FR2822162A1 - Molecules d'acides nucleiques codant une dextrane-saccharase calatalysant la synthese de dextrane portant des ramifications de type alpha-1,2 osidiques - Google Patents

Abstract

La présente invention porte sur un polypeptide isolé ayant une activité enzymatique de glycosyltransférase apte à former des dextranes présentant des ramifications alpha (1 <T 1028> 2) comprenant au moins un domaine de liaison au glucane et un domaine à activité catalytique situé en aval du domaine de liaison au glucane. Elle porte également sur des polynucléotides codant lesdits enzymes et les vecteurs les contenant.

Description

<Desc/Clms Page number 1>

MOLECULES D'ACIDES NUCLEIQUES CODANT UNE DEXTRANE-
SACCHARASE CATALYSANT LA SYNTHESE DE DEXTRANE PORTANT DES RAMIFICATIONS DE TYPE ALPHA-1, 2 OSIDIQUES
La présente invention relève du domaine de la glycotechnologie et plus particulièrement de la synthèse d'oligosaccharides ou oligosides à effet prébiotique, thérapeutique ou diagnostique.

La présente invention porte sur des molécules d'acides nucléiques codant une enzyme ayant une activité de glycosyltransférase catalysant la synthèse de dextranes ou d'oligosides portant des ramifications de type a (1- 2) osidiques.

L'invention porte en outre sur les enzymes synthétisées par les acides nucléiques selon l'invention, ainsi que sur leurs systèmes d'expression dans des cellules procaryotes ou eucaryotes. Elles portent enfin sur l'utilisation desdites enzymes dans la production d'oligosaccharides dans l'alimentation, ou en tant que principe actif de produits thérapeutiques et/ou cosmétiques.

Les oligosides et hétérooligosides jouent le rôle de signaux de reconnaissance et d'effecteur chez l'animal comme dans les plantes (on parle alors d'oligosaccharines), en se liant spécifiquement à des lectines, des glycosyltransférases, des glycosidases, des molécules d'adhésion, etc... Ainsi, les déterminants antigéniques des groupes sanguins sont des osides, et notre défense contre nombre de bactéries pathogènes est dirigée contre les structures osidiques de l'enveloppe bactérienne. Par ailleurs, l'une des raisons majeures du rejet des xénogreffes est l'existence de structures osidiques propres à chaque espèce. Ces propriétés, ainsi que les connaissances acquises ces dernières années sur les glycosyltransférases et les lectines, contribuent à faire de certains oligosides des candidats de choix pour la thérapeutique ou la prophylaxie des désordres liés à l'équilibre microbiologique de différents organes tels

<Desc/Clms Page number 2>

l'intestin, ou la peau. Par exemple, les oligosides constituent une alternative intéressante à l'utilisation de microorganismes et d'antibiotiques pour réguler la composition de la flore intestinale (effet prébiotique). Certains oligosides peuvent être considérés comme des"fibres solubles"lorsqu'ils ne sont pas métabolisés par les enzymes digestives humaines et animales ; en gagnant le colon, ils interagissent avec la flore microbienne et affectent spécifiquement la croissance et l'adhésion de certaines espèces.

Incorporées à faible dose (moins de 1 %) dans l'alimentation, certaines de ces molécules osidiques améliorent l'état de santé et stimulent la prise de poids des animaux.

Une revue des différentes glycosyltransférases, leur structure et leur activité, est décrite dans Vincent Monchois et al. (réf. 1).

Brièvement : a) Il apparaît que la structure des glycosyltransférases et/ou dextrane-saccharases étudiées est très conservée et est constituée, partant de la partie aminée de la protéine, d'une séquence signal, d'un domaine variable, d'un domaine catalytique et d'un domaine de liaison au glucane. b) Les glucooligosides (GOS) sont synthétisables par des glycosyltransférases telles les dextrane-saccharases, à partir de substrats peu coûteux tel le saccharose et en présence d'un sucre accepteur de

glucose. D'autres substrats, tels l'a-D-fluoro-glucose, le paranitrophényl-aD-glucopyranoside, l'a-D-glucopyranoside-a-D-sorbofuranoside ou le 4-0a-D-galactopyranosylsucrose peuvent également être utilisés.

Ces enzymes catalysent à partir du substrat le transfert d'unités glucose sur des molécules acceptrices. En présence d'un accepteur de glucose tel le maltose, ou l'isomaltose, les glycosyltransférases catalysent la synthèse d'oligosaccharides de bas poids moléculaire comprenant majoritairement des chaînes de 3 à 7 glucoses. En revanche, en absence d'accepteur, l'enzyme synthétise des glucanes de haut poids moléculaire de type dextrane.

<Desc/Clms Page number 3>

c) Les structures et la fonction des glucanes ou des oligosides synthétisés par les glycosyltransférases dépendent de la souche bactérienne productrice.

Dans l'ensemble de ce texte, on appellera de façon générique des glycosyltransférases les différentes enzymes capables de catalyser la synthèse de polymères de glucose à partir de saccharose. Elles sont généralement produites par des souches bactériennes de type Leuconostoc, Lactococcus, Streptococcus ou Neisseria. La taille et la structure des glucanes produits dépendent de la souche productrice.

Les unités de glucose sont couplées par des liaisons osidiques a (1-6) comme dans le dextrane, par des liaisons &alpha;(1#3), comme dans le cas du mutane, ou par une alternance des deux types (alternane).

De la même façon, l'existence et la nature des ramifications, leur longueur et leur position varient selon l'origine de la souche productrice.

Les glycosyltransférases produisant des glucanes ou des GOS contenant au moins 50 % de liaison a (1o6) sont appelées dextranesaccharases. Celles ci sont produites notamment par des bactéries de type Leuconostoc mesenteroides. d) La dextrane-saccharase de L. mesenteroides NRRL B- 1299 a la particularité de produire, quant à elle, un dextrane hautement ramifié dont la majorité des ramifications sont de type a (1- > 2). Utilisée en présence de saccharose et de maltose, molécule acceptrice de glucose, elle conduit à la formation de GOS présentant pour certains une liaison a (12) à leur extrémité non réductrice et pour d'autres des ramifications a (1- > 2) sur les résidus intermédiaires entre les extrémités. A ce titre, ils

résistent à la dégradation par les enzymes (hydrolases) du tractus digestif supérieur, chez l'homme et l'animal, et ne sont dégradés que par les bactéroïdes, bénéfiques à l'organisme. Un phénomène identique se produit au niveau de la peau, permettant d'envisager des applications en

<Desc/Clms Page number 4>

cosmétologie, car c'est le déséquilibre de la flore microbienne cutanée qui est à l'origine de nombreux problèmes cosmétiques et dermatologiques. C'est en raison de ces caractéristiques qu'ils sont désignés ici par le terme GOS d'intérêt.

Dans l'ensemble du texte, les polysaccharides synthétisés par les glycosyltransférases selon l'invention sont soit des dextranes de haut poids moléculaire lorsque la réaction est réalisée sans accepteur de glucose, soit des oligosides lorsque la réaction est réalisée en présence d'accepteur de glucose tel le maltose ou l'isomaltose sans que cela soit nécessairement spécifié. En effet, la fonctionnalité de l'enzyme est caractérisée par la nature des liaisons glucose-glucose (a (1-6), a (1- > 2)) ou autres et non par le poids moléculaire du polysaccharide synthétisé.

Les dextrane-saccharases de L. mesenteroides trouvent déjà de nombreuses applications dans l'industrie, et en particulier celles de la souche NRRL B-1299 pour lesquelles un procédé de synthèse des GOS présentant des ramifications a (1-2) a été décrit dans le brevet EP 0325 872 B1.

Marguerite Dois et al. (2) ont montré que les GOS produits par les dextrane-saccharases de cette souche sont en fait un mélange d'au moins trois familles de molécules similaires différant de fait par le nombre et le positionnement des ramifications de type a (1-2), ce qui amène l'hypothèse de l'existence de différentes activités enzymatiques de type glycosyltransférase dans cette souche bactérienne.

Compte tenu de l'intérêt industriel dans le domaine des aliments prébiotiques, en cosmétologie ou en pharmacie des GOS présentant des ramifications a (1-2) et rappelé ci-dessus, la présente invention vise à isoler et caractériser une enzyme particulière parmi celles produites par L mesenteroides NRRL B-1299 qui serait plus particulièrement impliquée dans la synthèse d'oligosides présentant les ramification a (1-'-2). L'identification et la caractérisation d'une telle enzyme offrent l'avantage, d'une part, de fournir un procédé de production uniforme

<Desc/Clms Page number 5>

et reproductible des GOS d'intérêt et, d'autre part, d'identifier les caractéristiques essentielle de l'enzyme productrice de ces GOS d'intérêt, afin, le cas échéant, d'améliorer les performances des produits de la réaction enzymatique en fonction de l'utilisation envisagée.

Le problème technique sous-tendu dans la présente invention était ainsi de pouvoir disposer d'une enzyme et donc des acides nucléiques isolés codant cette enzyme permettant la production améliorée de GOS à ramifications a (1-)-2).

La présente invention apporte une solution technique aux différentes questions évoquées ci-avant en fournissant une nouvelle dextrane-saccharase, appelée DSR-D codée par un gène doté d'une structure nouvelle et inattendue (dsrD) et capable de catalyser la synthèse des glucanes ou des oligosaccharides contenant des ramifications a (1-2).

Par structure nouvelle et inattendue, on entend le fait que l'organisation de la protéine diffère de celle de toutes les autres glycosyltransférases décrites à ce jour (1) et dont le domaine catalytique est situé en amont d'un domaine de liaison au glucane, ce dernier constituant la partie carboxylique de la protéine.

Ainsi, la présente invention porte sur un polypeptide isolé ayant une activité enzymatique de glycosyltransférase apte à former des dextranes présentant des ramifications a (1-2), caractérisé en ce qu'il comprend au moins un domaine de liaison au glucane et un domaine à activité catalytique situé en aval du domaine de liaison au glucane. Par situé en aval, on entend le fait que la partie aminée de la séquence à activité catalytique ou Domaine catalytique est proximale de la partie carboxylique du domaine de liaison au glucane. Ces deux domaines peuvent être immédiatement contigus ou au contraire séparés par une région variable.

La glycosyltransférase selon l'invention comporte de préférence un peptide signal.

<Desc/Clms Page number 6>

Dans un mode de réalisation de l'invention, la glycosyltransférase comprend deux domaines catalytiques situés de part et d'autre du domaine de liaison au glucane.

La présence d'un domaine à activité catalytique dans la partie carboxylique de l'enzyme est une caractéristique essentielle de cette dernière dans sa capacité à former des liaisons a (1-2) osidiques. En effet, comme le montrent les expériences décrites ci-après, la délétion de ce domaine dans une enzyme ayant au moins deux domaines catalytiques conduit à la production de glucanes ou d'oligosides ayant essentiellement des liaisons osidiques de type a (1 6) et dépourvus de liaisons de type a (12).

L'analyse comparative des différentes glycosyltransférases incluant les dextrane-saccharases a mis en évidence un très fort degré de conservation de leur domaine catalytique.

Le domaine catalytique situé dans la partie carboxy-terminale de la glycosyltransférase selon l'invention a une séquence présentant au moins 44 % d'identité et 55 % de similarité avec les domaines catalytiques des autres glycosyltransférases analysées. En particulier, le domaine catalytique dans la partie carboxylique de la glycosyltransférase selon l'invention a au moins 65 % d'identité et au moins 80 % de similarité avec la séquence ID No. 1 représentée dans la figure 7, la triade catalytique Asp/Glu/Asp en positions respectives 2210/2248/2322 étant conservée.

Dans l'ensemble du texte, on entend par X% de similarité par rapport à une séquence de référence le fait que X % des acides aminés sont identiques ou modifiés par substitution conservative telle que définie dans le logiciel d'alignement des séquences d'acides aminés ClustalW (http :///bioweb. pasteur. fr/docs/doc-c ! ensoft/ctustatw//) et que (100-X) % peuvent être délétés, substitués par d'autres amino-acides, ou encore que (100-X) % peuvent être ajoutés à la séquence de référence.

<Desc/Clms Page number 7>

Une structure primaire particulière de l'enzyme selon l'invention est représentée dans la séquence ID No. 2 qui représente une séquence de 2835 acides aminés d'une dextrane-saccharase de L. mesenteroides B1299.

Cette dextrane-saccharase, nommée DSR-D, possède comme la plupart des glycosyltransférases et des dextrane-saccharases une séquence signal, une région variable faiblement conservée, un domaine catalytique hautement conservé (CD1), un domaine de liaison au glucane (GBD) et un

deuxième domaine catalytique (CD2) dans la partie carboxylique de la protéine. DSR-D est la première glycosyltransférase analysée et présentant deux domaines catalytiques, dans la configuration présentée dans la figure 1 b). C'est également la première glycosyltransférase dont un domaine catalytique est situé dans la partie carboxylique de la protéine.

La figure 1 b fait apparaître également que le domaine de liaison au glucane est sensiblement plus long que celui décrit précédemment pour les dextranes saccharases connues ; ainsi, une autre caractéristique des enzymes selon l'invention est la taille de ce domaine qui est supérieur à 500 amino-acides.

La comparaison et l'analyse de la séquence de DSR-D avec les séquences des glycosyltransférases ou des dextrane-saccharases déjà décrites (1), ainsi que les moyens utilisés à cette fin sont indiqués dans l'exemple 2 détaillé ci-après. Il y apparaît clairement que si l'existence de deux domaines catalytiques différencie substantiellement DSR-D des autres enzymes, en revanche les séquences desdits domaines sont substantiellement conservées. En particulier, les acides aminés nécessaires à l'activité catalytique sont conservés dans le deuxième domaine catalytique, à savoir la triade Asp/Glu/Asp située aux positions

respectives 2210/2248/2322 de la séquence ID No. 2, représentée dans la figure 8.

Ainsi, l'invention porte également sur tout polypeptide isolé ayant une activité catalytique de glycosylstransférase apte à former des dextranes ou des oligosaccharides ayant des ramifications a (1-+2) tel qu'obtenu par modification, substitution, insertion ou délétion de séquences d'amino-acides mais comportant des séquences présentant au moins 80 %

<Desc/Clms Page number 8>

et de préférence au moins 90 % de similarité avec les séquences suivantes de la séquence ID No. 2 : 423-439 478-501 519-539 560-571 631-645 1014-1021 2120-2138 2161-2184 2202-2214 2243-2250 2315-2322 2689-2696
De façon préférée, enfin, un polypeptide à activité catalytique selon l'invention contient les acides aminés suivants :
W en positions 425 et 2122,
E en positions 430,565 et 2127,2248
D en positions 487,489, 527,638, 2170,2172, 2210 et
2322,
H en position 637 et 2321
Q en position 1019 et 2694.

Les polypeptides à activité de glycosyltransférases aptes à former des liaisons osidiques a (1 2) peuvent se présenter sous forme isolée, ou au contraire intégrés dans une protéine plus large, comme par exemple une protéine de fusion. Il peut être en effet avantageux d'inclure des séquences présentant une autre fonction, comme par exemple une séquence étiquette spécifique d'un ligand permettant d'en faciliter la purification. Ces séquences étiquettes peuvent être du type GST (glutathion-S-Transférase), Intéine-CBD (Chitine-Binding Domain), (commercialisé par New England Biolabs, http ://ww. neb. com), MBD (Maltose Binding Domain), polypeptides contenant des résidus histidine contigus permettant de faciliter la purification du polypeptide avec lequel il est fusionné. L'homme du métier peut concevoir toute autre protéine de fusion permettant d'associer la fonction de la DSR-D de l'invention avec une autre fonction, comme par exemple, et sans être limitatif, une

<Desc/Clms Page number 9>

séquence augmentant la stabilité de l'enzyme produite par expression dans un hôte recombinant ou une séquence apte à augmenter la spécificité ou l'efficacité d'action de cette enzyme, ou une séquence visant à associer une autre activité enzymatique connexe.

De telles protéines de fusion font également partie de l'invention dès lors qu'elles contiennent le domaine CD2 et le site de liaison au glucane. De la même façon, les fragments de la séquence ID No. 2, comprenant au moins la séquence ID No. 1 et le domaine de liaison au glucane, seuls ou intégrés dans une séquence polypeptidique plus large font partie de l'invention, à partir du moment où l'activité enzymatique de dextrane-saccharase est conservée.

Les variants des séquences polypeptidiques définies cidessus font également partie de l'invention. Outre les polypeptides obtenus par substitution conservative des acides aminés telle que définie plus haut, les variants incluent des polypeptides dont l'activité enzymatique est améliorée par exemple par mutagenèse dirigée ou aléatoire, par évolution moléculaire, ou par duplication du domaine catalytique CD2.

La structure particulière de cette enzyme identifiée dans la présente invention résulte d'un processus comprenant : a) l'identification et l'isolement de la dextrane-saccharase de L mesenteroides catalysant la production des GOS d'intérêt portant les ramifications a (1-)-2) ; b) le séquençage de fragments de l'enzyme ;

c) la synthèse d'amorces d'amplification aptes à amplifier le gène correspondant de la souche productrice ou des fragments de ceux-ci ; d) le séquençage des fragments amplifiés ; e) le clonage dans des vecteurs spécifiques et leur expression dans des hôtes appropriées.

Les modalités du procédé mis en oeuvre sont détaillées dans la partie expérimentale ci-après. La première étape consiste en une séparation des protéines par électrophorèse en gel de polyacrylamide, et

<Desc/Clms Page number 10>

identification des bandes présentant l'activité de dextrane saccharase par une réaction enzymatique in situ en présence de substrat et d'accepteur. La nature des GOS synthétisés est ensuite identifiée sur chaque bande par analyse HPLC selon les méthodes décrites dans (1). Le temps de rétention des oligosides en HPLC dépend de la nature et de l'organisation de leurs liaisons osidiques. Il est possible en particulier de distinguer ceux constitués de résidus liés en a (1-6), en a (1-)-6) avec une ramification a (1-2) à l'extrémité non réductrice de la molécule, et ceux recherchés composés d'une chaîne linéaire a (1-6) avec des ramifications a (12).

Les inventeurs ont donc isolé et identifié la dextranesaccharase de L. mesentéroides NRRL B-1299 productrice des GOS d'intérêt.

Un procédé d'ingénierie reverse mis en oeuvre dans les étapes b) à e) ci-dessus a permis ensuite de fournir la séquence nucléotidique codant l'enzyme et permettant de la produire en quantité industrielle et le cas échéant de la modifier, d'en améliorer ses performances par les techniques à la disposition de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer la mutagénèse dirigée ou aléatoire, ou l'évolution moléculaire (DNA shuffling) (3).

Un autre aspect de l'invention porte sur une molécule d'acide nucléique isolée codant une enzyme à activité glycosyltransférase apte à former des dextranes ou des oligosides présentant des ramifications a (1-+2) et comprenant au moins une séquence codant un domaine de liaison au glucane, et au moins une séquence nucléotidique codant un domaine catalytique situé en 3'de la précédente, ladite séquence codant un domaine catalytique ayant au moins 50 % et de préférence au moins

70 % de similarité avec la séquence ID No. 3 représentée dans la figure 9.

Par similarité, on entend le fait que, pour un même cadre de lecture, un triplet donné est traduit par le même acide aminé. Ce terme inclut donc les modifications de bases résultant de la dégénérescence du code génétique.

<Desc/Clms Page number 11>

Le pourcentage de similarité est déterminé en comparant une séquence donnée avec la séquence de référence. Lorsque celles-ci sont de longueurs différentes, le pourcentage de similarité est basé sur le pourcentage de nucléotides de la séquence la plus courte similaires à ceux de la séquence la plus longue.

Le degré de similarité peut être déterminé

conventionnellement par utilisation de logiciels tels le ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680) distribués par Julie Thompson (ThompsonEMBL-Heidelberq. DE) et Toby Gibson (Gibson&commat;EMBL-Heidelberg.DE) du Laboratoire Européen de Biologie Moléculaire, Meyerhosfstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany. ClustalW peut aussi être chargé à partir de plusieurs sites web incluant IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire,

B. P. 163, 67404 Illkirch cedex France ; ftp ://ftp-iqbmc. u-strabq. fr/pub/) et EB ! (ftp ://ftp. ebi. ac. uk/pub/software/) et tous les sites renvoyant à l'institut de Bioinformatique, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK).

Les acides nucléiques isolés selon l'invention peuvent comprendre notamment d'autres séquences destinées à améliorer l'expression et/ou l'activité de l'enzyme produite.

Il peut s'agir à titre d'exemple : - des séquences codant une séquence signal pour leur sécrétion ; - une duplication de la séquence codant le domaine catalytique CD2.

De façon préférée, un acide nucléique isolé selon l'invention comprend : a) deux séquences codant des domaines catalytiques ayant au moins 50 %, et de préférence au moins 80 % de similarité avec la séquence ID n 3 ;

<Desc/Clms Page number 12>

b) une séquence codant le domaine de liaison au glucane, cette dernière étant située de préférence entre les deux séquences en a).

Un acide nucléique selon l'invention pourra comprendre en outre : - un promoteur, apte à son expression dans une cellule hôte choisie, - une séquence codant un peptide signal, et/ou - une ou des séquences variables, cette ou ces séquence (s) étant toutes situées en partie 5'des séquences codant le ou les domaine (s) catalytique (s).

Un exemple particulier d'un acide nucléique isolé selon l'invention comprend plus particulièrement : a) la séquence ID No. 4 représentée dans la figure 10, b) une séquence présentant au moins 80 % de similarité avec la séquence ID nu 4, ou c) le brin complémentaire de la séquence a) ou b), ou d) une séquence hybridant a), b) ou c).

L'hybridation en d) est réalisée en conditions standard, et de préférence en conditions stringentes. Par hybridation en condition

stringente, on entend le fait qu'il existe une identité de séquences d'au moins 80 % de la séquence que l'on cherche à hybrider et de préférence une identité d'au moins 90 % de la séquence que l'on cherche à hybrider, dans des conditions décrites par exemple dans Sambrook et al. (3eme édition, 2001, ColI. Spring Harbour, Laboratory Press, Coll. Spring Harbour, NY).

L'invention porte également sur un gène codant une dextranesaccharase apte à former au moins 15. % de ramifications a (1-2). Outre la séquence codante, le gène comprend les séquences permettant l'initiation de la transcription ainsi que les séquences permettant l'attachement de l'ARN messager au ribosome (RBS). La séquence ID No. 5 représentée

<Desc/Clms Page number 13>

dans la figure 11 représente une structure du gène tel qu'isolé de L. mesentéroiöes NRRL B-1299.

Les nucléotides en amont de !'ATG d'initiation de la traduction sont numérotés 1 à 232.

On peut identifier l'existence d'une séquence RBS entre les nucléotides 218 et 223, ainsi que les séquences consensus-35 et-10 situées entre les nucléotides 82 et 86 (TTGAA), d'une part et 100 et 105 (ATAAT), d'autre part.

Toute séquence d'acide nucléique hybridable avec l'ADN de la séquence ID No. 4 ou son brin complémentaire est susceptible de coder une enzyme ayant les propriétés et caractéristiques de l'enzyme selon l'invention. Ceci s'applique tant aux séquences naturelles existant dans d'autres micro-organismes que L. mesenteroides NRRL-1299 et isolées de banques génomiques de micro-organismes, que celles préparées par génie génétique ou par synthèse chimique.

En particulier, les séquences en amont de l'A TG d'initiation de la traduction et nécessaires à l'expression de la protéine peuvent être avantageusement substituées par des séquences d'initiation de la transcription et/ou de fixation au ribosome adaptés au système d'expression choisi pour la séquence codante.

Une séquence d'acides nucléiques susceptible de s'hybrider en condition stringente avec l'acide nucléique isolé selon l'invention comprend également des fragments, des dérivés, ou des variants alléliques de la séquence d'acides nucléiques selon l'invention qui code une protéine ayant l'activité enzymatique décrite ci-avant. Ainsi, les fragments sont définis comme des fragments de molécules d'acides nucléiques suffisamment longs pour coder une protéine ayant conservé son activité enzymatique. Celle-ci inclut aussi bien des fragments dépourvus de la séquence codant le peptide signal responsable de la sécrétion de la protéine.

<Desc/Clms Page number 14>

Le terme"dérivé"signifie séquence, différente de la séquence originelle, à une ou plusieurs positions, mais présentant un haut degré de similarité avec ces séquences. Dans ce contexte, similarité signifie une identité d'au moins 80 % des nucléotides, et de préférence d'au moins 90 % avec la séquence originelle. Les modifications dans ce cas portent sur des délétions, substitutions, insertions ou recombinaisons, à partir du moment où l'enzyme codée par ces séquences homologues présentent l'activité enzymatique des polypeptides selon l'invention.

Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention telles que décrites ci-dessus et qualifiées de dérivés de ces molécules telles que définies ci-avant, sont généralement des variants exerçant la même fonction biologique. Ces variations peuvent être des variations naturelles, notamment celles observables d'une espèce à l'autre et résultant d'une

variabilité inter espèce ou au contraire être introduites par le moyen d'une mutagenèse dirigée, aléatoire ou par DNA Shuffling (évolution moléculaire).

De la même façon, font partie de l'invention les acides nucléiques isolés codant une glycosyltransférase apte à catalyser la synthèse de dextrane ou d'oligosaccharide portant au moins 20 % et de préférence au moins 30 % de ramifications de type a (1-2) et obtenus par évolution moléculaire (DNA shuffling) et comprenant : - une étape de modification aléatoire d'une des séquences décrites précédemment et, en particulier, des séquences ID No. 3 et 4 et d'établissement de variants ; - une étape d'expression de ces séquences modifiées dans une cellule hôte appropriée, un hôte abritant un variant ; - une étape de criblage des hôtes exprimant une enzyme apte à former plus de 20 % et de préférence plus de 30 % de liaisons a (1- 2) sur un substrat approprié et une étape d'isolement du ou des gènes améliorés.

Un acide nucléique isolé selon l'invention pourra également comprendre :

<Desc/Clms Page number 15>

a) une séquence ayant au moins 80 % de similarité avec la séquence codant une dextrane-saccharase exprimée par le plasmide pCRT7-dsr D dans E. coli déposé à la CNCM le 15 mars 2001 sous le numéro 1- 2649 (E. coli TM 109 [pCR-T7-ds/D]), ou b) une séquence complémentaire de la séquence en a).

L'invention porte également sur les fragments d'acides nucléiques tels que définis ci-dessus, hybridables avec la séquence ID No. 4, et utilisables comme sondes d'hybridation pour la détection de séquences codant des enzymes selon l'invention. Ces fragments peuvent être préparés par toutes les techniques connues de l'homme du métier.

Outre les sondes d'hybridation, des amorces d'amplification font également partie de l'invention. Lesdites amorces sont des fragments hybridables avec la SEQ ID No. 4 ou avec son brin complémentaire et permettent l'amplification de séquences spécifiques codant des dextranesaccharases présentes dans un organisme procaryote ou eucaryote, animal ou végétal.

L'utilisation de telles amorces d'amplification permet la mise en oeuvre d'un procédé d'identification de l'existence éventuelle d'un gène codant une enzyme apte à catalyser la synthèse de GOS avec des ramifications a (1-)-2) dans un tel organisme, ledit procédé faisant également partie de l'invention.

L'invention porte également sur des vecteurs d'expression comprenant un acide nucléique tel que décrit ci-avant, sous le contrôle de séquence permettant son expression et de préférence son excrétion dans des cellules procaryotes ou eucaryotes. Par cellules procaryotes, on choisira de préférence des bactéries choisies dans un groupe comprenant E. coli, les Lactococcus, les Bacillus, les Leuconostoc. Par cellules eucaryotes, on choisira de préférence les eucaryotes choisis dans un groupe contenant les levures, les champignons ou les végétaux.

Le vecteur comprend un promoteur adapté à l'expression de l'acide nucléique isolé selon l'invention dans le système d'expression choisi.

<Desc/Clms Page number 16>

A titre d'exemple, le promoteur du bactériophage T7 pourrait être avantageusement choisi pour une expression dans E. Coli.

L'invention porte également sur les cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, transformées par un acide nucléique selon l'invention de préférence compris dans un vecteur d'expression portant un promoteur, adapté à une expression dans les cellules hôtes choisies. Les cellules transformées sont choisies dans le groupe des bactéries à Gram-telle E coli, ou dans le groupe des bactéries à Gram+ telles Lactococcus, Bacillus, Leuconostoc ou parmi les eucaryotes dans un groupe comprenant les levures ou les champignons, ou les végétaux.

Un exemple particulier d'une cellule transformée selon l'invention est la souche E. coli porteuse d'un plasmide appelé PCRT7dsrD et porteur de la séquence ID No. 4 sous le contrôle du promoteur du bactériophage T7 et déposée à la CNCM le 15 mars 2001 sous le numéro 1-2649.

La présente invention, par ailleurs, porte sur un procédé de production d'une glycosyltransférase apte à former des dextranes ou des oligosides présentant au moins 15 % et de préférence au moins 20 % de ramifications de type a (1-)-2) osidiques et comprenant : a) l'insertion d'un acide nucléique ou d'un vecteur tel que décrit précédemment dans une cellule hôte apte à l'exprimer et de préférence à sécréter la glycosyltransférase ; b) la caractérisation de l'activité enzymatique recherchée par toutes les méthodes accessibles à l'homme du métier ; c) la purification de l'enzyme à partir d'un extrait cellulaire.

Par méthode de caractérisation de l'activité enzymatique connue de l'homme du métier, on comprendra les méthodes décrites dans la littérature par exemple dans la référence (2) ainsi que de nouvelles méthodes susceptibles d'être mises au point permettant d'identifier et de discriminer les glucooligosaccharides présentant le taux de ramification recherché.

<Desc/Clms Page number 17>

Il s'agit en fait de tout procédé de criblage permettant d'identifier la présence de ramifications a (1-2) dans un GOS.

A titre d'exemple, seront utilisées : - l'HPLC pour lequel la migration des GOS varie en fonction de la nature et le positionnement des ramifications, notamment ceux ayant le lien a (1-2) à l'extrémité réductrice et ceux ayant ce lien sur l'avantdernier glucose, et/ou - la Résonnance magnétique nucléaire (RMN), - l'existence d'une réaction positive avec des anticorps monoclonaux spécifiques des liaisons a (1- > 2) sur l'extrémité réductrice et/ou d'anticorps monoclonaux spécifiques des liaisons a (1#2) sur l'avantdernier glucose du GOS.

L'invention porte également sur un procédé d'obtention d'une glycosyltransférase apte à présenter des oligosides ou des dextranes présentant un taux de ramification a (1-2) supérieur à 15 % et de préférence supérieur à 30 % de la totalité des liaisons osidiques et comprenant une étape de modification de la séquence ID No. 4 par addition, délétion, mutation à partir du moment où : - le cadre de lecture n'est pas modifié, et - les acides aminés suivants sont conservés après traduction :
W en positions 425 ou 2122, codé par le triplet TGG en positions 1273 et 6364,
E en positions 430,565, 2127 et 2248 codés par les triplets GAA en positions 1288,1693, 6379 et 6742 respectivement,
D en positions 487,489, 527, 638,2170 et 2210 codés par les triplets GAT en positions 1459, 1465, 1579,1912, 6508 et 6628 respectivement,
D en positions 2172 et 2322 codés par les triplets GAT en positions 6514 et 6964,
H en position 637 et 2321, codés respectivement par les triplets CAT en position 1909 et CAC en position 6961,

<Desc/Clms Page number 18>

Q en positions 1019 et 2694 codés respectivement par les triplets CM (3055) et CAG (8080).

Un procédé de production d'une glycosyltransférase selon l'invention ayant les mêmes caractéristiques que ci-avant peut également comprendre : - une étape de modification aléatoire de la séquence ID n 4 et d'établissement d'une banque de variants, - une étape d'expression de ces séquences modifiées dans une cellule hôte appropriée, un hôte abritant un variant, - une étape de criblage des hôtes exprimant une enzyme apte à former plus de 15 % et de préférence plus de 30 % de liaison a (1- 2) sur un substrat approprié, - une étape d'isolement du ou des gènes améliorés.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé consiste à modifier la séquence ID No. 3 par duplication de tout ou partie du domaine catalytique CD2.

On pourra comprendre que les procédés ci-dessus visent non seulement à l'obtention d'une glycosyltransférase apte à former des oligosides présentant un taux de ramification a (1- 2) constant et reproductible, supérieur à 15 % des ramifications totales mais également à améliorer le taux de ramification a (1- 2) dans l'objectif de modifier les propriétés des oligosides obtenus dans le sens d'une amélioration de leurs propriétés diététiques ou de leur capacité à maintenir ou rétablir la flore bactérienne associée à certains organes du corps humain ou animal.

La présente invention porte enfin sur les glycosyltransférases susceptibles d'être obtenues par un procédé cité ci-avant et apte à former au moins 15 % et de préférence au moins 30 % de ramifications de type a (1- 2) osidiques dans des glucooligosaccharides.

L'invention porte enfin sur l'utilisation des glycosyltransférases selon l'invention ainsi que celles susceptibles d'être obtenues par les procédés ci-dessus, dans la fabrication d'une composition à effet

<Desc/Clms Page number 19>

prébiotique ou dans la fabrication d'une composition dermatologique, cosmétique ou pharmaceutique.

A titre d'exemples non limitatifs, on peut citer l'amélioration du transit intestinal chez les animaux et chez l'homme, l'amélioration de l'assimilation du calcium et/ou du magnésium et des minéraux en général, la prévention du cancer du colon, la prévention ou le traitement des affections de la peau telles l'acné, les pellicules, les odeurs corporelles.

L'avantage des polypeptides et des acides nucléiques codant ces polypeptides selon l'invention se situe non seulement au niveau de l'amélioration en terme de qualité, de rendement, de reproductibilité, et de prix de revient des glycosyltransférases aptes à former des oligosaccharides avec des ramifications de type a (1-) 2) osidiques mais également dans la perspective de produire de nouvelles enzymes dont la fonctionnalité est améliorée.

Les figures, exemples et description détaillés ci-après permettent, sans la limiter, d'illustrer les caractéristiques et les fonctionnalités particulières des polypeptides à activité enzymatique et des séquences codant ceux-ci. Elles permettent en particulier d'illustrer de façon plus précise la spécificité du domaine catalytique présent dans la partie carboxylique de l'enzyme selon l'invention et son évolution potentielle pour l'obtention d'enzymes améliorées.

LEGENDE DES FIGURES :
Figure 1 : structure des glycosyltransférases : la figure 1a) représente la structure des glycosyltransférases et des dextranesaccharases décrites dans la littérature (1). La figure 1b) représente la structure de la glycosyltransférase selon l'invention. A : peptide signal ; B : région variable, C : domaine catalytique, D : domaine de liaison au glucane (GBD).

Figure 2 : schéma récapitulatif de la méthode de clonage de la séquence nucléotidique codant une glycosyltransférase selon l'invention à

<Desc/Clms Page number 20>

l'aide d'une bibliothèque génomique en utilisant une sonde PCR décrite dans le tableau 1 et une sonde Hind)))/EcoRV respectivement.

Fiqure 3 : comparaison des séquences signal de différentes glycosyltransférases de L. mesenteroides. Les acides aminés conservés sont en gras. DSR-B : L mesenteroides B-1299 (4) ; DSR-S : L mesenteroides B-512F (5) ; ASR : L mesenteroides B-1355 (6).

Fiqure 4 : alignement des 11 séquences répétées de l'enzyme DSR-D et observées dans La zone variable.

Figure 5 : alignement des séquences conservées du domaine catalytique.

-Bloc A : acides aminés essentiels de la partie N-terminale du domaine catalytique ; - Bloc B : acides aminés de la partie du domaine catalytique de liaison au saccharose ; - Blocs C, D, E : blocs contenant les trois résidus d'acides aminés impliqués dans la triade catalytique (6) ; - Bloc F : séquence contenant la glutamine 937 de GTF-I étudiée par Monchois et al. (7).

Les acides aminés entièrement conservés sont indiqués en gras. ** : substitutions conservatives ; * : substitutions semi-conservatives ; - : GAP. Les numérotations sont celles de la séquence ID No. 2.

Fiqure 6 : caractérisation HPLC des produits synthétisés par l'enzyme recombinante DSR-D.

6A : analyse en HPLC des glucooligosaccharides obtenus avec les dextrane-saccharases de L. mesenteroides NRLL B-1299.

6B : analyse HPLC des glucooligosaccharides obtenus par la DSR-D recombinante. L'identification des différents pics suivants : 1 : fructose, 2 : maltose, 3 : sucrose, 4 : panose,

<Desc/Clms Page number 21>

5 : R4, 6 : OD4, 7 : R5, 8 : OD5, A, B, C : pics non identifiés.

6C : DSR-D recombinante délétée du domaine catalytique de la partie carboxylique de l'enzyme (# DSR-D).

Figure 7 : séquence peptidique de CD2.

Figure 8 : séquence peptidique de DSR-D.

Figure 9 : séquence nucléotidique codant CD2.

Figure 10 : séquence nucléotidique codant DSR-D.

Figure 11 : séquence nucléotidique d'un gène codant DSR-D.

MATERIELS ET METHODES :
1) Souches bactériennes, plasmides et conditions de croissance : Toutes les souches sont conservées à -80 C dans des tubes contenant 15% de glycérol (v/v).

Leuconostoc mesenteroides B-1299 (NRRL, Peoria, USA) est cultivée à 27 C, sous agitation (200 RPM) sur milieu standard (saccharose 40 g. 1-', phosphate potassium 20 g. l-1, extrait de levure 20 g.l-1, MgSO4-7H2O 0.2 g.l-1, MnSO4-H2O 0.01g.l-1, NaCl 0.01g.l-1, CaCl2 0. 02 g. l-1, FeS04-7H20 0.01 g. f-1), le pH étant ajusté à 6,9.

Escherichia coli DH5a et JM109 ont été cultivées sur milieu LB (LuriaBertani).

La sélection des clones recombinants de pUC18 ou pGEM-T Easy est effectuée sur boites LB-agar supplémenté avec 100 g.ml-1 d'ampicilline, 0.5 mM d'isopropyl-ss-D-thiogalactopyranoside (IPTG) et 40 ug. ml' de 5bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-D-galactopyranoside (X-gal). Des cellules d' E. coli TOP 10 ont été utilisée pour le système de clonage de produit PCR

<Desc/Clms Page number 22>

TOPO Cloning (Invitrogen), et cultivées sur milieu LB supplémenté de kanamycine à la concentration de 50 ug. ml!'.

En ce qui concerne l'expression de dsrD,) le kit de clonage ECHO Cloning System (Invitrogen) permet le clonage d'un produit PCR dans un vecteur donneur (pUNI/V5-His-TOPO), précédent une étape de recombinaison avec un vecteur accepteur adapté (pCR-T7-E). Ce système requiert des

cellules E. coli PYR1, TOP 10 et BL21 (DE3) pLysS cultivées sur milieu LB supplémenté de 50 ug. mf' de kanamycine, ainsi que de 34aug. m de chloramphenicol pour la souche BL21 (DE3) pLysS.

Les plasmides pUC18 digérés et déphosphorylés proviennent de Pharmacia (Amersham Pharmacia Biotech) et ont été utilisés pour la constitution de banque d'ADN génomique de L. mesenteroides B-1299. Le clonage de produit PCR a, quant à lui, nécessité l'emploi de plasmide pGEM-T Easy (Promega), et pour les fragments de plus de 2 kbp de plasmide TOPO-XL (Invitrogen)
2) Electrophorèse sur gel, localisation et caractérisation de l'enzvme :

Après une culture de L. mesenteroides B-1299 de 7h, le milieu est centrifugé (7000 RPM, 4 C, 30 min) et les cellules, où 90% de l'activité enzymatique se retrouve, sont concentrées 10 fois dans une solution de tampon acétate (20 mM, pH 5,4), chauffées 5 minutes à 95 C en présence de solution de dénaturation (Tris HCI 62.5 mM, SDS 4%, urée

6M, bleu de bromophenol 0. 01% et-mercaptoethanol 200 mM). 300 ph du mélange est déposé sur gel de polyacrylamide à 7%. Après migration, les protéines totales sont révélées par coloration au noir amido, alors que l'activité dextrane-saccharase est détectée par coloration du polymère au réactif de Schiff après synthèse de dextrane in situ. Les bandes correspondant à des dextrane-saccharases actives sont excisées et incubées séparément dans 2 ml de solution d'acétate de sodium 20 mM pH 5.4 contenant 100g. r1 de saccharose et 50 g.l-1 de maltose. Après consommation totale du saccharose, la réaction est arrêtée par chauffage à

<Desc/Clms Page number 23>

95 C pendant 5 minutes, et le milieu réactionnel est centrifugé 5 minutes à 15000g afin d'éliminer le dextrane insoluble. Les échantillons sont analysés par chromatographie en phase inverse (colonne C18, Ultrasep 100, 6 um, 5x300mm, Bishoff Chromatography) en utilisant de l'eau ultrapure comme éluant, à un débit constant de 0. 5ml. min-1. Les oligosaccharides sont séparés pendant 30 minutes à température ambiante, et détectés par réfractométrie. Le séquençage peptidique a été réalisée sur les bandes protéiques sélectionnées par le Laboratoire de Microséquençage, Institut Pasteur, Paris.

3) Techniques de biologie moléculaire utilisée :
La purification du plasmide d'E. coli et la purification du DNA génomique de L. mésenteroides ont été réalisées en utilisation respectivement QiaPrep Spin Plasmid kit et le Cell Culture DNA maxi kit (QiaGen). Les procédés d'amplification et de clonage ont été réalisés en utilisant les techniques standards (Sambrook et al. 2001, voir supra). Les enzymes de restriction et de modification proviennent des sociétés commerciales New England Biolabs ou Gibco BRL et utilisées selon les protocoles des fabricants.

La PCR est réalisée avec des amorces choisies sur la base de la séquence protéique obtenue sur une bande de gel d'électrophorèse isolée (voir plus haut, électrophorèse sur gel et localisation de l'enzyme).

Deux peptides ont été sélectionnés : - 29-FYFESGK, et - 24-FESQNNNP et utilisés pour synthétiser des oligonucléotides dégénérés et indiqués dans le tableau 1 ci-dessous.

Dans ce tableau où les numérotations sont celles de la figure 10, il apparaît que la présence d'un résidu sérine dans les deux peptides nécessite la synthèse de deux amorces pour chaque peptide dans la mesure où la sérine peut être codée par six codons différents. ECHO-dir et ECHO-inv sont les amorces utilisées ayant permis l'amplification de dsrD

<Desc/Clms Page number 24>

par PCR pour son clonage dans le système d'expression Echo Cloning (Invitrogen). TABLEAU) :

<tb>
<tb> Désignation <SEP> Description <SEP> Séquence <SEP> 5'-3'
<tb> 29-diol <SEP> FYFESGK <SEP> TT <SEP> (CMTA <SEP> (CfT) <SEP> TT <SEP> (C/T) <SEP> GA <SEP> (A/G) <SEP> TCAGG <SEP> (C/G) <SEP> AA <SEP> (A/G)
<tb> 29-dir2 <SEP> TT <SEP> (C/T)TA(C/T)TT(C/T)GA(A/G)AGCGG <SEP> (C/G) <SEP> AA <SEP> (A/G)
<tb> 24-mv1 <SEP> FESQNNNP <SEP> (T/G) <SEP> GG <SEP> (G/A) <SEP> TT <SEP> (G/A) <SEP> TT <SEP> (G/A)TTTTGTGA(T/C0TCAAA
<tb> 24-) <SEP> nv2 <SEP> (T/G) <SEP> GG <SEP> (G/A)TT(G/A) <SEP> TT <SEP> (G/A)TTTTGGCT(T/C)TCAAA
<tb> IPCR-rev <SEP> séquence <SEP> nt <SEP> CCCTTTACAAGCTGATTTTGCTTATCTGCG
<tb> 5769-5798
<tb> IPCR-dir <SEP> séquence <SEP> nt <SEP> GGGTCMATCCTTACTATACATTGTCACACGG
<tb> 8311-8342
<tb> ECHO-dir <SEP> séquence <SEP> nt <SEP> -6- <SEP> AGTTGTATGAGAGACATGAGGGTAATTTGTGACCGTAAAAAATTG
<tb> 39
<tb> ECHO-inv <SEP> séquence <SEP> nt <SEP> ATTTGAGGTAATGTTGATTTATCACCATCAAGCTTGAAATATTGACC
<tb> 8457-8504
<tb>
PCR : La PCR est réalisée en utilisant un thermocycleur Perkin-

Elmer, modèle 2400, et en utilisant 50 nanogrammes de l'ADN génomique. Les quantités d'amorces utilisées sont de 10 uM de 29-Dir1 et de 24-lnv1. Au mélange réactionnel, sont ajoutés 250 uM de chaque désoxynucléotide triphosphate, et la Taq Polymérase.

Après une amplification de 25 cycles à 94 C pendant 30 secondes puis à 50 C pendant 30 secondes, puis à 72 C pendant 5 minutes, un fragment de 666 paires de base a été obtenu.

<Desc/Clms Page number 25>

Hybridation southern et bibliothèque qénomique de L. mesenteroides B-1299 : .

L'ADN chromosomique de L. mesenteroides B-1299 a été digéré avec différentes enzymes de restriction, puis séparé sur gel d'agarose. Des bibliothèques génomiques de la bactérie ont été transférées sur des membranes de nylon hybond N+ (Amersham PharmaciaBiotech).

L'hybridation a été réalisée en utilisant le fragment de 666 paires de bases à la désoxy-adénosine-triphosphate marqué au 32p. La réaction de marquage a été réalisée en utilisant le kit de marquage"Mega Prime DNA Labelling System Dit" (Amersham PharmaciaBiotech), suivie par la purification de la sonde sur des colonnes MicroSpin S-200HR. La préhybridation et l'hybridation ont été réalisées en conditions fortement stringentes (650 C pendant la nuit, selon les méthodes habituelles) (Maniatis et al., 2001).

PCR inverse :
L'ADN génomique de L. mesentéroides B-1299 est digéré par EcoRV dans les conditions recommandées par le fournisseur.

Après re-circularisation, les produits de digestion sont utilisés comme matrice dans une PCR inverse (Extrapol tf DNA polymérase (Eurobio) 25 cycles, 94 C, 30 secondes ; 510 C, 30 secondes ; 72 C, 3 minutes). Les deux amorces ont été choisies en fonction de la séquence de l'insert de pSB2 comme ceci est indiqué dans la figure 2.

La figure 2 résume les modalités d'obtention des différents plasmides porteurs des fragments de dsrD par criblage de la bibliothèque génomique et utilisation des sondes décrites ci-dessus.

Séquence d'ADN et analyse :
Après le séquençage des peptides, des amorces dégénérées dessinées en tenant compte de la fréquence d'utilisation des codons dans les gènes de dextrane-saccharases de L. mesenteroides B-1299, ont été

synthétisées et ont permis l'amplification d'un fragment de 666 bp. Le

<Desc/Clms Page number 26>

séquençage de ce fragment a révélé de fortes homologes avec les gènes de dextrane-saccharases déjà connus, tout en étant totalement nouveau.

L'utilisation de ce fragment comme sonde homologue dans des expériences de Southern, a permis de repérer des signaux positifs sur différentes pistes d'ADN génomique digéré. Une première banque Hindlll a ainsi été criblée, et un plasmide recombinant, nommé pSB2, contenant un insert de 5,6 kbp, a été purifié. L'analyse de la séquence de ce fragment

Hindlll a révélé un cadre ouvert de lecture couvrant la totalité de l'insert. Ensuite, une banque EcoRV a été criblée avec une sonde !/EcoRV isolée à l'extrémité N-term de l'insert Hindlll de 5, 6 kbp. Un plasmide recombinant pSB3, testé positivement par dot-blot, s'est avéré contenir un insert de 3,8 kbp qui, après séquençage, a été montré contenir le codon d'initiation de la traduction et la région promotrice du nouveau gène de dextrane-saccharase nommé dsrD.

Dans le but d'obtenir le codon de terminaison de dsrD, une PCR inverse a été réalisée sur de l'ADN génomique de L. mesenteroides B-1299 digéré par EcoRV et religué sur lui-même, en utilisant des amorces oligonucléotidiques divergentes dessinées à partir de la séquence de l'insert pSB2. Un fragment unique à la taille attendue de 1 kbp a été amplifié puis cloné dans un pGEM-T Easy, pour obtenir le plasmide pSB4.

Après séquençage, la séquence amplifiée située en aval du site Hindlll comporte 221 bp et contient le codon de terminaison du cadre de lecture de dsrD, situé 30 bp en aval du site de restriction Hindlll.

Le séquençage des différents fragments portés par les trois plasmides a été réalisé par la société Génome Express, et ce sur les deux brins. Les analyses des séquences de nucléotides ont été réalisées en utilisant le"ORF Finder" (http ://www. ncbi. nlm. nih. Qov/Qorf/qorf. html), Blast

(http.//www. ncbi. nlm. nih. qov/blast/blastcQi, Altschul et al., 1997) ClustalW fhttp'//www2. ebi. ac. uk/clustalw. Thompson et al, 1994), PRODOM (http ://protein.toulouse.inra.fr/prodom.html, Corpet et al, 2000), PFAM (http ://pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml, Bateman et al, 2000) et SAPS

<Desc/Clms Page number 27>

(http ://bioweb. pasteur. fr/seqanal/interfaces/saps. html, Brendel et al, 1992), l'ensemble de ces logiciels étant accessible par internet.

Expression de la protéine :
Le système de clonage ECHO (Invitrogen) a été utilisé : deux amorces telles que proposées dans le tableau 1 ci-dessus permettent l'amplification en utilisant le système de Boehringer Mannheim"Expand Long Template"dans les conditions suivantes : 94 C pendant 3 minutes suivis de 25 cycles à 940 C pendant 30 secondes, 55 C pendant 30 secondes, et 68 C pendant 7 minutes. Les produits PCR sont ensuite clonés dans le vecteur pUNIN5-His-TOPO, permettant l'obtention d'un vecteur donneur (pUNI-dsrD) pour recombiner avec un vecteur accepteur (pCR-T7-E) et adapté à l'expression dans E. coli. Le plasmide final est désigné pCR-T7-dsrD.

Cette construction place le gène dsrD sous le contrôle du promoteur du bactériophage T7 et permet l'expression inductible du gène dsrD.

Après induction avec 1 mM d'IPTG, les cellules d'E. coli BL21 transformées sont récoltées par centrifugation après 4 heures de croissance, et re-suspendues à une densité optique finale de 80 à 600 nm dans du tampon acétate de sodium 20 mM pH 5,4 et du Triton X100 à 1% (v/v) en présence de 1 mM PMSF afin d'empêcher la protéolyse dans les extraits cellulaires après sonication.

Tests enzymatiques :
Les réactions enzymatiques sont réalisées dans les conditions standards à 30 degrés dans du tampon acétate de sodium 20 mM pH 5.4, CaCl2 0,05 g/r1, NaN3 1 g/r'et saccharose 100 gil~'. L'activité de l'enzyme DSR-D est déterminée en mesurant la libération des sucres réducteurs,

une unité étant définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la formation d'1 pmol de fructose par minute dans les conditions standards. Les oligosaccharides sont synthétisés dans un milieu réactionnel contenant 100 g/l de maltose, 200 g/f de saccharose et 0,5 unitésiml de DSR-D.

<Desc/Clms Page number 28>

Comme pour la synthèse de dextrane, la réaction enzymatique a été poursuivie pendant 24 heures en présence de 100 g/) de glucose. Le dextrane produit a été précipité en présence d'éthanol 50 % (v/v) et lavé deux fois dans l'éthanol à 50 % (v/v) avant lyophilisation. Il est ensuite dissous à 10 mg/ml dans du D2O et analysé par spectrométrie deRMrl du 13C.

Analyse par RMN : Les analyses par résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton ont été réalisées sur un spectromètre Varian unit Plus équipé d'un système Ultrashim (fréquence d'opération 499,836 Mhz). Les échantillons ont été dilués dans de l'eau deutérée (5mg dans 0.75 ml de solvant) et analysés à 25 C. Les spectres de protons ont ensuite été réalisés à une fréquence de 3300Hz pendant 90 pulses et 12480 points. Le temps d'acquisition est égal à 1,891 secondes et le nombre d'accumulations et de 32 scans.

Les spectres du carbone 13C sont enregistrés à l'aide d'un spectromètre Brüker AC 300. Les échantillons sont dilués dans de l'eau deutérée (environ 10-15 mg dans 0,40 ml). les spectres sont réalisés à une fréquence de 75 MHz à 70 C, et le temps d'acquisition est égal à 0,54 secondes.

Les déplacements chimiques sont donnés en ppm par rapport au signal méthyle de l'acétone dans l'eau, qui est pris comme standard à =31. 5 ppm par rapport au signal méthyle du 4,4 diméthyl-4-silapentane-1- sulfonate.

Exemple 1 : Caractérisation et purification de l'enzyme DSR-D et obtention du dsrD
Les enzymes produites par les cultures de L. mesentéroides et obtenues sur gel de polyacrylamide en SDS tel que décrit dans la partie Matériels et Méthodes sont isolées par découpe du gel.

Les GOS produits par les enzymes ainsi isolées sont analysés par HPLC selon les méthodes décrites dans (1). L'enzyme dont l'activité est recherchée est déduite de la nature des GOS produits. Après protéolyse

<Desc/Clms Page number 29>

trypsique et séparation par HPLC des peptides produits, 2 peptides : 29FYFESGK et 24-FESQNNNP sont séquencés et utilisés comme modèle pour la synthèse d'amorces nucléotidiques dégénérées.

Les différentes étapes d'amplification et de clonage sont représentées dans la figure 2. Le gène complet est inséré dans le plasmide pCR-T7-E et exprimé dans E. coli.

La production d'une enzyme fonctionnelle est attestée par la production des GOS dont l'analyse HPLC est représentée dans la figure 6b).

On remarquera en particulier l'importance des pics 5 et 7 représentatifs des GOS à ramification a (1-)-2).

Exemple 2 : caractérisation des séquences dsrD et de DSR-D
2.1 Séquence nucléotidique :
La séquence nucléotidique de l'enzyme est représentée dans la séquence ID No. 4. Elle est composée d'un cadre de lecture de 8508 nucléotides.

La séquence nucléotidique de l'insert dans le plasmide pCRT7-dsrD contient un site de liaison au ribosome (RBS), 9 bases en amont du codon d'initiation ATG et est composée d'un hexa-nucléotide GAGGAA.

2.2 Analyse de la séquence d'amino-acides :
La séquence de 8508 nucléotides de dsrD code une protéine de 2835 acides aminés et est représentée dans la séquence ID No. 2. Le point isolectrique de cette protéine est de 4,88 et son poids moléculaire théorique de 313,2 kDa. En dépit des fortes similarités avec les dextranesaccharases déjà connues, dsrD est caractérisée par une structure original.

L'alignement de la séquence d'amino-acides avec l'ensemble des glycosyltransférases et des dextrane-saccharases connues confirme que la structure en domaine des glycosyltransférases et des dextranesaccharases est conservée, à savoir : une séquence signal, une région

<Desc/Clms Page number 30>

variable, un domaine catalytique hautement conservé et un domaine de liaison au glucane. Cette structure est représentée dans la figure 1a.

Comme l'indique la figure 1 b, un deuxième domaine catalytique forme la partie carboxy-terminale de l'enzyme comme cela été confirmé par PRODOM et une analyse Blas.

Avec un poids moléculaire de 313,2 kDa, DSR-D a environ 2 fois le poids moléculaire moyen des autres glycosyltransférases et dextrane-saccharases (1), ce qui est en accord avec la présence d'un deuxième domaine catalytique à l'extrémité C-terminale et également avec un domaine de liaison au glucane plus long. a) analyse de la séquence signal
La séquence signal et la séquence nucléotidique codant le peptide signal sont extrêmement conservées si on les compare aux autres dextrane-saccharases comme ceci est indiqué dans la figure 3. Le site de clivage est localisé entre les acides aminés 40 et 41. b) domaine variable :
En aval du peptide signal, DSR-D a un domaine variable de 207 acides aminés. Lorsqu'on le compare aux autres domaines variables des glycosyltransférases, en utilisant un programme d'alignement de type SAPS, on met en évidence la présence d'un motif de 14 acides aminés répété 11 fois comme ceci est indiqué dans la figure 4.

Ce motif répété, riche en alanine, threonine et acide aspartique n'a jamais été identifié précédemment.

Le rôle et la signification de cette région n'ont jamais été élucidés. Différentes études ont démontré que sa délétion n'affecte pas l'activité enzymatique (4). Le rôle du motif répété de 14 acides aminés qui n'existe pas dans les autres glycosyltransférases reste néanmoins à déterminer. c) analyse des domaines catalytiques :
Le premier domaine catalytique s'étend des acides aminés 248 à 1142 (CD1) de la séquence ID No 2, alors que le deuxième est

<Desc/Clms Page number 31>

localisé entre les acides aminés 1980 et 2836 (CD2). Ces deux domaines présentent 45 % d'identité et 65 % de similarité entre eux.

CD1 et CD2 contiennent les acides aminés déjà identifiés dans les giycosyitransférases et tes dextrane-saccharases comme étant essentiels à leur activité enzymatique, et comme ceci est indiqué dans la figure 5.

Les triades catalytiques de CD1 et CD2 déterminées par analogie avec l'a amylase (réf. 7) sont présentes aux positions suivantes : (Asp 527/Glu 565/Asp 638 pour CD1 et Asp 2210/Glu 2248/Asp 2322 pour CD2).

D'autres résidus conservés ont été identifiés comme importants pour l'activité enzymatique : les résidus Trp 425/Glu 430 pour CD1 et Trp 2122/Glu 2127 pour CD2, lesquels sont analogues à celles du domaine N-terminal de GFTI décrits par Monchois et al. (4) : Trp 344/Glu 349.

En revanche, certaines séquences situées dans la région conservée des glycosyltransférases et des dextrane-saccharases ne se retrouvent pas dans CD2 de DSR-D. Ainsi, comme indiqué dans le tableau 4 ci-dessus, les séquences FIHNDTI (2214-2220) et KGVQEKV (2323- 2329) divergent des autres séquences consensus des dextranesaccharases déjà étudiées qui sont respectivement NVDADLL et SEVQTVI. d) domaine de liaison au glucane :
Lorsque l'on compare la séquence de DSR-D avec les séquences connues, il apparaît que le domaine de liaison au glucane est sensiblement plus long. En effet, ce domaine a une longueur d'environ 500 acides aminés dans les glycosyltransférases et les dextranesaccharases étudiées alors que dans DSR-D, il représente 836 acides aminés. Plusieurs motifs répétés A et C ont pu être identifiés. En particulier, une série de répétition AC a pu être identifiée.

<Desc/Clms Page number 32>

Exemple 3 : expression dsr-D dans E. coli Des cellules d'E. coli BL21 (DE3) pLysS pCR-T7-dsrD ont été cultivées comme décrit ci-dessus. Après gel d'électrophorèse en polyacrylamide- (page-SDS) l'analyse des extraits protéiques révèle effectivement la présence de plusieurs bandes ayant l'activité de dextrane saccharase, ladite activité étant mesurée comme ci-dessus. C'est cette lignée qui a été déposée à la CNCM le 15 mars 2001 sous le numéro 1- 2649.

Identification et caractérisation de l'activité enzymatique :
En utilisant une molécule accepteur de glucose, les dextrane-

saccharases produites par E. coli recombinant ont été comparées avec celles produites par L. mesentéroïdes B-1299.

L'analyse HPLC des produits de la réaction avec la DSR-D recombinante montre (figure 6) des temps de rétention correspondant aux GOS préalablement identifiés R4 et R5 (2). Les oligosaccharides de type R sont les séries de GOS linéaires, le lien a (1- 2) étant lié à l'extrémité nonréductrice. La série OD, GOS linéaires résultant de liens glycosidiques a (1 6) avec un résidu maltose à l'extrémité réductrice, a été observée en très faibles quantités. Trois nouveaux composés sont en revanche détectés dans les produits de l'enzyme recombinante.

Identification des GOS produits :
Finalement, la figure 6b montre clairement que les pics 5 et 7 représentant les GOS de la série R sont relativement plus importants avec l'enzyme recombinante qu'avec l'enzyme native dont les pics correspondant au panose et à OD5 sont plus importants.

Exemple 4 : Effet de la délétion de CD2 sur l'activité enzymatique de DSR-D L'ADN génomique de L. mesenteroides B-1299 est utilisé comme matrice pour amplifier par PCR le gène dsrD délété de la séquence correspondant au second domaine catalytique. Pour cela, 2 oligonucléotides, ECHOdir (5'-AGTTGTATGAGAGACATGAGGGTAATTTGTGACCGTAAAAAATTG) (SEQ. ID

<Desc/Clms Page number 33>

No. 6), correspondant à la séquence nucléotidique-6 à 39 et contenant le codon d'initiation de la traduction, et ECHO-inv-dél (5'GTATTAGTGAATAAGTATTCACCATTGCATTTATCGTCAAAATAGTACG) (SEQ. ID No. 7) complémentaire de la séquence 5889-5937 et correspondant à la séquence peptidique YYFDDKGNGEYCFTNT, ont été synthétisées, afin de fusionner l'extrémité C-terminale de la protéine délétée avec un tag His présent sur le vecteur de clonage. La réaction PCR a été réalisée grâce à un DNA thermal cycler model 2400 (Perkin-Elmer), avec le système Expand Long Templat System (Boehringer Mannheim), suivant le cycle de température : 94 C pendant 3 min, puis 25 cycles avec : 30 s à 94 C, 30s à 55 C et 7 min à 68 C. le produit PCR a ensuite été cloné dans le vecteur donneur pUNI, et le plasmide résultant, utilisé dans une réaction de recombinaison avec le vecteur d'expression pCR-T7-AdsrD.

La préparation des extraits cellulaires, les réactions enzymatiques, l'analyse des produits de la réaction sont les mêmes que dans l'exemple 3 ci-dessus.

Le profil HPLC des GOS obtenus avec l'enzyme DSR-D délétée du domaine CD2 apparaît dans la figure 6 c).

Les GOS de type R, représentés par les pics 5 et 7 visibles dans la figure 6 a) et 6 b) sont totalement absents des produits obtenus avec l'enzyme recombinante délétée de CD2. Les seuls produits analysables sont ceux correspondant à des oligosides linéaires résultant de liens a (1- 6) avec un résidu maltose dans la partie réductrice. Ce résultat indique clairement le rôle essentiel du domaine catalytique situé dans la partie carboxy-terminale de l'enzyme dans sa capacité à former des liaisons osidiques a (1- 2).

En conclusion, les inventeurs ont réussi en isolant une dextrane saccharase particulière produite par L. mesenteroides à caractériser une structure particulière et inattendue de cette enzyme apte à produire des oligosides d'intérêt et présentant des ramifications de type

<Desc/Clms Page number 34>

a (1-2). L'identification et la caractérisation de cette séquence permettent d'une part de construire des cellules ou organismes recombinants exprimant de façon spécifique cette enzyme et, d'autre part, d'en envisager sa modification par mutagenèse dirigée ou aléatoire ou par évolution moléculaire (DNA Shuffling) afin d'en améliorer encore ses caractéristiques.

Cette invention permet en outre d'améliorer le rendement et la reproductibilité de la production des GOS d'intérêt pour les différentes applications citées ci-avant.

<Desc/Clms Page number 35>

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

(1) Monchois V., Willemot R. M., Monsan P. (1999). Glucansucrases : mechanism of action and structure-function relationships. FEMS microbiol. Rev. 23,131-151.

(2) Dols M., Remaud-Simeon M., Willemot R. M., Vignon M. R., Monsan P. F. (1998). Structural characterization of the maltose acceptor-products synthesised by Leuconostoc mesenteroides NRRL B- 1299 dextransucrase. Carbohydrate Research 305,549-559.

(3) Arnold F. H. (2001). Nature 409 n 6817,253.

(4) Monchois V. Vignon M., Russel R. R. B. (1999). Isolation of key amino-acid residues at the N-terminal end of the core region of

Streptococcus downei glucansucrase GTF-I. Appl. Microbiol. Biotechnol.

52,660-665.

(5) Wilke-Douglas M., Perchorowicz J. T., Houck C. M., Thomas B. R. (1989). Methods and compositions for altering physical characteristics of fruit and fruit products. PCT patent, WO 89/12386.

(6) Arguello-MOrales M. A., Remaud-Simeon M., Pizzut S., Sarçabal P., Willemot R. M., Monsan P. (2000). Sequence analysis of the gene encoding alternansucrase, a sucrose glucosyltransferase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355. FEMS Microb. Lett. 182,81-85.

(7) Devulapalle K. S., Goodman S., Gao Q., Hemsley A., Mooser G. (1997). Knowledge-based model of a glusocyltransferase from oral bacterial group of mutants streptococci. PProtein Sci. 6,2489-2493.

Claims (26)

REVENDICATIONS

1. Polypeptide isolé ayant une activité enzymatique de glycosyltransférase apte à former des dextranes présentant des ramifications a (1- 2) à partir de saccharose, d'a-D-fluoro-glucose, de

para-nitrophényt-a-D-g) ucopyranoside, d'a-D-gtucopyranoside-aDsorbofurano-side ou de 4-0-aD-galactopyranosylsucrose, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un domaine de liaison au glucane et un domaine à activité catalytique situé en aval du domaine de liaison au glucane.

2. Polypeptide selon la revendication 1 comprenant au moins deux domaines catalytiques situés de part et d'autre du domaine de liaison au glucane.

3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2 comprenant un peptide signal, une région variable, deux domaines catalytiques et un domaine de liaison au glucane situé entre les deux domaines catalytiques.

4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel le ou les domaine (s) à activité catalytique a (ont) un pourcentage de similarité compris entre 65 % et 100 % avec la SEQ. ID : n 1.

5. Polypeptide selon l'une des revendications précédentes dans lequel la taille du domaine de liaison au glucane est supérieure à 500 aminoacides.

6. Polypeptide selon la revendication 5. ayant la SEQ. ID : n 2.

7. Polypeptide selon la revendication 6 modifié par substitution, insertion, délétion de séquences d'acides aminés et

<Desc/Clms Page number 37>

Q en position 1019 et 2694.

H en position 637 et 2321,

2322,

D en positions 487,489, 527,638, 2170,2172, 2210 et

E en positions 430,565 et 2127,2248,

W en positions 425 et 2122,

8. Polypeptide selon la revendication 7 dans lequel les acides aminés suivants sont inchangés :

423-439 (SEQ. ID nu 6) 478-501 (SEQ. ID nu 7) 519-539 (SEQ. D n 8) 560-571 (SEQ. ID n 9) 631-645 (SEQ. Dn 10) 1014-1021 (SEQ D n 11) 2120-2138 (SEQ. ID n 12) 2161-2184 (SEQ. ID D n 13) 2202-2214 (SEQ. ID D n 14) 2243-2250 (SEQ. D n 15 2315-2322 (SEQ. D n 16) 2689-2696 (SEQ. ID n 17)

comportant des séquences présentant au moins 80 % et de préférence au moins 90 % de similarité avec les séquences suivantes de la séquence ID n 2 :

9. Acide nucléique isolé codant une enzyme à activité glycosyltransférase apte à former des dextranes présentant des

ramifications a1- 2 à partir de saccharose, d'a-D-fluoro-glucose, de paranitrophény !-a-D-g ! ucopyranoside, d'a-D-gtucopyranoside-aD-sorbofuranoside ou de 4-0-a-D-galactopyranosylsucrose, et comprenant au moins une séquence nucléotidique codant un domaine catalytique ayant au moins 50 %, et de préférence au moins 80 % d'identité avec la séquence ID nu 3, et situé en 3'd'une séquence codant un domaine de liaison au glucane.

<Desc/Clms Page number 38>

10. Acide nucléique selon la revendication 9 comprenant : a) deux séquences codant des domaines catalytiques ayant au moins 50 %, et de préférence au moins 80 % d'identité avec la séquence ID no 3 ; b) une séquence codant le domaine de liaison au glucane, ce dernier étant situé de préférence entre les deux séquences en a).

11. Acide nucléique isolé selon la revendication 10 présentant au moins 80 % d'identité avec a) la séquence ID no 4 ou ; b) le brin complémentaire de la séquence en a), ou c) une séquence hybridant a) ou b) en conditions stringentes.

12. Acide nucléique isolé selon la revendication 11 constitué de la séquence ID no 4 ou son brin complémentaire ou de la séquence déduite de la dégénérescence du. code génétique.

13. Acide nucléique isolé selon la revendication 11 comprenant : a) une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence codant une dextrane saccharase exprimée par le plasmide pCR-

T7-dsr D déposé à la CNCM le 15 mars 2001 sous le numéro 1-2649, ou b) une séquence complémentaire de la séquence en a).

14. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 9 à 13.

15. Vecteur selon la revendication 14 dans lequel l'acide nucléique est sous le contrôle de séquence permettant son expression dans des cellules procaryotes ou eucaryotes.

<Desc/Clms Page number 39>

16. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 13 ou un vecteur selon l'une des revendications 14 à 15.

17. Cellule transformée selon la revendication 16 choisie dans un groupe comprenant E. coli, les leuconostoc, les végétaux, les Lactococcus et les Bacillus ou les levures ;

18 cellule transformée selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de E. coli déposée à la CNCM le 15 mars 2001 sous le n 1-2649.

19. Procédé de production d'une dextrane saccharase apte à former des liaisons a1 2 comprenant : a) l'insertion d'un acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 13 ou un vecteur selon l'une des revendications 14 à 15 dans une cellule hôte selon la revendication 16 ; b) la purification de l'enzyme à partir d'un extrait cellulaire.

20. Procédé selon la revendication 19 dans lequel la cellule hôte est un procaryote choisi dans un groupe comprenant E. coli, les Lactococci, les Bacillus, les Leuconostoc..

21. Procédé selon la revendication 19 dans lequel la cellule hôte est un eucaryote choisi dans un groupe comprenant les levures, les champignons, les végétaux.

22. Procédé d'obtention d'une dextrane saccharase apte à former des oligosides ou des dextranes présentant un taux de liaison a (1- 2) supérieur à 30 % des liaisons totales comprenant une étape de

<Desc/Clms Page number 40>

Q en positions 1019 et 2694 codés respectivement par les triplets CM (3055) et CAG (8080).

H en position 637 et 2321, codés respectivement par les triplets CAT en position 1909 et CAC en position 6961,

D en positions 2172 et 2322 codés par les triplets GAT en positions 6514 et 6964,

6508 et 6628 respectivement,

D en positions 487,489, 527,638, 2170 et 2210 codés par les triplets GAT en positions 1459,1465, 1579,1912,

E en positions 430,565, 2127 et 2248 codés par les triplets GAA en positions 1288,1693, 6379 et 6742 respectivement,

W en positions 425 ou 2122, codé par le triplet TGG en positions 1273 et 6364,

modification de la séquence ID no 4 par addition, délétion, mutation à partir du moment ou : - le cadre de lecture n'est pas modifié, et - les acides aminés suivants sont conservés après traduction :

23. Procédé d'obtention d'une glycosyltransférase isolée apte à former des oligosides ou des dextranes présentant un taux de liaison a (1- 2) supérieur à 30 % comprenant : - une étape de modification aléatoire de la séquence ID n 4 et d'établissement d'une banque de variants, - une étape d'expression de ces séquences modifiées dans une cellule hôte appropriée, un hôte abritant un variant, - une étape de criblage des hôtes exprimant une enzyme apte à former plus de 30 % de liaison a (1- 2) sur un substrat approprié,

- une étape d'isolement du ou des gènes améliorés.

<Desc/Clms Page number 41>

24. glycosyltransférase apte à former au moins 30 % de liaison a (1-) 2) susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 19 à 22.

25. Utilisation d'une glycosyltransférase obtenue par un procédé selon l'une des revendications 19 à 22 dans la fabrication d'une composition à effet prébiotique.

26. Utilisation d'une glycosyltransférase obtenue par un procédé selon l'une des revendications 19 à 23 dans la fabrication d'une composition pharmaceutique ou cosmétique.