FR2825094A1 - New isolated human gonadotropin-releasing hormone receptors and nucleic acids, useful for treating disorders associated with gonadal steroids, e.g. endometriosis - Google Patents
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Abstract
Description
3s Nouveau récepteur GnRH humain et ses applications La présente invention3s New human GnRH receptor and its applications The present invention
concerne un gène codant pour un nouveau récepteur humain GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone Receptor ou récepteur pour l'hormone libératrice de gonadotropine). Elle a également pour objet des cellules hôtes génétiquement modifiées qui expriment ledit récepteur, ainsi que leur utilisation pour s évaluer et cribler des produits et des analogues de GnRH impliqués dans l'activation, la relates to a gene coding for a new human receptor GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone Receptor or receptor for the gonadotropin releasing hormone). It also relates to genetically modified host cells which express said receptor, as well as their use for evaluating and screening GnRH products and analogs involved in the activation, the
régulation et le découplage dudit récepteur. regulation and decoupling of said receiver.
Un grand nombre de récepteurs de la famille GnRH-R kécepteurs GnRH) ont été identifiés récernment dans de nombreuses espèces. Bien souvent, un certain nombre de sous-types de récepteurs GnRH a été isolé chez une même espèce (cf. par exemple, pour o le crapaud, McCann et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001), 98(1), 361-366). I1 a été montré chez les vertébrés que ces récepteurs se trouvent exprimés au moins dars l'hypophyse et le cerveau. Chez l'homrne, il n'existe actuellement qu'un seul récepteur GnRH connu, à savoir celui isolé par S. Kakar et ses collaborateurs (Kakar et coll., A large number of GnRH-R family receptors (GnRH receptors) have been identified recently in many species. Quite often, a number of GnRH receptor subtypes have been isolated from the same species (cf. for example, for o the toad, McCann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001), 98 (1), 361-366). It has been shown in vertebrates that these receptors are found expressed at least in the pituitary gland and the brain. In humans, there is currently only one known GnRH receptor, namely that isolated by S. Kakar and his collaborators (Kakar et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992),189, 289-295). Biochem. Biophys. Res. Common. (1992), 189, 289-295).
La demanderesse vient à présent de trouver un nouveau récepteur GnRH humain, The Applicant has now found a new human GnRH receptor,
ci-après désigné par GnRH-R2.hereinafter referred to as GnRH-R2.
L'invention concerne tout d'abord ledit récepteur GnRH-R2 isolé, lequel comprend la séquence d'acides aminés SEQ. ID. NO. 4. Ladite séquence SEQ. ID. NO. 4 est la suivante: The invention relates firstly to said isolated GnRH-R2 receptor, which comprises the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 4. Said sequence SEQ. ID. NO. 4 is as follows:
1 MSAGNGTPWG SAAGEEVWAG SGVEVEGSEL PTFSAAAKVR VGVTIVLFVS 1 MSAGNGTPWG SAAGEEVWAG SGVEVEGSEL PTFSAAAKVR VGVTIVLFVS
51 SAGGNLAVLW SVTRREPSQL RPSPVRRLFI HLAAPDLLVT FWMPLDATW 51 SAGGNLAVLW SVTRREPSQL RPSPVRRLFI HLAAPDLLVT FWMPLDATW
101 NITVQWLAVD IACRTLMFLK LMATYSAAFL PWIGLDRQA AVLNPLGSRS 101 NITVQWLAVD IACRTLMFLK LMATYSAAFL PWIGLDRQA AVLNPLGSRS
151 GVRKLLGAAW GLSFLLAFPD LFLFHTVHRA GPDPFTQCVT KGSFKAQWQE 151 GVRKLLGAAW GLSFLLAFPD LFLFHTVHRA GPDPFTQCVT KGSFKAQWQE
201 TTYNLFTFCC LFLLPLTAMA ICYSRIVLSV SRPQTRKGSH APAGEFALPR 201 TTYNLFTFCC LFLLPLTAMA ICYSRIVLSV SRPQTRKGSH APAGEFALPR
251 SFDNCPRVRL RALRLALLIL LTFILCWTPY YLLGMWYWFS PTMLTEVPPS 251 SFDNCPRVRL RALRLALLIL LTFILCWTPY YLLGMWYWFS PTMLTEVPPS
301 LSHILFLLGL LNAPLDPLLY GAFTLGCRRG HQELSIDSSK EGSGRMLQEE 301 LSHILFLLGL LNAPLDPLLY GAFTLGCRRG HQELSIDSSK EGSGRMLQEE
351 IHAFRQLEVQ KTVTSRRAGE TKGISITSI351 IHAFRQLEVQ KTVTSRRAGE TKGISITSI
De préférence, ledit récepteur consiste en la séquence d'acides aminés SEQ. ID. NO. 4. Preferably, said receptor consists of the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 4.
-2 L'invention concerne aussi un récepteur GnRH isolé codé par une séquence nucléotidique telle qu'il s'hybride avec le polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 3 (décrite plus loin). De préférence, ledit récepteur GnRH isolé est codé par une séquence nucléotidique telle qu'il s'hybride dans des conditions de forte stringence avec ledit The invention also relates to an isolated GnRH receptor encoded by a nucleotide sequence such that it hybridizes with the polynucleotide of sequence SEQ. ID. NO. 3 (described later). Preferably, said isolated GnRH receptor is coded by a nucleotide sequence such that it hybridizes under conditions of high stringency with said
polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 3. polynucleotide of sequence SEQ. ID. NO. 3.
Elle a de plus pour objet un polynucléotide isolé comprenant soit la séquence de nucléotides SEQ. ID. NO. 3, soit la séquence complémentaire à ladite séquence de nucléotides SEQ. ID. NO. 3. Cette séquence SEQ. ID. NO. 3 est la suivante: 1 tttctctcca gOccaccatg tatgcaggca acggcacccc ttgggggtca 51 gcagcggggg aggaggtctg ggchggatca ggagtggagg tggagggctc 101 agagctgccc accttctcgg cagcagccaa ggtccgagtg ggagtgacca 151 ttgtgctÈtt tgtttcUtag gctggaggga acctggcagt cctgtggtca 201 gtgacacggc gggaacccag ccagatccgc ccctctccgg tcaggagact 251 ctteatccat ttagcagccg ccgacttact agtcactttt gtggttaLgc 301 ccctagatgc cacctggaat atcachgttc aatggctggc tgtggacatc 351 gcatgtcgga cactgatgtt cctgaaacta atggccacgt attctgcagc 401 tttcctgcct gtggtcattg gattggaccg ccaggcagca gtactcaacc 451 cgcUtggatc ccgttcaggt gtaaggaaac ttctgggggc agcctgggga 501 cttagtttcc tgcttgcctt ccccgacctg ttcctgttcc acacggtcca 551 ccgagctggc ccagacactt tcactcagtg tgtcaccaaa ggcagcttca 601 aggctcaatg gcaagagacc acctataacc tcttcacctt ctgctgcctc 651 tttctgchgc cactgactgc caLggocatc tgatatagoc gcattgtcat 701 cagtgtgtoc aggocacaga caaggaaggg gagccatgoc cctgctgOtg 751 astttgccat cccccgctcc tttgacaatt gtccccgtgt tcgtctccgg 801 gccctgagac tggcactgct tatattgctg acctteatcc totgotggac 851 accttattac ctactgggta tgtggtactg gétatccccc accatgctaa 901 ctgaagtcec tcccagcchg agccacatcc têttcctcht gggcctactc 951 aatgctcctt tggatcctct cctctatggg gcattcaccc ttggctgccg 1001 aagaggOcac caagaactta gtatagactc ttctaaagaa gggtatggga 1051 gaatgctcca agaggagatt catgccttta gacagctgga agtacaaaaa 1101 actgtgacat caagaagggc aggagaaaca aaaggcattt ctataacatc -3 1151 tatctgatcc taacagagta tgtaggaaca gaatagtaag tctttagtgc 1201 cataagaCct taacaCctca cttctactcc tgctctccta gttcccccc De prétérence, ledit polynucléotide isolé consiste en une séquence de nucléotides comprenant la séquence de nucléotides SEQ. ID. NO. 3. Encore plus préférentiellement, It further relates to an isolated polynucleotide comprising either the nucleotide sequence SEQ. ID. NO. 3, or the sequence complementary to said nucleotide sequence SEQ. ID. NO. 3. This sequence SEQ. ID. NO. 3 is as follows: 1 tttctctcca gOccaccatg tatgcaggca acggcacccc ttgggggtca 51 gcagcggggg aggaggtctg ggchggatca ggagtggagg tggagggctc 101 agagctgccc accttctcgg cagcagccaa ggtccgagtg ggagtgacca 151 ttgtgctÈtt tgtttcUtag gctggaggga acctggcagt cctgtggtca 201 gtgacacggc gggaacccag ccagatccgc ccctctccgg tcaggagact 251 ctteatccat ttagcagccg ccgacttact agtcactttt gtggttaLgc 301 ccctagatgc cacctggaat atcachgttc aatggctggc tgtggacatc 351 gcatgtcgga cactgatgtt cctgaaacta atggccacgt attctgcagc 401 tttcctgcct gtggtcattg gattggaccg ccaggcagca gtactcaacc 451 cgcUtggatc ccgttcaggt gtaaggaaac ttctgggggc agcctgggga 501 cttagtttcc tgcttgcctt ccccgacctg ttcctgttcc acacggtcca 551 ccgagctggc ccagacactt tcactcagtg tgtcaccaaa ggcagcttca 601 aggctcaatg gcaagagacc acctataacc tcttcacctt ctgctgcctc 651 tttctgchgc cactgactgc caLggocatc tgatatagoc gcattgtcat 701 cagtgtgtoc aggocacaga caaggaaggg gagccatgoc cctgctgOtg 751 astttgccat cccccgctcc tttgacaatt gtccccgtgt tcgtctccgg 801 gccctgagac tggcactgct tatattgctg ac ctteatcc totgotggac 851 accttattac ctactgggta tgtggtactg gétatccccc accatgctaa 901 ctgaagtcec tcccagcchg agccacatcc têttcctcht gggcctactc 951 aatgctcctt tggatcctct cctctatggg gcattcaccc ttggctgccg 1001 aagaggOcac caagaactta gtatagactc ttctaaagaa gggtatggga 1051 gaatgctcca agaggagatt catgccttta gacagctgga agtacaaaaa 1101 actgtgacat caagaagggc aggagaaaca aaaggcattt ctataacatc -3 1151 tatctgatcc taacagagta tgtaggaaca gaatagtaag tctttagtgc 1201 cataagaCct taacaCctca cttctactcc tgctctccta gttcccccc Preferably, said isolated polynucleotide consists of a nucleotide sequence comprising the nucleotide sequence SEQ. ID. NO. 3. Even more preferably,
ledit polynucléotide isolé consiste en la séquence de nucléotides SEQ. ID. NO. 3. said isolated polynucleotide consists of the nucleotide sequence SEQ. ID. NO. 3.
L'invention comprend également les polynucléotides dont la séquence est homologue au moins à 75 %, de prétérence au moins à 85 % et encore plus préférentiellement au The invention also includes polynucleotides whose sequence is at least 75% homologous, at least 85% preferable and even more preferably at
moins à 90 % voire 95 %, à la séquence SEQ. ID. NO. 3. less than 90% or even 95%, with the sequence SEQ. ID. NO. 3.
L' invention concerne de même un polynucléotide isolé qui code pour un récepteur GnRH naturel, ledit polynucléotide comprenant une séquence nucléotidique telle qu'il s'hybride avec un polynucléotide isolé comprenant la séquence de nucléotides o SEQ. ID. NO. 3 ou la séquence complémentaire à ladite séquence de nocléotides The invention also relates to an isolated polynucleotide which codes for a natural GnRH receptor, said polynucleotide comprising a nucleotide sequence such that it hybridizes with an isolated polynucleotide comprising the nucleotide sequence o SEQ. ID. NO. 3 or the sequence complementary to said nocleotide sequence
SEQ. ID. NO. 3.SEQ. ID. NO. 3.
L'invention a également pour objet un polynucléotide isolé comprenant une séquence nucléotidique codant soit pour un polypoptide de séquence d'acides aminés SEQ. ID. NO. 4, soit pour le polypeptide de séquence d'acides aminés complémentaire à la séquence d'acides aminés SEQ. ID. NO. 4. L ' invention a encore pour obj et un polynucléotide isolé qui code pour un récepteur GnRH naturel, ledit polynucléotide étant susceptible de s'hybrider avec un polynucléotide isolé comprenant une séquence nucléotidique codant soit pour un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ. ID. NO. 4, soit pour le polypeptide de séquence d'acides aminés complémentaire à la séquence d'acides aminés The invention also relates to an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence coding either for a polypoptide of amino acid sequence SEQ. ID. NO. 4, or for the polypeptide of amino acid sequence complementary to the amino acid sequence SEQ. ID. NO. 4. The subject of the invention is also an isolated polynucleotide which codes for a natural GnRH receptor, said polynucleotide being capable of hybridizing with an isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence coding for either an amino acid sequence polypeptide SEQ. ID. NO. 4, or for the polypeptide of amino acid sequence complementary to the amino acid sequence
SEQ. ID. NO. 4.SEQ. ID. NO. 4.
L'invention concerne aussi un polynucléotide isolé qui code pour un récepteur GnRH naturel, ledit polynucléotide étant susceptible d'être obtenu par un procédé comportant les étapes successives suivantes: a) réaction de polymérisation en châîne (PCR) sur une banque d'ADNc humain de tissus de cerveau ou d'hypophyse avec 0,5 M d'amorce F1 (de séquence SEQ. ID. NO. 1) et d'amorce R1 (de séquence SEQ. ID. NO. 2), 200,aM de déoxynucléotides triphosphate (ou dNTPs: dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 10 mM de Tris-HC1 (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5mM de MgC12 et 0,5 U de Taq ADN polymérase dans un volume final de 50 Ill, les paramètres de cycles thermiques comprenant une dénaturation à 94 C pendant 30 s, une hybridation des amorces à C pendant 1 minute et une extension de polymérisation à 72 C pendant 30 s (avec une extension finale de 5 minutes); b) hydrolyse des séquences HindIII et EcoRI; et The invention also relates to an isolated polynucleotide which codes for a natural GnRH receptor, said polynucleotide being capable of being obtained by a process comprising the following successive steps: a) polymerase chain reaction (PCR) on a human cDNA library brain or pituitary tissue with 0.5 M primer F1 (sequence SEQ. ID. NO. 1) and primer R1 (sequence SEQ. ID. NO. 2), 200, aM deoxynucleotides triphosphate (or dNTPs: dATP, dCTP, dGTP and dTTP), 10 mM Tris-HC1 (pH 8.3), 50 mM KC1, 1.5 mM MgC12 and 0.5 U of Taq DNA polymerase in a final volume of 50 Ill, the thermal cycle parameters comprising denaturation at 94 C for 30 s, hybridization of primers at C for 1 minute and polymerization extension at 72 C for 30 s (with a final extension of 5 minutes); b) hydrolysis of the HindIII and EcoRI sequences; and
c) séparation sur gel d'agarose 1%. c) separation on 1% agarose gel.
L'invention se rapporte également au récepteur GnRH isolé codé par un polynucléotide The invention also relates to the isolated GnRH receptor encoded by a polynucleotide.
susceptible d' être obtenu par le procédé qui vient d' être décrit. capable of being obtained by the process which has just been described.
Un obj et supplémentaire de l' invention est un vecteur recombinant contenant la séquence nucléotidique de l'un des polynucléotides décrits précédernnent. L'invention concerne de plus un vecteur recombinant contenant la séquence nucléotidique de l'un o desdits polynucléotides associée à une séquence nucléotidique de régulation contenant des informations de régulation transcriptionnelle et traductionnelle qui contrôlent An additional object of the invention is a recombinant vector containing the nucleotide sequence of one of the polynucleotides described above. The invention further relates to a recombinant vector containing the nucleotide sequence of one of said polynucleotides associated with a regulatory nucleotide sequence containing transcriptional and translational regulatory information which controls
l' expression de la séquence nucléotidique dans une cellule hôte. expression of the nucleotide sequence in a host cell.
L'invention offre également une cellule génétiquement modifiée contenant la séquence nucléotidique de l'un des polynocléotides décrits précédemment. Elle offre encore une 1S cellule génétiquement modifiée contenant la séquence nucléotidique de l'un desdits polynucléotides associée à une séquence nocléotidique de régulation contenant des informations de régulation transcriptionnelle et traductionnelle qui contrôlent The invention also provides a genetically modified cell containing the nucleotide sequence of one of the polynocleotides described above. It also offers a genetically modified 1S cell containing the nucleotide sequence of one of said polynucleotides associated with a nocleotide regulatory sequence containing transcriptional and translational regulatory information which controls
l'expression de la séquence nucléotidique dans une cellule hôte. expression of the nucleotide sequence in a host cell.
L'invention concerne en outre l'utilisation de l'un des récepteurs définis précédemment pour la découverte d'agents thérapeutiques, et en particulier pour la découverte d'agents thérapeutiques destinés à traiter les pathologies dépendantes des stérodes gonadiques, et en particulier: - chez la femme: l'endométriose, le fibrome, la désensibilisation hypophysaire gonadotrope lors des protocoles de procréation médicalement assistée, le cancer du sein chez la femme pré-ménopausée, le syndrome des ovaires polykystiques, le cancer de l'ovaire et le cancer de l'endomètre; - chez l'homme: l'hyperplasie bénigne de la prostate et le cancer de la prostate; The invention further relates to the use of one of the receptors defined above for the discovery of therapeutic agents, and in particular for the discovery of therapeutic agents intended for treating pathologies dependent on gonadal sterodes, and in particular: - in women: endometriosis, fibroma, gonadotropic pituitary desensitization during assisted reproductive procedures, breast cancer in pre-menopausal women, polycystic ovary syndrome, ovarian cancer and cancer endometrial; - in men: benign prostatic hyperplasia and prostate cancer;
- la puberté précoce masculine ou féminine. - male or female precocious puberty.
Par ailleurs, l'invention aura encore pour objet l'utilisation de l'un des récepteurs définis précédemment pour la découverte d' agents thérapeutiques pour la découverte d'agents thérapeutiques destinés à protéger les ovaires chez la femme qui est soumise à Furthermore, the subject of the invention will also be the use of one of the receptors defined above for the discovery of therapeutic agents for the discovery of therapeutic agents intended to protect the ovaries in women who are subjected to
une chimiothérapie ou à traiter l'adénome gonadotrope. chemotherapy or to treat gonadotropic adenoma.
s L'invention concerne encore, en tant que médicament, l'un des récepteurs définis précédernment ou un fragment biologiquement actif d'un de ceux-ci. Elle concerne également une composition pharmaceutique contenant, à titre de principe actif, l'un des The invention also relates, as a medicament, to one of the previously defined receptors or to a biologically active fragment of one of them. It also relates to a pharmaceutical composition containing, as active ingredient, one of the
récepteurs défmis précédemment ou un fragment biologiquement actif d'un de ceux-ci. previously defined receptors or a biologically active fragment of one of them.
s Elle concerne en outre l'utilisation desdits récepteurs ou fragments biologiquement actifs de ceux-ci pour préparer un médicament destiné à traiter les pathologies dépendantes des stérodes gonadiques, et en particulier: - chez la fernme: l'endométriose, le fibrome, la désensibilisation hypophysaire gonadotrope lors des protocoles de procréation médicalement assistée, le cancer du 0 sein chez la femme préménopausce, le syndrome des ovaires polykystiques, le cancer de l'ovaire et le cancer de l'endomètre; - chez l'homme: l'hyperplasie bénigne de la prostate et le cancer de la prostate; s It also relates to the use of said receptors or biologically active fragments thereof for preparing a medicament intended for treating pathologies dependent on gonadal sterodes, and in particular: - in women: endometriosis, fibroma, desensitization gonadotropic pituitary during medically assisted procreation protocols, breast cancer in premenopausal women, polycystic ovary syndrome, ovarian cancer and endometrial cancer; - in men: benign prostatic hyperplasia and prostate cancer;
- la puberté précoce masculine ou féminine. - male or female precocious puberty.
L'invention concerne encore par ailleurs l'utilisation d'un des récepteurs définis précédemment ou d'un fragment biologiquement actif d'un de ceux-ci pour préparer un médicament destiné à protéger les ovaires chez la femme qui est soumise à une The invention also further relates to the use of one of the receptors defined above or of a biologically active fragment of one of them for preparing a medicament intended to protect the ovaries in women who are subjected to a
chimiothérapie ou à traiter l'adénome gonadokope. chemotherapy or to treat gonadokope adenoma.
D'autres objets et intérêts de la présente invention deviendront encore évidents à la Other objects and interests of the present invention will become apparent from
lumière de la description détaillée qui suit. light of the detailed description which follows.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Selon la présente invention, le récepteur GnRH-R2 humain peut être cloné et exprimé. According to the present invention, the human GnRH-R2 receptor can be cloned and expressed.
GnRH-R2 est caractérisé par sept segments trans-membranaires caractéristiques des récepteurs couplés aux protéines G; mais, contrairement au récepteur GnRH-R, GnRH-R2 possède une extrémité intracellulaire C-terminale avec en séquence finale la présence d'un domaine PDZ d'ancrage au cytosquelette (PSD-95/discs large/ZO-l, GnRH-R2 is characterized by seven trans-membrane segments characteristic of receptors coupled to G proteins; but, unlike the GnRH-R receptor, GnRH-R2 has a C-terminal intracellular end with in the final sequence the presence of a PDZ domain for anchoring to the cytoskeleton (PSD-95 / large discs / ZO-1,
décrit dans Kornau et coll., Science (1995), 269, 1737-1740). described in Kornau et al., Science (1995), 269, 1737-1740).
GnRH-R2 produit ici peut être utilisé pour évaluer et cribler des produits et des analogues de GnRH impliqués dans l' activation, la régulation ou le découplage de GnRH-R2. Alternativement, 1'ADN de GnRH-R2, des oligonucléotides sens ou anti-sens, GnRH-R2, des fragments peptidiques de celui-ci, ou des anticorps dirigés contre celui-ci peuvent être utilisés dans des méthodes de diagnostic et/ou thérapeutiques. - 6 La séquence d'acides nucléiques codante (SEQ. ID. NO 3) et la séquence en acides aminés déduite (SEQ. ID. NO. 4) pour le récepteur humain GnRH-R2 sont décrites dans la présente demande. La phase de lecture ouverte complète code pour une protéine de 379 acides aminés d'environ 39 000 daltons. L'analyse d'hydrophobicité de la protéine déduite révèle 7 portions composées d'acides aminés hautement hydrophobes. Contrairement au premier récepteur humain GnRH-R découvert, GnRH-R2 possède une longue extrémité C-terminale avec la présence d'un motif de reconnaissance PDZ GnRH-R2 produced here can be used to assess and screen GnRH products and analogs involved in the activation, regulation or decoupling of GnRH-R2. Alternatively, GnRH-R2 DNA, sense or antisense oligonucleotides, GnRH-R2, peptide fragments thereof, or antibodies to it can be used in diagnostic and / or therapeutic methods . - 6 The coding nucleic acid sequence (SEQ. ID. NO 3) and the deduced amino acid sequence (SEQ. ID. NO. 4) for the human GnRH-R2 receptor are described in the present application. The complete open reading phase codes for a protein of 379 amino acids of approximately 39,000 daltons. The hydrophobicity analysis of the deduced protein reveals 7 portions composed of highly hydrophobic amino acids. Unlike the first human receptor GnRH-R discovered, GnRH-R2 has a long C-terminal end with the presence of a PDZ recognition motif
(ITSI-Stop) en bout de châine C-terminale. (ITSI-Stop) at the end of the C-terminal chain.
La présente invention a pour objet des polynucléotides ou polypeptides isolés. Un o polynucléotide ou un polypeptide est dit " isolé " s'il est pris hors de son environnement original. En particulier, un polynucléotide ou un polypeptide est isolé The present invention relates to isolated polynucleotides or polypeptides. A polynucleotide or a polypeptide is said to be "isolated" if it is taken out of its original environment. In particular, a polynucleotide or a polypeptide is isolated
s'il est séparé du matériel biologique avec lequel il coexiste dans le système naturel. if it is separated from the biological material with which it coexists in the natural system.
Selon l'invention, les séquences qui codent pour GnRH-R2 et des fragments ou des protéines de fusion de GnRH-R2 peuvent être utilisés pour générer des molécules d'ADN recombinant qui dirige l'expression de GnRH-R2, ou d'une portion active de celui-ci, dans des cellules hôtes appropriées. Alternativement, des séquences qui s'hybrident avec des portions des séquences de GnRH-R2 peuvent également être utilisées dans des essais d'hybridation d'acides nucléiques, Southern blot, Northern blot, etc. A cause de la dégénération du code génétique, d'autres séquences d'ADN codant substantiellement pour la séquence en acides aminés de GnRH-R2 peuvent être utilisces pour le clonage et l'expression de GnRH-R2. De telles séquences d'ADN incluent celles capables d'hybrider les séquences de GnRH-R2 dans certaines conditions de stringence qui peuvent être ajustées de plusieurs manières. Par exemple, lors de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), la température à laquelle s'hybrident les amorces à la matrice ou les concentrations de MgCl2 dans le tampon réactionnel, peuvent être ajustés. Lors de l'utilisation de fragrnents d'ADN radio-marqués, ou d'oligonucléotides pour sonder des membranes, la stringence peut être ajustée en changeant les forces ioniques des solutions de lavage ou en contrôlant avec précaution la température de According to the invention, the sequences which code for GnRH-R2 and fragments or fusion proteins of GnRH-R2 can be used to generate recombinant DNA molecules which direct the expression of GnRH-R2, or of a active portion of it, in appropriate host cells. Alternatively, sequences which hybridize with portions of the GnRH-R2 sequences can also be used in nucleic acid hybridization tests, Southern blot, Northern blot, etc. Due to the degeneration of the genetic code, other DNA sequences substantially encoding the amino acid sequence of GnRH-R2 can be used for the cloning and expression of GnRH-R2. Such DNA sequences include those capable of hybridizing the GnRH-R2 sequences under certain stringency conditions which can be adjusted in several ways. For example, during a polymerase chain reaction (PCR), the temperature at which the primers hybridize to the matrix or the concentrations of MgCl2 in the reaction buffer can be adjusted. When using radio-labeled DNA fragments, or oligonucleotides to probe membranes, the stringency can be adjusted by changing the ionic strengths of the washing solutions or by carefully controlling the temperature of
so lavage.so wash.
L'invention comprend en particulier les polynucléotides présentant une homologie d'au moins 75 % avec le polynucléotide de séquence SEQ. ID. NO. 3. Le degré d'homologie exprimé en % est calculé comme suit: - lOO x (N'/N) - 7 avec N' représentant le nombre de nucléotides modifés par rapport à la séquence The invention particularly includes polynucleotides having at least 75% homology with the polynucleotide of sequence SEQ. ID. NO. 3. The degree of homology expressed in% is calculated as follows: - 100 x (N '/ N) - 7 with N' representing the number of nucleotides modified compared to the sequence
SEQ. ID. NO. 3 et N le nombre de nucléotides de SEQ. ID. NO. 3. SEQ. ID. NO. 3 and N the number of nucleotides of SEQ. ID. NO. 3.
De manière préLérentielle, une telle séquence nucléotidique homologue sthybride spécifquement avec la séquence complémentaire à la séquence SEQ. ID. NO. 3 dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence PreLerentially, such a nucleotide sequence homologous hybridizes specifically with the sequence complementary to the sequence SEQ. ID. NO. 3 under stringent conditions. Parameters defining stringency conditions
dépendent de la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent (T.). depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (T.).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, et d'après Sambrook et coll. For sequences comprising more than 30 bases, and according to Sambrook et al.
(Molecular cloning: A Laboratory Mannal, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Tm est définie par la relation: 0 Tn = 81, 5 + 0,41 x ( /0 G+) + 16,6 x log[cations] - 0,63 x (% formamide) - (600 / nombre de bases) Pour la présente invention, les conditions de stringence seront dites " fortes " lorsque l'on utilise une température d'hybridation de 10 C en dessous de T", et des tampons d'hybridation contenant une solution 6 x SSC (chlorure de sodium 0,9 M et citrate de sodium 0,09 M). Dans de telles conditions, les polynucléotides de séquences aspécifiques ne s'hybrideront pas avec le polynucléctide de la séquence complémentaire (Molecular cloning: A Laboratory Mannal, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Tm is defined by the relation: 0 Tn = 81.5 + 0.41 x (/ 0 G +) + 16.6 x log [cations] - 0.63 x (% formamide) - (600 / number of bases) For the present invention, the stringency conditions will be said to be "strong" when a hybridization temperature of 10 C is used below of T ", and hybridization buffers containing 6 x SSC solution (0.9 M sodium chloride and 0.09 M sodium citrate). Under such conditions, polynucleotides of aspecific sequences will not hybridize with the polynuclectide of the complementary sequence
à la séquence SEQ. ID. NO. 3.to the sequence SEQ. ID. NO. 3.
Des séquences d'ADN altérées qui peuvent être utilisées en accord avec la présente invention incluent des délétions, des additions ou des substitutions de différents résidus nucléotidiques résultant dans une séquence qui code le même produit du gène ou de fonction équivalente. Le produit du gène peut également contenir des délétions, des additions ou des substitutions de résidus d'acides aminés dans la séquence de GnRH-R2, qui résultent dans des changements dits silencieux, produisant ainsi un Altered DNA sequences which can be used in accordance with the present invention include deletions, additions or substitutions of different nucleotide residues resulting in a sequence which codes for the same gene product or equivalent function. The gene product may also contain deletions, additions or substitutions of amino acid residues in the sequence of GnRH-R2, which result in so-called silent changes, thereby producing a
GnRH-R2 de foncti on équiv al ente. GnRH-R2 of equivalent function.
De telles substitutions en acides aminés peuvent être réalisés sur la base de la polarité, de la charge, de la solubilité, de l'hydrophobicité, de l'hydrophilicité, ettou de la nature Such amino acid substitutions can be made based on polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or nature
amphipatique des résidus impliqués. amphipatic residue involved.
Par exemple, des acides aminés chargés négativement incluent l'acide aspartique et l'acide glutamique, des acides aminés chargés positivement incluent la lysine et l'arginine, des acides aminés avec des groupements polaires ayant des valeurs d'hydrophobicité voisines incluent la leucine, l'isoleucine, la valine; la glycine, l'alanine; l'asparagine, la glutamine; la serine, la thréonine; la phénylalanine, la tyrosine. Un récepteur ayant une fonction équivalente à GnREl-R2 réfère à un récepteur - 8 qui fixe GnRH mais pas nécessairement avec la même affinité de son équivalent natif GnRH-R2. Les séquences d'ADN de la présente invention peuvent être modifiées pour altérer la séquence codant pour GnRH-R2 pour de nombreuses raisons incluant de manière non limitative des altérations qui modifient le processus et l' expression du produit du gène. Par exemple, des mutations peuvent être introduites en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple la mutagénèse dirigée, l'insertion de nouveaux sites de restriction, l'altération des glycosylations, la phosphorylation, etc. En particulier, dans certains systèmes d' expression comme la levure, la cellule hôte peut o surglycosyler le produit du gène. Dans un tel système, il est préférable d'altérer la séquence codante de GnRH-R2 pour éliminer les sites de glycosylation. Dans l'étendue de la divulgation de la présente invention figurent également une séquence GnRH-R2 ou GnRH-R2 modifiée liée à une séquence hétérologue pour coder une protéine de fusion. La protéine de fusion peut être modifiée pour contenir une site de clivage 1S localisé entre la séquence de GnRH-R2 et la séquence de la protéine hétérologue, de For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, positively charged amino acids include lysine and arginine, amino acids with polar groups having similar hydrophobicity values include leucine, isoleucine, valine; glycine, alanine; asparagine, glutamine; serine, threonine; phenylalanine, tyrosine. A receptor with a function equivalent to GnREl-R2 refers to a receptor - 8 which fixes GnRH but not necessarily with the same affinity of its native equivalent GnRH-R2. The DNA sequences of the present invention can be modified to alter the sequence encoding GnRH-R2 for a number of reasons including, but not limited to, alterations which modify the process and expression of the gene product. For example, mutations can be introduced using techniques well known to those skilled in the art, for example site-directed mutagenesis, insertion of new restriction sites, alteration of glycosylations, phosphorylation, etc. In particular, in certain expression systems such as yeast, the host cell can o over-glycosylate the gene product. In such a system, it is preferable to alter the coding sequence of GnRH-R2 to eliminate the glycosylation sites. Also within the scope of the disclosure of the present invention is a modified GnRH-R2 or GnRH-R2 sequence linked to a heterologous sequence to encode a fusion protein. The fusion protein can be modified to contain a 1S cleavage site located between the sequence of GnRH-R2 and the sequence of the heterologous protein,
telle sorte que GnRH-R2 peut être clivé de la partie hétérologuè. such that GnRH-R2 can be cleaved from the heterologous part.
La séquence codant pour GnRH-R2, qui fait partie de la présente invention, peut être synthétisée entièrement ou en partie en utilisant des méthodes chimiques bien connues de l'homme du métier qui pourra notarument se réLérer aux publications suivantes: Caruthers et coll., Nuc. Acids Res. Symp. Ser. (1980), 7, 215-233; Crea et Horn, Nuc. Acids Res., 9(10), 2331; Matteucci et Caruthers, Tetrahedron Lett. (1980), The sequence coding for GnRH-R2, which forms part of the present invention, can be synthesized entirely or in part using chemical methods well known to those skilled in the art which may in particular refer to the following publications: Caruthers et al., nuc. Acids Res. Symp. Ser. (1980), 7, 215-233; Crea and Horn, Nuc. Acids Res., 9 (10), 2331; Matteucci and Caruthers, Tetrahedron Lett. (1980)
21, 719; et Chow et Kempe, Nuc. Acids Res. (1981), 9(12), 2807-2817. 21, 719; and Chow and Kempe, Nuc. Acids Res. (1981), 9 (12), 2807-2817.
Alternativement, la protéine elle-même peut être produite en utilisant des méthodes chimiques pour synthétiser la séquence en acides aminés de GnRH-R2 entièrement ou Alternatively, the protein itself can be produced using chemical methods to synthesize the amino acid sequence of GnRH-R2 entirely or
en partie.in part.
Dans le but d'exprimer le récepteur GnRH-R2 biologiquement actif, la séquence nucléotidique codant pour GnRH-R2 ou un équivalent fonctionnel comme décrit ci-dessus, est insérée dans un vecteur d'expression approprié, i.e., un vecteur contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codante insérce. Les produits du gène GnRH[-R2 ainsi que les cellules hôtes ou les lignées cellulaires transfectées ou transformées avec le vecteur d' expression recombinant GnRH-R2 peuvent être utilisés dans de nombreux cas qui incluent mais ne sont pas limités à la génération d'anticorps (i.e. monoclonaux ou polyclonaux) qui fixent le récepteur, y compris ceux qui inhibent de manière compétitive la fixation de GnRH et neutralisent son activité, le criblage et la sélection d'analogues de GnRH ou des produits qui agissent via le récepteur GnRH-R2, etc. Des méthodes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour construire des vecteurs d' expression contenant la séquence codant pour GnRH-R2 et les signaux de contr81es de transcription/traduction. Ces méthodes incluent les techniques in vitro d'ADN recombinant, les techniques synthétiques et les recombinaisons génétiques (cf. par exemple les techniques décrites dans Maniatis et coll., Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) et Ausubel et coll., Current Protocols in Molecular Biology, Grcene Publishing Associates et Wiley In order to express the biologically active GnRH-R2 receptor, the nucleotide sequence coding for GnRH-R2 or a functional equivalent as described above, is inserted into an appropriate expression vector, ie, a vector containing the necessary elements for transcription and translation of the inserted coding sequence. GnRH [-R2 gene products as well as host cells or cell lines transfected or transformed with the recombinant expression vector GnRH-R2 can be used in many cases which include but are not limited to the generation of antibodies (ie monoclonal or polyclonal) which bind the receptor, including those which competitively inhibit the binding of GnRH and neutralize its activity, the screening and selection of GnRH analogs or of the products which act via the GnRH-R2 receptor, etc. Methods well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing the sequence encoding GnRH-R2 and the transcription / translation control signals. These methods include in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques and genetic recombinations (see for example the techniques described in Maniatis et al., Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Grcene Publishing Associates and Wiley
o Interscience (1989), New York).o Interscience (1989), New York).
Une variété de systèmes hôtes/vecteur d' expression peut être utilisce pour exprimer la séquence codant pour GnRH-R2. Lesdits systèmes incluent mais ne sont pas limités aux microorganismes comme une bactérie transformée par un ADN recombinant de bactériophage, des vecteurs d'ADN de plasmides ou cosmides contenant la séquence codant pour GnRH-R2, des levures transformées avec des vecteurs d'expression contenant la séquence codant pour GnRH-R2, des systèmes de cellules d'insectes infectées par un vecteur d' expression viral (par exemple un baculovirus) contenant la séquence codant pour GnRH-R2, des cellules de plantes infectées par un vecteur d'expression viral (par exemple le cauliflower mosaic virus (CaMV) ou le tobacco mosaic virus (TMV)) ou transformées par un vecteur d' expression plasmidique (par exemple Ti plasmid) contenant la séquence codant pour GnRH-R2, ou un système de cellule animale infectée par un vecteur d' expression viral recombinant (par exemple A variety of host / expression vector systems can be used to express the sequence encoding GnRH-R2. Said systems include but are not limited to microorganisms such as bacteria transformed by recombinant bacteriophage DNA, plasmid or cosmid DNA vectors containing the sequence coding for GnRH-R2, yeasts transformed with expression vectors containing the coding sequence for GnRH-R2, insect cell systems infected with a viral expression vector (for example a baculovirus) containing the coding sequence for GnRH-R2, plant cells infected with a viral expression vector ( for example the cauliflower mosaic virus (CaMV) or the tobacco mosaic virus (TMV)) or transformed by a plasmid expression vector (for example Ti plasmid) containing the sequence coding for GnRH-R2, or an animal cell system infected with a recombinant viral expression vector (for example
adénovirus ou vaccinia virus).adenovirus or vaccinia virus).
Les éléments d'expression de ces systèmes varient selon le système hôte/vecteur utilisé. The expression elements of these systems vary according to the host / vector system used.
Par exemple, lorsque le clonage a lieu dans un système de cellules de mammifères, les promoteurs qui dérivent du génome de cellules de mammiferes (par exemple un promoteur métallothionéine) ou à partir de virus de mammifères (par exemple le promoteur tardif d'adénovirus (adenovirus late promoter) ou le promoteur de vaccinia For example, when cloning takes place in a mammalian cell system, the promoters which are derived from the genome of mammalian cells (for example a metallothionein promoter) or from mammalian viruses (for example the late adenovirus promoter ( adenovirus late promoter) or the vaccinia promoter
virus 7,5 K) peuvent être utilisés. 7.5 K virus) can be used.
L'invention concerne de plus le clonage de l'ADNc de GnRH-R2 dans un vecteur d'expression pCDNA 3.1. Des cellules HEK peuvent être transfectées avec la construction vecteur/GnRH-R2 de manière transitoire ou de façon stable en utilisant un The invention further relates to the cloning of the cDNA of GnRH-R2 into an expression vector pCDNA 3.1. HEK cells can be transfected with the vector / GnRH-R2 construct either transiently or stably using a
réactif Effectene selon les recommandations du fabricant (Qiagen). Reagent Effectene according to the manufacturer's recommendations (Qiagen).
De nombreuses procédures connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour la production d'anticorps contre des épitopes du récepteur GnRH-R2 produit de manière - 10 recombinante. Des anticorps neutralisants, ceux qui réalisent une compétition avec les sites de fixation à GnRH sur le récepteur GnRH-R2 sont préférés pour une utilisation Many procedures known to those skilled in the art can be used for the production of antibodies to epitopes of the recombinantly produced GnRH-R2 receptor. Neutralizing antibodies, those which compete with GnRH binding sites on the GnRH-R2 receptor are preferred for use
dans des méthodes de diagnostic ou thérapeutiques. in diagnostic or therapeutic methods.
Pour la production d' anticops, différentes espèces d' animaux peuvent être immunisées For the production of anticops, different species of animals can be immunized
s par injection de GnRH-R2 (y compris, notamment, les lapins, les souris, les rats, etc.). s by injection of GnRH-R2 (including, in particular, rabbits, mice, rats, etc.).
Des adjuvants peuvent être utilisés pour augmenter la réponse immunologique, dépendant de l'espèce hôte, notamment le réactif de Freund, des gels minéraux comme l'hydroxide d'aluminium, des substances ayant des surfaces activées comme la lysoélicithine, des polyols pluroniques, des polyanions, des peptides, des huiles o minérales, du dinitrophénol, etc. Des anticorps monoclonaux contre GnRH-R2 peuvent étre préparés en utilisant n'importe quelle technique qui permet la production de molécules d'anticorps dans des cultures de lignces cellulaires comme, par exemple, les techniques d'hybridomes onginellement décrites par Kohler et Milstein (Nature (1975), 256, 495-497), la technique d'hybridome de cellules B (Kosbor et coll., Immunology Today (1983), 4, 72; Cote et coll. , Proc. Natl. Acad. Sci. (1983), 80, 2026-2030). Des fragments d'anticorps reconnaissant les sites spécifiques de liaison de GnRH-R2 peuvent être générés par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. De tels fragments comprennent notamment les fragments F(ab')2 qui peuvent être obtenus par Adjuvants can be used to increase the immunological response, depending on the host species, in particular the Freund's reagent, mineral gels like aluminum hydroxide, substances with activated surfaces like lysoelicithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, mineral oils, dinitrophenol, etc. Monoclonal antibodies to GnRH-R2 can be prepared using any technique which allows the production of antibody molecules in cell line cultures such as, for example, the hybridoma techniques previously described by Kohler and Milstein (Nature (1975), 256, 495-497), the B cell hybridoma technique (Kosbor et al., Immunology Today (1983), 4, 72; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1983 ), 80, 2026-2030). Antibody fragments recognizing the specific binding sites of GnRH-R2 can be generated by standard techniques well known to those skilled in the art. Such fragments include in particular the F (ab ') 2 fragments which can be obtained by
digestion trypsique de la molécule d'anticorps. tryptic digestion of the antibody molecule.
L'ADN de GnRH-R2, les oligonocléotides anti-sens, les produits d'expression de GnRH-R2, les anticorps et les lignées cellulaires hôtes exprimant GnRH-R2 décrits ci-dessus sont utiles dans le domaine du diagnostic et en thérapeutique, mais également GnRH-R2 DNA, antisense oligonocleotides, GnRH-R2 expression products, antibodies and host cell lines expressing GnRH-R2 described above are useful in the diagnostic field and in therapy, but also
pour la recherche pharmacologique et la découverte de médicaments. for pharmacological research and drug discovery.
Par exemple, la séquence d'ADN de GnRH-R2 peut être utilisée dans des essais d'hybridation sur biopsies pour diagnostiquer une expression anormale de GnRH-R2, par exemple une analyse par les techniques de Southern et de Northern, incluant les essais d'hybridation in situ. Ds le domaine thérapeutique, des molécules anti-sens définies sur la base de la séquence d'ADN de GnRH-R2 peuvent être utilisées pour bloquer le transport et l'expression de GnRH-R2. Alternativement, 1'ADN de GnRH-R2 peut être utilisé en thérapie génique pour introduire le gène normal recombinant dans des cellules défectives ou pour corriger des matations afn de reconstituer GnRH-R2 et For example, the DNA sequence of GnRH-R2 can be used in biopsy hybridization assays to diagnose an abnormal expression of GnRH-R2, for example analysis by Southern and Northern techniques, including assays of in situ hybridization. In the therapeutic field, antisense molecules defined on the basis of the DNA sequence of GnRH-R2 can be used to block the transport and expression of GnRH-R2. Alternatively, the DNA of GnRH-R2 can be used in gene therapy to introduce the recombinant normal gene into defective cells or to correct matations in order to reconstitute GnRH-R2 and
sa fonction.his function.
Egalement selon la présente invention, des anticorps spécifiques contre GnRH-R2 peuvent être utilisés pour déterminer le prof1 d'expression du récepteur dans des - 11 biopsies de tissus, ou pour permettre des diagnostics à partir d'imagerie médicale réalisce in vivo. Par exemple, un anticorps couplé à une entité de détection en imagerie Also according to the present invention, specific antibodies against GnRH-R2 can be used to determine the prof1 of expression of the receptor in tissue biopsies, or to allow diagnostics from medical imaging performed in vivo. For example, an antibody coupled to a detection entity in imaging
peut être administré à un patient pour localiser la distribution de GnRHR2 in vivo. can be administered to a patient to locate the distribution of GnRHR2 in vivo.
Toujours selon l' invention, le récepteur GnRH-R2, ou un fragment de celui-ci contenant son site de fixation, peut être administré in vivo. Le récepteur libre ou le fragment peptidique de celui-ci peut réaliser une compétition pour la fixation de GnRH et inhiber Still according to the invention, the GnRH-R2 receptor, or a fragment thereof containing its binding site, can be administered in vivo. The free receptor or the peptide fragment thereof can compete for the binding of GnRH and inhibit
son interaction avec le récepteur natif in vivo. its interaction with the native receptor in vivo.
A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par o un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevets, tous les brevets et toutes autres références Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as that commonly understood by an ordinary specialist in the field to which this invention belongs. Likewise, all publications, patent applications, all patents and all other references
mentionnées ici sont incorporées par référence. mentioned here are incorporated by reference.
Les paragraphes qui suivent décrivent une méthode pour cloner un ADNc codant pour The following paragraphs describe a method for cloning a cDNA encoding
le récepteur GnRH-R2.the GnRH-R2 receptor.
Is.,C,,I,o,,nage du re',c,teur.GnRH,-,,R,2 Dans un premier temps, une réaction de polymérisation en châîne (PCR) est réalisée sur une série de banques d'ADNc disponibles commercialement de tissus du cerveau ou de l'hypophyse dans lesquels GnRH est habituellement exprimé (cf. Kakar et coll., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 189, 289-295) en utilisant les amorces F1 de séquence SEQ. ID. NO. 1 et R1 de séquence SEQ. ID. NO. 2. Ces séquences, reproduites ci-après, contiennent respectivement des séquences de sites de restriction Is., C ,, I, o ,, nage du re ', c, tor.GnRH, - ,, R, 2 First, a chain polymerization reaction (PCR) is carried out on a series of libraries Commercially available cDNAs from brain or pituitary tissues in which GnRH is usually expressed (cf. Kakar et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 189, 289-295) using primers F1 of sequence SEQ. ID. NO. 1 and R1 of sequence SEQ. ID. NO. 2. These sequences, reproduced below, respectively contain restriction site sequences
HindIII et EcoRI.HindIII and EcoRI.
Les séquences SEQ. ID. NO. 1 et SEQ. ID. NO. 2 des amorces F1 et R1 sont les suivantes: s - SEQ. ID. NO. 1: 5'- GCA AGC TTC CAC CAT GTC TGC AGG C3' SEQ sequences. ID. NO. 1 and SEQ. ID. NO. 2 of primers F1 and R1 are the following: s - SEQ. ID. NO. 1: 5'- GCA AGC TTC CAC CAT GTC TGC AGG C3 '
- SEQ. ID. NO. 2: 5'- CGG AAT TCG GGG GGA ACT AGG AG -3' - SEQ. ID. NO. 2: 5'- CGG AAT TCG GGG GGA ACT AGG AG -3 '
Les conditions de réaction incluent O,5 I1M de F1 (de séquence SEQ. ID. NO. 1) et de R1 (de séquence SEQ. ID. NO. 2), 200 M de déoxyoucléotides triphosphate (ou dNTPs: dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 10 mM Tris-HC1 (pH 8,3) , 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2 et 0,5 U Taq ADN polymérase dans un volume final de 50 p1. Les paramètres de cycles thermiques comprennent une dénaturation à 94 C pendant 30 s, une hybridation des amorces à 60 C pendant 1 minute et une extension de The reaction conditions include 0.5 μM of F1 (of sequence SEQ. ID. NO. 1) and of R1 (of sequence SEQ. ID. NO. 2), 200 M of deoxyucleotide triphosphate (or dNTPs: dATP, dCTP, dGTP and dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCI, 1.5 mM MgCl2 and 0.5 U Taq DNA polymerase in a final volume of 50 p1. Thermal cycle parameters include denaturation at 94 C for 30 s, hybridization of primers at 60 C for 1 minute and extension of
polymérisation à 72 C pendant 30 s (avec une extension finale de 5 minutes). polymerization at 72 ° C. for 30 s (with a final extension of 5 minutes).
Les produits de PCR sont ensuite séparés sur gel d'agarose 1% et visualisés par une The PCR products are then separated on 1% agarose gel and visualized by a
coloration au bromure d'éthidium.staining with ethidium bromide.
La séquence en acides nucléiques obtenue ainsi contient les sites de restriction HindIII dans la partie 5' et EcoRI dans la partie 3', permettant une insertion directement dans un vecteur d'expression, par exemple un vecteur d'expression de type pCDNA3.1 (InVitrogen). Après l'étape d'amplification par PCR présentée ci-dessus, les produits sont soumis à 0 une hydrolyse HindIII et EcoRI afin de libérer des extrémités contenant ces séquences puis purifiés à partir du gel d'agarose par électroélution. La séquence obtenue est ensuite insérée dans un vecteurd'expression comme par exemple pCDNA3. 1 (InVitrogen). L'analyse par digestion par des enzymes de restriction convenables de différents clones bactériens ayant reçu ledit vecteur d'expression permet d'isoler les 1 5 clones bactériens contenant la nouvelle construction " vecteur d' expression / The nucleic acid sequence thus obtained contains the HindIII restriction sites in the 5 'part and EcoRI in the 3' part, allowing insertion directly into an expression vector, for example an expression vector of pCDNA3.1 type ( Invitrogen). After the PCR amplification step presented above, the products are subjected to 0 HindIII and EcoRI hydrolysis in order to release ends containing these sequences and then purified from the agarose gel by electroelution. The sequence obtained is then inserted into an expression vector such as for example pCDNA3. 1 (InVitrogen). Analysis by digestion with suitable restriction enzymes of different bacterial clones having received said expression vector makes it possible to isolate the 15 bacterial clones containing the new construction "expression vector /
polynucléotide codant pour GnRH-R2 ". polynucleotide encoding GnRH-R2 ".
La préparation en grande quantité de ces constructions plasmidiques est réalisée à l'aide The preparation in large quantities of these plasmid constructs is carried out using
d'un kit de purification d'ADN plasmidique (Qiagen). a plasmid DNA purification kit (Qiagen).
L'intérêt de l'invention dans le domaine thérapeutique peut être apprécié à l'aide des The advantage of the invention in the therapeutic field can be appreciated using the
tests pharmacologiques décrits ci-après. pharmacological tests described below.
Tests pharmacologiques A) Affinité de GnRH pour le récepteur GnRH-R2: Pharmacological tests A) Affinity of GnRH for the GnRH-R2 receptor:
Les cellules sont récupérces 48 h après la transtection par un traitement à la trypsine. The cells are recovered 48 h after transtection by a treatment with trypsin.
Pour la préparation membranaire, les membranes des cellules transfectées avec le récepteur humain GnRH-R2 sont diluées à la concentration de 100 ug/ml dans le tampon réactionnel contenant 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM de MgCl2, 100,ug/ml de bacitracine et 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA) . Les membranes sont incubées avec 0,2 nM de ['2sI]D-Trp6-GnRH (NEN) dans un volume final de 200 1ll pendant 1 heure à 4 C. La réaction est arrêtée par une filtration rapide sur des filtres 96 puits GF/1 pré- chargés à 0,5 % en polyéthylènimine. Les filtres sont ensuite lavés trois fois à 4 C avec du tampon de lavage contenant 50 mM Tris (pH 7,4) en utilisant une station de filtration Packard 96 puits. Les filtres ainsi séchés sont submergés de 40,ul de cocktail scintillant (Microscint O. Packard) et sont soumis à un comptage sur le Topcount (Packard). L'activité non-spécifique est déterminée en présence de 100 nM de D-Trp6- GnRH. Une courbe dose-réponse est générée pour D-Trp6-GnRH (0,001 nM à 100 nM) et permet de montrer l'affinité de GnRH pour le récepteur GnRH-R2. B) Modulation de la production d'Inositol Phosphate: La production d'Inositol Phosphate (IP) stimulée par GnRH est déterminée selon la méthode de Davidson et coll., Endocrinology (1990), 126, 80-87. En résumé, les cellules transfectées par GnRH-R2 sont incubées 18 h en présence de [H3]Inositol et stimulées avec 100 nM de GnRH en présence de chlorure de lithium. La réaction est stoppée par l'addition d'acide formique 0,1 M à 4 C. Après neutralisation avec du Tris/Base 1 M, les Inositol Phosphates sont séparés sur une colonne échangeuse d'ions (Biorad) et comptés. Les résultats obtenus permettent d'apprécier la modulation de la For the membrane preparation, the membranes of the cells transfected with the human GnRH-R2 receptor are diluted to the concentration of 100 μg / ml in the reaction buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM of MgCl2, 100 , ug / ml bacitracin and 0.1% bovine serum albumin (BSA). The membranes are incubated with 0.2 nM of ['2sI] D-Trp6-GnRH (NEN) in a final volume of 200 μl for 1 hour at 4 C. The reaction is stopped by rapid filtration on 96-well GF filters / 1 preloaded at 0.5% polyethyleneimine. The filters are then washed three times at 4 ° C. with washing buffer containing 50 mM Tris (pH 7.4) using a Packard 96-well filtration station. The filters thus dried are submerged with 40 μl of scintillating cocktail (Microscint O. Packard) and are subjected to counting on the Topcount (Packard). The non-specific activity is determined in the presence of 100 nM of D-Trp6-GnRH. A dose-response curve is generated for D-Trp6-GnRH (0.001 nM to 100 nM) and makes it possible to show the affinity of GnRH for the GnRH-R2 receptor. B) Modulation of Inositol Phosphate Production: The production of Inositol Phosphate (IP) stimulated by GnRH is determined according to the method of Davidson et al., Endocrinology (1990), 126, 80-87. In summary, the cells transfected with GnRH-R2 are incubated for 18 h in the presence of [H3] Inositol and stimulated with 100 nM of GnRH in the presence of lithium chloride. The reaction is stopped by the addition of 0.1 M formic acid at 4 C. After neutralization with 1 M Tris / Base, the Inositol Phosphates are separated on an ion exchange column (Biorad) and counted. The results obtained make it possible to appreciate the modulation of the
production d'Inositol Phosphate par le récepteur GnRH-R2. production of Inositol Phosphate by the GnRH-R2 receptor.
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