
- immunogen
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000282324 Felis Species 0.000 title claims abstract description 63
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 24
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 title abstract description 8
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 title abstract description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 22
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 title description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 title 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 46
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 22
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 14
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims abstract description 10
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 69
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 62
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 58
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 10
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 6
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 6
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 claims description 5
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 claims description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims description 3
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 claims description 3
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 43
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 36
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 33
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 33
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 14
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 9
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 5
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 4
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 description 3
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 3
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 3
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N Glutamine Chemical compound OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940023860 canarypox virus HIV vaccine Drugs 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101100328893 Arabidopsis thaliana COL5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100328886 Caenorhabditis elegans col-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101800001603 Capsid protein C Proteins 0.000 description 1
- 101150047856 Cav2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 101800001847 Core protein precursor Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101150088952 IGF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101150068332 KIT gene Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 208000005098 feline infectious peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940090046 jet injector Drugs 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229940024231 poxvirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
L'invention est relative à l'IGF-1 félin, à la séquence nucléotidique codant pour cette protéine, ainsi qu'à l'utilisation de l'IGF-1 comme adjuvant pour la vaccination des chats, en particulier contre les rétrovirus félins FIV et FeLV. L'IGF-1 peut être utilisé sous forme de protéine ou exprimé in vivo par un vecteur d'expression approprié, e. g. viral ou plasmidique. L'invention vise tous les types de vaccins, à savoir inactivés, atténués, sous-unités et recombinants. Les vecteurs exprirnant IGF-1 in vivo peuvent également être utilisés dans des compositions stimulantes de l'immunité.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention a trait au facteur de croissance IGF-1 félin, à un polynucléotide codant pour cet IGF-1 et à des vecteurs d'expression le contenant.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation de l'IGF-1 comme adjuvant de vaccination chez l'espèce féline en particulier pour les vaccins contre les rétrovirus félins.
L'IGF-1 est un médiateur endocrinien pour la croissance. Il s'agit du principal effecteur de l'hormone de croissance. L'IGF-1 joue également un rôle dans le système complexe de la régulation de l'immunité et de l'inflammation aux côtés de cytokines, d'hormones (notamment le cortisol, l'hormone de croissance).
US-A-5,202, 119 décrit l'utilisation thérapeutique de l'IGF-1 humain comme stimulant de l'immunité chez l'homme et plus particulièrement chez les sujets immunodéprimés. Une application particulière est l'association de l'IGF1 humain à un immunogène pour stimuler la production d'anticorps vis-à-vis de cet immunogène. Ce brevet propose d'étendre l'application aux mammifères en général et à l'espèce aviaire, sans cependant décrire des séquences IGF-1 animales ni fournir aucun résultat expérimental chez l'animal.
La déposante a observé que l'IGF-1 stimule plus particulièrement la réponse cellulaire en général. Ce profil de réponse s'avère particulièrement bien adapté dans le cas des rétrovirus félins. Il stimule aussi l'immunité mucosale.
Par ailleurs, jusqu'à l'invention, le gène codant pour l'IGF-1 félin n'était pas disponible.
La déposante a réussi à isoler et séquencer le gène de l'IGF-1 provenant de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de chat. Ce gène a été isolé après amplification en chaîne par polymérase (ACP ou PCR) avec l'aide des oligonucléotides décrits dans les exemples.
Le gène IGF-1 félin a une taille de 462 nucléotides (SEQ ID NO : 1) et code pour une protéine de 153 acides aminés (SEQ ID NO : 2). En N-terminal de la protéine telle que définie dans la SEQ 1 D NO : 2 il y a une séquence peptide signal de 48 acides aminés (de 1 à 48 dans la séquence SEQ ID NO : 2) servant à la sécrétion de la protéine, ce peptide signal étant secondairement clivé. La protéine mature (SEQ 1 D NO : 3) de 105 acides aminés, correspond aux acides aminés 49 à 153 de la SEQ ID NO : 2.
<Desc/Clms Page number 2>
La présente invention concerne aussi bien la séquence ADN codant pour l'IGF1 félin et son brin complémentaire que la séquence ARN correspondante, et les séquences équivalentes obtenues par dégénérescence du code génétique.
Un premier objet de l'invention est donc un polynucléotide (par définition ADN ou ARN) isolé comprenant la séquence nucléotidique identifiée SEQ ID NO : 1 et la même séquence avec substitutions des T en U. Elle a aussi pour objet le polynucléotide isolé ayant cette séquence. La présente invention a aussi pour objet un polynucléotide isolé codant pour la séquence en acides aminés identifiée SEQ ID NO : 2 ou 3.
Par définition la notion d'IGF-1 selon l'invention couvre les IGF-1 d'origine féline et les protéines ayant une homologie égale ou supérieure à 98,5 % et de préférence à 99,0 % avec la SEQ ID NO : 2. Les polynucléotides codant pour ces protéines d'origine féline ou pour les homologues ainsi définis font partie de l'invention.
Les polynucléotides selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse chimique ou par expression au moyen de vecteurs d'expression appropriés.
La présente invention a également pour objet les protéines ou polypeptides IGF-1 félins isolés sous forme mature ou leur précurseur. L'invention a donc en
particulier pour objet un polypeptide comportant la séquence SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3.
particulier pour objet un polypeptide comportant la séquence SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3.
Les protéines selon l'invention peuvent aussi être définies comme étant codées par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou exprimées par les polynucléotides selon l'invention. La protéine ou le polypeptide IGF-1 peut être exprimé et isolé sous forme mature dans un système cellulaire permettant sa sécrétion et le clivage du peptide signal en 5'. Il peut aussi être exprimé et isolé sous forme de précurseur.
La présente invention a aussi pour objet les vecteurs d'expression comportant comme insert un polynucléotide tel que défini ci-dessus.
La séquence nucléotidique peut être insérée dans des vecteurs d'expression in vitro classiques, notamment d'origine virale telle que Baculovirus ou d'origine plasmidique. Ces vecteurs sont ensuite utilisés pour infecter ou transfecter des
<Desc/Clms Page number 3>
systèmes cellulaires appropriés, comme les cellules d'insectes, des cellules d'origine procaryote (par exemple Escherichia colt) ou eucaryote, en particulier des levures, notamment Saccharomyces cerevisiae, des cellules de mammifères, notamment des cellules de hamster (par exemple les cellules CHO) et des cellules de chat (par exemple les cellules CRFK). On préfère utiliser le Baculovirus (US-A- 4,745, 051 ; ViatardJ. ea/., J. Virol., 1990,64 (1), 37-50 ; Verne A., Virology, 1988, 167,56-71), e. g. Autographa california Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV, comme vecteur pour exprimer l'IGF-1 dans des cellules d'insectes, notamment cellules de Spodoptera frugiperda Sf9 (dépôt ATCC CRL 1711). L'homme du métier connaît et peut mettre en oeuvre les méthodes de production de protéines adaptées au système choisi, et ainsi obtenir et isoler la protéine IGF-1. L'invention couvre donc également ces vecteurs d'expression in vitro comprenant un polynucléotide selon l'invention, la protéine IGF-1 félin ainsi produite, et son usage en tant qu'adjuvant de vaccin et de stimulant non spécifique de l'immunité.
De manière préférée, le polynucléotide selon l'invention est introduit dans des vecteurs d'expression in vivo dans des conditions permettant l'expression chez l'hôte d'une protéine IGF-1 félin fonctionnelle. Ces vecteurs d'expression peuvent être des plasmides, des vecteurs viraux, tels que les poxvirus, par exemple des
mutants atténués du virus de la vaccine, e. g. le MVA (souche Ankara) (Stickl H. et Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153 ; Sutter G. et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1992, 89, 10847-10851), le NYVAC (souche modifiée génétiquement par délétion de régions non essentielles du génome codant pour des facteurs de virulence), les avipox (en particulier canarypox, folwpox), le swinepox, le raccoonpox, les adénovirus (en particulier CAV-2) et les herpèsvirus, tels que le virus herpès félin FHV. Parmi les vecteurs viraux, canarypox et FHV sont préférés.
mutants atténués du virus de la vaccine, e. g. le MVA (souche Ankara) (Stickl H. et Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153 ; Sutter G. et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1992, 89, 10847-10851), le NYVAC (souche modifiée génétiquement par délétion de régions non essentielles du génome codant pour des facteurs de virulence), les avipox (en particulier canarypox, folwpox), le swinepox, le raccoonpox, les adénovirus (en particulier CAV-2) et les herpèsvirus, tels que le virus herpès félin FHV. Parmi les vecteurs viraux, canarypox et FHV sont préférés.
Pour les poxvirus, l'homme du métier peut se reporter à WO-A-90/12882, et plus particulièrement pour le virus de la vaccine à US-A-4,769, 330 ; US-A- 4,722, 848 ; US-A-4,603, 112 ; US-A-5,110, 587 ; US-A-5,494, 807 ; US-A-5,762, 938 ; pour le fowlpox à US-A-5,174, 993 ; US-A-5,505, 941 ; US-A-5,766, 599 ; pour le canarypox à US-A-5,756, 103.
Lorsque le vecteur d'expression est un virus de la vaccine, les sites
<Desc/Clms Page number 4>
d'insertion du (des) polynucléotide (s) à exprimer sont en particulier le gène de la thymidine kinase (TK), le gène de l'hémagglutinine (HA), la région du corps d'inclusion de type A (ATI). Lorsqu'il s'agit d'un canarypox, les sites d'insertion sont en particulier situés dans, ou constitués par, les cadres ouverts de lecture (COLs) C3, C5 et C6. Lorsqu'il s'agit d'un fowlpox, les sites d'insertion sont en particulier situés dans, ou constitués par, les COLs F7 et F8.
Selon l'un des modes préférés de l'invention, le vecteur d'expression poxvirus est un ALVAC ou un virus canarypox (par exemple de la souche Rentschler) qui a été atténué, notamment par plus de 200 passages sur cellules de fibroblastes d'embryons de poulet (CEF). Un virus canarypox de souche ALVAC a été déposé le 14 novembre 1996 auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) sous le numéro d'accès VR-2547. D'autres poxvirus atténués peuvent être utilisés, notamment des fowlpox atténués (e. g. TROVAC) ou des virus de la vaccine atténués (e. g. NYVAC). Sur les poxvirus TROVAC et NYVAC, l'homme de l'art peut se reporter au brevet WO-A-96/40241.
De préférence, lorsque le vecteur d'expression est un poxvirus, le polynucléotide à exprimer est inséré sous le contrôle d'un promoteur spécifique des poxvirus, notamment le promoteur vaccine 7,5 kDa (Cochran et al., J. Virology, 1985,54, 30-35), le promoteur vaccine 13L (Riviere et a/., J. Virology, 1992,66, 3424-3434), le promoteur vaccine HA (Shida, Virology, 1986,150, 451-457), le promoteur cowpoxATI (Funahashi et a/., J. Gen. Virol., 1988,69, 35-47), ou encore le promoteur vaccine H6 (Taylor J. eta/. Vaccine, 1988,6, 504-508 ; Guo P. et al. J.
Virol., 1989,63, 4189-4198 ; Perkus M. et al. J. Virol., 1989,63, 3829-3836).
Lorsque le vecteur d'expression est un FHV, les sites d'insertion du (des) polynucléotide (s) à exprimer sont en particulier les cadres ouverts de lecture (COLs) COL2 et COL5 (US-A-6,074, 649).
De préférence, lorsque le vecteur d'expression est un virus herpès, le polynucléotide à exprimer est inséré sous la dépendance de signaux régulateurs de la transcription et notamment de promoteurs, de préférence apportés lors de l'insertion, par exemple le promoteur précoce du cytomégalovirus ou CMV-IE (Cytomegalovirus Immédiate Early), notamment d'origine humaine (hCMV-IE), du
<Desc/Clms Page number 5>
rat, du cobaye ou de préférence d'origine murine (mCMV IE), les promoteurs précoce et tardif du virus SV40 (Simian Virus 40), les promoteurs tardifs de glycoprotéines, notamment de gB, gC et gD, d'herpèsvirus alpha, notamment de l'herpèsvirus félin (FHV).
Par définition, un plasmide comprend au moins une unité de transcription comprenant un polynucléotide d'intérêt par exemple celui codant pour IGF-1 et les éléments nécessaires à son expression in vivo. On préfère la forme plasmide circulaire, superenroulée ou non. La forme linéarisée entre également dans le cadre de cette invention.
Chaque plasmide comprend un promoteur. Il s'agit de préférence du promoteur précoce du cytomégalovirus (promoteur CMV-IE), d'origine humaine ou murine, ou encore éventuellement d'une autre origine telle que rat, cobaye. Le promoteur CMV-IE peut comprendre la partie promoteur proprement dite, associée
ou non à la partie activatrice (enhancer). On peut se référer à EP-A-260, 148, EP-A- 323, 597, US-A-5, 168, 062, US-A-5, 385, 839, US-A-4, 968, 615, WO-A-87/03905. On préfère le CMV-IE humain (Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530) ou murin.
ou non à la partie activatrice (enhancer). On peut se référer à EP-A-260, 148, EP-A- 323, 597, US-A-5, 168, 062, US-A-5, 385, 839, US-A-4, 968, 615, WO-A-87/03905. On préfère le CMV-IE humain (Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530) ou murin.
De manière plus générale, le promoteur est soit d'origine virale, soit d'origine cellulaire. Comme promoteur viral autre que CMV-IE, on peut citer le promoteur précoce ou le promoteur tardif du virus SV40 ou le promoteur LTR du virus du Sarcome de Rous. Comme promoteur cellulaire, on peut citer le promoteur d'un gène du cytosquelette, tel que par exemple le promoteur de la desmine (Kwissa M. et a/., Vaccine, 2000,18 (22), 2337-2344), ou encore le promoteur de l'actine (Miyazaki J. et a/., Gene, 1989,79 (2), 269-277). Lorsque plusieurs gènes sont présents dans le même plasmide, ceux-ci peuvent être présentés dans la même unité de transcription ou dans plusieurs unités différentes.
Par équivalence, les sous-fragments de ces promoteurs, conservant une activité promotrice adéquate sont compris dans la présente invention : e. g. les promoteurs CMV-IE tronqués selon WO-A-98/00166. La notion de promoteur selon l'invention inclut donc les dérivés et sous-fragments conservant une activité promotrice adéquate, de préférence substantiellement similaire à celle du promoteur proprement dit dont ils sont issus. Pour le CMV-IE, cette notion comprend la partie
<Desc/Clms Page number 6>
promoteur proprement dite et/ou la partie activatrice et les dérivés et sousfragments.
Les plasmides peuvent également comprendre d'autres éléments de régulation de transcription, tels que par exemple des séquences stabilisatrices du type intron, de préférence intron Il du gène de la ss-globine de lapin (van Ooyen et al. Science, 1979,206 : 337-344), et/ou séquence signal de la protéine codée par le gène de l'activateur du plasminogène tissulaire (tPA ; Montgomery et al. Cell. Mol.
Biol. 1997,43 : 285-292), et/ou signal de polyadénylation (polyA), notamment du gène de l'hormone de croissance bovine (bGH) (US-A-5,122, 458) ou du gène de la ss-globine du lapin.
Conformément à l'invention, l'IGF-1 félin peut être utilisé comme adjuvant de vaccin en particulier pour augmenter la réponse immunitaire cellulaire dirigée contre un ou plusieurs immunogènes, notamment immunogènes de rétrovirus félin tel que virus de l'immunodéficience féline (FIV) et virus de la leucémie féline (FeLV). Des IGF-1 d'autres espèces peuvent aussi être utilisés à cet effet, bien que l'IGF-1 félin soit préféré.
Conformément à l'invention, l'IGF-1 félin peut en variante ou simultanément être utilisé comme adjuvant de vaccin pour augmenter la réponse immunitaire mucosale dirigée contre un ou plusieurs immunogènes, notamment immunogènes de rétrovirus félin tel que FIV et FeLV. Des IGF-1 d'autres espèces peuvent aussi être utilisés à cet effet, bien que l'IGF-1 félin soit préféré.
L'invention concerne ainsi les compositions destinées à induire chez un membre de l'espèce féline, notamment un chat, une réponse immunitaire contre un pathogène félin. Les compositions immunogènes ou vaccinales selon l'invention comprennent une protéine IGF-1 de préférence IGF-1 félin selon l'invention ou un vecteur recombinant exprimant cet IGF-1 in vivo, au moins un immunogène de FIV et/ou de FeLV, ou un vecteur recombinant exprimant cet immunogène in vivo, et un excipient ou véhicule acceptable sur le plan vétérinaire. La notion de composition immunogène recouvre ici toute préparation susceptible, une fois administrée au félin, notamment au chat, d'induire une réponse immunitaire dirigée contre le pathogène considéré, réponse qui est augmentée par la présence de la protéine
<Desc/Clms Page number 7>
IGF-1. Il s'agit de préférence d'une composition vaccinale capable d'induire une protection efficace ou un certain degré de protection contre ce pathogène, degré de protection qui est ici accru par la présence de la protéine IGF-1 félin.
Les compositions immunogènes et vaccinales visées dans l'invention recouvrent tous les types connus, à savoir inactivées, vivantes atténuées, de sousunités et vecteurs recombinants.
Comme on l'a vu plus haut, la protéine IGF-1 peut être ajoutée telle quelle à l'immunogène pour former, en présence d'un excipient ou véhicule acceptable sur le plan vétérinaire, une composition prête à être administrée. On peut aussi prévoir de combiner la protéine IGF-1 à un système de libération prolongée conçu pour libérer graduellement la protéine.
Suivant une modalité particulière de l'invention, on peut exprimer la protéine IGF-1 in vivo en utilisant un vecteur d'expression in vivo, ou vecteur recombinant, tel que décrit ci-dessus. Dans ce cas, on préfère aussi que l'immunogène soit exprimé à l'aide d'un vecteur recombinant, de même type ou de type différent, que celui exprimant la protéine IGF-1. On peut aussi prévoir d'utiliser un même vecteur d'expression in vivo, comprenant et exprimant au moins un immunogène et la protéine IGF-1. Par immunogène exprimé par un vecteur, on entend un peptide, polypeptide ou protéine capable d'induire chez l'hôte une réaction immunitaire contre un agent pathogène. Il peut s'agir d'une protéine ou d'une glycoprotéine entière, ou d'un fragment immunologiquement actif.
La présente invention couvre donc de préférence les compositions immunogènes et les vaccins comprenant :
- un vecteur d'expression in vivo contenant un polynucléotide codant pour un IGF-
1 de préférence félin, dans des conditions permettant l'expression chez le félin, notamment chez le chat, d'une protéine IGF-1 fonctionnelle, - au moins un vecteur d'expression in vivo contenant au moins un polynucléotide codant pour un immunogène de FIV et/ou de FeLV, ce vecteur pouvant être aussi celui exprimant IGF-1, et - un véhicule ou excipient acceptable au plan vétérinaire.
- un vecteur d'expression in vivo contenant un polynucléotide codant pour un IGF-
1 de préférence félin, dans des conditions permettant l'expression chez le félin, notamment chez le chat, d'une protéine IGF-1 fonctionnelle, - au moins un vecteur d'expression in vivo contenant au moins un polynucléotide codant pour un immunogène de FIV et/ou de FeLV, ce vecteur pouvant être aussi celui exprimant IGF-1, et - un véhicule ou excipient acceptable au plan vétérinaire.
<Desc/Clms Page number 8>
Pour les vaccins de sous-unités et les vaccins recombinants, les immunogènes sont de préférence, pour le virus FELV, la glycoprotéine d'enveloppe (env) ou la protéine gag/pol, ou les associations de ces immunogènes de FeLV, et, pour FIV, les protéines env, gag/pro, rev, tat, ou leurs associations, de préférence env et gag, éventuellement associés à rev et/ou tat. Pour les vaccins recombinants, une séquence nucléotidique codant pour l'immunogène considéré est insérée dans le vecteur d'expression sous la dépendance des signaux nécessaires à son expression in vivo.
Les avantages de l'utilisation de l'IGF-1 lors des vaccinations sont notamment l'augmentation des réponses cellulaires et mucosales, la diminution de la dose d'immunogène ou de vecteur recombinant utilisée. De plus, chez certains animaux non répondeurs après administration d'un vaccin usuel, l'utilisation de l'IGF-1 en association avec le vaccin usuel permet la stimulation de la réponse immunitaire et son augmentation jusqu'à un niveau protecteur.
Une particularité avantageuse de l'invention est l'utilisation d'un vecteur pour exprimer in vivo l'IGF-1 ce qui permet d'augmenter la durée d'action d'IGF-1. Le recours à un vecteur d'expression in vivo pour IGF-1 est préféré quelle que soit la forme de l'immunogène.
Suivant une modalité particulière, l'invention couvre les compositions comprenant un plasmide codant et exprimant l'IGF-1 de préférence félin selon l'invention et au moins un autre plasmide codant et exprimant au moins un immunogène félin. Des exemples de constructions de plasmides contenant des immunogènes félins conformes à l'invention sont donnés dans WO-A-98/03660 et WO-A-00/77043. L'invention couvre également les compositions comprenant un plasmide codant et exprimant simultanément l'IGF-1 de préférence félin et au moins un immunogène félin.
On a vu que l'invention s'applique aux rétrovirus félins (virus de l'immunodéficience féline (FIV) et virus de la leucémie féline (FeLV). Elle peut néanmoins être aussi appliquée à d'autres pathogènes félins, tels que virus de la pan leucopénie féline (FPV), virus de la péritonite infectieuse féline (PIF ou FIPV), virus herpès félin (FHV), calicivirus félin (FCV), virus de la rage et Chlamydia.
<Desc/Clms Page number 9>
Comme on l'a vu plus haut, les vaccins peuvent être des vaccins atténués, des vaccins inactivés, des vaccins de sous-unités ou des vaccins recombinants. Pour les vaccins de sous-unités et les vaccins recombinants, les immunogènes félins sont de préférence choisis parmi la protéine de capside VP2 pour FPV, les glycoprotéines S, M, N et leurs combinaisons pour FIPV, les glycoprotéines g8, gC, gD et leurs combinaisons pour FHV, la protéine de capside C pour FCV, et la glycoprotéine G pour le virus de la rage.
Entre aussi dans le cadre de cette inventions les compositions dans lesquelles la préparation immunogène ou vaccinale comprend un immunogène de deux ou plus de ces pathogènes, ou plus particulièrement un immunogène de l'un ou plusieurs de ces pathogènes et un immunogène de FIV et/ou de FeLV.
Les compositions selon l'invention peuvent aussi comprendre un ou plusieurs autres adjuvants de l'immunité, notamment choisis parmi ceux habituellement utilisés en vaccination féline pour la ou les valences considérées. Les compositions classiques (vaccins inactivés, vivants atténués, sous-unités) peuvent ainsi comprendre à titre d'adjuvant classique des composés de type carbomère, de l'hydroxyde d'alumine, ou être formulés sous forme d'émulsion huile-dans-l'eau ou eau-dans-l'huile-dans-l'eau. Pour les compositions à base de vecteur d'expression viral, on peut citer les composés de type carbomère et les émulsions huile-dansl'eau ou eau-dans-l'huile-dans-l'eau.
Les compositions plasmidiques peuvent être avantageusement formulées avec un lipide cationique contenant un sel d'ammonium quaternaire. Ces lipides sont de préférence ceux qui répondent à la formule suivante :
dans laquelle R1 est un radical aliphatique linéaire, saturé ou insaturé, ayant de 12 à 18 atomes de carbone, Rz est un autre radical aliphatique, renfermant 2 ou 3 atomes de carbone, et X un groupement hydroxyle ou amine.
dans laquelle R1 est un radical aliphatique linéaire, saturé ou insaturé, ayant de 12 à 18 atomes de carbone, Rz est un autre radical aliphatique, renfermant 2 ou 3 atomes de carbone, et X un groupement hydroxyle ou amine.
<Desc/Clms Page number 10>
Parmi ces lipides cationiques, on préfère le DMRIE (N- (2-hydroxyéthyl) -N, N- diméthyl-2, 3-bis (tetradécyloxy) -1-propanammonium ; WO-A-96/34109), de préférence associé avec un lipide neutre, de préférence le DOPE (dioléoylphosphatidyl-éthanolamine ; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5,382-389), pour former le DMRIE-DOPE.
De préférence, le mélange plasmide avec cet adjuvant se fait de manière extemporanée et l'on préfère, avant son administration, laisser le temps au mélange ainsi constitué de se complexer, par exemple pendant une durée allant de 10 à 60 minutes, notamment de l'ordre de 30 minutes.
Lorsque du DOPE est présent, le ratio molaire DMRIE : DOPE va de préférence de 95 : 5 à 5 : 95, plus particulièrement de 1 : 1.
Le ratio pondéral plasmide : adjuvant DMRIE ou DMRIE-DOPE peut aller notamment de 50 : 1 à 1 : 10, en particulier de 10 : 1 à 1 : 5, et de préférence de 1 : 1 à 1 : 2.
La présente invention a aussi pour objet des méthodes d'immunisation et de vaccination des félins, notamment des chats, en particulier contre les rétrovirus félins FIV et FeLV.
Ces méthodes comprennent l'administration d'une quantité efficace d'une composition immunogène ou d'un vaccin selon l'invention. Cette administration peut se faire notamment par la voie parentérale, e. g. par administration sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, ou par la voie orale et/ou nasale.
Ces méthodes peuvent notamment viser l'augmentation de la réponse immunitaire cellulaire et/ou mucosale vis-à-vis du ou des immunogènes associés, en particulier vis-à-vis de FIV et/ou de FeLV.
La présente invention a encore pour objet des compositions stimulantes non spécifiques de l'immunité, c'est-à-dire utilisables comme stimulant général de l'immunité. Ces compositions sont administrées en présence comme en l'absence de pathologie déclarée, en général indépendamment de tout vaccin, afin de renforcer les défenses immunitaires notamment du félin, de préférence du chat. Ces compositions comprennent des vecteurs recombinés viraux ou plasmidiques exprimant in vivo de l'IGF-1 selon l'invention et un excipient ou véhicule acceptable
<Desc/Clms Page number 11>
sur le plan vétérinaire, ces compositions permettant une production prolongée d'IGF-1 dans l'organisme. Les caractéristiques de ces vecteurs ont déjà été décrites. Ces compositions peuvent aussi comprendre un ou plusieurs adjuvants tels que décrits ci-dessus.
Les différentes compositions et vaccins peuvent être injectés par un injecteur à jet liquide sans aiguille.
Les compositions immunogènes et les vaccins selon l'invention comprennent une quantité efficace de plasmide ou de vecteur viral, la détermination de ces quantités étant à la portée de l'homme du métier. La déposante recommande : - dans le cas des compositions immunogènes ou des vaccins à base de plasmide, une dose peut comporter de 1 pug environ à 2000 ig environ, notamment de 50 fl9 environ à 1000 Ftg environ. Les volumes de dose peuvent être compris entre 0,1 et 2 ml, de préférence entre 0,2 et 1 ml.
- dans le cas des compositions immunogènes ou des vaccins à base de poxvirus, une dose peut être comprise entre environ 103 pfu et environ 109 pfu.
Lorsque le vecteur est le virus canarypox, la dose est plus particulièrement comprise entre environ 105 pfu et environ 109 pfu, de préférence entre environ 106 pfu et environ 108 pfu. Lorsque le vecteur est le virus herpès félin, la dose est plus particulièrement comprise entre environ 102 DtCCso et environ 107 DICC50. Les volumes de dose des compositions immunogènes et des vaccins félins à base de vecteurs viraux sont en général compris entre 0,1 et 2,0 ml, de préférence entre 0,2 et 1,0 ml.
Lorsque l'IGF-1 est apporté sous forme protéique la dose va de 20 à 2000 fl9 et de préférence de 100 à 500 jj. g.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs dans lequel : EXEMPLES
Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standards de biologie moléculaire (digestion par les enzymes de
Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standards de biologie moléculaire (digestion par les enzymes de
<Desc/Clms Page number 12>
restriction, synthèse d'un ADN complémentaire simple brin, amplification en chaîne par polymérase, élongation d'un oligonucléotide par une ADN polymérase...)
décrites par Sambrook J. et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention, ainsi que les divers fragments d'amplification en chaîne par polymérase (= ACP ou PCR), ont été isolés et purifiés en utilisant le kit"Genedean" (B ! 0101 tnc. La Jolla, CA).
décrites par Sambrook J. et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention, ainsi que les divers fragments d'amplification en chaîne par polymérase (= ACP ou PCR), ont été isolés et purifiés en utilisant le kit"Genedean" (B ! 0101 tnc. La Jolla, CA).
Exemple 1 : Préparation de l'ARN total de lymphocytes de chat
Du sang de chat a été récolté sur un tube héparine par une prise de sang à la veine jugulaire. Les cellules mononucléées, en absence de toute stimulation, ont été récoltées par centrifugation sur un gradient de Ficoll. L'ARN total de ces cellules contenu dans 100 ml de suspension a été extrait en utilisant le kit High pure RNA isolation kit (Roche Molecular Biochemical, Cat # 1 828 665) en suivant les instructions du fournisseur pour les étapes d'extraction. Le culot d'ARN obtenu à la fin de l'extraction est resuspendu avec 1 à 2 ml d'eau distillée stérile sans RNase.
Du sang de chat a été récolté sur un tube héparine par une prise de sang à la veine jugulaire. Les cellules mononucléées, en absence de toute stimulation, ont été récoltées par centrifugation sur un gradient de Ficoll. L'ARN total de ces cellules contenu dans 100 ml de suspension a été extrait en utilisant le kit High pure RNA isolation kit (Roche Molecular Biochemical, Cat # 1 828 665) en suivant les instructions du fournisseur pour les étapes d'extraction. Le culot d'ARN obtenu à la fin de l'extraction est resuspendu avec 1 à 2 ml d'eau distillée stérile sans RNase.
Exemple 2 : Isolement du gène codant pour l'IGF-1 félin
L'ADN complémentaire (ADNc) de l'IGF-1 félin est synthétisé avec le kit
Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
L'ADN complémentaire (ADNc) de l'IGF-1 félin est synthétisé avec le kit
Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
Une réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction RT-PCR ) est réalisée avec 50 ! de la suspension d'ARN félin (exemple 1), la Pfu polymérase (Stratagène, Cat # 600154) et avec les oligonucléotides suivants :
EL490 (39 mer) (SEQ ID NO : 4) 5'ACGCCGTCGACATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCCAACCC 3' et FC124 (42 mer) (SEQ ID NO : 5) 5'CGCGGATCCCTACATTCTGTAGTTCTTGTTTCCCGCACTCCC 3'.
EL490 (39 mer) (SEQ ID NO : 4) 5'ACGCCGTCGACATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCCAACCC 3' et FC124 (42 mer) (SEQ ID NO : 5) 5'CGCGGATCCCTACATTCTGTAGTTCTTGTTTCCCGCACTCCC 3'.
Ce couple d'oligonucléotides permet l'incorporation d'un site de restriction Sail, d'un site de restriction BamHI, d'un codon ATG initiateur en 5'de l'insert et
<Desc/Clms Page number 13>
d'un codon stop en 3'de l'insert.
La synthèse du premier brin d'ADNc se fait par élongation de l'hexamer du kit, après hybridation de ce dernier à la matrice d'ARN.
Les conditions de synthèse du premier brin d'ADNc sont une température de 420C pendant 20 min, puis de 99 C pendant 5 min, et enfin de 4 C pendant 5 min.
Les conditions de la réaction PCR en présence du couple d'oligonucléotides EL490 et FC124 sont une température de 95 C pendant 2 min, puis 40 cycles (95 C pendant 30 sec, puis 55 C pendant 45 sec, et 72 C pendant 1 min), et enfin 72 C pendant 10 min en présence de la Taq DNA polymérase (Gibco BRL, Cleveland, OH, USA, Cat # 18038-26) pour produire un fragment de 481 paires de bases (pb).
Ce fragment est ensuite inséré dans le plasmide pCR2 (plasmide présent dans le kit"Topo TA cloning kit", InVitrogen, Cat # K4550-40). Le plasmide ainsi obtenu a une taille de 4432 pb et est nommé pPB476.
L'ensemble de ces opérations est répétée encore deux fois afin d'obtenir 3 "populations"de plasmides pPB476. Les inserts de ces plasmides sont ensuite séquencés. La séquence consensus (SEQ ID NO : 1), établie à partir de ces 3 "populations" plasmides pPB476, a une taille de 462 pb et code pour une protéine de 153 acides aminés (SEQ ID NO : 2). Cette protéine est le facteur IGF-1 du chat (= IGF-1 félin).
Exemple 3 : construction du plasmide pPB477
Le plasmide pPB476 (exemple 2) a été digéré par BamHI et Sali et le fragment BamHI-Sall de 468 pb ainsi obtenu a été ligaturé avec le plasmide pVR1012 (figure 1 et exemple 7 de WO-A-98/03199 ; Hartikka J. et al. Human Gene Therapy. 1996.7. 1205-1217), préalablement digéré avec BamHI et Sali, pour donner le plasmide pPB477 (5334 pb). Ce plasmide contient, sous le contrôle du promoteur précoce du cytomégalovirus humain ou hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un insert codant pour l'IGF-1 félin.
Le plasmide pPB476 (exemple 2) a été digéré par BamHI et Sali et le fragment BamHI-Sall de 468 pb ainsi obtenu a été ligaturé avec le plasmide pVR1012 (figure 1 et exemple 7 de WO-A-98/03199 ; Hartikka J. et al. Human Gene Therapy. 1996.7. 1205-1217), préalablement digéré avec BamHI et Sali, pour donner le plasmide pPB477 (5334 pb). Ce plasmide contient, sous le contrôle du promoteur précoce du cytomégalovirus humain ou hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un insert codant pour l'IGF-1 félin.
Exemple 4 : Activité biologique in vitro du produit du gène IGF-1 félin
Des cellules CHO-K1 (cellules ovariennes de hamster, accessible auprès de
Des cellules CHO-K1 (cellules ovariennes de hamster, accessible auprès de
<Desc/Clms Page number 14>
la souchothèque American Type Culture Collection sous le numéro d'accès CCL-61) sont mises en culture en milieu essentiel minimum ou MEM (Gibco-BRL) dans des boîtes de Petri de 60 mm de diamètre et transfectées avec 5 g pjasmide pPB477 (exemple 3), préalablement complexés avec 10 J.. LI de LipofectAmine PLUS@ (Cat# 10964-013, Gibco-BRL, Cleveland, OH, USA). Les conditions de formation des complexes ADN/LipofectAmine@ et de transfection des cellules ont été celles recommandées par le fournisseur (Gibco-BRL). 48 heures après la transfection, les surnageants des cultures sont récoltés et congelés.
Des cellules CRFK sont mises en culture dans des plaques de 96 puits à raison de 100 000 cellules par puits en milieu MEM additionné de 0, 1% de BSA et de 1 % de sérum de veau foetal. 24 heures plus tard, le milieu de culture est retiré et les cultures sont alors additionnées avec du surnageant dilué ou non de culture des cellules CHO-K1 transfectées avec le plasmide pPB477. Chaque dilution du surnageant (1/1,1/5, 1/10 et 1/100) est testé en triplicate en milieu MEM. Le contrôle négatif est constitué par un surnageant de culture CHO-K1 sans sérum et sans transfection avec pPB477. Après 24 heures de culture, les cellules CRFK sont incubées à 37 C en présence de thymidine tritiée les 8 dernières heures de culture (concentration finale en thymidine tritiée : 2,5 jCi/ml). Les plaques de culture sont stockées à-20 C. La radioactivité est mesurée par lecture sur un compteur p MicroBeta trilux (Wallac).
Les surnageants de cellules CHO-K1 transfectées avec le plasmide pPB477 ont donné les résultats suivants :
<tb>
<tb> Dilution <SEP> surnageant <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Radioactivité <SEP> Ecart-type <SEP> Indice <SEP> de
<tb> puits <SEP> moyenne <SEP> prolifération
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> 3 <SEP> 2123 <SEP> 327 <SEP> 0%
<tb> 1/100 <SEP> 3 <SEP> 2872 <SEP> 657 <SEP> 135%
<tb> 1/10 <SEP> 3 <SEP> 8444 <SEP> 646 <SEP> 397%
<tb>
<tb> Dilution <SEP> surnageant <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Radioactivité <SEP> Ecart-type <SEP> Indice <SEP> de
<tb> puits <SEP> moyenne <SEP> prolifération
<tb> Témoin <SEP> négatif <SEP> 3 <SEP> 2123 <SEP> 327 <SEP> 0%
<tb> 1/100 <SEP> 3 <SEP> 2872 <SEP> 657 <SEP> 135%
<tb> 1/10 <SEP> 3 <SEP> 8444 <SEP> 646 <SEP> 397%
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
<tb>
<tb> 1/5 <SEP> 3 <SEP> 8990 <SEP> 912 <SEP> 423%
<tb> 1/1 <SEP> 3 <SEP> 9533 <SEP> 1091 <SEP> 449%
<tb>
<tb> 1/5 <SEP> 3 <SEP> 8990 <SEP> 912 <SEP> 423%
<tb> 1/1 <SEP> 3 <SEP> 9533 <SEP> 1091 <SEP> 449%
<tb>
Les résultats de chaque essai sont exprimés par leur indice de prolifération correspondant au rapport des valeurs de radioactivité moyenne pour l'échantillon et le témoin négatif exprimé en pourcentage.
Ces résultats montrent que le produit du gène IGF-1 félin exprimé par le plasmide pPB477 possède une activité biologique sur cellules in vitro.
Exemple 5 : Culture du virus FIV
Pour leur amplification, des virus de l'immunodéficience féline de souche Villefranche IFFA 1/88 (Steffan A. M. et al., J. Gen. Virol., 1994,75, 3647-3653) ou de souche Petaluma sont cultivés sur cellules de lymphocytes T auxiliaires félins (par exemple Q201 ; Willet B. et al., J. Gen. Virol., 1997,78, 611-618).
Pour leur amplification, des virus de l'immunodéficience féline de souche Villefranche IFFA 1/88 (Steffan A. M. et al., J. Gen. Virol., 1994,75, 3647-3653) ou de souche Petaluma sont cultivés sur cellules de lymphocytes T auxiliaires félins (par exemple Q201 ; Willet B. et al., J. Gen. Virol., 1997,78, 611-618).
Les cellules Q201 sont mises en culture en Falcon 25 cm2 avec du milieu Eagle-MEM supplémenté de 2 mM de glutamin, de 10 % de sérum de veau, de 100 Ul/ml de pénicilline, de 100 jj. g/mt de streptomycine et de 100 Ul/ml d'interleukine-2 humaine recombinée, contenant environ 100 000 cellules par ml.
Les cellules sont cultivées à +37 C.
Après 3 jours la couche cellulaire arrive à confluence. Le milieu de culture est alors remplacé et le virus FIV est ajouté à raison de 5 pfu/cellule.
Lorsque l'effet cytopathogène (CPE) est complet (généralement 48-72 heures après le début de la mise en culture), les suspensions virales sont récoltées, puis clarifiées par centrifugation et congelées à-80 C. 3 à 4 passages successifs sont généralement nécessaires à la production d'un lot viral. Le lot viral est stocké à- 80 C.
Exemple 6 : Extraction de l'ARN viral de FIV
L'ARN viral contenu dans 100 ml de suspension virale de la souche FIV
L'ARN viral contenu dans 100 ml de suspension virale de la souche FIV
<Desc/Clms Page number 16>
Villefranche est extrait après décongélation avec les solutions du kit High Pure TM Viral RNA Kit (Cat # 1 858 882, Roche Molecular Biochemical), en suivant les instructions du fournisseur pour les étapes d'extraction. Le culot d'ARN obtenu à la fin de l'extraction est resuspendu avec 1 à 2 ml d'eau distillée stérile sans RNase.
Exemple 7 : Construction du plasmide pPB371
L'ADN complémentaire (ADNc) de FIV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
L'ADN complémentaire (ADNc) de FIV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
Une réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction RT-PCR ) est réalisée avec 50 gel de la suspension d'ARN viral de FIV (exemple 6) et avec les oligonucléotides suivants : FC116 (36 mer) (SEQ ID NO : 6) 5'TTTTTTCTGCAGCAATAAGAATGGCAGAAGGATTTG 3' et FC117 (36 mer) (SEQ ID NO : 7) 5'TCGCACCTGAAACATCTCGAGTGTTTCCACATGTAT 3'.
Ce couple d'oligonucléotides permet l'incorporation d'un site de restriction Pstl, d'un site de restriction Xhol et d'un codon ATG initiateur en 5'de l'insert.
La synthèse du premier brin d'ADNc se fait par élongation de l'oligonucléotide FC117, après hybridation de ce dernier à la matrice d'ARN.
Les conditions de synthèse du premier brin d'ADNc sont une température de 42 C pendant 15 min, puis de 99 C pendant 5 min, et enfin de 4 C pendant 5 min.
Les conditions de la réaction PCR en présence du couple d'oligonucléotides FC116 et FC117 sont une température de 95 C pendant 2 min, puis 40 cycles (95 C pendant 30 sec, puis 500C pendant 45 sec, et 72 C pendant 3 min), et enfin 720C pendant 7 min pour produire un fragment de 1476 pb.
Ce fragment est digéré par l'enzyme de restriction Pst ! puis par l'enzyme de restriction Xhoi pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Pstl- Xhol d'environ 1450 pb. Ce fragment est appelé fragment A.
Une deuxième réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction RT-PCR ) est réalisée avec 50 J de la
<Desc/Clms Page number 17>
suspension d'ARN viral de FIV (exemple 6) et avec les oligonucléotides suivants : FC118 (36 mer) (SEQ ID NO : 8)
5'ATACATGTGGAAACACTCGAGATGTTTCAGGTGCGA 3' et FC119 (54 mer) (SEQ ID NO : 9)
5'TTTTTTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCTGAGATACTTCATCATTC ( TCCTC 3'.
5'ATACATGTGGAAACACTCGAGATGTTTCAGGTGCGA 3' et FC119 (54 mer) (SEQ ID NO : 9)
5'TTTTTTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCTGAGATACTTCATCATTC ( TCCTC 3'.
Ce couple d'ofigonudéotides permet l'incorporation d'un site de restriction Xhol, d'un site de restriction BamHI et d'un codon stop en 3'de l'insert.
La synthèse du premier brin d'ADNc se fait par élongation de l'oligonucléotide FC118, après hybridation de ce dernier à la matrice d'ARN.
Les conditions de synthèse du premier brin d'ADNc sont une température de 42 C pendant 15 min, puis de 99 C pendant 5 min, et enfin de 40C pendant 5 min.
Les conditions de la réaction PCR en présence du couple d'oligonucléotides FC118 et FC119 sont une température de 95 C pendant 2 min, puis 40 cycles (95 C pendant 130 sec, puis 500C pendant 45 sec, et 72 C pendant 3 min), et enfin 72 C pendant 7 min pour produire un fragment de 1193 pb.
Ce fragment est digéré par l'enzyme de restriction Xhol puis par l'enzyme de restriction BamHI pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Xhol-BamHI d'environ 1170 pb. Ce fragment est appelé fragment B.
Les fragments A et B sont ligaturés avec le plasmide d'expression eucaryote pVR1012 préalablement digéré parXbal et EcoRI, pour donner le plasmide pPB371 (7467 pb). Ce plasmide contient, sous le contrôle du promoteur précoce du cytomégalovirus humain ou hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un insert codant pour la protéine env de FIV.
Exemple 8 : Construction du plasmide pPB374
L'ADN complémentaire (ADNc) de FIV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
L'ADN complémentaire (ADNc) de FIV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
Une réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction RT-PCR ) est réalisée avec 50 lli de la suspension d'ARN viral
<Desc/Clms Page number 18>
de FIV (exemple 6) et avec les oligonucléotides suivants :
PB670 (37 mer) (SEQ ID NO : 10) 5'TTTGTCGACAAGGTAGGAGAGATTCTACAGCAACATG 3' et PB674 (40 mer) (SEQ ID NO : 11) 5'TTTGCGGCCGCGTTATTGAGCCATTACTAACCTAATATTG 3'.
PB670 (37 mer) (SEQ ID NO : 10) 5'TTTGTCGACAAGGTAGGAGAGATTCTACAGCAACATG 3' et PB674 (40 mer) (SEQ ID NO : 11) 5'TTTGCGGCCGCGTTATTGAGCCATTACTAACCTAATATTG 3'.
Ce couple d'oligonucléotides permet l'incorporation d'un site de restriction Sali, d'un site de restriction Notl, d'un codon ATG initiateur en 5'et d'un codon stop en 3'de l'insert.
La synthèse du premier brin d'ADNc se fait par élongation de l'oligonucléotide PB674, après hybridation de ce dernier à la matrice d'ARN.
Les conditions de synthèse du premier brin d'ADNc sont une température de 42 C pendant 15 min, puis de 99 C pendant 5 min, et enfin de 4 C pendant 5 min.
Les conditions de la réaction PCR en présence du couple d'oligonucléotides PB670 et PB674 sont une température de 95 C pendant 2 min, puis 40 cycles (95 C
! t pendant 30 sec, puis 500C pendant 45 sec, et 720C pendant 3 min), et enfin 72 C pendant 7 min pour produire un fragment de 1758 pb.
! t pendant 30 sec, puis 500C pendant 45 sec, et 720C pendant 3 min), et enfin 72 C pendant 7 min pour produire un fragment de 1758 pb.
Ce fragment est digéré par l'enzyme de restriction Sail puis par l'enzyme de restriction Notl pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Sall- Notl d'environ 1750 pb. Ce fragment est ligaturé avec le plasmide d'expression pVR1012 préalablement digéré par Sali et Notl, pour donner le plasmide pPB374 (6633 pb). Ce plasmide contient, sous le contrôle du promoteur précoce hCMV-IE un insert codant les protéines gag/pro de FIV.
Exemple 9 : Construction du plasmide pPB375
L'ADN complémentaire (ADNc) de FIV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
L'ADN complémentaire (ADNc) de FIV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
Une réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction RT-PCR ) est réalisée avec 50 pI de la suspension d'ARN viral de FIV (exemple 6) et avec les oligonucléotides suivants : FC116 (36 mer) (SEQ ID NO : 6)
<Desc/Clms Page number 19>
et FC120 (48 mer) (SEQ ID NO : 12)
5' TTTTTACCTGCATTTCCTTCTTCCAGTTTTACCTCTTGAATTTCGTTC 3'.
5' TTTTTACCTGCATTTCCTTCTTCCAGTTTTACCTCTTGAATTTCGTTC 3'.
Ce couple d'oligonucléotides permet l'incorporation d'un site de restriction Pstl, d'un site de restriction BspMI et d'un codon ATG initiateur en 5'de l'insert.
La synthèse du premier brin d'ADNc se fait par élongation de l'oligonucléotide FC120, après hybridation de ce dernier à la matrice d'ARN.
Les conditions de synthèse du premier brin d'ADNc sont une température de 42 C pendant 15 min, puis de 99 C pendant 5 min, et enfin de 4 C pendant 5 min.
Les conditions de la réaction PCR en présence du cou pie d'oligonucléotides FC116 et FC120 sont une température de 95 C pendant 2 min, puis 40 cycles (95 C pendant 30 sec, puis 50 C pendant 45 sec, et 72 C pendant 3 min), et enfin 72 C pendant 7 min pour produire un fragment de 265 pb.
Ce fragment est digéré par l'enzyme de restriction Pstl puis par l'enzyme de restriction BspMI pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Pstl-BspMI d'environ 240 pb. Ce fragment est nommé fragment C.
Une deuxième réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction RT-PCR ) est réalisée avec 50 ut de la suspension d'ARN viral de FIV (exemple 6) et avec les oligonucléotides suivants :
PB672 (48 mer) (SEQ ID NO : 13)
5'TTTACTGGAAGAAGGAAATGCAGGTAAAAGGAAAAGACAAAGAAGAAG
3' et PB673 (36 mer) (SEQ ID NO : 14)
5' TTTAGATCTTTAGTCCATAAGCATTCTTTCTATTTC 3'.
PB672 (48 mer) (SEQ ID NO : 13)
5'TTTACTGGAAGAAGGAAATGCAGGTAAAAGGAAAAGACAAAGAAGAAG
3' et PB673 (36 mer) (SEQ ID NO : 14)
5' TTTAGATCTTTAGTCCATAAGCATTCTTTCTATTTC 3'.
Ce couple d'oligonucléotides permet l'incorporation d'un site de restriction BspMI, d'un site de restriction Bglll et d'un codon stop en 3'de l'insert.
La synthèse du premier brin d'ADNc se fait par élongation de l'oligonucléotide PB673, après hybridation de ce dernier à la matrice d'ARN.
Les conditions de synthèse du premier brin d'ADNc sont une température de 420C pendant 15 min, puis de 99 C pendant 5 min, et enfin de 4 C pendant 5 min.
Les conditions de la réaction PCR en présence du couple d'oligonucléotides PB672 et PB673 sont une température de 950C pendant 2 min, puis 40 cycles (95 C
<Desc/Clms Page number 20>
pendant 30 sec, puis 50 C pendant 45 sec, et 72 C pendant 3 min), et enfin 720C pendant 7 min pour produire un fragment de 246 pb.
Ce fragment est digéré par l'enzyme de restriction BspMI puis par l'enzyme de restriction Bglll pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment BspMI-BgIII d'environ 230 pb. Ce fragment est nommé fragment D.
Les fragments C et D sont ligaturés avec le plasmide d'expression pVR1012 préalablement digéré par les enzymes de restriction Pstl et Bglll, pour donner le plasmide pPB375 (5316 pb). Ce plasmide contient, sous le contrôle du promoteur précoce hCMV-IE un insert codant pour la protéine rev de FIV.
Exemple 10 : Construction du plasmide pPB383
L'ADN complémentaire (ADNc) de FIV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
L'ADN complémentaire (ADNc) de FIV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
Une réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction RT-PCR ) est réalisée avec 50 pI de la suspension d'ARN viral de FIV (exemple 6) et avec les oligonucléotides suivants :
PB680 (29 mer) (SEQ ID NO : 15) 5'TTTCTGCAGATGGAAGACATAATAGTATT 3', et PB681 (32 mer) (SEQ ID NO : 16) 5'TTTAGATCTCTAAGCAGTAGTTATTGATAATG 3'.
PB680 (29 mer) (SEQ ID NO : 15) 5'TTTCTGCAGATGGAAGACATAATAGTATT 3', et PB681 (32 mer) (SEQ ID NO : 16) 5'TTTAGATCTCTAAGCAGTAGTTATTGATAATG 3'.
Ce couple d'oligonucléotides permet l'incorporation d'un site de restriction Bglll, d'un site de restriction Pstl, d'un codon ATG initiateur en 5'et d'un codon stop en 3'de l'insert.
La synthèse du premier brin d'ADNc se fait par élongation de l'oligonucléotide PB681, après hybridation de ce dernier à la matrice d'ARN.
Les conditions de synthèse du premier brin d'ADNc sont une température de 420C pendant 15 min, puis de 99 C pendant 5 min, et enfin de 4 C pendant 5 min. Les conditions de la réaction PCR en présence du couple d'oligonucléotides PB680 et PB681 sont une température de 950C pendant 2 min, puis 40 cycles (95 C pendant 30 sec, puis 50 C pendant 45 sec, et 72 C pendant 1 min), et enfin 72 C
<Desc/Clms Page number 21>
pendant 7 min pour produire un fragment de 254 pb.
Ce fragment est digéré par l'enzyme de restriction Pstl puis par l'enzyme de restriction Bglll pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Pstl- Bgill d'environ 240 pb. Ce fragment est ligaturé avec le plasmide d'expression pVR1012 préalablement digéré par Pstl et Bglll, pour donner le plasmide pPB383 (5089 pb). Ce plasmide contient, sous le contrôle du promoteur précoce hCMV-IE, un insert codant pour la protéine tat de FIV.
Exemple 11 : Extraction de l'ARN viral de FeLV
Des virus FeLV de type A (souche Glasgow-1) (Stewart M. et a/., J. Virol., 1986,58, 825-834) ont été purifiés selon les techniques bien connues de l'homme du métier. L'ARN viral génomique de chaque virus a été ensuite isolé en utilisant la technique d'extraction thiocyanate de guanidium/phénolchloroforme décrite par P. Chomczynski et N. Sacchi (Anal. Biochem., 1987,162, 156-159).
Des virus FeLV de type A (souche Glasgow-1) (Stewart M. et a/., J. Virol., 1986,58, 825-834) ont été purifiés selon les techniques bien connues de l'homme du métier. L'ARN viral génomique de chaque virus a été ensuite isolé en utilisant la technique d'extraction thiocyanate de guanidium/phénolchloroforme décrite par P. Chomczynski et N. Sacchi (Anal. Biochem., 1987,162, 156-159).
Exemple 12 : Construction du plasmide pPB179
L'ADN complémentaire (ADNc) de FeLV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat# N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
L'ADN complémentaire (ADNc) de FeLV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat# N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
Une réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction RT-PCR ) est réalisée avec 50 pLI de la suspension d'ARN viral de FeLV (exemple 11) et avec les oligonucléotides suivants :
PB247 (29 mer) (SEQ ID NO : 17) 5'TTTGTCGACCATGGAAAGTCCAACGCACC 3', et PB249 (28 mer) (SEQ ID NO : 18)
5'TTTGGATCCTCATGGTCGGTCCGGATCG 3'.
PB247 (29 mer) (SEQ ID NO : 17) 5'TTTGTCGACCATGGAAAGTCCAACGCACC 3', et PB249 (28 mer) (SEQ ID NO : 18)
5'TTTGGATCCTCATGGTCGGTCCGGATCG 3'.
Ce couple d'oligonucléotides permet l'incorporation d'un site de restriction Sail, d'un site de restriction BamHI, d'un codon ATG initiateur en 5'et d'un codon stop en 3'de l'insert.
La synthèse du premier brin d'ADNc se fait par élongation de l'oligonucléotide PB249, après hybridation de ce dernier à la matrice d'ARN.
<Desc/Clms Page number 22>
Les conditions de synthèse du premier brin d'ADNc sont une température de 42 C pendant 15 min, puis de 99 C pendant 5 min, et enfin de 4 C pendant 5 min.
Les conditions de la réaction PCR en présence du couple d'oligonucléotides PB247 et PB249 sont une température de 950C pendant 2 min, puis 40 cycles (95 C pendant 30 sec, puis 50 C pendant 45 sec, et 720C pendant 1 min), et enfin 72 C pendant 7 min pour produire un fragment de 1947 pb.
Ce fragment est digéré par l'enzyme de restriction Sali puis par l'enzyme de restriction BamHI pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Sall-BamHI d'environ 1935 pb. Ce fragment est ligaturé avec le plasmide d'expression pVR1012 préalablement digéré par Sali et BamHI, pour donner le plasmide pPB179 (6804 pb). Ce plasmide contient, sous le contrôle du promoteur précoce hCMV-IE, un insert codant pour la protéine env de FeLV-A.
Exemple 13 : Construction du plasmide pPB181
L'ADN complémentaire (ADNc) de FeLV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
L'ADN complémentaire (ADNc) de FeLV est synthétisé avec le kit Gene Amp RNA PCR Kit (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en utilisant les conditions données par le fournisseur.
Une réaction de transcription inverse, suivie d'une réaction d'amplification en chaîne (Réaction RT-PCR ) est réalisée avec 50 jj. ! de la suspension d'ARN viral de FeLV (exemple 11) et avec les oligonucléotides suivants :
PB283 (33 mer) (SEQ ID NO : 19)
5'TTGTCGACATGTCTGGAGCCTCTAGTGGGACAG 3', et PB284 (40 mer) (SEQ ID NO : 20) 5'TTGGATCCTTATTTAATTACTGCAGTTCCAAGGAACTCTC 3'.
PB283 (33 mer) (SEQ ID NO : 19)
5'TTGTCGACATGTCTGGAGCCTCTAGTGGGACAG 3', et PB284 (40 mer) (SEQ ID NO : 20) 5'TTGGATCCTTATTTAATTACTGCAGTTCCAAGGAACTCTC 3'.
Ce couple d'oligonucléotides permet l'incorporation d'un site de restriction Sall, d'un site de restriction BamHI, d'un codon ATG initiateur en 5'et d'un codon stop en 3'de l'insert.
La synthèse du premier brin d'ADNc se fait par élongation de l'oligonucléotide PB284, après hybridation de ce dernier à la matrice d'ARN.
Les conditions de synthèse du premier brin d'ADNc sont une température de 42 C pendant 15 min, puis de 99 C pendant 5 min, et enfin de 4 C pendant 5 min.
<Desc/Clms Page number 23>
Les conditions de la réaction PCR en présence du couple d'oligonucléotides PB283 et PB284 sont une température de 95 C pendant 2 min, puis 40 cycles (95 C pendant 30 sec, puis 50 C pendant 45 sec, et 72 C pendant 1 min), et enfin 72 C pendant 7 min pour produire un fragment de 3049 pb.
Ce fragment est digéré par l'enzyme de restriction Sali puis par l'enzyme de restriction BamHi pour isoler, après électrophorèse en gel d'agarose, le fragment Sali-BamHI d'environ 3039 pb. Ce fragment est ligaturé avec le plasmide d'expression pVR1012 préalablement digéré par Sali et BamHI, pour donner le plasmide pPB181 (7908 pb). Ce plasmide contient, sous le contrôle du promoteur précoce hCMV-IE, un insert codant pour la protéine gag/pro de FeLV-A.
Exemple 14 : Préparation des plasmides
Pour la préparation des plasmides destinés à la vaccination des chats, on peut utiliser toute technique permettant d'obtenir une suspension de plasmides purifiés. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. La production des plasmides se fait par culture de bactéries Escherichia coli K12 transformées avec les plasmides selon l'invention. On peut citer en particulier la technique de lyse alcaline suivie de deux ultracentrifugations successives sur gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium telle que décrite dans Sambrook J. et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. NY. 1989). On peut se référer également aux demandes de brevet WO-A-95/21250 et WO-A-96/02658 qui décrivent des méthodes pour produire à l'échelle industrielle des plasmides utilisables pour la vaccination. Pour les besoins de la fabrication des vaccins, les plasmides sont resuspendus de manière à obtenir des solutions à haute concentration ( > 2 mg/ml) compatibles avec le stockage. Pour ce faire, les plasmides sont resuspendus soit en eau ultrapure, soit en tampon TE (Tris-HCI 10 mM ; EDTA 1 mM ; pH 8.0).
Pour la préparation des plasmides destinés à la vaccination des chats, on peut utiliser toute technique permettant d'obtenir une suspension de plasmides purifiés. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. La production des plasmides se fait par culture de bactéries Escherichia coli K12 transformées avec les plasmides selon l'invention. On peut citer en particulier la technique de lyse alcaline suivie de deux ultracentrifugations successives sur gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthidium telle que décrite dans Sambrook J. et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. NY. 1989). On peut se référer également aux demandes de brevet WO-A-95/21250 et WO-A-96/02658 qui décrivent des méthodes pour produire à l'échelle industrielle des plasmides utilisables pour la vaccination. Pour les besoins de la fabrication des vaccins, les plasmides sont resuspendus de manière à obtenir des solutions à haute concentration ( > 2 mg/ml) compatibles avec le stockage. Pour ce faire, les plasmides sont resuspendus soit en eau ultrapure, soit en tampon TE (Tris-HCI 10 mM ; EDTA 1 mM ; pH 8.0).
Exemple 15 : Fabrication des vaccins et administration
Le stock de plasmide pPB477 est dilué en tampon TE, en eau physiologique ou en tampon PBS, et mélangé à divers plasmides vaccinaux exprimant des
Le stock de plasmide pPB477 est dilué en tampon TE, en eau physiologique ou en tampon PBS, et mélangé à divers plasmides vaccinaux exprimant des
<Desc/Clms Page number 24>
immunogènes, en particulier pPB371 (exemple 7) et/ou pPB374 (exemple 8) et/ou pPB375 (exemple 9) et/ou pPB383 (exemple 10) et/ou pPB179 (exemple 12) et/ou pPB181 (exemple 13). Ces plasmides peuvent également être, par exemple, ceux cités dans les exemples de WO-A-98/03660 et WO-A-00/77043.
Les différents mélanges de plasmides immunogènes et du plasmide pPB477 ainsi obtenus sont co-administrés à chaque chat par voie intramusculaire.
Dans ce cas, les doses vaccinales sont injectées sous un volume de 1 ml.
Exemple 16 : Formulation des plasmides
Le mélange de plasmides immunogènes et du plasmide pPB477 (exemple 15) est dilué en tampon TE, en eau physiologique ou en tampon PBS de façon à obtenir une concentration de 1 mg/ml. Une solution de DMRIE-DOPE à 0,75mM est préparée par reprise d'un Iyophilisat de DMRIE-DOPE par un volume adapté d'H20 stérile.
Le mélange de plasmides immunogènes et du plasmide pPB477 (exemple 15) est dilué en tampon TE, en eau physiologique ou en tampon PBS de façon à obtenir une concentration de 1 mg/ml. Une solution de DMRIE-DOPE à 0,75mM est préparée par reprise d'un Iyophilisat de DMRIE-DOPE par un volume adapté d'H20 stérile.
La formation des complexes ADN plasmidique-lipide est réalisée par dilution à parties égales de la solution de DMRIE-DOPE 0,75 mM par la solution d'ADN à 1 mg/ml. La solution d'ADN est introduite progressivement à l'aide d'une aiguille sertie 26G le long de la paroi du flacon contenant la solution de lipide cationique de façon à éviter la formation de mousse. On procède à une agitation douce dès que les deux solutions ont été mélangées. On obtient en final une composition comprenant 0,375 mM de DMRIE-DOPE et 500 g/mt d'ADN.
Il est souhaitable que l'ensemble des solutions utilisées soit à température ambiante pour l'ensemble des opérations décrites ci-dessus. On laisse la complexation ADN/DMRIE-DOPE se mettre en place à température ambiante pendant 30 minutes avant de procéder à l'immunisation des animaux comme cela est décrit dans l'exemple 15.
Il doit être bien compris que l'invention définie par les revendications annexées n'est pas limitée aux modes de réalisation particuliers indiqués dans la description ci-dessus, mais englobe les variantes qui ne sortent ni du cadre ni de l'esprit de la présente invention.
Claims (25)
1. Polynucléotide isolé comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1.
2. Polynucléotide isolé codant pour la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 2 ou 3.
3. Polynucléotide isolé ayant la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1.
4. Polypeptide IGF-1 félin isolé.
5. Polypeptide IGF-1 félin isolé ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 2 ou 3.
6. Vecteur d'expression in vitro comprenant un polynucléotide selon la revendication 1,2 ou 3.
7. Vecteur d'expression in vivo comprenant un polynucléotide selon la revendication 1,2 ou 3.
8. Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide.
9. Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que le vecteur est un vecteur viral.
10. Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que le vecteur viral est choisi dans le groupe consistant en poxvirus, adénovirus et herpèsvirus.
11. Vecteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que le poxvirus est choisi dans le groupe consistant en virus de la vaccine, canarypox, fowlpox, swinepox et raccoonpox.
12. Vecteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que le vecteur est
FHV.
13. Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce que le vecteur est un canarypox.
14. Composition destinée à induire chez un membre de l'espèce féline, notamment un chat, une réponse immunitaire contre un pathogène félin, cette composition comprenant une protéine IGF-1 de préférence IGF-1 félin ou un vecteur recombinant exprimant in vivo cet IGF-1, et au moins un immunogène de pathogène félin ou un vecteur recombinant exprimant in vivo cet immunogène et un excipient
<Desc/Clms Page number 26>
ou véhicule acceptable sur le plan vétérinaire.
15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que le pathogène félin est FIV et/ou FeLV.
16. Composition selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle comprend un plasmide exprimant l'IGF-1.
17. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce qu'elle comprend un plasmide exprimant l'immunogène de pathogène félin.
18. Composition selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur viral, de préférence poxvirus, adénovirus ou herpèsvirus, exprimant l'IGF-1.
19. Composition selon la revendication 14, ~15 ou 18, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur viral, de préférence poxvirus, adénovirus ou herpèsvirus, exprimant l'immunogène de pathogène félin.
20. Composition selon la revendication 18 ou J 9, caractérisée en ce que le vecteur viral est choisi parmi virus de la vaccine, canarypox, fowlpox, swinepox, raccoonpox et FHV.
21. Composition selon la revendication 14 ou 15, dans laquelle l'immunogène est choisi dans le groupe consistant en immunogène inactivé, immunogène vivant atténué et sous-unités.
22. Composition selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine IGF-1.
23. Composition selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur d'expression in vivo selon l'une des revendications 7 à 13.
24. Composition selon l'une quelconque des revendications 14 à 23, caractérisée en ce qu'elle comprend un immunogène de FPV, de FIPV, de FHV, de
FCV, du virus de la rage et/ou de Chlamydia, ou un vecteur exprimant un tel immunogène.
25. Composition stimulante de l'immunité comprenant un vecteur recombinant, de préférence plasmide ou vecteur viral, exprimant IGF-1 in vivo et un véhicule ou excipient acceptable au plan vétérinaire.
Priority Applications (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0111736A FR2829498B1 (fr) | 2001-09-11 | 2001-09-11 | Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins |
PCT/IB2002/003638 WO2003022886A1 (fr) | 2001-09-11 | 2002-09-10 | Igf-1 utilise comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins |
JP2003526958A JP2005516587A (ja) | 2001-09-11 | 2002-09-10 | 特にネコレトロウイスルに対する、ネコワクチンアジュバントとしてのigf−1 |
DE60238773T DE60238773D1 (de) | 2001-09-11 | 2002-09-10 | Igf-1 als impfstoffhilfsmittel für katzen, insbesondere gegen feline retroviren |
AT02755576T ATE493146T1 (de) | 2001-09-11 | 2002-09-10 | Igf-1 als impfstoffhilfsmittel für katzen, insbesondere gegen feline retroviren |
CA2459769A CA2459769C (fr) | 2001-09-11 | 2002-09-10 | Igf-1 utilise comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins |
US10/238,114 US7326417B2 (en) | 2001-09-11 | 2002-09-10 | IGF-1 as feline vaccine adjuvant, in particular against feline retroviruses |
EP02755576A EP1425305B1 (fr) | 2001-09-11 | 2002-09-10 | Igf-1 utilise comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins |
US11/963,085 US20080181912A1 (en) | 2001-09-11 | 2007-12-21 | Igf-1 as feline vaccine adjuvant, in particular against feline retroviruses |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0111736A FR2829498B1 (fr) | 2001-09-11 | 2001-09-11 | Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FR2829498A1 true FR2829498A1 (fr) | 2003-03-14 |
FR2829498B1 FR2829498B1 (fr) | 2003-11-28 |
Family
ID=8867163
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FR0111736A Expired - Lifetime FR2829498B1 (fr) | 2001-09-11 | 2001-09-11 | Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1425305B1 (fr) |
JP (1) | JP2005516587A (fr) |
AT (1) | ATE493146T1 (fr) |
CA (1) | CA2459769C (fr) |
DE (1) | DE60238773D1 (fr) |
FR (1) | FR2829498B1 (fr) |
WO (1) | WO2003022886A1 (fr) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111848785A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-10-30 | 青岛博隆基因工程有限公司 | 猫疱疹病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7468273B2 (en) | 2003-05-01 | 2008-12-23 | Meial Limited | Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use |
EP2813281B1 (fr) | 2004-01-07 | 2016-08-17 | Pall Technology UK limited | Récipient pour le traitement biologique |
US7771995B2 (en) | 2005-11-14 | 2010-08-10 | Merial Limited | Plasmid encoding human BMP-7 |
EP2186823A1 (fr) | 2005-11-14 | 2010-05-19 | Merial Limited | Thérapie génique pour traiter l'insuffisance rénale |
ES2760004T3 (es) | 2008-05-08 | 2020-05-12 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vacuna contra Leishmania utilizando un inmunnógeno salival de mosca de la arena |
BR112014001287B1 (pt) | 2011-07-20 | 2020-12-08 | Centre National De La Recherche Scientifique | vacina recombinante do vírus da leucemia felina contendo gene otimizado do envelope do vírus da leucemia felina |
WO2013142371A1 (fr) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Merial Limited | Vaccin contre l'herpèsvirus équin 1 recombinant contenant une glycoprotéine c mutée et utilisations associées |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1986000619A1 (fr) * | 1984-07-13 | 1986-01-30 | Chiron Corporation | Facteurs de croissance prepro i et ii analogues a l'insuline |
EP0229750A2 (fr) * | 1986-01-07 | 1987-07-22 | Washington University | Facteur de croissance humain I analogue à la pre-pro insuline |
US5202119A (en) * | 1991-06-28 | 1993-04-13 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response |
WO1995016703A1 (fr) * | 1993-12-15 | 1995-06-22 | Thomas Jefferson University | Analogues de l'igf-1 |
US5473054A (en) * | 1992-05-08 | 1995-12-05 | Thomas Jefferson University | IGF-1 analogs |
WO1997033997A1 (fr) * | 1996-03-11 | 1997-09-18 | University College London | Procede de traitement de pathologies musculaires |
WO1998024922A1 (fr) * | 1996-12-02 | 1998-06-11 | Valentis, Inc. | Systeme d'expression du facteur de croissance insulinoide i (igf-i) et ses methodes d'utilisation |
WO2001036483A1 (fr) * | 1999-11-15 | 2001-05-25 | University College London | Utilisation de l'isoforme du facteur de croissance insulinoide i (mgf) dans le traitement de troubles neurologiques |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2751223B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-12-04 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique felin |
-
2001
- 2001-09-11 FR FR0111736A patent/FR2829498B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-09-10 EP EP02755576A patent/EP1425305B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-10 AT AT02755576T patent/ATE493146T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-09-10 DE DE60238773T patent/DE60238773D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-10 JP JP2003526958A patent/JP2005516587A/ja active Pending
- 2002-09-10 CA CA2459769A patent/CA2459769C/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-10 WO PCT/IB2002/003638 patent/WO2003022886A1/fr active Application Filing
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1986000619A1 (fr) * | 1984-07-13 | 1986-01-30 | Chiron Corporation | Facteurs de croissance prepro i et ii analogues a l'insuline |
EP0229750A2 (fr) * | 1986-01-07 | 1987-07-22 | Washington University | Facteur de croissance humain I analogue à la pre-pro insuline |
US5202119A (en) * | 1991-06-28 | 1993-04-13 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response |
US5473054A (en) * | 1992-05-08 | 1995-12-05 | Thomas Jefferson University | IGF-1 analogs |
WO1995016703A1 (fr) * | 1993-12-15 | 1995-06-22 | Thomas Jefferson University | Analogues de l'igf-1 |
WO1997033997A1 (fr) * | 1996-03-11 | 1997-09-18 | University College London | Procede de traitement de pathologies musculaires |
WO1998024922A1 (fr) * | 1996-12-02 | 1998-06-11 | Valentis, Inc. | Systeme d'expression du facteur de croissance insulinoide i (igf-i) et ses methodes d'utilisation |
WO2001036483A1 (fr) * | 1999-11-15 | 2001-05-25 | University College London | Utilisation de l'isoforme du facteur de croissance insulinoide i (mgf) dans le traitement de troubles neurologiques |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111848785A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-10-30 | 青岛博隆基因工程有限公司 | 猫疱疹病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子 |
CN111848785B (zh) * | 2020-07-10 | 2022-09-06 | 青岛博隆基因工程有限公司 | 猫疱疹病毒抗体序列、四肽链分子、免疫球蛋白分子 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2459769A1 (fr) | 2003-03-20 |
JP2005516587A (ja) | 2005-06-09 |
WO2003022886A1 (fr) | 2003-03-20 |
EP1425305A1 (fr) | 2004-06-09 |
CA2459769C (fr) | 2013-05-28 |
EP1425305B1 (fr) | 2010-12-29 |
FR2829498B1 (fr) | 2003-11-28 |
ATE493146T1 (de) | 2011-01-15 |
DE60238773D1 (de) | 2011-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2605629C (fr) | Vaccins contre le virus nipah | |
CA2570156C (fr) | Administration sans aiguille d'un vaccin contre le felv | |
EP2979705B1 (fr) | Vaccin contre le virus de la fièvre du nil | |
EP1185655B1 (fr) | Gm-csf equin | |
FR2829498A1 (fr) | Igf-1 comme adjuvant de vaccin felin, notamment contre les retrovirus felins | |
JP2017052774A (ja) | 最適化ネコ白血病ウイルスエンベロープ遺伝子を含む組換えネコ白血病ウイルスワクチン | |
US20030096417A1 (en) | Vaccination against feline immunodeficiency virus | |
EP1418941B9 (fr) | Induction de reponse immunitaire contre le virus de l'immunodeficience feline | |
US7326417B2 (en) | IGF-1 as feline vaccine adjuvant, in particular against feline retroviruses | |
AU2008201425A1 (en) | Vaccination against the feline immunodeficiency virus | |
NZ620566B2 (en) | Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene | |
FR2796396A1 (fr) | Gene de calicivirus felin et vaccin recombine les incorporant |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 15 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 16 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 17 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 18 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 19 |
|
PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 20 |