FR2814247A1 - Confocal optical scanner for biological microscope, has optical system to focus light from object to form beam reflected by rotary mirror for scanning - Google Patents
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Abstract
Description
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Microscope confocal à balavase laser avec formation optique de l'imase
Domaine technique :. Confocal laser balavase microscope with optical imase formation
Technical area :.
L'invention concerne un microscope confocal à balayage laser comportant des moyens pour former optiquement, dans un plan, une image confocale. The invention relates to a confocal laser scanning microscope comprising means for optically forming, in a plane, a confocal image.
Technique antérieure : Dans un microscope confocal laser de type courant. l'échantillon est scanné point par point, dans un plan horizontal, au moyen de miroirs galvanométriques. Le signal issu de chaque point scanné est enregistré sur un photorécepteur placé derrière un trou microscopique. A chaque position des miroirs galvanométriques correspond un point de l'échantillon. La reconstitution d'un plan horizontal de l'échantillon nécessite de connaître exactement la position des miroirs galvanométriques correspondant au signal échantillonné à chaque instant sur le photorécepteur. Le bon fonctionnement du système nécessite un contrôle très précis des miroirs galvanométriques et une synchronisation parfaite entre le mouvement des miroirs galvanométriques et l'échantillonnage du signal provenant du photorécepteur. Ceci limite en particulier la vitesse des miroirs galvanométriques pouvant être utilisés. PRIOR ART: In a standard confocal laser microscope. the sample is scanned point by point, in a horizontal plane, using galvanometric mirrors. The signal from each scanned point is recorded on a photoreceptor placed behind a microscopic hole. Each position of the galvanometric mirrors corresponds to a point in the sample. The reconstitution of a horizontal plane of the sample requires knowing exactly the position of the galvanometric mirrors corresponding to the signal sampled at each instant on the photoreceptor. The good functioning of the system requires a very precise control of the galvanometric mirrors and a perfect synchronization between the movement of the galvanometric mirrors and the sampling of the signal coming from the photoreceptor. This limits in particular the speed of the galvanometric mirrors that can be used.
Un moyen d'éviter cette difficulté consiste à utiliser un microscope confocal à disque de Nipkov. One way to avoid this difficulty is to use a confocal Nipkov disc microscope.
Dans un tel appareil, l'image est enregistrée sur une caméra, ce qui supprime les problèmes de synchronisation. Toutefois le microscope confocal à disque de Nipkov n'utilise qu'une faible partie de la lumière produite par la source d'éclairage, ce qui le rend difficilement utilisable en lumière monochromatique, les éclairages monochromatiques étant généralement peu intenses. In such a device, the image is recorded on a camera, which eliminates synchronization problems. However, the Nipkov confocal disc microscope uses only a small part of the light produced by the lighting source, which makes it difficult to use in monochromatic light, the monochromatic lighting being generally not very intense.
Description de l'invention : L'objet de la présente invention est de réaliser un microscope confocal à balayage laser dans lequel les problèmes de synchronisation soient supprimés et/ou dans lequel l'image confocale est directement observable à l'aide d'un oculaire. Ceci permet d'augmenter la vitesse de balayage et donc la vitesse d'imagerie. Description of the invention: The object of the present invention is to provide a confocal laser scanning microscope in which synchronization problems are eliminated and / or in which the confocal image is directly observable using an eyepiece. . This increases the scanning speed and therefore the imaging speed.
L'invention consiste en un microscope confocal à balayage laser dans lequel l'image confocale est formée optiquement dans un plan, et non reconstituée informatiquement à partir du signal reçu sur un capteur à un seul élément placé derrière un pinole. Typiquement, une caméra matricielle peut être placée dans ce plan. Toutefois, il est également possible d'observer directement, à l'aide d'un oculaire, l'image formée dans ce plan. The invention consists of a confocal laser scanning microscope in which the confocal image is formed optically in a plane, and not reconstituted by computer from the signal received on a single element sensor placed behind a pinole. Typically, a matrix camera can be placed in this plane. However, it is also possible to directly observe, using an eyepiece, the image formed in this plane.
Dans un microscope confocal de type usuel, il est possible d'observer directement à l'aide d'un oculaire le plan image ou le faisceau réfléchi par l'objet parvient directement. Toutefois, l'image ainsi observée n'est pas une image confocale car elle n'a pas été filtrée par le trou microscopique, et seule l'image acquise par échantillonnage du signal traversant le trou microscopique est véritablement confocale. Pour obtenir optiquement une image confocale il est nécessaire d'utiliser un moyen équivalent au filtrage par le In a standard confocal microscope, it is possible to observe directly with an eyepiece the image plane or the beam reflected by the object comes directly. However, the image thus observed is not a confocal image because it has not been filtered by the microscopic hole, and only the image acquired by sampling the signal passing through the microscopic hole is truly confocal. To optically obtain a confocal image, it is necessary to use a means equivalent to filtering by the
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trou microscopique. Selon une version de l'invention, ceci est réalisé par un microscope confocal à balayage laser - comprenant un ou plusieurs miroirs mobiles permettant le balayage de l'échantillon observé dans un plan, - comprenant un faisceau laser réfléchi par lesdits miroirs mobiles, traversant ensuite l'objectif de microscope, parvenant à l'échantillon, et focalisé en un point de l'échantillon, - construit de telle manière que la lumière provenant du point de l'échantillon sur lequel est focalisé le faisceau laser d'éclairage soit collectée par l'objectif, puis réfléchie par lesdits miroirs mobiles, et focalisée en un point fixe d'un premier plan image, et caractérisé par le fait qu'il comporte : - des moyens pour renvoyer vers lesdits miroirs mobiles la partie du faisceau issu de l'échantillon qui parvient audit point fixe du premier plan image, et pour ne pas renvoyer vers lesdits miroirs mobiles la partie du faisceau qui parvient hors dudit point fixe, -des moyens pour focaliser cette partie du faisceau, après qu'elle ait été à nouveau réfléchie par lesdits miroirs mobiles, sur un second plan image, - des moyens pour observer et/ou enregistrer l'image formée dans ledit second plan image. microscopic hole. According to a version of the invention, this is achieved by a confocal laser scanning microscope - comprising one or more mobile mirrors allowing the scanning of the sample observed in a plane, - comprising a laser beam reflected by said mobile mirrors, then passing through the microscope objective, reaching the sample, and focused at a point of the sample, - constructed in such a way that the light coming from the point of the sample on which the lighting laser beam is focused is collected by the objective, then reflected by said mobile mirrors, and focused at a fixed point of a first image plane, and characterized by the fact that it comprises: - means for returning to said mobile mirrors the part of the beam coming from the sample arriving at said fixed point in the first image plane, and so as not to return to said moving mirrors the part of the beam which reaches outside said fixed point, means for foc align this part of the beam, after it has been again reflected by said movable mirrors, on a second image plane, - means for observing and / or recording the image formed in said second image plane.
Le point fixe du premier plan image joue le rôle usuellement dévolu au trou microscopique. Le faisceau issu de ce point fixe est ensuite à nouveau réfléchi sur les miroirs mobiles (par exemple des miroirs galvanométriques), ce qui a pour objet de ramener le point éclairé en un point du second plan image qui est mobile en même temps que le point de l'échantillon sur lequel le faisceau d'éclairage est focalisé, et non fixe comme le point fixe du premier plan image. Le second plan image joue donc le rôle du plan image d'un
microscope conventionnel non confocal, c'est-à-dire que chaque point de ce plan est l'image d'un point correspondant de l'échantillon. Mais le passage de l'onde par le point fixe du premier plan image a permi son filtrage, et donc l'effet confocal. L'image formée dans ce second plan image peut typiquement être enregistrée sur un capteur CCD ou observée à l'aide d'un oculaire. The fixed point of the first image plane plays the role usually assigned to the microscopic hole. The beam from this fixed point is then again reflected on the mobile mirrors (for example galvanometric mirrors), which has the aim of bringing the illuminated point to a point in the second image plane which is mobile at the same time as the point of the sample on which the lighting beam is focused, and not fixed like the fixed point of the first image plane. The second image plane therefore plays the role of the image plane of a
conventional non-confocal microscope, that is to say that each point of this plane is the image of a corresponding point of the sample. But the passage of the wave through the fixed point of the first image plane allowed its filtering, and therefore the confocal effect. The image formed in this second image plane can typically be recorded on a CCD sensor or observed using an eyepiece.
Le point fixe du second plan image peut être matérialisé par un trou microscopique, auquel cas l'onde issue de ce point fixe peut être ramenée, par un ensemble de lentilles et de miroirs convenablement dimensionnés. vers l'une ou l'autre face des miroirs mobiles, puis être focalisée sur le second plan image. Toutefois, il est plus simple d'utiliser comme point fixe un point réfléchissant, moyennant quoi l'onde réfléchie par ce point parcourt simplement son trajet aller en sens inverse. Dans ce cas, seule une seule face des miroirs mobiles est utilisée. The fixed point of the second image plane can be materialized by a microscopic hole, in which case the wave coming from this fixed point can be brought back, by a set of lenses and mirrors suitably dimensioned. towards one or the other side of the movable mirrors, then be focused on the second image plane. However, it is simpler to use a reflecting point as a fixed point, whereby the wave reflected by this point simply travels its forward path in the opposite direction. In this case, only one side of the movable mirrors is used.
Pour séparer le faisceau issu du point réfléchissant et ayant retraversé les miroirs mobiles du faisceau provenant de l'objectif et se dingeant vers les miroirs mobiles, il est avantageux de pouvoir distinguer ces faisceaux par leur polarité. Ceci permet également d'atténuer l'effet des réflexions parasites sur divers éléments optiques. Ceci est réalisé par exemple avec : - un moyen pour polariser l'onde issue de l'objet, To separate the beam from the reflecting point and having crossed the mobile mirrors from the beam from the objective and dinging towards the mobile mirrors, it is advantageous to be able to distinguish these beams by their polarity. This also makes it possible to attenuate the effect of parasitic reflections on various optical elements. This is done for example with: - a means for polarizing the wave coming from the object,
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- une lame quart d'onde placée sur la partie commune au trajet de l'onde parvenant audit point fixe d'un plan image, et au trajet de l'onde provenant dudit point fixe du premier plan image.
- A quarter wave plate placed on the part common to the path of the wave arriving at said fixed point of an image plane, and to the path of the wave coming from said fixed point of the first image plane.
- un séparateur de faisceau polarisant permettant de réfléchir, vers ledit second plan image, l'onde provenant dudit point fixe du premier plan image. a polarizing beam splitter making it possible to reflect, towards said second image plane, the wave coming from said fixed point of the first image plane.
Une autre solution, présentant l'avantage d'une moindre atténuation du faisceau issu de l'objet, consiste à utiliser la seconde face des miroirs mobiles. Le système obtenu est alors un peu plus complexe mais n'est pas affecté par des réflections parasites et utilise la totalité de l'intensité lumineuse disponible. Another solution, having the advantage of less attenuation of the beam coming from the object, consists in using the second face of the movable mirrors. The system obtained is then a little more complex but is not affected by stray reflections and uses all of the available light intensity.
Description rapide des figures : La figure 1 représente un microscope confocal à balayage laser selon l'art antérieur. La figure 2 représente un premier mode de réalisation de l'invention, utilisant une seule face des miroirs mobiles. La figure 3 représente un second mode de réalisation de l'invention, utilisant deux faces des miroirs mobiles. Brief description of the figures: FIG. 1 represents a confocal laser scanning microscope according to the prior art. FIG. 2 represents a first embodiment of the invention, using a single face of the movable mirrors. FIG. 3 represents a second embodiment of the invention, using two faces of the movable mirrors.
Convention : On appellera"lentille"aussi bien une lentille simple qu'un groupe de lentilles ou un doublet achromatique, généralement calculé pour minimiser les aberrations. Convention: We will call "lens" as well a simple lens as a group of lenses or an achromatic doublet, generally calculated to minimize aberrations.
Premier mode de réalisation : La figure 1 décrit un microscope confocal en fluorescence à balayage laser selon l'art antérieur Un faisceau issu d'un laser (100) traverse un élargisseur de faisceau ou collimateur formé des lentilles (101) (102) puis est réfléchi par le miroir dichroïque (103) qui réfléchit la longueur d'onde du laser (100) et laisse passer la longueur d'onde réémise par fluorescence. Le faisceau est alors réfléchi sur le miroir galvanométrique (104) mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, puis sur le miroir galvanométrique (105) mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Il traverse l'objectif (106) fonnant à l'infini une image de l'échantillon, et est finalement focalisé en un point de l'échantillon (107). Le faisceau réémis par fluorescence à partir de ce point est collecté par l'objectif, réfléchi successivement par les deux miroirs galvanométriques. traverse le miroir dichroïque, et est focalisé par la lentille (108) sur un trou microscopique (109). La partie du faisceau qui traverse le trou microscopique (109) parvient à un photorécepteur (110). Le signal issu de ce photorécepteur est ensuite échantillonné. First embodiment: FIG. 1 describes a confocal laser scanning fluorescence microscope according to the prior art A beam coming from a laser (100) passes through a beam expander or collimator formed by lenses (101) (102) then is reflected by the dichroic mirror (103) which reflects the wavelength of the laser (100) and lets through the wavelength re-emitted by fluorescence. The beam is then reflected on the galvanometric mirror (104) mobile in rotation around an axis located in the plane of the figure, then on the galvanometric mirror (105) mobile in rotation around an axis orthogonal to the plane of the figure . It passes through the objective (106) infinitely forming an image of the sample, and is finally focused at a point of the sample (107). The beam re-emitted by fluorescence from this point is collected by the objective, reflected successively by the two galvanometric mirrors. passes through the dichroic mirror, and is focused by the lens (108) on a microscopic hole (109). The part of the beam which passes through the microscopic hole (109) reaches a photoreceptor (110). The signal from this photoreceptor is then sampled.
L'image d'un plan de l'objet est ensuite obtenue à partir du signal issu de ce photorécepteur, échantillonné de manière synchrone par rapport au mouvement des miroirs galvanométriques. The image of a plane of the object is then obtained from the signal from this photoreceptor, sampled synchronously with respect to the movement of the galvanometric mirrors.
La figure 2 montre un microscope confocal en fluorescence à balayage laser selon un premier mode de réalisation de l'invention. Les éléments communs avec l'art antérieur ont été numérotés comme sur la figure 1. Un faisceau issu d'un laser (100) traverse un élargisseur de faisceau ou collimateur formé des lentilles (101) (102) puis est réfléchi par le miroir dichroïque (103) qui réfléchit la longueur d'onde du laser (100) et laisse passer la longueur d'onde réémise par fluorescence. Le faisceau est alors réfléchi sur le miroir galvanométrique (104) mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, puis sur le miroir FIG. 2 shows a confocal laser scanning fluorescence microscope according to a first embodiment of the invention. The elements common to the prior art have been numbered as in FIG. 1. A beam coming from a laser (100) passes through a beam expander or collimator formed by lenses (101) (102) then is reflected by the dichroic mirror (103) which reflects the wavelength of the laser (100) and lets through the wavelength re-emitted by fluorescence. The beam is then reflected on the galvanometric mirror (104) mobile in rotation around an axis located in the plane of the figure, then on the mirror
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galvanométrique (105) mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Il traverse ensuite le séparateur de faisceau polarisant (201) puis l'objectif de microscope (106). Le faisceau réémis par fluorescence à partir de ce point est collecté par l'objectif, réfléchi successivement par les deux miroirs galvanométriques, traverse le miroir dichroïque, et est focalisé par la lentille (108) sur un point réfléchissant (203) situé sur la face arrière d'une lame quart d'onde (202). La partie du faisceau qui traverse la lame quart d'onde parvient ensuite à une cavité absorbante. galvanometric (105) mobile in rotation about an axis orthogonal to the plane of the figure. It then crosses the polarizing beam splitter (201) and then the microscope objective (106). The beam re-emitted by fluorescence from this point is collected by the objective, reflected successively by the two galvanometric mirrors, crosses the dichroic mirror, and is focused by the lens (108) on a reflecting point (203) located on the face. rear of a quarter wave plate (202). The part of the beam which crosses the quarter-wave plate then reaches an absorbent cavity.
La partie du faisceau qui est réfléchie par le point (203) retraverse la lame quart d'onde (202). la
lentille (108), le miroir dichroïque (103), est réfléchie par les miroirs galvanométriques (104) (105). est réfléchie par le séparateur de faisceau polarisant (204), puis est focalisée par la lentille (205) dans le plan d'un capteur CCD (206) fixé sur la caméra (207). The part of the beam which is reflected by the point (203) crosses the quarter-wave plate (202). the
lens (108), the dichroic mirror (103), is reflected by the galvanometric mirrors (104) (105). is reflected by the polarizing beam splitter (204), then is focused by the lens (205) in the plane of a CCD sensor (206) attached to the camera (207).
La polarisation du laser (100) est choisie pour que l'onde issue de ce laser traverse le séparateur de faisceau (204). Le polariseur (201) est orienté pour être à son tour traversé par cette onde. La lame quart d'onde (202) a son axe neutre orienté à 45 degrés de l'axe passant du polariseur (201) et est quart d'onde pour l'onde réémise par fluorescence. The polarization of the laser (100) is chosen so that the wave coming from this laser crosses the beam splitter (204). The polarizer (201) is oriented so as to be in turn traversed by this wave. The quarter-wave plate (202) has its neutral axis oriented at 45 degrees from the axis passing from the polarizer (201) and is quarter-wave for the wave re-emitted by fluorescence.
Dans ces conditions, l'image confocale de l'objet se forme directement sur le capteur CCD (206) lorsque l'objet est balayé au moyen des miroirs galvanométriques. Un contrôle imparfait des miroirs galvanométriques se traduit au pire par des zones sombres sur l'image, mais en aucun cas par un déplacement des points de l'objet ou une quelconque imprécision géométrique. Le balayage de l'objet doit être effectué pendant le temps d'intégration du capteur. Les images peuvent ensuite être transférées du capteur CCD à un échantillonneur et un ordinateur. Under these conditions, the confocal image of the object is formed directly on the CCD sensor (206) when the object is scanned by means of the galvanometric mirrors. An imperfect control of the galvanometric mirrors results at worst in dark areas on the image, but in no case by a displacement of the points of the object or any geometric imprecision. The object must be scanned during the integration time of the sensor. The images can then be transferred from the CCD sensor to a sampler and a computer.
Le capteur peut aussi être remplacé par un oculaire, éventuellement un ensemble binoculaire, permettant l'observation directe de l'image formée dans le plan ou se trouve sur le schéma le CCD (206). The sensor can also be replaced by an eyepiece, possibly a binocular assembly, allowing direct observation of the image formed in the plane where the CCD (206) is located on the diagram.
Dans ce cas, le balayage doit se faire suffisamment rapidement pour ne pas être perceptible par l'oeil. In this case, the scanning must be done quickly enough not to be noticeable by the eye.
Second mode de réalisation :
Le second mode de réalisation est représenté par la figure 3, et diffère du premier par le fait que
chaque miroir galvanométrique comporte deux faces utilisables, qui sont effectivement utilisées. Second embodiment:
The second embodiment is represented by FIG. 3, and differs from the first by the fact that
each galvanometric mirror has two usable faces, which are actually used.
Le faisceau issu du laser (300) traverse l'élargisseur de faisceau ou collimateur formé des lentilles (301) (302) puis est réfléchi par le miroir dichroïque (303). Il est alors réfléchi par le miroir galvanométrique (304) mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure, puis par le miroir fixe (305) et par le miroir galvanométrique (306) mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Il traverse alors l'objectif (307) formant à l'infini une image de l'échantillon, et est focalisé en un pont de l'échantillon observé (308). La lumière réémise par fluorescence depuis ce point retraverse l'objectif (307) en sens inverse, est réfléchie par le miroir galvanométrique (306), le miroir fixe (305), et le miroir galvanométrique (304). Elle traverse le miroir dichroïque (303), et est focalisée par la lentille (309) et le miroir fixe (310) sur le trou microscopique (311). La lumière ayant traversé le trou microscopique (310) est réfléchie par le miroir (312), collimatée par la lentille (313), réfléchie par le miroir (314), puis par la seconde face du miroir galvanométrique (304). Elle est alors réfléchie par le miroir (315) puis par la seconde face du miroir galvanométrique (306). Elle est alors focalisée par la lentille (316) sur un point du The beam from the laser (300) passes through the beam expander or collimator formed by the lenses (301) (302) and is then reflected by the dichroic mirror (303). It is then reflected by the galvanometric mirror (304) movable in rotation around an axis located in the plane of the figure, then by the fixed mirror (305) and by the galvanometric mirror (306) movable in rotation around a axis orthogonal to the plane of the figure. It then crosses the objective (307) infinitely forming an image of the sample, and is focused in a bridge of the observed sample (308). The light re-emitted by fluorescence from this point crosses the objective (307) in the opposite direction, is reflected by the galvanometric mirror (306), the fixed mirror (305), and the galvanometric mirror (304). It passes through the dichroic mirror (303), and is focused by the lens (309) and the fixed mirror (310) on the microscopic hole (311). The light having passed through the microscopic hole (310) is reflected by the mirror (312), collimated by the lens (313), reflected by the mirror (314), then by the second face of the galvanometric mirror (304). It is then reflected by the mirror (315) and then by the second face of the galvanometric mirror (306). It is then focused by the lens (316) on a point of the
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plan image dans lequel se trouve le capteur CCD (317) fixé à la caméra (318). Comme précédemment le capteur CCD peut être remplacé par un oculaire. image plane in which the CCD sensor (317) attached to the camera (318) is located. As before, the CCD sensor can be replaced by an eyepiece.
Le fonctionnement de l'ensemble est le même que dans le premier mode de réalisation. The operation of the assembly is the same as in the first embodiment.
Mode"points multiples"
Il est possible d'éclairer simultanément plusieurs points de l'objet pour améliorer la vitesse d'imagerie. Le faisceau laser collimaté peut par exemple être divisé en plusieurs faisceau de directions différentes au moyen de prismes biréfringents. Plusieurs points de l'échantillons se trouvent alors éclairés
simultanément. Dans le cas du second mode de réalisation, le trou microscopique unique doit être remplaçé par une plaque comprenant plusieurs trous microscopiques, pratiqués chacun au point qui est éclaué par le faisceau issu d'un point de l'objet sur lesquels un des faisceaux d'éclairage est focalisé. De même, dans le cas du premier mode de réalisation, lepoint réfléchissant peut également être remplacé par ensemble de points réfléchissants. "Multiple points" mode
It is possible to simultaneously light several points of the object to improve the imaging speed. The collimated laser beam can for example be divided into several beams of different directions by means of birefringent prisms. Several points of the samples are then lit
simultaneously. In the second embodiment, the single microscopic hole must be replaced by a plate comprising several microscopic holes, each made at the point which is illuminated by the beam from a point on the object on which one of the beams of lighting is focused. Similarly, in the case of the first embodiment, the reflecting point can also be replaced by a set of reflecting points.
Applications industrielles :
Le présent microscope est destiné à améliorer la vitesse du microscope confocal en fluorescence et à permettre l'observation directe d'une image confocale à l'aide d'oculaires. Il peut en particulier être appliqué pour l'observation in vivo d'échantillons biologiques.Industrial applications:
The present microscope is intended to improve the speed of the confocal fluorescence microscope and to allow direct observation of a confocal image using eyepieces. It can in particular be applied for the in vivo observation of biological samples.
Claims (5)
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0011879A FR2814247A1 (en) | 2000-09-18 | 2000-09-18 | Confocal optical scanner for biological microscope, has optical system to focus light from object to form beam reflected by rotary mirror for scanning |
| EP01969915A EP1330671B1 (en) | 2000-09-18 | 2001-09-18 | Confocal optical scanning device |
| US10/380,373 US7209287B2 (en) | 2000-09-18 | 2001-09-18 | Confocal optical scanning device |
| PCT/FR2001/002890 WO2002023247A1 (en) | 2000-09-18 | 2001-09-18 | Confocal optical scanning device |
| DE60133916T DE60133916D1 (en) | 2000-09-18 | 2001-09-18 | OPTICAL CONFOCUS SENSING DEVICE |
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