FR2810049A1 - Detecting and quantifying minority viral mutants, especially of human immune deficiency virus resistant to protease inhibitors, by real-time amplification - Google Patents

Abstract

Detection and/or quantification of minority variants, having at least one mutation, in a heterogeneous population of viruses, present in a biological sample. Detection and/or quantification of minority variants, having at least one mutation, in a heterogeneous population of viruses, present in a biological sample. Nucleic acids (I) are extracted from the sample and amplified by polymerase chain reaction (PCR), using primers that flank a viral sequence (Ia) suspected of carrying a mutation. Separately a standard amplicon is prepared similarly, from a sequence known to carry the mutation. Both amplicons are then subjected to real-time PCR using: (i) a pair of highly conserved primers that do not differentiate between mutated and non-mutated sequences, then quantifying the number of viral (I), mutated or not, present in the sample; and (ii) a pair of primers that are mutation specific, and quantifying the number of mutant sequences in the sample. Comparison of the results of (i) and (ii) gives the proportion of mutant viruses in the population. Independent claims are also included for the following: (1) pairs of primers (a) and (b); (c) and (d); (d) and (e), and (d) and (f) (a) CTTTAGCTTCCCTCAGATCACTC; (b) CCTGGCTTTAATTTTACTGGTACA; (c) GGTACAGTATTAGTAGGACCTACA; (d) TGGTACAGTTTCAATAGGACTAAT; (e) TATTAGTAGGACCTACACCAGC; and (f) AACATAATTGGAAGAAATCAGA ; (2) the probe (g) CTCAGATTGGTTGCACTTTAAATTTTCC; and (3) kit for the process comprising primer pairs for the three amplifications; a probe that has conjugated to its 5' and 3'-ends, respectively, a fluorescent reporter and a fluorescence quencher, specific for the amplicons; standard (mutated) nucleic acid; products and reagents for performing PCR amplifications.

Description

METHODE DE DETECTION ET/OU DE QUANTIFICATION DE VARIANTS MINORITAIRES AU SEIN D'UNE POPULATION VIRALE HETÉROGÈNE DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE. La présente invention concerne une méthode de detection et/ou de quantification de variants minoritaires sein d'une population virale hétérogène dans des échantillons biologiques. La présente invention s'applique plus particulièrement à la détection et/ou la quantification de variants minoritaires du virus d'immunodéficience humaine (VIH).  METHOD FOR DETECTING AND / OR QUANTIFYING MINORITY VARIANTS WITHIN A VIRAL HETEROGENEOUS POPULATION IN A BIOLOGICAL SAMPLE. The present invention relates to a method for detecting and / or quantifying minority variants within a heterogeneous viral population in biological samples. The present invention is more particularly applicable to the detection and / or quantification of minor variants of the human immunodeficiency virus (HIV).

Chez les patients infectés par le VIH, le virus est représenté par une population hétérogène de variants viraux génétiquement distincts. Au cours des traitements antirétroviraux, à défaut de pouvoir totalement supprimer la réplication virale, on assiste à la sélection de variants viraux résistants. Ces variants sont porteurs de mutations dans la réverse transcriptase et/ou la protéase qui sont les principales cibles des traitements antirétroviraux. Au cours de l'échappement du virus à ces traitements l'émergence de la résistance virale est un processus graduel au cours duquel les mutations s'accumulent progressivement, ce qui s'accompagne d'un niveau croissant de résistance. In HIV-infected patients, the virus is represented by a heterogeneous population of genetically distinct viral variants. During antiretroviral therapy, if viral replication can not be completely suppressed, the selection of resistant viral variants is observed. These variants carry mutations in the reverse transcriptase and / or protease which are the main targets of antiretroviral treatments. During the escape of the virus from these treatments the emergence of viral resistance is a gradual process in which mutations accumulate gradually, which is accompanied by a growing level of resistance.

Ces variants minoritaires pourraient jouer un rôle considérable dans l'évolution de la résistance au cours du traitement ou à la suite de changements traitement. En effet, on suspecte que les mutants résistants qui émergent au tout début de l'échec d'un traitement antirétroviral ne représentent qu'une très faible minorité la population virale. Ces virus minoritaires ne sont probablement pas détectables à ce stade, mais constituent la base de la sélection ultérieure de virus fortement résistants. Lorsque les virus résistants commencent à être détectés par les tests génotypiques classiques, les virus fortement résistants sont déjà prêts à émerger. These minority variants may play a significant role in the evolution of resistance during treatment or as a result of treatment changes. Indeed, it is suspected that the resistant mutants that emerge at the very beginning of the failure of antiretroviral therapy represent only a very small minority of the viral population. These minority viruses are probably not detectable at this stage, but form the basis for the subsequent selection of highly resistant viruses. When resistant viruses begin to be detected by conventional genotypic tests, highly resistant viruses are already ready to emerge.

De plus, lorsqu'un traitement antirétroviral doit être changé, le traitement de relais est choisi en fonction du génotype viral. La présence de virus minoritaires porteurs de mutations absentes des virus majoritaires pourrait participer à l'échec ultérieur du traitement de relais. In addition, when antiretroviral treatment has to be changed, the relay treatment is chosen according to the viral genotype. The presence of minority viruses carrying mutations absent from the majority viruses could contribute to the subsequent failure of relay processing.

Enfin, lorsqu'un traitement antirétroviral en échec est interrompu, le virus plasmatique résistant est plus ou moins vite remplacé par un virus sensible de type sauvage. Chez de nombreux patients, ce remplacement semble souvent incomplet, dans la mesure où la réintroduction du traitement aboutit le plus souvent à la réémergence rapide du virus résistant. Cet échec semble être conséquence de minorités faibles de virus résistant résiduel, persistant de façon prolongée après l'interruption thérapeutique. Finally, when a failed antiretroviral treatment is interrupted, the resistant plasma virus is more or less quickly replaced by a wild-type susceptible virus. In many patients, this replacement often seems incomplete, since the reintroduction of the treatment results in the rapid re-emergence of the resistant virus. This failure seems to be a consequence of weak minorities of residual resistant virus, persisting for a long time after the therapeutic interruption.

La dynamique de l'évolution de résistance du VIH n'a pas encore été examinée de façon approfondie. Une raisons de ce manque d'informations l'absence de moyens techniques capables d'analyser de façon précise et quantitative les sous-populations virales minoritaires, rares, ou limitées à des compartiments spécifiques de organisme. The dynamics of the evolution of HIV resistance have not yet been thoroughly examined. One reason for this lack of information is the lack of technical means capable of accurately and quantitatively analyzing minority viral subpopulations, rare or limited to specific compartments of organisms.

Les tests génotypiques classiques (séquençage) après transcription inverse et ampl' ication par polymérisation en chaîne (PCR) peuvent détecter la présence mutations spécifiques, mais selon la mutation étudiée, les séquences mutées doivent représenter 10 à 50 % de la population totale pour être détectées (Günthard et a1., 1998, AIDS Res. Hum. Retroviruses, vol. 14, pages 869-76) et la procédure n'est pas strictement quantitative. De plus, la nécessité de séquencer des centaines ou des milliers de clones pour obtenir sensibilité même modeste rend cette approche peu pratique. Classical genotypic tests (sequencing) after reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR) can detect the presence of specific mutations, but depending on the mutation studied, the mutated sequences must represent 10 to 50% of the total population to be detected. (Günthard et al., 1998, AIDS Res, Hum Retroviruses, Vol 14, pp 869-76) and the procedure is not strictly quantitative. In addition, the need to sequence hundreds or thousands of clones to achieve even modest sensitivity makes this approach impractical.

La technique de PCR sélective utilisant des amorces nucléotidiques spécifiques des séquences mutées et sauvages a été employée pour identifier la présence de mutations de résistance plutôt que pour les quantifier. Bien que supérieures aux techniques de séquençage, les techniques actuelles de PCR sélective ont certaines limitations. Pour une mutation de résistance donnée, les séquences mutées et sauvages diffèrent dans la plupart des cas par une seule paire de bases. Même quand ce mésappariement est placé dans la position la plus déstabilisante c'est-à-dire à l'extrémité 3' l'amorce spécifique, l'amorce reconnaissant la séquence mutée permet également, avec une efficacité réduite, amplification de la séquence sauvage (Huang<I>et al.,</I> 1992 Nucleic Acids Res., vol. 20, pages 4567-73; Kwok et<I>al.,</I> 1990, Nucleic Acids Res., vol. 18, pages 999-1005). De fait, il est nécessaire de diluer les échantillons ou diminuer le nombre de cycles d'amplification à niveau où les signaux non spécifiques provenant de la séquence non désirée ne sont plus détectables après la , ce qui limite la sensibilité du test. Une amélioration de la discrimination entre les séquences mutées sauvages a été obtenue par l'introduction d' ou plusieurs mésappariements additionnels dans l'extrémité 3' de l'amorce (Anderson et <I>al.,</I> 1994, Antiviral ., vol. 25, pages 245-58 ; Larder et <I>a1.,</I> 1991, AIDS, vol. 5, pages 137-44 ; De Milito et a1., 1995, Mol. Biotechnol., vol. 3, pages 166-9 ; Cha et a1., 1992, PCR Methods Appl., vol. 2, pages 14-20), mais l'effet de mésappariements additionnels n'a pas été évalué en détail. En outre, dans les tests actuellement décrits, les réactions de PCR ont déjà atteint la phase plateau de la réaction lors de la détection des produits d'amplification par électrophorèse ou hybridation. Dans ces conditions, un échantillon donné peut être identifié comme ayant profil sauvage , mutant ou mixte , mais la quantification du nombre de séquences mutées originellement présentes n'est possible. The selective PCR technique using nucleotide primers specific for mutated and wild sequences was used to identify the presence of resistance mutations rather than to quantify them. Although superior to sequencing techniques, current selective PCR techniques have certain limitations. For a given resistance mutation, mutated and wild sequences differ in most cases by a single base pair. Even when this mismatch is placed in the most destabilizing position that is to say at the 3 'end the specific primer, the primer recognizing the mutated sequence also allows, with reduced efficiency, amplification of the wild-type sequence. (Huang et al., 1992 Nucleic Acids Res., Vol 20, pp. 4567-73, Kwok et al., 1990, Nucleic Acids Res., Vol. 999-1005). In fact, it is necessary to dilute the samples or decrease the number of amplification cycles to a level where non-specific signals from the unwanted sequence are no longer detectable after the, which limits the sensitivity of the test. An improvement in discrimination between wild-type mutated sequences has been achieved by introduction of additional mismatch (s) into the 3 'end of the primer (Anderson et al., 1994, Antiviral. 25, pp. 245-58, Larder et al., 1991, AIDS, vol 5, pp. 137-44, De Milito et al., 1995, Mol Biotechnol., vol. 3, pp 166-9, Cha et al., 1992, PCR Methods Appl., Vol 2, p 14-20), but the effect of additional mismatches has not been evaluated in detail. In addition, in the tests currently described, the PCR reactions have already reached the plateau phase of the reaction when the amplification products are detected by electrophoresis or hybridization. Under these conditions, a given sample can be identified as having a wild-type, mutant or mixed profile, but the quantification of the number of mutated sequences originally present is not possible.

Récemment, il a été décrit dans brevet américain US 5,827,648 une méthode pour mesurer les populations relatives de deux variants d' séquence nucléotidique cible. Cette méthode s'applique plus particulièrement à des variants du VIH et est basée sur une méthode d'hybridation différentielle. La sensibilité de cette méthode reste cependant modérée. Ains', aucun test permettant une quantification précise de séquences mutées en présence d'un excès de séquences sauvages n'est actuellement disponible. Recently, there has been described in US Pat. No. 5,827,648 a method for measuring the relative populations of two variants of the target nucleotide sequence. This method is more particularly applicable to HIV variants and is based on a differential hybridization method. The sensitivity of this method remains moderate. Thus, no test allowing precise quantification of mutated sequences in the presence of an excess of wild sequences is currently available.

La présente invention a précisément pour objet une nouvelle méthode de détection et/ou de quantification de virus portant au moins une mutation par exemple de résistance aux antiviraux au sein d'une population virale hétérogène contenu dans un échantillon biologique. La méthode de l'invention permet notamment de détecter la présence de variants minoritaires représentant moins de 1 la population virale. The present invention specifically relates to a novel method for detecting and / or quantifying viruses carrying at least one mutation, for example antiviral resistance in a heterogeneous viral population contained in a biological sample. The method of the invention makes it possible in particular to detect the presence of minority variants representing less than 1 the viral population.

Ce but est atteint selon l'invention grâce à une méthode de détection et/ou de quantification variants minoritaires portant au moins une mutation au sein d'une population hétérogène de virus contenue dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes . This object is achieved according to the invention by means of a minority variant detection and / or quantification method carrying at least one mutation within a heterogeneous population of viruses contained in a biological sample, characterized in that it comprises the steps following.

a) l'extraction des acides nucléiques contenus dans l'échantillon biologique, b) l'amplification par PCR des acides nucléiques de l'étape (a) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique virale susceptible de porter la mutation, c) la préparation d'un standard par amplification PCR avec la même paire d'amorces qu'à l'étape (b) d'une séquence d'acide nucléique portant la mutation, d) l'amplification par PCR en temps réel des produits d'amplification de l'étape (b) et du standard de l'étape (c) avec une paire d'amorces hautement conservées discriminant pas les séquences portant ou non la mutation et la quantification du nombre de séquences d'acide nucléique virales portant ou non la mutation présentes dans l'échantillon, e) l'amplification par PCR en temps réel produits d'amplification de l'étape (b) et du standard de l'étape (c) avec une paire d'amorces spécifiques d'une séquence portant la mutation, et quantification du nombre de séquences d'acide nucléique virales portant la mutation présentes dans l'échantillon, f) la comparaison des quantifications des étapes (d) et (e) pour déterminer la proportion de virus portant mutation dans l'échantillon. a) extraction of the nucleic acids contained in the biological sample; b) amplification by PCR of the nucleic acids of step (a) with a pair of primers flanking a viral nucleic acid sequence likely to carry the mutation, c) the preparation of a standard by PCR amplification with the same pair of primers as in step (b) of a nucleic acid sequence carrying the mutation, d) the amplification by PCR in time real amplification products of step (b) and the standard of step (c) with a pair of highly conserved primers not discriminating sequences with or without the mutation and the quantification of the number of acid sequences whether or not the viral nuclei carry the mutation present in the sample, e) the amplification by real-time PCR amplification products of step (b) and the standard of step (c) with a pair of primers specific to a sequence carrying the mutation, and quantification the number of viral nucleic acid sequences carrying the mutation present in the sample, f) comparing the quantifications of steps (d) and (e) to determine the proportion of mutating viruses in the sample.

On entend par amplification par PCR tant réaction de polymérisation en chaîne (PCR) proprement dite que les techniques d'amplification qui en sont dérivées. By PCR amplification is meant both actual polymerase chain reaction (PCR) and the amplification techniques derived therefrom.

L'étape (a) d'extraction des acides nucléiques peut être réalisée par des techniques classiques à partir d'un échantillon biologique prélevé sur un patient infecté par le virus étudié. Les méthodes de préparation d'échantillons pour des analyses en biologie moléculaire sont bien connues de l'homme du métier. Tous les types d'échantillons biologiques pouvant contenir des populations virales comme des cellules, des tissus, des sécrétions biologiques ou des liquides biologiques sont utilisables pour la méthode objet de l'invention. Les échantillons biologiques selon l'invention sont avantageusement du plasma. The nucleic acid extraction step (a) may be carried out by conventional techniques from a biological sample taken from a patient infected with the virus of interest. Sample preparation methods for molecular biology assays are well known to those skilled in the art. All types of biological samples that may contain viral populations such as cells, tissues, biological secretions or body fluids can be used for the method that is the subject of the invention. The biological samples according to the invention are advantageously plasma.

La méthode de l'invention s'applique à toutes les familles virus. Dans le cas de virus à ARN, comme le VIH ou le virus de l'hépatite C, l'étape (b) est une RT PCR en présence une paire d'amorces encadrant séquence d'acide nucléique susceptible de porter la mutation. The method of the invention applies to all virus families. In the case of RNA viruses, such as HIV or hepatitis C virus, step (b) is RT PCR in the presence of a pair of primers flanking nucleic acid sequence capable of carrying the mutation.

L'étape (b) de l'invention est une amplification par PCR acides nucléiques de l'étape avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique virale susceptible de porter la mutation. La paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique virale susceptible de porter la mutation est choisie de façon a amplifier avec la même efficacité les séquences qui portent la mutation et celles qui ne la portent pas. La paire d'amorces utilisée à l'étape (d) est également choisie de façon à amplifier avec la même efficacité les séquences qui portent ou non la mutation. Step (b) of the invention is a nucleic acid PCR amplification of the step with a pair of primers flanking a viral nucleic acid sequence capable of carrying the mutation. The pair of primers flanking a viral nucleic acid sequence capable of carrying the mutation is chosen so as to amplify with the same efficiency the sequences which carry the mutation and those which do not. The pair of primers used in step (d) is also chosen so as to amplify with the same efficiency the sequences which carry or do not have the mutation.

Le standard préparé à l'étape (c) de la méthode de l'invention correspond aux produits d'amplification d'une séquence portant la mutation étudiée, obtenus avec les mêmes amorces pour l'étape (b) de la méthode de l'invention. La séquence portant la mutation étudiée et utilisée pour réaliser standard peut être une séquence en acide nucléique d'un virus portant la mutation une séquence en acide nucléique d'un virus sauvage dans lequel la mutation a été introduite par mutagenèse dirigée ou peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier qui permet d'obtenir une séquence capable de fournir par amplification avec les mêmes amorces que pour l'étape (b) un produit présentant les mêmes caractéristiques (séquence et longueur identiques) que la séquence en acide nucléique un virus portant la mutation étudiée. The standard prepared in step (c) of the method of the invention corresponds to the amplification products of a sequence carrying the mutation studied, obtained with the same primers for step (b) of the method of the invention. invention. The sequence carrying the mutation studied and used to make standard may be a nucleic acid sequence of a virus carrying the mutation a nucleic acid sequence of a wild-type virus in which the mutation has been introduced by site-directed mutagenesis or may be carried out by any technique known to those skilled in the art which makes it possible to obtain a sequence capable of amplifying with the same primers as for step (b) a product having the same characteristics (identical sequence and length) as the acid sequence a virus carrying the mutation studied.

L'amplification par PCR en temps réel mise en oeuvre aux étapes (d) et (e) de la méthode de l'invention est technique récente qui permet la quantification rapide et précise d'ADN ou d'ADNc (Heid <I>et al.,</I> 1996, Génome Res., vol. 6, pages 986-94 ; Gibson et al., 1996, Génome Res., vol. 6, pages 995-1001). Dans cette technique, réactions amplification par PCR sont réalisées en présence d'une sonde conjuguée à ses extrémités 5' et 3', respectivement, avec un colorant fluorescent reporteur et un composé de réduction d'intensité de fluorescence. Avantageusement, le colorant fluorescent reporteur et le composé de réduction d'intensité de fluorescence aux extrémités de la sonde sont respectivement la 6-carboxy-fluorescéine (FAM) et la 6- carboxy-tétraméthylrhodamine (TAMRA). La sonde utilisée est spécifique d'une séquence présente aussi bien dans les produits d'amplification des étapes (d) et (e). Ainsi, la séquence de la sonde est choisie pour être complémentaire d'une région amplifiée aux étapes (d) et (e) qui comprend pas la mutation. The real-time PCR amplification implemented in steps (d) and (e) of the method of the invention is a recent technique which allows the rapid and precise quantification of DNA or cDNA (Heid <I> and al., 1996, Genome Res., Vol 6, pp. 986-94, Gibson et al., 1996, Genome Res., vol 6, pp 995-1001). In this technique, PCR amplification reactions are performed in the presence of a conjugate probe at its 5 'and 3' ends, respectively, with a reporter fluorescent dye and a fluorescence intensity reduction compound. Advantageously, the reporter fluorescent dye and the fluorescence intensity reduction compound at the ends of the probe are respectively 6-carboxy-fluorescein (FAM) and 6-carboxy-tetramethylrhodamine (TAMRA). The probe used is specific for a sequence present both in the amplification products of steps (d) and (e). Thus, the probe sequence is chosen to be complementary to an amplified region in steps (d) and (e) which does not include the mutation.

Au cours des réactions de PCR des étapes (d) et (e) de la méthode objet de l'invention, produits d'amplification s'accumulent et se lient avec la sonde. L'activité 5'-3' exonucléase de la polymérase dégrade la sonde fluorogénique et sépare le composé de réduction d''intensité de fluorescence et le colorant fluorescent ce entraîne l'émission d'un signal fluorescent. La fluorescence émise est mesurée en continu et le nombre de cycles d'amplification nécessaires pour que la fluorescence dépasse un seuil donné (cycle seuil ou Cs) est déterminé aux étapes (d) et (e) de la méthode de l'invention. During the PCR reactions of steps (d) and (e) of the method object of the invention, amplification products accumulate and bind with the probe. The 5'-3 'exonuclease activity of the polymerase degrades the fluorogenic probe and separates the fluorescence intensity reducing compound and the fluorescent dye resulting in the emission of a fluorescent signal. The emitted fluorescence is measured continuously and the number of amplification cycles necessary for the fluorescence to exceed a given threshold (threshold cycle or Cs) is determined in steps (d) and (e) of the method of the invention.

La quantification du nombre total de séquences d'acide nucléique virales (portant ou non la mutation) dans l'échantillon de l'étape (d) et celle du nombre de séquences d'acide nucléique mutées présentes dans l'échantillon de l'étape (e) sont réalisées en comparant le Cs avec une courbe étalon de Cs obtenue avec des dilutions du standard soumis à des amplifications dans les conditions des étapes (d) et (e). Quantification of the total number of viral nucleic acid sequences (with or without the mutation) in the sample of step (d) and that of the number of mutated nucleic acid sequences present in the sample of step (e) are performed by comparing Cs with a Cs standard curve obtained with dilutions of the standard subjected to amplifications under the conditions of steps (d) and (e).

La méthode selon l'invention est fondée sur la capacité d'amplifier de façon préférentielle des séquences comportant une mutation spécifique. Ainsi, à l'étape (e) de la méthode de l'invention, il est nécessaire d'utiliser une paire d'amorces dont l'une est complémentaire de séquence présentant la mutation et présente donc un mésappariement avec la séquence non mutée. Tous les mésappariements n'étant pas équivalents, ce mésappariement pourrait ne pas empêcher une amplification de la séquence non mutée (sauvage), ce qui pourrait entraîner des signaux non-spécifiques. The method according to the invention is based on the ability to preferentially amplify sequences comprising a specific mutation. Thus, in step (e) of the method of the invention, it is necessary to use a pair of primers, one of which is complementary to the sequence having the mutation and thus has a mismatch with the non-mutated sequence. Since not all mismatches are equivalent, this mismatch may not prevent amplification of the non-mutated (wild-type) sequence, which may result in nonspecific signals.

Les inventeurs ont étudié ce phénomène dans le cadre de l'invention, et ont comparé plusieurs amorces sens couplées avec la même amorce antisens. Comme déj' décrit, l' onction d'un ou plusieurs mésappariements additionnels proches de l'extrémité 3' de l'amorce "liore considérablement la discrimination (Anderson<I>et al.,</I> 1994, Antiviral Res., vol. 25, pages 245-58 ; Larder et a1., 1991, AIDS, vol. 5, pages 137-44 ; De Milito et a1., 5, Mol. Biotechnol., vol. 3, pages 166-9 ; Cha et<I>al.,</I> 1992, PCR Methods Appl., vol. 2, pages 14-20). The inventors have studied this phenomenon in the context of the invention, and compared several sense primers coupled with the same antisense primer. As already described, the anointing of one or more additional mismatches close to the 3 'end of the primer substantially improves the discrimination (Anderson et al., 1994, Antiviral Res. Vol 25, pp. 245-58, Larder et al., 1991, AIDS, vol 5, pp. 137-44, De Milito et al., 5, Mol Biotechnol., vol 3, pp. 166-9; and <I> al., </ I> 1992, PCR Methods Appl., Vol 2, pages 14-20).

Afin de limiter le risque de signaux non- spécifiques, et donc pour réaliser une ampl' ication sélective de la séquence mutée, la méthode de l'invention comprend à l'étape (e) la mise en #uvre d'une amorce sens spécifique de la séquence mutée présentant au moins un ou deux mésappariemments supplémentaires autre que la mutation étudiée. In order to limit the risk of non-specific signals, and thus to achieve a selective amplification of the mutated sequence, the method of the invention comprises in step (e) the implementation of a specific sense primer. of the mutated sequence having at least one or two additional mismatches other than the mutation of interest.

Les inventeurs ont obtenu une discrimination optimale, sans réduire l'efficacité d'amplification des séquences mutées, en utilisant à l'étape (e) une amorce sens spécifique de la séquence mutée présentant un mésappariement moyennement déstabilisant, autre que la mutation, en position -2 par rapport à l'extrémité 3 de l'amorce sens. La notion de mésappariement moyennement déstabilisant a été décrite par Huang et al. (1992, Nucleic Acids Res., vol. 20, pages 4567-73) et par Kwok et a1. (1990, Nucleic Acids Res., vol. 18, pages 999-1005). The inventors obtained an optimal discrimination, without reducing the amplification efficiency of the mutated sequences, using in step (e) a specific sense primer of the mutated sequence presenting a moderately destabilizing mismatch, other than the mutation, in position. -2 with respect to the end 3 of the sense primer. The notion of moderately destabilizing mismatch has been described by Huang et al. (1992, Nucleic Acids Res., Vol 20, pp. 4567-73) and by Kwok et al. (1990, Nucleic Acids Res., Vol 18, pages 999-1005).

Les séquences portant ou la mutation à étudier peuvent présenter une certaine variabilité génétique, par exemple présence d'autres mutations ou polymorphisme. Les inventeurs ont donc identifié les conditions des PCR en temps réel des étapes (d) et (e) à . utiliser pour que la quantification des séquences présentant une mutation ne soit pas faussée par un éventuel polymorphisme dans le milieu et l'extrémité 5' des amorces. Ainsi, selon la méthode de l'invention, les PCR en temps réel des étapes (d) et (e) sont réalisées en présence de 3 à 5 mM de MgC12, avec plus de 100 mM de chacun des dNTP, avantageusement 200 mM de chacun des dNTP et à une température équivalente aux Tm des amorces utilisées. Bearing sequences or the mutation to be studied may exhibit some genetic variability, for example presence of other mutations or polymorphism. The inventors have therefore identified the conditions of the real-time PCRs of steps (d) and (e) to. use so that the quantification of sequences with a mutation is not distorted by a possible polymorphism in the medium and the 5 'end of the primers. Thus, according to the method of the invention, the real-time PCRs of steps (d) and (e) are carried out in the presence of 3 to 5 mM of MgCl 2, with more than 100 mM of each of the dNTPs, advantageously 200 mM of each of the dNTPs and at a temperature equivalent to the Tm of the primers used.

Dans un mode préféré de réalisation de la méthode de 'invention, un contrôle supplémentaire permettant de déterminer la limite de sensibilité de la méthode est utilisé. Ce contrôle correspond à un standard identique à celui préparé à l'étape (c) mais ne présentant pas la mutation à étudier. Ce contrôle est amplifié par PCR en temps réel selon les conditions de PCR des étapes (d) et (e) de méthode. In a preferred embodiment of the method of the invention, additional control to determine the sensitivity limit of the method is used. This control corresponds to a standard identical to that prepared in step (c) but not presenting the mutation to be studied. This control is amplified by real-time PCR according to the PCR conditions of method steps (d) and (e).

Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont concerné tout particulièrement l'application de la méthode selon l'invention à la détection et/ou la quantification de variants minoritaires du VIH portant au moins une mutation de résistance au sein d'une population virale hétérogène contenue dans un échantillon biologique. De façon avantageuse, la méthode de l'invention permet de détecter et/ou de quantifier des variants minoritaires du VIH portant au moins une mutation de résistance dans la séquence de la protéase au sein d'une population virale hétérogène contenue dans un échantillon biologique. Plus précisément, la méthode de l'invention permet de détecter et/ou de quantifier des variants minoritaires du VIH portant la mutation de résistance V82A ou L90M dans la séquence de la protéase au sein d'une population virale hétérogène contenue dans échantillon biologique. The work carried out in the context of the present invention has particularly concerned the application of the method according to the invention to the detection and / or quantification of minority variants of HIV carrying at least one resistance mutation within a population. heterogeneous virus contained in a biological sample. Advantageously, the method of the invention makes it possible to detect and / or quantify minority variants of HIV carrying at least one resistance mutation in the protease sequence within a heterogeneous viral population contained in a biological sample. More specifically, the method of the invention makes it possible to detect and / or quantify minority variants of HIV carrying the V82A or L90M resistance mutation in the protease sequence in a heterogeneous viral population contained in a biological sample.

L'invention se rapporte donc tout spécialement à la méthode décrite précédemment appliquée à la détection et/ou la quantification des variants minoritaires du VIH portant l'une moins des mutations de résistance V82A ou L90M dans séquence de la protéase, au sein d'une population virale hétérogène contenue dans un échantillon biologique. The invention thus relates especially to the previously described method applied to the detection and / or quantification of minority variants of HIV carrying one of the least V82A or L90M resistance mutations in the protease sequence, within a heterogeneous viral population contained in a biological sample.

forme de mise en aeuvre préférée de cette application de méthode de l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) l'extraction des ARN contenus dans l'échantillon biologique, b) l'amplification par RT PCR des ARN de l'étape (a) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique virale susceptible de porter la mutation V82A ou L90M, cette paire d'amorces étant SEQ ID No.1 et SEQ ID No.2 dans la liste de séquences en annexe, c) la préparation d'un standard par amplification par PCR avec la même paire d'amorces qu'à l'étape (b) d'une séquence d'acide nucléique portant la mutation V82A ou L90M, d) l'amplification par PCR en temps réel des produits d'amplification de l'étape (b) et du standard de l'étape (c) avec une paire d'amorces hautement conservées ne discriminant pas les séquences portant ou non la mutation V82A ou L90M " cette paire d'amorces étant SEQ ID No.3 et SEQ ID No.4 dans la liste de séquences en annexe, et quantification du nombre de séquences d'acide nucléique virales portant ou non la mutation V82A ou L90M présentes dans l'échantillon, e) l'amplification PCR en temps réel des produits d'amplification de l'étape (b) et du standard de l'étape (c) avec une paire d amorces spécifiques d'une séquence portant la mutation V82A ou L90M, et quantification du nombre de séquences d'acide nucléique virales portant la mutation V82A ou L90M présentes dans l'échantillon, f) la comparaison quantifications des étapes (d) et (e) pour déterminer la proportion de virus portant la mutation V82A ou L90M, dans l'échantillon. Preferred embodiment of this method application of the invention is characterized in that it comprises the following steps: a) the extraction of the RNAs contained in the biological sample, b) the amplification by RT PCR of the RNA of step (a) with a primer pair flanking a viral nucleic acid sequence capable of carrying the V82A or L90M mutation, this primer pair being SEQ ID No.1 and SEQ ID No.2 in the c) the preparation of a standard by PCR amplification with the same pair of primers as in step (b) of a nucleic acid sequence carrying the mutation V82A or L90M, d ) the real-time PCR amplification of the amplification products of step (b) and the standard of step (c) with a pair of highly conserved primers that do not discriminate sequences with or without the V82A mutation or L90M "this pair of primers being SEQ ID No.3 and SEQ ID No.4 in the seq list. uences, and quantification of the number of viral nucleic acid sequences with or without the V82A or L90M mutation present in the sample, e) the real-time PCR amplification of the amplification products of step (b) and the standard of step (c) with a pair of primers specific for a sequence carrying the V82A or L90M mutation, and quantifying the number of viral nucleic acid sequences carrying the V82A or L90M mutation present in the sample, f) comparing the quantifications of steps (d) and (e) to determine the proportion of virus carrying the V82A or L90M mutation in the sample.

L'étape (e) de méthode pour détecter et/ou quantifier des variants minoritaires du VIH portant la mutation de résistance V82A dans la séquence de la protéase au sein d'une population virale hétérogène contenue dans un échantillon biologique est avantageusement réalisée avec la paire d'amorces référencées comme ID No.4 et SEQ ID No.6 dans la liste des séquences en annexe. The method step (e) for detecting and / or quantifying minority variants of HIV carrying the V82A resistance mutation in the protease sequence within a heterogeneous viral population contained in a biological sample is advantageously carried out with the pair. of primers referenced as ID No.4 and SEQ ID No.6 in the attached sequence listing.

L'étape (e) de la méthode pour détecter et/ou quantifier des variants minoritaires du VIH portant la mutation de résistance L90M dans la séquence de la protéase au sein d'une population virale hétérogène contenue dans un échantillon biologique est avantageusement réalisée avec la paire d'amorces référencées comme SEQ ID No.4 et SEQ ID No.7 dans la liste des séquences en annexe. Step (e) of the method for detecting and / or quantifying minority variants of HIV carrying the L90M resistance mutation in the protease sequence within a heterogeneous viral population contained in a biological sample is advantageously carried out with the pair of primers referenced as SEQ ID No.4 and SEQ ID No.7 in the attached sequence listing.

L'invention concerne également les paires d'amorces utilisées dans les différentes étapes de la méthode de détection et/ou de quantification des variants minoritaires du VIH portant l'une au moins des mutations de résistance V82A ou L90M dans la séquence la protéase, au sein d'une population virale hétérogène contenue dans un échantillon biologique. The invention also relates to the primer pairs used in the various steps of the method for detecting and / or quantifying minority variants of HIV carrying at least one of the V82A or L90M resistance mutations in the protease sequence, at the within a heterogeneous viral population contained in a biological sample.

L'invention concerne une re d'amorces susceptible d'être mise en oeuvre à l'étape (b) de la méthode de séquence SEQ ID No.1 et SEQ ID No.2 dans la liste de séquences en annexe. The invention relates to a re primers capable of being implemented in step (b) of the sequence method SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 in the sequence listing in the appendix.

L'invention concerne aussi une paire d'amorces susceptible d'être mise en oeuvre à l'étape (d) de la méthode et de séquence SEQ ID No.3 et SEQ ID No.4 dans la liste de séquences en annexe. The invention also relates to a pair of primers that can be implemented in step (d) of the method and sequence SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 in the attached sequence listing.

L'invention s'applique à une paire d'amorces susceptible d'être mise en oeuvre à l'étape (e) de la méthode et de séquence SEQ ID No.4 et SEQ ID No.6 ou de séquence SEQ ID No.4 et SEQ ID No.7 dans la liste de séquences en annexe. The invention applies to a pair of primers that can be implemented in step (e) of the method and of sequence SEQ ID No.4 and SEQ ID No. 6 or sequence SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 7 in the attached sequence listing.

L'invention concerne également une sonde susceptible d'être mise en oeuvre aux étapes (d) et (e) de la méthode et de séquence SEQ ID No.5 dans la liste de séquences en annexe. The invention also relates to a probe that can be implemented in steps (d) and (e) of the method and sequence SEQ ID No. 5 in the attached sequence listing.

La méthode de l'invention trouve donc de nombreuses applications comme bien entendu - l'étude de la dynamique de l'émergence de mutations dans des populations virales, par exemple, au cours de traitements antiviraux, - l'évolution des populations de virus mutés lors des interruptions pharmaceutiques, - l'appréciation plus précise de la réponse ou de l'échec des traitements antiviraux conduisant à des décisions thérapeutiques plus efficaces. L'invention concerne aussi un kit pour la mise en oeuvre la méthode de l'invention. Un tel kit caractérisé en ce qu'il comprend les réactifs suivants - une paire d'amorces encadrant le segment susceptible de porter une mutation, - une paire d'amorces hautement conservées discriminant pas les séquences mutées et non mutées, - une paire d'amorces spécifiques des séquences mutées, - une sonde conjuguée à ses extrémités 5' et 3', respectivement, avec un colorant fluorescent reporteur et un composé réduction d'intensité de fluorescence, spécifique des produits d'amplification des étapes (c) et (d) de la méthode selon l'invention, - un séquence d'acide nucléique portant mutation pour la préparation d'un standard par amplification PCR avec la paire d'amorces encadrant le segment susceptible de porter une mutation, - les produits et réactifs nécessaires pour réaliser les différentes amplifications par PCR. The method of the invention therefore has many applications as of course - the study of the dynamics of the emergence of mutations in viral populations, for example, during antiviral treatments, - the evolution of mutated virus populations during pharmaceutical interruptions, - more precise assessment of the response or failure of antiviral treatments leading to more effective therapeutic decisions. The invention also relates to a kit for implementing the method of the invention. Such a kit characterized in that it comprises the following reagents - a pair of primers flanking the segment likely to carry a mutation, - a pair of highly conserved primers not discriminating the mutated and non-mutated sequences, - a pair of specific primers of the mutated sequences; a conjugate probe at its 5 'and 3' ends, respectively, with a reporter fluorescent dye and a fluorescence intensity reduction compound, specific for the amplification products of steps (c) and (d); ) of the method according to the invention, - a nucleic acid sequence bearing mutation for the preparation of a standard by PCR amplification with the pair of primers surrounding the segment likely to carry a mutation, - the products and reagents necessary for perform the different amplifications by PCR.

L'invention concerne un kit pour la détection et/ou la quantification de variants minoritaires du portant la mutation de résistance aux antirétroviraux V82A ou L90M dans la séquence de la protéase qui comprend les réactifs suivants - la paire d'amorces encadrant le segment susceptible de porter une mutation de séquence SEQ ID No.l et SEQ ID No.2 dans la liste de séquences en annexe, - la paire d'amorces hautement conservées ne discriminant pas les séquences mutées et non mutées de séquence SEQ ID No.3 et SEQ ID No.4 dans la liste de séquences en annexe, - la paire d'amorces spécifiques des séquences portant la mutation V82A de séquence SEQ ID No.4 et SEQ ID No.6 dans la liste de séquences en annexe et la paire d'amorces spécifiques des séquences portant mutation L90M de séquence SEQ ID No.4 et SEQ ID No.7 dans la liste de séquences annexe, - la sonde conjuguée à ses extremités 5' et 3', respectivement, avec un colorant fluorescent reporteur et un composé réduction d'intensité de fluorescence de séquence SEQ ID No.5 dans la liste de séquences en annexe. The invention provides a kit for the detection and / or quantification of minority variants of the V82A or L90M antiretroviral resistance mutation in the protease sequence that comprises the following reagents - the primer pair surrounding the segment likely to carry a mutation of sequence SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 in the list of sequences in the appendix, the pair of highly conserved primers not discriminating the mutated and non-mutated sequences of sequence SEQ ID No.3 and SEQ ID No. 4 in the attached sequence listing, - the pair of sequence-specific primers carrying the V82A mutation of sequence SEQ ID No.4 and SEQ ID No.6 in the attached sequence listing and the pair of primers specific for sequences carrying an L90M mutation of sequence SEQ ID No.4 and SEQ ID No.7 in the list of accompanying sequences, the probe conjugated at its 5 'and 3' ends, respectively, with a fluorescent dye reporter and a fluorescence intensity reduction compound of sequence SEQ ID No. 5 in the attached sequence listing.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent et qui font référence aux figures suivantes - la figure 1 présente la quantification par PCR séquence-sélective des populations virales exprimant la mutation de résistance L90M. L'ARN est extrait des échantillons cliniques et les ARN correspondant au gène de la protéase ont été amplifiés par RT-PCR. Les produits d'amplification ont été dilués et la quantité d'ADN présent a été quantifiée par PCR en temps réel réalisée en utilisant la paire d'amorces non séquence- sélectives F3/R1 de séquence SEQ ID No.3 et SEQ ID No.4 dans la liste de séquences en annexe (A). Pour tous les échantillons, la quantité d'ADN présent est déterminé grâce à une courbe standard obtenue à partir de dilutions d'ADN provenant de l'amplification d'un plasmide contenant la séquence de la protéase de pNL4-3 dans lequel la mutation L90M a été introduite par mutation dirigée 0). La même quantité d'ADNc est amplifiée dans des réactions parallèles en utilisant une paire d'amorces séquence-selectives M2-L90M/R1 de séquence SEQ ID No.4 et SEQ ID No.7 dans la liste de séquences en annexe (B). Les échantillons obtenus à partir de patients non traités (#) se superposent avec la courbe obtenue avec de l'ADN standard contenant la séquence sauvage ([:] -n), alors que les échantillons obtenus à partir de patients en échec de traitement thérapeutique dont le génotypage a montré qu'ils présentent des virus exprimant de multiples mutations de résistance parmi lesquelles L90M (#) correspondent à la courbe obtenue avec de l'ADN standard contenant la mutation L90M (0-0). Les échantillons contenant 41 % de séquences mutées<B>(1)</B> ou 3 % de séquences mutées<B>(Y)</B> ce qui a été montré par analyse des clones dérivés réactions PCR parallèles donnent des résultats intermédiaires proches des valeurs prédites (lignes brisées). I1 faut noter que les échantillons contenant moins de 0,1 % de séquences mutées peuvent être distinguées des échant' ons contenant uniquement des virus sauvages. Other advantages and characteristics of the invention will become apparent from the following examples which refer to the following figures - FIG. 1 shows the sequence-selective PCR quantification of the viral populations expressing the L90M resistance mutation. RNA is extracted from clinical samples and RNAs corresponding to the protease gene were amplified by RT-PCR. The amplification products were diluted and the amount of DNA present was quantified by real-time PCR performed using the pair of F3 / R1 non-sequence selective primers of sequence SEQ ID No.3 and SEQ ID No. 4 in the sequence listing in appendix (A). For all samples, the amount of DNA present is determined by a standard curve obtained from dilutions of DNA from the amplification of a plasmid containing the pNL4-3 protease sequence in which the L90M mutation was introduced by directed mutation 0). The same amount of cDNA is amplified in parallel reactions using a pair of M2-L90M / R1 selective-sequence primers of sequence SEQ ID No.4 and SEQ ID No.7 in the attached sequence listing (B). . Samples obtained from untreated patients (#) are superimposed with the curve obtained with standard DNA containing the wild-type sequence ([:] -n), whereas samples obtained from patients failing therapeutic treatment whose genotyping has shown that they have viruses expressing multiple resistance mutations among which L90M (#) correspond to the curve obtained with standard DNA containing the L90M mutation (0-0). Samples containing 41% of mutated <B> (1) </ B> sequences or 3% of <B> (Y) mutated sequences </ B> as shown by analysis of clones derived from parallel PCR reactions yielded results intermediates close to the predicted values (broken lines). It should be noted that samples containing less than 0.1% of mutated sequences can be distinguished from samples containing only wild-type viruses.

- la figure 2 présente 1 cinétiques de conversion de virus mutées en virus sauvages suite à des interruptions structurées de traitement. Le plasma provient de 5 patients différents aux temps indiques avant et après l'IT le pourcentage de séquences virales exprimant les mutations de résistance V82A (#) et L90M est déterminé par séquence-sélective. Les valeurs dans la zone ombragée ( U ) sont sous la limite de detection ( < 1 pour V82A et < 0,05 % pour L90M). charge virale plasmatique (O) est déterminée par Monitor (Roche). Par un génotypage standard, tous les patients présentent la mutation V82A et les patients 1, 4 et 5 ont mutation L90M avant 'IT. Les mutations V82A et L90M sont indétectables par génotypage standard à 3, 4, 2 et 2 mois respectivement pour patients 1, 2, 3 et 5. Les flèches indiquent le moment ' une thérapie antirétrovirale est reprise. FIG. 2 shows the kinetics of conversion of mutated viruses into wild viruses following structured treatment interruptions. The plasma comes from 5 different patients at the indicated times before and after the IT the percentage of viral sequences expressing the V82A (#) and L90M resistance mutations is determined by sequence-selective. The values in the shaded area (U) are below the detection limit (<1 for V82A and <0.05% for L90M). Plasma viral load (O) is determined by Monitor (Roche). By standard genotyping, all patients have the V82A mutation and patients 1, 4 and 5 have L90M mutation before IT. The V82A and L90M mutations are undetectable by standard genotyping at 3, 4, 2 and 2 months respectively for patients 1, 2, 3 and 5. The arrows indicate when antiretroviral therapy is resumed.

I.<U>Matériel et méthodes</U>. I-1.<U>Patients</U>. I. <U> Materials and Methods </ U>. I-1. <U> Patients </ U>.

Le sang périphérique a été obtenu à partir de patients infectés par le VIH avant et suite l'interruption de toute thérapie antirétrovirale et plasma a été conserve à -80 C. Tous les patients donné leur consentement avant de suivre l'IT. I-2.<U>Préparation de</U> l'ADNc <U>viral</U>. Peripheral blood was obtained from HIV-infected patients before and following the interruption of any antiretroviral therapy and plasma was kept at -80 C. All patients gave their consent before following the IT. I-2. <U> Preparation of </ U> the <U> Viral </ U> cDNA.

Le plasma (0,5 à 1 ml) a éte centrifugé à 23,500xg pendant une heure à 4 C et l'ARN été extrait à partir du culot et élué dans 60 -p1 d'eau. Quinze p1 d'ARN ont éte utilisés pour la RT-PCR (Titan One Tube RT-PCR kit, Boehringer Mannheim) selon les instructions du fournisseur et en utilisant à la concentration finale de 0,4 pM les amorces ProtF1 (5'-CTTTAGCTTCCCTCAGATCACTC) et ProtR1 (5'- CCTGGCTTTAATTTTACTGGTACA) respectivement SEQ ID No.1 et SEQ ID No.2 dans la liste de séquences en annexe. Les conditions de la RT-PCR sont les suivantes : dénaturation à 94 C pendant 30 sec, hybridation à 52 C pendant 30 sec, extension à 68 C pendant 45 sec ; 40 cycles. The plasma (0.5 to 1 ml) was centrifuged at 23,500xg for one hour at 4 ° C and the RNA was extracted from the pellet and eluted in 60 μl of water. Fifteen μl of RNA were used for RT-PCR (Titan One Tube RT-PCR kit, Boehringer Mannheim) according to the supplier's instructions and using at the final concentration of 0.4 μM primers ProtF1 (5'-CTTTAGCTTCCCTCAGATCACTC). ) and ProtR1 (5'-CCTGGCTTTAATTTTACTGGTACA) respectively SEQ ID No.1 and SEQ ID No.2 in the attached sequence listing. The conditions of the RT-PCR are as follows: denaturation at 94 ° C. for 30 sec, hybridization at 52 ° C. for 30 sec, extension at 68 ° C. for 45 sec; 40 cycles.

I-3.<U>Quantification des populations virales</U> <U>contenant des mutations de résistance en utilisant la</U> PCR <U>en</U> <U>temps réel</U>. I-3. <U> Quantification of viral populations </ U> <U> containing resistance mutations using </ U> PCR <U> in </ U> <U> real time </ U>.

Les mutations de résistance V82A (GTC -> GCC) et L90M (TTG <B>---></B> ATG) ont été introduites dans le plasmide pNL4-3 mutagenèse dirigée comme déjà décrit Petit et<I>a1.</I> Resistance mutations V82A (GTC -> GCC) and L90M (TTG <B> ---> </ B> ATG) were introduced into the plasmid pNL4-3 site-directed mutagenesis as already described as Small and <I> a1. / I>

(1999, J. Virol., vol. 73, pages 5079-88) et vérifiées par séquençage. L'ADN plasmidique des plasmides sauvage, V82A et L90M a été ensuite amplifié par PCR en utilisant la paire d'amorces ProtFl/ProtR1. Les produits de cette amplification ont été utilisés comme standard, afin de s'assurer que les échantillons (ADNc viral) et les standards utilisés pour la en temps réel se trouvent dans la même forme. (1999, J. Virol., Vol.73, pages 5079-88) and verified by sequencing. The plasmid DNA of the wild-type plasmids, V82A and L90M was then amplified by PCR using the ProtF1 / ProtR1 primer pair. The products of this amplification have been used as standard, to ensure that the samples (viral cDNA) and the standards used for the real-time are in the same form.

Pour quantifier la proportion de séquences exprimant la mutation V82A, les produits obtenus par RT-PCR été dilués dans un tampon Tris à 10 mM au pH de 7,4 contenant de l'EDTA à 0,1 mM et de l'ADN de sperme de hareng à 100 ng/ml (Sigma) (habituellement 10-4 -10-6) et des aliquotes de 10 u1 ont été ajoutés aux réactions de PCR permettant l'amplification non-sélective de toutes les séquences virales ou l'amplification préférentielle des séquences contenant la mutation V82A. Pour 'amplification non-sélective, les conditions de réaction sont, dans un volume total de 50 u1, du tampon Taqman 1X, MgC12 à 3 mM, chaque dNTP à 200 nM, chaque amorce à nM F3 (5'- GGTACAGTATTAGTAGGACCTACA) et R1 (5'- TGGTACAGTTTCAATAGGACTAAT), la sonde TaqMan a 50 nM [5'-(6- Fam)CTCAGATTGGTTGCACTTTAAATTTTCC(Tamra)(phosphate)], l'uracil-n-glycosylase à 0,5U et la Taq polymérase AmpliTaq Gold à 1,25 U. Les amorces F3, R1 et sonde TaqMan correspondent respectivement aux séquences SEQ ID No.3, SEQ ID No.4 et SEQ ID No.5 dans la liste de séquences en annexe. Pour 'amplification préférentielle de V82A les conditions sont identiques, exceptée l'amorce F3 remplacee par l'amorce M2-V82A (5'-TATTAGTAGGACCTACACCAGC ; SEQ ID No.6 dans la liste de séquences en annexe). Les réactifs le matériel ont ' ' fournis par Perkin-Elmer, les oligonucléotides ont été synthétisés par Genset. Les échantillons été évalués par en temps réel (Heid <I>et a1.,</I> 1996, Genome Res., vol. 6, pages 986-94 ; Gibson et al., 1996, Genome ., vol. 6, pages -1001) en utilisant le système de Perkin-Elmer 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems) en utilisant les paramètres de cycles suivants : 50 C x 2 min ; 95 C x 10 min ; suivie de 40 cycles à 95 C x sec et 50 C x 1 min. Le nombre de cycles nécessaire pour atteindre la fluorescence seuil (Cs) est déterminé et quantité de séquences initialement présentes est calculée par extrapolation sur la courbe standard. Les mêmes dilutions de standard (produits d'amplification produits via le plasmide V82A) sont utilisées pour à la fois les amplifications non- sélective et sélective de V82A. Le pourcentage de séquences virales est calculé selon la formule : % de séquences mutées _ [quantité de séquences mutées dans l'échantillon)/(quantité totale de séquences dans l'échantillon)] x 100. Pour quantifier la proportion de séquences exprimant la mutation L90M, des techniques analogues sont utilisées, exceptée l'amorce M2-V82A remplacée par l'amorce M2-L90M (5'-AACATAATTGGAAGAAATCAGA ; SEQ ID No.7 dans la liste de séquences en annexe). Des dilutions des produits d'amplification générés à partir du plasmide L90M sont utilisées pour réaliser courbe standard. To quantify the proportion of sequences expressing the V82A mutation, the products obtained by RT-PCR were diluted in 10 mM Tris buffer at pH 7.4 containing 0.1 mM EDTA and sperm DNA. of herring at 100 ng / ml (Sigma) (usually 10-4 -10-6) and 10 u1 aliquots were added to PCR reactions allowing nonselective amplification of all viral sequences or preferential amplification sequences containing the V82A mutation. For non-selective amplification, the reaction conditions are, in a total volume of 50 μl, 1 × Taqman buffer, 3 mM MgCl 2, each 200 nM dNTP, each nM F3 primer (5'-GGTACAGTATTAGTAGGACCTACA) and R1. (5'-TGGTACAGTTTCAATAGGACTAAT), the TaqMan probe has 50 nM [5 '- (6-Fam) CTCAGATTGGTTGCACTTTAAATTTTCC (Tamra) (phosphate)], the uracil-n-glycosylase at 0.5U and the Taq polymerase AmpliTaq Gold at 1 The primers F3, R1 and TaqMan probe correspond respectively to the sequences SEQ ID No.3, SEQ ID No.4 and SEQ ID No.5 in the attached sequence listing. For preferential amplification of V82A, the conditions are identical except for primer F3 replaced by primer M2-V82A (5'-TATTAGTAGGACCTACACCAGC, SEQ ID No.6 in the attached sequence listing). The material reagents provided by Perkin-Elmer, the oligonucleotides were synthesized by Genset. The samples were evaluated in real time (Heid <I> and a1., </ I> 1996, Genome Res., Vol 6, pp. 986-94, Gibson et al., 1996, Genome., Vol. pages -1001) using the Perkin-Elmer 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems) using the following cycle parameters: 50 C x 2 min; 95 C x 10 min; followed by 40 cycles at 95 C x sec and 50 C x 1 min. The number of cycles necessary to reach the threshold fluorescence (Cs) is determined and the amount of sequences initially present is calculated by extrapolation to the standard curve. The same standard dilutions (amplification products produced via plasmid V82A) are used for both non-selective and selective amplification of V82A. The percentage of viral sequences is calculated according to the formula:% mutated sequences [amount of mutated sequences in the sample] / (total amount of sequences in the sample)] x 100. To quantify the proportion of sequences expressing the mutation L90M, analogous techniques are used, except the M2-V82A primer replaced by the M2-L90M primer (5'-AACATAATTGGAAGAAATCAGA, SEQ ID No. 7 in the attached sequence listing). Dilutions of the amplification products generated from plasmid L90M are used to make standard curve.

Les amplifications non-sélectives et sélectives sont toujours réalisées en même temps. Toutes les réactions sont réalisées en double et la moyenne des deux valeurs est utilisée pour les calculs. Bien que les réactions réalisées en utilisant les amorces M2-V82A et M2-L90M amplifient des séquences contenant les mutations correspondantes plus efficacement que les séquences sauvages, des produits d'amplification résultant de l'amplification des séquences sauvages sont générés. Lorsque des échantillons contenant uniquement des séquences sauvages sont analysés comme décrit ci-dessus, les résultats indiquent la présence apparente de 0,6 ,2% (moyenne DS, n = 10) de séquences mutées en utilisant le système V82A et de 0,01 0,02% (moyenne DS, n = 10) séquences mutées en utilisant le système L90M. Basée sur ces résultats, la limite de sensibilité a été définie comme la moyenne + 2 DS de ces valeurs soit 1% pour V82A et 0,05% pour L90M. Non-selective and selective amplifications are always performed at the same time. All reactions are performed in duplicate and the average of the two values is used for the calculations. Although the reactions carried out using the M2-V82A and M2-L90M primers amplify sequences containing the corresponding mutations more efficiently than the wild-type sequences, amplification products resulting from the amplification of the wild-type sequences are generated. When samples containing only wild-type sequences are analyzed as described above, the results indicate the apparent presence of 0.6, 2% (DS average, n = 10) of mutated sequences using the V82A system and 0.01 0.02% (DS average, n = 10) mutated sequences using the L90M system. Based on these results, the sensitivity limit was defined as the + 2 DS average of these values, ie 1% for V82A and 0.05% for L90M.

I-4. Evaluation <U>des produits</U> PCR <U>clonés</U>. I-4. <U> evaluation of cloned </ U> PCR </ U> products </ U>.

Pour valider les résultats obtenus par PCR séquence- sélective utilisant une technique indépendante et pour évaluer le génotype des populations virales minoritaires exprimant les mutations V82A et OM, des aliquotes des réactions initiales de RT-PCR sont amplifiés en utilisant les amorces F4 (5'-CTCAGATCACTCTTTGGCA ; SEQ ID No.8 dans la liste de séquences en annexe) et R1, et les produits sont clonés dans pCR4-TOPO (Invitrogen) puis utilisés pour transfecter E.<I>col!.</I> Les colonies sont mises à pousser sur des boîtes LB. Pour évaluer la proportion de clones contenant des séquences sauvages ou mutées (V82A ou L90M), des colonies individuelles sont transférées sur 200 u1 milieu LB. Après une incubation toute la nuit à 370C, les cultures sont remises en suspension, diluées à 1 :50 dans de eau, et des aliquotes de 10 u1 sont évalués par PCR en temps réel comme décrit ci-dessus. Les clones contenant les séquences sauvages ou mutées sont facilement distinguées en comparant le Cs obtenu pour les réactions réalisées en utilisant les conditions de PCR séquence- ou non-séquence- sélective (clones mutants, OCs < 2 cycles ; clones sauvages, 10 cycles). L'ADN plasmidique des clones représentatifs est purifié et les inserts séquencés. Les données du séquençage confirment l'identification des clones sauvages mutants dans tous les cas (27 clones). To validate the results obtained by selective-sequence PCR using an independent technique and to evaluate the genotype of the minority viral populations expressing the V82A and OM mutations, aliquots of the initial RT-PCR reactions are amplified using the F4 primers (5'- CTCAGATCACTCTTTGGCA, SEQ ID No.8 in the attached sequence listing) and R1, and the products are cloned into pCR4-TOPO (Invitrogen) and then used to transfect E. coli. </ I> to push on LB boxes. To evaluate the proportion of clones containing wild-type or mutated sequences (V82A or L90M), individual colonies are transferred to 200 μL LB medium. After overnight incubation at 370C, the cultures are resuspended, diluted 1 in 50 in water, and 10 μl aliquots are evaluated by real-time PCR as described above. Clones containing the wild-type or mutated sequences are easily distinguished by comparing the Cs obtained for the reactions performed using the sequence- or non-sequence-selective PCR conditions (mutant clones, OCs <2 cycles, wild-type clones, 10 cycles). The plasmid DNA of the representative clones is purified and the inserts sequenced. Sequencing data confirm the identification of wild-type mutant clones in all cases (27 clones).

II.<U>Résultats</U>. II. <U> Results </ U>.

II-1. <U>Détection des mutations de résistance en</U> <U>utilisant la</U> PCR <U>en temps réel</U>.  II-1. <U> Detection of resistance mutations in </ U> <U> using </ U> PCR <U> in real time </ U>.

La présence de mésappariements entre l'amorce et cible en partie 3' de l'oligonucléotide diminue 'efficacité de l'amplification par PCR (Huang et a1. 1992, Nucleic Acids Res., vol. 20, pages 4567-73; Kwok et<I>a1.,</I> 0, Nucleic Acids Res., vol. 18, pages 999-1005). En utilisant la PCR en temps réel, il est possible de mesurer avec précision les différences dans l'efficacité amplification en déterminant le nombre de cycles (cycle seuil ou Cs) nécessaires pour générer un signal fluorescent spécifique. Le clivage permet la séparation physique du groupe fluorescent (FAM) et du quencheur (TAMRA) présent dans la sonde non clivée. Cette approche est utilisée pour quantifier la proportion de séquences virales dans les échantillons cliniques contenant les mutations V82A et L90M dans le gène de la protéase associées avec la résistance aux inhibiteurs de protéases. The presence of mismatches between the primer and target in part 3 'of the oligonucleotide decreases the efficiency of PCR amplification (Huang et al., 1992, Nucleic Acids Res., Vol 20, pp. 4567-73; <I> A1, </ I> 0, Nucleic Acids Res., Vol 18, pp. 999-1005). By using real-time PCR, it is possible to accurately measure differences in amplification efficiency by determining the number of cycles (threshold cycle or Cs) required to generate a specific fluorescent signal. Cleavage allows the physical separation of the fluorescent group (FAM) and the quencher (TAMRA) present in the uncleaved probe. This approach is used to quantify the proportion of viral sequences in clinical samples containing V82A and L90M mutations in the protease gene associated with protease inhibitor resistance.

Dans des études initiales, des oligonucléotides qui permettent une discrimination adéquate entre les séquences sauvages et mutées ont été identifiés. Lorsqu une amorce appariée parfaitement avec les séquences contenant la mutation résistance V82A (et donc produisant un mésappariement A-C en partie 3' avec la séquence sauvage) est utilisée, l'amplification de la séquence sauvage , comme attendu, retardée mais la différence de 1,2 cycles dans le Cs (correspondant à une diminution d'un facteur ,3 de l'efficacité d'amplification) ne permet pas une bonne discrimination entre les deux séquences. Comme précédemment décrit (Larder<I>et</I> a1., 1991, AIDS, vol. 5, pages 137-44; Cha <I>et a1.,</I> 92, PCR Methods Appl., vol. 2, pages 14-22), l'addition d'un mésappariement supplémentaire en position -2 par rapport à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide déstabilise considérablement l'amplification des séquences sauvages, alors que cette seule mutation a peu d'effet sur l'amplification de la séquence V82A. En utilisant cet oligonucléotide, un OCs supérieur à 10 cycles est observé en comparant l'amplification de standard sauvage et V82A, ce qui correspond à une diminution dans l'efficacité de l'amplification de la séquence sauvage d'un facteur supérieur ' 1000. En utilisant une approche similaire un oligonucléotide permettant une amplification préférentielle de séquences contenant la mutation L90M a été identifié. Le mésappariement avec la séquence sauvage produit par l'alignement de l'oligonucléotide reconnaissant la séquence L90M est intrinsèquement plus déstabilisant que celui produit l'oligonucléotide reconnaissant V82A, ce qui entraîne une meilleure discrimination (ACs = 15 cyc , correspondant à une diminution dans l'efficacité de l'amplification de la séquence sauvage d'un facteur supérieur à 30000). Ces oligonucléotides sont utilisés pour quantifier des populations minoritaires de séquences mutées dans échantillons cliniques. In initial studies, oligonucleotides that allow for adequate discrimination between wild-type and mutated sequences have been identified. When a primer paired perfectly with the sequences containing the V82A resistance mutation (and thus producing an AC 3 'mismatch with the wild-type sequence) is used, the amplification of the wild-type sequence, as expected, is delayed but the difference of 1, 2 cycles in the Cs (corresponding to a decrease of a factor, 3 of the amplification efficiency) does not allow a good discrimination between the two sequences. As previously described (Larder et al., 1991, AIDS, vol 5, pages 137-44, Cha <I> et al., </ I> 92, PCR Methods Appl., Vol. 2, pages 14-22), the addition of additional mismatch at the -2 position relative to the 3 'end of the oligonucleotide greatly destabilizes the amplification of the wild sequences, whereas this single mutation has little effect on the amplification of the V82A sequence. Using this oligonucleotide, an OCs greater than 10 cycles is observed by comparing the wild-type amplification and V82A, which corresponds to a decrease in the efficiency of amplification of the wild-type sequence by a factor greater than 1000. Using a similar approach, an oligonucleotide allowing preferential amplification of sequences containing the L90M mutation has been identified. The mismatch with the wild-type sequence produced by alignment of the oligonucleotide recognizing the L90M sequence is inherently more destabilizing than that produced by the V82A recognizing oligonucleotide, resulting in better discrimination (ACs = 15 cyc, corresponding to a decrease in efficiency of amplification of the wild-type sequence by more than 30000). These oligonucleotides are used to quantify minority populations of mutated sequences in clinical samples.

L'ARN a été purifié à partir de plasma et l'ARN correspondant au gène de la protéase a été amplifie par PCR. Ces produits d'amplification ont été dilués et quantifiés par en temps réel en utilisant une paire d'amorces qui ne fait pas la différence entre les séquences sauvages et mutées (Figure 1A). Lorsque ces produits de ont été analyses en utilisant une paire d'amorces qui amplifient de façon préférentielle les séquences contenant mutation L90M, échantillons provenant de patients non-traités ont donné des résultats qui suivent la courbe obtenue en utilisant le standard contenant la séquence sauvage (Figure 1B, cercles pleins), alors que les échantillons patients en échec de traitement virologique qui ont été démontrés par génotypage standard comme contenant de nombreuses mutations de résistance parmi lesquelles L90M se superposent avec la courbe obtenue avec le standard L90M (Figure carrés pleins). Cet enseignement et d'autres résultats démontrent que, sous les conditions de réaction utilisées dans cette étude, la présence de polymorphismes ou d'autres mutations de résistance dans la plupart des échantillons cliniques n'affectent pas l'efficacité de l'amplifi ion des séquences sauvages et des séquences avec la mutation V82A ou L90M (Christopherson et a1., 1997, Nucleic Acids ., vol. 2, pages 14-20). Au contraire, lorsque les échantillons contenant une population minoritaire de séquences virales avec la mutation L90M sont analysés, les résultats se situent entre ceux obtenus pour les échantillons contenant seulement soit les séquences sauvages, soit les séquences mutées (Figure 1B, triangles), et correspondent assez bien aux valeurs déterminées en évaluant les clones dérivés de réactions de PCR parallèles réalisées sur ces échantillons. Il faut noter que les échantillons contenant de l'ordre de 0,05 % des séquences avec la mutation L90M peuvent être distingués avec cette approche des échantillons contenant uniquement des séquences sauvages. Des résultats identiques sont obtenus pour la détection de mutants V82A, exceptée la sensibilité du test qui est approximativement de 1 % de séquences mutées.  RNA was purified from plasma and RNA corresponding to the protease gene was amplified by PCR. These amplification products were diluted and quantified in real time using a primer pair that does not differentiate between wild-type and mutated sequences (Figure 1A). When these products were analyzed using a pair of primers that preferentially amplify the L90M mutation-containing sequences, samples from untreated patients gave results that follow the curve obtained using the standard containing the wild-type sequence ( Figure 1B, solid circles), whereas the virologically failed patient samples that have been demonstrated by standard genotyping to contain many resistance mutations including L90M overlap with the curve obtained with the L90M standard (Figure solid squares). This and other results demonstrate that, under the reaction conditions used in this study, the presence of polymorphisms or other resistance mutations in most clinical samples does not affect the efficiency of amplification of wild sequences and sequences with the V82A or L90M mutation (Christopherson et al., 1997, Nucleic Acids, Vol 2, pages 14-20). In contrast, when the samples containing a minority population of viral sequences with the L90M mutation are analyzed, the results are between those obtained for the samples containing only either the wild sequences or the mutated sequences (Figure 1B, triangles), and correspond to quite well to the values determined by evaluating the clones derived from parallel PCR reactions performed on these samples. It should be noted that the samples containing about 0.05% of the sequences with the L90M mutation can be distinguished with this approach of the samples containing only wild sequences. Identical results are obtained for the detection of V82A mutants, except for the sensitivity of the assay which is approximately 1% of mutated sequences.

I1-2. Evaluation <U>des cinétiques disparition</U> <U>des formes résistantes durant</U> l'IT. I1-2. <U> evaluation of the kinetic disappearance </ U> <U> of the resistant forms during </ U> the IT.

Des patients infectés par le -1 avec des souches virales grandement résistantes aux antirétroviraux suivant une IT ont été identifiés. échantillons plasmatiques de ces patients ont été analysés suivant la technique de l'invention avant et suite à 'interruption de tout traitement antirétroviral. La proportion des souches virales contenant les souches L90M et/ou V82A en fonction du temps est montrée à la Figure 2. Avant 'arrêt de la thérapie une grande proportion de souches mutantes sont présentes. Un mois après l'arrêt de la thérapie, les souches résistantes restent prédominantes dans les 3 patients testés. la suite, la proportion des souches mutantes diminue chez la plupart des patients. Lorsque des échantillons obtenus 3 mois après l'arrêt la thérapie sont analysés par un génotypage standard, une apparente conversion en séquences sauvages est observée chez 4 des 5 patients. Lorsque les échantillons obtenus plus de 3 mois après l'arrêt de la thérapie sont analysés par PCR en temps réel, des souches virales résistantes ' iduelles sont encore présentes chez 3 des 5 patients, bien un seul de ces patients présente plus de 5 % de souches résistantes. Les souches virales mutantes sont devenues la suite indétectables par PCR en temps réel chez 3 patients, mais la durée de l'interruption de traitement nécessaire est plutôt variable (moins de 2 mois, entre 2 et 4 mois entre 3 et 5 mois respectivement pour les patients 3, 5 et ). Chez les deux autres patients, les séquences virales mutantes sont encore présentes lorsque la thérapie est reprise après 5 à 6 mois d'interruption. Patients infected with -1 with viral strains highly resistant to antiretrovirals following an IT were identified. Plasma samples from these patients were analyzed according to the technique of the invention before and after interruption of any antiretroviral treatment. The proportion of viral strains containing the L90M and / or V82A strains as a function of time is shown in FIG. 2. Before stopping the therapy a large proportion of mutant strains are present. One month after stopping the therapy, the resistant strains remained predominant in the 3 patients tested. As a result, the proportion of mutant strains decreases in most patients. When samples obtained 3 months after stopping the therapy are analyzed by standard genotyping, an apparent conversion to wild sequences is observed in 4 of the 5 patients. When the samples obtained more than 3 months after stopping the therapy are analyzed by real-time PCR, resistant viral strains are still present in 3 of 5 patients, although only one of these patients presents more than 5% of resistant strains. The mutant viral strains became undetectable by real-time PCR in 3 patients, but the duration of the necessary treatment interruption is rather variable (less than 2 months, between 2 and 4 months between 3 and 5 months respectively for patients 3, 5 and). In the other two patients, the viral mutant sequences are still present when the therapy is resumed after 5 to 6 months of interruption.

I1-3. Génotypage <U>des souches résistantes</U> <U>présentes durant</U> l'IT. I1-3. <U> Genotyping of resistant strains </ U> <U> present during </ U> IT.

Pour confirmer ces résultats et évaluer le génotype populations virales minoritaires exprimant les mutations V82A et L90M, des aliquotes des réactions RT-PCR réalisées sur les échantillons de deux patients avant et à différents temps après l'arrêt de la thérapie sont amplifiés à nouveau en utilisant des amorces qui ne font pas la différence entre les séquences sauvage et mutantes (F4/R1). Les produits d'amplification sont clonés et la proportion de clones contenant des séquences mutantes déterminée. Comme montré dans le Tableau 1, les résultats obtenus par PCR en temps réel séquence-sélective et ceux obtenus par l'évaluation des clones sont concordantes. De plus, des clones sauvages et mutants représentatifs sont séquencés. Tous les clones dérivés à partir des échantillons obtenus avant l'arrêt de la thérapie contiennent toutes les mutations de résistance identifiées par génotypage standard (Tableau 1). Inversement, la plupart des clones provenant d'échantillons obtenus 5 mois après l'arrêt de thérapie qui ne présentent pas la mutation V82A ou L90M présentent un génotype sauvage chez les deux patients. To confirm these results and to evaluate the genotype of minority viral populations expressing the V82A and L90M mutations, aliquots of RT-PCR reactions performed on the samples of two patients before and at different times after stopping the therapy are amplified again using primers that do not differentiate between wild-type and mutant sequences (F4 / R1). The amplification products are cloned and the proportion of clones containing mutant sequences determined. As shown in Table 1, the results obtained by selective-sequence real-time PCR and those obtained by the evaluation of the clones are concordant. In addition, representative wild and mutant clones are sequenced. All clones derived from samples obtained prior to discontinuation of therapy contain all resistance mutations identified by standard genotyping (Table 1). Conversely, most clones from samples obtained 5 months after stopping therapy that do not have the V82A or L90M mutation show a wild-type genotype in both patients.

De façon surprenante, les clones contenant des mutations de résistance identifiés dans les échantillons 5 mois (patient 1) ou 3 mois (patient 2) après l' ne sont pas homogènes et la plupart ont un génotype intermédiaire entre celui d'une population grandement mutante présente avant l'interruption de la thérapie et une population sauvage majoritaire qui émerge après l'IT. Par exemple, 3 à 4 % de la population virale présente chez le patient 2, 3 mois après l'IT ont les mutations V82A et/ou L9 mais les résultats obtenus par clonage indiquent que ces mutations sont presentes dans les populations partiellement non- chevauchantes. Parmi les 5 clones minoritaires identifiés, un clone présente toutes les 7 mutations (clone F), second présente 5 des 7 mutations dont L90M mais pas V82A (clone , et un troisième présente 4 des 7 mutations dont L90M et V82A (clone H) et les autres clones contiennent L90M en association avec une autre mutation (clone I) ou seule (clone L'analyse génétique indique que ces virus avec génotype de résistance intermédiaire sont apparus par deux mécanismes distincts . réémergence de génomes viraux sélectionnés aux premiers stades de la résistance aux drogues et recombinaison entre des souches sauvages résistantes. Le premier mécanisme est illustré par le clone B (patient 1, Tableau 1) qui porte seulement 2 des mutations de résistance présentes dans les souches avant l'IT 154V et V82A. L'analyse phylogénétique de ce clone plus proche des virus sauvages post-IT que des virus résistants pré-IT, ce qui suggère fortement qu'il n'a été géneré par une réversion sélective des mutations de résistance. De façon similaire, l'analyse du génotype écarte une production par recombinaison. L'histoire clinique de ce patient en accord avec l'idée que ce clone résulte de réémergence de génomes viraux sélectionnés dans les stades précoces la résistance aux antirétroviraux. En effet, clone B contient les mutations de résistance typiques d' résistance au indinavir mais ne présente pas la mutation G48V. Cette dernière mutation grandement typique d' résistance au saquinavir a dû être sélectionnée ultérieurement après que le patient a changé pour traitement avec du saquinavir suite à un échec initial avec un traitement avec du indinavir. La réémergence de quas'- espèces préexistantes est certainement l'explication pour le clone G du patient 2 bien qu'une réversion sélective des mutations A71V et V82A soit plus difficile à exclure, parce que ce virus avec une résistance intermédiaire est plus proche des virus résistants pré-IT que des virus sauvages post Au contraire, l'analyse des séquences suggère fortement que plusieurs des autres clones sont générés via des recombinaisons, par exemple, clone C (patient 1) et clones H-I (patient 2). Pour chaque cas, une extrémité de la protease porte des motifs de la séquence en acide nucléique qui sont typiques de virus sauvages post-IT alors que le reste de la séquence contient un polymorphisme caractéristique des virus résistants pré-IT. Plusieurs éléments indiquent que ces recombinaisons sont survenues<I>in</I> <I>vivo</I> et non durant l'amplification avant le clonage. Surprisingly, the clones containing resistance mutations identified in the samples 5 months (patient 1) or 3 months (patient 2) after the are not homogeneous and most have an intermediate genotype between that of a highly mutant population present before the interruption of therapy and a majority wild population that emerges after IT. For example, 3 to 4% of the viral population present in the patient 2, 3 months after IT have V82A and / or L9 mutations, but results obtained by cloning indicate that these mutations are present in partially non-overlapping populations . Among the 5 minority clones identified, one clone has all 7 mutations (clone F), the second has 5 of 7 mutations including L90M but not V82A (clone, and a third has 4 of 7 mutations including L90M and V82A (clone H) and the other clones contain L90M in combination with another mutation (clone I) or alone (clone Genetic analysis indicates that these viruses with an intermediate resistance genotype have appeared by two distinct mechanisms: reemergence of selected viral genomes in the early stages of resistance The first mechanism is illustrated by clone B (patient 1, Table 1) which carries only 2 of the resistance mutations present in the strains before the IT 154V and V82A.The phylogenetic analysis of this clone closer to the post-IT wild-type viruses than pre-IT resistant viruses, which strongly suggests that it was generated by a selective reversion of resistance mutations. Similarly, genotype analysis excludes recombinant production. The clinical history of this patient agrees with the idea that this clone results from reemergence of selected viral genomes in the early stages of antiretroviral resistance. Indeed, clone B contains the typical resistance mutations of indinavir resistance but does not show the G48V mutation. This latter, highly typical mutation of saquinavir resistance had to be selected later after the patient was changed for treatment with saquinavir following initial failure with treatment with indinavir. The re-emergence of pre-existing species is certainly the explanation for clone G of patient 2 although a selective reversion of A71V and V82A mutations is more difficult to exclude, because this virus with intermediate resistance is closer to viruses On the contrary, the sequence analysis strongly suggests that several of the other clones are generated via recombinations, for example, clone C (patient 1) and clones HI (patient 2). For each case, one end of the protease carries motifs of the nucleic acid sequence that are typical of post-IT wild-type viruses while the rest of the sequence contains a polymorphism characteristic of pre-IT resistant viruses. Several elements indicate that these recombinations occurred <I> in </ I> <I> vivo </ I> and not during the amplification before cloning.

exemple, le clone C du patient 1 contient plusieurs polymorphismes en 5' qui ne sont pas typiques de virus résistants pré-IT, or ce recombinant est présent dans échantillon qui ne contient aucun virus résistant détectable qui pourrait servir de source pour ces motifs durant la PCR.

I1-4.<U>Quantification des souches exprimant</U> <U>mutations de résistance après une</U> IT <U>de 3 mois</U>. for example, clone C of patient 1 contains several 5 'polymorphisms which are not typical of pre-IT resistant viruses, but this recombinant is present in a sample which contains no detectable resistant virus which could serve as a source for these motifs during the PCR.

I1-4. <U> Quantification of strains expressing </ U><U> mutations of resistance after </ U> IT <U> of 3 months </ U>.

Pour évaluer si une IT d'une durée de 3 mois communément utilisée est suffisante pour éliminer complètement les virus résistants, la proportion de virus exprimant les mutations V82A et L90M a été quantifiée chez les patients qui suivent une IT depuis 3 mois et pour lesquels un génotypage conventionnel révèle une apparente totale reconversion en virus sauvage. Pour les 13 patients avec mutations V82A ou L90M avant l'interruption traitement, des populations minoritaires exprimant ces mutations de résistance sont encore détectables après une IT 3 mois dans 9 cas (Table II). La proportion de souches virales exprimant V82A et L90M diminue chez les patients présentant les deux mutations avant l'IT. Cependant, il convient de noter que la proportion de populations résiduelles avec V82A est plus importante que celle des populations L90M chez les 3 patients avec des populations résistantes détectables après l'IT, ce qui est en accord avec la présence de souches avec des génotypes de résistance intermédiaires, comme décrit ci-dessus. La spécificité de la méthode de PCR séquence-sélective apparaît valable puisque les virus avec les mutations V82A ou L90M ne sont jamais détectées chez les individus qui ne présentent pas la mutation correspondante avant l'IT.

To evaluate whether a commonly used 3-month IT is sufficient to completely eliminate resistant viruses, the proportion of viruses expressing V82A and L90M mutations has been quantified in patients who have been on an IT for 3 months and for whom a Conventional genotyping reveals an apparent total reconversion to wild-type virus. For the 13 patients with V82A or L90M mutations before treatment interruption, minority populations expressing these resistance mutations are still detectable after 3 months of IT in 9 cases (Table II). The proportion of viral strains expressing V82A and L90M decreased in patients with both mutations before IT. However, it should be noted that the proportion of residual populations with V82A is greater than that of the L90M populations in the 3 patients with resistant populations detectable after IT, which is in agreement with the presence of strains with genotypes of intermediate resistance, as described above. The specificity of the sequence-selective PCR method appears valid since viruses with V82A or L90M mutations are never detected in individuals who do not have the corresponding mutation before IT.

<U>Tableau <SEP> 2 <SEP> : <SEP> Détection <SEP> des <SEP> populations <SEP> virales <SEP> minoritaires</U>
<tb> <U>exprimant <SEP> les <SEP> mutations <SEP> de <SEP> résistance <SEP> V82A <SEP> et/ou <SEP> L90M <SEP> dans</U>
<tb> <U>le <SEP> plasma <SEP> de <SEP> patients <SEP> après <SEP> une <SEP> IT <SEP> de <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> t</U>.
<tb> Technique <SEP> Temps <SEP> Résultats <SEP> du <SEP> génotypage <SEP> ou
<tb> d'évaluation <SEP> quantification <SEP> des <SEP> souches <SEP> virales <SEP> mutantes <SEP> par
<tb> Génotype <SEP> Avant <SEP> IT <SEP> 82A <SEP> 90M <SEP> 82A <SEP> 90L <SEP> 82V <SEP> 90M
<tb> Apres <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> 82V <SEP> 90L <SEP> 82V <SEP> 90L <SEP> 90L
<tb> PCR <SEP> Apres <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> Patient <SEP> % <SEP> % <SEP> Patient <SEP> % <SEP> % <SEP> Patient <SEP> %
<tb> <B>V <SEP> 82A</B> <SEP> L90M <SEP> <B>V <SEP> 82A</B> <SEP> L90M <SEP> <B>V <SEP> 82A</B> <SEP> L90M
<tb> 17 <SEP> 21 <SEP> 13 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> sld <SEP> 23 <SEP> sld <SEP> 9
<tb> 2 <SEP> 15 <SEP> 6 <SEP> 13 <SEP> 4 <SEP> sld <SEP> 1 <SEP> 5
<tb> 3 <SEP> 9 <SEP> 0,1 <SEP> 12 <SEP> 3 <SEP> sld <SEP> 15 <SEP> sld <SEP> 2
<tb> 21 <SEP> sld* <SEP> sld <SEP> 19 <SEP> sld <SEP> sld <SEP> 14 <SEP> sld
<tb> t <SEP> des <SEP> patients <SEP> infectés <SEP> par <SEP> le <SEP> VIH <SEP> ont <SEP> été
<tb> testés <SEP> après <SEP> une <SEP> IT <SEP> de <SEP> 3 <SEP> mois <SEP> et <SEP> ont <SEP> été <SEP> identifiés <SEP> les
<tb> patients <SEP> pour <SEP> lesquels <SEP> le <SEP> génotypage <SEP> standard <SEP> revèle <SEP> une
<tb> révers' <SEP> apparemment <SEP> complète <SEP> en <SEP> virus <SEP> sauvage. <SEP> La
<tb> proportion <SEP> de <SEP> séquences <SEP> virales <SEP> contenant <SEP> la <SEP> mutation <SEP> de
<tb> résistance <SEP> V82A <SEP> et/ou <SEP> L90M <SEP> est <SEP> déterminée <SEP> par <SEP> une <SEP> PCR
<tb> séquence-sélective <SEP> pour <SEP> tous <SEP> les <SEP> patients <SEP> dont <SEP> génotype
<tb> avant <SEP> l'IT <SEP> contient <SEP> la <SEP> mutation <SEP> de <SEP> résistance <SEP> V82A <SEP> et/ou
<tb> L90M. <SEP> * <SEP> sld <SEP> signifie <SEP> <SEP> sous <SEP> la <SEP> limite <SEP> de <SEP> détection <SEP> <SEP> qui
<tb> est <SEP> inférieure <SEP> à <SEP> 1% <SEP> pour <SEP> V82A <SEP> et <SEP> inférieure <SEP> à <SEP> 05% <SEP> pour
<tb> L90M.<U> Table <SEP> 2 <SEP>: <SEP> Detection <SEP> of <SEP> minority <SEP> viral <SEP> populations </ U>
<tb><U> expressing <SEP> the <SEP> mutations <SEP> of <SEP> resistance <SEP> V82A <SEP> and / or <SEP> L90M <SEP> in </ U>
<tb><U> the <SEP> plasma <SEP> of <SEP> patients <SEP> after <SEP> a <SEP> IT <SEP> of <SEP> 3 <SEP> months <SEP> t </ U >.
<tb> Technique <SEP> Time <SEP><SEP> Results <SEP> genotyping <SEP> or
<tb> evaluation <SEP> quantification <SEP> of <SEP> strains <SEP> viral <SEP> mutants <SEP> by
<tb> Genotype <SEP> Before <SEP> IT <SEP> 82A <SEP> 90M <SEP> 82A <SEP> 90L <SEP> 82V <SEP> 90M
<tb> After <SEP> 3 <SEP> months <SEP> 82V <SEP> 90L <SEP> 82V <SEP> 90L <SEP> 90L
<tb> PCR <SEP> After <SEP> 3 <SEP> months <SEP> Patient <SEP>% <SEP>% <SEP> Patient <SEP>% <SEP>% <SEP> Patient <SEP>%
& numsp & num / B><SEP> L90M
<tb> 17 <SEP> 21 <SEP> 13 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> sld <SEP> 23 <SEP> sld <SEP> 9
<tb> 2 <SEP> 15 <SEP> 6 <SEP> 13 <SEP> 4 <SEP> sld <SEP> 1 <SEP> 5
<tb> 3 <SEP> 9 <SEP> 0.1 <SEP> 12 <SEP> 3 <SEP> sld <SEP> 15 <SEP> sld <SEP> 2
<tb> 21 <SEP> sld * <SEP> sld <SEP> 19 <SEP> sld <SEP> sld <SEP> 14 <SEP> sld
<tb> t <SEP><SEP> patients <SEP> infected <SEP> with <SEP><SEP> HIV <SEP> have <SEP> been
<tb> tested <SEP> after <SEP> one <SEP> IT <SEP> of <SEP> 3 <SEP> months <SEP> and <SEP> have <SEP> been <SEP> identified <SEP>
<tb> patients <SEP> for <SEP> which <SEP><SEP> genotyping <SEP> standard <SEP> reveals <SEP> one
<tb> reversal '<SEP> apparently <SEP> complete <SEP> in <SEP> wild <SEP> virus. <SEP> The
<tb> proportion <SEP> of <SEP><SEP> viral <SEP> sequences containing <SEP><SEP> mutation <SEP> of
<tb> resistance <SEP> V82A <SEP> and / or <SEP> L90M <SEP> is <SEP> determined <SEP> by <SEP> a <SEP> PCR
<tb> selective-sequence <SEP> for <SEP> all <SEP><SEP> patients <SEP> including <SEP> genotype
<tb> before <SEP> IT <SEP> contains <SEP><SEP> mutation <SEP> of <SEP> resistance <SEP> V82A <SEP> and / or
<tb> L90M. <SEP> * <SEP> sld <SEP> means <SEP><SEP> under <SEP> the <SEP><SEP> limit of <SEP> detection <SEP><SEP> which
<tb> is <SEP> lower <SEP> than <SEP> 1% <SEP> for <SEP> V82A <SEP> and <SEP> lower <SEP> than <SEP> 05% <SEP> for
<tb> L90M.

Claims (24)

REVENDICATIONS 1) Méthode de détection et/ou de quantification de variants minoritaires portant au moins une mutation au sein d'une population hétérogène de virus contenue dans échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes a) l'extraction des acides nucléiques contenus dans l'echantillon biologique, b) l'amplification par PCR des acides nucléiques de l'étape (a) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique virale susceptible de porter la mutation, c) la préparation d'un standard amplification PCR avec la même paire d'amorces qu'à l'étape (b) d' séquence d'acide nucléique portant la mutation, d) l'amplification par PCR en temps réel des produits d'amplification de l'étape (b) et du standard de l'étape (c) avec une paire d'amorces hautement conservées ne discriminant pas les séquences portant ou non la mutation, et la quantification du nombre de séquences d'acide nucléique virales portant ou non la mutation présentes dans l'échantillon, e) l'amplification par PCR en temps réel des produits d'amplification de l'étape (b) et du standard l'étape (c) avec une paire d'amorces spécifiques d' séquence portant la mutation, et quantification du nombre de séquences d'acide nucléique virales portant la mutation présentes dans l'échantillon, f) la comparaison des quantifications des étapes (d) et (e) pour déterminer la proportion de virus portant la mutation dans l'échantillon.1) Method for detecting and / or quantifying minority variants carrying at least one mutation within a heterogeneous population of viruses contained in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: a) the extraction of nucleic acids contained in the biological sample, b) the PCR amplification of the nucleic acids of step (a) with a pair of primers flanking a viral nucleic acid sequence capable of carrying the mutation, c) the preparation of a standard PCR amplification with the same pair of primers as in the nucleic acid sequence step (b) carrying the mutation, d) the real-time PCR amplification of the amplification products of the step (b) and the standard of step (c) with a pair of highly conserved primers that do not discriminate sequences with or without the mutation, and quantifying the number of viral nucleic acid sequences with or without the mutate. present in the sample, e) real-time PCR amplification of the amplification products of step (b) and the standard step (c) with a pair of sequence-specific primers bearing the mutation, and quantifying the number of mutation-carrying viral nucleic acid sequences present in the sample, f) comparing the quantifications of steps (d) and (e) to determine the proportion of virus carrying the mutation in the sample . 2) Méthode selon la revendication , caractérisée en ce que les variants minoritaires appartiennent à toutes les familles de virus.2) Method according to claim, characterized in that the minority variants belong to all families of viruses. 3) Méthode selon l'une des revendications 1 2, caractérisée en ce que les variants minoritaires sont des virus ' ARN et en ce que l'étape (b) est une RT PCR en présence d'une paire d'amorces encadrant la séquence d'acide nucléique susceptible de porter la mutation.3) Method according to one of claims 1 2, characterized in that the minority variants are RNA viruses and in that step (b) is an RT PCR in the presence of a pair of primers flanking the sequence nucleic acid capable of carrying the mutation. 4) Méthode selon l'une quelconque revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les paires d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique virale susceptible de porter la mutation des étapes (b) et sont choisies de façon à amplifier avec la même efficacité les séquences qui portent la mutation et celles qui ne la portent pas.4) Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the primer pairs flanking a viral nucleic acid sequence capable of carrying the mutation of steps (b) and are chosen so as to amplify with the same the sequences that carry the mutation and those that do not. 5) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la séquence portant la mutation utilisée pour réaliser le standard de l'étape (c) est une séquence en acide nucléique d'un virus portant la mutation, ou une séquence en acide nucléique d'un virus sauvage dans lequel la mutation a été introduite par mutagenèse dirigée ou tout autre séquence capable de fournir par amplification avec les mêmes amorces que pour l'étape (b) un produit présentant les mêmes caractéristiques que la séquence en acide nucléique d' virus portant la mutation.5) Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the sequence carrying the mutation used to achieve the standard of step (c) is a nucleic acid sequence of a virus carrying the mutation, or a nucleic acid sequence of a wild-type virus in which the mutation has been introduced by site-directed mutagenesis or any other sequence capable of providing by amplification with the same primers as for stage (b) a product having the same characteristics as the sequence nucleic acid virus carrying the mutation. 6) Méthode selon l'une quelconque revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les étapes (d) et (e) sont réalisées avec une sonde conjuguée à ses extrémités 5' et 3', respectivement, avec un colorant fluorescent reporteur et un composé de réduction d'intensité de fluorescence, ladite sonde étant spécifique d'une séquence présente aussi bien dans produits d'amplification des étapes (d) et (e).6) Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that steps (d) and (e) are carried out with a conjugate probe at its 5 'and 3' ends, respectively, with a fluorescent dye reporter and a fluorescence intensity reduction compound, said probe being specific for a sequence present both in amplification products of steps (d) and (e). 7) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en que la fluorescence émise lors des étapes (d) et (e) mesurée en continu et le nombre de cycles d'amplification nécessaires pour que la fluorescence dépasse un seuil donné (Cs) est déterminé auxdites étapes (d) et (e) en ce que la quantification du nombre total de séquences d'acide nucléique virales portant ou non la mutation dans l'échantillon de l'étape (d) et celle du nombre de séquences d'acide nucléique mutées présentes dans l'échantillon de l'étape (e) sont réalisées en comparant le Cs avec une courbe étalon de Cs obtenue avec des dilutions du standard soumis à des amplifications dans les conditions des étapes (d) et (e) .7) Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the fluorescence emitted during steps (d) and (e) measured continuously and the number of amplification cycles necessary for the fluorescence exceeds a given threshold (Cs) is determined in said steps (d) and (e) in that the quantification of the total number of viral nucleic acid sequences carrying or not the mutation in the sample of step (d) and that of the number of Mutated nucleic acid sequences present in the sample of step (e) are performed by comparing the Cs with a Cs standard curve obtained with standard dilutions subject to amplifications under the conditions of steps (d) and (c). e). 8) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'à l'étape (e) l'amorce sens spécifique de la séquence mutée présente au moins un ou deux mésappariements supplémentaires autre que., la mutation.8) Method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that in step (e) the specific sense primer of the mutated sequence has at least one or two additional mismatches other than. 9) Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'à l'étape (e) l'amorce sens spécifique de la séquence mutée présente un mésappariement moyennement déstabilisant, autre que la mutation, en position -2 par rapport à l'extrémité 3' de ladite amorce sens.9) Method according to claim 8, characterized in that in step (e) the specific sense primer of the mutated sequence has a moderately destabilizing mismatch, other than the mutation, in position -2 with respect to the end 3 'of said sense primer. 10) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que les PCR en temps réel des étapes (d) et ( ) sont réalisées en présence de 3 à 5 mM de MgC12, avec plus de 100 mM de chacun des dNTP, avantageusement 200 mM de chacun des dNTP et à une température équivalente aux des amorces utilisées.10) Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the real-time PCR of steps (d) and () are carried out in the presence of 3 to 5 mM MgCl 2, with more than 100 mM each dNTPs, advantageously 200 mM of each of the dNTPs and at a temperature equivalent to the primers used. 11) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend un contrôle supplémentaire correspondant à un standard identique à celui préparé à étape (c) mais ne présentant pas la mutation qui est amplifié par PCR en temps réel dans les mêmes conditions que celles des étapes (d) et (e).11) Method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that it comprises an additional control corresponding to a standard identical to that prepared in step (c) but not having the mutation which is amplified by PCR in time real under the same conditions as those of steps (d) and (e). 12) Application d'une méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes à la détection et/ou la quantification de variants minoritaires du VIH portant au moins une mutation de résistance aux antirétroviraux.12) Application of a method according to any one of the preceding claims to the detection and / or quantification of minority variants of HIV carrying at least one antiretroviral resistance mutation. 13) Méthode détection et/ou de quantification de variants minoritaires portant au moins une mutation, selon l'une quelconque des revendications 1 à il, caractérisée en ce que lesdits variants minoritaires sont des virus VIH et en que ladite mutation est une mutation de résistance aux antirétroviraux présente dans la séquence de la protéase.13) Method for detecting and / or quantifying minority variants carrying at least one mutation, according to any one of Claims 1 to 11, characterized in that the said minority variants are HIV viruses and in that the said mutation is a resistance mutation. antiretrovirals present in the protease sequence. 14) Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite mutation est la mutation de résistance V82A ou L90M.14) Method according to claim 13, characterized in that said mutation is the V82A or L90M resistance mutation. 15) Méthode de détection et/ou de quantification de variants minoritaires du VIH portant au moins une mutation de résistance aux antirétroviraux V82A L90M dans la séquence de la protéase, au sein d'une population virale hétérogène contenue dans échantillon biologique, selon l'une quelconque des revendications 13 ou caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) l'extraction des ARN contenus dans 'échantillon biologique, b) l'amplification par RT des ARN de l'étape (a) avec une paire d'amorces encadrant une séquence d'acide nucléique virale susceptible de porter la mutation V82A ou L90M, cette paire d'amorces étant ID No.l et SEQ ID No.2 dans la liste de séquences en annexe, c) la préparation d'un standard par amplification PCR avec la même paire d'amorce qu'à l'étape (b) d'une séquence d'acide nucléique portant la mutation V82A ou L90M, d) l'amplification par PCR en temps réel des produits d'amplification de l'étape (b) et du standard de 'étape (c) avec une paire d'amorces hautement conservées discriminant pas les séquences portant ou non la mutation V82A ou L90M " cette paire d'amorces étant SEQ ID No. 3 et SEQ ID No. 4 dans la liste de séquences en annexe, et quantification du nombre de séquences d'acide nucléique virales portant ou non la mutation V82A ou L90M présentes dans l'échantillon, e) l'amplification par PCR en temps réel des produits d'amplification de l'étape (b) et du standard de l'étape (c) avec une paire d'amorces spécifiques d'une séquence portant la mutation V82A ou L90M, et quantification du nombre de séquences d'acide nucléique virales portant la mutation V82A ou L90M présentes dans l'échantillon, f) la comparaison des quantifications des étapes (d) et (e) pour déterminer la proportion de virus portant la mutation V82A ou L90M dans l'échantillon.15) Method for the detection and / or quantification of minority variants of HIV carrying at least one V82A L90M antiretroviral resistance mutation in the protease sequence, within a heterogeneous viral population contained in a biological sample, according to one of any one of claims 13 or characterized in that it comprises the following steps: a) the extraction of the RNAs contained in the biological sample, b) the amplification by RT of the RNAs of step (a) with a pair of primers flanking a viral nucleic acid sequence capable of carrying the V82A or L90M mutation, this primer pair being ID No. 1 and SEQ ID No. 2 in the attached sequence listing, c) the preparation of a standard by PCR amplification with the same pair of primer as in step (b) of a nucleic acid sequence carrying the mutation V82A or L90M, d) real-time PCR amplification of the amplification products of step (b) and Step (c) standard with a pair of highly conserved primers not discriminating sequences with or without the V82A or L90M mutation. This pair of primers being SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 in the list of appended sequences, and quantification of the number of viral nucleic acid sequences carrying or not the V82A or L90M mutation present in the sample, e) the real-time PCR amplification of the amplification products of step (b). ) and the standard of step (c) with a pair of primers specific for a sequence carrying the V82A or L90M mutation, and quantifying the number of viral nucleic acid sequences carrying the V82A or L90M mutation present in the sample, f) comparing the quantifications of steps (d) and (e) to determine the proportion of virus carrying the V82A or L90M mutation in the sample. 16) Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que la mutation est la mutation de résistance V82A dans la séquence de la protéase et en ce que l'étape (e) est réalisée avec la paire d'amorces de séquence ID No.4 et SEQ ID No.6 dans la liste de séquences annexe.16) Method according to claim 15, characterized in that the mutation is the V82A resistance mutation in the protease sequence and in that step (e) is carried out with the pair of primers of sequence ID No.4 and SEQ ID No.6 in the attached sequence listing. 17) Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que la mutation est la mutation de résistance L90M dans la séquence de la protéase et en ce que l'étape (e) est réalisée avec la paire d'amorces de séquence ID No.4 et SEQ ID No.7 dans la liste de séquences annexe.17) Method according to claim 15, characterized in that the mutation is the L90M resistance mutation in the protease sequence and in that step (e) is carried out with the pair of primers of sequence ID No.4 and SEQ ID No.7 in the attached sequence listing. 18) Une paire d'amorces susceptible d'être mise en ceuvre à l'étape (b) d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend les amorces de séquences SEQ ID No. et SEQ ID No.2 dans la liste de séquences en annexe.18) A pair of primers capable of being implemented in step (b) of a method according to any one of claims 13 to 17, characterized in that it comprises the primers of sequences SEQ ID No. and SEQ ID No.2 in the attached sequence listing. 19) Une paire d'amorces susceptible d'être mise en #uvre à l'étape (d) d'une méthode selon l' quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend les amorces de séquences SEQ ID No. et SEQ ID No.4 dans la liste de séquences en annexe.19) A pair of primers that can be used in step (d) of a method according to any one of claims 13 to 17, characterized in that it comprises the primers of sequences SEQ ID No. and SEQ ID No.4 in the attached sequence listing. 20) Une paire d'amorces susceptible d'être mise en #uvre à l'étape (e) d'une méthode selon l' quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend les amorces de séquences SEQ ID No.4 SEQ ID No.6 dans la liste de séquences en annexe.20) A pair of primers that can be used in step (e) of a method according to any one of claims 13 to 17, characterized in that it comprises the primers of sequences SEQ ID No. .4 SEQ ID No.6 in the attached sequence listing. 21) Une paire d'amorces susceptible d'etre mise en oeuvre à l'étape (e) d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend les amorces de séquences SEQ ID No.4 et SEQ ID No.7 dans la liste de séquences en annexe.21) A pair of primers capable of being used in step (e) of a method according to any one of claims 13 to 17, characterized in that it comprises the primers of sequences SEQ ID No. .4 and SEQ ID No.7 in the attached sequence listing. 22) Une sonde susceptible d'être mise en aeuvre aux étapes (d) et (e) d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que sa séquence correspond à SEQ ID No.5 dans la liste de séquences en annexe.22) A probe that can be implemented in steps (d) and (e) of a method according to any one of claims 13 to 17, characterized in that its sequence corresponds to SEQ ID No.5 in the list of sequences in annex. 23) Un kit pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et 13 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend les réactifs suivants . - une paire d'amorces encadrant segment susceptible de porter une mutation, - une paire d'amorces hautement conservées ne discriminant pas les séquences mutées et non mutées, - une paire d'amorces spécifiques des séquences mutées, - une sonde conjuguée à ses extrémités 5' et 3',. respectivement, avec un colorant fluorescent reporteur et un composé de réduction d'intensité de fluorescence, spécifique des produits d'amplification des étapes (c) et (d) d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 et 13 à 17, - une séquence d'acide nucléique portant la mutation pour la préparation d'un standard par amplification PCR avec la paire d'amorces encadrant le segment susceptible de porter une mutation, - les produits réactifs nécessaires pour réaliser les différentes amplifications par PCR.23) A kit for carrying out a method according to any one of claims 1 to 11 and 13 to 17, characterized in that it comprises the following reagents. a pair of primers surrounding a segment capable of carrying a mutation, a pair of highly conserved primers that do not discriminate mutated and non-mutated sequences, a pair of primers specific for the mutated sequences, a conjugate probe at its ends; 5 'and 3' ,. respectively, with a reporter fluorescent dye and a fluorescence intensity reducing compound, specific for the amplification products of steps (c) and (d) of a method according to any one of claims 1 to 11 and 13 to 17, - a nucleic acid sequence carrying the mutation for the preparation of a standard by PCR amplification with the pair of primers surrounding the segment likely to carry a mutation, - the reagent products necessary to carry out the various amplifications by PCR. 24) Un kit selon revendication 23, pour la détection et/ou la quantification de variants minoritaires du VIH portant la mutation de résistance aux antirétroviraux V82A ou L90M dans la séquence de la protéase, caractérisé en ce il comprend - la paire d'amorces encadrant le segment susceptible de porter une mutation de séquence SEQ ID No.l et SEQ ID No.2 dans la liste séquences en annexe, - la paire d'amorces hautement conservées ne discriminant pas les séquences mutées et non mutées de séquence SEQ ID No.3 et ID No.4 dans la liste de séquences en annexe, - la paire d'amorces spécifiques des séquences portant la mutation V82A de séquence SEQ ID No.4 et SEQ ID No.6 dans la liste de séquences en annexe et la paire d'amorces spécifiques des séquences portant la mutation L90M de séquence SEQ ID No.4 et SEQ ID No.7 dans la liste de séquences en annexe, - la sonde conjuguée à ses extrémités<B>51</B> et<B>31,.,</B> respectivement, avec un colorant fluorescent reporteur et un. composé de réduction d'intensité de fluorescence de séquence SEQ ID No.5 dans la liste de séquences en annexe.24) A kit according to claim 23, for the detection and / or quantification of minority variants of HIV carrying the V82A or L90M antiretroviral resistance mutation in the protease sequence, characterized in that it comprises - the pair of primers surrounding the segment capable of carrying a mutation of sequence SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 in the list of sequences in the appendix, the pair of highly conserved primers not discriminating the mutated and non-mutated sequences of sequence SEQ ID No. 3 and ID No. 4 in the attached sequence listing, - the pair of sequence-specific primers carrying the V82A mutation of sequence SEQ ID No.4 and SEQ ID No.6 in the attached sequence listing and the pair of primers specific for the sequences carrying the L90M mutation of sequence SEQ ID No.4 and SEQ ID No.7 in the attached sequence listing, - the probe conjugated at its ends <B> 51 </ B> and <B> 31,., </ B> respectively, with a fluorine dye escent reporter and one. fluorescence intensity reduction compound of SEQ ID No.5 sequence in the attached sequence listing.