FR2821241A1

FR2821241A1 - Use of peptaibols to stimulate the natural defenses of plants against fungal, bacterial or viral attack

Info

Publication number: FR2821241A1
Application number: FR0102933A
Authority: FR
Inventors: Olivier Besnard
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2002-08-30

Abstract

The use of peptaibols to stimulate the natural defenses of plants against attack by fungal, bacterial or viral pathogens. Peptaibols having at least one amino acid, selected from aminoisobutyric acid, isovaline, valinol, tryptophanol, and phenylalaminol, are used to stimulate the natural defenses of whole plants, against attack by fungal, bacterial or viral pathogens by foliar or radical application or by injection. An independent claim is also included for the production of a peptaibol from filamentary fungi e.g. Trichoderma, or by a non-ribosomal process giving a protein template for peptide synthetase, or by a peptide synthetic route. ACTIVITY : Plant Antibacterial; Plant Antifungal; Plant Antiviral. MECHANISM OF ACTION : Immunostimulant.

Description

DESCRIPTION
L'invention concerne une nouvelle utilisation de peptaibols pour la stimulation des défenses naturelles des plantes contre les pathogènes fongiques et/ou bactériens et/ou viraux. DESCRIPTION
The invention relates to a new use of peptaibols for stimulating the natural defenses of plants against fungal and / or bacterial and / or viral pathogens.

Les produits les plus répandus dans ce type d'action sont les éliciteurs. The most common products in this type of action are the elicitors.

Ils peuvent être d'origine : - chimique : notamment les ions mercuriques, cuivriques et aluminiques, les acides arachidonique, phosphoreux, salicylique, fulvique et humique ; - biochimique : notamment les oligosaccharidiques extraits des animaux et végétaux tels que le chitosan, les fucosides et ceux issus d'algues ; - bactérienne : notamment à base de broyats complets de bactéries inactivées, mais aussi d'extraits peptidiques de Pseudomonas, Clavibacter et Xanthomonas tels que l'harpine et autres polypeptids ; - fongique : notamment des types protéiniques, enzymatiques et même oligopeptidiques. They can be of: - chemical origin: in particular mercuric, cupric and aluminum ions, arachidonic, phosphorous, salicylic, fulvic and humic acids; - biochemical: in particular the oligosaccharides extracted from animals and plants such as chitosan, fucosides and those derived from algae; - bacterial: in particular based on complete ground material of inactivated bacteria, but also on peptide extracts of Pseudomonas, Clavibacter and Xanthomonas such as harpine and other polypeptids; - fungal: in particular protein, enzymatic and even oligopeptide types.

Ces derniers sont essentiellement des élicitines issus de Phytophtora et Pythium. Leur composition en acides aminés de la partie N-terminale est variable, et ce critère permet de les classer en diverses familles. L'oligandrine, qui ne contient pas certains résidus (tryptophane, histidine, arginine), contient en abondance d'autres résidus comme la Thréonine et la sérine dans sa partie N-terminale. Ceci constitue une caractéristique

clé dans la reconnaissance de l'empreinte d'une élicitine. On peut citer les élicitines déjà décrites à partir de Phytophtora (crytogéine, cinnamomine, dreschlerin, megaspermine, capsciceine, parasiticeine, cactoreine, infestine) et à partir de Pythium (vexines et oligandrines). The latter are essentially elicitins from Phytophtora and Pythium. Their amino acid composition of the N-terminal part is variable, and this criterion allows them to be classified into various families. Oligandrine, which does not contain certain residues (tryptophan, histidine, arginine), contains in abundance other residues such as Threonine and serine in its N-terminal part. This is a characteristic

key in recognizing the imprint of an elicitin. Mention may be made of the elicitins already described from Phytophtora (crytogeine, cinnamomine, dreschlerin, megaspermine, capsciceine, parasiticeine, cactoreine, infestine) and from Pythium (vexins and oligandrines).

Les éliciteurs selon l'invention sont des petits peptides d'une vingtaine d'acides

aminés spécifiques (oligopeptides). The elicitors according to the invention are small peptides of around twenty acids

specific amines (oligopeptides).

Leur composition comprend au moins un acide aminé choisi parmi l'aminoisobutyrique (Aib), l'isovaline (Iva), le valinol, le tryptophanol, le phenylalaminol, la pipérazine. Their composition comprises at least one amino acid chosen from aminobutyric acid (Aib), isovaline (Iva), valinol, tryptophanol, phenylalaminol, piperazine.

Ils sont classés sous le nom spécifique de peptaibols)). They are classified under the specific name of peptaibols)).

Les peptaibols sont actuellement connus pour leurs propriétés biologiques, antibiotiques dans des applications médicales. Peptaibols are currently known for their biological properties, antibiotics in medical applications.

Alors que les peptaibols, selon l'invention, sont utilisés comme stimulateur des défenses naturelles des plantes entières par application foliaire, racinaire ou par injection, contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux et/ou ravageurs. Whereas the peptaibols, according to the invention, are used as stimulator of the natural defenses of whole plants by foliar, root application or by injection, against pathogens of cultures of the fungal and / or bacterial and / or viral and / or pest types.

Lesdits peptaibols sont incorporés à un véhicule autorisé en agriculture de type Said peptaibols are incorporated into a vehicle authorized in agriculture of the type

mouillant et pénétrant. wetting and penetrating.

La composition en question peut se présenter sous la forme : - liquide, notamment sous la forme de solution aqueuse ; - solide, notamment sous la forme de poudres, granulés ou en enrobage de semences. The composition in question can be in the form: - liquid, in particular in the form of an aqueous solution; - solid, especially in the form of powders, granules or as a seed coating.

Ils peuvent être obtenus à partir : - de champignons filamenteux, notamment le Trichoderma ; - selon un processus non-ribosomal qui se présente sous la forme de templat protéinique dénommé peptides synthétases ; - par voie de synthèse peptidique. They can be obtained from: - filamentous fungi, in particular Trichoderma; - according to a non-ribosomal process which takes the form of a protein templat called peptide synthetases; - by peptide synthesis.

Par rapport aux enzymes et aux polypeptides, la production de peptaibols comprenant 7 à 10 acides aminés permet un gain de productivité important (en énergie et en temps). En outre, la concentration à pulvériser à l'hectare est beaucoup plus

faible (économie de produit). Compared to enzymes and polypeptides, the production of peptaibols comprising 7 to 10 amino acids allows a significant gain in productivity (in energy and time). In addition, the concentration to be sprayed per hectare is much higher

low (product saving).

Enfin, leur dégradabilité dans la nature est beaucoup plus rapide. Par rapport aux éliciteurs (oligopeptides) connus, les peptaibols comportent une structure hélicoïdale qui possède un pouvoir de pénétration plus prononcé favorisant la perforation des membranes des cellules avec pour conséquence une efficacité de destruction plus importante. Finally, their degradability in nature is much faster. Compared to known elicitors (oligopeptides), peptaibols have a helical structure which has a more pronounced penetrating power promoting the perforation of cell membranes with consequent greater destruction efficiency.

Les caractéristiques et les avantages de l'invention vont être exposés ci-après de manière détaillée. The characteristics and advantages of the invention will be explained below in detail.

DEFINITION DES PEPTAIBOLS Les peptaibols sont des peptides linéaires de nature hydrophobe dont la masse est comprise entre 1 et 2 kDa. Ils sont composés de 7 à 20 aminoacides. Ces derniers

sont représentés par de fortes proportions de glycins C '' disubstitués : l'acide a-aminoisobutyrique (Aib), isovaline (Iva), valinol, tryptophanol, phenylalaminol, pipérazine. DEFINITION OF PEPTAIBOLS Peptaibols are linear peptides of hydrophobic nature with a mass between 1 and 2 kDa. They are composed of 7 to 20 amino acids. These latter

are represented by high proportions of disubstituted C 'glycins: a-aminoisobutyric acid (Aib), isovaline (Iva), valinol, tryptophanol, phenylalaminol, piperazine.

Ils possèdent un groupe acyl en extrimité N-terminale et un a-aminoalcool dans la partie C-terminale. Il existe tout de même quelques exceptions, par exemple, récemment un peptaibol ayant à son extrémité C-terminale un aminoacide cyclique (pipérazine) a été isolé. They have an acyl group at the N-terminal end and an α-amino alcohol in the C-terminal part. There are still some exceptions, for example, recently a peptaibol having at its C-terminal a cyclic amino acid (piperazine) was isolated.

Selon le nombre et la nature des résidus, les peptaibols forment trois sous-classes : 1-les peptaibols à chaîne longue avec 18-20 résidus comme l'alaméthicine isolé de

Trichoderma viride ; 2-les peptaibols ayant une séquence courte constituée de 11 à 16 résidus ; 3-les lipopeptaibols avec 11 résidus et une chaîne lipidique en extrémité N-terminale. Depending on the number and nature of the residues, peptaibols form three subclasses: 1-long chain peptaibols with 18-20 residues such as alamethicine isolated from

Trichoderma viride; 2-peptaibols having a short sequence consisting of 11 to 16 residues; 3-lipopeptaibols with 11 residues and a lipid chain at the N-terminal end.

Les peptaibols en question sont des produits naturels d'origine fongique. Ils sont produits comme métabolites secondaires, surtout par le genre Trichoderma connu pour son antagonisme en latte biologique. The peptaibols in question are natural products of fungal origin. They are produced as secondary metabolites, especially by the genus Trichoderma known for its antagonism in biological latte.

La biosynthèse des peptaibols n'est pas directement codée par le matériel génétique microbien comme dans le cas des protéines. Le système métabolique responsable de leur synthèse n'est pas constitutif, mais il est induit chez l'organisme producteur par la présence d'autres champignons compétiteurs. L'assemblage des acides aminés constituants les peptaibols est donc assuré par un processus non-ribosomal qui se présente sous forme de templat protéinique appelé peptides synthétases. The biosynthesis of peptaibols is not directly encoded by microbial genetic material as in the case of proteins. The metabolic system responsible for their synthesis is not constitutive, but it is induced in the producing organism by the presence of other competing fungi. The assembly of the amino acids constituting the peptaibols is therefore ensured by a non-ribosomal process which takes the form of a protein templat called peptide synthetases.

La synthèse de la chaîne peptidique est généralement terminée par l'attachement de l'acide aminoalcool. The synthesis of the peptide chain is generally completed by the attachment of the aminoalcoholic acid.

Cependant il existe certaines exceptions comme c'est le cas de l'aibellin qui possède en son extrimité C-terminale un aminoalcool modifié ou les trichobachines qui ont une glycine à l'extrémité C-terminale et les clonostachines contenant un sucre lié au carboxyle terminal par une liaison ester. However there are certain exceptions such as the case of aibellin which has at its C-terminal end a modified aminoalcohol or the trichobachines which have a glycine at the C-terminal end and the clonostachines containing a sugar linked to the terminal carboxyl by an ester link.

En plus, plusieurs peptides contenant l'Aib sont apparentés aux peptaibols, comme par

exemple les efrapeptines, les aminolipopeptides leucinostatines, trichoplines, et helioferines. Ces peptides contiennent à leurs extrémités c-terminales des résidus inhabituels de forme cyclique ou linéaire. L'hétérogénéité des séquences peptidiques représentant les peptaibols peut s'expliquer par la non spécificité du système enzymatique envers les différents acides aminés. In addition, several Aib-containing peptides are related to peptaibols, such as

example efrapeptins, aminolipopeptides leucinostatin, trichoplines, and helioferins. These peptides contain at their c-terminal ends unusual residues of cyclic or linear form. The heterogeneity of the peptide sequences representing the peptaibols can be explained by the non-specificity of the enzymatic system towards the various amino acids.

La détermination de la structure des protéines peut être prédit par la traduction de l'ARN messager codant pour leur biosynthèse. Mais, dans le cas des peptaibols cela n'est pas possible puisque leur synthèse n'est pas directement codée par les gènes, et les méthodes chimiques s'avèrent nécessaires. The determination of the structure of proteins can be predicted by the translation of messenger RNA coding for their biosynthesis. But, in the case of peptaibols this is not possible since their synthesis is not directly coded by genes, and chemical methods are necessary.

PROPRIETES BIOLOGIQUES DES PEPTAIBOLS Les acides aminés qui constituent les peptaibols sont responsables de leur comportement physicochimique. Ainsi, ils adoptent une structure linéaire, hélicoïdale et un caractère amphiphile qui leur permet d'interagir avec les bicouches phospholipidiques en perturbant leur organisation. BIOLOGICAL PROPERTIES OF PEPTAIBOLS The amino acids that make up peptaibols are responsible for their physicochemical behavior. Thus, they adopt a linear, helical structure and an amphiphilic character which allows them to interact with phospholipid bilayers by disturbing their organization.

Utilisée à une concentration de 25-50 mM, l'alamethecine (mélange de peptaibols issus de Trichoderma viride dont le composé majoritaire contient 8 résidus Aib et 2 prolines) augmente la perméabilité des membranes cellulaires et mitochondriales, et de certaines bactéries de la panse des ruminants. De même les trichorzianes A et B

inhibent la croissance de l'amibe Dictyostelium discoideum dont la lyse intervient à des Used at a concentration of 25-50 mM, alamethecine (mixture of peptaibols from Trichoderma viride, the main compound of which contains 8 Aib residues and 2 prolines) increases the permeability of cell and mitochondrial membranes, and of certain bacteria of the rumen ruminants. Likewise the trichorzians A and B

inhibit the growth of the amoeba Dictyostelium discoideum whose lysis occurs at

concentrations de 7 et de 25 uM de trichorzianine neutre (TA Il c) et trichorzianine acide (TB Illc).

concentrations of 7 and 25 µM of neutral trichorzianin (TA II c) and acid trichorzianin (TB Illc).

Tout récemment, on a attribué aux peptaibols des activités biologiques très intéressantes, comme l'action antibiotique contre le virus de la mosaïque du tabac attaquant des jeunes plants de haricots de Lima. Very recently, peptaibols have been attributed to very interesting biological activities, such as the antibiotic action against the tobacco mosaic virus attacking young lima bean plants.

OLIGOPERTIDES DU TYPE PEPTAIBOLS CONNUS Ils sont connus sous les appellations suivantes : Aibellin, Alamethicin-F-30,

Ampullosporin, Antiamoebin-I, Atroviridin-A, Bergofungin-A, Boletusin, ChrysosperminA, Clonostachin, Emerimicin-D-A, Harzianin-HB-I, Hypelcin-A, Hypomurocin-A-I, Leu1Zervamicin, Longhibrachin-A-I, LP237-F7, NA-VII, Paracelsin-A, Peptaibolin, Peptaivirin-A, Polysporin-A, Pseudokinin-KLIII, Samarosporin-I, Saturnisporin-I, Saturnisporin-SA-I, Stilbellin-t, Suzukacillin, Trichocellin-TC-A-I, Trichodecenin-TD-I, Trichogin-A-IV, Trichokindin-la, Trichokonin-la, Trichokonin-lb, Trichokonin-Xa, Trichokonin-Ilb, Trichokonin-Ilc, Tricholongin-BI, Trichorovin-TV-la, Trichorozin- !, Trichorzianine-TA-Illc, Trichorzin-HA-I, Trichosporin-TS-B-la-1, Trichotoxin-A-40, Trikoningin-KA-V, Tylopeptin-A, XR586, Zervamicin-A-1-16. EXEMPLE DE TRAVAUX DE PRODUCTION ET DE DÉTECTION DE PEPTAIBOLS À PARTIR DE CULTURES DE CHAMPIGNONS Le screening des microorganismes a été réalisé sur une collection de souches fongiques. Les souches sont repiquées sur un milieu de malt gélosé (30 g de malt, 15g d'agar et 1 litre d'eau distillée). Les tubes de culture sont incubés dans une étuve thermostatée pendant quelques jours, et la conservation est faite à 4 C. KNOWN PEPTAIBOLS-TYPE OLIGOPERTIDES They are known by the following names: Aibellin, Alamethicin-F-30,

Ampullosporin, Antiamoebin-I, Atroviridin-A, Bergofungin-A, Boletusin, ChrysosperminA, Clonostachin, Emerimicin-DA, Harzianin-HB-I, Hypelcin-A, Hypomurocin-AI, Leu1Zervamicin, Longhibrachin-AI, LP237 -7 VII, Paracelsin-A, Peptaibolin, Peptaivirin-A, Polysporin-A, Pseudokinin-KLIII, Samarosporin-I, Saturnisporin-I, Saturnisporin-SA-I, Stilbellin-t, Suzukacillin, Trichocellin-TC-AI, Trichodecenin I, Trichogin-A-IV, Trichokindin-la, Trichokonin-la, Trichokonin-lb, Trichokonin-Xa, Trichokonin-Ilb, Trichokonin-Ilc, Tricholongin-BI, Trichorovin-TV-la, Trichorozin-!, Trichorzianine-TA- Illc, Trichorzin-HA-I, Trichosporin-TS-B-la-1, Trichotoxin-A-40, Trikoningin-KA-V, Tylopeptin-A, XR586, Zervamicin-A-1-16. EXAMPLE OF PRODUCTION AND DETECTION OF PEPTAIBOLS FROM MUSHROOM CULTURES Screening of microorganisms was carried out on a collection of fungal strains. The strains are subcultured on an agar malt medium (30 g of malt, 15 g of agar and 1 liter of distilled water). The culture tubes are incubated in a thermostatically controlled oven for a few days, and the storage is made at 4 C.

Les cultures sont réalisées en fioles de Roux sur milieu synthétique liquide (170 ml de milieu par fiole d'un litre). Après stérilisation, l'ensemencement est effectué par 2 ml d'une suspension de spores et les préparations sont portées à l'incubation.

The cultures are carried out in Roux flasks on liquid synthetic medium (170 ml of medium per one liter flask). After sterilization, the seeding is carried out with 2 ml of a spore suspension and the preparations are brought to incubation.

1-Composition des milieux de culture pour Trichoderma harzianum pep 10 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) ; 10,8 g de nitrate de potassium (KNO3) ; 7,5 g de sulfate de magnesium (MgS04) ; 3 g de phosphate de calcium monobasique (Ca (P04H2) 2 ; 0,15 g de sulfate de manganèse (MnSO4,5H2O) ; 0,15 g de sulfate de zinc (ZnS04, 7H2O) ; 0,075 de sulfate de cuivre (Cu S04, 5H2O) ; 0,015 de sulfate de fer (FeSO4, 7H2O) ; 75 g de glucose ; 15 litres d'eau distillée. 1-Composition of the culture media for Trichoderma harzianum pep 10 g of potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4); 10.8 g potassium nitrate (KNO3); 7.5 g magnesium sulfate (MgSO4); 3 g of monobasic calcium phosphate (Ca (P04H2) 2; 0.15 g of manganese sulfate (MnSO4.5H2O); 0.15 g of zinc sulfate (ZnS04, 7H2O); 0.075 of copper sulfate (Cu S04 , 5H2O); 0.015 iron sulphate (FeSO4, 7H2O); 75 g of glucose; 15 liters of distilled water.

2-Extraction-Purification Les préparations de cultures sont filtrées sur des dispositifs de filtration ayant une porosité de 0,2 microns. Le mycellium est lavé au n-butanol, et le filtrat est extrait 3 fois avec le même solvant. La phase organique est concentrée par élimination du solvant 2-Extraction-Purification The culture preparations are filtered on filtration devices having a porosity of 0.2 microns. The mycellium is washed with n-butanol, and the filtrate is extracted 3 times with the same solvent. The organic phase is concentrated by removing the solvent

sous vide. Le résidu obtenu est repris dans du méthanol et refiltré sur une membrane de 0, 1 microns. La présence de peptaibols est révélée en CCM. On utilise comme système de développement, un mélange de solvants composé de dichlorométhane/ méthanol (80/20), et comme réactif de révélation la solution suivante : acide acétique/acide sulfurique/p-anisaldéhyde : 50 ml/1 ml/1 ml. Le résidu méthanolique est chromatographié sur une colonne de gel de Séphadex LH20 avec le méthanol comme éluant. Les fractions ainsi obtenues sont de nouveau chromatographiées sur une colonne de gel de silice. Le système d'élution utilisé est constitué d'un gradient de méthanol dans le dichlorométhane. under vacuum. The residue obtained is taken up in methanol and re-filtered through a 0.1 micron membrane. The presence of peptaibols is revealed in TLC. A development mixture is used, a mixture of solvents composed of dichloromethane / methanol (80/20), and as a development reagent the following solution: acetic acid / sulfuric acid / p-anisaldehyde: 50 ml / 1 ml / 1 ml. The methanolic residue is chromatographed on a column of Sephadex LH20 gel with methanol as eluent. The fractions thus obtained are again chromatographed on a column of silica gel. The elution system used consists of a gradient of methanol in dichloromethane.

3-Microséquençage d'un peptaibol La détermination de la séquence d'aminoacides composant une protéine repose sur l'emploi de deux méthodes complémentaires : a) Séquençage chimique par la méthode d'Edmans-Matsudaira [A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing. Academic Press, Inc., NY, Edmans-Matsudaira (eds.) 1989]. Cette méthode est automatisée et efficace pour un polypeptide ne dépassant pas les 100 résidus. b) Coupure enzymatique à l'aide d'endopeptidases. On obtient des fragments peptidiques assez courts qui sont faciles à analyser par la méthode chimique. 3-Microsequencing of a peptaibol The determination of the amino acid sequence making up a protein is based on the use of two complementary methods: a) Chemical sequencing by the Edmans-Matsudaira method [A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing. Academic Press, Inc., NY, Edmans-Matsudaira (eds.) 1989]. This method is automated and effective for a polypeptide not exceeding 100 residues. b) Enzymatic cleavage using endopeptidases. Quite short peptide fragments are obtained which are easy to analyze by the chemical method.

La séquence peptidique peut être obtenue en recoupant les informations issues de différentes méthodes : - enzymes spécifiques coupant la liaison entre deux acides aminés bien précis ; - enzymes qui libèrent l'acide aminé N-terminal ; - enzymes qui libèrent l'acide aminé C-terminal ; - réactifs chimiques qui coupent la liaison dans laquelle est engagé le carboxyle d'un acide aminé bien déterminé. Ce qui est le cas pour certaines enzymes. The peptide sequence can be obtained by cross-checking information from different methods: - specific enzymes cutting the link between two very precise amino acids; - enzymes which release the N-terminal amino acid; - enzymes which release the C-terminal amino acid; - chemical reagents which cut the bond in which the carboxyl of a well-defined amino acid is engaged. This is the case for certain enzymes.

4-Élucidation Les différents peptaibols sont ensuite séparés par HPLC semi-préparative, en utilisant une colonne de silice greffée C-18 de type Sphérisorb ODS2 et un collecteur de fractions. Le débit est fixé à 2 ml/min. L'éluant est composé d'un mélange eau/ méthanol (90/10). La détection est effectuée sous UV à une longueur d'onde (lambda : 220 nm). 4-Elucidation The different peptaibols are then separated by semi-preparative HPLC, using a column of C-18 grafted silica of the Spherisorb ODS2 type and a fraction collector. The flow rate is fixed at 2 ml / min. The eluent is composed of a water / methanol mixture (90/10). The detection is carried out under UV at a wavelength (lambda: 220 nm).

Les structures chimiques des peptides sont caractérisées par Spectrométrie de masse (SM) et RMN. En SM, les peptaibols contenant la liaison Aib-Pro sont caractérisés par

la rupture de celle-ci. En effet, le caractère basique de l'azote sur la proline rend cette liaison labile. Après fixation d'un proton, une rupture de la liaison Aib-Pro intervient et The chemical structures of the peptides are characterized by Mass Spectrometry (MS) and NMR. In SM, the peptaibols containing the Aib-Pro bond are characterized by

breaking it. Indeed, the basic nature of nitrogen on proline makes this bond labile. After fixing a proton, the Aib-Pro link breaks down and

génère deux fragments caractéristiques. Deux modes d'ionisation sont applicables : La méthode FAB où les ions sont formés par bombardement avec des atomes accélérés de Xénon ayant une énergie de 8 Kev. La technique d'ionisation par électrospray en mode positif et négatif. generates two characteristic fragments. Two modes of ionization are applicable: The FAB method where the ions are formed by bombardment with accelerated Xenon atoms having an energy of 8 Kev. The electrospray ionization technique in positive and negative mode.

En Résonance Magnétique Nucléaire, les spectres RMN du proton et carbone 13C sont obtenus sur des spectromètres Bruker, AC 300 et AM 400 équipés respectivement de calculateurs Aspect 3000 et X 32. Les déplacements chimiques sont déterminés par rapport au TMS. Les expériences RMN 2D sont réalisés à l'aide du logiciel Bruker DIS NMR 89. In Nuclear Magnetic Resonance, the 13C proton and carbon NMR spectra are obtained on Bruker, AC 300 and AM 400 spectrometers equipped with Aspect 3000 and X 32 computers respectively. The chemical shifts are determined relative to the TMS. 2D NMR experiments are carried out using Bruker DIS NMR 89 software.

L'élucidation de la structure peptidique exacte de chaque peptaibol est assurée par le recoupement des informations obtenues lors de l'hydrolyse acide totale avec celles fournies par les méthodes spectrales. Ainsi, la SM nous permet d'établir les séquences peptidiques alors qu'à l'aide des différentes expériences en RMN bidimensionnelle, on peut différencier entre deux acides aminés ayant le même poids moléculaire. The elucidation of the exact peptide structure of each peptaibol is ensured by cross-checking the information obtained during total acid hydrolysis with that provided by spectral methods. Thus, MS allows us to establish peptide sequences whereas, using different two-dimensional NMR experiments, we can differentiate between two amino acids with the same molecular weight.

EXEMPLE DE SYNTHÈSE CHIMIQUE DES PEPTAIBOLS Il faut pour cela surmonter les problèmes dus aux encombrements stériques des acides aminés alpha-alpha disubstitués (couplage incomplet, racémisation, etc...) et aux dégradations des liaisons acido-labiles du type Aib-Pro. EXAMPLE OF CHEMICAL SYNTHESIS OF PEPTAIBOLS This requires overcoming the problems due to steric hindrance of the disubstituted alpha-alpha amino acids (incomplete coupling, racemization, etc.) and to the degradation of the acid-labile bonds of the Aib-Pro type.

La synthèse en phase solide semble apporter la solution à ce genre de problèmes. Par exemple, la synthèse totale de l'alamethicine a été réalisée par le remplacement de tous les résidus Aib dans la séquence par des Leucines. Solid phase synthesis seems to provide the solution to this kind of problem. For example, the total synthesis of alamethicin was carried out by replacing all the Aib residues in the sequence with Leucines.

Les Fmoc-aminoalcools sont facilement fixés sur une résine commerciale de type 2chlorotrityle, par l'utilisation d'un mélange binaire de dichlorométhane et de DMF et d'une base comme la pyridine. The Fmoc-amino alcohols are easily fixed on a commercial resin of the 2chlorotrityl type, by the use of a binary mixture of dichloromethane and DMF and a base such as pyridine.

La résine peut fixer jusqu'à 0.24mM/g de Fmoc-aminoalcool après 6 heures de réactions. Les résines ainsi chargées, sont utilisées pour l'assemblage progressif des acides aminés dans un synthétiseur automatisé. Le clivage de la liaison éther entre les peptides et la résine est réalisé pendant 45 minutes à l'aide d'un mélange constitué de 50% TFA/DCM, 2% d'isopropylsilane, 5% H20 et 5% de phénol. The resin can fix up to 0.24 mM / g of Fmoc-amino alcohol after 6 hours of reactions. The resins thus loaded are used for the progressive assembly of amino acids in an automated synthesizer. The ether bond between the peptides and the resin is cleaved for 45 minutes using a mixture of 50% TFA / DCM, 2% isopropylsilane, 5% H2O and 5% phenol.

Sous ces conditions, tous les groupes protecteurs sont clivés sans affecter la liaison acidolabile Aib-Pro. Les peptides sont ensuite purifiés par HPLC préparative et leurs séquences déterminées par !'analyse des acides aminés à la spectrographie de masse. La racémisation des acides aminés à été étudiée selon la méthode de Kusumoto et al (1981). Under these conditions, all the protective groups are cleaved without affecting the Aib-Pro acidolabile bond. The peptides are then purified by preparative HPLC and their sequences determined by amino acid analysis using mass spectrography. The racemization of amino acids has been studied according to the method of Kusumoto et al (1981).

On fixe des aminoalcools sur la résine chlorotritylé. La fixation du Fmoc-aminoalcool Amino alcohols are fixed on the chlorotrityl resin. Fixation of Fmoc-aminoalcohol

sur la résine chlorotrityle est effectuée comme suit : 250 mg de résine (0, 32mmol) et 0, 96 mmole de Fmoc-aminoalcool et 1, 92 mmole de pyridine sont agités pendant 6,24, 48 et 72 heures dans 1,5 ml de dichlorométhane anhydre. On ajoute 4 ml de méthanol et on laisse agiter pendant 30 minutes pour que la réaction soit complète. on the chlorotrityl resin is carried out as follows: 250 mg of resin (0.32 mmol) and 0.96 mmol of Fmoc-aminoalcohol and 1.92 mmol of pyridine are stirred for 6.24, 48 and 72 hours in 1.5 ml anhydrous dichloromethane. 4 ml of methanol are added and the mixture is left to stir for 30 minutes so that the reaction is complete.

La résine chargée et lavée et le clivage du groupe Fmoc est réalisé par un traitement de la résine avec une solution de 20% pyridine dans du DMF pendant 15 minutes. La charge de la résine est déterminée par l'analyse aux U. V. The loaded and washed resin and the cleavage of the Fmoc group is carried out by treating the resin with a solution of 20% pyridine in DMF for 15 minutes. The charge of the resin is determined by analysis in U. V.

Réactifs d'activation et dérivées d'acides aminés : Préparation du Fmoc-valinol et du Fmoc-phenylaminol : 20 mMole d'aminoalcool ;

24 mmole de 9-fluorenylméthyl chloroformate ; 20 mMole de triéthylamine dans 50 ml de dichlorométhane anhydre. Activation reagents and amino acid derivatives: Preparation of Fmoc-valinol and Fmoc-phenylaminol: 20 mMole of amino alcohol;

24 mmol of 9-fluorenylmethyl chloroformate; 20 mMole of triethylamine in 50 ml of anhydrous dichloromethane.

Ces réactifs sont agités ensemble à température adéquate pendant 1 minute On évapore le CH2CI2 sous vide et le résidu obtenu est lavé à l'éther, 10% d'acide citrique et à l'eau. These reagents are stirred together at an appropriate temperature for 1 minute. The CH2Cl2 is evaporated under vacuum and the residue obtained is washed with ether, 10% citric acid and with water.

Le solide est dissout dans l'acétate d'éthyle et séché sur MgSo4. The solid is dissolved in ethyl acetate and dried over MgSo4.

Après évaporation du solvant et précipitation dans de l'hexane, on, récupère un solide blanc.

After evaporation of the solvent and precipitation in hexane, a white solid is recovered.

C'est le peptaibol dont la structure est confirmée par les méthodes analytiques classiques. It is peptaibol, the structure of which is confirmed by conventional analytical methods.

EFFETS PHYSIOLOGIQUES DES PEPTAIBOLS Après avoir essayé des peptaibols selon l'invention, il a été conclu que ces derniers induisent la biosynthèse de produits volatils, ce qui n'est pas le cas de certains peptides connus pour leurs propriétés de former des canaux ioniques ou de transporter des ions. PHYSIOLOGICAL EFFECTS OF PEPTAIBOLS After having tried peptaibols according to the invention, it was concluded that the latter induce the biosynthesis of volatile products, which is not the case for certain peptides known for their properties of forming ion channels or carry ions.

1-Choix des marqueurs biochimiques sur plantes entières a) Mesure de l'activité peroxydasique (enzyme endogène aux plantes) Les peroxydases tiennent en effet une place prépondérante dans les mécanismes de résistance des plantes. 1-Choice of biochemical markers on whole plants a) Measurement of peroxidase activity (enzyme endogenous to plants) Peroxidases have a predominant place in the resistance mechanisms of plants.

Elles participent à la production d'espèces actives de l'oxygène à la fois toxiques pour les agents pathogènes et impliquées dans la formation de la réaction

d'hypersensibilité (HR). Elles interviennent également dans la modification de la paroi cellulaire résultant d'une augmentation de la synthèse de la lignine et/ou de subérine (barrières mécaniques) ainsi que dans la réalisation de pontages covalents entre les protéines de la paroi cellulaire. Elles permettent l'oxydation de phénols en quinones They participate in the production of active oxygen species both toxic to pathogens and involved in the formation of the reaction

hypersensitivity (HR). They also intervene in the modification of the cell wall resulting from an increase in the synthesis of lignin and / or suberin (mechanical barriers) as well as in the realization of covalent bridges between the proteins of the cell wall. They allow the oxidation of phenols to quinones

très toxiques et l'incorporation des flavonoïdes dans les parois (barrière chimique). Compte tenu du rôle primordial des peroxydases dans la résistance des plantes, nous avons utilisé l'activité peroxydasique comme marqueur de la résistance suite aux traitements par des éliciteurs. very toxic and the incorporation of flavonoids in the walls (chemical barrier). Given the essential role of peroxidases in plant resistance, we have used peroxidase activity as a marker of resistance following treatment with elicitors.

Afin de doser les activités peroxydasiques, les feuilles sont broyées en milieu tampon tris-maléate pH6. In order to measure the peroxidase activities, the leaves are ground in a tris-maleate pH6 buffer medium.

L'extrait est ensuite mis en présence de gaïacol et de l'eau oxygénée et une réaction rapide se fait : le gaïacol est transformé en tétragaïacol. L'apparition du tétragaiacol dans le milieu, nous permet de calculer l'activité peroxydasique. The extract is then placed in the presence of guaiacol and hydrogen peroxide and a rapid reaction takes place: the guaiacol is transformed into tetragaiacol. The appearance of tetragaiacol in the medium allows us to calculate the peroxidase activity.

Les dosages sont effectués dans ce même tampon en utilisant le gaïacol comme substrat. Les résultats sont exprimés en ADO/Mn/gMF. b) Mesure de l'activité chitinasique Afin de vérifier que les mécanismes de résistance sont déclenchés, nous avons également dosé une activité enzymatique apparaissant dans les situations de résistance : l'activité chitinasique (enzyme synthétisée dès l'attaque des parasites, qui dégrade la chitine, constituant des parois des champignons phytopathogènes). The assays are carried out in this same buffer using guaiacol as a substrate. The results are expressed in ADO / Mn / gMF. b) Measurement of the chitinasic activity In order to verify that the resistance mechanisms are triggered, we have also assayed an enzymatic activity appearing in the situations of resistance: the chitinasic activity (enzyme synthesized from the attack of the parasites, which degrades the chitin, constituting the walls of phytopathogenic fungi).

- Réaction colorimétrique utilisée :

Para Nito Phénol PNP analogue de substrat 10 p (2mg 1 ml) + extrait enzymatique brut + tampon acétate qsp 0, 5 ml/50 mM/pH5.

- Colorimetric reaction used:

Para Nito Phenol PNP analog of substrate 10 p (2mg 1 ml) + crude enzyme extract + acetate buffer qs 0, 5 ml / 50 mM / pH5.

- 7 incubation 2 h au bain-marie 37 C - 7 + 0, 5 ml Na2Co3 (0, 2 M) - 7 mesure colorimétrique au spectrophotomètre

coef. d'extinction 7. 10-3 n cm-1 à 410 nm Activité chitinasique exprimée en nM de PNP par g de matière fraîche par heure 2-Matériel végétal utilisé Toutes les plantes testées sont des jeunes plants obtenus par semis ou par bouturages. On pratique des pulvérisations, des formulations obtenues à partir de peptaibols. Ces formulations contiennent divers mouillants ou pénétrants capables de véhiculer la matière active peptaibols jusqu'aux cellules. - 7 2 h incubation in a 37 C water bath - 7 + 0.5 ml Na2Co3 (0.2 M) - 7 colorimetric measurement with a spectrophotometer

coef. extinction 7. 10-3 n cm-1 at 410 nm Chitinic activity expressed in nM of PNP per g of fresh material per hour 2-Plant material used All the plants tested are young plants obtained by sowing or cuttings. Sprays and formulations obtained from peptaibols are practiced. These formulations contain various wetting or penetrating agents capable of transporting the active ingredient peptaibols to the cells.

EFFETS DE PROTECTION ANTI-PATHOGENIQUE DES PEPTAIBOLS 1-Effets à l'encontre des fusarioses du melon La pulvérisation de peptaibols formulés sur des plantes de melon de sept jours et inoculés de Fusarium oxysporum fsp metonis quatre jours avant, permet d'obtenir certains résultats.

ANTI-PATHOGENIC PROTECTION EFFECTS OF PEPTAIBOLS 1-Effects against Fusarium wilt of melon Spraying peptaibols formulated on seven day old melon plants and inoculated with Fusarium oxysporum fsp metonis four days before, allows certain results to be obtained.

Parallèlement, un lot de plantules a vu ses feuilles pulvérisées avec de l'eau. At the same time, a batch of seedlings had their leaves sprayed with water.

Dix jours après l'inoculation, les symptômes apparaissent uniquement chez les plants inoculés traités avec de l'eau. Trois semaines après l'infection, les jeunes plants infectés se dessèchent et meurent. Ten days after inoculation, symptoms appear only in inoculated plants treated with water. Three weeks after infection, infected seedlings dry up and die.

Les plants inoculés et traités avec le peptaibol ne présentent pas de symptômes avant six semaines et continuent ensuite à se développer normalement.

Plants inoculated and treated with peptaibol do not show symptoms for six weeks and then continue to develop normally.

Ces résultats expriment clairement le pouvoir éliciteur du peptaibol sur la résistance des plants de melon vis-à-vis du Fusarium sp. These results clearly express the elicitor power of peptaibol on the resistance of melon plants to Fusarium sp.

2-Effets contre les maladies aériennes - Du melon : En pulvérisant du peptaibol sur les plants de melon, on observe un effet similaire de protection par rapport à l'oïdium. 2-Effects against aerial diseases - Melon: By spraying peptaibol on melon plants, a similar protective effect is observed compared to powdery mildew.

En effet, cinq jours après l'inoculation de l'oïdium, les symptômes apparaissent sur les plants traités préalablement avec de l'eau, et jaunissent peu à peu. Les plants traités avec le peptaibol ne présentent que peu ou pas de symptômes et continuent de se développer normalement trois semaines après l'inoculation. Indeed, five days after the inoculation of powdery mildew, the symptoms appear on the plants treated beforehand with water, and yellow little by little. Plants treated with peptaibol show little or no symptoms and continue to develop normally three weeks after inoculation.

- De la vigne : La pulvérisation du peptaibol sur les feuilles de vigne provoque également une forte augmentation d'activité peroxydasique. - Vine: Spraying peptaibol on the vine leaves also causes a strong increase in peroxidase activity.

L'invention concerne donc l'utilisation de peptaibols comprenant au moins un acide aminé choisi parmi l'aminoisobutyrique (Aib),l'isovaline (Iva), le valinol, le tryptophanol, le phenylalaminol, la pipérazine, comme stimulateur des défenses naturelles des plantes entières par l'application foliaire, racinaire ou par injection, contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux. The invention therefore relates to the use of peptaibols comprising at least one amino acid chosen from aminobutyric acid (Aib), isovaline (Iva), valinol, tryptophanol, phenylalaminol, piperazine, as stimulator of the natural defenses of whole plants by foliar, root or injection application against crop pathogens of the fungal and / or bacterial and / or viral types.

Lesdits peptaibols sont incorporés à un véhicule autorisé en agriculture de type mouillant et pénétrant. Said peptaibols are incorporated into a vehicle authorized in agriculture of the wetting and penetrating type.

La composition précitée se présente : - soit sous la forme liquide, notamment sous la forme de solution aqueuse ; - soit sous la forme solide, notamment sous la forme de poudres, granulés ou en enrobage de semences. The above composition is present: either in the liquid form, in particular in the form of an aqueous solution; - Either in the solid form, in particular in the form of powders, granules or as a seed coating.

La production d'un peptaibol, selon l'invention peut être obtenu : - soit à partir de champignons filamenteux, notamment le Trichoderma ; - soit selon un processus non-ribosomal qui se présente sous la forme de templat protéinique dénommé peptide synthétase ; - soit par voie de synthèse peptidique. The production of a peptaibol according to the invention can be obtained: - either from filamentous fungi, in particular Trichoderma; - either according to a non-ribosomal process which is in the form of protein templat called peptide synthetase; - either by peptide synthesis.

L'utilisation de peptaibols, selon l'invention a pour effet de réduire, lorsqu'ils sont The use of peptaibols according to the invention has the effect of reducing, when they are

appliqués : - aux céréales, notamment le blé, le maïs et le riz, l'attaque des oïdiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses, des pyricularioses et des maladies bactériennes et virales ; - aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des oïdiums, des tavelures, des monilioses, des maladies bactériennes et virales te)) es que) a"Sharka" ; - à la vigne, l'attaque de l'oïdium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques et virales telles que le"Court-Noué" ; - aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oïdiums, maladies bactériennes et virales ; - aux oléagineux, notamment le soja, le tournesol, les melons, les carottes, le choufleur et les pommes de terre, l'attaque des oïdiums, des mildious des pythiacées (Phytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (Rhizoctonia, Sclerotinia, Pyrenochaeta), des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium), des maladies bactériennes et virale.

applied: - to cereals, in particular wheat, corn and rice, the attack of powdery mildew, septoria, rust, fusarium wilt, blast disease and bacterial and viral diseases; - to fruit trees, in particular pear and apple, the attack of powdery mildew, scab, moniliosis, bacterial and viral diseases te)) es que) a "Sharka"; - in the vineyard, the attack of powdery mildew, downy mildew, Botrytis, wood diseases, telluric and viral diseases such as "Court-Noué"; - in lawns and in horticulture, attacks by pythiaceae, sclerotia fungi, fusarium wilt, powdery mildew, bacterial and viral diseases; - oilseeds, in particular soybeans, sunflowers, melons, carrots, cauliflower and potatoes, attack by powdery mildew, mildew of pythiaceae (Phytophtora, Pythium), sclerotia mushrooms (Rhizoctonia, Sclerotinia, Pyrenochaeta), vascular fungi (Fusarium, Verticillium), bacterial and viral diseases.

La composition, selon l'invention, comporte au moins un peptaibol comprenant au moins un acide aminé choisi parmi l'aminoisobutyrique (Aib), l'isovaline (Iva), le valinol, le tryptophanol, le phenyialaminol, la pipérazine.The composition according to the invention comprises at least one peptaibol comprising at least one amino acid chosen from aminobutyric acid (Aib), isovaline (Iva), valinol, tryptophanol, phenyialaminol, piperazine.

Claims

REVENDICATIONS

1-Utilisation de peptaibols comprenant au moins un acide aminé choisi parmi l'aminoisobutyrique (Aib), l'isovaline (Iva), le valinol, le tryptophanol, le phenylalaminol, comme stimulateur des défenses naturelles des plantes entières par l'application foliaire, racinaire ou par injection, contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux. 1 — Use of peptaibols comprising at least one amino acid chosen from aminobutyric acid (Aib), isovaline (Iva), valinol, tryptophanol, phenylalaminol, as stimulator of the natural defenses of whole plants by foliar application, root or by injection, against pathogens of fungal and / or bacterial and / or viral types.

2-Utilisation, selon la revendication1, caractérisée en ce que les peptaibols sont incorporés à un véhicule autorisé en agriculture de type mouillant et pénétrant. 2-Use according to claim 1, characterized in that the peptaibols are incorporated into a vehicle authorized in agriculture of the wetting and penetrating type.

3-Utilisation, selon la revendication 2, caractérisée en ce que la composition précitée se présente sous la forme liquide, notamment sous la forme de solution aqueuse. 3-Use according to claim 2, characterized in that the above composition is in the liquid form, in particular in the form of aqueous solution.

4-Utilisation, selon la revendication 2, caractérisée en ce que la composition précitée se présente sous la forme solide, notamment sous la forme de poudres, granulés ou en enrobage de semences. 4-Use according to claim 2, characterized in that the above composition is in the solid form, in particular in the form of powders, granules or as a seed coating.

5-Production d'un peptaibol, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de champignons filamenteux, notamment le Trichoderma. 5-Production of a peptaibol, according to claim 1, characterized in that it is obtained from filamentous fungi, in particular Trichoderma.

6-Production d'un peptaibol, selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu selon un processus non-ribosomal qui se présente sous la forme de templat protéinique dénommé peptide synthétase. 6-Production of a peptaibol, according to claim 1, characterized in that it is obtained according to a non-ribosomal process which is in the form of protein templat called peptide synthetase.

7-Production d'un peptaibol, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il est obtenu par voie de synthèse peptidique. 7-Production of a peptaibol, according to claim 1, characterized in that it is obtained by peptide synthesis.

8-Utilisation d'un peptaibol, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il a pour effet de réduire, lorsqu'il est appliqué : - aux céréales, notamment le blé, le maïs et le riz, l'attaque des oïdiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses, des pyricularioses et des maladies bactériennes et virales ; - aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des oïdiums, des tavelures, des monilioses, des maladies bactériennes et virales telles que la"Sharka" ; - à la vigne, l'attaque de l'oïdium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques et virales telles que le"Court-Noué" ; - aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oïdiums, maladies bactériennes et virales ; 8- Use of a peptaibol according to any one of the preceding claims, characterized in that it has the effect of reducing, when applied: - to cereals, in particular wheat, corn and rice, l attack of powdery mildew, septoria, rust, Fusarium wilt, blast disease and bacterial and viral diseases; - fruit trees, especially pear and apple, the attack of powdery mildew, scab, moniliosis, bacterial and viral diseases such as "Sharka"; - in the vineyard, the attack of powdery mildew, downy mildew, Botrytis, wood diseases, telluric and viral diseases such as "Court-Noué"; - in lawns and in horticulture, attacks by pythiaceae, sclerotia fungi, fusarium wilt, powdery mildew, bacterial and viral diseases;

- aux oléagineux, notamment le soja, le tournesol, les melons, les carottes, le choufleur et les pommes de terre, l'attaque des oïdiums, des mildious des pythiacées (Phytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (Rhizoctonia, Scierotinia Pyrenochaeta), des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium), des maladies - with oilseeds, in particular soybeans, sunflowers, melons, carrots, cauliflower and potatoes, attack by powdery mildew, mildew of pythiaceae (Phytophtora, Pythium), sclerotia mushrooms (Rhizoctonia, Scierotinia Pyrenochaeta ), vascular fungi (Fusarium, Verticillium), diseases

bactériennes et virale. bacterial and viral.

9-Composition, produite selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un peptaibol comprenant au moins un acide aminé choisi parmi l'aminoisobutyrique (Aib), l'isovaline (Iva), le valinol, le 9-Composition produced according to any one of claims 5 to 7, characterized in that it comprises at least one peptaibol comprising at least one amino acid chosen from aminobutyric acid (Aib), isovaline (Iva), valinol, the

tryptophanol, le phenylalaminol. tryptophanol, phenylalaminol.