FR2811681A1 - Vector for identifying modulators of nuclear-cytoplasmic protein translocation, useful e.g. for targeted delivery of therapeutic proteins - Google Patents

Abstract

Vector (A) for expressing a protein (I) that can activate or inhibit, directly or indirectly, transcription of a reporter gene (RG) present in a host cell comprising: (i) nucleotide sequences encoding a DNA-binding domain (DBD) and a transcription activating domain (TAD), but containing no domains for nuclear localization or nuclear export, and (ii) at least one cloning site for inserting a nucleic acid (X) for screening, is new. Vector (A) for expressing a protein (I) that can activate or inhibit, directly or indirectly, transcription of a reporter gene (RG) present in a host cell comprising: (i) nucleotide sequences encoding a DNA-binding domain (DBD) and a transcription activating domain (TAD), but containing no domains for nuclear localization or nuclear export, and (ii) at least one cloning site for inserting a nucleic acid (X) for screening, where: elements (i) and (ii) are placed under control of a promoter that is inducible and/or repressed by at least one external stimulus so that, after introduction of (X), a protein is expressed that is a fusion of DBD, TAD and the X-encoded product, is new. Independent claims are also included for the following: (a) recombinant plasmid (B) comprising (A) and (X) that is being screened for control of nuclear-cytoplasmic translocation of a given protein, in response to a specific stimulus, with X inserted into the cloning site of the vector; (b) libraries of (B), containing a library of nucleic acids as X; (c) cells transformed with (B) or the library of (b), also including an RG and/or a selection gene (SG), either as a second vector or integrated into the genome; (d) screening nucleotide sequences to identify new proteins or polypeptides for which the nuclear-cytoplasmic distribution is changed in response to a particular stimulus; (e) identifying polypeptide domains and/or amino acids in a particular protein that are involved in control of the nuclear-cytoplasmic distribution in response to a particular stimulus; (f) screening for compounds that block or stimulate the nuclear-cytoplasmic translocation of a particular protein; (g) identifying non-chemical stimuli that block or stimulate the nuclear-cytoplasmic translocation of a particular protein; (h) nucleic acid sequences identified by these methods; (i) kits for performing methods (e)-(g); and (j) kit for detecting or quantifying a stress or toxic agent that includes (A).

Description

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L'invention a trait à des nouveaux procédés de criblage de séquences d'acides nucléiques codant pour des domaines polypeptidiques impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique. L'invention a trait également à des procédés de criblage et d'identification de substances ou de stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléocytoplasmique dépendante de séquences régulatrices spécifiques. Elle porte aussi sur les vecteurs, les plasmides, les cellules et les kits pour la mise en #uvre des procédés selon l'invention. Elle porte enfin sur les utilisations des séquences nucléotidiques identifiées dans le domaine des biotechnologies pour la réalisation de systèmes d'expression conditionnelle de protéines, la réalisation de tests biologiques ou encore l'identification de nouveaux marqueurs spécifique d'un état physiologique ou pathologique donné.  The present invention provides novel methods for screening nucleic acid sequences encoding polypeptide domains involved in the control of the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein in response to a specific stimulus. The invention also relates to methods of screening for and identifying non-chemical substances or stimuli that block or stimulate nucleocytoplasmic translocation dependent on specific regulatory sequences. It also relates to vectors, plasmids, cells and kits for the implementation of the methods according to the invention. Finally, it relates to the uses of the nucleotide sequences identified in the field of biotechnology for the production of conditional protein expression systems, the performance of biological tests or the identification of new markers specific for a given physiological or pathological state.

Le séquençage systématique du génome de différents organismes a permis la réalisation de nouvelles approches globales d'études de la fonction des gènes, constituant les approches de la génomique fonctionnelle. L'objectif de la génomique fonctionnelle, outre de comprendre la fonction de gènes inconnus est aussi de mieux comprendre les réseaux de régulation de gènes et de leurs produits d'expression en fonction de l'état physiologique de la cellule et des conditions de l'environnement et les réseaux d'interaction des protéines. On peut citer comme exemples de nouvelles approches de génomique fonctionnelle, l'utilisation des méthodes d'analyse du transcriptome (membranes à haute-densité, micro-arrays ou puces à ADN) (1) ou du protéome (gels bi-dimensionnels, puces à protéines) (2). On peut aussi citer l'utilisation de la fonction de recrutement de la machinerie transcriptionnelle par les facteurs de transcription, fonction dite d'activation transcriptionnelle pour le criblage systématique de séquences cibles de facteurs de transcription (méthode dite du simple-  Systematic sequencing of the genome of different organisms has led to new global approaches to gene function studies, constituting functional genomics approaches. The objective of functional genomics, besides understanding the function of unknown genes, is also to better understand gene regulatory networks and their expression products according to the physiological state of the cell and the conditions of the cell. environment and protein interaction networks. Examples of new approaches to functional genomics include the use of transcriptome analysis methods (high-density membranes, microarray or microarray) (1) or proteome (two-dimensional gels, microarrays). with proteins) (2). We can also cite the use of the function of recruitment of the transcriptional machinery by the transcription factors, a so-called transcriptional activation function for the systematic screening of target sequences of transcription factors (the so-called simple method of transcription).

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hybride ) ou des séquences codant des domaines d'interaction protéineprotéine (méthode dite du double-hybride ) (3).  hybrid) or sequences encoding proteinprotein interaction domains (so-called double-hybrid method) (3).

Les études récentes du transcriptome chez les organismes eucaryotes ont montré la remarquable adaptation de l'expression génique en fonction des conditions environnementales et de l'état physiologique des cellules par la régulation fine de la synthèse des ARN messagers (4). Les informations apportées par ces études sont particulièrement intéressantes dans le domaine médical et ont permis notamment de mieux comprendre le processus de cancérogenèse en partie associé au dérèglement du contrôle de l'expression génique (5,21).  Recent transcriptome studies in eukaryotic organisms have shown the remarkable adaptation of gene expression as a function of environmental conditions and the physiological state of cells by the fine regulation of messenger RNA synthesis (4). The information provided by these studies is of particular interest in the medical field and has, in particular, made it possible to better understand the carcinogenesis process partly associated with dysregulation of the control of gene expression (5,21).

Les variations de l'environnement imposent à la cellule une remobilisation rapide et importante de la transcription. Cette augmentation parfois spectaculaire, dès les premières secondes, n'est possible que si les facteurs de régulation sont déjà présents, passant alors d'une forme inactivée à une forme activée. Les cascades de régulation mises en jeu dans les mécanismes de transduction de signal sont une parfaite illustration. Diverses réactions sont alors impliquées comme la phosphorylation, la glycosilation ou encore le transport actif d'un compartiment cellulaire à un autre.  Variations in the environment impose on the cell a rapid and important remobilization of transcription. This sometimes spectacular increase, from the first seconds, is possible only if the regulating factors are already present, then passing from an inactivated form to an activated form. The regulatory cascades involved in signal transduction mechanisms are a perfect illustration. Various reactions are then involved such as phosphorylation, glycosilation or active transport from one cell compartment to another.

La séparation physique entre le cytoplasme et le noyau est en effet un moyen puissant de réguler l'activité d'une protéine. Suite à un stimulus ou à un stress intra ou extra cellulaire, certaines protéines comme les facteurs de régulation de la transcription, séquestrés dans le cytoplasme, peuvent être activés par leur adressage au noyau. De même que d'autres, à localisation nucléaire, peuvent être inactivés par leur adressage au cytoplasme. L'adressage au noyau se fait, grâce aux importines et le retour au compartiment cytoplasmique se fait par l'intermédiaire d'une protéine appelée CRM1. Celle-ci reconnaît un motif peptidique NES (Nuclear Exportation Signal). L'export du complexe CRM1-proteine NES se fait par  The physical separation between the cytoplasm and the nucleus is indeed a powerful means of regulating the activity of a protein. Following an intracellular or extracellular stimulus or stress, certain proteins such as transcriptional regulation factors, sequestered in the cytoplasm, can be activated by their targeting to the nucleus. As others, with nuclear localization, can be inactivated by their addressing to the cytoplasm. The addressing to the nucleus is done, thanks to the importines and the return to the cytoplasmic compartment is done via a protein called CRM1. This recognizes a peptide motif NES (Nuclear Exportation Signal). The export of CRM1-protein complex NES is done by

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l'intermédiaire de la même protéine RAN. Ce phénomène déjà bien décrit concerne des facteurs de transcription comme NF-kapaB ou c-jun (7) chez les mammifères, Yap1 et Msn2 (28,8) chez la levure et Cop1 (14) chez les plantes.  via the same RAN protein. This phenomenon, already well described, concerns transcription factors such as NF-kapaB or c-jun (7) in mammals, Yap1 and Msn2 (28.8) in yeast and Cop1 (14) in plants.

Dans le présent texte, on entend par translocation nucléocytoplasmique , le mouvement actif d'une protéine donnée du noyau vers le cytoplasme ou du cytoplasme vers le noyau en réponse à un stimulus spécifique.  In the present text, nucleocytoplasmic translocation is understood to mean the active movement of a given protein from the nucleus to the cytoplasm or from the cytoplasm to the nucleus in response to a specific stimulus.

On entend par stimulus spécifique , toutes modifications rapides des conditions environnementales, et en particulier les stress ou modifications des conditions environnementales entraînant une réponse cellulaire rapide et une adaptation de la cellule à ces modifications.  By specific stimulus is meant any rapid changes in environmental conditions, and in particular stresses or changes in environmental conditions resulting in a rapid cellular response and adaptation of the cell to these changes.

Comme exemples de protéines, dont le mode de régulation est fondé sur une translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à des stimuli spécifiques, on peut citer le gène suppresseur de tumeur p53 (6), les activateurs transcriptionnels c-jun et NF-kapaB chez le mammifère (7) ou Msn2 et Hog1 chez la levure (8,9) qui, comme Yap1, transitent du cytoplasme au noyau lors d'un stress. On peut aussi citer la MAPKAKinase2 chez l'homme qui, quant à elle, présente un mode de régulation inverse puisque, sous l'effet d'un stress, elle transite du noyau vers le cytoplasme (10).  Examples of proteins whose mode of regulation is based on a nucleo-cytoplasmic translocation in response to specific stimuli include the tumor suppressor gene p53 (6), the transcriptional activators c-jun and NF-kapaB in the mammal (7) or Msn2 and Hog1 in yeast (8,9) which, like Yap1, pass from cytoplasm to the nucleus during stress. We can also mention MAPKAKinase2 in humans, which, in turn, has a reverse mode of regulation because, under the effect of stress, it passes from the nucleus to the cytoplasm (10).

Certaines pathologies sont par ailleurs associées à des modifications de la régulation de la localisation cellulaire des protéines nucléaires. Par exemple des mutations sur le gène suppresseurs de tumeur p53 sont associées à une dérégulation de la localisation nucléo-cytoplasmique de la protéine pour lequel il code. On peut aussi citer l'exemple du retard mental lié à l'X fragile, associé à une modification de la régulation nucléocytoplasmique d'une ribonucléoprotéine (25). Chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer, des études ont mis en évidence une augmentation  Some pathologies are also associated with changes in the regulation of the cellular localization of nuclear proteins. For example mutations on the p53 tumor suppressor gene are associated with a deregulation of the nucleo-cytoplasmic localization of the protein for which it codes. Another example is the fragile X-linked mental retardation associated with a change in the nucleocytoplasmic regulation of a ribonucleoprotein (25). In patients with Alzheimer's disease, studies have shown an increase in

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de la concentration nucléaire du facteur de transcription NF-kappaB dans les neurones cholinergiques (26).  the nuclear concentration of NF-kappaB transcription factor in cholinergic neurons (26).

Les modifications des fonctions essentielles d'une protéine impliquée dans une fonction d'activation de la transcription lors d'un stimulus peuvent passer inaperçues par les techniques d'analyse du transcriptome ou du protéome, car aucune néo-synthèse de transcrits ou de protéines n'est observable. En effet, ces protéines déjà présentes en absence de stimulus sont activées par modification post-traductionnelle ou par changement de compartiment cellulaire.  Changes in the essential functions of a protein involved in a transcription activation function during a stimulus may go unnoticed by transcriptome or proteome analysis techniques, since no neo-synthesis of transcripts or proteins is observable. Indeed, these proteins already present in the absence of stimuli are activated by post-translational modification or cell compartment change.

En exemple chez la levure Saccharomyces cerevisiae, Yapl, homologue à c-jun des mammifères, est un facteur de transcription dont la localisation est régulée en fonction des conditions environnementales.  As an example in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Yapl, homologue to c-jun of mammals, is a transcription factor whose localization is regulated according to environmental conditions.

La délétion du gène YAP1 entraîne chez la levure une hypersensibilité au stress oxydatif (H202, diamide, cadmium...). Il a été par ailleurs montré que la régulation de Yap1 est essentiellement fondée sur le changement de la localisation cellulaire de la protéine. En particulier, en absence de stress, Yap1 est principalement localisée dans le cytoplasme et au moment du stress, sa localisation change (on parle de translocation) pour devenir essentiellement nucléaire. Cette propriété lui est conférée par l'existence de deux domaines appelés NLS (signal de localisation nucléaire, d'après la nomenclature anglaise Nuclear Localisation Signal) et NES (signal d'export nucléaire, d'après la nomenclature anglaise Nuclear Export Signal) qui lui permettent respectivement d'être importée au noyau en présence de stress et réexportée vers le cytoplasme en absence de stress.  The deletion of the YAP1 gene leads to yeast hypersensitivity to oxidative stress (H202, diamide, cadmium ...). It has furthermore been shown that the regulation of Yap1 is essentially based on the change of the cellular localization of the protein. In particular, in the absence of stress, Yap1 is mainly localized in the cytoplasm and at the moment of stress, its location changes (we speak of translocation) to become essentially nuclear. This property is conferred by the existence of two domains called NLS (nuclear localization signal, according to the English nomenclature Nuclear Localization Signal) and NES (nuclear export signal, according to the English nomenclature Nuclear Export Signal) which allow it to be imported to the nucleus in the presence of stress and re-exported to the cytoplasm in the absence of stress.

Les facteurs de transcription peuvent déclencher l'expression d'un gène, et donc la synthèse d'une protéine, ou l'inhiber. Leur structure est composé de différents motifs, appelés domaines, qui, outre les domaines NLS ou NES, comporte un domaine de liaison à l'ADN. Une fois liés, les  Transcription factors can trigger the expression of a gene, and thus the synthesis of a protein, or inhibit it. Their structure is composed of different motifs, called domains, which, in addition to the NLS or NES domains, has a DNA binding domain. Once linked,

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facteurs de transcription peuvent interagir pour le contrôle de l'expression des gènes.  Transcription factors can interact for the control of gene expression.

L'identification et la caractérisation des protéines dont la localisation nucléo-cytoplasmique est dépendante de facteurs environnementaux extracellulaires ou même intracellulaires, la quantification éventuelle de ces mouvements représente une nouvelle approche, notamment : - pour identifier des molécules susceptibles d'activer ou d'inhiber cette translocation, y compris en présence d'un stimulus spécifique, pour cribler les domaines de ces protéines impliquées dans la translocation, pour identifier des protéines à fonction encore inconnue, utilisables comme marqueurs moléculaires pour le diagnostic, pour développer des tests biologiques, biosensors , indicateurs de la présence de molécules toxiques dans un environnement donné.  The identification and characterization of proteins whose nucleo-cytoplasmic localization is dependent on extracellular or even intracellular environmental factors, the possible quantification of these movements represents a new approach, in particular: - to identify molecules likely to activate or inhibit this translocation, including in the presence of a specific stimulus, to screen the domains of these proteins involved in the translocation, to identify proteins with unknown function, usable as molecular markers for diagnosis, to develop biological tests, biosensors, indicators of the presence of toxic molecules in a given environment.

La présente invention a pour objet le développement d'un outil apte aux identifications et caractérisations ci-dessus, et permettant d'étudier de façon systématique les translocations nucléo-cytoplasmiques. Un tel outil permet d'étudier des phénomènes de régulation cellulaire qui échappent actuellement aux outils basés sur l'hybridation d'acides nucléiques (puces à ADN) ou sur la visualisation quantitative des protéines (électrophorèse bidimensionnelle).  The subject of the present invention is the development of a tool capable of identifying and characterizing the above, and making it possible to systematically study nucleo-cytoplasmic translocations. Such a tool makes it possible to study cellular regulation phenomena that currently escape the tools based on hybridization of nucleic acids (DNA chips) or on the quantitative visualization of proteins (two-dimensional electrophoresis).

Certaines constructions ont déjà été décrites pour localiser les protéines dans les compartiments cellulaires, mais aucune ne propose d'identifier et de quantifier les protéines dont la translocation nucléocytoplasmique est une réponse à un stress ou un stimulus spécifique. A titre d'exemple, on peut citer :  Some constructs have already been described to localize proteins in cell compartments, but none propose to identify and quantify proteins whose nucleocytoplasmic translocation is a response to a specific stress or stimulus. By way of example, mention may be made of:

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a) une méthode développée pour l'étude de l'activation transcriptionnelle des différentes protéines homologues Yap1 à
Yap5 de la levure en présence d'H202 ou de cadmium (11). Pour ce faire, des fusions ont été réalisées entre les protéines Yap1 à
Yap5 et le domaine LexADBD, responsable de la fixation à une séquence d'ADN spécifique : UAS lexA (15). Cet outil permet de tester, par l'expression d'un gène rapporteur placé sous contrôle d'un promoteur fixant la protéine lexA, le niveau d'activation transcriptionnelle des activateurs Yap1 à Yap5 en réponse à un stimulus spécifique, indépendamment de la régulation éventuelle de leur domaine de fixation. Cette méthode permet donc d'identifier les séquences activatrices régulées par des stimuli spécifiques mais ne permet pas d'identifier sélectivement des séquences responsables de la translocation nucléo- cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique. En outre cette méthode ne peut s'appliquer à des protéines qui ne sont pas des activateurs de la transcription. b) Des méthodes de criblage systématique de séquences de localisation nucléaire (NLS) ont été décrites par Ueki et al. (12) ou encore par Rhee et al. (13). Elles consistent en la construction d'un plasmide permettant l'expression dans la levure, sous le contrôle d'un promoteur à expression forte (promoteur du gène
ADH1), d'une protéine de fusion contenant le domaine de liaison à l'ADN lexA (lexADBD), le domaine d'activation transcriptionnelle de Gal4 (Gal4AD) et la séquence polypeptidique X à cribler. Ce plasmide est introduit dans une levure contenant la séquence d'un gène rapporteur ou de sélection placé sous le contrôle de séquences promotrices contenant le site de fixation du domaine de liaison à l'ADN de lexA. Dans Ueki et al., le plasmide code également une a) a method developed for the study of the transcriptional activation of the different Yap1 homologous proteins at
Yap5 of yeast in the presence of H202 or cadmium (11). To do this, fusions were carried out between Yap1 proteins at
Yap5 and the LexADBD domain, responsible for binding to a specific DNA sequence: UAS lexA (15). This tool makes it possible to test, by the expression of a reporter gene placed under the control of a promoter binding the lexA protein, the level of transcriptional activation of the activators Yap1 to Yap5 in response to a specific stimulus, independently of the possible regulation. of their attachment domain. This method therefore makes it possible to identify the activation sequences regulated by specific stimuli but does not make it possible to selectively identify sequences responsible for the nucleocyclasmic translocation in response to a specific stimulus. In addition, this method can not be applied to proteins that are not transcription activators. b) Methods of systematic screening of nuclear localization sequences (NLS) have been described by Ueki et al. (12) or by Rhee et al. (13). They consist of the construction of a plasmid allowing expression in yeast, under the control of a strong expression promoter (promoter of the gene
ADH1), a fusion protein containing the lexA DNA binding domain (lexADBD), the transcriptional activation domain of Gal4 (Gal4AD) and the polypeptide sequence X to be screened. This plasmid is introduced into a yeast containing the sequence of a reporter or selection gene placed under the control of promoter sequences containing the attachment site of the lexA DNA binding domain. In Ueki et al., The plasmid also encodes a

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séquence NES. De fait, celle-ci gêne l'observation d'une translocation en réponse à un stimulus ou à un stress. Cette méthode est limitée, puisqu'elle permet uniquement de recenser la localisation des protéines, et plus particulièrement d'isoler les protéines dont la localisation est nucléaire. Dans Rhee et al., une séquence favorisant la localisation nucléaire de lexA a été identifiée et mutée. Ainsi, l'expression du gène de sélection ou du gène rapporteur, sous contrôle de l'activateur transcriptionnel artificiel lexADBD-Gal4AD-X, n'est possible que si X code au moins pour un domaine de localisation nucléaire et ne contient pas de domaine affectant la stabilité de la protéine. Néanmoins, l'utilisation d'un promoteur fort pour l'expression de la protéine de fusion lexADBD-Gal4AD-X ne permet pas de détecter des variations sensibles ou transitoires de la répartition nucléo- cytoplasmique. Enfin, il n'est ni décrit, ni suggéré dans ces documents des procédés permettant l'identification des stimuli spécifiques auxquels ces domaines de régulation sont sensibles, ainsi que des procédés permettant l'identification de produits agissant sur la fonction régulatrice de ces domaines.  NES sequence. In fact, this hinders the observation of a translocation in response to a stimulus or stress. This method is limited, since it allows only to identify the location of proteins, and more particularly to isolate proteins whose location is nuclear. In Rhee et al., A sequence promoting the nuclear localization of lexA has been identified and mutated. Thus, the expression of the selection gene or of the reporter gene, under the control of the artificial transcriptional activator lexADBD-Gal4AD-X, is only possible if X codes at least for a nuclear localization domain and does not contain a domain affecting the stability of the protein. Nevertheless, the use of a strong promoter for the expression of the lexADBD-Gal4AD-X fusion protein does not make it possible to detect sensitive or transient variations in the nucleocytoplasmic distribution. Finally, there is neither described nor suggested in these documents methods for identifying specific stimuli to which these regulatory domains are sensitive, as well as methods for identifying products acting on the regulatory function of these domains.

La présente invention vise tout d'abord à fournir un outil permettant d'étudier la mobilisation des protéines vers le noyau ou vers le cytoplasme en réponse à un changement de conditions environnementales, en application d'une substance ou sous l'effet d'un stress.  The present invention aims first at providing a tool for studying the mobilization of proteins towards the nucleus or to the cytoplasm in response to a change in environmental conditions, in application of a substance or under the effect of a stress.

Le principe de l'invention repose sur la construction d'un vecteur d'expression porteur d'une séquence nucléotidique codant une protéine directement ou indirectement susceptible d'activer ou d'inhiber la transcription d'un gène rapporteur ou d'un gène de sélection présent dans la cellule hôte, soit au niveau de son génome, soit sous forme de plasmide.  The principle of the invention is based on the construction of an expression vector carrying a nucleotide sequence encoding a protein directly or indirectly capable of activating or inhibiting the transcription of a reporter gene or a gene of selection present in the host cell, either at the level of its genome or in plasmid form.

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L'invention résulte donc de la réalisation d'un vecteur d'expression spécialement adapté pour son utilisation dans des nouveaux procédés de criblage, le même vecteur permettant : a) d'identifier de nouvelles séquences nucléotidiques des protéines ou polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique est contrôlée en réponse à des stimuli spécifiques ; b) d'identifier le domaine polypeptidique ou les acides aminés d'une protéine donnée spécifiquement impliqués dans le contrôle de sa translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique ; c) d'identifier des stimuli non chimiques spécifiques reconnus par les séquences nucléotidiques impliquées dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique ; et d) d'identifier de nouvelles substances capables de moduler la fonction régulatrice de séquences nucléotidiques impliquées dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique.  The invention thus results from the production of an expression vector specially adapted for use in new screening methods, the same vector allowing: a) to identify new nucleotide sequences of proteins or polypeptides whose nucleotide distribution Cytoplasmic is controlled in response to specific stimuli; b) identifying the polypeptide domain or amino acids of a given protein specifically involved in the control of its nucleo-cytoplasmic translocation in response to a specific stimulus; c) identify specific non-chemical stimuli recognized by the nucleotide sequences involved in the control of the nucleo-cytoplasmic translocation; and d) to identify new substances capable of modulating the regulatory function of nucleotide sequences involved in the control of nucleo-cytoplasmic translocation.

Plus précisément, l'invention porte sur un vecteur d'expression permettant l'expression d'une protéine directement ou indirectement susceptible d'activer ou d'inhiber la transcription d'un gène rapporteur présent dans une cellule hôte, et comprenant les éléments suivants : - des séquences nucléotidiques codant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine d'activation transcriptionnelle, lesdites séquences nucléotidiques étant exemptes de domaines de localisation nucléaire (NLS) ou de domaines d'exportation nucléaire (NES) ; - au moins un site de clonage permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique X à cribler, ces éléments étant placés sur le vecteur sous le contrôle d'un promoteur inductible et/ou répressible par un ou des effecteur (s) de  More specifically, the invention relates to an expression vector for the expression of a protein that is directly or indirectly capable of activating or inhibiting the transcription of a reporter gene present in a host cell, and comprising the following elements: nucleotide sequences encoding a DNA binding domain, a transcriptional activation domain, said nucleotide sequences being free of nuclear localization domains (NLS) or nuclear export domains (NES); at least one cloning site allowing the insertion of a nucleotide sequence X to be screened, these elements being placed on the vector under the control of an inducible and / or repressible promoter by one or more effector (s) of

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manière à permettre, après l'insertion de la séquence nucléotidique X , l'expression d'une protéine comportant en fusion le domaine de liaison à l'ADN, le domaine d'activation transcriptionnelle et le polypeptide d'expression de la séquence nucléotidique X à cribler. Le vecteur d'expression est destiné à être introduit dans une cellule hôte portant un gène de sélection et/ou un gène rapporteur.  in order to allow, after the insertion of the nucleotide sequence X, the expression of a protein comprising melt the DNA binding domain, the transcriptional activation domain and the expression polypeptide of the nucleotide sequence X to be screened. The expression vector is intended to be introduced into a host cell carrying a selection gene and / or a reporter gene.

On entend par vecteur d'expression , toute molécule d'ADN capable d'être introduite dans une cellule hôte, de s'auto-répliquer dans la cellule hôte et d'y exprimer une séquence nucléotidique X homologue ou hétérologue d'intérêt. Il comprend donc, en général, une ou plusieurs origines de réplication compatibles avec la ou les espèces dans lesquelles il est destiné à être introduit, un ou plusieurs marqueurs de sélection permettant son maintien par pression de sélection dans l'organisme et au moins un site de restriction adapté pour l'insertion d'une séquence nucléotidique X.  Expression vector means any DNA molecule capable of being introduced into a host cell, to auto-replicate in the host cell and to express therein a homologous or heterologous X nucleotide sequence of interest. It therefore comprises, in general, one or more origins of replication compatible with the species in which it is intended to be introduced, one or more selection markers allowing its maintenance by selection pressure in the body and at least one site restriction system adapted for insertion of an X nucleotide sequence.

Le vecteur d'expression selon l'invention contient les éléments appropriés pour son utilisation dans une cellule hôte eucaryote. Dans une forme préférée de l'invention, le vecteur d'expression est approprié pour son utilisation dans la levure pour la mise en #uvre des procédés de criblage et dans une bactérie pour les étapes de clonage et d'amplification des séquences nucléotidiques X à cribler. Dans une forme encore préférée, le vecteur d'expression est approprié pour son utilisation dans la levure Saccharomyces cerevisiae et la bactérie Escherichia coli.  The expression vector according to the invention contains the elements suitable for use in a eukaryotic host cell. In a preferred form of the invention, the expression vector is suitable for its use in yeast for the implementation of screening methods and in a bacterium for the cloning and amplification steps of nucleotide sequences X to screened. In a still preferred form, the expression vector is suitable for use in the yeast Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli bacterium.

Les séquences nucléotidiques codant un domaine de liaison à l'ADN sont toutes les séquences codant des domaines polypeptidiques impliqués dans une interaction avec une séquence nucléotidique spécifique, dite séquence-cible . Les domaines de liaison à l'ADN sont par exemple choisis parmi les domaines de liaison à l'ADN des activateurs transcriptionnels.  The nucleotide sequences coding for a DNA binding domain are all the sequences coding for polypeptide domains involved in an interaction with a specific nucleotide sequence, called the target sequence. The DNA binding domains are for example selected from the DNA binding domains of transcriptional activators.

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Les domaines de liaison à l'ADN et leur site de liaison spécifique peuvent être mis en évidence en particulier par des tests d'interaction protéine-ADN, bien connus de l'homme du métier, en particulier les tests de retard de migration sur gel (electromobility shift assay) ou les méthodes de séparations sur colonne d'affinité à l'ADN. Des domaines de liaison à l'ADN préférés sont les domaines de liaison à l'ADN des protéines lexA, Gal4 et TetR et plus particulièrement la séquence lexADBD.  The DNA binding domains and their specific binding site can be demonstrated in particular by protein-DNA interaction tests, which are well known to those skilled in the art, in particular the gel migration delay tests. (electromobility shift assay) or DNA affinity column separation methods. Preferred DNA binding domains are the DNA binding domains of the lexA, Gal4 and TetR proteins and more particularly the lexADBD sequence.

Selon l'invention, le terme domaine d'activation transcriptionnelle représente tout domaine polypeptidique nécessaire pour permettre le recrutement de la machinerie transcriptionnelle et ne participant pas à la fonction de liaison à l'ADN. De manière préférée, des domaines d'activation transcriptionnelle choisis pour la réalisation du vecteur selon l'invention sont les domaines bien caractérisés Gal4AD (16) ou B42 (18).  According to the invention, the term transcriptional activation domain represents any polypeptide domain necessary to allow the recruitment of the transcriptional machinery and not participating in the DNA binding function. In a preferred manner, transcriptional activation domains chosen for producing the vector according to the invention are the well-characterized Gal4AD (16) or B42 (18) domains.

De manière optionnelle, le vecteur d'expression comprend en plus une séquence codant un marqueur de la localisation cellulaire ou/et une séquence d'immuno-localisation, lesdites séquences étant placées sur le vecteur de manière à permettre, après l'insertion d'une séquence nucléotidique X dans le vecteur, l'expression d'une protéine comportant en fusion le domaine de liaison à l'ADN, le domaine d'activation transcriptionnelle, le marqueur de la localisation cellulaire ou/et le peptide d'immuno-localisation et le polypeptide d'expression de la séquence nucléotidique X à cribler.  Optionally, the expression vector further comprises a sequence encoding a marker of the cellular localization and / or an immuno-localization sequence, said sequences being placed on the vector so as to allow, after the insertion of an X nucleotide sequence in the vector, the expression of a fusion protein, the DNA binding domain, the transcriptional activation domain, the cell localization marker and / or the immuno-localization peptide and the expression polypeptide of the nucleotide sequence X to be screened.

Le terme marqueur de la localisation cellulaire représente tout domaine permettant une détection de la localisation cellulaire des protéines auxquelles il peut être fusionné sans affecter leur fonction native. De manière préférée, un marqueur de la localisation cellulaire est un domaine présentant une émission de fluorescence après excitation à une longueur d'onde appropriée. Un exemple de domaine de marquage de la localisation cellulaire particulièrement préféré est la GFP (Green Fluorescent Protein)  The term "cell localization marker" represents any domain that allows detection of the cellular localization of the proteins to which it can be fused without affecting their native function. Preferably, a marker of the cellular localization is a domain having a fluorescence emission after excitation at an appropriate wavelength. An example of a particularly preferred cell localization labeling domain is GFP (Green Fluorescent Protein)

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(17), ou un de ses dérivés, il peut aussi être la RFP (Red Fluorescent Protein) ou la BFP (Blue Fluorescent Protein)
Le terme peptide d'immuno-localisation représente tout peptide décelable par un test mettant en jeu une réaction immunologique (immunoprécipitation, immunofluorescence). Des exemples de séquences d'immuno-localisation codant de tels peptides sont les séquences codant les étiquettes HA, c-myc (29) ou HA-c-myc. (17), or one of its derivatives, it can also be the RFP (Red Fluorescent Protein) or the BFP (Blue Fluorescent Protein)
The term immuno-localization peptide represents any peptide detectable by a test involving an immunological reaction (immunoprecipitation, immunofluorescence). Examples of immuno-localization sequences coding for such peptides are the sequences encoding the HA, c-myc (29) or HA-c-myc tags.

Le vecteur d'expression selon la présente invention permet, après son introduction dans une cellule hôte, l'expression d'une protéine de fusion comprenant au moins les deux domaines : domaine de liaison à l'ADN et domaine d'activation transcriptionnelle. Dans une forme de réalisation, le vecteur d'expression permet, après son introduction dans une cellule hôte, l'expression d'une protéine de fusion comprenant en outre un marqueur de la localisation cellulaire ou/et un peptide d'immunolocalisation.  The expression vector according to the present invention allows, after its introduction into a host cell, the expression of a fusion protein comprising at least the two domains: DNA binding domain and transcriptional activation domain. In one embodiment, the expression vector allows, after introduction into a host cell, expression of a fusion protein further comprising a cell localization marker and / or an immunolocalization peptide.

Le vecteur est construit de manière à ce que la localisation nucléocytoplasmique de la protéine de fusion exprimée soit dépendante du domaine codé par la séquence nucléotidique X insérée dans le vecteur.  The vector is constructed such that the nucleocytoplasmic localization of the expressed fusion protein is domain-dependent encoded by the nucleotide sequence X inserted into the vector.

Les domaines cités précédemment, domaine de liaison à l'ADN, d'activation transcriptionnelle et éventuellement de marqueur de la localisation cellulaire et d'immuno-localisation sont donc choisis de manière à être exempts de domaines de localisation nucléaire (NLS) et de domaines d'exportation nucléaire (NES). On entend par domaine de localisation nucléaire , des domaines impliqués dans la translocation vers le noyau d'une protéine le contenant, conduisant à une localisation essentiellement nucléaire de ladite protéine. On entend par domaine d'exportation nucléaire , des domaines impliqués dans la translocation vers le cytoplasme d'une protéine le contenant, conduisant à une localisation essentiellement cytoplasmique de ladite protéine. Des The aforementioned domains, DNA binding domain, transcriptional activation domain and optionally marker of cell localization and immuno-localization are therefore chosen so as to be free of nuclear localization domains (NLS) and domains. nuclear export (NES). By nuclear localization domain is meant domains involved in the translocation to the nucleus of a protein containing it, leading to an essentially nuclear localization of said protein. By nuclear export domain is meant domains involved in the translocation to the cytoplasm of a protein containing it, leading to an essentially cytoplasmic localization of said protein. of the

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exemples de domaines exempts de domaine NES et NLS sont les domaines de liaison à l'ADN lexADBD, Gal4DBD (16), TetR(19), les domaines d'activation transcriptionnelle Gal4AD, B42 et le marqueur de la localisation cellulaire GFP. Il est par ailleurs possible de tester si les domaines choisis sont exempts de domaine de localisation nucléaire en analysant la répartition nucléo-cytoplasmique de la protéine de fusion constituée essentiellement des domaines de liaison à l'ADN, d'activation transcriptionnelle et éventuellement de marqueur de la localisation cellulaire exprimée par le vecteur seul après son introduction dans une cellule hôte.  Examples of domain-free domains NES and NLS are the DNA binding domains lexADBD, Gal4DBD (16), TetR (19), Gal4AD transcriptional activation domains, B42 and the GFP cell localization marker. It is also possible to test whether the selected domains are free of nuclear localization domain by analyzing the nucleo-cytoplasmic distribution of the fusion protein consisting essentially of DNA binding domains, of transcriptional activation and possibly of the cellular localization expressed by the vector alone after its introduction into a host cell.

Une des caractéristiques essentielles des vecteurs selon l'invention est que les séquences nucléotidiques codant la protéine de fusion sont placées sous le contrôle d'un promoteur inductible ou répressible par un ou des effecteur (s) En effet, les demandeurs ont remarqué qu'une expression trop forte de la protéine de fusion diminue de manière importante la sensibilité des procédés de criblage selon l'invention décrits ci-après. Il est par conséquent avantageux de pouvoir moduler le niveau d'expression de la protéine de fusion par l'utilisation d'un promoteur régulé par un ou des effecteur (s) De tels promoteurs sont tous les promoteurs inductibles ou répressibles tels que les promoteurs, fonctionnels chez la levure, comprenant l'UASGAL inductible au galactose (20), ou encore les promoteurs répressibles ou inductibles à la tétracycline, dont le niveau de répression ou d'induction peut être avantageusement contrôlé par la concentration en tétracycline utilisée dans le milieu de cultures (19). Néanmoins, tout promoteur dont l'activité peut être modulée par un effecteur externe, c'est-à-dire une molécule chimique ou un paramètre physique tel que la température peut être choisi.  One of the essential characteristics of the vectors according to the invention is that the nucleotide sequences coding for the fusion protein are placed under the control of an inducible or repressible promoter by one or more effector (s). Indeed, the applicants have noticed that excessively strong expression of the fusion protein significantly decreases the sensitivity of the screening methods according to the invention described hereinafter. It is therefore advantageous to be able to modulate the level of expression of the fusion protein by the use of a promoter regulated by one or more effector (s). Such promoters are all inducible or repressible promoters such as promoters. yeast functional agents, including galactose-inducible UASGAL (20), or repressible or inducible tetracycline promoters, the level of repression or induction of which can be advantageously controlled by the tetracycline concentration used in the control medium. crops (19). Nevertheless, any promoter whose activity can be modulated by an external effector, that is to say a chemical molecule or a physical parameter such that the temperature can be chosen.

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Le vecteur d'expression contient enfin au moins un site de clonage.  The expression vector finally contains at least one cloning site.

De manière préférée, il contient un site de clonage multiple (polylinker) pour l'insertion des séquences nucléotidiques X à cribler et l'expression des polypeptides pour lesquels elles codent, en fusion avec les domaines de liaison à l'ADN, d'activation transcriptionnelle et, le cas échéant, d'immunolocalisation et/ou de marquage de la localisation cellulaire, définis plus haut. Preferably, it contains a multiple cloning site (polylinker) for the insertion of the nucleotide sequences X to be screened and the expression of the polypeptides for which they code, in fusion with the DNA binding domains, for activation. transcriptional and, if appropriate, immunolocalization and / or labeling the cell location, defined above.

Un vecteur préféré est un vecteur permettant l'expression dans la levure, d'une protéine de fusion, nommé LG et contenant les domaines lexADBD, Gal4AD sous contrôle d'un promoteur minimal et de l'UASGAL. Un schéma de la construction LG est présenté en figure 2c. Un tel vecteur est par exemple le plasmide pLEXADBD-GAL4AD déposé à la CNCM le 13 Juillet 2000 sous le n I-2519 et présenté en figure 1. Un vecteur préféré peut en outre porter les séquences codant le domaine GFP et le tag HA-cmyc pour détecter la localisation cellulaire de la protéine de fusion indépendemment de sa fonction d'activateur transcriptionnel (tel que présenté en figure 8).  A preferred vector is a yeast-expressing vector of a fusion protein, named LG, containing the lexADBD, Gal4AD domains under the control of a minimal promoter and UASGAL. A diagram of the LG construction is presented in Figure 2c. Such a vector is, for example, the plasmid pLEXADBD-GAL4AD deposited at the CNCM on July 13, 2000 under the number I-2519 and presented in FIG. 1. A preferred vector may also carry the sequences encoding the GFP domain and the HA-cmyc tag. to detect the cellular localization of the fusion protein independently of its transcriptional activator function (as shown in FIG. 8).

L'invention porte également sur tout plasmide recombinant obtenu par l'insertion dans le vecteur d'expression décnt plus haut d'une séquence nucléotidique dont la propriété éventuelle d'être impliquée dans le contrôle de la translocation nucléaire en réponse à un stimulus spécifique est recherchée. La séquence nucléotidique insérée dans le vecteur peut être une séquence naturelle codant une protéine de fonction connue ou inconnue. Elle peut aussi être une séquence d'un fragment d'ADN génomique ou d'ADN complémentaire d'un organisme. Elle peut être une séquence nucléotidique artificielle, dérivés d'acides nucléiques recombinant ou synthétique. Elle peut être aussi toute séquence d'acide nucléique sur laquelle a été réalisée une mutagenèse.  The invention also relates to any recombinant plasmid obtained by insertion into the expression vector above a nucleotide sequence whose potential property to be involved in the control of nuclear translocation in response to a specific stimulus is sought. The nucleotide sequence inserted into the vector may be a natural sequence encoding a known or unknown functional protein. It can also be a sequence of a fragment of genomic DNA or DNA complementary to an organism. It can be an artificial nucleotide sequence derived from recombinant or synthetic nucleic acids. It can also be any nucleic acid sequence on which mutagenesis has been performed.

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L'invention porte également sur des banques de plasmides issues de l'insertion d'une banque d'acides nucléiques dans le vecteur. La banque d'acides nucléiques est obtenue par exemple par digestion enzymatique de l'ADN génomique ou de l'ADN complémentaire (ADNc) d'ARN d'un organisme. Les organismes peuvent être indifféremment tout organisme eucaryote, micro-organisme, végétal ou animal ; ils peuvent aussi être des virus ou des éléments transposables. La préparation d'une telle banque de plasmides est particulièrement adaptée pour l'identification de protéines susceptibles de porter des domaines impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique par la mise en #uvre des procédés de l'invention décrits ciaprès.  The invention also relates to plasmid libraries derived from the insertion of a nucleic acid library into the vector. The nucleic acid library is obtained for example by enzymatic digestion of genomic DNA or RNA complementary DNA (cDNA) of an organism. The organisms can be indifferently any eukaryotic organism, microorganism, plant or animal; they can also be viruses or transposable elements. The preparation of such a plasmid library is particularly suitable for the identification of proteins capable of carrying domains involved in the control of the nucleo-cytoplasmic translocation in response to a specific stimulus by the implementation of the methods of the invention. invention described below.

La banque de plasmides peut aussi être obtenue par mutagenèse dirigée ou aléatoire d'une séquence nucléotidique donnée par des méthodes bien connues de l'homme du métier. On obtient alors une banque contenant différentes versions mutées d'une même séquence nucléotidique. La préparation d'une telle banque de plasmides est particulièrement adaptée pour la mise en #uvre du procédé de criblage de séquences nucléotidiques de l'invention décrit plus loin permettant d'identifier les acides aminés d'un domaine polypeptidique ou d'une protéine donnée, impliqués dans la réponse à un stimulus spécifique. Elle permet aussi d'identifier une séquence nucléotidique optimale spécialement adaptée pour permettre l'expression d'une protéine de fusion dont la localisation cellulaire est contrôlée en réponse à un stimulus spécifique. La préparation d'une telle banque permet encore de déterminer une séquence nucléotidique consensus utile pour une recherche dans les banques de données de protéines portant les domaines codés par ces séquences consensus.  The plasmid library can also be obtained by site-directed or random mutagenesis of a given nucleotide sequence by methods well known to those skilled in the art. We then obtain a library containing different mutated versions of the same nucleotide sequence. The preparation of such a plasmid library is particularly suitable for the implementation of the method of screening nucleotide sequences of the invention described below making it possible to identify the amino acids of a given polypeptide domain or protein. , involved in the response to a specific stimulus. It also makes it possible to identify an optimal nucleotide sequence specially adapted to allow the expression of a fusion protein whose cell localization is controlled in response to a specific stimulus. The preparation of such a library also makes it possible to determine a consensus nucleotide sequence useful for searching the protein databases carrying the domains encoded by these consensus sequences.

L'invention porte aussi sur des cellules transformées par les plasmides recombinants décrits ci-dessus et contenant par ailleurs la  The invention also relates to cells transformed with the recombinant plasmids described above and also containing the

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séquence d'un gène rapporteur et/ou d'un gène de sélection, lesdites séquences étant portées sur un second vecteur nucléotidique ou intégrées dans le génome.  sequence of a reporter gene and / or a selection gene, said sequences being carried on a second nucleotide vector or integrated into the genome.

Les cellules transformées sont des cellules eucaryotes dans lesquelles une translocation nucléo-cytoplasmique peut être observée. Des cellules préférées sont des cellules pouvant être cultivées sur milieu solide, de manière à faciliter la sélection et l'isolement des clones d'intérêts lors de la mise en #uvre des procédés de criblage de l'invention décrits plus bas.  Transformed cells are eukaryotic cells in which a nucleo-cytoplasmic translocation can be observed. Preferred cells are solid culture grown cells, so as to facilitate the selection and isolation of clones of interest when performing the screening methods of the invention described below.

Des cellules encore préférées selon l'invention sont des cellules de levure. Des cellules encore préférées sont des cellules de l'espèce Saccharomyces cerevisiae. Still preferred cells according to the invention are yeast cells. Still preferred cells are cells of the species Saccharomyces cerevisiae.

On entend par gène de sélection , un gène dont l'expression est nécessaire pour la croissance de la cellule sur un milieu spécifique appelé milieu sélectif. On entend par gène rapporteur , un gène dont l'expression peut être quantifiée au moyen d'un test simple et rapide.  By selection gene is meant a gene whose expression is necessary for the growth of the cell on a specific medium called selective medium. The term "reporter gene" means a gene whose expression can be quantified by means of a simple and rapid test.

Gènes rapporteurs et/ou gènes de sélection sont introduits de manière stable dans la cellule, soit directement intégrés dans le génome, soit présents sur un plasmide. Le gène de sélection et le gène rapporteur sont placés sous le contrôle d'un promoteur portant un ou plusieurs sites de fixation du domaine de liaison à l'ADN exprimé par les séquences portées sur le plasmide recombinant. La transcription des gènes rapporteurs et/ou de sélection est par conséquent dépendante de l'expression stable au noyau de la protéine de fusion codée par les séquences portées sur le plasmide recombinant selon l'invention.  Reporter genes and / or selection genes are stably introduced into the cell, either directly integrated into the genome, or present on a plasmid. The selection gene and the reporter gene are placed under the control of a promoter carrying one or more sites for binding the DNA binding domain expressed by the sequences carried on the recombinant plasmid. The transcription of the reporter and / or selection genes is therefore dependent on the core stable expression of the fusion protein encoded by the sequences carried on the recombinant plasmid according to the invention.

A titre d'exemple de gènes rapporteurs, on citera les gènes codant

pour les enzymes (3-galactosidase, luciférase, p-gtucuronidase ou chloramphénicol-acétyl-transférase (CAT). Des exemples de gènes de sélection sont les gènes de résistance à une substance tels que KanR, les As an example of reporter genes, mention may be made of the genes encoding

for enzymes (3-galactosidase, luciferase, p-glucuronidase or chloramphenicol acetyl transferase (CAT).) Examples of selection genes are substance resistance genes such as KanR,

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gènes de biosynthèse des acides aminés ou des purines, tels que les gènes LEU2, URA3, TRP1, HIS3, ADE2 et ADE3 de la levure.  genes for the biosynthesis of amino acids or purines, such as the LEU2, URA3, TRP1, HIS3, ADE2 and ADE3 genes of yeast.

Des cellules préférées sont des cellules de la levure Saccharomyces cerevisiae transformées par un plasmide recombinant selon l'invention, approprié, et co-transformées par un deuxième plasmide portant le gène rapporteur lacZ placé sous contrôle de l'UASlexA et nommé pUASlexA-lacZ (voir aussi figure 2d).  Preferred cells are yeast Saccharomyces cerevisiae cells transformed with a suitable recombinant plasmid according to the invention, and co-transformed with a second plasmid carrying the lacZ reporter gene placed under the control of UASlexA and named pUASlexA-lacZ (see also Figure 2d).

Les cellules transformées selon l'invention sont avantageusement utilisées pour la mise en oeuvre des procédés de criblage décrits ci-après.  The cells transformed according to the invention are advantageously used for carrying out the screening methods described below.

Le principe général des procédés de criblage selon l'invention est le suivant : Les cellules en culture expriment une protéine de fusion codée par les séquences portées sur le plasmide recombinant. Ladite protéine de fusion est donc constituée au moins d'un domaine de liaison à l'ADN, d'un domaine d'activation transcriptionnelle et d'un polypeptide codé par une séquence nucléotidique, nommé X. La fixation de la protéine de fusion via son domaine de liaison à l'ADN sur le promoteur du gène rapporteur et/ou de sélection permet le recrutement des éléments de la machinerie transcriptionnelle au promoteur, via son domaine d'activation transcriptionnelle et la transcription des gènes rapporteur et/ou de sélection. Néanmoins, l'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection n'est théoriquement possible que si la protéine de fusion est stable et localisée au noyau. Par conséquent, le niveau d'expression du gène rapporteur ou du gène de sélection reflète directement le niveau d'expression au noyau de la protéine de fusion. De plus, des variations du niveau d'expression du gène rapporteur ou du gène de sélection en réponse à un stimulus spécifique reflètent directement un contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse au stimulus spécifique.  The general principle of the screening methods according to the invention is as follows: The cells in culture express a fusion protein encoded by the sequences carried on the recombinant plasmid. Said fusion protein therefore consists of at least one DNA binding domain, a transcriptional activation domain and a polypeptide encoded by a nucleotide sequence, named X. The attachment of the fusion protein via its DNA binding domain on the promoter of the reporter and / or selection gene allows the transcription elements to be recruited to the promoter, via its transcriptional activation domain and the transcription of the reporter and / or selection genes. Nevertheless, the expression of the reporter gene and / or the selection gene is theoretically only possible if the fusion protein is stable and localized to the nucleus. Therefore, the level of expression of the reporter gene or selection gene directly reflects the level of core expression of the fusion protein. In addition, variations in the level of expression of the reporter gene or the selection gene in response to a specific stimulus directly reflect a control of the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein in response to the specific stimulus.

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Ainsi, un des avantages d'un procédé de l'invention est qu'il permet d'identifier des séquences nucléotidiques codant des domaines impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique.  Thus, one of the advantages of a method of the invention is that it makes it possible to identify nucleotide sequences encoding domains involved in the control of the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein in response to a specific stimulus.

L'invention porte ainsi sur un procédé de criblage de séquences nucléotidiques pour l'identification de nouvelles protéines et/ou de nouveaux polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique est modifiée en réponse à un stimulus spécifique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) La culture en parallèle de clones isolés des cellules transformées par des plasmides ou des banques de plasmides telles que décrits ci-dessus ; (b) l'application ou non de un ou plusieurs stimuli aux clones cultivés ; (c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction de l'application ou non du ou des stimuli ; (d) la sélection et l'isolement d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet de l'application du ou des stimuli ; (e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléaire du marqueur de la localisation cellulaire ; (f) l'identification des séquences nucléotidiques codant les protéines et/ou les polypeptides dont la répartition nucléo- cytoplasmique est modifiée en réponse à un stimulus spécifique et exprimés dans les cellules sélectionnées en d) ou e).  The invention thus relates to a method for screening nucleotide sequences for the identification of new proteins and / or new polypeptides whose nucleo-cytoplasmic distribution is modified in response to a specific stimulus characterized in that it comprises the following steps (a) parallel cultivation of clones isolated from cells transformed with plasmids or plasmid libraries as described above; (b) the application or not of one or more stimuli to cultured clones; (c) evaluating the growth of clones on a selective medium, said growth being dependent on the expression of the selection gene, and / or the evaluation of the expression of the reporter gene depending on the application or not of the or stimuli; (d) selecting and isolating a group of clones whose expression levels of the reporter and / or selection gene are modified as a result of the application of the stimulus (s); (e) where appropriate, selecting and isolating a subgroup of clones according to nuclear expression of the marker of cellular localization; (f) identifying nucleotide sequences encoding proteins and / or polypeptides whose nucleocytoplasmic distribution is modified in response to a specific stimulus and expressed in the cells selected in d) or e).

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Tout type de stimulus tel que défini précédemment peut être appliqué dans le procédé de l'invention. Des exemples de stimuli, sont les stress thermique, stress osmotique, stress oxydatif, stress aux UV ou à d'autres rayons, la carence nutritionnelle, la présence d'un produit toxique ou d'un produit dans des concentrations inhabituelles le rendant toxique, en particulier des métaux lourds et des agents mutagènes, l'application d'une substance dans des concentrations actives ; cette liste des stimuli n'étant pas limitative et, le choix du stimulus dépendant du type de séquences recherchées par le procédé de criblage mis en #uvre.  Any type of stimulus as defined above can be applied in the method of the invention. Examples of stimuli are heat stress, osmotic stress, oxidative stress, UV or other radiation stress, nutritional deficiency, the presence of a toxic product or product in unusual concentrations that make it toxic, especially heavy metals and mutagens, the application of a substance in active concentrations; this list of stimuli is not limiting and the choice of stimulus depends on the type of sequences sought by the screening method used.

Selon le mode de réalisation du procédé, on appliquera un ou plusieurs stimuli particuliers sur chaque clone.  According to the embodiment of the method, one or more particular stimuli will be applied to each clone.

Dans un mode de réalisation préféré employant des cellules appropriées, les clones individuels sont repiqués et cultivés sur milieu solide en boite de pétri. Des cellules appropriées pour la culture sur milieu solide sont des cellules de levure. Les boîtes sont ensuite répliquées sur plusieurs boîtes différentes, puis un stimulus spécifique est appliqué par boîte, de manière à tester en parallèle plusieurs stimuli par clone cellulaire et au moins une boîte est mise à incuber en absence de stimulus.  In a preferred embodiment employing appropriate cells, the individual clones are subcultured and cultured on solid medium in a petri dish. Cells suitable for solid medium culture are yeast cells. The boxes are then replicated on several different boxes, then a specific stimulus is applied per box, so as to test in parallel several stimuli per cell clone and at least one box is incubated in the absence of stimulus.

Dans un autre mode de réalisation du procédé, les clones sont cultivées en micro-plaques en milieu liquide, à raison de un clone par puits.  In another embodiment of the method, the clones are cultured in microplates in a liquid medium, at the rate of one clone per well.

Chaque culture est ensuite ré-inoculée de manière à obtenir plusieurs micro-plaques contenant les mêmes séries de clones en culture. Un stimulus spécifique est appliqué par micro-plaque, de manière à tester en parallèle plusieurs stimuli par clone cellulaire et au moins une micro-plaque est mise à incuber en absence de stimulus. Each culture is then re-inoculated so as to obtain several microplates containing the same series of clones in culture. A specific stimulus is applied by micro-plate, so as to test in parallel several stimuli per cell clone and at least one micro-plate is incubated in the absence of stimulus.

L'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif à l'étape c) du procédé peut être estimée à l'oeil ou se faire par exemple à l'aide d'un test mesurant la turbidité, par spectrophotométrie par exemple.  The evaluation of the growth of clones on selective medium in step c) of the process can be estimated by the eye or can be done for example using a test measuring turbidity, for example by spectrophotometry.

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Dans un mode de réalisation préféré, les clones sont issus de la transformation d'une souche de Saccharomyces cerevisiae portant le gène LEU2 comme gène de sélection. Après repiquage et réplique, les clones sont cultivés sur milieu sélectif ne contenant pas de leucine La croissance des clones est alors dépendante du niveau d'expression du gène LEU2.  In a preferred embodiment, the clones are derived from the transformation of a strain of Saccharomyces cerevisiae carrying the LEU2 gene as a selection gene. After subculture and replication, the clones are cultured on a selective medium containing no leucine. The growth of the clones is then dependent on the level of expression of the LEU2 gene.

L'évaluation de l'expression du gène rapporteur est mise en oeuvre dans un mode préféré de réalisation du procédé par un test enzymatique en présence de substrats chromogéniques, l'intensité de la réaction pouvant être évaluée à l'oeil ou par spectrophotométrie. Des tests mesurant une intensité de fluorescence par fluorimétrie ou une intensité de radioactivité à l'aide de compteur à scintillation peuvent aussi être utilisés et choisis selon le gène rapporteur utilisé dans les cellules employées pour le procédé. De manière générale, tout type de tests simple à mettre en #uvre et conduisant à une quantification rapide des niveaux d'expression du gène rapporteur peut être utilisé dans le procédé.  The evaluation of the expression of the reporter gene is carried out in a preferred embodiment of the method by an enzymatic test in the presence of chromogenic substrates, the intensity of the reaction being able to be evaluated by the eye or by spectrophotometry. Tests measuring fluorescence intensity by fluorimetry or radioactivity intensity using a scintillation counter may also be used and selected according to the reporter gene used in the cells used for the method. In general, any type of test that is simple to implement and which leads to rapid quantification of reporter gene expression levels can be used in the method.

Dans un autre mode de réalisation, les clones sont issus de la transformation de Saccharomyces cerevisiae portant le gène rapporteur lacZ. Après repiquage et sélection, les clones sont cultivés sur milieu solide contenant le substrat chromogènique 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-Dgalactopyranoside, X-gal. L'intensité de la coloration bleue des colonies sur boîte reflète alors le niveau d'expression du gène lacZ.  In another embodiment, the clones are derived from the transformation of Saccharomyces cerevisiae carrying the lacZ reporter gene. After subculturing and selection, the clones are grown on a solid medium containing the 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalactopyranoside, X-gal chromogenic substrate. The intensity of the blue staining of colonies on the plate then reflects the level of expression of the lacZ gene.

Un changement du niveau d'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection en réponse à l'application d'un stimulus spécifique n'est pas nécessairement lié à une modification de la localisation nucléaire de la protéine. Il peut aussi être liée à un effet du stimulus sur la stabilité ou la fonctionnalité de la protéine de fusion exprimée par les séquences portées sur le plasmide recombinant. Afin de différencier les séquences sélectivement impliquées dans le contrôle de la translocation nucléocytoplasmique de celles impliquées dans un autre mode de régulation post-  A change in the expression level of the reporter gene and / or the selection gene in response to the application of a specific stimulus is not necessarily related to a change in the nuclear localization of the protein. It may also be related to a stimulus effect on the stability or functionality of the fusion protein expressed by the sequences carried on the recombinant plasmid. In order to differentiate the sequences selectively involved in the control of the nucleocytoplasmic translocation from those involved in another post-regulatory mode of regulation.

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traductionnelle, le procédé de l'invention peut comprendre une étape de sélection des cellules pour lesquelles une modification de la localisation cellulaire de la protéine de fusion en réponse à un stimulus spécifique est validée à l'aide de la détection de la localisation cellulaire, nucléaire ou cytoplasmique du marqueur de la localisation cellulaire.  translationally, the method of the invention may comprise a step of selecting cells for which a modification of the cellular localization of the fusion protein in response to a specific stimulus is validated by means of the detection of nuclear cell localization or cytoplasmic marker of cell localization.

Le procédé permet ainsi de sélectionner différents types de protéines selon le mode de sélection des clones. Différents modes de sélections sont possibles :
Dans un premier mode, on sélectionne les clones dont l'expression du gène rapporteur et/ou de sélection est activée uniquement lors de l'application du stimulus. Ces clones permettent l'identification de protéines dont la localisation passe du cytoplasme au noyau lors de l'application du stimulus. The method thus makes it possible to select different types of proteins according to the mode of selection of the clones. Different modes of selection are possible:
In a first mode, clones whose expression of the reporter and / or selection gene are activated only when the stimulus is applied are selected. These clones allow the identification of proteins whose location passes from the cytoplasm to the nucleus during the application of the stimulus.

Dans un second mode, on sélectionne les clones dont l'expression du gène rapporteur et/ou de sélection est activée uniquement en absence de stimulus. Ces clones permettent l'identification de protéines dont la localisation passe du noyau au cytoplasme lors de l'application du stimulus.  In a second mode, clones are selected whose expression of the reporter and / or selection gene is activated only in the absence of stimuli. These clones allow the identification of proteins whose location passes from the nucleus to the cytoplasm during the application of the stimulus.

D'autres modes de sélection sont possibles, notamment ceux fondés sur les réponses à différents stimuli. Par exemple, afin de rechercher une protéine spécifiquement régulée par le stress oxydatif en général et non un agent oxydant particulier, seuls des clones exprimant le gène rapporteur et/ou gène de sélection lors de l'application de plusieurs stress oxydatifs différents seront sélectionnés.  Other modes of selection are possible, especially those based on responses to different stimuli. For example, in order to search for a protein specifically regulated by oxidative stress in general and not a particular oxidizing agent, only clones expressing the reporter gene and / or selection gene upon the application of several different oxidative stresses will be selected.

Les séquences nucléotidiques sont identifiées à l'étape f) du procédé à partir des clones sélectionnés. Tout procédé permettant l'identification sans ambiguïté de la séquence nucléotidique codant la protéine ou le polypeptide dont la répartition nucléo-cytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique peut être mis en oeuvre à l'étape f) du procédé.  The nucleotide sequences are identified in step f) of the method from the selected clones. Any method allowing the unambiguous identification of the nucleotide sequence encoding the protein or polypeptide whose nucleo-cytoplasmic distribution changes in response to a specific stimulus can be implemented in step f) of the method.

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Dans un mode de mise en #uvre particulier du procédé, les séquences sont identifiées par l'amplification partielle ou complète des séquences recombinantes et séquençage des produits amplifiés. Dans un mode préféré de mise en #uvre du procédé, les séquences sont identifiées après extraction des plasmides recombinants, introduction des plasmides dans une bactérie et amplification par culture des clones transformants, puis extraction et purification des plasmides amplifiés et enfin séquençage. Des méthodes d'extraction de plasmides sont par exemple décrites pour des cellules de levures par Ausubel et al. (22). Une méthode d'amplification de séquences nucléotidiques spécifiques bien connue est l'amplification par PCR.  In a particular mode of implementation of the method, the sequences are identified by the partial or complete amplification of the recombinant sequences and sequencing of the amplified products. In a preferred mode of implementation of the method, the sequences are identified after extraction of the recombinant plasmids, introduction of the plasmids into a bacterium and amplification by culturing the transforming clones, then extraction and purification of the amplified plasmids and finally sequencing. For example, plasmid extraction methods are described for yeast cells by Ausubel et al. (22). A well known method of amplification of specific nucleotide sequences is PCR amplification.

L'invention porte également sur un procédé d'identification d'un domaine polypeptidique et/ou des acides aminés d'une protéine donnée que l'on souhaite analyser, impliqués dans le contrôle de sa répartition nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique et comprenant les étapes suivantes : (a) La culture en parallèle de clones isolés de cellules transformées par une banques de plasmides recombinants selon l'invention et portant différentes versions d'une même séquence nucléotidique codant une protéine dont la répartition nucléo-cytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique ; (b) l'application ou non du stimulus spécifique aux clones cultivés ; (c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction ou non du stimulus appliqué ; (d) l'évaluation de la croissance d'un clone contrôle exprimant la séquence sauvage de la protéine étudiée sur milieu sélectif, ladite croissance étant  The invention also relates to a method for identifying a polypeptide domain and / or amino acids of a given protein that one wishes to analyze, involved in the control of its nucleo-cytoplasmic distribution in response to a specific stimulus and comprising the following steps: (a) The parallel culture of clones isolated from cells transformed with a library of recombinant plasmids according to the invention and bearing different versions of the same nucleotide sequence encoding a protein whose nucleo-cytoplasmic distribution changes in response to a specific stimulus; (b) the application or not of the stimulus specific to the cultured clones; (c) evaluating the growth of clones on a selective medium, said growth being dependent on the expression of the selection gene, and / or the evaluation of the expression of the reporter gene depending on the stimulus applied or not; (d) evaluating the growth of a control clone expressing the wild-type sequence of the protein studied on a selective medium, said growth being

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dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction ou non du stimulus appliqué ; (e) la sélection et l'isolement d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection en présence et/ou en absence du stimulus spécifique, sont modifiés par rapport aux niveaux d'expression observés chez le clone contrôle à l'étape d); (f) l'identification des séquences nucléotidiques mutagénisées et codant des versions mutées de la protéine étudiée portées sur les plasmides recombinants des cellules sélectionnées en e) et par là, l'identification des mutations sur la protéine affectant le contrôle de sa localisation nucléocytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique.  dependent on the expression of the selection gene, and / or the evaluation of the expression of the reporter gene depending on the stimulus applied or not; (e) selecting and isolating a group of clones whose expression levels of the reporter gene and / or the selection gene in the presence and / or absence of the specific stimulus, are modified with respect to the levels of expression observed in the control clone in step d); (f) the identification of the mutagenized nucleotide sequences encoding mutated versions of the studied protein carried on the recombinant plasmids of the cells selected in e) and hence the identification of the mutations on the protein affecting the control of its nucleocytoplasmic localization in response to a specific stimulus.

Dans le procédé de l'invention défini ci-dessus, les séquences nucléotidiques criblées sont issues de la mutagenèse d'une séquence codant une protéine dont la localisation cellulaire change en réponse à un stimulus spécifique. Les clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection en réponse au stimulus spécifique sont modifiés par rapport au clone exprimant la séquence sauvage (non mutagénisée) sont sélectionnés. Cette sélection permet ainsi d'identifier au sein de la protéine analysée, le domaine fonctionnel et voire, plus précisément, les acides aminés spécifiquement impliqués dans le contrôle de la localisation cellulaire en réponse au stimulus. Ce procédé permet aussi de sélectionner des protéines d'intérêt mutées, dont la ou les mutations modifient le profil de régulation de leur localisation cellulaire.  In the method of the invention defined above, the screened nucleotide sequences result from the mutagenesis of a sequence encoding a protein whose cell localization changes in response to a specific stimulus. Clones whose expression levels of the reporter and / or selection gene in response to the specific stimulus are modified relative to the clone expressing the wild-type (non-mutagenized) sequence are selected. This selection thus makes it possible to identify, within the analyzed protein, the functional domain and, more specifically, the amino acids specifically involved in the control of the cellular localization in response to the stimulus. This method also makes it possible to select mutated proteins of interest whose mutation or mutations modify the regulatory profile of their cellular localization.

Les protéines que l'on souhaite analyser par le procédé ci-dessus sont des protéines de fonction connue ou inconnue. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine que l'on souhaite analyser est exprimée par la mise en oeuvre du procédé dans un système homologue. De préférence, la protéine que l'on souhaite analyser est une protéine impliquée dans une fonction de régulation de la transcription de gènes spécifiques. De manière  The proteins that it is desired to analyze by the above method are proteins of known or unknown function. In a preferred embodiment, the protein that one wishes to analyze is expressed by the implementation of the method in a homologous system. Preferably, the protein that one wishes to analyze is a protein involved in a function of regulating the transcription of specific genes. So

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encore préférée, la protéine que l'on souhaite analyser est une protéine dont certaines mutations sont impliquées dans des états pathologiques spécifiques, en particulier, le processus de cancérogenèse de la cellule, les altérations du métabolisme cellulaire ou encore la neuro-dégénérescence.  still preferred, the protein that is to be analyzed is a protein of which certain mutations are involved in specific disease states, in particular, the process of carcinogenesis of the cell, alterations of cellular metabolism or even neuro-degeneration.

Les modes de mise en #uvre de l'étape c) du procédé sont identiques aux modes de mise en oeuvre de l'étape c) du procédé de criblage de séquences nucléotidiques pour l'identification de nouvelles protéines et/ou de nouveaux polypeptides dont la répartition nucléocytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique, précédemment décrit.  The modes of implementation of step c) of the method are identical to the embodiments of step c) of the nucleotide sequence screening method for the identification of new proteins and / or new polypeptides of which the nucleocytoplasmic distribution changes in response to a specific stimulus, previously described.

L'invention porte également sur un procédé de criblage de substances bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'obtention de plusieurs cultures en parallèle d'un même clone cellulaire isolé de la transformation de cellules par un plasmide recombinant selon l'invention ; b) la mise en contact de chaque culture avec une ou plusieurs substances à cribler ; c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante sur ce milieu de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction d'une ou des substances appliquées ; d) la sélection d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet d'une ou des substances appliquées ;  The invention also relates to a method for screening substances that block or stimulate the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein, characterized in that it comprises the following steps: a) obtaining several cultures in parallel with a same cellular clone isolated from the transformation of cells by a recombinant plasmid according to the invention; b) bringing each culture into contact with one or more substances to be screened; c) the evaluation of the growth of clones on a selective medium, said growth being dependent on this medium of the expression of the selection gene, and / or the evaluation of the expression of the reporter gene as a function of one or more applied substances; d) selecting a group of clones whose expression levels of the reporter and / or selection gene are modified by the effect of one or more substances applied;

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e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléo-cytoplasmique du marqueur de la localisation cellulaire ; f) l'identification des substances bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, appliquées aux clones sélectionnés en d) ou e).  e) where appropriate, the selection and isolation of a subgroup of clones according to the nucleo-cytoplasmic expression of the marker of the cellular localization; f) the identification of the substances blocking or stimulating the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein, applied to the clones selected in d) or e).

Par substance, il faut comprendre toute substance naturelle ou synthétique susceptible d'être ajoutée au milieu de culture et d'en modifier certains paramètres. Des exemples de substances sont des agents toxiques, des agents mutagènes, des agents oxydants, des agents thérapeutiques, des métabolites, etc... ou plus généralement des produits biologiquement actifs.  By substance, it is necessary to understand any natural or synthetic substance that can be added to the culture medium and to modify certain parameters. Examples of substances are toxic agents, mutagenic agents, oxidizing agents, therapeutic agents, metabolites, etc., or more generally biologically active products.

La mise en #uvre du procédé de criblage de substances est similaire à celle du procédé d'identification d'un domaine polypeptidique et/ou des acides aminés d'une protéine donnée décrite précédemment. Les substances peuvent être considérées comme des stimuli particuliers par rapport au crible précédent Une différence réside toutefois dans le fait que le procédé décrit maintenant consiste à cribler un grand nombre de substances sur un même clone cellulaire, contrairement au procédé précédemment décrit qui consistait à cribler un grand nombre de clones cellulaires par stimulus testé
Le but de ce procédé est donc d'identifier des nouvelles substances capables d'agir directement ou indirectement sur les domaines polypeptidiques contrôlant la translocation nucléaire ou cytoplasmique. De telles substances sont particulièrement utiles pour bloquer ou stimuler l'activité de protéines nucléaires, telles que les activateurs transcriptionnels. The implementation of the method of screening substances is similar to that of the method for identifying a polypeptide domain and / or amino acids of a given protein described above. The substances can be considered as particular stimuli compared to the previous screen. However, a difference lies in the fact that the method described now consists of screening a large number of substances on the same cellular clone, unlike the previously described method which consisted in screening a large number of cell clones per stimulus tested
The purpose of this method is therefore to identify new substances capable of acting directly or indirectly on the polypeptide domains controlling the nuclear or cytoplasmic translocation. Such substances are particularly useful for blocking or stimulating the activity of nuclear proteins, such as transcriptional activators.

Elles peuvent en particulier être utilisées dans la préparation d'un médicament permettant de contrôler l'expression de gènes spécifiques en They can in particular be used in the preparation of a medicament for controlling the expression of specific genes in

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contrôlant la localisation cellulaire de leurs régulateurs de la transcription, lesdits régulateurs étant codés par des gènes naturels ou recombinants.  controlling the cellular localization of their transcriptional regulators, said regulators being encoded by natural or recombinant genes.

Dans un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, les clones cellulaires sont cultivés en micro-plaques, chaque puits contenant une culture d'un même clone cellulaire. Une substance spécifique est appliquée par puits, de manière à tester en parallèle sur le même clone cellulaire un grand nombre de substances. En particulier, ce mode de réalisation préféré permet le criblage à haut débit de molécules biologiquement actives.  In a preferred embodiment of the method of the invention, the cell clones are cultured in microplates, each well containing a culture of the same cell clone. A specific substance is applied per well, so as to test in parallel on the same cell clone a large number of substances. In particular, this preferred embodiment allows high throughput screening of biologically active molecules.

L'identification de conditions environnementales particulières ou de stimuli non chimiques peut fournir un moyen de contrôler des protéines portant des domaines polypeptidiques spécifiques par l'application d'un stimulus non chimique particulier.  The identification of particular environmental conditions or non-chemical stimuli may provide a means of controlling proteins carrying specific polypeptide domains by the application of a particular non-chemical stimulus.

Par conséquent, l'invention porte aussi sur un procédé d'identification de stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée et comprenant les étapes suivantes : a) l'obtention de plusieurs cultures en parallèle d'un même clone cellulaire isolé de la transformation de cellules par un plasmide recombinant selon l'invention ; b) l'application ou non sur chaque culture d'un ou plusieurs stimuli non chimiques ; c)l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante sur ce milieu de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction du ou des stimuli non chimiques appliqués ;  Therefore, the invention also relates to a method of identifying non-chemical stimuli blocking or stimulating nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein and comprising the steps of: a) obtaining multiple cultures in parallel with a same cellular clone isolated from the transformation of cells by a recombinant plasmid according to the invention; b) the application or not to each culture of one or more non-chemical stimuli; c) evaluating the growth of the clones on a selective medium, said growth being dependent on this medium of the expression of the selection gene, and / or the evaluation of the expression of the reporter gene as a function of the non-stimulus or stimuli applied chemicals;

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d) la sélection d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection changent en fonction du ou des stimuli non chimiques appliqués ; e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléo-cytoplasmique du marqueur de la localisation cellulaire ; f) l'identification des stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, appliqués aux clones sélectionnés en d) ou e).  d) selecting a group of clones whose expression levels of the reporter and / or selection gene change according to the non-chemical stimulus (s) applied; e) where appropriate, the selection and isolation of a subgroup of clones according to the nucleo-cytoplasmic expression of the marker of the cellular localization; f) the identification of non-chemical stimuli blocking or stimulating the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein, applied to the clones selected in d) or e).

Par stimuli non chimiques , on entend toutes variations de paramètres physiques de l'environnement telles que des variations de la température, de la pression, du pH la liste des stimuli susceptibles d'être testés n'étant pas limitative.  By non-chemical stimuli is meant any variations of physical parameters of the environment such as variations in temperature, pressure, pH the list of stimuli that can be tested is not limiting.

La mise en oeuvre du procédé d'identification de stimuli non chimiques est identique à celle du procédé de criblage de substances décrit plus haut. L'application de substances chimiques est simplement remplacé dans ce procédé par l'application d'un stimulus non chimique particulier.  The implementation of the method for identifying non-chemical stimuli is identical to that of the substance screening method described above. The application of chemicals is simply replaced in this process by the application of a particular non-chemical stimulus.

Un des avantages de l'identification de stimuli non chimiques est qu'elle permet par exemple de fournir un moyen de contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine comportant en fusion un domaine polypeptidique spécifique par l'application du ou des stimuli identifiés.  One of the advantages of identifying non-chemical stimuli is that it makes it possible, for example, to provide a means for controlling the nucleo-cytoplasmic translocation of a protein comprising a specific polypeptide domain by the application of the identified stimulus (s). .

Pour l'ensemble des procédés décrits dans le présent texte, il est rappelé que des cellules selon l'invention utilisées à l'étape a) sont de manière préférée des cellules de levure, de manière encore préférée des cellules de Saccharomyces cerevisiae. Un mode de réalisation préféré des procédés consiste ainsi à utiliser la souche Saccharomyces cerevisiae portant le plasmide pUASlexA-lacZ (sur lequel est présent le gène rapporteur  For all the methods described in the present text, it is recalled that cells according to the invention used in step a) are preferably yeast cells, more preferably Saccharomyces cerevisiae cells. A preferred embodiment of the methods thus consists in using the strain Saccharomyces cerevisiae carrying the plasmid pUASlexA-lacZ (on which the reporter gene is present

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lacZ) ou le plasmide pUASlexA-LEU2 (sur lequel est présent le gène de sélection LEU2) comme présenté en figure 8. La souche Saccharomyces cerevisiae présente l'avantage d'être facilement transformée par une banque de plasmides par des méthodes bien connues de l'homme du métier telle que la méthode décrite par Ausubel et al. (23), d'être cultivable en milieu solide contenant par exemple de l'agar et de permettre l'isolement de clones individuels par repiquage. Elle est donc particulièrement adaptée pour les procédés de criblages selon l'invention.  lacZ) or the pUASlexA-LEU2 plasmid (on which the LEU2 selection gene is present) as shown in FIG. 8. The Saccharomyces cerevisiae strain has the advantage of being easily transformed by a plasmid library by methods that are well known in the art. one skilled in the art such as the method described by Ausubel et al. (23), to be cultivable in solid medium containing for example agar and to allow the isolation of individual clones by subculture. It is therefore particularly suitable for the screening methods according to the invention.

L'invention porte également sur une séquence d'acide nucléique codant un domaine polypeptidique impliqué dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique identifiée par les procédés décrits ci-dessus.  The invention also relates to a nucleic acid sequence encoding a polypeptide domain involved in the control of the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein in response to a specific stimulus identified by the methods described above.

Une séquence nucléotidique identifiée par les procédés de criblage de l'invention peut ainsi être avantageusement utilisée pour le ciblage au noyau de protéines d'intérêt, en réponse à un stimulus donné, notamment des protéines thérapeutiques.  A nucleotide sequence identified by the screening methods of the invention can thus be advantageously used for targeting to the nucleus of proteins of interest, in response to a given stimulus, in particular therapeutic proteins.

Plus précisément, il est possible de construire une cassette d'expression permettant, dans une cellule dans laquelle elle est introduite, l'expression d'une protéine de fusion constituée du domaine codé par une séquence nucléotidique identifiée par les procédés de criblage et de la séquence d'une protéine d'intérêt dont on souhaite contrôler la localisation cellulaire en réponse à un stimulus spécifique.  More specifically, it is possible to construct an expression cassette allowing, in a cell into which it is introduced, the expression of a fusion protein consisting of the domain encoded by a nucleotide sequence identified by the screening methods and the sequence of a protein of interest for which it is desired to control the cellular localization in response to a specific stimulus.

L'invention porte donc sur l'utilisation d'une séquence nucléotidique identifiée par les procédés pour l'expression d'une protéine de fusion constituée du domaine codé par la séquence nucléotidique identifiée par le procédé de criblage et d'une protéine d'intérêt, notamment une protéine thérapeutique, dont on souhaite contrôler la localisation cellulaire en réponse à un stimulus spécifique.  The invention thus relates to the use of a nucleotide sequence identified by the methods for the expression of a fusion protein consisting of the domain encoded by the nucleotide sequence identified by the screening method and a protein of interest , in particular a therapeutic protein, whose cell localization is desired to be controlled in response to a specific stimulus.

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On entend par cassette d'expression , l'ensemble des éléments nucléotidiques nécessaires pour permettre l'expression de la protéine de fusion décrite dans la cellule dans laquelle elle est introduite, en particulier les séquences codantes de la protéine de fusion placée sous contrôle d'un promoteur approprié et les séquences terminatrices appropriées.  Expression cassette means the set of nucleotide elements necessary to allow the expression of the fusion protein described in the cell into which it is introduced, in particular the coding sequences of the fusion protein under the control of an appropriate promoter and the appropriate terminator sequences.

L'invention porte aussi sur l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques identifiée par les procédés pour le contrôle de l'expression d'au moins un gène donné en réponse à un stimulus spécifique, ladite séquence étant placée dans une construction de manière à permettre l'expression d'un facteur de transcription dont la localisation cellulaire est contrôlée par le stimulus spécifique, ledit facteur de transcription contrôlant alors l'expression d'au moins un gène donné d'intérêt, en réponse à un stimulus spécifique. En d'autre terme, cette utilisation consiste à réaliser des nouveaux systèmes de contrôles, inductible ou répressible, de l'expression de gènes en fonction d'un effecteur externe (le stimulus spécifique). De tels systèmes ont de nombreuses applications en biotechnologie pour l'expression hétérologue contrôlée de protéines d'intérêts, par exemple de protéines utilisées dans les domaines médical, agro-alimentaire ou agrochimique.  The invention also relates to the use of a nucleic acid sequence identified by the methods for controlling the expression of at least one given gene in response to a specific stimulus, said sequence being placed in a construct of to allow the expression of a transcription factor whose cell localization is controlled by the specific stimulus, said transcription factor then controlling the expression of at least one given gene of interest, in response to a specific stimulus. In other words, this use consists in producing new inducible or repressible control systems for the expression of genes according to an external effector (the specific stimulus). Such systems have many applications in biotechnology for the controlled heterologous expression of proteins of interest, for example proteins used in the medical, agri-food or agrochemical fields.

Les protéines ou polypeptides identifiés dont la répartition nucléocytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique peuvent être utilisés comme marqueurs cellulaires spécifiques d'un état physiologique donné, et en particulier d'un état pathologique donné.  The identified proteins or polypeptides whose nucleocytoplasmic distribution changes in response to a specific stimulus can be used as specific cellular markers of a given physiological state, and in particular of a given disease state.

L'invention porte donc sur l'utilisation de telles protéines ou polypeptides pour la détection in vitro à partir d'un échantillon de matériel biologique isolé d'un individu de la localisation cellulaire ou du niveau d'expression des protéines ou polypeptides servant de marqueurs cellulaires d'un état pathologique spécifique.  The invention thus relates to the use of such proteins or polypeptides for the in vitro detection from a sample of biological material isolated from an individual of the cell localization or level of expression of the proteins or polypeptides serving as markers. cells of a specific disease state.

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Il existe un réel besoin, notamment dans le domaine de la thérapie génique de réaliser des vecteurs permettant la localisation au noyau d'une molécule biologiquement active. Ces vecteurs comportent, pour l'adressage au noyau, des polypeptides portant les séquences NLS. Afin de contrôler la localisation nucléaire, il peut être intéressant de remplacer ces séquences NLS par les séquences identifiées par les procédés de l'invention et contrôlant la translocation nucléo-cytoplasmique spécifique.  There is a real need, particularly in the field of gene therapy, to produce vectors for locating the nucleus of a biologically active molecule. These vectors comprise, for the addressing of the nucleus, polypeptides carrying the NLS sequences. In order to control the nuclear localization, it may be advantageous to replace these NLS sequences with the sequences identified by the methods of the invention and controlling the specific nucleo-cytoplasmic translocation.

Par conséquent, l'invention porte sur l'utilisation d'une protéine ou d'un polypeptide identifiée par les procédés de l'invention dans la préparation d'un vecteur permettant le contrôle de la localisation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus donné, d'une molécule biologiquement active, ledit vecteur étant formé d'un produit de couplage entre ladite protéine ou polypeptide identifié par les procédés de l'invention et la molécule biologiquement active. Therefore, the invention relates to the use of a protein or polypeptide identified by the methods of the invention in the preparation of a vector allowing the control of the nucleo-cytoplasmic localization in response to a given stimulus. of a biologically active molecule, said vector being formed of a coupling product between said protein or polypeptide identified by the methods of the invention and the biologically active molecule.

Il est en outre possible d'utiliser une séquence d'acide nucléique identifiée par le procédé de criblage pour la réalisation de tests biologiques pour détecter et quantifier la présence d'un agent stressant ou toxique dans un environnement donné.  It is further possible to use a nucleic acid sequence identified by the screening method for carrying out biological tests to detect and quantify the presence of a stressor or toxic agent in a given environment.

Le test biologique consiste 1) à cultiver des cellules recombinantes selon l'invention. Les cellules expriment une protéine de fusion activatrice, ayant la capacité d'activer l'expression d'un gène rapporteur et portant un domaine impliqué dans le contrôle de sa translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à la présence d'agent stressant ou toxique ;
2) à quantifier l'expression du gène rapporteur sous contrôle de la protéine de fusion activatrice. The biological test consists of 1) cultivating recombinant cells according to the invention. The cells express an activating fusion protein, having the ability to activate the expression of a reporter gene and carrying a domain involved in the control of its nucleo-cytoplasmic translocation in response to the presence of stressor or toxic agent;
2) to quantify expression of the reporter gene under control of the activating fusion protein.

Le niveau d'expression du gène rapporteur reflète l'exposition des cellules à l'agent stressant ou toxique dans un environnement donné.  The expression level of the reporter gene reflects the exposure of the cells to the stressor or toxic agent in a given environment.

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L'invention porte enfin sur des kits pour la mise en #uvre des procédés de l'invention et comprenant au moins les éléments suivants : - un vecteur d'expression selon l'invention ; - des cellules adaptées pour la mise en #uvre des procédés de l'invention et contenant la séquence d'un gène de sélection et/ou d'un gène rapporteur ; - le cas échéant, les produits et tampons nécessaires pour la quantification du gène rapporteur ou la sélection sur milieu sélectif.  The invention finally relates to kits for carrying out the methods of the invention and comprising at least the following elements: an expression vector according to the invention; cells suitable for carrying out the methods of the invention and containing the sequence of a selection gene and / or a reporter gene; - where appropriate, the products and buffers necessary for the quantification of the reporter gene or selection on selective medium.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules fournies dans le kit sont des cellules de levure. Dans un mode de réalisation encore préféré, les cellules sont des cellules de Saccharomyces cerevisiae. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules fournies dans le kit contiennent un gène rapporteur choisi parmi les

gènes codant la p-galactosidase, la p-gtucuronidase, la luciférase ou la chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules fournies dans le kit contiennent un gène de sélection choisi parmi les gènes LEU2, URA3, TRP1, HIS3, ADE2 et KanR. In a preferred embodiment of the invention, the cells provided in the kit are yeast cells. In a further preferred embodiment, the cells are Saccharomyces cerevisiae cells. In another preferred embodiment of the invention, the cells provided in the kit contain a reporter gene selected from

genes encoding β-galactosidase, p-glucuronidase, luciferase or chloramphenicol acetyltransferase (CAT). In another preferred embodiment of the invention, the cells provided in the kit contain a selection gene selected from the LEU2, URA3, TRP1, HIS3, ADE2 and KanR genes.

L'invention porte aussi sur un kit pour la réalisation d'un test biologique (biosensors) pour détecter et quantifier la présence d'un agent stressant ou toxique dans un environnement et comprenant au moins les éléments suivants : - un plasmide recombinant selon l'invention ; - des cellules adaptées pour la réalisation du test biologique et contenant la séquence d'un gène de sélection et/ou d'un gène rapporteur ;  The invention also relates to a kit for carrying out a biological test (biosensors) for detecting and quantifying the presence of a stressing or toxic agent in an environment and comprising at least the following elements: a recombinant plasmid according to the invention; invention; cells suitable for carrying out the biological test and containing the sequence of a selection gene and / or a reporter gene;

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- le cas échéant, les produits, supports et tampons nécessaires pour la culture des cellules, la quantification du gène rapporteur ou/et la sélection sur milieu sélectif
Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et ses avantages. - where appropriate, the products, supports and buffers necessary for the culture of the cells, the quantification of the reporter gene and / or the selection on selective medium
The following examples will provide a better understanding of the invention and its advantages.

PARTIE EXPERIMENTALE Description des figures : Figure 1 : - Schéma du vecteur d'expression pLEXADBD-GAL4AD. EXPERIMENTAL PART Description of the figures: FIG. 1: Scheme of the pLEXADBD-GAL4AD expression vector.

Figure 2 : - La figure 2a schématise les éléments présents sur le plasmide auto-réplicatif de levure à faible nombre de copies pLGY pGal1 représente le promoteur du gène GAL1 inductible au galactose. LexADBD représente le domaine de fixation à l'ADN de la protéine lexA, Gal4AD représente le domaine d'activation transcriptionnelle de la protéine Gal4p, YAP1 sauvage représente la séquence codant la protéine Yap1 et NES représente le domaine signal d'exportation nucléaire responsable du contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique de Yap1 en réponse à un stress de type oxydatif. Figure 2: Figure 2a schematizes the elements present on the low copy number yeast self-replicating plasmid pLGY pGal1 represents the promoter of the galactose-inducible GAL1 gene. LexADBD represents the DNA binding domain of the lexA protein, Gal4AD represents the transcriptional activation domain of the Gal4p protein, YAP1 wild represents the Yap1 protein coding sequence and NES represents the nuclear export signal domain responsible for the control. of the nucleo-cytoplasmic translocation of Yap1 in response to oxidative stress.

- la figure 2b schématise la construction pLGYm réalisée. Cette construction est identique à pLGY excepté une mutation dans le domaine NES conduisant à une localisation au noyau constitutive.  FIG. 2b schematizes the construction pLGYm carried out. This construct is identical to pLGY except for a mutation in the NES domain leading to a localization to the constitutive nucleus.

- La figure 2c schématise le vecteur d'expression pLG sans insert.  FIG. 2c schematizes the expression vector pLG without insert.

- La figure 2d schématise la cassette rapporteur UASlexA-lacZ, contenant le gène chimérique constitué d'un promoteur minimal avec des domaines de fixation de lexA répétés en tandem (8 copies) et d'un gène rapporteur codant pour la p- galactosidase. Cette cassette a été introduite dans un  Figure 2d schematizes the UASlexA-lacZ reporter cassette containing the minimal promoter chimeric gene with tandemly repeated lexA binding domains (8 copies) and a reporter gene encoding β-galactosidase. This cassette was introduced in a

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plasmide réplicatif de levure à haut nombre de copie pour donner pUASlexA-lacZ.  replication plasmid of high copy number yeast to give pUASlexA-lacZ.

Figure 3 : La figure 3 est un schéma illustrant le principe du crible avec l'exemple de la construction pLGY Figure 4 : La figure 4 est une photographie illustrant l'effet de la région NES sur la fonction de protection contre le stress oxydatif de l'activateur Yap1. Figure 3: Figure 3 is a diagram illustrating the principle of the screen with the example of the pLGY construct Figure 4: Figure 4 is a photograph illustrating the effect of the NES region on the protection function against the oxidative stress of the Yap1 activator.

La souche délétée pour le gène YAP1, #yap1, a été transformée par les différents plasmides pLG, pLGY et pLGYm et les clones transformant ont été mis à croître sur une dose ou non de 1 mM H202. Cette dose est létale pour une souche #yap1, mais ne l'est pas pour une souche de type sauvage (WT). Le plasmide pLG ne restaure pas la capacité à croître sur 1 mM H202 d'une souche #yap1, ainsi que le plasmide pLGYm, comme cela était attendu. En revanche, la construction pLGY restaure partiellement sur glucose et complètement sur galactose la capacité de la souche #yap1 à croître sur 1 mM d'H202. The strain deleted for the YAP1 gene, # yap1, was transformed by the different plasmids pLG, pLGY and pLGYm and the transforming clones were grown on a dose of 1 mM H202 or not. This dose is lethal for a # yap1 strain, but not for a wild-type (WT) strain. Plasmid pLG does not restore the ability to grow on 1 mM H202 of a # yap1 strain, as well as plasmid pLGYm, as expected. In contrast, the pLGY construct restores partially on glucose and completely on galactose the ability of the # yap1 strain to grow on 1 mM H 2 O 2.

Figure 5 : La figure 5 est un graphe illustrant les dosages de l'activité ssgalactosidase mesurée sur une souche sauvage co-transformée par les plasmides pLGY et pUASlexA-lacZ. Les valeurs d'activité sont rapportées à l'activité d'une souche sauvage ne contenant que le plasmide pUASlexAlacZ et soumis aux même conditions. A DO=0,3 ; les cultures en milieu glucose ont été mises en contact avec des doses sublétales d'H202, de diamide ou d' H202 et diamide combiné. Figure 5: Figure 5 is a graph illustrating the assays of ssgalactosidase activity measured on a wild strain co-transformed with plasmids pLGY and pUASlexA-lacZ. The activity values are related to the activity of a wild-type strain containing only the plasmid pUASlexAlacZ and subjected to the same conditions. At OD = 0.3; cultures in glucose medium were contacted with sublethal doses of H202, diamide or H202 and diamide combined.

Figure 6 : La figure 6 est un graphe illustrant les dosages de l'activité ssgalactosidase mesurée sur une souche sauvage co-transformée par les plasmides pLGYm et pUASlexA-lacZ. Les valeurs d'activité sont rapportées à l'activité d'une souche sauvage ne contenant que le plasmide pUASlexAlacZ et soumis aux même conditions. A DO=0,3 ; les cultures en milieu Figure 6: Figure 6 is a graph illustrating the assays of ssgalactosidase activity measured on a wild strain co-transformed with plasmids pLGYm and pUASlexA-lacZ. The activity values are related to the activity of a wild-type strain containing only the plasmid pUASlexAlacZ and subjected to the same conditions. At OD = 0.3; cultures in the middle

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glucose ont été mises en contact avec des doses sublétales d'H202, de diamide ou d'H202 et diamide combiné.  Glucose was contacted with sublethal doses of H 2 O 2, diamide or H 2 O 2 and combined diamide.

Figure 7: La figure 7 est une photographie illustrant les niveaux de coloration révélés par un test colorimétrique et mesurés sur des colonies transférées sur filtre nylon. Après transformation de la souche S. cerevisiae par le plasmide pLGY (A) et pLGYm (B) ; les transformant ont été repiqués et mis à croître sur milieu glucose et répliqués sur filtre. Les filtres contenant les colonies ont été transférés durant un temps déterminé sur un milieu contenant ou non des doses sublétales d'eau oxygénée ou de diamide. Figure 7: Figure 7 is a photograph illustrating color levels revealed by colorimetric assay and measured on colonies transferred to a nylon filter. After transformation of the strain S. cerevisiae by the plasmid pLGY (A) and pLGYm (B); transformants were subcultured and grown on glucose medium and replicated on filter. The filters containing the colonies were transferred for a definite time to a medium containing or not sublethal doses of hydrogen peroxide or diamide.

Figure 8 : La figure 8 est une illustration d'un exemple de mise en oeuvre d'un procédé de l'invention pour le criblage de protéines ou de polypeptide dont la répartition nucléo-cytoplasmique est contrôlée en réponse à un stimulus spécifique. Figure 8: Figure 8 is an illustration of an example of implementation of a method of the invention for the screening of proteins or polypeptide whose nucleo-cytoplasmic distribution is controlled in response to a specific stimulus.

A. Matériels et méthodes A.1 Milieux, plasmides et souches Dans les expériences décrites plus loin, les milieux de culture utilisés sont les milieux complets (YPD) ou minimum synthétique glucose (YNB) (24). A. Materials and Methods A.1 Media, Plasmids and Strains In the experiments described below, the culture media used are Complete Media (YPD) or Synthetic Minimum Glucose (YNB) (24).

Les souches S. cerevisiae utilisées sont la souche S. cerevisiae YPH98 (27), contenant le plasmide pUASlexA-lacZ portant la cassette constituée du gène lacZ sous contrôle d'un promoteur et d'une ou plusieurs séquences de fixation de la protéine LexA, et la souche isogénique portant la délétion yap1#-1 (yap1 ::LEU2) encore appelée Ayapl. The S. cerevisiae strains used are S. cerevisiae strain YPH98 (27), containing the plasmid pUASlexA-lacZ carrying the cassette consisting of the lacZ gene under the control of a promoter and one or more LexA protein binding sequences, and the isogenic strain carrying the deletion yap1 # -1 (yap1 :: LEU2) also called Ayapl.

Le plasmide pLEXADBD-GAL4AD (vecteur d'expression) déposé le 13 Juillet 2000 à la CNCM sous le n I-2519 a été construit par l'insertion de la séquence codant le domaine Gal4AD (acide aminé 767 à 880) au site de clonage du vecteur pGilda-LexADBD commercialisé par Clontech. La figure 1 présente un schéma dudit plasmide. The plasmid pLEXADBD-GAL4AD (expression vector) deposited on July 13, 2000 at the CNCM under the number I-2519 was constructed by inserting the sequence encoding the Gal4AD domain (amino acid 767 to 880) at the cloning site. pGilda-LexADBD vector marketed by Clontech. Figure 1 shows a diagram of said plasmid.

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A. 2 Dosage B-qalactosidase Milieu Solide : Les souches de levure ont été mises en culture en milieu minimum liquide additionné des acides aminés nécessaires à sa croissance et contenant du glucose. Ces levures ont ensuite été étalées sur milieu solide identique au milieu liquide pour obtenir une densité d'environ une centaine de colonies par boîte de pétri de 10 cm de diamètre. Après 36 heures à 30 C, les colonies sont transférées par adsorption sur un filtre nylon. Ce filtre est déposé sur le même type de milieu solide que décrit précédemment (colonie dirigée vers le haut) additionné ou non d'une dose de 1 mM d'H202 ou de 0,5 mM de cadmium. Après 8 heures dans ces conditions, les filtres sont plongés dans l'azote liquide (pour perméabiliser les levures) puis déposés (colonie dirigée vers le haut sur un papier Wattman imbibé d'une solution 100 mM tampon phosphate, 10 mM KCI, 10 mM MgS04 et contenant 1 mM de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-Dgalactopyranoside (X-gal) (substrat de la ss-galactosidase)). Les colonies sont placées à 30 C durant 4 heures afin de révéler la coloration. A. 2 Assay B-qalactosidase Medium Solid: The yeast strains were cultured in a minimum liquid medium supplemented with the amino acids necessary for its growth and containing glucose. These yeasts were then spread on solid medium identical to the liquid medium to obtain a density of about one hundred colonies per petri dish of 10 cm in diameter. After 36 hours at 30 ° C., the colonies are transferred by adsorption to a nylon filter. This filter is deposited on the same type of solid medium as previously described (colony directed upwards) with or without a dose of 1 mM H 2 O 2 or 0.5 mM cadmium. After 8 hours under these conditions, the filters are immersed in liquid nitrogen (to permeabilize the yeasts) and then deposited (colony directed upwards on a Wattman paper impregnated with a solution 100 mM phosphate buffer, 10 mM KCl, 10 mM MgSO 4 and containing 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-Dgalactopyranoside (X-gal) (substrate for β-galactosidase)). The colonies are placed at 30 C for 4 hours to reveal the color.

Milieu liquide : Les souches de levure sont mises en culture à 30 C dans 20 ml de milieu liquide minimum additionné avec les acides aminés nécessaires à sa croissance et au maintien des plasmides et contenant du glucose. A la densité optique de 0,3, les souches cultivées ont été ou non mises en présence d'une dose sublétale d' H202 (0,2 mM), de diamide (1 mM) ou des deux éléments combinés (0,2 mM d' H2O2 + 1 mM de diamide). Liquid medium: The yeast strains are cultured at 30 ° C. in 20 ml of minimum liquid medium supplemented with the amino acids necessary for its growth and the maintenance of the plasmids and containing glucose. At the optical density of 0.3, the cultured strains were or were not brought into contact with a sublethal dose of H202 (0.2 mM), diamide (1 mM) or the two combined elements (0.2 mM). H2O2 + 1 mM diamide).

Au temps t=2 heures 0,6 mM d' H202 et 2 mM de diamide ou les deux combinés (0,6 mM d' H202 + 2 mM de diamide) sont ajoutés au milieu de culture. Au temps t=4 heures, les cultures sont arrêtées et centrifugées. Les culots sont congelés à -80 C. Les protéines sont extraites de la façon suivante : les culots sont repris dans 200 l de tampon (0,1 mM Tris-HCI (pH 7,5), 0,2 M NaCI, 0,01 M ss-mercaptoéthanol, 20% glycérol et 5 mM EDTA. Les tubes sont plongés dans l'azote liquide puis décongelés à 30 C. At time t = 2 hours, 0.6 mM H 2 O 2 and 2 mM diamide or both combined (0.6 mM H 2 O 2 + 2 mM diamide) are added to the culture medium. At time t = 4 hours, the cultures are stopped and centrifuged. The pellets are frozen at -80 ° C. The proteins are extracted as follows: the pellets are taken up in 200 l of buffer (0.1 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl, 0, M ss-mercaptoethanol, 20% glycerol and 5 mM EDTA The tubes are immersed in liquid nitrogen and then thawed at 30 ° C.

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L'opération est répétée deux fois. 30 l de la suspension est utilisée pour le dosage p-galactosidase et au temps t=0 minute sont ajoutés 3 ml de MgCl2 0. 1 mM, 4. 5 M p-mercaptoéthanol, 3 l de MUG (4-méthyl-umbelliféryl-p-Dgalactoside) 100 mM et 264 l de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7,5. La réaction est arrêtée à différents temps avec 500 (il de Na2CO3 1M. La lecture du dosage est réalisée au fluorimètre avec comme longueur d'onde d'excitation 365 nm et d'émission 455 nm. The operation is repeated twice. 30 μl of the suspension is used for the β-galactosidase assay and at time t = 0 min 3 ml of 1 mM MgCl 2, 4. 5 M p-mercaptoethanol, 3 μl of MUG (4-methylumbelliferyl) are added. p-Dgalactoside) 100 mM and 264 l of 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.5. The reaction is stopped at different times with 500 μl of 1 M Na 2 CO 3 The reading of the assay is carried out with the fluorimeter with excitation wavelength 365 nm and emission 455 nm.

B. Résultats Exemple 1 Validation du procédé de criblage
La protéine Yap1 a été utilisée pour explorer la validité du procédé de criblage des domaines polypeptidiques impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique. B. Results Example 1 Validation of the screening method
The Yap1 protein has been used to explore the validity of the method of screening polypeptide domains involved in the control of nucleo-cytoplasmic translocation in response to a specific stimulus.

Pour cela, une fusion a été réalisée entre lexADBD (DNA Binding Domain, ayant la propriété de se fixer à une séquence d'ADN spécifique : UASlexA), Gal4AD (Activating Domain, ayant la propriété de recruter la polymérase) et Yap1. La construction obtenue est nommée LGY (figure 2A). LexA et Gal4 ne contiennent aucune séquence d'adressage au noyau ; ainsi, la localisation nucléo-cytoplasmique de la fusion est dictée uniquement par le domaine impliqué dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique portée par la protéine Yap1. Une construction analogue a été réalisée avec lexA, Gal4 et Yap1 muté au site de translocation nucléo-cytoplasmique (NES). Cette construction obtenue est nommée LGYm (figure 2B). Cette dernière construction permet de tester l'effet d'une localisation constitutive au noyau de la protéine LGYm sur l'expression du gène rapporteur lacZ (voir plus bas). Une construction exprimant seulement la protéine lexA-Gal4 a été réalisée et nommée LG (figure 2C). For this, a fusion was performed between lexADBD (DNA Binding Domain, having the property of attaching to a specific DNA sequence: UASlexA), Gal4AD (Activating Domain, having the property of recruiting the polymerase) and Yap1. The resulting construct is named LGY (Figure 2A). LexA and Gal4 do not contain any kernel addressing sequence; thus, the nucleo-cytoplasmic localization of the fusion is dictated solely by the domain involved in the control of the nucleo-cytoplasmic translocation carried by the Yap1 protein. A similar construct was performed with mutated lexA, Gal4, and Yap1 at the nucleo-cytoplasmic translocation (NES) site. This obtained construct is named LGYm (Figure 2B). This latter construction makes it possible to test the effect of constitutive localization at the nucleus of the LGYm protein on the expression of the lacZ reporter gene (see below). A construct expressing only the lexA-Gal4 protein was made and named LG (Figure 2C).

L'ensemble de ces constructions LGY, LGYm et LG a été placé sous le contrôle d'un promoteur inductible au galactose et répressible au glucose et All of these LGY, LGYm and LG constructs were placed under the control of an inducible galactose and glucose repressible promoter and

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sur un vecteur nucléotidique de levure à faible nombre de copies pour donner respectivement les plasmides recombinants pLGY, pLGYm et pLG.  on a low copy number yeast nucleotide vector to give respectively the recombinant plasmids pLGY, pLGYm and pLG.

Elles ont été introduites dans une souche de levure contenant la construction promoteur UASlexA (pUASlexA fusionné au gène rapporteur lacZ codant pour la ss-galactosidase) (figure 2D). Afin de vérifier que la triple fusion lexA, Gal4, Yap1 n'altérait pas la fonction de cette dernière protéine Yap1, la construction obtenue a été testée pour la complémentation d'une souche de levure délétée pour la fonction Yap1 (#yap1) en réalisant l'expérience suivante : Les trois constructions pLGY, pLGYm et pLG (figure 4) ont été introduites dans une souche de levure #yap1, puis la souche #yap1 a été soumise à un stress pour tester l'hypersensibilité à l'H202 de la souche. Les résultats montrent que la fusion LGY supprime l'hypersensibilité à l'eau oxygénée de la souche #yap1. Ceci montre que la fusion LGY n'altère pas les propriétés de la protéine Yap1 en réponse au stress oxydatif. A l'aide de la construction LGY, il devrait donc être possible d'évaluer le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique de la protéine de fusion LGY en fonction d'un stimulus spécifique, en l'occurrence un stress oxydatif. Afin de confirmer cette hypothèse, l'expérience suivante a été établie. Les souches de levure sauvage contenant le plasmides pUASlexA-lacZ et respectivement les plasmides pLG, pLGY, pLGYm ont été cultivées en milieu liquide contenant du glucose. La culture des cellules en milieu glucose permet une expression faible des constructions LG, LGY et LGYm. En phase exponentielle et à la densité optique (DO) de 0,3, les différentes souches ont été soumises à un stress ou non avec des doses sublétales d'eau oxygénée, de diamide, ou d'eau oxygénée et de diamide combinés. Il a été observé : - qu'en présence ou en absence de stress, l'expression du gène rapporteur ss-galactosidase est la même pour les souches comprenant la construction LG ou n'en contenant pas. La protéine LG, ne possédant pas de séquence d'adressage au noyau, est localisée dans le They were introduced into a yeast strain containing the UASlexA promoter construct (pUASlexA fused to the lacZ reporter gene encoding β-galactosidase) (FIG. 2D). In order to verify that the triple fusion lexA, Gal4, Yap1 did not alter the function of this last protein Yap1, the resulting construct was tested for the complementation of a yeast strain deleted for the function Yap1 (# yap1) by realizing The following experiment: The three constructs pLGY, pLGYm and pLG (FIG. 4) were introduced into a yap1 yeast strain, then the # yap1 strain was subjected to stress to test the hypersensitivity to H2O2 of the yeast. strain. The results show that the LGY fusion suppresses hypersensitivity to hydrogen peroxide of the # yap1 strain. This shows that LGY fusion does not alter the properties of Yap1 protein in response to oxidative stress. With the help of the LGY construct, it should therefore be possible to evaluate the control of the nucleo-cytoplasmic translocation of the LGY fusion protein according to a specific stimulus, in this case an oxidative stress. In order to confirm this hypothesis, the following experiment has been established. Wild yeast strains containing plasmid pUASlexA-lacZ and plasmids pLG, pLGY, pLGYm, respectively, were cultured in glucose-containing liquid medium. Cell culture in glucose medium allows weak expression of LG, LGY and LGYm constructs. In the exponential phase and at the optical density (OD) of 0.3, the different strains were subjected to stress or not with sublethal doses of oxygenated water, diamide, or hydrogen peroxide and diamide combined. It has been observed that: - in the presence or absence of stress, the expression of the β-galactosidase reporter gene is the same for strains comprising the LG construct or not containing it. The LG protein, lacking a nuclear targeting sequence, is localized in the

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cytoplasme et n'active pas l'expression du gène rapporteur. En revanche, pour une construction LG contenant une séquence NLS d'adressage au noyau, il a été mesuré une très forte activité ss-galactosidase ; - qu'en l'absence de stress, l'expression du gène rapporteur ss-galactosidase est la même pour les souches contenant la construction
LG ou LGY (figure 5) ; - que, pour la souche contenant la construction LGY et en présence d'un stress eau oxygénée, diamide, ou eau oxygénée-diamide combinés, il est observé une nette augmentation de l'activité ss-galactosidase (figure 5) ; - qu'en l'absence de stress, la protéine chimérique LGYm active l'expression du gène rapporteur (figure 6). cytoplasm and does not activate the expression of the reporter gene. In contrast, for an LG construct containing an NLS kernel targeting sequence, a very high ss-galactosidase activity was measured; - in the absence of stress, the expression of the β-galactosidase reporter gene is the same for the strains containing the construct
LG or LGY (Figure 5); that, for the strain containing the LGY construct and in the presence of oxygenated water, diamide or oxygenated-diamide combined stress, there is a marked increase in the β-galactosidase activity (FIG. 5); in the absence of stress, the chimeric LGYm protein activates the expression of the reporter gene (FIG. 6).

Ces résultats démontrent que l'augmentation de l'activité ss-galactosidase est clairement dépendante du contrôle de la localisation nucléocytoplasmique des protéines chimériques LGY ou LGYm. De plus, les fusions n'ont pas altéré la fonction du facteur de transcription lexA-Gal4, ni celle de Yap1, en particulier le domaine de Yap1 codant un domaine polypeptidique impliqué dans le contrôle nucléo-cytoplasmique en réponse à un stress spécifique. Le système semble donc opérationnel pour quantifier de manière précise les mouvements de Yap1 entre le cytoplasme et le noyau et, de manière plus générale, les mouvements d'une protéine en fonction d'un stimulus spécifique Exempte 2 : Exemple de mise en oeuvre du procédé de criblage de séquences nucléotidiques codant des protéines ou polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique est contrôlée en réponse à un stimulus spécifique. These results demonstrate that the increase in β-galactosidase activity is clearly dependent on the control of the nucleocytoplasmic localization of the LGY or LGYm chimeric proteins. In addition, the fusions did not alter the function of the lexA-Gal4 or Yap1 transcription factor, particularly the Yap1 domain encoding a polypeptide domain involved in nucleo-cytoplasmic control in response to a specific stress. The system therefore seems to be operational to accurately quantify the Yap1 motions between the cytoplasm and the nucleus and, more generally, the movements of a protein according to a specific stimulus. Exempt 2: Example of the implementation of the method screening for nucleotide sequences encoding proteins or polypeptides whose nucleo-cytoplasmic distribution is controlled in response to a specific stimulus.

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Il est possible de recenser par un criblage exhaustif les effecteurs de la réponse à un stimulus spécifique dont l'activation repose sur une régulation de la translocation nucléo-cytoplasmique. Ce criblage est réalisé grâce à l'élaboration d'une banque d'ADN. Plusieurs millions de transformants indépendants sont testés séparément par l'étalement du résultat de la transformation sur boîte de pétri contenant un milieu solide 2. 5% agar. Les clones transformants sont mis à croître sur milieu contenant aussi le substrat chromogénique de la P-galactosidase, X-gal, ce qui permet de mesurer directement par un test de coloration simple sur boîte, l'activité ss-galactosidase des colonies étalées. Afin de valider la possibilité de cribler les clones par un test de coloration sur boîte reflétant les niveaux d'expression du gène rapporteur lacZ, l'expérience suivante a été réalisée Les clones contenant respectivement les constructions LGY ou LGYm ont été cultivés et étalés sur boîte de pétri. Les colonies isolés sont transférées sur un filtre préalablement déposé sur un milieu contenant de l'eau oxygénée ou du diamide (figure 7A). Les résultats de cette expérience sont les suivants : l'apparition d'une coloration bleue des colonies (révélant une expression de la protéine ss-galactosidase) est observée avec la construction LGY uniquement en présence de stress. Pour une souche transformée avec la construction LGYm, il est aussi observé une expression du gène rapporteur en l'absence de stress (figure 7B). Les résultats sont donc fidèles à ceux qui avaient été obtenus en milieu liquide et montrent qu'il est tout à fait envisageable de cribler une banque d'ADN pour recenser les facteurs susceptibles de transiter du cytoplasme au noyau durant un stimulus spécifique ou inversement du noyau vers le cytoplasme. Plus précisément, le criblage est réalisé de la manière suivante : a) Comme présentée dans la figure 8, à la place du gène YAP1, une banque d'ADN génomique de levure ou une banque d'ADN complémentaire de plantes ou de mammifères, est ajoutée en  The effectors of the response to a specific stimulus whose activation is based on a regulation of the nucleo-cytoplasmic translocation can be identified by exhaustive screening. This screening is performed through the development of a DNA library. Several million independent transformants are separately tested by spreading the result of petri dish transformation containing solid medium 2. 5% agar. The transforming clones are grown on medium also containing the chromogenic substrate of β-galactosidase, X-gal, which enables the β-galactosidase activity of the plated colonies to be measured directly by a simple staining test on the plate. In order to validate the possibility of screening the clones by a box staining test reflecting the levels of expression of the lacZ reporter gene, the following experiment was carried out. The clones containing respectively the LGY or LGYm constructs were grown and spread on a box. of petri. The isolated colonies are transferred to a filter previously deposited on a medium containing oxygenated water or diamide (FIG. 7A). The results of this experiment are as follows: the appearance of colony blue staining (revealing expression of the β-galactosidase protein) is observed with the LGY construct only in the presence of stress. For a strain transformed with the LGYm construct, expression of the reporter gene in the absence of stress is also observed (FIG. 7B). The results are therefore faithful to those obtained in liquid medium and show that it is quite possible to screen a DNA library to identify the factors likely to pass from the cytoplasm to the nucleus during a specific stimulus or conversely of the nucleus. to the cytoplasm. More precisely, the screening is carried out as follows: a) As shown in FIG. 8, in place of the YAP1 gene, a yeast genomic DNA library or a DNA library complementary to plants or mammals, is added in

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fusion avec les tag HA et c-myc, utilisés pour l'immuno- localisation, et la GFP utilisée pour la localisation par fluorescence et la construction LG. b) Les colonies transformant sont mises en contact sur milieu solide puis répliquées sur deux boites c) Sur une boite, un stimulus spécifique est appliqué, sur l'autre boite, aucun stimulus n'est appliqué. d) A l'aide de la construction pUASlexA-LEU2, contenant le gène d'auxotrophie à la leucine (figure 8), il est possible de sélectionner, dans un premier temps, trois types de protéine (sur le critère de croissance ou non de la levure) : - celles dont la localisation est toujours nucléaire, mais neutre au niveau de l'activation ou de la répression de la transcription (type a) ; - celles dont la localisation est toujours nucléaire, mais bloquant ou activant la transcription en fonction d'un stimulus spécifique (malgré la présence de Gal4AD) (type ss) ; - celles dont la localisation change entre le cytoplasme et le noyau sous l'effet d'un stimulus spécifique (type #). e) A l'aide la construction du gène rapporteur pUASlexA-lacZ (figure
8), il est possible d'éliminer sur le critère de la coloration blanche ou bleue les protéines de type a. En effet, pour cette catégorie de protéine, avec ou sans stimulus, les colonies sont toujours bleues, alors que, pour les protéines de types p ou #, la coloration des colonies est modifiée sous l'effet du stimulus spécifique. fusion with the HA and c-myc tags, used for immuno-localization, and the GFP used for fluorescence localization and LG construction. b) The transforming colonies are put in contact on solid medium then replicated on two boxes c) On one box, a specific stimulus is applied, on the other box, no stimulus is applied. d) Using the pUASlexA-LEU2 construct, containing the leucine auxotrophy gene (FIG. 8), it is possible to initially select three types of protein (on the growth criterion or not) yeast): - those whose location is always nuclear, but neutral at the level of activation or repression of transcription (type a); - those whose location is still nuclear, but blocking or activating transcription according to a specific stimulus (despite the presence of Gal4AD) (type ss); - those whose location changes between the cytoplasm and the nucleus under the effect of a specific stimulus (type #). e) Using the construction of the reporter gene pUASlexA-lacZ (Figure
8), it is possible to eliminate, on the criterion of the white or blue coloring, the proteins of type a. In fact, for this category of protein, with or without stimulus, the colonies are always blue, whereas for p- or # -proteins colony staining is modified under the effect of the specific stimulus.

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f) A l'aide de la GFP (Green Fluorescent Protein), et des tags HA, c- myc, dans la construction originale (figure 8), il est possible de distinguer les deux catégories de protéines p et #. En effet, il est possible d'observer par microscopie optique la localisation de la fusion et de faire la distinction entre une protéine dont la localisation cellulaire change sous l'effet du stimulus de celles dont la localisation est toujours nucléaire.  f) Using GFP (Green Fluorescent Protein), and HA tags, c-myc, in the original construct (Figure 8), it is possible to distinguish the two categories of proteins p and #. Indeed, it is possible to observe by optical microscopy the location of the fusion and to distinguish between a protein whose cellular localization changes under the effect of the stimulus of those whose location is always nuclear.

Exemple 3 : Exemple d'un procédé pour l'identification de résidus spécifiquement impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique d'une protéine donnée
Pour illustrer le procédé de l'invention permettant d'identifier des résidus spécifiquement impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique d'une protéine donnée, l'exemple qui suit présente la mise en oeuvre du procédé dans le cas de la protéine Yap1. Dans le cas de la protéine Yap1, il a été montré que la partie C-terminale de cette protéine est nécessaire mais non suffisante pour conserver le mode de régulation par translocation nucléocytoplasmique. La protéine Yap1 p est fusionnée avec le facteur de transcription lexA-Gal4 pour former la protéine de fusion LGY. Les résultats présentés dans les exemples 1 et 2 ont montré que l'expression du gène rapporteur lacZ sous contrôle de la protéine LGY était dépendante de l'application d'un stress oxydatif. Example 3: Example of a method for the identification of residues specifically involved in the control of nucleo-cytoplasmic translocation in response to a specific stimulus of a given protein
To illustrate the method of the invention for identifying residues specifically involved in the control of the nucleo-cytoplasmic translocation in response to a specific stimulus of a given protein, the following example presents the implementation of the method in the case of the Yap1 protein. In the case of the Yap1 protein, it has been shown that the C-terminal portion of this protein is necessary but not sufficient to maintain the mode of regulation by nucleocytoplasmic translocation. The Yap1 p protein is fused with the lexA-Gal4 transcription factor to form the LGY fusion protein. The results presented in Examples 1 and 2 showed that the expression of the lacZ reporter gene under control of the LGY protein was dependent on the application of oxidative stress.

La séquence nucléotidique portant la séquence codant la protéine Yap1 est mutagénisée par mutagenèse aléatoire. La mutagenèse aléatoire est réalisée par PCR dans des conditions augmentant la probabilité d'erreurs de la polymérase. Les produits de PCR comportant potentiellement des mutations sont ensuite insérés dans le vecteur pLG pour réaliser une banque de plasmides pLGY potentiellement mutés au niveau de la séquence codant pour la protéine Yap1. Cette banque de  The nucleotide sequence carrying the sequence coding for the Yap1 protein is mutagenized by random mutagenesis. Random mutagenesis is performed by PCR under conditions increasing the probability of polymerase errors. Potentially mutant PCR products are then inserted into the pLG vector to make a library of potentially mutated pLGY plasmids at the sequence coding for the Yap1 protein. This bank of

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plasmide est introduite dans la souche de Saccharomyces cerevisiae contenant la cassette rapporteur pUASlexA-lacZ. Les clones transformants sont ensuite étalés sur milieu solide de croissance sans X-gal. Les clones sont ensuite repiqués et répliqués sur milieu contenant du X-gal avec ou sans agent stressant. Les clones dont la coloration reste bleue en présence ou en absence de stress sont sélectionnés, ils contiennent une mutation affectant la fonction de régulation en réponse à un agent stressant. Les clones dont la coloration bleue sur milieu avec agent stressant est plus intense que le niveau de coloration du clone exprimant la protéine LGY sauvage sont aussi sélectionnés. Ils permettent d'identifier des mutations augmentant le phénomène de translocation en réponse à un agent stressant. Les mutations sont caractérisées par l'extraction des plasmides de levure des clones sélectionnés et le séquençage de la région mutagénisée.  The plasmid is introduced into the Saccharomyces cerevisiae strain containing the pUASlexA-lacZ reporter cassette. The transforming clones are then spread on solid growth medium without X-gal. The clones are then subcultured and replicated on medium containing X-gal with or without stressing agent. Clones whose staining remains blue in the presence or absence of stress are selected, they contain a mutation affecting the regulatory function in response to a stressor. Clones whose blue coloration on a medium with a stressing agent is more intense than the level of coloration of the clone expressing the wild-type LGY protein are also selected. They make it possible to identify mutations increasing the translocation phenomenon in response to a stressor. The mutations are characterized by extracting yeast plasmids from selected clones and sequencing the mutagenized region.

Ainsi, ce procédé de criblage simple à mettre en oeuvre, permet d'identifier de manière précise les acides aminés d'une protéine donnée spécifiquement impliqués dans le contrôle de la translocation nucléocytoplasmique en réponse à un stimulus. Il permet aussi de construire des séquences artificielles optimisées en fonction de l'intensité de contrôle de la translocation souhaitée.  Thus, this simple screening method to be used makes it possible to precisely identify the amino acids of a given protein specifically involved in the control of the nucleocytoplasmic translocation in response to a stimulus. It also makes it possible to construct artificial sequences optimized according to the intensity of control of the desired translocation.

Exemple 4 : Exemple de mise en #uvre du procédé de criblage de substances ou de stimuli spécifiques capables de bloquer ou de stimuler la translocation nucléo- cytoplasmique d'une protéine donnée
Afin d'illustrer le procédé de criblages de substances selon l'invention, l'influence de trois stimuli sur la translocation nucléocytplasmique de la protéine Yap1 a été étudiée. Le plasmide pLGY a été introduit dans la souche S. cerevisiae YPH98 contenant la cassette rapporteur pUASlexA-lacZ. Un ou plusieurs clones transformants ont été EXAMPLE 4 Example of the Implementation of the Method for Screening Specific Substances or Stimuli that Block or Stimulate the Nucleocytoplasmic Translocation of a Given Protein
In order to illustrate the method for screening substances according to the invention, the influence of three stimuli on the nucleocytoplasmic translocation of the Yap1 protein has been studied. Plasmid pLGY was introduced into S. cerevisiae strain YPH98 containing the pUASlexA-lacZ reporter cassette. One or more transforming clones have been

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repiqués en milieu liquide et mis à croître séparément à 28 C. L'effet de l'application de trois stimuli différents a été testé séparément, un stimulus consistant à appliquer de l'H202, un stimulus consistant à appliquer un autre agent oxydant, le diamide et enfin un troisième stimulus consistant à appliquer une combinaison de diamide et d' H2O2. L'expression du gène rapporteur lacZ a été quantifiée par dosage ss-galactosidase en absence ou en présence des stimuli appliqués. Les résultats présentés dans la figure 5 montrent une expression induite du gène lacZ par l'eau oxygéné ou le diamide. De manière surprenante, les résultats montrent une expression du gène lacZ 4,5 fois plus forte en présence d'une combinaison des deux produits. Ainsi, cette expérience montrent qu'il est possible d'évaluer le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée et de quantifier les mouvements de protéines du cytoplasme vers le noyau ou du noyau vers le cytoplasme. Ils montrent aussi qu'il est envisageable de tester à grande échelle un grand nombre de molécules susceptibles d'agir en favorisant ou en empêchant la translocation de protéines d'intérêt et de quantifier l'importance du phénomène.  transplanted in liquid medium and grown separately at 28 C. The effect of the application of three different stimuli was tested separately, a stimulus consisting of applying H202, a stimulus consisting in applying another oxidizing agent, the diamide and finally a third stimulus of applying a combination of diamide and H2O2. Expression of the lacZ reporter gene was quantified by ss-galactosidase assay in the absence or presence of applied stimuli. The results presented in FIG. 5 show an induced expression of the lacZ gene by oxygenated water or diamide. Surprisingly, the results show an expression of the lacZ gene 4.5 times stronger in the presence of a combination of the two products. Thus, this experiment shows that it is possible to evaluate the control of the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein and to quantify the movements of proteins from the cytoplasm to the nucleus or from the nucleus to the cytoplasm. They also show that it is possible to test on a large scale a large number of molecules likely to act by promoting or preventing the translocation of proteins of interest and to quantify the importance of the phenomenon.

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Claims (38)

REVENDICATIONS 1. Vecteur d'expression permettant l'expression d'une protéine directement ou indirectement susceptible d'activer ou d'inhiber la transcription d'un gène rapporteur présent dans une cellule hôte, et comprenant les éléments suivants : > des séquences nucléotidiques codant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine d'activation transcriptionnelle, lesdites séquences nucléotidiques étant exemptes de domaines de localisation nucléaire (NLS) ou de domaines d'exportation nucléaire (NES) ; > au moins un site de clonage permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique X à cribler, ces éléments étant placés sur le vecteur sous le contrôle d'un promoteur inductible et/ou répressible par un ou des effecteur(s) externe (s) de manière à permettre, après l'insertion d'une séquence nucléotidique X , l'expression d'une protéine comportant en fusion le domaine de liaison à l'ADN, le domaine d'activation transcriptionnelle et le polypeptide d'expression de la séquence nucléotidique X à cribler.  1. Expression vector for the expression of a protein directly or indirectly capable of activating or inhibiting the transcription of a reporter gene present in a host cell, and comprising the following elements: nucleotide sequences coding a DNA binding domain, a transcriptional activation domain, said nucleotide sequences being free of nuclear localization domains (NLS) or nuclear export domains (NES); at least one cloning site allowing the insertion of a nucleotide sequence X to be screened, these elements being placed on the vector under the control of an inducible and / or repressible promoter by an external effector (s) (s) ) to allow, after the insertion of an X nucleotide sequence, the expression of a fusion protein the DNA binding domain, the transcriptional activation domain and the expression polypeptide of the nucleotide sequence X to be screened. 2. Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend en plus une séquence codant un marqueur de la localisation cellulaire ou/et une séquence d'immuno-localisation, lesdites séquences étant placées sur le vecteur de manière à permettre, après l'insertion d'une séquence nucléotidique X dans le vecteur, l'expression d'une protéine comportant en fusion le domaine de liaison à l'ADN, le domaine d'activation transcriptionnelle, le marqueur de la localisation cellulaire ou/et le peptide d'immuno-localisation et le polypeptide d'expression de la séquence nucléotidique X à cribler. 2. Vector according to claim 1 characterized in that it further comprises a sequence encoding a marker of the cellular localization and / or an immuno-localization sequence, said sequences being placed on the vector so as to allow, after the inserting an X nucleotide sequence into the vector, expressing a fusion protein, the DNA binding domain, the transcriptional activation domain, the cell localization marker and / or the peptide immuno-localization and the expression polypeptide of the nucleotide sequence X to be screened. <Desc/Clms Page number 45><Desc / Clms Page number 45> 3. Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'un marqueur de la localisation cellulaire est un domaine présentant une émission de fluorescence après excitation à une longueur d'onde appropriée.  3. Vector according to claim 2 characterized in that a marker of the cellular localization is a domain having a fluorescence emission after excitation at an appropriate wavelength. 4. Vecteur selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'un domaine présentant une émission de fluorescence est choisi parmi le groupe protéines de la GFP, RFP ou BFP. 4. Vector according to claim 3 characterized in that a domain having a fluorescence emission is selected from the group of proteins of GFP, RFP or BFP. 5. Vecteur selon l'une des quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'une séquence d'immuno-localisation est choisie parmi le groupe des séquences codant les étiquettes HA, c-myc ou5. Vector according to any one of claims 2 to 4, characterized in that an immuno-localization sequence is chosen from the group of sequences encoding the labels HA, c-myc or HA-c-myc. HA-c-myc. 6. Vecteur selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'un promoteur inductible ou répressible est le promoteur comprenant l'UASGAL ou les promoteurs inductibles ou répressibles à la tétracycline. 6. Vector according to one of the preceding claims characterized in that an inducible or repressible promoter is the promoter comprising UASGAL or inducible or repressible promoters with tetracycline. 7. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel un domaine de liaison à l'ADN est sélectionné parmi les domaines des protéines lexA, Gal4 et TetR, et plus particulièrement la séquence lexADBD. The vector according to any preceding claim wherein a DNA binding domain is selected from the lexA, Gal4 and TetR protein domains, and more particularly the lexADBD sequence. 8. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel un domaine d'activation transcriptionnelle est sélectionné parmi les domaines des protéines Gal4 et B42. The vector of any preceding claim wherein a transcriptional activation domain is selected from the domains of Gal4 and B42 proteins. 9. Plasmide pLEXABDBD-GAL4AD déposé à la CNCM le 13 Juillet9. Plasmid pLEXABDBD-GAL4AD deposited at the CNCM on July 13th 2000 sous le n I-2519. 2000 as I-2519. 10. Plasmide recombinant caractérisé en ce qu'il est constitué d'un vecteur d'expression selon l'une des revendications 1 à 9 et d'une séquence nucléotidique dont la propriété éventuelle d'être impliquée dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une 10. Recombinant plasmid characterized in that it consists of an expression vector according to one of claims 1 to 9 and a nucleotide sequence whose possible property to be involved in the control of the nucleotide translocation. cytoplasmic of a <Desc/Clms Page number 46><Desc / Clms Page number 46> protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique est recherchée, ladite séquence nucléotidique étant insérée au site de clonage dudit vecteur d'expression.  given protein in response to a specific stimulus is sought, said nucleotide sequence being inserted at the cloning site of said expression vector. 11. Banque de plasmides recombinants issue de l'insertion d'une banque d'acides nucléiques dans le vecteur selon l'une des revendications 1 à 9. 11. Bank of recombinant plasmids resulting from the insertion of a nucleic acid library into the vector according to one of claims 1 to 9. 12. Banque de plasmides recombinants selon la revendication 11 caractérisée en ce que la banque d'acides nucléiques est construite à partir d'extraits d'acides nucléiques génomiques. 12. Bank of recombinant plasmids according to claim 11 characterized in that the nucleic acid library is constructed from genomic nucleic acid extracts. 13. Banque de plasmides recombinants selon la revendication 11 caractérisée en ce que la banque d'acides nucléiques est construite à partir d'acides nucléiques issus de la mutagenèse d'une séquence nucléotidique dont la propriété éventuelle d'être impliquée dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique est recherchée. 13. Bank of recombinant plasmids according to claim 11 characterized in that the nucleic acid library is constructed from nucleic acids derived from mutagenesis of a nucleotide sequence whose possible property to be involved in the control of the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein in response to a specific stimulus is sought. 14. Cellules caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un plasmide selon la revendication 10 ou une banque de plasmides selon l'une quelconque des revendications 11 à 13 et contiennent la séquence d'un gène rapporteur et/ou d'un gène de sélection, lesdites séquences étant portées sur un second vecteur nucléotidique ou intégrées dans le génome. 14. Cells characterized in that they are transformed with a plasmid according to claim 10 or a plasmid library according to any one of claims 11 to 13 and which contain the sequence of a reporter gene and / or a gene of selection, said sequences being carried on a second nucleotide vector or integrated into the genome. 15. Cellules selon la revendication 14 caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules de levure, en particulier de cellules de l'espèce15. Cells according to claim 14, characterized in that they are yeast cells, in particular cells of the species Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae. 16. Cellules selon l'une quelconque des revendications 14 à 15 caractérisées en ce qu'un gène rapporteur est choisi parmi les gènes Cells according to any one of claims 14 to 15, characterized in that a reporter gene is chosen from among the genes <Desc/Clms Page number 47> <Desc / Clms Page number 47> codant la 3-galactosidase, la (3-glucuronidase, la luciférase ou la chloramphénicol acétyl-transférase (CAT).  encoding 3-galactosidase, (3-glucuronidase, luciferase or chloramphenicol acetyltransferase (CAT).

17. Cellules selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 caractérisées en ce qu'un gène de sélection est choisi parmi les gènes de biosynthèse des acides aminés ou des purines ou les gènes de résistance à une substance. 17. Cells according to any one of claims 14 to 16 characterized in that a selection gene is selected from amino acid biosynthesis genes or purines or substance resistance genes. 18. Cellules selon la revendication 17 caractérisées en ce qu'un gène de sélection est choisi parmi les gènes LEU2, URA3, TRP1, HIS3,18. Cells according to claim 17, characterized in that a selection gene is chosen from the genes LEU2, URA3, TRP1, HIS3, ADE2 et KanR. ADE2 and KanR. 19. Procédé de criblage de séquences nucléotidiques pour l'identification de nouvelles protéines et/ou de nouveaux polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) La culture en parallèle de clones isolés des cellules définies selon l'une des revendications 14 à 18 ; b) l'application ou non de un ou plusieurs stimuli aux clones cultivés ; c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction de l'application ou non du ou des stimuli ; d) la sélection et l'isolement d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet de l'application du ou des stimuli ; 19. A method for screening nucleotide sequences for the identification of new proteins and / or new polypeptides whose nucleo-cytoplasmic distribution changes in response to a specific stimulus, characterized in that it comprises the following steps: parallel of isolated clones of the cells defined according to one of claims 14 to 18; b) the application or not of one or more stimuli to cultured clones; c) evaluating the growth of the clones on a selective medium, said growth being dependent on the expression of the selection gene, and / or the evaluation of the expression of the reporter gene depending on the application or not of the stimuli; d) selecting and isolating a group of clones whose expression levels of the reporter and / or selection gene are modified by the application of the stimulus (s); <Desc/Clms Page number 48><Desc / Clms Page number 48> e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléaire du marqueur de la localisation cellulaire ; f) l'identification des séquences nucléotidiques codant les protéines et/ou les polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique est modifiée en réponse à un stimulus spécifique et exprimés dans les cellules sélectionnées en d) ou e).  e) where appropriate, the selection and isolation of a subgroup of clones according to the nuclear expression of the marker of the cellular localization; f) identifying the nucleotide sequences encoding the proteins and / or polypeptides whose nucleo-cytoplasmic distribution is modified in response to a specific stimulus and expressed in the cells selected in d) or e). 20. Procédé d'identification d'un domaine polypeptidique et/ou des acides aminés d'une protéine donnée que l'on souhaite analyser, impliqués dans le contrôle de sa répartition nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique et comprenant les étapes suivantes : a. La culture en parallèle de clones isolés de cellules transformées par une banques de plasmides recombinants selon la revendication 13 et portant différentes versions d'une même séquence nucléotidique codant une protéine dont la répartition nucléo-cytoplasmique change en réponse à un stimulus spécifique ; b. l'application ou non du stimulus spécifique aux clones cultivés ; c. l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction ou non du stimulus appliqué ; d. l'évaluation de la croissance d'un clone contrôle exprimant la séquence sauvage de la protéine étudiée sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de 20. A method for identifying a polypeptide domain and / or amino acids of a given protein that one wishes to analyze, involved in the control of its nucleo-cytoplasmic distribution in response to a specific stimulus and comprising the following steps : at. The parallel culture of clones isolated from cells transformed with a recombinant plasmid library according to claim 13 and carrying different versions of the same nucleotide sequence encoding a protein whose nucleo-cytoplasmic distribution changes in response to a specific stimulus; b. the application or not of the stimulus specific to cultured clones; c. the evaluation of the growth of clones on a selective medium, said growth being dependent on the expression of the selection gene, and / or the evaluation of the expression of the reporter gene depending on the stimulus applied or not; d. the evaluation of the growth of a control clone expressing the wild-type sequence of the protein studied on a selective medium, said growth being dependent on the expression of the gene of <Desc/Clms Page number 49><Desc / Clms Page number 49> sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction ou non du stimulus appliqué ; e. la sélection et l'isolement d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection en présence et/ou en absence du stimulus spécifique, sont modifiés par rapport aux niveaux d'expression observés chez le clone contrôle à l'étape d); f. l'identification des séquences nucléotidiques mutagénisées et codant des versions mutées de la protéine étudiée portées sur les plasmides recombinants des cellules sélectionnées en e) et par là, l'identification des mutations sur la protéine affectant le contrôle de sa localisation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus spécifique.  selecting, and / or evaluating the expression of the reporter gene depending on whether or not the applied stimulus; e. the selection and isolation of a group of clones whose expression levels of the reporter gene and / or the selection gene in the presence and / or absence of the specific stimulus are modified with respect to the levels of expression observed in the clone controls at step d); f. the identification of the mutagenized nucleotide sequences encoding mutated versions of the studied protein carried on the recombinant plasmids of the cells selected in e) and hence the identification of the mutations on the protein affecting the control of its nucleo-cytoplasmic localization in response to a specific stimulus. 21. Procédé selon l'une des revendications 19 à 20 dans lequel les clones isolés à l'étape a) sont repiqués et cultivés sur milieu solide. 21. Method according to one of claims 19 to 20 wherein the clones isolated in step a) are subcultured and cultured on solid medium. 22. Procédé selon l'une des revendications 19 à 20 dans lequel les clones isolés à l'étape a) sont cultivés en micro-plaques en milieu liquide, à raison de un clone par puits. 22. Method according to one of claims 19 to 20 wherein the clones isolated in step a) are cultured in microplates in a liquid medium, at a rate of one clone per well. 23. Procédé de criblage de substances bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'obtention de plusieurs cultures en parallèle d'un même clone cellulaire isolé de la transformation de cellules par un plasmide recombinant selon la revendication 10 ; b) la mise en contact de chaque culture avec une ou plusieurs substances à cribler ; 23. A method of screening substances blocking or stimulating the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein, characterized in that it comprises the following steps: a) obtaining several cultures in parallel of the same cell clone isolated from cell transformation with a recombinant plasmid according to claim 10; b) bringing each culture into contact with one or more substances to be screened; <Desc/Clms Page number 50><Desc / Clms Page number 50> c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante sur ce milieu de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction de la ou des substances appliquées ; d) la sélection d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet d'une ou des substances appliquées ; e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléo-cytoplasmique du marqueur de la localisation,cellulaire ; f) l'identification des substances bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, appliquées aux clones sélectionnés en d) ou e).  c) evaluating the growth of clones on a selective medium, said growth being dependent on this medium of the expression of the selection gene, and / or the evaluation of the expression of the reporter gene as a function of the substance or substances applied; d) selecting a group of clones whose expression levels of the reporter and / or selection gene are modified by the effect of one or more substances applied; e) where appropriate, the selection and isolation of a subgroup of clones according to the nucleo-cytoplasmic expression of the marker of the localization, cell; f) the identification of the substances blocking or stimulating the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein, applied to the clones selected in d) or e). 24. Procédé selon la revendication 23 dans lequel les clones sont cultivés en micro-plaques et une substance spécifique est appliquée par puits de manière à tester en parallèle sur un même clone un grand nombre de substances. 24. The method of claim 23 wherein the clones are grown in microplates and a specific substance is applied per well so as to test in parallel on the same clone a large number of substances. 25. Procédé d'identification de stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée et comprenant les étapes suivantes : a) l'obtention de plusieurs cultures en parallèle d'un même clone cellulaire isolé de la transformation de cellules par un plasmide recombinant selon la revendication 10 ; b) l'application ou non sur chaque culture d'un ou plusieurs stimuli non chimiques ; 25. A method of identifying non-chemical stimuli blocking or stimulating the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein and comprising the following steps: a) obtaining multiple cultures in parallel of the same cell clone isolated from the transformation of cells by a recombinant plasmid according to claim 10; b) the application or not to each culture of one or more non-chemical stimuli; <Desc/Clms Page number 51><Desc / Clms Page number 51> c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante sur ce milieu de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction du ou des stimuli non chimiques appliqués ; d) la sélection d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet du ou des stimuli non chimiques appliqués ; e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléo-cytoplasmique du marqueur de la localisation cellulaire ; f) l'identification des stimuli non chimiques bloquant ou stimulant la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée, appliqués aux clones sélectionnés en d) ou e).  c) evaluating the growth of the clones on a selective medium, said growth being dependent on this medium of the expression of the selection gene, and / or the evaluation of the expression of the reporter gene as a function of the non-stimulus or stimuli applied chemicals; d) selecting a group of clones whose expression levels of the reporter and / or selection gene are modified by the effect of the non-chemical stimulus (s) applied; e) where appropriate, the selection and isolation of a subgroup of clones according to the nucleo-cytoplasmic expression of the marker of the cellular localization; f) the identification of non-chemical stimuli blocking or stimulating the nucleo-cytoplasmic translocation of a given protein, applied to the clones selected in d) or e). 26. Utilisation d'une protéine ou d'un polypeptide identifié à l'étape f) d'un procédé selon l'une des revendications 19,21 ou 22 pour la détection, à partir d'un échantillon de matériel biologique isolé d'un individu, de la localisation cellulaire ou du niveau d'expression des protéines ou polypeptides spécifique d'un état pathologique donné. 26. Use of a protein or polypeptide identified in step f) of a method according to one of claims 19, 21 or 22 for the detection, from a sample of biological material isolated from an individual, the cellular localization or the level of expression of the proteins or polypeptides specific for a given pathological state. 27. Utilisation d'une protéine ou d'un polypeptide identifié par un procédé selon l'une des revendications 19,21 ou 22, dans la préparation d'un produit permettant le contrôle de la localisation nucléo-cytoplasmique en réponse à un stimulus donné d'une molécule biologiquement active, ledit produit étant formé par le couplage entre ladite protéine ou polypeptide identifié par un procédé selon l'une des revendications 19,21 ou 22 et la molécule biologiquement active. 27. Use of a protein or polypeptide identified by a method according to one of claims 19, 21 or 22, in the preparation of a product allowing the control of the nucleo-cytoplasmic localization in response to a given stimulus. of a biologically active molecule, said product being formed by coupling between said protein or polypeptide identified by a method according to one of claims 19, 21 or 22 and the biologically active molecule. <Desc/Clms Page number 52> <Desc / Clms Page number 52> 28. Séquence d'acide nucléique identifiée par un procédé de l'une des revendications 19,21 ou 22, à l'étape (f) dudit procédé.  28. A nucleic acid sequence identified by a method of one of claims 19, 21 or 22, in step (f) of said method. 29. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication29. Use of a nucleic acid sequence according to claim 28 dans la préparation d'une cassette d'expression utile pour la synthèse d'une protéine de fusion, ladite protéine de fusion étant constituée du domaine codé par ladite séquence d'acide nucléique et d'une protéine d'intérêt, notamment une protéine thérapeutique, dont on souhaite contrôler la localisation cellulaire en réponse à un stimulus spécifique. In the preparation of an expression cassette useful for the synthesis of a fusion protein, said fusion protein consisting of the domain encoded by said nucleic acid sequence and a protein of interest, in particular a protein therapeutic, which one wishes to control the cellular localization in response to a specific stimulus. 30. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication30. Use of a nucleic acid sequence according to claim 28 pour la réalisation de nouveaux systèmes de contrôles conditionnels de l'expression d'un gène en réponse à un stimulus spécifique, ladite séquence étant placée dans une construction de manière à permettre l'expression d'un facteur de transcription dont la localisation cellulaire est contrôlée par le stimulus spécifique, ledit facteur de transcription contrôlant alors l'expression d'au moins un gène donné d'intérêt en réponse à un stimulus spécifique,28 for the realization of new systems of conditional controls of the expression of a gene in response to a specific stimulus, said sequence being placed in a construction so as to allow the expression of a transcription factor whose cell localization is controlled by the specific stimulus, said transcription factor then controlling the expression of at least one given gene of interest in response to a specific stimulus, 31. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication31. Use of a nucleic acid sequence according to claim 28 pour la réalisation de tests biologiques pour détecter et quantifier la présence d'un agent stressant ou toxique dans un environnement donné. 28 for carrying out biological tests to detect and quantify the presence of a stressor or toxic agent in a given environment. 32. Utilisation de substances identifiées par un procédé selon l'une des revendications 23 à 24 dans la préparation d'un médicament permettant de contrôler l'expression de gènes spécifiques en contrôlant la localisation cellulaire, nucléaire ou cytoplasmique de leurs régulateurs de la transcription, lesdits régulateurs étant codés par des gènes naturels ou recombinants. 32. Use of substances identified by a method according to one of claims 23 to 24 in the preparation of a medicament for controlling the expression of specific genes by controlling the cellular, nuclear or cytoplasmic localization of their transcriptional regulators, said regulators being encoded by natural or recombinant genes. <Desc/Clms Page number 53> <Desc / Clms Page number 53> 33. Kit pour la mise en #uvre des procédés selon l'une des revendications 19 à 25 caractérisé en ce qu'il comprend au moins les éléments suivants : un vecteur selon l'une des revendications 1 à 9 ; des cellules adaptées pour la mise en #uvre des procédés selon l'une des revendications 19 à 25 et contenant la séquence d'un gène rapporteur ou/et d'un gène de sélection ; le cas échéant, les produits et tampons nécessaires pour la quantification du gène rapporteur ou la sélection par l'expression du gène de sélection. 33. Kit for implementing the methods according to one of claims 19 to 25, characterized in that it comprises at least the following elements: a vector according to one of claims 1 to 9; cells adapted for carrying out the methods according to one of claims 19 to 25 and containing the sequence of a reporter gene and / or a selection gene; if necessary, the products and buffers necessary for the quantification of the reporter gene or the selection by the expression of the selection gene. 34. Kit selon la revendication 33 dans lequel des cellules adaptées pour la mise en #uvre des procédés selon l'une des revendications 19 à34. The kit of claim 33 wherein cells adapted for carrying out the methods according to one of claims 19 to 25 sont des cellules de levure. 25 are yeast cells. 35. Kit selon l'une quelconque des revendications 33 à 34 dans lequel un gène rapporteur est choisi parmi les gènes codant la35. A kit according to any one of claims 33 to 34 wherein a reporter gene is selected from the genes encoding the P-galactosidase, la P-glucuronidase, la luciférase ou la chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Β-galactosidase, β-glucuronidase, luciferase or chloramphenicol acetyltransferase (CAT). 36. Kit selon l'une quelconque des revendications 33 à 35 dans lequel un gène de sélection est choisi parmi les gènes de biosynthèse des acides aminés ou des purines ou les gènes de résistance à une substance. 36. Kit according to any one of claims 33 to 35 wherein a selection gene is selected from genes for amino acid biosynthesis or purines or genes for resistance to a substance. 37. Kit selon l'une quelconque des revendications 33 à 36 dans lequel un gène de sélection est choisi parmi les gènes LEU2, URA3, TRP1,37. Kit according to any one of claims 33 to 36, in which a selection gene is chosen from among the genes LEU2, URA3, TRP1, HIS3, ADE2 et KanR. HIS3, ADE2 and KanR. 38. Kit pour la réalisation d'un test biologique (biosensors) pour détecter et quantifier la présence d'un agent stressant ou toxique dans un environnement et comprenant au moins les éléments suivants : 38. Kit for carrying out a biological test (biosensors) for detecting and quantifying the presence of a stressor or toxic agent in an environment and comprising at least the following elements: <Desc/Clms Page number 54><Desc / Clms Page number 54> un vecteur d'expression selon l'une des revendications 1 à 9 ; des cellules adaptées pour la réalisation du test biologique et contenant la séquence d'un gène de sélection et/ou d'un gène rapporteur ; le cas échéant, les produits, supports et tampons nécessaires pour la culture des cellules, la quantification du gène rapporteur ou/et la sélection sur milieu sélectif. an expression vector according to one of claims 1 to 9; cells suitable for carrying out the biological test and containing the sequence of a selection gene and / or a reporter gene; where appropriate, the products, supports and buffers necessary for cell culture, quantification of the reporter gene and / or selection on selective medium.