FR2826736A1

FR2826736A1 - Dispositif a balayage optique confocal

Info

Publication number: FR2826736A1
Application number: FR0108516A
Authority: FR
Inventors: Vincent Lauer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2001-06-28
Publication date: 2003-01-03

Abstract

L'invention concerne un dispositif de balayage optique confocal dans lequel le faisceau FX est réfléchi une première fois par les miroirs galvanométriques 1104, 1105, dans lequel le faisceau FE1 provenant de l'échantillon est à nouveau réfléchi par les miroirs galvanométriques puis est réfléchi par un point réfléchissant 1203, et dans lequel le faisceau FE2 réfléchi par le point 1203 est à nouveau réfléchi par les miroirs galvanométriques et parvient au plan image dans lequel est placé le capteur 1206. Applications : microscopie 3D et 2D rapide, en biologie et étude des matériaux.

Description

Dispositif à balaYage optique confocal Domaine technique
L'invention concerne un dispositif à balayage optique confocal utilisé par exemple dans un microscope confocal rapide, plus particulièrement un microscope confocal en fluorescence destiné à fonctionner en temps réel.

Technique antérieure.

Le principe du microscope confocal à balayage est d'éclairer l'échantillon avec un faisceau lumineux focalisé sur un point, et de ne détecter que la lumière provenant en retour de ce point. Le microscope confocal comporte donc un faisceau d'éclairage éventuellement filtré par un trou microscopique, et l'onde provenant de l'objet éclairé traverse elle-même un trou microscopique sélectionnant la lumière provenant du point éclairé. L'onde provenant de l'objet est ensuite détectée.

Pour générer une image de l'objet, il est nécessaire de déplaçer le point éclairé dans un plan. Ce balayage peut être réalisé de diverses manières : i)-en déplaçant l'échantillon observé par rapport à l'objectif. C'est la méthode la plus simple mais elle est excessivement lente. ii)-en réalisant les trous microscopiques sur un disque traversé dans un sens par la lumière d'éclairage et dans l'autre sens par la lumière provenant de l'objet. Lorsque le disque est en rotation rapide dans le plan image, les trous microscopiques se déplaçent et l'échantillon est scanné. C'est la technique du disque de Nipkow. Le disque étant perçé de nombreux trous, cette technique de balayage est très rapide. La détection peut se faire directeent sur une caméra, et il est également possible d'observer l'image directement à l'oeil nu. Par contre, 95% de la puissance lumineuse disponible est perdue, ce qui limite l'efficacité de cette technique lorsque les échantillons sont faiblement fluorescents. La société Zeiss propose toutefois un tel microscope (le CARV) pour l'observation d'échantillons fluorescents. iii)-en utilisant des miroirs galvanmétriques pour défléchir le faisceau. L'échantillon est alors scanné point par point et un seul trou microscopique est utilisé. Un tube photomultiplicateur permet la détection des photons ayant traversé ce trou. Cette technique est la plus utilisée en microscopie confocale en fluorescence car il y a peu de perte d'énergie lumineuse. Par contre la vitesse d'imagerie est limitée par la saturation de la fluorescence et/ou la fréquence d'oscillation des miroirs galvanométrique. L'image ne peut pas être observée directement et doit nécessairement être reconstituée informatiquement à partir des données acquises par le tube photomultiplicateur. La reconstitution d'un plan horizontal de l'échantillon nécessite de connaître exactement la position des miroirs galvanométriques correspondant au signal échantillonné à chaque instant sur le photorécepteur. Le bon fonctionnement du système nécessite un contrôle très précis des miroirs galvanométriques et une synchronisation parfaite entre le mouvement des miroirs galvanométriques et l'échantillonnage du signal provenant du photorécepteur.

Pour améliorer la vitesse d'imagerie, il a été conçu un microscope à disque de Nipkow comprenant un disque collecteur constitué d'un réseau de microlentilles, et solidaire du disque portant les trous microscopiques. Chaque microlentille est placée en face d'un trou microscopique et focalise sur ce trou la lumière provenant du faisceau d'éclairage. Cette technique est décrite par exemple dans le brevet américains numéro 5,162, 941 de l'université de Wayne, ainsi que dans le brevet américain numéro 5,579, 157 de la société Yokogawa Electric Corporation. Le microscope correspondant est commercialisé sous le nom "Ultraview"par Perkin-Elmer. Cette technique permet d'éviter la perte de puissance lumineuse résultant de l'utilisation d'un disque de Nipkow, tout en conservant la vitesse d'imagerie élevée inhérente aux systèmes à disque de Nipkow.

La technique utilisée par Yokogawa Electric Corp. pose de difficiles problèmes de réalisation mécanique et d'alignement et elle est coûteuse à mettre en oeuvre. Le disque portant les trous microscopiques et le disque collecteur doivent être alignés l'un par rapport à l'autre avec une grande précision. L'ensemble constitué par ces deux disques doit être en rotation rapide autour d'un axe qui doit être parfaitement fixe, parfaitement orthogonal au plan des disques, et parfaitement orthogonal au à la direction de propagation de la lumière incidente. En pratique, il est extrêmement difficile de maintenir fixe la position de l'axe, et ceci se traduit par des défauts de l'image, typiquement des petites lignes claires ou fonçées se superposant à l'image. Le brevet américain numéro 5,579, 157 de Yokogawa décrit une solution permettant d'atténuer ce type de défauts, toutefois cette solution est peu efficace. D'autres problèmes d'alignement existent, décrits par exemple par le brevet américain numéro 5,717, 519 de Yokogawa Electric Corp.

Dans le système de Yokogawa Electric Corp. ou dans le CARV de Zeiss, une partie de l'onde d'éclairage se réfléchit sur la plaque portant les trous microscopiques et se dirige ensuite vers le capteur CCD. Cette onde étant très intense par rapport à l'onde correspondant à la fluorescence, elle est difficile à éliminer à l'aide de filtres dichroïques, ce qui entraîne une atténuation importante du faisceau.

Dans le système de Yokogawa Electric Corp. ou dans le CARV de Zeiss, les mêmes trous microscopiques sont traversés successivement par le faisceau d'éclairage dirigé vers l'échantillon, et par le faisceau provenant de l'échantillon. Si le diamètre de ces trous est réduit, la perte d'intensité du faisceau qui en résulte est très supérieure à celle qui résulte de la seule diminution du diamètre du trou microscopique dans un microscope confocal à balayage laser par miroirs galvanométriques. Pour que l'intensité reste raisonnablement élevée, les trous microcopiques doivent avoir un diamètre proche de largeur de la tache d'Airy. Ceci cause une forte diminution de la résolution par rapport au microscope confocal à balayage laser par miroirs galvanométriques, dans lequel la résolution peut être augmentée en diminuant le diamètre du trou microscopique.

Dans le système de Yokogawa Electric Corp. ou dans le CARV de Zeiss, l'image d'un trou microscopique sur la caméra CCD, lorsque cette image s'est déplaçé d'une longueur égale à la moitié de la largeur de la tache d'Airy, recouvre assez largement la même image avant déplacement. De ce fait la résolution est limitée uniquement par la longueur d'onde d'émission fluorescente, et la limite de résolution

est supérieure à ce qu'elle est dans un microscope confocal à balayage par miroirs galvanométriques, dans lequel la faible longueur d'onde d'excitation est mise à profit.

Une autre solution pour améliorer la vitesse d'imagerie est décrite par le brevet américain numéro 5,351, 152 de la société Zeiss. Le système décrit dans ce brevet comporte un réseau fixe de microlentilles qui sépare le faisceau laser en sous-faisceaux qui sont chacun filtré par un trou microscopique situé dans un plan image. L'objectif focalise dans l'objet les faisceaux issus de chacun de ces trous microscopiques. Le faisceau réémis par l'objet est ensuite redirigé vers un capteur CCD, chaque pixel du capteur CCD étant l'image d'un point de l'objet sur lequel est focalisé le faisceau issu d'un trou microscopique correspondant.

Le balayage est effectué par la méthode (i) consistant à déplacer l'échantillon par rapport à l'objectif, bien que d'autres méthodes ne soient pas expressément exclues. Le point de l'échantillon qui est éclairé par un des sous-faisceaux et dont l'image est obtenue sur un point correspondant du capteur CCD balaye une zone réduite de l'échantillon. L'image de l'échantillon doit être reconstituée informatiquement à partir d'une série d'images obtenues successivement sur le capteur CCD pendant l'opération de balayage de l'échantillon. La vitesse de balayage de ce microscope est donc limitée par la vitesse de lecture du capteur CCD, qui doit être relu plusieurs fois pour l'obtention d'une seule image.

D'une manière générale, la déconvolution 3D de l'image, qui peut sensiblement améliorer la résolution, est difficile à l'aide des microscopes confocaux existants. Dans les appareils à balayage par miroirs galvanométriques, elle est rendue difficile par les erreurs d'échantillonnage. Dans les appareils à disque de Nipkow, elle est rendue difficile par les inhomogénéités spatiales de l'éclairage.

Description de l'invention
L'invention a pour objet un dispositif de balayage optique confocal à l'aide duquel les défauts précédemment indiqués des microscopes confocaux à balayage par miroirs galvanométriques ou par disque de Nipkow avec ou sans collecteur sont résolus. En particulier, l'invention permet l'observation directe de l'image et l'acquisition de l'image à l'aide d'un capteur CCD, et simplifie les problèmes de synchronisation et d'alignement. Ceci est compatible, dans la présente invention, avec un balayage point par point du type utilisé par les microscopes à balayage par miroirs galvanométriques. L'invention permet également l'observation de l'image en temps réel, à une vitesse égale ou supérieure à celle atteinte par les microscopes à disque de Nipkow avec collecteur, mais sans les difficultés d'alignement et de réalisation mécanique liées à l'utilisation de ces appareils, à un coût très diminué, et avec une résolution améliorée par l'abscence de réflexion sur les parties non transparentes de l'ensemble portant les trous microscopiques.

Dans un microscope confocal à balayage par miroirs galvanométriques du type usuel, il est possible d'observer directement à l'aide d'un oculaire le plan image ou le faisceau réfléchi par l'objet parvient directement. Toutefois, l'image ainsi observée n'est pas une image confocale car elle n'a pas été filtrée par le trou microscopique, et seule l'image acquise par échantillonnage du signal traversant le trou microscopique est véritablement confocale. Pour obtenir optiquement une image confocale il est nécessaire d'utiliser un moyen équivalent au filtrage par le trou microscopique. Toutefois, si le trou microscopique ou équivalent est fixe, l'image formée derrière ce trou ne constitue pas directement une image de l'objet : on est ramené au

système décrit dans le brevet américain numéro 5,239, 178 de Zeiss. Si le trou microscopique ou équivalent est mobile, on est ramené au système à disque de Nipkow avec ou sans collecteur, et à ses défauts connus.

Selon une version de l'invention, ces problèmes sont résolus par un dispositif de balayage optique confocal comprenant : - un déflecteur de faisceau A, qui défléchit le faisceau d'éclairage qu'il parvienne à l'échantillon observé, - un déflecteur de faisceau B, qui défléchit le faisceau provenant de l'échantillon observé, caractérisé par le fait qu'il comprend un déflecteur de faisceau C, qui défléchit, d'un angle proportionnel à l'angle de déflection par ledit déflecteur B, le faisceau provenant de l'échantillon observé et ayant été défléchi par ledit déflecteur de faisceau B.

La déflexion par les déflecteurs A et B est la technique utilisée usuellement dans les microscopes confocaux à balayage laser. Les déflecteurs peuvent typiquement être des miroirs galvanométriques, ou des déflecteurs accousto-optique comme dans le microscope commercialisé par la société Noran Instruments. La déflexion sur le déflecteur A permet de déplacer dans l'objet chaque point éclairé. La déflexion sur le déflecteur B permet de ramener à un point fixe d'un plan image PB l'onde issue d'un point éclairé, de manière à pouvoir par exemple filtrer cette onde par un trou microscopique. Usuellement l'onde est ensuite détectée et l'image confocale est reconstruite par ordinateur. L'image formée dans le plan PB est mobile au sens ou l'image d'un point fixe de l'objet se déplace dans ce plan. Or pour détecter cette image avec une caméra ou pour l'observer directement il serait nécessaire qu'elle soit fixe. L'invention consiste à utiliser un déflecteur C qui a pour rôle de déplacer cette image de manière à compenser son mouvemement dû au déflecteur B, et à la rendre fixe par rapport à l'échantillon. Les déflecteurs n'étant pas plaçés dans des plans image, la déflection se traduit essentiellement par des modification de direction du faisceau à la sortie des déflecteurs, qui entraînent elles-mêmes des déplacements du point image dans le plan image.

La commande du déflecteur C pour compenser l'action du déflecteur B est, dans le cas général, difficile. La solution la plus simple est d'utiliser comme déflecteurs des miroirs mobiles ou des couples de miroirs mobiles vérifiant les conditions suivantes : - chaque miroir mobile dudit déflecteur B est confondu avec un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A, ou est solidaire d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A, - chaque miroir mobile dudit déflecteur C est confondu avec un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A, ou est solidaire d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A,
En effet, dans ce cas, et moyennant la réalisation d'un système optique correctement dimensionné, le mouvement des miroirs du déflecteur C peut compenser automatiquement celui des miroirs du déflecteur B, de sorte qu'après déflection par B et C la direction du faisceau issu d'un point fixe de l'objet soit effectivement constante. La compensation ne nécessite alors aucune précaution particulière dans la commande des déflecteurs. Elle nécessite au plus un ajustement des systèmes optiques. La conception d'un trajet optique approprié est facilitée si les miroirs sont dans des zones afocales, ou l'onde issue d'un point observé de l'objet est plane.

Le dispositif de balayage comprend de préférence au moins un trou microscopique de détection ou au moins un point réfléchissant microscopique traversé par ledit faisceau provenant de l'échantillon observé

et ayant été défléchi par le déflecteur B, avant que ce faisceau ne soit défléchi à nouveau par ledit déflecteur C. Ceci permet, comme dans un microscope confocal classique, de filtrer l'onde dans un plan ou l'image d'un point éclairé est fixe, c'est-à-dire ne se déplace pas lorsque le point éclairé se déplace dans l'échantillon observé. L'utilisation d'un trou microscopique constitue la solution la plus classique. Le rôle d'un point réfléchissant est similaire à celui d'un trou microscopique, le faisceau formant l'image étant alors le faisceau réfléchi au lieu du faisceau traversant le trou.

Le dispositif de balayage comprend de préférence un moyen pour focaliser en un ou plusieurs points d'un plan image l'onde provenant de l'échantillon observé et ayant été défléchie par lesdits déflecteurs B et C. Cette focalisation permet de former effectivement une image à partir de l'onde dont les déviations ont été compensées.

Le dispositif de balayage comprend de préférence plusieurs trous microscopiques de détection ou points réfléchissants de détection, et un moyen pour diviser le faisceau lumineux d'éclairage en plusieurs sous-faisceaux focalisé chacun en un point différent de l'échantillon observé. Chacun desdits trous microscopiques est de préférence l'image d'un point de l'objet sur lequel un desdits sous-faisceaux est focalisé. Ceci permet de scanner plusieurs points en parallèle, ce qui améliore la rapidité du système et la rend comparable à celle d'un microscope à disque de Nipkow.

Dans le cas ou le dispositif de balayage comprend plusieurs trous microscopiques ou points réfléchissants, le déflecteur C doit de préférence compenser exactement l'action du déflecteur B de sorte que la direction d'un faisceau provenant d'un point fixe de l'objet soit, après déflection par lesdits déflecteurs B et C, indépendante de la direction de ce faisceau après passage dudit déflecteur B. En effet, dans le cas contraire, un point du plan image serait susceptible d'être éclairé successivement par des faisceaux venant de points différents de l'objet et traversant des trous microscopiques différents.

L'acquisition des images confocales sur une caméra entraîne, dans le cas ou la longueur d'onde d'excitation est notablement inférieure à la longueur d'onde d'émission fluorescente, une perte de résolution par rapport à l'acquisition sur un capteur ponctuel. Ceci est le cas par exemple du microscope confocal à disque de Nipkow, dont la résolution est inférieure à celle du microscope confocal à balayage laser. Ceci est dû au fait que l'image d'un trou microscopique sur la caméra CCD, lorsque cette image s'est déplaçé d'une longueur égale à la moitié de la largeur de la tache d'Airy, recouvre assez largement la même image avant déplacement. Selon une version de l'invention, il est possible de résoudre ce problème en diminuant la taille des trous microscopiques de manière à atténuer le phénomène de recouvrement, toutefois cette solution entraîne une baisse de l'intensité lumineuse utile. Afin d'éviter cette perte d'intensité lumineuse, et selon une version de l'invention, chacun desdits trous microscopiques est associé à une lentille convergente placée avant ce trou sur le chemin de l'onde provenant de l'objet observé, et focalisant sur ce trou le faisceau issu d'un point correspondant de l'objet. Cette lentille permet de diminuer la largeur de la tache d'Airy et donc d'utiliser un trou de plus petit diamètre sans perte d'intensité.

Lorsqu'un éclairage laser est utilisé, le dispositif de balayage comprend de préférence un moyen pour faire varier la phase de chaque sous-faisceau. En effet, dans ce cas, les ondes constituant chaque sousfaisceau sont corrélées entre elles, ce qui est susceptible de créer dans l'objet des interférences pouvant

perturber l'image. La corrélation entre sous-faisceau doit donc de préférence être rompue, ce qui peut se faire en modifiant indépendamment, au cours du temps, la phase de chaque sous-faisceau. Le moyen pour faire varier la phase de chaque sous-faisceau est par exemple une vitre transparente portant des surépaisseurs et tournant autour d'un axe.

Un avantage important du présent dispositif de balayage est qu'il permet l'obtention d'un éclairage homogène dans l'ensemble de l'échantillon, ou du moins dont la périodicité spatiale est un sous-multiple de la distance d'échantillonnage. De plus il ne génère pas d'erreurs d'échantillonnage. Ceci le rend particulièrement bien adapté à l'utilisation d'algorithmes de déconvolution, qui permettent une amélioration de la qualité et de la résolution de l'image.

Description rapide des figures.

La figure 1 représente le mode de réalisation préféré, utilisant un éclairage laser multipoints et un réseaux de trous microscopiques. La figure 2 représente un second mode de réalisation, utilisant un éclairage incohérent multipoints et un réseau de trous microscopiques. La figure 3 représente l'image sur un capteur d'un réseau de trous microscopiques utilisé dans le mode préféré de réalisation, et la trajectoire d'un point de cette image. Les figures 4 à 6 illustrent la commande appliquée à un atténuateur de faisceau en fonction de la position et de la vitesse de déplacement de l'image sur la caméra d'un trou microscopique. La figure 7 représente un cube intégrant deux réseaux de trous microscopiques et un miroir dichroïque, simplifiant le second mode de réalisation. La figure 8 représente l'image sur un capteur d'un réseau de trous microscopiques utilisé dans le second mode de réalisation, et la trajectoire d'un point sur cette image, un seul miroir galvanométrique étant utilisé. La figure 9 représente un réseau de lentilles et un réseau de trous microscopiques utilisés pour l'éclairage de l'échantillon. La figure 10 représente un réseau de lentilles et un réseau de trous microscopiques utilisés pour détecter l'onde provenant de l'échantillon. La figure 11 représente en vue de coté un ensemble de miroirs également visibles sur la figure 1. La figure 12 représente une version simplifiée du premier mode de réalisation. La figure 13 représente un cinquième mode de réalisation, utilisant un éclairage incohérent et un réseau de points réfléchissants microscopiques. La figure 14 représente un réseau de trous microscopiques utilisé dans le premier mode de réalisation. La figure 15 représente un réseau de points réfléchissants utilisés dans le cinquième mode de réalisation. La figure 16 représente une version simplifiée du second mode de réalisation. La figure 17 représente une version améliorée du cinquième mode de réalisation. La figure 18 représente une version à deux miroirs galvanométriques du cinquième mode de réalisation. La figure 19 représente un troisième mode de réalisation, utilisant un balayage point par point et un point réfléchissant microscopique. Ce troisième mode de réalisation, représenté par la figure 19, est le mieux adapté à une compréhension immédiate du principe de fonctionnement. La figure 20 représente un quatrième mode de réalisation, utilisant un balayage point par point et un trou microscopique.

Mode de réalisation préféré.

Ce mode de réalisation est représenté par la figure 1. Il constitue le mode de réalisation le plus performant en termes de qualité d'image et de rapidité. En effet : - on utilise un éclairage laser multipoints, ce qui permet, en particulier sur des zones de petites dimensions, d'utiliser un éclairage intense sans saturer l'échantillon.

- on utilise des réseaux de trous microscopiques, qui filtrent parfaitement bien le faisceau et limitent les difficultés liées à d'éventuelles réflexions parasites.

Le faisceau issu d'un laser 100 traverse un atténuateur de faisceau 140 qui peut par exemple être électro-optique ou accousto-optique. Il traverse ensuite un élargisseur de faisceau comportant par exemple les lentilles 101 et 102. Le faisceau traverse ensuite un réseau de microlentilles 103.

On a représenté en traits pleins le sous-faisceau issu d'une de ces microlentilles et en pointillés le sous-faisceau issu d'une autre microlentille. On a indiqué par des flèches les directions du faisceau d'excitation FX et du faisceau réémis par l'objet fluorescent FE.

Le faiceau issu du réseau de microlentilles traverse une vitre 106 mobile en rotation autour d'un axe 107, puis une lentille optionnelle 135 qui peut ne pas être utilisée, puis un réseau de trous microscopiques 105. Le réseau de trous microscopiques 105 peut être constitué par dépôt d'une couche réfléchissante sur une vitre transparente par une méthode de type"litographique", les trous étant alors des interruptions de la couche réfléchissante. Dans ce cas un filtre neutre plaçé en sortie du laser peut être utilisé pour atténuer les effets de retour de la lumière laser. Le réseau de trous microscopiques peut également être constitué d'une plaque métallique dépolie dans laquelle les trous sont percés au moyen d'un laser. Cette solution évite les problèmes de retour du faisceau laser. La partie du faisceau qui traverse une microlentille du réseau 103 constitue un sous-faisceau focalisé sur un trou microscopique du réseau 105. La surface de la vitre 106 est divisée en un ensemble de sous-surfaces, par exemple les sous-surfaces 120 et 121. La moitié de ces soussurfaces portent une surépaisseur générant un décalage de phase de 180 degrés du faisceau laser les traversant. Les sous-surfaces portant des surépaisseurs sont réparties de manière pseudo-aléatoire dans l'ensemble des sous-surfaces. Chaque sous-surface est approximativement carrée. La largeur du coté du carré est égale à la distance entre deux trous microscopiques adjacents du réseau 105. La vitre 106 est positionnée de manière à ce que chaque trou microscopique du réseau 105 soit placé au-dessous d'une soussurface distincte. La rotation rapide de la vitre 106 permet de générer des décalages de phase pseudoaléatoires de l'ensemble des sous-faisceaux, de sorte que la cohérence spatiale du faisceau soit rompue après traversée de la vitre 106. En effet la cohérence entre faisceaux est susceptible de perturber légèrement l'image. La vitre 106 est toutefois peu utile si les trous microscopiques du réseau 105 sont suffisamment espacés, auquel cas elle peut être supprimée. Le faisceau ayant traversé la vitre 106 et le réseau de trous microscopiques 105 traverse ensuite le miroir dichroïque 104 et la lentille de tube 108 puis est réfléchi par un miroir 109. Il est ensuite réfléchi par un miroir galvanométrique 110 mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, par un miroir 111, et par un miroir galvanométrique 112 mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Il traverse l'objectif de microscope 113 et parvient à l'échantillon 114. L'objectif 113 est un objectif formant à l'infini une image de l'échantillon observé. Le réseau de trous microscopiques 105 est dans le plan image (plan ou se forme une image stigmatique de

l'objet observé). Le réseau de trous microscopiques 105 n'est pas absolument indispensable. Il est utile surtout pour rendre le faisceau plus"propre"dans le cas ou le réseau de microlentilles 103 est de qualité moyenne. Si le réseau de microlentilles 103 est de très bonne qualité, une meilleure qualité d'image peut être obtenue en supprimant le réseau de trous microscopiques 105.

De préférence, le plan focal image de l'objectif 113 est dans le plan focal objet (dans le sens objectif vers lentille 108) de la lentille 108 et le réseau de trous 105 est dans un plan focal de la lentille 108. Ceci permet de maximiser l'ouverture utile de chaque sous-faisceau. Dans ce cas la lentille 135 n'est pas utile.

L'échantillon éclairé émet en retour un faisceau lumineux non cohérent. Ce faisceau traverse l'objectif 113, est réfléchi par le miroir galvanométrique 112, le miroir 111, le miroir galvanométrique 110, le miroir 109. Il traverse la lentille de tube 108, est réfléchi par le miroir dichroïque 104, puis traverse le réseau de microlentilles 131 et le réseau de trous microscopiques 130. Le pas (distance entre les centres de deux trous adjacents) du réseau de trous microscopiques 130 est identique au pas du réseau 105. Le diamètre d'un trou microscopique du réseau 130 peut être égal ou inférieur au diamètre d'un trou microscopique du réseau 105. A chaque trou microscopique du réseau 130 correspond une microlentille du réseau de microlentilles 131. Les réseaux 131 et 130 sont positionnés de sorte que chaque trou du réseau 130 soit l'image d'un point de l'objet sur lequel est focalisé le faisceau d'éclairage issu d'un trou du réseau 105. Ceci signifie que chaque trous microscopique du réseau 130 est dans un plan image, par une microlentille correspondante, du plan focal de la lentille de tube 108. Le faisceau est ensuite réfléchi par le miroir 115. Il est ensuite réfléchi successivement par les miroirs 143,144, 145,146, 147 constituant l'ensemble 142 représenté par un bloc sur la figure 1, qui sont montrés sur la figure 11 en vue suivant la direction V indiquée sur la figure 1. L'ensemble 142 sert à inverser l'angle du faisceau par rapport à un plan contenant l'axe optique et situé dans le plan de la figure l. La direction P indiquée sur la figure 11 montre la direction d'observation suivant laquelle est réalisée la figure 1. Le faisceau traverse ensuite la lentille 116 identique à la lentille de tube 108, et dont le plan focal objet est sur le réseau de trous microscopiques 130. Il est réfléchi par la seconde face du miroir galvanométrique 110, par le miroir 117, par la seconde face du miroir galvanométrique 112. Il traverse le filtre monochromateur 141. Il traverse ensuite la lentille 118 qui forme dans son plan focal image l'image du réseau 105, et donc de l'échantillon observé. Il parvient au plan focal image de la lentille 118. Un capteur CCD 119 peut être placé dans ce plan, toutefois il est également possible d'observer directement l'image formée dans ce plan, à l'aide d'un oculaire. La distance focale de la lentille 116 doit être exactement égale à la distance focale de la lentille 108, et pour permettre un ajustement précis la lentille 116 peut être remplaçée par un doublet de lentilles, le réglage de la distance interlentilles permettant un ajustement de la distance focale de l'ensemble.

Les réseaux de trous microscopiques 130 et 131 sont par exemple du type représenté schématiquement sur la figure 14. Ils peuvent être réalisés par litographie sur une vitre en verre, un dépôt métallique aussi absorbant que possible constituant la couche absorbante.

La figure 9 montre le principe de la focalisation du faisceau laser sur le réseau de trous microscopiques 105, par le réseau de microlentilles 103. L'angle a indiqué sur cette figure vaut

F 0 ; = oMV. La largeur d'un trou microscopique du réseau 105 est par exemple égale à la largeur de la F108 tache d'Airy soit L105 = 1, 22ou F ; 08 est la distance focale de la lentille 108, Test la ouv FU3

distance focale de l'objectif 113, ouv est l'ouverture numérique de l'objectif 113, Z,,, est la longueur d'onde du laser. La distance D entre deux trous microscopiques adjacents est de préférence au moins 10 fois la largeur de chaque trou. Les microlentilles du réseau 103 sont des microlentilles sphériques limitées par des carrés et adjacentes les unes aux autres. La largeur de chaque microlentille (coté du carré la limitant ou distance entre les centres de deux microlentilles adjacentes) est égale à la distance D entre deux trous microscopiques adjacents. La distance focale F de chaque microlentille du réseau de microlentilles 103

D F D F108 1 et sa largeur D sont en outre liés par la relation = a = ouv 113, soit F103 = 2F103 F108 2 Fl13 ouv

Par exemple on peut avoir : F =2mm 113 ouv = 1, 25 F, 08 = 200 mm D = 2 mm Alas = 488 nm (laser argon) F = 80 mm L105 == 47/an Si la largeur des trous microscopiques du réseau 105 est égale au diamètre de la tache d'Airy,

soit 1, 22-as ---, il n'y a pas de perte d'énergie mais le faisceau n'est pas gaussien, ce qui se traduit par OMV/ une diminution de la résolution. Un faisceau approximativement gaussien peut être obtenu en diminuant le 1 7 diamètre du trou microscopique, par exemple à 1, 22-----. Toutefois ceci entraîne une diminution 20uv FI 13

de l'intensité utile. La meilleure solution pour obtenir un faisceau gaussien sans perdre inutilement de l'intensité utile est de ne pas utiliser le réseau de trous microscopiques, dont le rôle est surtout de pallier aux imperfections du réseau de microlentilles. Dans ce cas le faisceau est parfaitement gaussien, ce qui assure une résolution maximale. Cette solution nécessite toutefois des microlentilles de bonne qualité.

La figure 10 montre le principe de fonctionnement des microlentilles du réseau 131 et des trous microscopiques du réseau 130. L'angle a indiqué sur cette figure vaut, comme sur la figure

. n n 9, a = OuV--. On a représenté le plan focal 132 de la lentille 108. En l'abscence du réseau de FI08

micro lentilles 131, le réseau de trous microscopiques 130 devrait être plaçé dans ce plan, et l'angle de

divergence du faisceau après passage des trous microscopiques, dans la mesure ou ces trous sont suffisamment larges, serait a. Le réseau de lentilles 131 a pour utilité d'augmenter cet angle de divergence, ce qui équivaut à diminuer le diamètre des tache d'Airy formées sur chaque trou du réseau de trous microscopiques 130. Cect permet de diminuer le diamètre des trous microscopiques du réseau 130 sans perte d'intensité lumineuse, ce qui permet ensuite une réception sur un capteur CCD sans que la résolution soit diminuée par la superposition des taches d'Airy obtenues pour des points proches. L'angle de divergence du faisceau après passage des trous microscopiques devient, compte tenu des microlentilles du réseau 131, ss = ma avec typiquement m = 1, 5 à m = 4. Les distances d2 entre le réseau de microlentilles 131 et le réseau de trous microscopiques 130, dl entre le réseau de microlentilles 131 et le plan focal 132 de la lentille 108, et la distance focale F131 des microlentilles du réseau 131, sont liées par l'équation des lentilles minces (qui peut éventuellement être modifiée pour prendre en compte l'épaisseur des lentilles) :

1 1 1 d2 dl F131

et on a par ailleurs, compte tenu du coefficient m recherché :

dol - lem d2

De plus pour des raisons d'encombrement on a : D = 2da avec c > 1. Typiquement on peut prendre c = 2.

F Compte tenu également de l'expression de l'angle < x = OM---, on obtient finalement : F108 dl = D F108 F, jDJ F 1 d 2cJOMV 2c FI 13 Ouv F131 = 1 dl 1 d2 = -dl m

La largeur des trous microscopiques sur le réseau 130 peut être égale au diamètre de la tache d'Airy sur ces trous soit :

LBO = 1, 22 Â flua F108 m Ouv FI 13 130-1, 22-----OMV-F

ou Âfluo est la longueru d'onde correspondant au maximum de l'émission fluorescente.

En reprenant l'exemple de dimensionnement utilisé plus haut pour les réseaux 103 et 105 on obtient, pour c = 2 et m = 4, et pour luo = 518 nm (fluorescéine) :

=2 mm 113 ouv = 1,25 F, = 200 mm D = 2 mm

F, 03 = 80 mm dl = 40 mm Fl31 = 13,33 mm d2 = 10 mm L130 = 12 ym
On peut améliorer la résolution en utilisant des trous microscopiques dont le diamètre est la moitié du diamètre de la tache d'Airy, ou encore inférieur, soit : L130=6 m
Pour une résolution maximale, avec des trous microscopiques dont le diamètre est suffisamment inférieur à la tache d'Airy, et pour permettre dans des conditions optimales une déconvolution ultérieure de

l'image confocale le pas-n d'échantillonnage sur la capteur CCD (distance entre les centres de deux pixels adjacents) doit vérifier :

1 F118 À lasÀ flua 119--,-----,---.-- 40Mn3 +0 À s + Afluo plig = 4ouv. FI 13 Â las + Â fluo soit F118 = 4ouvi9Fn3---,-lA fluo

Par exemple avec Pl 19 = 12, um et toujours dans le même exemple de dimensionnement on obtient : FI 18 = 477 mm Pour une résolution maximale mais sans déconvolution ultérieure de l'image confocale on peut se contenter

4 Â las + Â fluo. de : FUS = ouvPU9FU3 SOIt Fus = 168 mm 22 /Mo

Avec des trous microscopiques dont le diamètre est d'une tache d'airy on peut se contenter de :

4 +MO 4 =-/-OMVPii9i3---.--Fus = ouvPu9FU3 1 À 2 Alasllfluo

Il est donc être utile de pouvoir modifier la distance focale de la lentille 118, ou de la remplacer par un système avec zoom ou par un système de grossissement variable avec des éléments optiques interchangeables.

Le réseau de microlentilles 131 est surtout utile lorsque la longueur d'onde d'excitation est très inférieure à la longueur d'onde de l'émission fluorescente et lorsque le diamètre des trous microscopiques est

de l'ordre d'une tache d'Airy. Si le diamètre des trous microscopiques est très inférieur à une tache d'Airy ou si la longueur d'onde d'excitation est proche de la longueur d'onde de l'émission fluorescente, le réseau de microlentilles 131 peut être supprimé sans grandes conséquences. Dans ce cas le réseau de trous microscopiques 130 est plaçé directement dans le plan focal image de la lentille 108.

Une difficulté pratique est liée au fait que des objectifs de différents grossissements ont des plans

focaux image distincts. Par conséquence, le plan focal objet de la lentille 108 (dans le sens de l'objectif vers la lentille 108) ne peut être confondu avec le plan focal image de l'objectif que pour un des objectifs utilisés.

Il est possible de pallier à cette difficulté en augmentant l'ouverture des sous-faisceaux issus de chaque microlentille, ce qui diminue l'intensité lumineuse disponible. La lentille 135 permet de pallier à cette difficulté sans qu'il y ait perte d'intensité lumineuse. Elle doit être dimensionnée de manière à ce qu'une onde plane dans l'objet ait pour image une onde plane entre la lentille 135 et le réseau de microlentilles 103.

Les miroirs galvanométriques 110 et 112 sont commandés de manière à déplacer l'image du réseau 130 sur le capteur 119, de la manière indiquée sur la figure 3. La figure 3 montre l'image du réseau 130 sur le capteur 119, pour une position de référence des miroirs galvanométriques. Le trait 301 superposé au dessin montre la trajectoire suivie par l'image d'un point 300 du réseau lorsque les miroirs galvanométriques sont commandés. Cette trajectoire est parcourue alternativement dans les deux sens. Lorsque cette trajectoire est suivie, l'image d'un trou du réseau 130 balaye une petite partie du plan image, et l'ensemble des images des trous du réseau balaye l'ensemble du plan image. Une image confocale est donc générée dans l'ensemble du plan image. Le contour 302 montre la limite de la zone utile, dans laquelle une image confocale de bonne qualité est générée. De nombreuses variantes de la trajectoire parcourue peuvent être utilisées, la contrainte essentielle étant que l'ensemble des points images des trous du réseau 130 balaye l'ensemble du plan image.

L'atténuateur de faisceau 140 doit être commandé en fonction de la position des miroirs galvanométriques et de leur vitesse. Ces paramètres peuvent être obtenus de manière connue par un feedback à partir des galvanomètres, ou peuvent être obtenus sans feedback à partir du système de commande des galvanomètres, avec une précision moindre. On note Ilas l'intensité du faisceau laser après traversée de l'atténuateur, et Vscan la vitesse de balayage, c'est-à-dire la vitesse de déplacement dans le plan image 119 et suivant l'axe x du point image d'un trou microscopique du réseau 130. Cette vitesse de

balayage est dûe uniquement au miroir galvanométrique le plus rapide. La position des miroirs galvanométriques peut être caractérisée par la position du point image dans le plan image 119. Les figures 5

lias et 6 illustrent la valeur du rapport - en fonction de la position du point image d'un trou Vscan

microscopique sur l'échantillon. La figure 5 représente un ensemble de points images des trous microscopiques, dont le point 300 également représenté sur la figure 4, pour la position de référence des miroirs galvanométriques. Sur cette figure on a représenté en traits continus les arêtes de la surface

lias représentant la fonction - en fonction des coordonnées x, y du point 300 dans le plan image 119.

Vscan

Sur la figure 6, on a représenté l'allure de cette fonction le long de la ligne 310 de la figure 5. Une valeur

constante de sur l'ensemble de la trajectoire, c'est-à-dire une commande de l'atténuateur en fonction Vscan

de la seule vitesse de balayage, permettrait en principe de supprimer les variations d'éclairage dûes aux variations de la vitesse de balayage. Toutefois, la courbe de la figure 6 permet également d'atténuer les effets d'une variation incontrôlée de l'amplitude d'oscillation des miroirs, au prix toutefois d'une perte d'intensité lumineuse. Il est également possible de faire fonctionner l'atténuateur de faisceau en mode binaire. La commande de l'intensité se fait alors conformément à la figure 7. Seule la partie centrale de la trajectoire, sur laquelle la vitesse est à peu près constante, est utilisée. Enfin, il est également possible de ne pas utiliser d'atténuateur de faisceau. L'image reste de qualité acceptable mais peut être affectée par des variations locales de l'intensité, qui peuvent être compensées par un traitement numérique ultérieur. D'une manière

générale, plus le nombre de trous microscopiques est élevé et plus la surface de la trajectoire de l'image d'un i point du réseau 130 dans le plan image 119 est élevée, moins les variations d'intensité d'éclairage sont notables. L'utilisation d'un réseau suffisamment dense de trous microscopiques peut donc remplacer avantageusement l'usage d'un atténuateur de faisceau.

A chaque objectif correspond un dimensionnement optimal des trous microscopiques utilisés, des microlentilles et de la lentille 135. On peut concevoir ces éléments de manière à ce qu'ils conviennent à l'ensemble des objectifs, toutefois les propriétés du système seront sous-optimales avec certains objectifs. Il est également possible de concevoir une série d'objectifs étudiés pour donner les meilleurs résultats avec un dimensionnement donné du reste du système. Toutefois, il est préférable de pouvoir échanger les trous microscopiques utilisés, les microlentilles et la lentille 135, de manière à pouvoir les optimiser en fonction des objectifs utilisés, des longueurs d'ondes d'excitation et de fluorescence, du niveau de fluorescence, de la vitesse d'acquisition souhaitée, de la résolution souhaitée. A cette fin, les réseaux de microlentilles 103 et 131, les réseaux de trous microscopiques 105 et 130, le miroir dichroïque 104, et la lentille 135, peuvent être rendus solidaires entre eux et constituer un bloc échangeable d'une seule pièce. Ceci évite à l'utilisateur d'avoir à régler l'alignement des différents éléments : les problèmes d'alignement sont réglés à la fabrication du bloc. Le positionnement du bloc dans le reste du système doit simplement se faire avec une précision angulaire suffisante (de l'ordre de 1 miliradian).

Le présent mode de réalisation peut être combiné avec tous les modes d'imagerie connus en microscopie confocale. En particulier, le porte-objet peut être muni d'un système de déplacement vertical piézoélectrique ou par moteur pas à pas, de manière à pouvoir générer des images tridimensionnelles en modifiant le plan de focalisation. Des systèmes à base d'atténuateurs accousto-optiques peuvent être utilisés pour commuter plusieurs lasers et exciter des fluorophores différents, de manière à générer par superposition des images plus riches en information. Le système est également compatible avec l'utilisation de la méthode à deux photons, le nombre de trous microscopiques devant alors être ajusté pour qu'une intensité suffisante reste disponible sur chaque point de focalisation du faisceau. Des roues de filtres (filtre 141) peuvent être utilisées pour modifier longueurs d'ondes détectées. Le miroir dichroïque 104 peut être remplaçé par un miroir semi-transparent de manière à pouvoir changer de longueurs d'onde d'excitation et de fluorescence en commutant un laser et en changeant de filtre 141, sans avoir à échanger le miroir

dichroïque 104. Le remplacement du miroir dichroïque 104 par un miroir semi-transparent permet également d'utiliser l'appareil pour observer en réflexion des échantillons diffractifs non fluorescents.

Ainsi qu'il a été indiqué plus haut, un certain nombre d'éléments de la figure 1 sont facultatifs. La figure 12 représente une version simplifiée du système de la figure 10, dans lequel on a supprimé des éléments dont l'abscence ne dégrade pas sensiblement la qualité de l'image. Le disque tournant (106,107) a été supprimé, ce qui a peu d'effet dans la mesure ou les points éclairés dans l'objet sont suffisamment éloignés les uns des autres. La lentille 135 a été supprimée, ce qui a peu d'effet dans la mesure ou les miroirs galvanométriques et le plan focal objet de la lentille 108 sont à proximité immédiate du plan focal image de l'objectif 113. Le réseau de trous microscopiques 105 a été supprimé, ce qui est acceptable si la qualité optique des microlentilles est suffisante. Le réseau de microlentilles 131 a été supprimé, ce qui a peu d'effet dans la mesure ou les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission sont peu différentes l'une de l'autre. Du fait de l'abscence du réseau de microlentilles 131, les trous microscopiques du réseau 130 doivent être plus larges et peuvent typiquement avoir le diamètre utilisé sur des microscopes à disque de Nipkow, soit environ 30 microns.

Il est possible, au moyen de lentilles relais, de modifier le dispositif de manière à ce que l'ensemble du système de balayage soit plaçé en arrière d'un plan image intermédiaire. Une telle solution peut être utile pour réaliser un dispositif de balayage adaptable à tout type de microscope.

Il est bien entendu possible de n'utiliser qu'un seul trou microscopique, auquel cas les caractéristiques de vitesse sont celles d'un microscope confocal à balayage par miroirs galvanométriques du type courant. Toutefois, l'avantage du système reste de pouvoir visualiser directement l'image et de pouvoir l'enregistrer sur une caméra. Les modes de réalisation 3 et 4 illustrent plus en détail des réalisations avec un seul trou microscopique ou équivalent.

Il peut être utile d'équiper l'appareil d'un dispositif de positionnement de l'échantillon 114 dans le sens de l'axe optique. En effet, ceci permet d'obtenir des images tridimensionnelles constituées de séries d'images bidimensionnelles obtenues chacune à une profondeur différente. L'image tridimensionnelle obtenue peut ensuite faire l'objet d'une déconvolution 3D qui en améliore la résolution. Préalablement à la déconvolution, la PSF ("point spread function"en anglais, ou réponse impulsionnelle 3D) doit être mesurée, par exemple sur une microbille fluorescente.

Second mode de réalisation :
Le second mode de réalisation diffère du premier par le fait qu'un éclairage non cohérent est utilisé.

Ceci limite la vitesse d'imagerie mais permet l'utilisation d'un éclairage moins coûteux et dont la longueur d'onde peut être aisément ajustée. Il est représenté sur la figure 2.

L'éclairage est fourni par exemple par l'arc incandescent 150 d'une lampe à vapeur de mercure. Il traverse un collecteur 151, un diaphragme de champ 152, un filtre monochromateur 153 sélectionnant la longueur d'onde d'excitation de la fluorescence. Il traverse la lentille 154, le diaphragme d'ouverture 155, la lentille 156, et parvient directement au réseau de trous microscopiques 105. L'ensemble constitué des

éléments 150 à 156 constitue un éclairage de Köhler et peut être remplacé par tout autre système d'éclairage de Köhler. Le reste du système est identique au mode de réalisation précédent.

Une grande partie de l'intensité lumineuse disponible est réfléchie par le réseau de trous microscopiques 105, ce qui limite la clarté de l'image formée dans le plan 119. Afin que le temps d'acquisition et la clarté de l'image restent dans des limites raisonnables, il est préférable d'utiliser un réseau 105 constitué de trous microscopiques très rapprochés les uns des autres. Alors que dans le mode de réalisation précédent, la distance entre deux trous microscopiques peut typiquement être d'environ 20 fois la largeur de chaque trou, dans le présent mode de réalisation il est préférable de limiter cette distance, qui peut par exemple être de 2 à 4 fois la largeur du trou microscopique. Ceci génère des perturbations à basse fréquence spatiale sur l'image, mais les fréquences spatiales élevées, qui sont le plus porteuses d'information, continuent de bénéficier de l'effet confocal.

Comme dans le mode de réalisation précédent, il est possible de supprimer le réseau de microlentilles 131. En particulier, pour permettre l'échange des deux réseaux de trous microscopiques sans que cet échange nécessite de réglage complexe, et pour diminuer le coût de fabrication, le réseau de lentilles 131 peut être supprimé et les réseaux de trous microscopiques 105,130 et le miroir dichroïque 104 peuvent être intégrés en un seul élément aisément réalisable, représenté sur la figure 7. Le miroir dichroïque 400 est intégré à un cube transparent 401. Des vitres 402,403 sont montées sur les cotés du cube, dont elles sont solidarisées par des pièces adaptées, par exemple 404. Des espaces vides 405,406 sont laissés entre les vitres et le cube 401. Le coté des vitres 402,404 qui regarde vers le cube est recouvert d'une couche mince métallique et d'une couche mince de résine photosensible. Les trous microscopiques sont réalisés par insolation de la résine photosensible à l'aide d'un projecteur en lumière blanche. On a représenté symboliquement en pointillés l'allure du faisceau lumineux issu de ce projecteur. Le projecteur est focalisé par exemple sur le plan constitué par la face de la vitre 402 qui porte les couches minces. Chaque point éclairé de la vitre 402 deviendra un trou microscopique. Du fait de la configuration du système, les points de la vitre 403 qui sont éclairés sont correctement plaçés sans qu'un réglage supplémentaire soit nécessaire, et deviendront les trous microscopiques correspondant aux trous de la vitre 402. Après insolation, un liquide approprié est introduit dans les espaces vides 405,406 de manière à enlever la résine aux endroits insolés, puis un acide est utilisé pour enlever le métal en ces mêmes points. On a alors obtenu les trous microscopiques. Un solvant peut être utilisé pour enlever la couche résiduelle de résine, et l'ensemble peut finalement être nettoyé. Enfin, il peut être utile d'introduire un liquide optique ou un plastique transparent dans l'espace vide, de préférence de même indice que les lames 402,403. Ceci évite les réflexions inutiles sur les surfaces de contact. Si un matériau de même indice que les lames 402,403 est introduit dans les espaces vides, alors on peut utiliser pour réaliser l'ensemble des vitres 402,403 dépolies sur leur face qui regarde vers le cube. Ceci permet une meilleure dispersion de la lumière incidente par les parties réfléchissantes. Les monochromateurs 153 et 141 peuvent également être intégrés à ce cube, ce qui permet de modifier le mode d'imagerie par échange d'un seul composant.

Une autre solution simplifiant l'échange des réseaux de trous microscopiques consiste à n'utiliser qu'un seul réseau de trous, qui est traversé dans un sens par le faisceau d'éclairage FX et dans l'autre sens

par le faisceau FE émis par fluorescence depuis l'échantillon observé. Dans ce cas le système est modifié comme indiqué sur la figure 16 : un seul réseau de trous microscopiques 105 est utilisé, mais le miroir dichroïque 104 est plaçé entre la lentille 156 et le réseau de trous microscopiques 105. Le réseau de microlentilles 131 est également supprimé et le dimensionnement mécanique est modifié pour tenir compte du remplacement du réseau 130 par le réseau 105. Cette configuration est particulièrement simplifiée, toutefois cette simplification a pour conséquence la présence d'une forte intensité de lumière résultant de la réflexion partielle du faisceau d'éclairage FX par le réseau de trous 105 ("stray light"), qui doit être éliminée par le miroir dichroïque 104 et le filtre 141.

Dans cette configuration, il est également possible de supprimer un des miroirs galvanométriques 110 ou 112, à condition de modifier légèrement l'axe de rotation du miroir restant. La figure 8, réalisée suivant les mêmes conventions que la figure 3, montre la trajectoire 500 de l'image d'un trou microscopique 503 dans le plan 119, ainsi que la zone 502 dans laquelle une image de bonne qualité est obtenue, la position des images des trous microscopiques dans la position de référence étant telle qu'indiquée sur la figure, limitée par le contour 501. Du fait que les trous microscopiques sont nombreux et proches les uns des autres, une trajectoire légèrement oblique permet de balayer l'ensemble du plan sans avoir recours à un deuxième miroir galvanométrique.

De même, il est possible d'utiliser les deux miroirs galvanométriques commandés en quadrature de sorte que la trajectoire de l'image d'un point 504 se déplace sur un cercle 505. Si les trous microscopiques sont suffisamment nombreux et proches les uns des autres l'ensemble du plan est balayé. L'avantage de cette solution est que le mouvement du point éclairé est à vitesse constante, ce qui garantit une bonne homogénéité de l'éclairage. Cette solution peut être transformée en un balayage bidimensionnel si le diamètre du cercle est progressivement augmenté, ce qui équivaut à ce que l'image d'un trou microscopique dans le plan 119 se déplace suivant une trajectoire en spirale.

Ce second mode de réalisation a l'avantage d'être moins coûteux que le premier dans la mesure ou il ne nécessite pas un faisceau laser. Il a également l'avantage de permettre une modification aisée des longeurs d'onde d'excitation et d'émission de la fluorescence dans l'ensemble du domaine visible et UV. Par contre, la faiblesse de l'éclairage permet difficilement l'imagerie en temps réel.

Ce second mode de réalisation peut être combiné avec le premier dans un même appareil, des obturateurs pouvant être utilisés pour passer d'un mode d'éclairage à un autre.

Troisième mode de réalisation :
Ce troisième mode de réalisation est un mode de réalisation simplifié utilisant un éclairage laser monopoint, dans lequel le trou microscopique est remplaçé par un point réfléchissant microscopique, et dans lequel une seule face des miroirs galvanométriques est utilisée. Du fait de sa simplicité, ce mode de réalisation se prête bien à une compréhension intuitive du fonctionnement.

La figure 18 montre un microscope confocal en fluorescence à balayage laser selon ce troisième mode de réalisation de l'invention. Sur cette figure on a indiqué en traits fins un faisceau passant par un point de l'objet et on a indiqué par des flèches les directions des différents faisceaux.

Un faisceau d'excitation FX issu d'un laser 1100 traverse un élargisseur de faisceau ou collimateur formé des lentilles 1101, 1102 puis est réfléchi par le miroir dichroïque 1103 qui réfléchit la longueur d'onde du laser 1100 et laisse passer la longueur d'onde réémise par fluorescence. Le faisceau FX est alors réfléchi sur le miroir galvanométrique 1104 mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, puis sur le miroir galvanométrique 1105 mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Il traverse ensuite le séparateur de faisceau polarisant 1204 puis l'objectif de microscope 1106. Il est focalisé par l'objectif en un point de l'échantillon fluorescent 1107. Le faisceau FEI réénùs par fluorescence à partir de ce point est collecté par l'objectif 1106, traverse le séparateur de faisceau polarisant 1204, est réfléchi successivement par les deux miroirs galvanométriques 1105 et 1104, traverse le miroir dichroïque 1103, et est focalisé par la lentille 1108 sur un point réfléchissant 1203 situé sur la face arrière d'une lame quart d'onde 1202. La partie du faisceau qui passe à coté du point réfléchissant parvient ensuite à une cavité absorbante. Le point réfléchissant peut par exemple être réalisé par litographie optique.

La partie du faisceau FEI qui est réfléchie par le point 1203 sera notée FE2. Ce faisceau FE2 retraverse la lame quart d'onde 1202, la lentille 1108, le miroir dichroïque 1103, est réfléchi par les miroirs galvanométriques 1104,1105, est réfléchi par le séparateur de faisceau polarisant 1204, puis est focalisé par la lentille 1205 dans le plan d'un capteur CCD 1206 fixé sur la caméra 1207.

La polarisation du laser 1100 est choisie pour que l'onde issue de ce laser traverse le séparateur de faisceau 1204. La lame quart d'onde 1202 a son axe neutre orienté à 45 degrés de l'axe passant du polariseur 1201 et est quart d'onde pour l'onde réémise par fluorescence. Elle a pour rôle de faire tourner de 90 degrés la direction de polarisation, afin que seule l'onde réfléchie par le point réfléchissant soit ensuite réfléchie par le séparateur de faisceau polarisant 1204, à l'exclusion de l'onde issue de réflexions parasites sur la lentille 1108.

Dans ces conditions, l'image confocale de l'objet se forme directement sur le capteur CCD 1206 lorsque l'objet est balayé au moyen des miroirs galvanométriques. Un contrôle imparfait des miroirs galvanométriques se traduit au pire par des zones sombres sur l'image, mais en aucun cas par un déplacement des points de l'objet ou une quelconque imprécision géométrique. Le balayage de l'objet doit être effectué pendant le temps d'intégration du capteur. Les images peuvent ensuite être transférées du capteur CCD à un échantillonneur et un ordinateur.

Le capteur peut aussi être remplacé par un oculaire, éventuellement un ensemble binoculaire, permettant l'observation directe de l'image formée dans le plan ou se trouve sur le schéma le CCD 1206.

Dans ce cas, le balayage doit se faire suffisamment rapidement pour ne pas être perceptible par l'oeil.

Ce mode de réalisation peut être adapté à un système multifaisceaux du type utilisé dans le premier mode de réalisation. Son avantage principal est qu'il ne nécessite aucun réglage précis hormis la mise en correspondance du point de focalisation du laser avec le point réfléchissant. Son inconvénient majeur est la perte d'intensité lumineuse qui résulte de l'utilisation de miroirs semi-transparents ou polarisants pour permettre l'utilisation d'une seule face des miroirs pour l'ensemble des trajets optiques.

On peut remplacer la lame quart d'onde 1202 par une vitre transparente et remplaçer le séparateur de faisceau polarisant 1204 par un séparateur de faisceau non polarisant. Le système reste parfaitement

fonctionnel dans ces conditions, le bruit dû aux réflexions parasites étant simplement un peu plus élevé. On peut alors également remplacer un des miroirs galvanométriques par un déflecteur accousto-optique, ce qui permet d'accélérer la procédure d'imagerie.

Le présent mode de réalisation permet une compréhension particulièrement aisée du fonctionnement du dispositif. Comme dans un microscope confocal à balayage laser du type le plus courant (par exemple le LSM de Zeiss), le mouvement des miroirs galvanométriques se traduit par un balayage de l'objet 1107 par le faisceau d'excitation FX. Le faisceau FEI émis par fluorescence parvient ensuite, après réflexion sur les miroirs galvanométriques, au point réfléchissant 1203. Dans un microscope confocal à balayage de type usuel, ce point réfléchissant serait remplaçé par un trou microscopique derrière lequel le signal serait détecté à l'aide d'un photomultiplicateur. Dans le cas présent, le faisceau FEI est réfléchi, donnant le faisceau FE2. Le faisceau FE2 suit exactement le trajet inverse du faisceau FE1 et en l'abscence du séparateur de faisceau 1204 il reviendrait exactement au point de focalisation du faisceau FX dans l'échantillon 1107. En introduisant le séparateur de faisceau 1204, on dérive ce faisceau de sorte qu'il parvienne en un point du CCD 1206. Ce point du CCD 1206 n'est atteint que lorsque le point correspondant de l'échantillon 1107 est éclairé par le faisceau FX. Chaque point du CCD 1206 correspond donc à un point unique de l'échantillon 1107 et lorsque l'échantillon 1107 est balayé au moyen des miroirs galvanométriques une image de cet échantillon se forme sur le CCD 1206.

Quatrième mode de réalisation :
Ce mode de réalisation est représenté par la figure 19. II s'agit d'un système utilisant un éclairage laser monopoint, mais comme dans le premier mode de réalisation on utilise deux faces des miroirs galvanométriques et un trou microscopique est utilisé. Ces caractéristiques évitent la plupart des réflections parasites.

Le faisceau issu du laser 1300 traverse l'élargisseur de faisceau ou collimateur formé des lentilles 1301,1302 puis est réfléchi par le miroir dichroïque 1303. II est alors réfléchi par le miroir galvanométrique 1304 mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, puis par le miroir fixe 1305 et par le miroir galvanométrique 1306 mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. II traverse alors l'objectif 1307 formant à l'infini une image de l'échantillon, et est focalisé en un point de l'échantillon observé 1308. La lumière réémise par fluorescence depuis ce point retraverse l'objectif 1307 en sens inverse, est réfléchie par le miroir galvanométrique 1306, le miroir fixe 1305, et le miroir galvanométrique 1304.

Elle traverse le miroir dichroïque 1303, et est focalisée par la lentille 1309 et le miroir fixe 1310 sur le trou microscopique 1311. La lumière ayant traversé le trou microscopique 1310 est réfléchie par le miroir 1312, collimatée par la lentille 1313, réfléchie par le miroir 1314, puis par la seconde face du miroir galvanométrique 1304. Elle est alors réfléchie par le miroir 1315 puis par la seconde face du miroir galvanométrique 1306. Elle est alors focalisée par la lentille 1316 sur un point du plan image dans lequel se trouve le capteur CCD 1317 fixé à la caméra 1318. Comme précédemment le capteur CCD peut être remplacé par un oculaire.

Le fonctionnement de l'ensemble est le même que dans le premier mode de réalisation.

Cinquième mode de réalisation
La figure 13 illustre un cinquième mode de réalisation, qui présente l'avantage d'être peu coûteux.

En effet il utilise un éclairage non cohérent, et il nécessite moins de réglages ou d'éléments spécifiques que le second mode de réalisation. Il utilise un seul miroir galvanométrique et une seule face de ce miroir, et il utilise un réseau de points réfléchissants microscopiques.

Le faisceau d'excitation FX1 est un faisceau non cohérent produit par exemple par une lampe à arc au Xénon équipée d'un collecteur ou d'un ensemble optique permettant la génération d'un éclairage de Köhler. Il est filtré par un filtre passe-bande étroit qui sélectionne la longueur d'onde d'excitation de la fluorescence. Il parvient au dispositif de balayage en 600. Il est réfléchi par le miroir dichroïque 601 puis par le séparateur de faisceau polarisant 602. Le faisceau FX1 est ensuite réfléchi par le miroir galvanométrique 603, traverse la lame quart d'onde 604 dont l'axe neutre est à 45 degrés du plan de la figure, traverse la lentille 605 et parvient au réseau de points réfléchissants 606 plaçés dans le plan focal image de la lentille 605. Le réseau de points réfléchissants 606 est du type représenté sur la figure 15. Il est constitué par exemple d'un ensemble de points réfléchissants (par exemple 650) formant une matrice carrée, sur une vitre de verre transparente traitée antiréflexion. La partie du faisceau FX1 qui est réfléchie par les points réfléchissants sera notée FX2. Ce faisceau FX2 retraverse la lentille 605, la lame quart d'onde 604, et est réfléchi par le miroir galvanométrique 603. Le faisceau FX2 traverse le séparateur de faisceau polarisant 602 puis la lentille 608 et la lentille de tube 609. Il traverse l'objectif 610 et est focalisé sur l'objet

fluorescent observé 611. Le faisceau réémis, par fluorescence, par l'objet fluorescent, sera noté FIE 1. IL traverse l'objectif 610, la lentille de tube 609, la lentille 608, le séparateur de faisceau polarisant 602. Le faisceau FEI est réfléchi par le miroir galvanométrique 603, traverse la lame quart d'onde 604 et la lentille 605, et parvient au réseau de points réfléchissants 606. La partie du faisceau qui est réfléchie par ce réseau de points réfléchissants sera notée FE2. Le faisceau FE2 traverse la lentille 605, la lame quart d'onde 604, est réfléchi par le miroir galvanométrique 603, est réfléchi par le séparateur de faisceau polarisant 602, traverse le miroir dichroïque 601 et la lentille 612, puis parvient au capteur CCD 613 situé dans le plan focal image de la lentille 612. L'image formée dans le plan ou se trouve le capteur 613 peut également être observée à l'aide d'un oculaire.

Le plan focal 607 de la lentille de tube 609 est également un plan focal de la lentille 608. L'autre plan focal de la lentille de tube 609 est de préférence confondu avec le plan focal image de l'objectif 610. De préférence le miroir galvanométrique 603 est dans un plan focal commun des lentilles 605,608 et 612. Le réseau de points réfléchissants 606 est dans un plan focal de la lentille 605. Le capteur CCD 613 est dans un plan focal de la lentille 612. Par exemple, les lentilles 609,608, 605,612 peuvent avoir une distance focale de 200 mm, l'objectif 610 peut être un objectif Nikon à immersion x 100 d'ouverture 1,4. Dans ce cas le réseau 606 peut par exemple être formé de points réfléchissants dont le diamètre est de 30 microns, la distance entre deux points adjacents étant par exemple de 150 microns. Le miroir dichroïque 601 réfléchit la longueur d'onde du faisceau d'excitation et laisse passer la longueur d'onde d'émission fluorescente. La lame

d'onde 604 sert modifier la polarisation des faisceaux de sorte par exemple que le faisceau FE2 soit réfléchi par le séparateur polarisant 602 alors que le faisceau Fie 1 le traverse.

Le miroir galvanométrique 603 peut par exemple être mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Dans ce cas, le réseau de points réfléchissants 606 doit être orienté de manière à ce que la trajectoire de l'image sur le capteur CCD d'un point réfléchissant soit du type décrit par la trajectoire 500 de la figure 8, ce qui permet de scanner l'ensemble de l'objet à l'aide d'un seul miroir galvanométrique.

Comme dans le premier mode de réalisation, il aurait été possible de mettre le miroir galvanométrique 603 dans le plan focal image de l'objectif 610 ou à proximité de ce plan. On a introduit les lentilles relais 609 et 610 pour illustrer la possibilité d'une telle construction, qui se prête particulièrement bien à la réalisation d'un dispositif de balayage adaptable à tout type de microscope. Dans ce cas, le dispositif de balayage constitue une unité indépendante délimitée par les pointillés 614, et adaptable à tout microscope possédant par exemple une sortie caméra sur laquelle on peut adapter l'unité 614.

Le réseau de points réfléchissants peut être réalisé par exemple par litographie.

La position du réseau 606 doit être ajustée en rotation autour de l'axe optique de manière à ce que le mouvement du miroir 603 déplace l'image sur la caméra des points réfléchissants, de la manière indiquée par la figure 8. La position du réseau 606 doit être ajustée en translation dans le sens de l'axe optique de manière que le réseau 606 soit conjugué au CCD 613. Ces réglages sont aisément réalisables.

Le présent mode de réalisation présente l'avantage d'être peu coûteux et de nécessiter peu de réglages. Il est bien adapté à une version bas coût de l'invention. L'appareil peut être muni d'un système de déplacement vertical de l'échantillon, auquel cas la qualité de l'image obtenue peut être améliorée par une déconvolution tridimensionnelle. Une telle déconvolution permet d'améliorer la résolution et de supprimer la plupart des défaut dûs aux réflexions parasites dans le système, et éventuellement de compenser les défauts liés à la faiblesse de la distance séparant les points du réseau 606. Elle nécessite la mesure préalable de la PSF ("Point Spread Function"en anglais) qui peut être effectuée par imagerie d'une microbille fluorescente, selon une technique connue.

Le fait que le faisceau d'éclairage FX1 soit lui-même réfléchi par le miroir galvanométrique avant de parvenir au réseau de points microscopiques permet de faire parcourir une trajectoire longue à chaque point éclairé, ce sans perte d'énergie lumineuse. En effet la zone éclairée est fixe dans l'objet mais mobile sur le réseau de points microscopiques.

Pour éviter l'usage d'un séparateur de faisceau polarisant et la perte d'intensité lumineuse qui en résulte, le dispositif peut être modifié comme indiqué sur la figure 17. Sur la figure 17 les divers éléments du dispositif sont les mêmes que sur la figure 13, les éléments 602,603 et 605 étant toutefois remplaçés respectivement par les éléments 602b, 603b et 605b. Le miroir polarisant 602 est remplaçé par le miroir simple 602b sur lequel se réfléchissent les faisceaux FX1 et FE2. Le miroir galvanométrique 603b est à peu près deux fois plus long que le miroir 603, et la lentille 605b est également plus grande que la lentille 605.

L'axe optique de la lentille 605b est décalé par rapport à l'axe optique du faisceau FX1 provenant du miroir galvanométrique, de sorte que le faisceau FX1 arrive en biais sur le réseau de points réfléchissants 606. Le

faisceau FX2 réfléchi par le réseau 606 parvient alors sur une zone du miroir 603b distincte de celle qui était éclairée par FX1. Après réflexion sur 603b, le faisceau FX2 passe à coté du miroir 602b. Le faisceau FEI provenant de l'échantillon suit le trajet inverse de sorte qu'après réflexion sur le réseau de trous microscopiques le faisceau FE2 parvient au capteur.

Le dispositif de la figure 17 peut être complété par un deuxième miroir galvanométrique, de manière à pouvoir effectuer un balayage bidimensionnel comme dans le deuxième mode de réalisation. Le schéma résultant est montré sur la figure 18 ou on a ajouté un miroir galvanométrique 615 et déplaçé en conséquence les autres éléments. L'axe de rotation du miroir 615 est orthogonal à celui du miroir 603b. En commandant en quadrature les deux miroirs, il devient possible de faire suivre une trajectoire circulaire à l'image sur le capteur d'un point du réseau de points réfléchissants. Cette trajectoire est similaire à la

trajectoire 505 de la figure 8. Toutefois, du fait que le faisceau d'excitation FXl est lui-même réfléchi par les i miroirs galvanométriques, une trajectoire circulaire de grand diamètre peut alors être parcourue sans perte d'intensité lumineuse. L'avantage de cette technique est que la vitesse de déplacement des points éclairés dans l'objet est à peu près constante, ce qui évite les suréclairages ponctuels qui sont liés aux phases d'accélération et de décélération d'un miroir galvanométrique unique.

Applications industrielles
Le présent dispositif de balayage optique, intégré à un microscope confocal, peut être utilisé pour l'imagerie en temps réel d'objets biologiques.

Claims

Revendications (1/2) 1-Dispositif à balayage optique confocal, comprenant : - un déflecteur de faisceau A, qui défléchit le faisceau d'éclairage qu'il parvienne à l'échantillon observé, - un déflecteur de faisceau B, qui défléchit le faisceau provenant de l'échantillon observé, caractérisé par le fait qu'il comprend un déflecteur de faisceau C, qui défléchit d'un angle proportionnel à l'angle de déflexion par ledit déflecteur B, le faisceau provenant de l'échantillon observé et ayant été défléchi par ledit déflecteur de faisceau B.

2-dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que : - lesdits déflecteurs de faisceau sont des miroirs mobiles ou des couples de miroirs mobiles, - chaque miroir mobile dudit déflecteur B est confondu avec un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A, ou est solidaire d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A, - chaque miroir mobile dudit déflecteur C est confondu avec un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A, ou est solidaire d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A, 3-dispositif selon une la revendication 2, caractérisé par le fait que - lesdits miroirs mobiles dudit déflecteur A sont chacun confondus avec un miroir mobile correspondant dudit déflecteur B, - lesdits miroirs mobiles du déflecteur C sont chacun réalisés sur la face opposée d'un miroir mobile correspondant dudit déflecteur A,
4-dispositif selon une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que lesdits déflecteurs de faisceau sont plaçés dans des plans afocaux.
5-dispositif selon une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'il comprend plusieurs trous microscopiques traversés par ledit faisceau provenant de l'échantillon observé et ayant été défléchi par ledit déflecteur B, ou plusieurs points réfléchissants réfléchissant ledit faisceau provenant de l'échantillon observé et ayant été défléchi par ledit déflecteur B.
6-dispositif selon une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'il comprend un moyen pour focaliser en un ou plusieurs points d'un plan image l'onde provenant de points correspondants de l'échantillon observé et ayant été défléchie par lesdits déflecteurs B et C.

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Revendications (2/2) 7-dispositif selon une des revendications 5 ou 6, caractérisé par le fait qu'il comprend un moyen pour diviser le faisceau lumineux d'éclairage en plusieurs sous-faisceaux focalisé chacun en un point différent de l'échantillon observé, et par le fait que chacun desdits trous microscopiques ou points réfléchissants est l'image d'un point de l'objet sur lequel un desdits sous-faisceaux est focalisé.
8-dispositif selon une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que ledit déflecteur C défléchit le faisceau provenant d'un point donné de l'objet de telle sorte que la direction de ce faisceau, après déflection par les déflecteurs B et C, soit indépendante de la position desdits déflecteurs B et C.
9-dispositif selon une des revendications 1 à 8 et selon la revendication 7, caractérisé par le fait qu'il comprend un moyen pour faire varier la phase de chacun desdits sous-faisceau.
10-dispositif selon la revendication 9, caractérisé par le fait que ledit moyen pour faire varier la phase de chacun desdits sous-faisceaux est une vitre transparente portant des surépaisseurs et tournant autour d'un axe.